DE68926893T2

DE68926893T2 - Verfahren zur Herstellung von clavulanic Säure

Info

Publication number: DE68926893T2
Application number: DE68926893T
Authority: DE
Inventors: Alison Jane Beecham Pharm Earl; John Edward Beecham Ph Hodgson; Ian Normansell
Original assignee: Beecham Group PLC
Current assignee: Beecham Group PLC
Priority date: 1988-06-02
Filing date: 1989-05-30
Publication date: 1997-01-23
Anticipated expiration: 2009-05-31
Also published as: EP0349121A2; EP0349121B1; ATE140971T1; DE68926893D1; EP0349121A3; GR3021071T3; ES2090036T3; PT90697A; GB8813055D0; JPH0242989A; US5759831A; PT90697B; JP3289726B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Moleküle, besonders rekombinante DNA- Moleküle, und insbesondere rekombinante Vektoren zur Verwendung bei der Transformation eines mikrobiellen Wirts, der inserierte DNA-Fragmente enthält, die ein oder mehrere Gene tragen, die an der Clavulansäurebiosynthese beteiligte Enzyme codieren.
Clavulansäure ist ein durch das mycelbildende Bakterium Streptomyces clavuligerus produzierter wirksamer β-Lactamase-Inhibitor (vgl. Reading C. und Cole M., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 11 (1977), 852-857) und eine Verbindung von großem klinischem Wert, da sie β-Lactamase-labile β-Lactam-Anübiotika vor Abbau schützt. Verfahren zur Erhöhung der Ausbeute (Titer) von Clavulansäure bei Fermentationsverfahren sind deshalb möglicherweise von großer wirtschaftlicher Wichtigkeit.
Ein mögliches Verfahren zur Lösung des Problems der Clavulansäureausbeuteverbesserung umfaßt die Anwendung gentechnischer DNA-Verfahren unter Verwendung von S. clavuligerus als Wirtszelle. In diesem Zusammenhang wurde vorgeschlagen, daß die Isolierung von an der Clavulansäurebiosynthese beteiligten Genen aus der chromosomalen DNA von S. clavuligerus ein möglicher Ausgangspunkt wäre (vgl. Bailey C.R. et al., Biotechnology 2 (1984), 808-811). Bis jetzt wurde jedoch kein spezifisches DNA-Molekül identifiziert, welches zur Steigerung des Clavulansäuretiters von Wert ist.
Obwohl von mehreren Enzymen angenommen wird, daß sie an der Clavulansäurebiosynthese beteiligt sind, wurde nur das Enzym Clavaminsäuresynthase (oder -synthetase) beschrieben. Clavaminsäuresynthase (nachstehend abgekürzt als CAS) ist eine 2-Oxoglutaratverknüpfte Oxygenase, die Proclavaminsäure in Clavaminsäure umwandelt (diese Stoffe sind Zwischenverbindungen im Clavulansäurebiosyntheseweg). Für weitere Einzeleinheiten vgl. die Veröffentlichungen von Elson S.W. et al., in J. Chem. Soc. Chem. Commun. (1987), Seiten 1736,1738 und 1739. Vgl. auch die Europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnr. 0 213 914.
Um die Erfindung klar zu definieren, wird Bezug genommen auf die beiliegenden Zeichnungen, wobei:
Figur 1 eine Restriktionskarte von DNA I ist;
Figur 2 eine Restriktionskarte von DNA II ist;
Figur 3 eine Restriktionskarte von DNA III ist;
Figur 4 eine Restriktionskarte von sieben von DNA III abgeleiteten Restriktionsfragmenten ist;
Figur 5a eine Restriktionskarte des rekombinanten Plasmids pBROC 41A ist;
Figur 5b eine Restriktionskarte des rekombinanten Plasmids pBROC 41 B ist; und
Figur 6 eine Restriktionskarte des rekombinanten Plasmids pBROC 31 ist.
Die Abkürzungen EcoRI, PstI, etc. in den Figuren entsprechen üblichen Abkürzungen für Restriktionsendonucleasen und es ist die ungefähre Länge der DNA in Kilobasen (kb) angegeben, die durch Meßexperimente mittels Agarosegelelektrophorese bestimmt wurde. Es ist selbstverständlich, daß die Figuren nicht notwendigerweise alle der möglichen Restriktionsschnittstellen zeigen, die in den veranschaulichten DNA-Fragmenten vorhandenen sind.
Gemäß einem ersten Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung DNA bereit, umfassend ein DNA-Fragment, das aus S. clavuligerus abgeleitet werden kann und mindestens ein Enzym codiert, das an der Clavulansäurebiosynthese beteiligt ist, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA etwa 60 kb lang ist und die im DNA-Fragment (I) in Figur I gezeigte Anordnung von Restriktionsschnittstellen aufweist.
Es ist erkennbar, daß die erfindungsgemäße DNA (I) nicht in ihrer "natürlichen" Form vorliegt (d.h. wie in der chromosomalen DNA von S. clavuligerus), sondern daß sie zur Abtrennung flankierender DNA gereinigt und isoliert wurde.
Der Vorteil der Erfindung ist, daß die DNA (I) ein oder mehrere an der Clavulansäurebiosynthese beteiligte Gene umfaßt, die wie nachstehend beschrieben zur Erhöhung der Ausbeute von Clavulansäure, die von einem zur Produktion von Clavulansäure befahigten Organismus produziert wird, verwendet werden können. Ein besonderer Vorteil ist, daß der Clavulansäuretiter bei Wildtyp-Streptomycesarten, zum Beispiel S. clavuligerus ATCC 27064, das natürlicherweise dazu neigt, nur sehr geringe Mengen von Clavulansäure zu produzieren, erheblich gesteigert werden kann.
Bestimmte Restriktionsfragmente der DNA (I) können ebenfalls in der vorstehenden Weise verwendet werden, mit der Maßgabe, daß sie ein oder mehrere Gene enthalten, die an der Clavulansäurebiosynthese beteiligt sind.
Demgemäß kann die erfindungsgemäße DNA eine DNA sein, die ein Subfragment der in Figur 1 gezeigten DNA (I) ist, z.B. ein Subfragment, das identisch mit oder selbst ein Subfragment der in Figur 3 gezeigten DNA (III) ist.
Das erfindungsgemäße Subfragment kann durch Spalten der DNA (I) mit geeigneten Restriktionsenzymen mittels bekannten Verfahren abgeleitet werden. Erfindungsgemäße Subfragmente können auch durch Spalten größerer DNA-Subfragmente mit geeigneten Restriktionsenzymen oder durch Ligieren kleinerer Subfragmente unter Anwendung bekannter Verfahren hergestellt werden.
Ein bevorzugtes Subfragment weist die in der DNA (III) in Figur 3 gezeigte Anordnung von Restriktionsschnittstellen auf oder ist ein Subfragment davon.
Bestimmte Subfragmente der DNA (III) umfassen jene in Figur 4 gezeigten, nämlich:
a) EcoRI BamHI - Fragment (IV);
b) BclI - BclI - Fragment (V);
c) BclI - BclI - Fragment (VI);
d) BglII - BglII - Fragment (VII)
e) BglII - BglII - Fragment (VIII);
f) BglII - BglII - Fragment (IX);
g) SphI - SphI - Fragment (X).
Mittels geeigneten, nachstehend beschriebenen Experimenten wurde festgestellt, daß die in Figur 1 gezeigte DNA (I) eine Sequenz umfaßt, welche die Clavaminsäuresynthaseaktivität codiert.
Entsprechend ist die DNA der vorliegenden Erfindung gemäß einem anderen Gesichtspunkt eine DNA, die ein Gen umfaßt, das ein Protein mit Clavaminsäuresynthaseaktivität codiert.
Das Gen für die Clavaminsäuresynthaseaktivität befindet sich innerhalb des in Figur 4 gezeigten DNA-Fragments (IX) und demgemäß ist das DNA-Fragment (IX) ein anderes bevorzugtes erfindungsgemäßes Subfragment.
Es ist selbstverständlich, daß die Erfindung DNA umfaßt, die nicht die genaue in den Figuren 1 bis 4 veranschaulichte Anordnung von Restriktionsschnittstellen aufweist, falls die DNA durch Standardverfahren, einschließlich Nucleotiddeletion, -substitution, -addition oder -inversion von der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen DNA abgeleitet wurde.
Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße DNA aus S. clavuligerus ATCC 27064 abgeleitet; die Figuren 1 bis 4 zeigen die S. clavuligerus-DNA.
Die Erfindung umfaßt auch DNA-Sequenzen, die, obwohl sie aus S. clavuligerus abgeleitet werden können, aus geeigneten zur Produktion von Clavulansäure befähigten Organismen erhalten werden, die von S. clavuligerus verschieden sind, wobei die Sequenzen nicht die in den Figuren 1 bis 4 veranschaulichte Anordnung von Restriktionsschnittstellen aufweisen, die jedoch vorzugsweise unter Bedingungen hoher Stringenz mit der in Figur 3 gezeigten DNA (III) oder einem Subfragment davon hybridisieren und die ein an der Clavulansäurebiosynthese beteiligtes Enzym codieren.
Andere bekannte zur Produktion von Clavulansäure befähigte Organismen umfassen S. jumonjinensis ATCC 29864 und S. katsurahamanus T-272.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt stellt die Erfindung rekombinante DNA bereit, umfassend DNA nach einem der erfindungsgemäßen Gesichtspunkte wie vorstehend beschrieben.
Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße rekombinante DNA in einem rekombinanten Vektor und stärker bevorzugt in einem Vektor enthalten, der zur Transformation befähigt ist und eine autonome Replikation in einem zur Produktion von Clavulansäure befähigten Organismus durchläuft, oder in einem Vektor, aus dem inserierte DNA in das Chromosom des zur Produktion von Clavulansäure befahigten Organismus über homologe Rekombination integriert werden kann.
Gemäß einem bevorzugten Gesichtspunkt ist der rekombinante Vektor ein zu einer hohen Expression befähigter Vektor.
Die DNA nach einem der Gesichtspunkte dieser Erfindung kann in jeden geeigneten Vektor durch auf dem Fachgebiet gut bekannte Verfahren eingeschleust werden, zum Beispiel durch direkte Kombination kohäsiver Enden, Versehen mit einem Homopolymerschwanz ("homopolymer tailing") oder durch ein Linker- oder Adaptermolekül.
Gemäß einem bevorzugten Gesichtspunkt wird der Vektor aus einem Streptomyceten abgeleitet.
Spezifische Beispiele solcher Vektoren schließen die folgenden ein
1) pIJ913 (Molekulargewicht 15,7 Megadaltons), ein bei Lydiate D.J. et al., Gene 35 (1985), 223-235, beschriebener Vektor mit niedriger Kopienzahl;
2) PIJ702 (Molekulargewicht 3,7 Megadaltons), ein bei Katz E. et al. J. Gen. Microbiol. 129 (1983), 2703-2714, beschriebener Vektor mit hoher Kopienzahl; und
3) pIJ680, beschrieben von Hopwood et al. (1985), Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, The John Innes Foundation.
Der Vektor kann auch aus einem Nicht-Streptomyceten abgeleitet werden; zum Beispiel dem Cosmid pTCF (Grosveld et al., Nucleic Acids Research 10 (1982), 6715-6732) oder dem Plasmid pAT153 (Twigg A.J. und Sherratt D., Nature 283 (1980), 216-218).
Es ist bekannt, daß gemäß den vorstehenden Verfahren hergestellte rekombinante Vektoren die inserierte DNA in einer von zwei möglichen Orientierungen enthalten können. Rekombinante Vektoren mit beiden Orientierungen sind im Schutzumfang der Erfindung eingeschlossen. Folglich weisen, falls das inserierte DNA-Fragment die in (IV) (Figur 4) gezeigte Anordnung von Restriktionsschnittstellen aufweist und der Plasmidvektor, in das es eingeschleust wurde, pIJ913 ist, die Restriktionskarten der erhaltenen rekombinanten Plasmide, die als pBROC 41A und pBROC 418 bezeichnet werden, beispielsweise die in den Figuren 5(a) und 5(B) gezeigte Struktur auf. Von diesen Plasmiden wird pBROC 41B [Figur 5(b)] bevorzugt.
Ein bevorzugter rekombinanter Vektor, der durch Insertion der DNA (III) in Figur 3 in pAT153 hergestellt werden kann, ist in Figur 6 gezeigt und wird bezeichnet als pBROC 31.
Andere bevorzugte erfmdungsgemäße Vektoren umfassen jene, die als pWOR10 (konstruiert durch Ligieren des DNA-Fragments (IX), wie vorstehend definiert, in die BamHI-Stelle von pIJ680) und pBROC 44 (konstruiert durch Ligieren des gleichen DNA- Fragments (IX) in die BglII-Stelle von pIJ702) bezeichnet werden. In pWOR10 ist die einzigartige BclI-Stelle in Fragment (IX) 2,45 kb von der einzigartigen XhoI-Stelle in dem pIJ680-Vektor entfernt. In pBROC 44 ist die einzigartige BclI-Stelle in Fragment (IX) 3 kb von der einzigartigen BamHI-Stelle des pIJ702-Vektors entfernt.
Die insertierte DNA in einem Vektor kann in einem anderen Vektor durch Standardverfahren subcloniert werden. Beispielsweise kann das rekombinante Plasmid pBROC 41B, gekennzeichnet wie in Figur 5(b) gezeigt, wie folgt erhalten werden:
a) Isolierung des großen EcoRI-EcoRI-Segments (14,35 kb) aus pBROC 31 (Figur 6) durch Spalten mit EcoRI; und
b) Ligierung des vorstehenden EcoRI-EcoRI-Segments mit pIJ913, das durch Spalten mit EcoRI linearisiert wurde.
Zur Herstellung der DNA und der rekombinanten Vektoren der Erfindung kann eine statistische Anordnung chromosomaler DNA-Fragmente durch partielle Spaltung von S. clavuligerus (ATCC 27064)-DNA mit irgendeinem geeigneten Restriktionsenzym erzeugt werden. Die Endonuclease MboI und deren Isoschizomeren können für diesen Zweck besonders geeignet sein.
Die DNA-Fragmente können dann auf einem Salzgradient der Größe nach fraktioniert werden und Fraktionen mit Fragmenten von etwa 35 bis 45 kb Länge können verwendet werden (vgl. Grosveld et al., Nucleic Acids Research 10 (1982), 6715-6732). Die DNA- Fragmente können dann durch übliche "Schrotschuß"-Verfahren mit einem gespaltenem Vektor ligiert werden, wobei eine "Clonbank" erzeugt wird.
Falls gewünscht, können kleinere Fragmente, zum Beispiel mit einer Länge von 10 kb oder mehr, durch Größenfraktionierung auf einem Agarosegel mittels elektrophoretischer Elution erhalten werden. Diese kleineren DNA-Fragmente können dann zur Herstellung einer Clonbank, wie vorstehend beschrieben, verwendet werden.
Der zur Herstellung der Clonbank verwendete Vektor kann ein Cosmid sein (zum Tragen großer DNA-Stücke befähigt), und für diesen Zweck ist das Cosmid pTCF (vgl. Grosveld et al., vorstehend zitiert) besonders geeignet.
Das Plasmid pAT153 kann ebenfalls vorteilhafterweise zur Herstellung einer Clonbank zum Tragen kleinerer DNA-Stücke verwendet werden.
Eine wie vorstehend beschrieben hergestellte Clonbank kann dann mit üblichen Verfahren unter Verwendung eines DNA-Stücks als Hybridisierungssonde untersucht werden, das bei der Insertion in einen geeigneten Vektor und der Einschleusung in einen nichtproduzierenden Mutantenstamm eines zur Produktion von Clavulansäure befähigten Wirts (eine "blockierte" Mutante) befähigt ist, die Fähigkeit des Wirts Clavulansäure zu synthetisieren wiederherzustellen. Es ist erkennbar, daß die Sonde radioaktiv markiert ist, zum Beispiel mit ³²P, und entweder das DNA-Stück selbst umfaßt oder aus einem Vektor besteht, der die DNA enthält, mit der Maßgabe, daß der Vektor keine nennenswerte Homologie mit dem zur Herstellung der mittels Sonde zu untersuchenden Clonbank aufweist.
Geeignete Sonden können durch das von Bailey C.R. et al. in Biotechnologv 2 (1984), 808-811, beschriebene Verfahren isoliert werden.
Eine bevorzugte Sonde ist das von Bailey C.R. et al. (vorstehend zitiert) beschriebene Plasmid pWOR1.
Zur Ausführung des in Biotechnology 2 (1984), 808-811, beschriebenen Verfahrens ist es erforderlich, daß S. clavuligerus dc1C8 zur Verfügung steht, ein mutierter Stamm von S. clavuligerus, dem die Fähigkeit zur Produktion von Clavulansäure fehlt. Die die Hinterlegung, Gewinnung und Eigenschaften von S. clavuligerus dc1CB betreffenden Einzelheiten sind wie folgt.

Hinterlegung

Der Stamm S. clavuligerus dc1C8 wurde bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, Schottland, am 19. Februar 1986 hinterlegt (Hinterlegungsnummer NCIB 12209), wobei die Hinterlegung gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren erfolgte.

Gewinnung von S. clavuligerus NCIB 12209

Die Analyse einer Probe von S. clavuligerus ATCC 27064 zeigte eine Vielzahl von Morphologien. Vierzehn verschiedene Arten wurden identifiziert. Eine von diesen wurde als S. clavuligerus SC2 isoliert.
Die Behandlung von S. clavuligerus SC2 mit 10 µM Ethidiumbromid wurde dann in Petrischalen ausgeführt und die Platten wurden 10 Tage inkubiert. Überlebende Zellen wurden auf eine Clavulansäureproduktion untersucht. Ein Isolat, das keine nachweisbaren Mengen von Clavulansäure bei der Analyse mit HPLC (Nachweis bei 230 nm) produzierte, wurde als Stamm dclC8 bezeichnet und unter der Hinterlegungsnummer NCIB 12209 wie vorstehend beschrieben hinterlegt.
S. clavuligerus NCIB 12209 ist ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung.

Taxonomie von S. clavuligerus NCIB 12209

Es wurde festgestellt, daß die taxonomischen und morphologischen Eigenschaften von S. clavuligerus NCIB 12209 im wesentlichen denjenigen von S. clavuligerus ATCC 27064 entsprechen, eine Beschreibung davon kann man im US-Patent 3,862,008 und auch bei Higgens C.E. und Kastner RE., Int. J. Systematic Bacteriol. 21(1971), 326-331, finden.
Nach dem Untersuchen einer wie vorstehend beschrieben hergestellten Clonbank mit einer geeigneten Hybridisierungssonde, zum Beispiel pWOR1, die der insertierten DNA entspricht oder sie umfaßt, kann die erfindungsgemäße DNA dann durch Standardverfahren subcloniert oder wie vorstehend beschrieben gespalten werden.
Falls ein ungeeignetes oder ein zu kurzes DNA-Stück aus dem Analyseschritt mittels Sonde erhalten wird, kann das neu isolierte DNA-Fragment selbst als Hybridisierungssonde (nach radioaktiver Markierung durch übliche Verfahren, z.B. Nicktranslation) zur Identifizierung weiterer positiver Kolonien in der Clonbank verwendet werden, deren insertierte DNA durch eine Kartierung mit Restriktionsenzymen analysiert und, falls erforderlich, durch Spaltung mit geeigneten Restriktionsenzymen modifiziert werden kann.
Das vorstehende Verfahren kann wiederholt werden, bis die benötigte erfindungsgemäße DNA isoliert ist.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt stellt die Erfindung einen Wirt bereit, der durch einen erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor transformiert wurde.
Der Wirt kann durch Standardverfahren transformiert werden.
Gemäß einem Gesichtspunkt kann der Wirt ein Nichterzeuger von Clavulansäure sein, zum Beispiel E. coli oder S. lividans. Solche Wirte können bei genetischen Manipulationsverfahren wertvoll sein und vorteilhafterweise zur Expression großer Mengen von an der Clavulansäurebiosynthese beteiligten Enzymen verwendet werden, zum Beispiel eines Enzyms mit CAS-Aktivität.
Bevorzugte Wirte sind jedoch jene, die bei der Züchtung in einem geeigneten Medium natürlicherweise zur Produktion von Clavulansäure befähigt sind, oder nicht-produzierende Mutanten davon mit einer Blockade der Clavulansäurebiosynthese, die die erfindungsgemäße DNA dann beseitigen kann, so daß die Clavulansäuresynthese wiederhergestellt und vorzugsweise gesteigert wird. Bevorzugte Wirte dieses Typs sind Streptomyceten, einschließlich S. clavuligerus ATCC 27064, S. jumonjinensis ATCC 29684 und S. katsurahamanus T-272, oder sind daraus abgeleitet.
Der Vorteil der Verwendung solcher Wirte ist, daß unter geeigneten Bedingungen ein erhöhter Titer von Clavulansäure nach einer Transformation mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor erzielt werden kann.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Clavulansäure in einem Wirt bereit, der natürlicherweise zur Produktion von Clavulansäure befähigt ist oder der eine blockierte nicht-produzierende Mutante dieses Wirts ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:
(a) Transformation des Wirts oder einer nicht-produzierenden Mutante davon mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor; und
(b) Züchtung der so gebildeten Transformanten unter geeigneten Bedingungen, so daß die Produktion von Clavulansäure stattfindet.
Allgemeine Verfahren zur Züchtung eines zur Produktion von Clavulansäure befähigten Organismus zur Gewinnung von Clavulansäure werden in der UK-Patentbeschreibung Nr.1,508,977 angegeben.
Bei dem vorstehenden Verfahren ist der Wirt vorzugsweise S. clavuligerus ATCC 27064 oder ist daraus abgeleitet.
Der bei dem vorstehenden Verfahren vorzugsweise verwendete rekombinante Vektor ist pWOR1.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

Beispiel 1

Konstruktion einer DNA-Bank von S. clavuligerus ATCC 27064 in dem Cosmidvektor pTCF

Chromosomale DNA von S. clavuligerus ATCC 27064 wurde isoliert, wie in der Europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnr. 0 233 715 beschrieben. Drei Aliquots von 20 µg chromosomaler DNA wurden mit MboI (0,5 Einheiten pro µg DNA) 5 Minuten, 10 Minuten und 15 Minuten unter Standardbedingungen partiell gespalten. Die drei Aliquots wurden vereinigt und auf einem Salz (1,25 M bis 5 M NACl)/Tris-EDTA-Gradienten fraktioniert und 3 Stunden bei 39 K Upm in einem SW40. 1-Beckmanrotor zentrifugiert.
Zwölf Fraktionen wurden gewonnen und die isolierten DNAs aus den Fraktionen 5 bis 9 ergaben 10 µg MboI-DNA-Fragmente mit einer Größe von etwa 35 bis 45 kb.
Die Präparation von pTCF-Vektorteilen wurde gemäß Grosveld F.G., Lund T., Murray E.J., Mellor A.L., Dahl H.H. und Flavell R.A., Nucleic Acids Research 10 (1982), 6715-6732, ausgeführt.
S. clavuligerus-DNA-Fragmente und Vektorteile wurden in einem Verhältnis von 5:3:3 miteinander ligiert, die Mischung wurde verpackt und zur Transduktion von E. coli ED8767 verwendet, wie bei Grosveld et al. (vorstehend zitiert) beschrieben. Dieses Verfahren ergab 4 x 10&sup6; Kolonien pro µg verpackter DNA.

Beispiel 2

Herstellung von DNA I

5000 E. coli ED8767-Kolonien mit pTCF mit S. clavuligerus ATCC 27064-DNA- Insertionen wurden auf Nitrocellulosefiltern immobilisiert und lysiert. Das Plasmid pWOR1 (Bailey C.R. et al. (vorstehend zitiert)) wurde isoliert, nicktranslatiert und zur Analyse der Filter mittels Sonde durch Standardkoloniehybridisierungsverfahren verwendet.
Zwei zur Hybridisierung befähigte Kolonien wurden gewonnen, die vereinigt das in Figur 1 veranschaulichte 60 kb große DNA I-Segment enthalten.

Beispiel 3

Konstruktion einer DNA-Bank von S. clavuligerus ATCC 27064 in pAT153

Chromosomale DNA von S. clavuligerus ATCC 27064 wurde isoliert, wie in der Europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnr. 0 233 715 beschrieben.
60 µg der S. clavuligerus ATCC 27064-DNA wurden mit MboI partiell gespalten und auf einem Agarosegel fraktioniert. Die DNA wurde aus Fraktionen mit Fragmenten einer Größe von > 10 kb durch elektrophoretische Elution isoliert, wie von Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. (1982), Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Habor Laboratory), beschrieben.
10 µg pAT153 (Twigg und Sherratt (vorstehend zitiert)) wurden mit BamHI gespalten und mit alkalische Phosphatase aus Kälberdarm behandelt, um endstständige Phosphatgruppen zu entfernen und einer Rezirkularisierung vorzubeugen. Der Vektor und die > 10 kb großen DNA-Fragmente von S. clavuligerus ATCC 27064 wurden miteinander ligiert und zur Transforrnation von E. coli DH1 verwendet.

Beispiel 4

Herstellung von DNA III

6000 E. coli DH1-Kolonien mit pAT153 mit S. clavuligerus ATCC 27064-Insertionen wurden auf Nitrocellulosefiltern immobilisiert und lysiert. Das 2,2 kb große SphI- BglII-Insertionsfragment aus pWOR1 [Stellen 3 bis 4 in Figur 3 von Bailey et al. (vorstehend zitiert)] wurde isoliert, nicktranslatiert und zur Analyse der Filter mittels Sonde durch Standardkoloniehybridisierungsverfahren verwendet.
Eine zur Hybridisierung befähigte Kolonie wurde gewonnen, die das in Figur 3 veranschaulichte 13,1 kb große DNA III-Fragment enthält.

Beispiel 5

Erhöhung des Clavulansäuretiters im S. clavuligerus-Stamm SC2 durch das Plasmid pWOR10

Das Plasmid pWOR10 wurde durch Ligation des BglII-BglII-Fragments (IX) (Figur 4) in die BamHI-Stelle von pIJ680 konstruiert (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces (1985), A Laboratory Manual, The John Innes Foundation).
Das Plasmid pWOR10 wurde in S. clavuligerus SC2 (Wildtyp-Neuisolat) durch ein Verfahren eingeschleust, das dem bei Bailey C.R. et al. (vorstehend zitiert) beschriebenen entspricht. Transformanten wurde ausgewählt und auf MSD-Medium (1,0% Dextrin; 0.1% K&sub2;HPO&sub4;; 0,1% MGSO&sub4;; 0,1% NaCl; 0,1% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;; 0,4% CaCO&sub3;; Spurenelemente (0,0001% FeSO&sub4;; 0,0001% MnCl&sub2;; 0,0001% ZnSO&sub4;); 2,0% Agar) mit 5 µg/ml Thiostrepton wieder ausgestrichen. Zellen einer jeden Transformante wurden auf M5D aufgebracht und 6 Tage bei 26ºC gezüchtet.
Die Biotestplatten wurden dann mit den Stamm Klebsiella areogenes enthaltendem weichem Blutagar (Oxoid) übergossen, wie bei Reading C. und Cole M. in Antimicrob. Agents Chemother 11 (1977), 852-857, beschrieben (4% Tetrazoliumsalze und 5 µg/ml Penicillin G). Nach Inkubation über Nacht bei 26ºC wurden die Hemmzonen gemessen. Diejenigen Transformanten, die größere Zonen als die Kontrollkultur zeigten, wurden zur genauen Titerbeurteilung in eine Schüttelflaschenkultur überführt. Die Zellen wurden in 25 ml eines geeigneten Impfmediums überimpft, wie in der UK-Patentbeschreibung Nr. 1,508,977 beschrieben, und 3 Tage bei 26ºC unter Schütteln gezüchtet. 1 ml der Impfkultur wurde auf ein Medium für den letzten Entwicklungsschritt überimpft, wie in der UK-Patentbeschreibung Nr.1,508,977 beschrieben, und bei 26ºC vier Tage gezüchtet.
Proben der Kulturbrühe wurden nach drei und vier Tagen Wachstum entfernt und auf eine Clavulansäureproduktivität untersucht, wie bei Bird A.E. et al., Analyst 107 (1982), 1241-1245, und Foulstone M. und Reading C., Antimicrob. Agents Chemother. 22 (1982), 753-762, beschrieben.

Ergebnisse

Von den 21 untersuchten Isolaten zeigte eines erhöhte Titer verglichen mit der S. clavuligerus SC2-Ausbeute, wobei ein Vorteil von bis zu 53% bei in Abwesenheit von Thiostrepton gezüchteten Kulturen und ein Vorteil von 39% bei in Gegenwart von Thiostrepton gezüchteten Kulturen erzielt wurde. In allen Fällen wurde festgestellt, daß das autonome Plasmid pWOR10 vorhanden ist.

Beispiel 6

Transformation von S. lividans mit pBROC 44

pBROC 44 wurde durch Ligierung des BglII-BglII-Fragrnents (IX) (Figur 4) in die BglII-Stelle von pIJ702 hergestellt (vgl. Hopwood et al. (vorstehend zitiert)).
S. lividans-Sporen wurden auf 25 ml Protoplastenimpfmedium (Trypton-Sojabrühe (TSB) + 1% Maltose) in einer 250 ml-Schüttelflasche überimpft und 3 Tage bei 30ºC unter Schütteln inkubiert. 1 ml der Impfkultur wurde in ein den letzten Schritt der Protoplastenbildung förderndes Medium [umfassend 15 ml YEME (Hopwood et al. (vorstehend zitiert) mit 1% Maltose plus 10 ml TSB plus 0,5% Glycin plus 1% Maltose] in einer 250 ml-Schüttelflasche mit einer Spiralfeder überführt. Die Inkubation (16 Stunden) bei 30ºC erfolgte über Nacht. Die Kultur wurde in sterilen Zentrifugenröhrchen geerntet und das Mycel wurde in 10,3% Saccharose gewaschen. Das Zellpellet wurde in 1,5 ml Lysozymgemisch resuspendiert und bei 25ºC l Stunde unter gelegentlichem Mischen inkubiert. Die Protoplastenbildung wurde mit einem Mikroskop überwacht. Protoplastenpuffer (PB) (4 ml) (Hopwood et al. (vorstehend zitiert)) wurde zugegeben und beigemischt und die Zellsuspension wurde dann durch sterile Baumwollfilter gefiltert. Die Protoplastensuspension wurde zentrifugiert, kurz in PB gewaschen und schließlich in 2 ml PB resuspendiert. Die Protoplastenkonzentration wurde unter Verwendung einer Thoma-Zählkammer bestimmt.
4 x 10&sup9; Protoplasten wurden in ein frisches Zentrifugenröhrchen eingebracht, 5 ml PB wurden zugegeben und die Protoplasten wurden durch Zentrifugation pelletiert. Die Protoplasten wurden in etwa 400 µl PB resuspendiert. 5 µl Ligierungsgemisch wurden der Protoplastensuspension zugegeben und innerhalb von 30 Sekunden wurden 0,5 ml Transformationspuffer zugegeben (Hopwood et al. (vorstehend zitiert), Seite 246).
Nach 10 Sekunden wurden 5 ml PB zugegeben und die Protoplasten wurden abzentrifugiert.
Die Protoplasten wurden in 1 ml PB resuspendiert und Verdünnungen in PB wurden absteigend bis zu einer Konzentration 10&supmin;³ hergestellt. Proben von 0,1 ml einer jeden Verdünnung wurden auf das Regenerationsmedium R2YE ausplattiert, vgl. Thompson C.J., Ward J.M. und Hopwood D.A., Nature 286 (1980), 525-527. Die Agarplatten wurden bei 30ºC inkubiert. Nach 20 Stunden wurden die Platten mit 2 ml weichem Nähragar mit 500 µg/ml Thiostrepton übergossen. Die Agarplatten wurden für weitere 3 Tage inkubiert. Thiostrepton-resistente Transformanten wurden aus den Regenerationsplatten entnommen und wieder auf frischem R2YE-Agar ausgestrichen. Nach 3 bis 4 Tagen Wachstum wurden die Transformanten auf ein Impfmedium mit 50 µg/ml Thiostrepton überimpft und unter Schütteln 2 Tage bei 30ºC gezüchtet. Das Plasmid wurde gemäß dem Verfahren von Hopwood et al. (vorstehend zitiert) isoliert. Das richtige als pBROC 44 bezeichnete Konstrukt wurde durch Restriktionsendonucleasespaltung bestätigt, wie von Maniatis et al. (1982) (vorstehend zitiert) beschrieben.

Beispiel 7

Nachweis der Clavaminsäuresynthaseaktivitat in mit pBROC 44 transformierten S. lividans- Zellen
Die nachstehend beschriebenen Experimente zeigen das Vorhandensein einer Clavaminsäuresynthase(CAS)-Aktivität in S. lividans-Zellen, die durch pBROC 44 transformiert wurden (Beispiel 6). Drei Kulturen wurden untersucht:
(i) S. lividans-Wirt;
(ii) S. lividans mit pIJ702; und
(iii) S. lividans mit pBROC 44 (Beispiel 6).
Die Kulturen (i) und (ii) dienten als negative Kontrollen für (iii).
Da der Vektor pIJ702 einen Locus für die Thiostreptonresistenz enthält, wurden die zwei diesen Vektor enthaltende Kulturen in Gegenwart von Thiostrepton (50 µg/ml) gezüchtet. Der Wirt selbst wurde ohne Thiostrepton gezüchtet.
Das verwendete Medium wies folgende Zusammensetzung auf:
Difco-Hefeextrakt 3 g
Difco-Bactopepton 3g
Oxoidmalzextrakt 3g/l Liter H&sub2;O
Glucose 10g
Saccharose 340g
und wurde nach dem Autoklavieren mit MgCl&sub2; und Glycin bis zu Endkonzentrationen von 5 mM bzw. 50 mM ergänzt.
Das Medium wurde mit einem einzelnen Agarpropfen aus einer Sporenplatte beimpft und die Kulturen wurden in gefederten 250 ml- oder 500 ml-Schüttelflaschen bei 31ºC gezüchtet.
Das Mycel wurde durch Zentrifugation nach 48 Stunden Wachstum geerntet und zur Freisetzung intrazellulärer Enzyme im gleichen Volumen von 50 mM Tris-HCl/10 mM MgCl&sub2;/10 mM KCl/10% Glycerin/l mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)/pH 7,5 beschallt (3 Stöße von je 5 sec).
Zur Untersuchung der CAS-Aktivität wurde das zentrifugierte Beschallungsprodukt (115µl) mit Fe²&spplus; (15 µl, 10 mM), α-Ketoglutarat (15 µl, 10 mM) und dem Substrat für CAS [5-Amino-3-hydroxy-2-(2-oxoazetidin-1-yl)valerat; Proclavaminsäure, wie in der EP-A- 0 213 914 beschrieben] (5 µl, 5 mg/ml) 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit Imidazol (37,5 µl, 20%, pH 6,8) für 10 Minuten und im Anschluß daran erfolgte der Nachweis des gewonnenen Produkts durch HPLC unter Verwendung einer 30 cm großen Waters-C18-Säule, äquilibriert in 0,1 M NaH&sub2;PO&sub4;/6% MeOH/pH 3,2 bei 2 ml/min, wobei der Nachweis bei 312 nm erfolgte. Eine Weichgelpermeationschromatographie wurde bei 4ºC unter Verwendung einer 2,6 cm x 45 cm großen Säule von Ultrogel AcA 54, äquilibriert in Beschallungspuffer (vgl. vorstehend) bei 20 ml/Std, durchgeführt. Die Fraktionen wurden wie vorstehend auf eine CAS-Aktivität untersucht. Die Proteinanalysen wurden gemäß dem Verfahren von Bradford, Analytical Biochem. 72 (1976), 248-245, durchgeführt.

Ergebnisse

Kulturen von S. lividans allein, S. lividans mit dem Vektor pIJ702 und mit pBROC 44 transformierten S. lividans-Zellen wurden 48 Stunden gezüchtet, wobei eine trübe Brühe erhalten wurde. Das Mycel einer jeden Kultur wurde geerntet und beschallt und die zentrifugierten Beschallungsprodukte wurden auf CAS-Aktivität untersucht. Die HPLC- Daten zeigten, daß die mit pBROC 44 transformierten S. lividans-Zellen einen HPLC-Peak mit den folgenden Eigenschaften erzeugen:
(i) er eluiert zusammen mit dem Standard für Clavaminsäure (2,5 min);
(ii) er fehlt in den zwei Kontrollkulturen (S. lividans allein und S. lividans mit pIJ702 ohne die Insertion); und
(iii) er fehlt, wenn die mit pBROC 44 transformierte Kultur in Abwesenheit von entweder Fe²&spplus;, α-Ketoglutarat oder dem Substrat untersucht wird.
Dieser Beweis zeigt, daß die mit pBROC 44 transformierte Kultur eine CAS- Aktivität erzeugt.
Es wurde festgestellt, daß die spezifische Aktivität des aus S. lividans/pBROC 44 gereinigten CAS 0,0036 µMol/min/mg Protein beträgt. Dies ist vergleichbar mit Werten zwlschen 0,008 und 0,06 µMol/min/mg Protein für die CAS aus S. clavuligerus ATCC 27064 Neuisolat SC2). Obwohl die spezifische Aktivität der donierten CAS etwas geringer ist als die von nativer CAS, zeigen die Daten, daß das Enzym im Hinblick auf die Translation intakt ist und daß pBROC 44 das vollständige CAS-Gen enthält.

Claims

1. DNA, umfassend ein DNA-Fragment, das aus S. clavuligerus abgeleitet werden kann und mindestens ein Enzym codiert, das an der Clavulansäurebiosynthese beteiligt ist, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA etwa 60 kb lang ist und die im DNA-Fragment (I) in Figur 1 gezeigte Anordnung von Restriktionsschnittstellen aufweist.

2. Subfragment der DNA nach Anspruch 1, wobei das Subfragment identisch mit oder selbst ein Subfragment des in Figur 3 gezeigten DNA-Fragments (III) ist.

3. DNA nach Anspruch 1 oder 2, umfassend ein Gen, das ein Protein mit Clavaminsäuresynthaseaktivität codiert.

4. DNA nach Anspruch 2 oder 3, wobei die DNA die in DNA- Fragment (IX) in Figur 4 gezeigte Anordnung von Restriktionsschnittstellen besitzt.

5. DNA-Sequenz nach Anspruch 3, die mit dem DNA-Fragment (III) mit der in Figur 3 gezeigten Anordnung von Restriktionsschnittstellen oder einem Subfragment davon hybridisiert und die ein Enzym mit Clavaminsäuresynthaseaktivität codiert.

6. DNA, die durch Nucleotiddeletion, -substitution, -insertion oder -inversion von einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 abgeleitet ist.

7. DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die von S. clavuligerus abgeleitet ist.

8. Rekombinanter Vektor, umfassend eine rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 7.

9. Vektor nach Anspruch 8, der ein zu einer hohen Expression befähigter Vektor ist.

10. Wirt, transformiert mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 8 oder 9.

11. Wirt nach Anspruch 10, der ein Streptomycet oder ein E. coli ist.

12. Streptomyceswirt nach Anspruch 11, der natürlicherweise zur Produktion von Clavulansäure befähigt ist.

13. Wirt nach Anspruch 11 oder 12, der S. clavuligerus ATCC 27064, S. jumonjinensis ATCC 29864, S. katsurahamanus T- 272 oder eine Mutante davon ist.

14. Verfahren zur Produktion von Clavulansäure in einem Wirt, der natürlicherweise zur Produktion von Clavulansäure befähigt ist oder der eine blockierte nicht-produzierende Mutante dieses Wirts ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

(a) Transformation des Wirts oder einer nicht-produzierenden Mutante davon mit einäm Vektor nach Anspruch 8 oder 9; und

(b) Züchtung der so gebildeten Transformanten unter entsprechenden Bedingungen, so daß die Produktion von Olavulansäure stattfindet.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Transformanten einen Wirt nach Anspruch 13 umfassen.

16. S. clavuligerus-Stamm NCIB 12209.