CN113025533B - 一株产丁酸的芽孢杆菌菌株筛选及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株产丁酸的芽孢杆菌菌株筛选及其应用，属于生物工程技术领域。本发明的巨大芽孢杆菌FMME ZK001具有较好的传代稳定性；在摇瓶水平上发酵生产丁酸产量达10.4g/L，本发明的发酵生产丁酸的方法工艺操作简单易行、培养基成本低廉，适用于工业化生产。丁酸作为一种重要的短链脂肪酸，由于具有替代抗生素，增强动物机体免疫力，维护胃肠道内有益微生物菌群，促进动物消化能力等特点，对饲料发酵具有重要影响。该菌株可以用于饲料发酵产生丁酸，具有较强的产丁酸能力。

Description

一株产丁酸的芽孢杆菌菌株筛选及其应用
技术领域
本发明涉及一株产丁酸的芽孢杆菌菌株筛选及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
丁酸(Butyric acid)是一种四碳短链脂肪酸(Short-Chain Fatty Acid,SCFA)，由结肠腔内细菌发酵未消化的碳水化合物而来，易被结肠上皮吸收，并代谢产生能量。丁酸及其盐对结肠健康和肠道屏障功能的影响一直是人们关注的焦点。
饲料益生菌除去本身的益生特性还能够通过产出各种化学物质，对动物消化吸收和肠道健康起到积极的作用。例如，动物肠道存在慢性炎症和肠道损伤修复慢，而饲料益生菌能够产丁酸，能替代抗生素，增强动物免疫力，促进抗菌肽(HDP)的表达，还能作为肠上皮细胞的重要能源，修复肠上皮细胞损伤，通过多种机制干扰肠道病原体的生长，产生的微生物和氨基酸能增加饲料营养价值，丁酸还能够抑制病原微生物的生长，延长饲料保质期。丁酸作为一种重要的短链脂肪酸，容易被结肠上皮细胞吸收。丁酸及其盐对肠道健康和肠道的屏蔽功能起着重要的作用，并且可以增强动物消化吸收能力、调节肠道免疫反应、减缓肠道炎症、减少氧化损伤等。由于还具有替代抗生素，增强动物机体免疫力，维护胃肠道内有益微生物菌群，促进动物消化能力等特点，对饲料发酵具有重要影响。因此，丁酸在饲料中有极大的应用。
与传统微生物代谢改造或发酵优化方法相比，饲用益生菌发酵生产丁酸，既能够降低成本、保护环境，特定的物质能够得到更高的产量，且益生菌能够很好的定植在肠道，不会对动物机体造成任何损害，既能够生产有益物质又能丰富肠道菌群，促进了动物的健康，对于现代饲料产业具有重要的现实意义和应用价值。
目前微生物法生产丁酸通常是通过基因工程技术来提高微生物发酵生产丁酸的产量，虽然通过基因工程手段的确可以大幅度的增加丁酸的产量，但是操作和培养难度居高不下，工业化的负担增大、成本的增加。
发明内容
为了解决目前在丁酸的微生物发酵中所存在的重组菌的构建及培养难度高的问题，本发明从土壤及动物粪便样品中筛选到了一株产丁酸的巨大芽孢杆菌，其培养条件简单、丁酸产量高，适于饲料的制备，提升家畜的免疫力。
本发明提供了一株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，已于2021年1月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021167，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
本发明提供了含有所述巨大芽孢杆菌的微生物制剂。
在一种实施方式中，所述微生物菌剂中巨大芽孢杆菌的含量不低于1.0×106cfu/mL或1.0×106cfu/g。
本发明提供了一种生产丁酸的方法，利用所述巨大芽孢杆菌，或所述微生物制剂生产丁酸。
在一种实施方式中，将对数期的巨大芽孢杆菌以1-3mL/100mL的量加入反应体系。
在一种实施方式中，反应体系中含有葡萄糖、酵母粉、蛋白胨。
在一种实施方式中，反应体系中含有葡萄糖30g/L，酵母粉5.0g/L，蛋白胨5.0g/L。
在一种实施方式中，在25-35℃，150-250rpm下培养。
在一种实施方式中，反应时间不低于60h。
本发明提供了所述菌株在生产丁酸中的应用。
本发明提供了所述菌株在饲料制备中的应用。
本发明的有益效果：本发明的巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium FMME ZK001具有较好的传代稳定性，在传代数代之后，其丁酸的生产能力均能够稳定在一定水平；在摇瓶水平上发酵生产丁酸产量达10.4g/L，同时还能生产乳酸、乙酸等多种酸类物质。本发明发酵生产丁酸的方法工艺操作简单易行、培养基成本低廉，适用于工业化生产。丁酸作为一种重要的短链脂肪酸，由于具有替代抗生素，增强动物机体免疫力，维护胃肠道内有益微生物菌群，促进动物消化能力等特点，对饲料发酵具有重要影响。该菌株可以用于饲料发酵产生丁酸，具有较强的产丁酸能力。
生物材料保藏
本发明提供的巨大芽孢杆菌，分类命名为Bacillus megaterium FMME ZK001，已于2021年1月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2021167，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
附图说明
图1为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium FMME ZK001的菌落形态图；
图2为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium FMME ZK001生长曲线图；
图3为Bacillus megaterium FMME ZK001在摇瓶水平发酵过程丁酸产量及菌体浓度变化曲线图；
图4为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium FMME ZK001发酵产其它酸类物质图。
具体实施方式
(1)培养基：
溴甲酚绿筛选培养基(g/L)：蛋白胨13.33，酵母膏13.33，MnSO4 0.0133，MgSO40.0133，FeSO4 0.0133，NaCl 0.0133，醋酸钠0.67，葡萄糖90，pH6.0，115℃灭菌15min；
固体活化培养基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5.0，蛋白胨5.0，琼脂15。自然pH，121℃，灭菌20min(葡萄糖单独灭菌，并于使用前混入培养基中)。
液体种子培养基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5.0，蛋白胨5.0。自然pH，121℃，灭菌20min(葡萄糖单独灭菌，并于使用前混入培养基中)。
液体发酵培养基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5.0，蛋白胨5.0。自然pH，121℃，灭菌20min(葡萄糖单独灭菌，并于使用前混入培养基中)。
(2)丁酸的测定：
发酵液预处理：取发酵液12000r/min离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤。
利用高效液相色谱法检测丁酸含量。色谱条件采用Bio-Rod Aminex HPX-87H分析柱，选用3.5mM硫酸为流动相，在柱温35℃、流速0.6mL/min及检测波长为210nm条件下，进样量10μL，对丁酸检测。
按照GB 1886.121-2015，采用面积归一化法测定丁酸含量。
饲料粗蛋白的检测：具体实施方式参见GB/T6432-94。
实施例1：菌株的筛选
(1)产丁酸的巨大芽孢杆菌筛选
初筛：取适量土壤及动物粪便样品，溶解于已灭菌的100mL蒸馏水中，放入摇床，30℃，200r/min震荡30min进行富集培养。取上清液进行十倍比稀释，吸取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8分别涂布于溴甲酚绿筛选平板，30℃恒温箱培养24h。由于大量分泌有机酸的菌株在溴甲酚绿筛选平板中会出现黄色变色反应圈，因此，根据是否存在黄色反应圈，确定潜在菌株范围；
复筛：利用基础培养基(溴甲酚绿筛选培养基)对具有潜在有机酸分泌能力的菌株进行分离挑选。分别点种已分离菌株至溴甲酚绿筛选平板，计算黄色反应圈直径与菌落直径比值。选取比值最大者菌株，-80℃保藏备用。
不产酸菌株不会出现黄色透明圈，产酸菌株周围会出现黄色透明圈，在5个梯度筛选平板上共得到521个菌落，其中产酸菌株疑似10株。将初筛得到的10株菌株分别点种于溴甲酚绿筛选平板，测量其透明圈/水解圈与菌落直径的比值(H/d值)，进行3次平行实验，其中4号菌株的平均H/d值分别达到2.1，其余菌株H/d值均在1.5以下。4号菌株具有较好的产酸能力，因此将4号菌株保藏备用。
表1不同菌株H/d值
菌株编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
H/d值 1 1 1.3 2.1 1.2 1 1.2 1.3 1.4 1.4
(2)菌株的鉴定
菌株形态鉴定：将筛选获得的菌株接种于种子培养基平板上，30℃条件下倒置培养24h，观察其菌落生长状态(图1)。同时使用接种环挑取单菌落菌株，进行革兰氏染色处理，在光学显微镜下观察菌株显微形态。
菌株种属鉴定：
(1)DNA的提取：将筛选获得的单菌落接种到含50mL种子液的500mL摇瓶中，200r/min，30℃条件下培养12h，6000rpm冷冻离心10min，收集菌体。严格按照TaKaRa试剂盒提供的操作进行细菌总DNA的提取。
(2)16S rRNA基因的扩增：PCR的上、下游引物分别为实验室存储的通用引物27F，5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R，5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。热循环参数为95℃预变性5min，95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃延伸10min。PCR产物由苏州金唯智生物科技有限公司测序。
(3)序列及系统发育分析：将菌株的16S rRNA基因序列通过BLAST进行同源性分析。多序列比对使用软件Clustal 1.83，最后用Mega 3.1软件的最大相似法(maximumlikelihood)和邻位相连法(neighbor-joining)构建系统进化树(Kimura 2-parameter模式)。
菌株4的菌落和菌体形态显示，该菌为该菌株为长杆状，革兰氏染色呈阳性，有芽孢，周生鞭毛，能运动，菌落呈圆形，表面粗糙有隆起，浅黄色，有恶臭味。
按照细菌基因组提取试剂盒说明，提取4号菌株的基因组，并进行PCR扩增获得该菌16SrRNA。根据测序结果，于NCBI数据库中序列进行BLAST比对后，利用MEGA 7软件构建进化树，菌株4与Bacillus megaterium相似性达到100％，结合菌株4菌落形态特征、镜检图片及16S rRNA分析鉴定其为巨大芽孢杆菌。送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2021167。
实施例2：巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium FMME ZK001摇瓶发酵
步骤1：配制培养基
固体活化培养基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5.0，蛋白胨5.0，琼脂15。自然pH，121℃，灭菌20min(葡萄糖单独灭菌，并于使用前混入培养基中)
液体种子培养基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5.0，蛋白胨5.0。自然pH，121℃，灭菌20min(葡萄糖单独灭菌，并于使用前混入培养基中)
液体发酵培养基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉5.0，蛋白胨5.0。自然pH，121℃，灭菌20min(葡萄糖单独灭菌，并于使用前混入培养基中)
步骤2：种子制备
蘸取菌株的菌悬液，在固体活化培养基上划线，在30℃恒温培养箱中培养24h左右得到单菌落，挑取单菌落接入含25mL液体种子培养基的100mL锥形瓶中，在30℃，200rpm摇床中过夜培养16h，培养至对数生长期(图2)制成种子液。
步骤3：摇瓶发酵培养
将制得的种子液按1％的接种量接入含100mL液体发酵培养基的500mL锥形瓶中，在30℃，200rpm摇床中培养3天，12h取一次样。收集发酵液预处理后得到的上清液，用HPLC测定发酵液中的丁酸含量，发酵结果如图3所示，发酵72h，丁酸产量最高可达到10.4g/L发酵过程中还会产生其他有机酸，如乙酸、乳酸、琥珀酸等(图4)，这些有机酸在动物饲料中也有添加，增加动物饲料的适口性，是十分有益的。
实施例3：巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium FMME ZK001传代稳定性
具体实施方式参见实施例2，将筛选得到的巨大芽孢杆菌Bacillus megateriumFMME ZK001进行10代的传代培养，将每一代的菌株接种至发酵培养基中进行摇瓶发酵。发酵结束后测定丁酸产量，传代培养后丁酸产量见表2，由表2可知，丁酸产量维持在9.65-10.4g/L，从而表明Bacillus megaterium FMME ZK001具有很高传代稳定性。
表2传代菌株的丁酸产量
传代 丁酸(g/L)
1 9.65
2 9.75
3 9.88
4 10.1
5 10.6
6 10.4
7 10.3
8 10.4
9 10
10 9.9
实施例4：巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium FMME ZK001菌粉的制备
取200～600μL的巨大芽孢杆菌接种于10～30mL LB液体培养基中，30℃下活化2至3代，待巨大芽孢杆菌达到1.0×108cfu/mL以上活菌数时，6000-12000rpm下离心10-20min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液(生理盐水或pH值为7的0.2M磷酸盐缓冲液)和冷冻保护剂(15～20g/100mL的蔗糖溶液)，待细胞浓度不低于107cfu/mL时，真空冷冻干燥处理得到菌粉。
实施例5：巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium FMME ZK001在饲料制备中的应用
将巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium FMME ZK001制得的微生物菌剂分别加入到含有经过粉碎处理过的花生粕和棉籽粕的饲料中，添加水，将水含量调整为35％，将实施例4中制备的菌剂按照0.2％(w/w)的接种量接种于饲料中，经过35℃发酵4-5天，pH值为5.0时结束发酵，检测粗蛋白、丁酸、活菌数。
花生粕饲料(％)：花生粕48，米糠15，葡萄糖2.0，CaCO3 0.01，水35％；
棉籽粕饲料(％)：棉籽粕48，米糠15，葡萄糖2.0，CaCO3 0.01，水35％；
发酵后饲料中花生粕和棉籽粕中粗蛋白含量略有增加，丁酸含量分别达到了6.52g/L和5.37g/L，进一步检测发酵后的饲料中的活菌数分别达到6.5×109cfu/mL和4.6×109cfu/mL。利用巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium FMME ZK001制备得到的微生物菌剂在发酵生粕和棉籽粕加工副产物为原料制成的饲料，能在饲料中有效的积累丁酸，可以提高饲料的适口性。同时发酵后饲料中的活菌数显著提高，巨大芽孢杆菌随着发酵饲料进入动物肠道后定殖在动物肠道内，能够更强力地调节动物肠道微生态平衡，增加家畜免疫力，有利于家畜生长。
表3微生物菌剂发酵对饲料中成分的影响
样品 饲料成分 粗蛋白(％) 丁酸(g/L) 活菌数(cfu/mL)
发酵前 花生粕 20.5 - -
发酵后 花生粕 21.6 6.52 1.5×10<sup>9</sup>
发酵前 棉籽粕 16.3 - -
发酵后 棉籽粕 16.5 5.37 1.1×10<sup>9</sup>
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1. 一株巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）FMME ZK001，已于2021年1月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021167。
2. 含有权利要求1所述巨大芽孢杆菌FMME ZK001的微生物制剂。
3. 根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中巨大芽孢杆菌FMME ZK001的含量不低于1.0×106 cfu/mL或1.0×106 cfu/g。
4. 一种生产丁酸的方法，其特征在于，利用权利要求1所述巨大芽孢杆菌FMME ZK001，或权利要求2或3所述微生物制剂生产丁酸。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将对数期的巨大芽孢杆菌FMME ZK001以1-3 mL/100 mL的量加入反应体系。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，反应体系中含有葡萄糖、酵母粉和蛋白胨。
7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在25-35℃，150-250 rpm下培养。
8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，反应时间不低于60 h。
9. 权利要求1所述的巨大芽孢杆菌FMME ZK001在生产丁酸中的应用。
10. 权利要求1所述的巨大芽孢杆菌FMME ZK001在饲料制备中的应用。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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