JPH0242989A - クラバラン酸の生合成遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 この発明は、ＤＮＡ分子、特に組換え体ＤＮＡ分子に関
し、更に詳しくはクラバラン酸の生合成に関与する酵素
をコードする１つ以上の遺伝子を有する挿入ＤＮＡ断片
をもつ微生物宿主の形質転換に用いろ組換え体ベクター
に関する。

（ロ）従来の技術及び発明か解決しようとする課題 クラバラン酸は、菌糸型細菌ストレプトミセス・クラブ
リゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｌａｖｕｌｉ
ｇｅｒｕｓ）によって産生される強いβ−ラクタマーゼ
阻害剤であり［リーディング・シーとコール・エム（Ｒ
ｅａｄｉｎｇ、Ｃ，ａｎｄ　Ｃｏ１ｅ、Ｍ）　、Ａｎｔ
ｉｍｉｃｒｏｌｂｉａｌＡｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅ
ｍｏｔｈｅｒａｐｙ、１１巻、８５２−８５７頁、　１
９７７年参照コ、β−ラクタマーゼに対して不安定なβ
−ラクタム抗生物質の分解を阻止するので、臨床上価値
の高い化合物である。それ故醗酵法でクラバラン酸の収
量（力価）を増大させる方法は、商業上非常に重要であ
る。

クラバラン酸の収量を改善する方法として従来考えられ
てきたのは、エス・クラブリゲルス（Ｓｃ　Ｉａｖｕ　
ｌ　ｉｇｅｒｕｓ　）を宿主細胞として用いる組換えＤ
ＮＡ法である。この方法については、クラバラン酸の生
合成に関与する遺伝子をエス・クラブリゲルスの染色体
ＤＮＡから分離すれば有望な出発点になるであろうと示
唆されていた［シー・アール・ベイリーら（Ｃ，Ｒ，Ｂ
ａ１ｌｅｙ　ｅＬａｌ）、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇＹ
、２巻、８０８−８１１頁、１９８１年参照］。しかし
、今までのところ、クラバラン酸の力価を増大するのに
価値のあるいかなるＤＮＡも、具体的に同定されていな
い。

いくつもの酵素が、クラバラン酸の生合成に関与してい
ると考えられろが、酵素のクラバラン酸シンターゼは、
これまで特性決定がなされていない。クラバラン酸シン
ターゼ（以下ＣＡＳと略称する）は、プロクラバミン酸
をクラバラン酸（これらの化合物はクラバラン酸の生合
成経路における中間体である）に変換する、２−オクソ
グルタレートで連結されたオキシゲナーゼである。これ
らの詳細については、ニス・ダブリュ・エルスンら（Ｓ
、Ｗ、Ｅｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ）、Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏ
ｃ、Ｃｈｅｍ、Ｃｏｍｍｕｎ１７３６、１７３８および
１７３９頁、　１９８７年ならびに欧州特許願公開第０
２１３９１４号公報に記載されている。

（ハ）課題を解決するための手段 本願発明を明確にするために、以下の図面を使用する。

第１図はＤＮＡＩの制限地図である。

第２図はＤＮＡ　　ＩＩの制限地図である。

第３図はＤＮＡＩＩ［の制限地図である。

第４図は、ＤＮＡ　ＩＩ［由来の７つの制限断片の制限
地図である。

第５ａ図は、組換え体プラスミドｐＢＲＯＣ　４１Ａの
制限地図である。

第５ｂ図は、組換え体プラスミドｐＢＲＯＣ　４１Ｂの
制限地図である。

第６図は、組換え体プラスミドｐＢＲＯＣ３１の制限地
図である。

図中の略記号ＥｃｏＲＩ、　Ｐｓｔｌ？、ｊどは制限エ
ンドヌクレアーゼの通常の略記号であり、ＤＮＡの近似
の長さをキロ塩基（ｋｂ）で示したが、アガロースゲル
の電気泳動法による大きさ決定実験で決定した乙のであ
る。なおこれらの図面は、図示されたＤＮＡ断片に存在
する可能性があるすべての制限部位を必ずしも示す乙の
ではない。

第１の態様として、この発明は、長さが約６０ｋｂで第
１図のＤＮＡ断片（Ｉ）に示す、制限部位の配置を有す
ることを特徴とする。クラバラン酸の生合成に関与する
少なくとも１つの酵素をコードする配クリを有するＤＮ
Ａを提供するものである。

この発明のＤＮＡ（Ｉ）は、その“天然”の状態（すな
わちエス・クラブリゲルスの染色体ＤＮＡ内で見いださ
れたままのらの）のらのではなく、精製し単離して、隣
接するＤＮＡから分離したものである。

この発明の利点は、ＤＮＡ（Ｉ）が、クラバラン酸の生
合成に関与し、かつ以下に述べるように利用できる１つ
以上の遺伝子を有し、クラバラン酸産生生物によって産
生されるクラバラン酸の収量を増大することである。特
にこの利点は、野生型のストレプトミセス属の種、例え
ばエス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４内てクラバ
ラン酸の力価を、著しく増大することができることであ
る。そしてこの菌株は、天然のままでは、ごく低レベル
のクラバラン酸しか産生しない。

まｒ二ＤＮＡ（Ｉ）のある種の制限断片は、クラバラン
酸の生合成に関与する１つ以上の無傷の遺伝子を何する
場合、上記のしかたで利用することもてきる。

したがってこの発明は、第１図に示すＤＮＡ（Ｉ）のサ
ブ断片（Ｓｕｂｒｒａｇｍｅｎｔ）のＤＮＡを提供する
ものであり、但し、このサブ断片が、第２図に示すＤＮ
Ａ（［［）のサブ断片である場合は、該サブ断片は、第
３図に示すＤＮＡ（ｌＩ［）と同一か、または該ＤＮＡ
（［Ｉ［）のサブ断片である。

この発明のサブ断片は、ＤｓＡ（Ｉ）を、適当な制限酵
素で公知の方法で切断して誘導することかできる。また
この発明のサブ断片は、大きいＤＮＡサブ断片を適当な
制限酵素で切断するか、または小さいサブ断片を公知の
方法を用いて連結することによって製造することができ
ろ。

好ましいサブ断片は、第３図のＤＮＡ（ＩＩ［）に示す
制御部位の配置をもっており、すなわちＤ　Ｎ　Ａ（Ｉ
ＩＩ）のサブ断片である。

ＤＮＡ（ＩＩＩ）の特定のサブ断片は、下記のような第
４図に示す断片を有する。

ａ）　　ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨｌ　　断片　（ｆｆ）
ｂ）　　Ｂｃｌｌ　−Ｂａｌｌ　　　〃（Ｖ）ｃ）　　
ＢｃｌＩ　−ＢｃｌＩ　　　”　　　（ＶＩ）ｄ　）　
　ＢｑｌＩＩ−Ｂｑｌ［［〃（■）ｅ　）　　Ｂｑｌ［
−ＢｑｌＩ［”　　　（■）ｆ　）　　ＢｑｌＩＩ　−
Ｂｑｌ［［”　　　（ＬＫ）ｇ）　説す−ジ曳１　　　
”　　　（Ｘ）以上に述べる適切な実験によって、第１
図に示すＤＮＡ（Ｉ）がＣＡＳ活性をコードする配列を
有することが見いだされた。

したがって、別のｇｌとして、この発明は、クラバミン
酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝
子からなるＤＮＡを提供するものである。

ＣＡＳ活性に関与する遺伝子は、第４図に示すＤＮＡ断
片（ＩＸ）内に位置しているので、ＤＮＡ断片（ＩＫ）
は、この発明の池の好ましいサブフラグメントである。

前記ＤＮＡが、上記のこの発明の９％％のＤＮＡについ
て、ヌクレオチドの欠失、置換、付加および逆位化を行
う標準法によって誘導されたものであれば、第１〜４図
に示す制限部位の正確な配置を持っていないＤＮＡもこ
の発明に含まれる。

この発明の好ましいＤＮＡは、エス・クラブリゲルスＡ
ＴＣＣ２７０６４由来のＤＮＡであり、第１〜４図がエ
ス・クラブリゲルスのＤＮＡを示す。

しかし、この発明には、エス・クラブリゲルス以外の適
切なりラバラン酸産生微生物から得られたＤＮＡ配列ら
含まれ、その配列は、第１〜４図に示す制限部位の配置
をもっていないが、好ましくは高度のストリンジエンン
イ（Ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）の条件下で第３図に示すＤ
ＮＡ（ＩＩＩ）らしくはそのサブ断片と雑種形成し、ク
ラバラン酸の生合成に関与する酵素をコードする配列で
ある。

その池の公知のクラバラン酸産生微生物としては、ニス
・ジュモニネンンス（Ｓ、　ｊｕｍｏｎｉｎｅｎｓｉｓ
）ＡＴＣＣ２９８６４とエス・カツラハマヌス（Ｓ、　
ｋａｔｓｕｒａｈａｍａｎｕｓ）　Ｔ−２７２が挙げら
れる。

さらに別の態様として、この発明は、上記のこの発明の
いずれかの態様のＤＮＡからなる組換え体ＤＮＡを提供
するものである。

この発明の組換え体ＤＮＡは、好ましくは、組換え体ベ
クター、さらに好ましくは、クラバラン酸産生生物に形
質転換しかつ該生物内で自律復製が可能なベクター、ま
たは挿入ＤＮＡを、相同組換えによってクラバラン酸産
生生物の染色体に組込みうるベクターである。

好ましい態様において、組換え体ベクターは高度の発現
ベクターである。

この発明の態様のＤＮＡは、当該技術分野で公知の方法
、例えば付着端の直接結合法、ホモポリマーテーリング
法（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ　ｔａｉｌｉｎｇ）または
リンカ−らしくはアダプターの分子によって適切なベク
ターに導入することができる。好ましい態様のベクター
は放線菌科の菌株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ）由来
のらのである。

上記ベクターの具体例は次のとおりである。

（Ｉ）　Ｉ）ＩＪ９１３　（分子量１５．７メガダルト
ン）：低コピー数のベクター［リンエイト。デイ・ジエ
イら（Ｌｙｄｉａｔｅ　Ｄ、Ｊ、ｅｔ　ａｔ）、Ｇｅｎ
ｅ、３５巻、２２３−２３５頁、　１９８５年に記載さ
れている］。

（２）　ｐｌＪ７０２　（分子量３．７メガダルトン）
：高コピー数のベクター［カッツ、エフら（Ｋａｔｚ、
Ｆ、ｅｔ　ａｌ）Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１
２９巻、２７０３−２７１４頁、　１９８３年に記載さ
れている］。

（３）　ｐｌＪ６８０　［ホップウッドら（Ｈｏｐｗｏ
ｏｄ　ｅｔ　ａｔ）。

Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、１９８５年に記載されている
。実験室のマニュアル。Ｔｈｅ　Ｊｏｈｎｌｎｎｅｓ　
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ］。

またはベクターは、非放線菌科（ｎｏｎ−Ｓｔｒｅｐｌ
ｏｍｙｃｅｔｅ）由来のベクター、例えばニスミドｐＴ
ＣＦ　［グロスベルトら（Ｇｒｏｓｖｅｌｄ　ｅＬａｌ
）　、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、
　１０巻、６７１５−６７３２頁、　１９８２年］また
はプラスミドｐＡＴ１５３［フィッグ。エイ・ジエイと
シエラツト、デイ（Ｔｗｉｇｇ、Ａ、Ｊ、ａｎｄ　５ｈ
ｅｒｒａＬｔ、Ｄ、）　、Ｎａｔｕｒｅ。

２８３巻、２１６〜２１８頁、１９８０年］であっても
よい。

上記の方法で作製された組換え・ベクターは、とりうる
２つの配向の１つの配向の挿入ＤＮＡを持っていること
は理解されるであろう。両方の配向を有する組換え体ベ
クターはこの発明の範囲に含まれる。従って例えば、挿
入Ｄ　Ｎ　Ａ断片が（Ｉ”／）に示す制限部位の配置（
第４図）をもち、該ＤＮＡ断片が導入されるプラスミド
ベクターがｐｌＪ９１３の場合に得られた組換え体プラ
スミド（ｐＢＲＯＣ　４１ＡとｐＢＲＯＣ４１Ｂと呼称
する）制限地図を第５（ａ）図と５（ｂ）図に示す。こ
れらのプラスミドのうち、ｐＢＲＯＣ４１Ｂ（第５（ｂ
）図）が好ましい。

第３図のＤＮＡ（ＩＩ［）をｐＡＴ１５３に挿入するこ
とによって作製された好ましい組換え体ベクターを第６
図に示し、これをｐＢＲＯＣ３１と命名した。

この発明によるその外の好ましい組換え体ベクターとし
ては次のように命名されたベクターがあり、すなわちｐ
ＷＯＲｌＯ（上記のＤＮＡ断片（ＩＸ）をｐｌＪ６８０
のＲａｍ旧部位に連結することによって構築した）と、
Ｉ）ＢＲＯＣ４４（同じＤＮＡ断片（ＩＸ）をＰＩＪ７
０２のＢｇｌｎ部位に連結することによって構築した）
である。ｐＷＯＲｌＯにおいて、断片ＩＸのユニークＢ
ｃｌ１部はｐｌＪ６８０ベクターのユニークＸｈｏ１部
位から２．４５ｋｂのところにある。またｐＢＲＯＣ　
４４において、断片■のＢａ１１部位は、ｐｌＪ　７０
２ベクターのユニークＢａｍ８１部位から３ｋｂのとこ
ろにある。

１つのベクターへの挿入ＤＮＡは、標準の方法で池のベ
クターにサブクローン化することができる。例えば第５
（ｂ）図に示すように特性決定された組換え体プラスミ
ドｐＢＲＯＣ　４１Ｂは次のようにして得られる。

ａ　）　ＥｃｏＲｌで切断することによって、ｐＢＲＯ
Ｃ３１（第６図）から大きなＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲＩ
セグメント（Ｉ４，３５ｋｂ）を分離し、次いで ｂ）上記のＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲ［セグメントを、Ｅ
ｃｏＲＩで切断することによって直線化されたｐｆＪ９
１３に連結する方法である。

この発明のＤＮＡと組換え体ベクターとを製造するため
に、ランダムアレイの染色体ＤＮＡフラグメントか、エ
ス・クラブリゲルス（ＡＴＣＣ２７０８４）のＤＮＡを
通常の制限酵素で部分消化することによって作製される
。エンドヌクレアーゼＭｂｏＩとそのアイソシゾマーが
この目的のために特に適切である。

次いでＤＮＡ断片を塩勾配法でサイズ分画を行い約３５
〜４５ｋｂの長さの断片を含有する画分を採取する［グ
ロスベルトら（Ｇｒｏｓｖｅｌｄ　　ｅｔ　ａｌ）Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１０巻、
６７１５〜６７３２頁。

Ｌ９８２年］。次いで得られたＤ　Ｎ　Ａ断片を、切断
されたベクターに通常の７ヨツトガン法によって連結し
て、“クローンバンク”を作製する。

所望により、例えば長さが１０ｋｂ以上のような小さな
断片が、電気泳動溶出法を用いてアガロースゲル以上で
サイズ分画することによって得ることができる。次にこ
れらの小さなりＮＡ断片は上記のクローンバンクを作製
するのに用いられる。

クローンバンクを作製するために用いるベクターはニス
ミドであり（大きなりＮＡ片を持つことができる）、こ
の目的のためには、ニスミドｐＴＣＦ（グロスベルトら
の上記文献参照）が特に適切である。

プラスミドｐＡＴ１５３は、小さなり　Ｎ　Ａ片を有す
るクローンバンクを形成するのに用いるのに有利である
。

上記のようにして作製されたクローンバンクは、適切な
ベクターに挿入され次いでクラバラン酸産生宿主の非産
生突然変異菌株（遮断された突然変異体）に形質された
ときに、宿主がクラバラン酸を合成する能力を復活する
ことができるＤＮＡ片を、雑種形成プローブとして用い
て通常の方法でプローブすることができる。このプロー
ブは、放射能で例えばｆｆｔＰで標識され、前記ＤＮＡ
ＮＡ片、または該ＤＮＡを含有するベクターで構成され
ていることが分かる。但し、前記ベクターは、プローブ
されるクローンバンクを形成するのに用いたベクターに
対して明確な相同性がない。

適切なプローブはノー・アール・ベイツーら（Ｃ，Ｒ，
Ｂａ１ｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ、２巻、８０８−８１１頁、１９８４年に記載の方
法で分離できる。

好ましいプローブは、ノー・アール・ベイツーら上記文
献に記載のプラスミドｐＷＯＲｌである。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２巻、８０ｇ−８１１頁
、　１９８４年に記載の方法を実施するには、クラバラ
ン酸を産生ずる能力を欠いたエス・クラブリゲルスの突
然変異菌株のエス・クラブリゲルスｄａｌｅ　８を入手
する必要がある。エス・クラブリゲルスｄｃｌｃ　８の
寄託、誘導および特性に関する詳細は次のとおりである
。

寄託 エス・クラブリゲルスｄｃｌｃ　８の菌株は、ｔｈｅＮ
ａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄ
ｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　ＭａｒｉｎｅＢａｃｔｅｒｉ
ａ（英国、スコツトランド・アバディーン）に１９８６
年２月１９日に寄託され、その寄託（受は入れ番号：　
ＮＣＩＢ　１２２０９号）は、特許手続上の微生物の寄
託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づく規則に
よって行われた。

エス・クラブリゲルスＭＣｌ８１２２０９の誘導エス・
クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４の試料を取出したと
ころ、種々の形態を示した。１４種のタイプが確認され
た。これらのうちの１つを分離してエス・クラブリゲル
ス５Ｃ−２と命名しｆこ。

エス・クラブリゲルス５Ｃ−２を、ペトリ皿上で、１１
０Ａｌのエチジウムプロミドで処理し、そのプレートを
１０日間培養した。生存菌を、クラバラン酸産生につい
て検定した。ＨＰＬＣで検定した際に（２３０ｍｍで検
出）、検出可能なりラバラン酸を全く産生しなかった１
つの分離物をｄｃｉＣ８菌株と命名し、上記の受は入れ
番号ＮＣ［８１２２０９号で寄託した。

エス・クラブリゲルスＭＣｌ８１２２０９は、この発明
の別の態様を形成する。

エス・クラブリゲルスＭＣｌ８１２２０９の分類エス・
クラブリゲルス１ｆｃＩ８１２２０９の分類学上および
形態学上の特性は、エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７
０６４の上記特性と本質的に類似していることが見出さ
れたが、後者の菌陳の特性は、米国特許第３，８６２．
００８号公報とヒギンズ、シー・イーとキャストナー、
アール・イー（Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｃ，Ｅ、ａｎｄＫａｓ
ｔｎｅｒ、Ｒ，Ｅ、）、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｓｙｓｔｅｍａｔ
ｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｏｌ　２１巻、３２６−３３１頁、
１９７１年に記載されている。上記のようにして作製し
たクローンバンクを、適切な雑種形成プローブ、例えば
ｐＷＯＲｌを用いて雑種形成試験をすることによって、
前記クローンバンク中に存在し前記プローブと雑種形成
するエス・クラブリゲルスの染色体Ｄ　Ｎ　Ａ断片を同
定して地図を作成する。これらの断片は、この発明のＤ
ＮＡより長いかまたは短かいＤＮＡである。この発明Ｄ
ＮＡは、上記のＤＮＡを、標準の方法を用いて、連結し
たりまたは制限酵素で切断することによって得ることが
できる。

不適当なまたは短すぎるＤＮＡ片がプロービング工程で
得られた場合は、新しく分離したＤＮＡ断片自体を、雑
種形成プローブとして用い（通常の方法例えばニックト
ランスレーンコン法で放射能標識した後）、クローンバ
ンク中の別の正のコロニーを同定することができ、その
挿入ＤＮＡは制限マツプによって分叶でき、必要に応じ
て、適当な制限酵素で切断することによって修飾するこ
とができる。

上記の工程は、この発明に必要なりＮＡが分離されるま
で反復される。

さらにこの発明は、この発明の組換え体ベクターによっ
て形質転換される宿主を堤供するものである。

宿主は標準的な方法で形質転換することができる。

１つの態様として、宿主はクラバラン酸を産生しないも
のであってもよく、例えば、イー・コリ（Ｅ、Ｃｏ１１
）もしくはニス・リビダンス（Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ）
が挙げられる。これらの宿主は、遺伝子操作技術上価値
のあるもので、クラバラン酸の生合成に関与する酵素、
例えばＣＡＳ活性を有する酵素を大玉に発現するのに有
利に使用することができる。

しかし、宿主として好ましいのは、適切な培地内で培養
された場合にクラバラン酸を自然に産生ずる宿主か、ま
たはクラバラン酸の生合成性を阻止された上記宿主のク
ラバラン酸非産生突然変異体であって、この発明のＤＮ
Ａで修復することができ、その結果クラバラン酸の合成
が回復し、好ましくは強化された宿主である。このタイ
プの好ましい宿主は、エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２
７０６４、ニス・ニーモニネンンスＡＴＣＣ２９８６４
およびエス・カツラハマヌスＴ−２７２、またはこれら
由来の宿主である。

これらの宿主を用いる利点は、この発明の組換え体ベク
ターで形質転換した後に、適当な条件下で、力価が増大
したクラバラン酸が得られることである。

したがってこの発明は、天然でクラバラン酸を産生ずる
宿主か、または該宿主の阻止されたクラバラン酸非産生
突然変異体由来の宿主にクラバラン酸を産生させろ方法
であって、 （ａ）前記の宿主またはその非産生突然変異体を、この
発明の組換え体ベクターで形質転換し、（ｂ）適当な条
件下で形成された形質転換体を培養し、クラバラン酸を
産生させる工程からなるクラバラン酸の製造法を堤供す
るものである。

クラバラン酸を得るように、クラバラン酸産生生物を培
養する一般的な方法は、英国特許第１．５０８，９７７
号明細書に記載されている。

上記の方法において、好ましい宿主は、エス・クラブリ
ゲルスＡＴＣＣ２７０６４らしくはこれから誘導された
宿主である。

上記の方法に用いられる好ましい組換え体ベクターは、
上言己のｐＷＯＲｌｏである。

次いでこの発明を実施例で説明するがこの発明を限定す
るものではない。

（ニ）実施例 内での構築 エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４の染色体ＤＮ
Ａをヨーロッパ特許願公開第０２３３７１５号公報に記
載しであるのと同様にして分離した。２０Ｍｇの染色体
ＤＮＡを含有する３つのアリコートを、Ｍｂｏｌ　（０
，５単位／μｇ　ＤＮＡ）を用いて、標準条件下、５分
、１０分および１５分間、部分的に消化した。

３つのアリコートを合して、塩（Ｉ，２５Ｍ−５ＭＮａ
Ｃ１）／トリスＥＤＴＡ勾配液で分画し、５Ｎ４０．１
ベツクマンローターを用い３９０００ｒｐｍで３時間遠
心分離した。

１２１の両分が収集され、５〜９の画分からＤ　Ｎ　Ａ
を分離して、大きさが約３５〜４５ｋｂのＭｂ。

Ｉ　ＤＮＡ断片１０４ｇを得た。

ｐＴＣＦベクターアームの製造は、グロスベルト。

エフ・ジー、ルント、ティ、マレイ、イー・ジェイ、メ
ラー、エイ・エル、ダール、エイチ・エイチ、フラベル
、アール・エイ（Ｇｒｏｓｖｅｌｄ　Ｆ、Ｇ、Ｌｕｎｄ
Ｔ、、Ｍｕｒｒａｙ、Ｅ、Ｊ、、Ｍｅｌｌｏｒ　Ａ、Ｌ
、、Ｄａｈｌ、Ｈ，Ｈ，、Ｆｌａｖｅｌｌ。

Ｒ１八、）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ、１０巻、６７１５−６７３２頁、１９８２年に記
載の方法に基づいて行った。

エス・クラブリゲルスのＤＮＡ断片とベクターアームを
５＋３：３の比率で連結し、混合物をパッケージし、グ
ロスベルトらの上記文献に記載されているのと同様にし
て、イー・コリ　ＥＤ８７６７の形質導入に用いた。こ
の方法によって、パッケージされたＤＮＡ１μｇ当り４
Ｘ１０”のコロニーを得た。

実施例２ＤＮＡＩの製造 エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４Ｄ　Ｎ　Ａの
挿入物を有するｐＴＣＦを含有するイー・コリＥ　Ｄ　
８７６７の５０００＠のコロニーを、ニトロセルロース
フィルターに固定して溶解した。プラスミドｐＷＯＲ１
（ベイ９−、シー・アールら前記文献）を単離し、切断
修復で標識し、標準のコロニー雑種形成法によって前記
フィルターをプローブするのに用いた。両者を合したと
ころ、第１図に示す６０ｋｂのＤＮＡ！セグメントを有
する２つの′Ｊ４＆種形成コロニーを得た。

エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４の染色体Ｄ　
Ｎ　Ａを、ヨーロッパ特許願公開第０２３３７１５号に
記載されているのと同様にして分離した。

６０μ９のエス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４Ｄ
ＮＡをＭｂｏｌで部分的に消化し、アガロースゲルで分
画した。マニアナイス、ティ、フリッチ、イー・エフ、
サムブルーク、ジェイ・（ＭａｎｉａｔｉｓＴ、、Ｆｒ
１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、
　）　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ＋実験室マニ
ュアル（コールド・スプリング・ハーバ−研究所）　、
１９８２年に記載の電気泳動溶出法で１０ｋｂより大き
い大きさの断片を含有する画分からＤＮＡを分離した。

１０μ９のｐＡＴ１５３　（ライラグとシエラットの前
記文献）をＢａｍ旧で消化し、子ウシ腸アルカリホスフ
ァターゼで処理し、末端のリン酸基を除いて画循環（ｒ
ｅｃｉｒｃｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）を防止した。この
ベクターと、エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０８４
Ｄ　Ｎ　Ａのｌｏｋｂ以上の断片を連結し、イー・コリ
ーＤＨ１を形質転換するのに用いた。

実施例４　　ＤＮＡＨの製造 エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４の挿入物を有
するｐＡＴ１５３を含有するイー・コリーＤＨＩの６０
００個のコロニーをニトロセルロースフィルターに固定
して溶解した。ｐＷＯＲｌから、２．２ｋｂのＳｐｈ　
Ｉ　−Ｂｇｌ［［挿入断片［ベイ９−ら（前記文献）の
第３図の部位３〜４］を分離し、切断修復で標識し、標
準コロニー雑種形成法で前記フィルターをプローブする
のに用いた。

第３図に示すＨ，ｌｋｂのＤＮＡＩＩＩ断片を有する１
つの雑種形成コロニーを得た。

実施例５　ニス・グラブリゲルス菌昧ＳＣ２内り大 Ｂｇｌ　ＩＩ　−Ｂｇｌ　［［断片ＩＸ（第４図）を、
ｐｌＪ６８０［ホップウッドら（Ｈｏｐｗｏｏｄ　ｅｔ
　ａｌ）、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ
ｏｒ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、実験室マニュアル、
Ｔｈｅ　Ｊｏｈｎｌｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ］
のＢａｍ旧部位に連結することによってプラスミドｐＷ
ＯＲ１ｏを構築した。

プラスミドｐＷＯＲ１０を、シー・アール・ベイ９−ら
の前記文献に記載されているのと類似の方法で、エス・
クラブリゲルスＳＣ２（野生型の再分離物）に形質転換
した。形質転換体を採取して５μ９／　ｍＱのチオスト
レプトン含有のＭ５Ｄ培地［デキストリン１．０％：　
Ｋ、ＨＰＯ，，０，１％；　Ｍｇ５Ｏ＋Ｏ，１％；　Ｎ
ａＣｌｔＯｏｌ％；（ＮＨ−）ｙｓｏ−、Ｑ、１％；　
ＣａＣＯ３０，４％：＠跡の元素（ＦｅＳ０，０．００
０１％：　ＭｎＣ１ｔＯ，０００１％；　ＺｎＳ０，０
．００Ｑ１％）：寒天２．０％コに再び画線接種した。

各形質転換体の細胞を、５ＭＤ培地に穿刺接種を行い６
日間２６℃で培養した。

次いでバイオアッセイプレートに、リーディング、ノイ
とコール、エム（Ｒｅａｄｉｎｇ、　Ｃ，ａｎｄ　ｃｏ
ｌｅＭ、）　、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、　Ａｇｅｎｔｓ
　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、、　１１巻、８５２−８５７頁
、１９７７年に記載されているようにして、クレブシエ
ラ−エロゲネス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ａｅｒｏｇｅ
ｎｅｓ）菌株、４％テトラゾリウム塩および５μ９／Ｒ
（ＩペニンリンＧを含む血液軟寒天（ｏｘｏｉｄ）をそ
そいだ。２６°Ｃで一夜培養した後、阻止域を尉定した
。対象の培養物より大きい阻止域を示す形質転換体を、
正確な力価を評価するために振盪フラスコ培養に付した
。細胞を、英国特許第１，５０８，９７７号の明細書に
記載の適切な種培地２５ＲＣに接種し、ｉ盪しながら２
６°Ｃで３日間培養する。Ｌｘ（ｌの種培養物を、英国
特許１．５０８．９７７号明細書に記載の最終段階の場
合に接種し、４日間２６°Ｃで培養する。

培養ブロスの試料を、３〜４日間の培養後に取出し、バ
ード、ニー・イーら（Ｂｉｒｄ、　Ａ、Ｅ、　ｅｔ　ａ
ｌ）、Ａｎａｌｙｓｔ、１０７巻、１２４１−１２４５
頁、１９８２年およびホールストン、エムとリーディン
グ、シー（ＦｏｕｌｓｔｏｎＭ、　ａｎｄ　Ｒｅａｄｉ
ｎｇ　Ｃ，）　、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ　Ａｇｅｎｔｓ
Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、　２２巻、７５３−７６２頁、１
９８２年に記載されているのと同様にしてクラバラン酸
の生産性を検定した。

試験結果 試験した２１１の分離物中１個が、ニス・タラブリゲル
スＳＣ２に比べて、チオストレプトンなしで培養した培
養物では５３％力価が増大し、チオストレプトンありで
培養した培養物では３９％力価が増大した。すべての場
合、自律性ｐＷＯＲ１０が存在することが見出された。

実施例６　ニス・リビダンスの、ｐＢＲＯＣ４４による
形質転換 Ｂｇｌ　ＩＩ　−Ｂｇｌ　［［断片■（第４図）をｐｌ
Ｊ７０２のＢｇｌ■部位に連結することによって、ｐＢ
ＲＯＣ４４を作製した（ホップウッドらの前記文献参照
）。

ニス・リビダンスの胞子を、２５ｈ＋Ｑの振盪フラスコ
に入った２５ｘＱのプロトプラスト種培地（トリプトン
・大豆ブロス＋１％マルトース）に接種し、振盪しなが
ら３０℃で３日間培養した。ｌ峠の種培養物を、コイル
ばね付きの２５０１！１２振盪フラスコに入っている２
５ＲＱの最終段階のプロトブラスティング培地［１％マ
ルトース＋ｌ　０２１２ＴｓＢ＋　０．５％グリンン＋
１％マルトース含有のＹＥＭＥ　（ホップウッドら前記
文献参照）　１５ｉ！（ｊで構成されている］に移した
。３０℃で一夜（Ｉ６時間）培養した。培養物を滅菌遠
心分離管で収穫し、１０．３％ショ糖溶液で菌糸を洗浄
した。細胞ペレットを１　、５μＱのリゾチーム混合物
中に再′８濁させ、時々ｌｌ会合なから２５°Ｃで１時
間培養した。プロトプラスが形成するのを顕微鏡を用い
て監視した。プロトプラスト緩衝液（ＰＢ）（４ｘＱ）
（ホップウッドら前記文献参照）を添加して混合し、次
いで細胞懸濁物を滅菌木綿わたフィルターで濾過した。

プロトプラスト＠濁液を遠心分離し、ＰＢ中でかんたん
に洗浄し、最終的に２ａｙｅＰＢ中に再懸濁した。プロ
トプラストの濃度は、トーマカウンティングチャンバー
（Ｔｈｏｍａ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｃｈａｍｂｅｒ）を
用いて測定した。

４ＸＩＯ’ｆｌｌのプロトプラストを清浄な遠心分離管
内に入れ、５峠のＰＢを加えて遠心分離してベレット化
した。プロトプラストを約４００μ２のＰＢ中に再懸濁
させた。このプロトプラスト懸濁液に５μＱの連結混合
物を加え、３０秒以内に０，５μＱの形質転換培地（ホ
ップウッドらの前記文献２４６頁）を加えた。１０秒後
に５ｍｆ７のＰＢを添加して、プロトプラストを遠心分
離した。

プロトプラストを１ｍｆ２のＰＢに再懸濁させて、ＰＢ
でｔｏ−’まで希釈した。各希釈液の試料０．１ｉＱを
再生培地Ｒ２ＹＥ［ｌ−リプソン、シー・ジエイ。

ワード、ジェイ・エムおよびホップウッド、デイ・ニー
（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、　Ｃ，Ｊ、、Ｗａｒｄ、　Ｊ、Ｍ
、　ａｎｄ　ＨｏｐｗｏｏｄＤ、Ａ、）　、Ｎａｔｕｒ
ｅ、　２８６巻、５２５−５２７頁、１９８０年参照］
にプレートした。寒天プレートを３０℃で培養した。２
０時間後に、プレートに、５００μ９／１ｔＱのチオス
トレプトン含有の栄養軟寒天２ｘＱをそそいだ。寒天プ
レートをさらに３日間培養した。チオストレプトン耐性
の形質転換体を再生プレートから採取し、清浄なＲ２Ｙ
Ｅ寒天に再び画線接種した。

３〜４日間の培養後、形質転換体を５０μ９／ＭＱのチ
オストレプトン含有の種培地に接種し、ｉｔしながら２
日間３０℃で培養した。プラスミドをホップウッドらの
前記文献の方法によって分離した。

ｐＢＲＯＣ４４と命名されたプラスミドの正しい構造を
、マニアナイスらの前記文献（Ｉ９８２年）に記載の制
限エンドヌクレアーゼ消化法で確認した。

下記実験は、ｐＢＲＯＣ４４で形質転換されたニス・リ
ビダンス（実施例６）内に、クラバミン酸シンターゼ（
ＣＡＳ）活性か存在すことを証明している。

下記３つの培養物を試験した。

（Ｉ）ニス・リビダンス宿主 （ｉｉ　）ｐｌＪ７０２を含有するニス・リビダンス（
ｉｉｉ　）Ｉ）ＢＲＯＣ４４を含有するニス・リビダン
ス（実施例６） 培養物（ｉ）と（ｉｉ）は、（ｉｉｉ）に対して負の対
象として作用した。

ベクターｐｌＪ７０２はチオストレプトン耐性の部位を
乙っているので、このベクターを含有する上記の２つの
培毘物はチオストレプトンの存在下（５０μ９／ｚｆ２
）で培養した。宿主自体はチオストレプトンなしで培養
した。

用いた培地は次のとおりである。

デイフコ（Ｄｉｒｃｏ）酵母エキス　　　３９デイフコ
バクトペプトン　　　　　３９オキソイド（ｏｘｏｉｄ
）麦芽エキス　　３９　１１２水グルコース　　　　　
　　　　　　　１０ｇショ糖　　　　　　　　　　　　
　　３４０ｇ次いで、加圧滅菌後、ＭｇＣ１ｔとグリシ
ンを最終濃度がそれぞれ５ｍＭと５０ｍＭになるように
加えて補充した。

上記の培地に胞子プレートからの単寒天フラグを接種し
、培養物を、２５０ｚＱらしくは５００２Ｉ２のスプリ
ング付き振盪フラスコ中、３１’Ｃで培養した。

４８時間の培養後、菌糸体を遠心分離で収穫し、音波処
理をして（３ｘ５秒処理）、同容積の、５０ｍＭトリス
塩酸／　ｌ　Ｏｔｎ’Ａ　ＭｇＣ１，／　ｌ　ＯｍＭ　
ＫＣＩ／　ｌ　Ｏ％グリセロール／　ｌ　ｍＭ　ＰＭＳ
Ｅ　（フェニルメチルスルホニルフルオリド）／ｐＨ７
，５中で細胞内酵素を放出させた。

ＣＡＳ活性を検定するために、前記の遠心分離・音波処
理物（Ｉ１５μｉ２）を、Ｆ　ｅ　”（Ｉ１５μｆ２．
１０ｍＭ）、α−ケトグルタレート（Ｉ５μＱ、　ｌＯ
ｍＭ）およびＣＡＳの基質［５−アミノ−３−ヒドロキ
シ−２−（２−オキソアゼチジン−■−イル）バレレー
ト：ブロクラバミン酸：ヨーロッパ特許公開（ＥＰ−Ａ
−０）第０２１３９１４号明細書に記載］（５μＱ。

５ｍｙ／ｍＱ）ととも室温で５分間培養し、次いでイミ
ダゾール（３７，５μＱ、２０％、　ｐＨ６，８）とと
もに１０分間培養し、Ｑ、１Ｍ　ＮａＨｚＰＯ４／　６
％ＭｅＯＨ／　ｐＨ３，２で飽和させた３　０　ａｍ　
Ｗａｔｅｒｓ　Ｃ１８カラムを用いろＨＰＬ：Ｃ（高速
液体クロマトグラフィ）で２ｍ（！／分で溶出し、３１
２ｎｍで検出することによって、誘導生成物を検出した
。ソフトゲルパーミェーションクロマトグラフィを、前
記の音波処理緩衝液で飽和さけたウルトロゲル＾ＣＡ３
４　（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　ＡＣＡ　５４）の２．６ｘ　
４５ｃｍカラムを用い、２０ｍＱ／ｈｒで４℃にて実施
した。画分のＣＡＳ活性を上記のようにして検定した。

タンパク質の検定は、プラトホード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ
）、Ａｎａｌｉｔｙｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２
巻、２４ｇ　−２５４頁、１９７６年の方法で行った。

試験結果 ニス・リビダンスのみ、ベクターｐｌＪ７Ｑ２を含有す
るニス・リビダンンス、およびｐＢＲＯＣ４４で形質転
換したニス・リビダンンスを４８時間培養して不透明の
ブロスを得た。各培養物の菌糸体を収穫し、音波処理し
、遠心分離して音波処理した乙のについてＣＡＳ活性を
検定した。ＨＰＬＣデータによれば、ｐＢＲＯＣ４４で
形質転換したニス・リビダンスが、下記の特性を有する
１（ＰＬＣのピーク部分を生成することが分かった。

（ｉ）上記のピーク部分は、標準のクラバミン酸ととも
に共溶比する（２．５分）。

（ｉｉ）上記ピーク部分は、２つの対照（ニス・リビダ
ンンスのみと、挿入部なしのｐｌＪ７０２を含有するニ
ス・リビダンンス）の培養物には生成しなかった。

（ｉｉｉ　）ｌ）ＢＲＯＣ４４で形質転換された培養物
を、Ｆｅ”、α−ケトグルタレートもしくは基質なしで
検定したところ、上記ピーク部はなかった。

上記の結果は、ｐＢＲＯＣ４４で形質転換された培養物
かＣＡＳ活性を発生するというとを示している。

ニス・リビダンス／ｐＢＲＯＣ４４から精製されたＣＡ
Ｓの比活性は、０．００３６μｍｏｌｅ／ｍｉｎ／ｍ９
／タンパク質であることか見出された。この値は、ニス
・グラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４（再分離物５Ｃ２
）由来のＣＡＳの（直、０．００８〜０．０６μｍｏｌ
ｅ／ｍｉｎ／ｍｉＦタンパク質に匹敵するものである。

このクローン化されたＣＡＳの比活性は、天然のＣＡＳ
の比活性よりわずかに低いけれども、このデータは、酵
素が完全に翻訳され、ｐＢＲＯＣ４４が完全なＣＡＳ遺
伝子を含有することを示している。

【図面の簡単な説明】

第１図はＤＮＡＩの制限地図、第２図はＤ　Ｎ　Ａ■の
制限地図：第３図はＤＮＡＩＩ［の制限地図；第４図は
、Ｄ　Ｎ　Ａ　ｍ由来の７つの制限断片の制限地図；第
５ａ図は、組換え体プラスミドｐＢＲＯＣ　４１Ａの制
限地図：第５ｂ図は、組換え体プラスミドｐＢＲＯＣ　
４１Ｂの制限地図：第６図は、組換え体プラスミドｐＢ
ＲＯＣ３１の制限地図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、クラバラン酸の生合成に関与する少なくともひとっ
   の酵素をコードする配列からなるＤＮＡであって、該Ｄ
   ＮＡが、約６０ｋｂの長さを有し、第１図のＤＮＡ断片
   （ I ）に示す制限部位の配置を有することを特徴とす
   るＤＮＡ。 ２、ＤＮＡのサブ断片が第２図に示すＤＮＡ断片（II）
   のサブ断片である場合、そのサブ断片が、第３図に示す
   ＤＮＡ断片（III）と同一か、または第３図に示すＤＮ
   Ａ断片（III）のサブ断片である請求項１記載のＤＮＡ
   のサブ断片。 ３、クラバラン酸シンターゼ活性を有するタンパク質を
   コードする遺伝子からなるＤＮＡ。 ４、ＤＮＡが、第４図のＤＮＡ断片（IX）に示す制限部
   位の配置を有する請求項２または３に記載のＤＮＡ。 ５、第３図に示す制限部位の配置を有する ＤＮＡ断片（III）もしくはそのサブ断片と雑種形成し
   、かつクラバラン酸の生合成に関与する酵素をコードす
   るＤＮＡ配列。 ６、請求項１〜５のいずれか１っに記載の ＤＮＡ配列から、ヌクレオチドの欠失、置換、挿入もし
   くは逆位によって誘導されたＤＮＡ。 ７、エス・クラブリゲリス由来の請求項１〜６のいずれ
   か１つに記載のＤＮＡ。 ８、請求項１〜７のいずれか１つに記載の ＤＮＡからなる組換え体ＤＮＡ。 ９、請求項８の組換え体ＤＮＡを有する組換え体ベクタ
   ー。 １０、ｐＷＯＲ１０、ｐＢＲＯＣ４４、ｐＢＲＯＣ３１
   、ｐＢＲＯＣ４１ＡまたはｐＢＲＯＣ４１Ｂと命名され
   ている請求項９記載のベクター。 １１、高発現ベクターである請求項９記載のベクター。 １２、請求項９〜１１のいずれか１つに記載のベクター
   で形質転換された宿主。 １３、放線菌科の菌株またはイー・コリである請求項１
   ２に記載の宿主。 １４、天然で、クラバラン酸を産生する請求項１３記載
   の放射菌科の菌株の宿主。 １５、エス・クラブリゲルスＡＴＣＣ２７０６４、エス
   ・ジユーモニネンシスＡＴＣＣ２９８６４もしくはエス
   ・カツラハマヌスＴ−２７２またはこれらの突然変異体
   である請求項１３または１４に記載の宿主。 １６、天然にクラバラン酸を産生する宿主か、または／
   この宿主の、阻止されたクラバラン酸非産生突然変異体
   由来の宿主にクラバラン酸を産生させる方法であって、
   下記工程： （ａ）前記宿主もしくはこの宿主のクラバラン酸非産生
   突然変異体を、請求項９〜１１のいずれか１つに記載の
   ベクターで形質転換させ、ついで（ｂ）得られた形質転
   換体を適当な条件下で培養し、クラバラン酸を産生させ
   る、 ことからなる方法。 １７、形質転換体が請求項１５に記載の宿主からなる請
   求項１６に記載の方法。 １８、菌株ＮＣＩＢ１２２０９。