CN105453890A - 一种人工培养古尼虫草子实体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人工培养古尼虫草子实体的方法。操作步骤包括菌种培养和子实体培养两部分；菌种培养分为斜面培养和液体培养，得到液体摇瓶种子；子实体培养是将液体摇瓶种子接种到固体培养基上，培养得到人工培养的古尼虫草子实体。人工培养的古尼虫草子实体质地致密，子座棒状，单生，或簇生，柄白色、淡黄色至鼠灰色，高度1～3cm，直径1～4mm；头部为灰白色至灰黑色，狭长卵型至柱状，单生，二叉分枝或簇生长。本发明生产工艺简单、工艺稳定、成本低、原料来源广泛、无毒、无污染，成本低廉，可大规模生产，不仅解决了野生古尼虫资源的匮乏，而且为将来古尼虫草的药食用价值探索、综合开发利用奠定了坚实的基础。
Description
技术领域
本发明属于药用真菌的人工培养方法技术领域，具体涉及用古尼拟青霉菌种(PaecilomycesgunniiZ.Q.Liang)进行培养形成古尼虫草子实体。
背景技术
古尼虫草Cordycepsgunnii(Berk.)Berk.于1983年被梁宗琦首次发现并报道，之后确认其无性型为古尼拟青霉PaecilomycesgunniiLiang。古尼拟青霉具有提高机体免疫力、增强记忆力、镇痛等作用，毒性毒理研究表明古尼拟青霉无毒性，无致畸、致病性、致癌性。1990年刘杰麟诱导出古尼虫草子实体，培养周期长达3.5个月，但子实体栽培培养前的菌种培养并无说明，且子实体培养的外部条件亦未有详细阐述，因此并无生产工艺可循。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种人工培养古尼虫草子实体的方法，利用古尼拟青霉菌种PaecilomycesgunniiZ.Q.Liang，经过优化液体培养和固体基质培养诱导出子实体，为将来大规模培养和开发利用古尼虫草提供了技术参数并奠定了良好的基础。
实现上述目的具体技术解决方案如下：
人工培养古尼虫草子实体的具体操作步骤如下：
（1）菌种培养
（1.1）斜面菌种活化培养
将古尼拟青霉菌（PaecilomycesgunniiZ.Q.Liang）点接于斜面试管培养基，24～26℃培养7～10d，得到斜面菌种；
（1.2）液体摇瓶种子培养
在液体摇瓶种子培养基中接入斜面菌种，高速打散斜面菌种，在温度24～26℃、转速120～140r/min、黑暗条件下恒温震荡培养8d，得到液体摇瓶种子；
（2）子实体培养
（2.1）按料液比1g:2ml的比例，将20g小米或大米和40ml子实体栽培营养液混合搅拌均匀，封口，浸泡2小时，温度121℃高温灭菌20min，自然冷却，得到固体培养基；
（2.2）将液体摇瓶种子打散接种到所述固体培养基上；紧密封口，温度24～26℃、光照强度为1～200lux条件下，培养15～20d，菌丝铺满固体培养基表面；在温度24~26℃、光照强度为1～200lux条件下，继续培养25～30d出现子实体原基，至子实体不再生长并保持健壮的时候采收，即得到人工培养的古尼虫草子实体；人工培养的古尼虫草子实体质地致密，子座棒状，单生，或簇生，柄白色、淡黄色至鼠灰色，头部为灰白色至灰黑色，狭长卵型至柱状，单生，二叉分枝或簇生长，高度1～3cm，直径1～4mm。
所述斜面试管培养基的原料和重量配比为：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g、琼脂20g，加水至1000ml，自然pH。
所述液体摇瓶种子培养基的原料和重量配比为：马铃薯200g、葡萄糖10g、麦芽糖10g、蛋白胨10g、MgSO41.5g、KH2PO43g、柠檬酸三胺0.4g、复合维生素B280mg·L-1，加水至1000ml，自然pH。
所述子实体栽培营养液的原料和重量配比为：马铃薯200g、葡萄糖10g、麦芽糖10g、蛋白胨10g、MgSO41.5g、KH2PO43g、柠檬酸三胺0.4g、复合维生素B280mg·L-1，加水至1000ml，pH值为6.0～7.0。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：
1.采用本发明生产工艺，古尼虫草子实体的培养周期缩短为60~70d，比刘杰麟诱导古尼虫草子实体的3.5个月的培养周期缩短了40~50d，且培养方法简单便捷，更加有利于古尼虫草子实体的大规模生产。
2.本发明采用古尼虫草的无性型－古尼拟青霉（PaecilomycesgunniiZ.Q.Liang）作为子实体栽培菌种，目前对该菌种已经有很多研究，在提高机体免疫力、增强记忆、镇痛镇静等方面效果显著且为无毒性药物，特殊毒理表明，其没有致畸、致突变、致癌作用。
3.本发明采用对数生长期的液体摇瓶种子接种，子实体生长快、产量高；用无毒的罐头瓶和耐高温聚丙烯膜生产保证其安全性。
4.本发明所用的液体摇瓶种子培养基和子实体栽培营养液中含有碳源、氮源、矿质元素和维生素等丰富的营养成分，并且比例适宜，能够使古尼拟青霉快速生长。
5.本发明按料液比1g:2ml的比例，由20g小米或大米和40ml子实体栽培营养液配制成固体培养基，所得固体培养基营养丰富，湿度适宜，透气性好，最适宜古尼虫草子实体的生长。
6.本发明的每瓶70g固体培养基加入9～10ml的接种量利于古尼虫草子实体的生长，接种量较少，则菌丝生长较慢，接种量较大，则会增加环境湿度且培养基营养条件满足不了太多菌的生长。
7.本发明的古尼虫草子实体最佳培养条件为温度24～26℃，保持1～200lux的持续光照。低温环境会抑制菌丝体的生长从而影响原基分化，黑暗培养虽更利于菌丝生长但持续光照条件会刺激原基分化，有利于子实体的形成，光照强度过高则会抑制原基分化和子实体的生长。
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明作进一步地说明。
本发明所用菌种为古尼拟青霉（PaecilomycesgunniiZ.Q.Liang），保藏在中国科学院微生物菌种保藏中心，保藏号CGMCCNo.2682。
实施例1
一种人工培养古尼虫草子实体的具体操作步骤如下：
（1）菌种培养
（1.1）斜面菌种活化培养
将葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g和琼脂20g，加水至1000ml，混合均匀得到斜面培养基；
将古尼拟青霉菌（PaecilomycesgunniiZ.Q.Liang）点接于斜面试管培养基，接种量为4mm2大小的菌丝体方块，25℃培养7d，得到斜面菌种；
（1.2）液体摇瓶种子培养
将马铃薯200g、葡萄糖10g、麦芽糖10g、蛋白胨10g、MgSO41.5g、KH2PO43g、柠檬酸三胺0.4g和复合维生素B280mg·L-1，加水至1000ml，混合均匀，得到液体摇瓶种子培养基；
在100ml液体摇瓶种子培养基中接入斜面菌种，接种量为一试管铺满菌丝的斜面菌种，高速打散斜面菌种，在温度25℃、转速130r/min、黑暗条件下恒温震荡培养8d，得到液体摇瓶种子。
（2）子实体培养
（2.1）将马铃薯200g、葡萄糖10g、麦芽糖10g、蛋白胨10g、MgSO41.5g、KH2PO43g、柠檬酸三胺0.4g和复合维生素B280mg·L-1，加水至1000ml，混合均匀，得到子实体栽培营养液，pH值为5.0；
（2.2）将20g高粱和40ml子实体栽培营养液混合搅拌均匀，封口，浸泡2小时，温度121℃、灭菌20min，自然冷却，得到固体培养基；
将液体摇瓶种子打散接种到所述固体培养基上，每瓶70g固体培养基接8ml液体摇瓶种子液。紧密封口，温度25℃，黑暗培养15d，菌丝铺满固体培养基表面；在温度25℃、黑暗条件下继续培养，无子实体形成。
实施例2
一种人工培养古尼虫草子实体的具体操作步骤如下：
（1）菌种培养
（1.1）斜面菌种活化培养
将葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g和琼脂20g，加水至1000ml，混合均匀得到斜面培养基；
将古尼拟青霉菌（PaecilomycesgunniiZ.Q.Liang）点接于斜面试管培养基，接种量为4mm2大小的菌丝体方块，25℃培养7d，得到斜面菌种；
（1.2）液体摇瓶种子培养
将马铃薯200g、葡萄糖10g、麦芽糖10g、蛋白胨10g、MgSO41.5g、KH2PO43g、柠檬酸三胺0.4g和复合维生素B280mg·L-1，加水至1000ml，混合均匀，得到液体摇瓶种子培养基；
在100ml液体摇瓶种子培养基中接入斜面菌种，接种量为一试管铺满菌丝的斜面菌种，高速打散斜面菌种，在温度25℃、转速130r/min、黑暗条件下恒温震荡培养8d，得到液体摇瓶种子。
（2）子实体培养
（2.1）将马铃薯200g、葡萄糖10g、麦芽糖10g、蛋白胨10g、MgSO41.5g、KH2PO43g、柠檬酸三胺0.4g和复合维生素B280mg·L-1，加水至1000ml，混合均匀，得到子实体栽培营养液，pH值为6.0；
（2.2）将20g小米和40ml子实体栽培营养液混合搅拌均匀，封口，浸泡2小时，温度121℃、灭菌20min，自然冷却，得到固体培养基。
将液体摇瓶种子打散接种到所述固体培养基上，每瓶70g固体培养基接9ml的液体摇瓶种子液。紧密封口，温度25℃、光照强度为101～200lux条件下，培养18d，菌丝铺满固体培养基表面；在温度25℃、光照强度为101～200lux条件下，继续培养28d出现子实体原基，至60d子实体长满培养瓶，几乎不再生长并保持健壮的时候采收，即得到人工培养的古尼虫草子实体，子实体质地致密，子座棒状，单生，柄鼠灰色，头部为灰黑色，狭长卵型，单生，二叉分枝或簇生长，子实体鲜重1.9～2.2/瓶，高度2～2.5cm，直径2～3mm。
实施例3
一种人工培养古尼虫草子实体的具体操作步骤如下：
（1）菌种培养
（1.1）斜面菌种活化培养
将葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g和琼脂20g，加水至1000ml，混合均匀得到斜面培养基；
将古尼拟青霉菌（PaecilomycesgunniiZ.Q.Liang）点接于斜面试管培养基，接种量为4mm2大小的菌丝体方块，25℃培养7d，得到斜面菌种；
（1.2）液体摇瓶种子培养
将马铃薯200g、葡萄糖10g、麦芽糖10g、蛋白胨10g、MgSO41.5g、KH2PO43g、柠檬酸三胺0.4g和复合维生素B280mg·L-1，加水至1000ml，混合均匀，得到液体摇瓶种子培养基；
在100ml液体摇瓶种子培养基中接入斜面菌种，接种量为一试管铺满菌丝的斜面菌种，高速打散斜面菌种，在温度25℃、转速130r/min、黑暗条件下恒温震荡培养8d，得到液体摇瓶种子。
（2）子实体培养
（2.1）将马铃薯200g、葡萄糖10g、麦芽糖10g、蛋白胨10g、MgSO41.5g、KH2PO43g、柠檬酸三胺0.4g和复合维生素B280mg·L-1，加水至1000ml，混合均匀，得到子实体栽培营养液，pH值为7.0；
（2.2）将20g大米和40ml子实体栽培营养液混合搅拌均匀，封口，浸泡2小时，温度121℃、灭菌20min，自然冷却，得到固体培养基。
将液体摇瓶种子打散接种到所述固体培养基上，每瓶70g固体培养基接10ml的液体摇瓶种子液。紧密封口，温度25℃、光照强度为1～100lux条件下，培养20d，菌丝铺满固体培养基表面；在温度25℃、光照强度为1～100lux条件下，继续培养35d出现子实体原基，至70d子实体几乎不再生长并保持健壮的时候采收，即得到人工培养的古尼虫草子实体，子实体质地致密，子座棒状，单生，柄白色，头部为灰色，柱状，子实体鲜重1.3～1.5g/瓶，高度1.2～1.3cm，直径1.5～2mm。
Claims (6)
1.一种人工培养古尼虫草子实体的方法，其特征在于操作步骤如下：
（1）菌种培养
（1.1）斜面菌种活化培养
将古尼拟青霉菌（PaecilomycesgunniiZ.Q.Liang）点接于斜面试管培养基，24～26℃培养7～10d，得到斜面菌种；
（1.2）液体摇瓶种子培养
在液体摇瓶种子培养基中接入斜面菌种，高速打散斜面菌种，在温度24～26℃、转速120～140r/min、黑暗条件下恒温震荡培养8d，得到液体摇瓶种子；
（2）子实体培养
（2.1）按料液比1g:2ml的比例，将20g小米或大米和40ml子实体栽培营养液混合搅拌均匀，封口，浸泡2小时，温度121℃高温灭菌20min，自然冷却，得到固体培养基；
（2.2）将液体摇瓶种子打散接种到所述固体培养基上；紧密封口，温度24～26℃、光照强度为1～200lux条件下，培养15～20d，菌丝铺满固体培养基表面；在温度24~26℃、光照强度为1～200lux条件下，继续培养25～30d出现子实体原基，至子实体不再生长并保持健壮的时候采收，即得到人工培养的古尼虫草子实体；人工培养的古尼虫草子实体质地致密，子座棒状，单生，或簇生，柄白色、淡黄色至鼠灰色，头部为灰白色至灰黑色，狭长卵型至柱状，单生，二叉分枝或簇生长，高度1～3cm，直径1～4mm。
2.根据权利要求1所述的一种人工培养古尼虫草子实体的方法，其特征在于：所述斜面试管培养基的原料和重量配比为：葡萄糖40g、蛋白胨10g、酵母浸出粉10g、琼脂20g，加水至1000ml，自然pH。
3.根据权利要求1所述的一种人工培养古尼虫草子实体的方法，其特征在于：所述的液体摇瓶种子培养基的原料和重量配比为：马铃薯200g、葡萄糖10g、麦芽糖10g、蛋白胨10g、MgSO41.5g、KH2PO43g、柠檬酸三胺0.4g、复合维生素B280mg·L-1，加水至1000ml，自然pH。
4.根据权利要求1所述的一种人工培养古尼虫草子实体的方法，其特征在于：所述子实体栽培营养液的原料和重量配比为：马铃薯200g、葡萄糖10g、麦芽糖10g、蛋白胨10g、MgSO41.5g、KH2PO43g、柠檬酸三胺0.4g、复合维生素B280mg·L-1，加水至1000ml，pH值为6.0～7.0。
5.根据权利要求1所述的一种人工培养古尼虫草子实体的方法，其特征在于：步骤（1.2）中，在100ml液体摇瓶种子培养基中接入斜面菌种，接种量为一试管铺满菌丝体的斜面菌种。
6.根据权利要求1所述的一种人工培养古尼虫草子实体的方法，其特征在于：步骤（2.2）中，在70g固体培养基中接入9～10ml液体摇瓶种子。
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