PL180300B1

PL180300B1 - wektor zawierajacy taki fragment DNA, a takze mikroorganizmzawierajacy wskazany fragment DNA badz wektor oraz biotechnologiczny sposób wytwarzania L-karnityny PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL180300B1
Application number: PL94313968A
Authority: PL
Inventors: Thomas Zimmermann; Josef Werlen
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 1993-10-08
Filing date: 1994-10-07
Publication date: 2001-01-31
Also published as: PL313968A1; HUT74825A; FI961537A; DE59410350D1; KR100346293B1; NO961385L; AU7854694A; HU220798B1; FI118568B; CZ288247B6; NO319058B1; CZ100596A3; SK280580B6; NO961385D0; WO1995010613A1; CN1282791A; FI961537A0; US5759824A; EP0722500B1; SK43196A3

Abstract

obejmujacej a) fragment 10,6 kb EcoRI, wstawiony w plazmid pVK100q, zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, oraz jego podfragmenty, jak równiez b) fragmenty, które hybrydyzuja ze wskazanym wyzej fragmentem 10,6 kb EcoRI lub jego podfragmentami i koduja enzymy o aktywnosciach dehydroge- nazy ? -butyrobetainy-CoA, syntetazy ? -butyrobetainy/krotonobetainy-CoA i/lub hydrolazy krotonobetainy-CoA 8 Wektor zawierajacy fragment DNA, obejmujacy co najmniej jeden sposród genów bcoC, bcoA/B oraz bcoD dla biosyntezy L-karnityny, kodujacy dehy- drogenaze y -butyrobetainy-CoA (bcoC), syntetaze ? -butyrobetaina/krotonobetaina-CoA (bcoA/B) lub hydrolaze krotonobetainy-CoA (bcoD), wybrany z gru- py obejmujacej a) fragment 10,6 kb EcoRI, wstawiony w plazmid pVK100q, zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, oraz jego podfragmenty, jak równiez b) fragmenty, które hybrydyzuja ze wskazanym wyzej fragmentem 10,6 kb EcoRI lub jego podfragmentami i koduja enzymy o aktywnosciach dehydroge- nazy ? -butyrobetainy-CoA, syntetazy ? -butyrobetainy/krotonobetainy-CoA i/lub hydrolazy krotonobetainy-CoA 16 Mikroorganizm rekombinacyjny, wybrany sposród mikroorganizmów rodzajów Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Comamonas oraz Rhizobium/Agrobacterium i zawierajacy fragment DNA, obejmujacy co najmniej jeden sposród genów bcoC, bcoA/B oraz bcoD dla biosyntezy L-karnity- ny, kodujacy dehydrogenaze ? -butyrobetainy-CoA (bcoC), syntetaze ? -butyrobetaina/krotonobetaina-CoA (bcoA/B) lub hydrolaze krotonobetainy-CoA (bcoD), wybrany z grupy obejmujacej a) fragment 10,6 kb EcoRI, wstawiony w plazmid pVK100q, zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, oraz jego podfragmenty, jak równiez b) fragmenty, które hybrydyzuja ze wskazanym wyzej fragmentem 10,6 kb EcoRI lub jego podfragmentami i koduja enzymy o aktywnosciach dehydroge- nazy ? -butyrobetainy-CoA, syntetazy ? -butyrobetainy/krotonobetainy-CoA i/lub hydrolazy krotonobetainy-CoA, lub wektor, zawierajacy wskazany wyzej fragment DNA 25 Biotechnologiczny sposób wytwarzania L-karnityny, znamienny tym, ze krotonobetaine i/lub ? -butyrobetaine poddaje sie fermentacji w obecnosci od- powiedniego zródla wegla i azotu, jak glutaminian, octan i betaina, badz gliceryna i betaina, stosujac mikroorganizm rekombinacyjny, wybrany sposród mikro- organizmów rodzajów Escherichia, Pseudomonas, Agrobactertum, Rhizobium, Comamonas oraz Rhizobium/Agrobacterium i zawierajacy fragment DNA, obejmujacy co najmniej jeden sposród genów bcoC , b c o A/B oraz bcoD dla biosyntezy L-karnityny, kodujacy dehydrogenaze ? -butyrobetainy-CoA (bcoD), synteta- ze ? -butyrobetaina/krotonobetaina-CoA (bcoA/B) lub hydrolaze krotonobetainy-CoA (bcoD). wybrany z grupy obejmujacej a) fragment 10,6 kb EcoRI, wstawiony w plazmid pVK100q, zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, oraz jego podfragmenty, jak ró w n ie z ..................................... PL PL PL PL PL

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy wyodrębnionego fragmentu DNA, obejmującego geny metabolizmu butyrobetaina/krotonobetaino-L-kamityna, wektora, zawierającego taki fragment DNA, a także mikroorganizmu, zawierającego wskazany fragment DNA bądź wektor, oraz biotechnologicznego sposobu wytwarzania L-kamityny.

L-Kamityna jest naturalną witaminopodobnąsubstancją o dużym znaczeniu w metabolizmie u człowieka. Przy wykorzystaniu kwasów tłuszczowych, L-kamityna ma zasadnicze znaczenie jako substancja-transmiter błony mitochondrialnej, a zatem transporter energii metabolicznej. Jeśli L-kamityna jest syntetyzowana w nieodpowiednich ilościach przez organizm, należy ją dodawać do pożywienia dla uniknięcia objawów niedoboru. Zwłaszcza w pożywieniu małych dzieci, które są wciąż niezdolne do biosyntezy własnej L-kamityny, L-kamityna jest zasadniczym składnikiem odżywczym.

Preparaty L-kamityny stosuje się jako składniki aktywne produktów farmaceutycznych. Uzupełnienie L-kamityną jest wskazane w przypadku niedoboru kamityny i innych wskazań terapeutycznych, zwłaszcza w zaburzeniach sercowych itp.

Znana jest biosynteza L-kamityny u wyższych organizmów, dalsze funkcje metaboliczne oraz znaczenie dla metabolizmu są przedmiotami intensywnych działań badawczych. Oprócz drogi metabolizmu, opisanej dla mikroorganizmów, zwłaszcza gatunku Pseudomonas (kataliza hydroksylazy γ -butyrobetainy, Lindtstedt i in., Biochemistry 16,2181 -2188,1977), L-kamityna jest tworzona jako metaboliczny produkt pośredni pewnych mikroorganizmów, np. Agrobacterium/Rhizobium sp. EP-A-0 158 194 ujawnia proces mikrobiologicznego wytwarzania L-kamityny, poczynając od, np. γ -butyrobetainy, w której mutanty produkcyjne negatywne względem dehydrogenazy L-kamitylu otrzymuje się za pomocą tradycyjnych procesów selekcji mikrobiologicznej, przy użyciu których uzyskuje się stosunkowo dobre wydajności L-kamityny już przy czasach reakcji od 20 do 30 godz. Dalsza optymalizacja tego procesu względem wydajności w funkcji objętości/czasu, me jest jednak możliwa przy użyciu klasycznej metody mikrobiologicznej.

Celem niniejszego wynalazku jest zatem dostarczenie bardziej ekonomicznego procesu biotechnologicznego wytwarzania L-kamityny, w których L-kamitynę otrzymuje się przy znacząco krótszym czasie reakcji przy jeszcze wyższych wydajnościach.

Badania nad metabolizmem γ -butyrobetaina/krotonobetaina doprowadziły do identyfikacji pięciu genów, bcoA/B, bcoC, bcoD. bcoE i bcoT, które kodują enzymy drogi metabolizmu γ -butyrobetaina/krotonobetaina i są zawarte m.in. w operonie tzw. operonie butyrobetaino-L-kamityny (bco). W tym kontekście skróty mają następujące znaczenie:

bcoA/B: gen syntetazy γ -butyrobetainy-CoA (bcoA)/syntetazy krotonobetainy-CoA (bcoB) tzn. unikalny gen kodujący produkt enzymu, o aktywności syntetazy γ -butyrobetainy-CoA oraz syntetazy krotonobetainy-CoA.

bcoC: gen dehydrogenazy γ -butyrobetainy-CoA.

bcoD: gen hydrolazy krotonobetainy-CoA.

180 300 bcoE: gen dehydrogenazy L-kamitylu; oraz bcoT: potencjalny gen układu transportu.

Ustalono, że produkty genowe genów bcoA/B. bcoC oraz bcoD są odpowiedzialne za biosyntezę L-kamityny, podczas gdy bcoE koduje dehydrogenazę kamityny, co powoduje degradację metabolicznego produktu pośredniego L-kamitylu-CoA do betainy. bcoT jest prawdopodobnie genem kodującym proteinę transportową układu transportu przypisanego do metabolizmu butyrobetainy. Gen ten nie jest istotny dla biosyntezy L-kamityny.

Niniejszy wynalazek dotyczy zatem fragmentów DNA i wektorów, które obejmująjeden lub więcej genów bcoC. bcoA/B oraz bcoD. kodujących enzymy biosyntezy L-kamityny w metabolizmie γ -butyrobetaina/krotonobetaina i ewentualnie dodatkowo potencjalny gen transportu bcoT.

Wynalazkiem objęty jest wyodrębniony fragment DNA, obejmujący co najmniej jeden spośród genów bcoC. bcoA/B oraz bcoD dla biosyntezy L-kamityny, kodujący dehydrogenazę γ -butyrobetainy-CoA (bcoC), syntetazę γ -butyrobetaina/krotonobetaina-CoA (bcoA/B) lub hydrolazę krotonobetainy-CoA (bcoD). wybrany z grupy obejmującej:

a) fragment 10,6 kb EcoRI, wstawiony w plazmid pVK100q, zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium E1K 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, oraz jego podfragmenty; jak również

b) fragmenty, które hybrydyzująze wskazanym wyżej fragmentem 10,6 kb EcoRI lub jego podfragmentami i kodują enzymy o aktywnościach dehydrogenazy γ -butyrobetainy-CoA, syntetazy γ -butyrobetainy/krotonobetainy-CoA i/lub hydrolazy krotonobetainy-CoA.

Korzystnie, fragment DNA według wynalazku obejmuje ponadto gen bcoT przypisany do metabolizmu γ -butyrobetaina/krotonobetaina i kodujący proteinę potencjalnego transportu.

Korzystnie, we fragmencie DNA według wynalazku geny bcoC, bcoA/B, bcoD i ewentualnie bcoT są wyprowadzone z mikroorganizmów rodzaj ów Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium oraz Rhizobium/Agrobactenum.

We fragmencie DNA według wynalazku wskazane geny są operacyjnie połączone z elementami kontroli genetycznej niezbędnymi dla ekspresji, takimi jak promotory i miejsca wiązania rybosomów. Korzystnie, geny biosyntezy L-kamityny są ustawione w sekwencji bcoC, bcoA/B i bcoD lub ewentualnie bcoC. bcoA/B. bcoD oraz bcoT i są obecne jako pojedyncza jednostka transkrypcyjna, zaś element regulacyjny genów obejmuje promotor naturalnego operonu bco, P^.

Korzystnie, we fragmencie DNA według wynalazku geny bcoC, bcoA/B. bcoD oraz bcoT są scharakteryzowane poniższą mapą restrykcyjną:

0’23^5678 bcoC bcoA/B bcoD bco T

180 300

Wynalazek obecny obejmuje także wektor, zawierający fragment DNA obejmujący co najmniej jeden spośród genów bęoC, bcoA/B oraz bcoD dla biosyntezy L-kamityny, kodujący dehydrogenazę γ -butyrobetainy-CoA (bcoO, syntetazę γ -butyrobetaina/krotonobetaina-CoA (bcoA/B) lub hydrolazę krotonobetainy-CoA (bcoD), wybrany z grupy obejmującej:

a) fragment 10,6 kb EcoRI, wstawiony w plazmid pVK100q, zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, oraz jego podfragmenty; jak również

Korzystnie, w wektorze według wynalazku fragment DNA obejmuje ponadto gen bcoT przypisany do metabolizmu γ -butyrobetaina/krotonobetaina i kodujący proteinę potencjalnego transportu.

Korzystnie, wektor według wynalazku ma we fragmencie DNA geny bcoC, bcoA/B. bcoD i ewentualnie bcoT. wyprowadzone z mikroorganizmów rodzajów Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium oraz Rhizobium/Agrobacterium.

Korzystnie, wektor według wynalazku ma we fragmencie DNA geny operacyjnie połączone z elementami kontroli genetycznej niezbędnymi dla ekspresji, takimi jak promotory i miejsca wiązania rybosomów. Korzystnie, we fragmencie DNA geny biosyntezy L-kamityny sąustawione w sekwencji bcoC. bcoA/B i bcoD lub ewentualnie bcoC. bcoA/B. bcoD oraz bcoT i sąobecne jako pojedyncza jednostka transkrypcyjna, zaś element regulacyjny genów obejmuje promotor naturalnego operonu bco, P_bc0.

W wektorze według wynalazku geny bcoC. bcoA/B, bcoD oraz bcoT we fragmencie DNA są scharakteryzowane powyższą mapą restrykcyjną.

Korzystnym wektorem według wynalazku jest plazmid pVK100q taki, jak zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, plazmid pVK1011 scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 3 i plazmid pAZIOl scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 4.

Wynalazek obejmuje także mikroorganizm rekombinacyjny, wybrany spośród mikroorganizmów rodzajów Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Comamonas oraz Rhizobium/Agrobacterium i zawierający fragment DNA, obejmujący co najmniej jeden spośród genów bcoC. bcoA/B oraz bcoD dla biosyntezy L-kamityny, kodujący dehydrogenazę γ -butyrobetainy-CoA (bcoC), syntetazę γ-butyrobetaina/krotonobetaina-CoA (bcoA/B) lub hydrolazę krotonobetainy-CoA (bcoD), wybrany z grupy obejmującej:

b) fragmenty, które hybrydyzująze wskazanym wyżej fragmentem 10,6 kb EcoRI lub jego podfragmentami i kodują enzymy o aktywnościach dehydrogenazy γ -butyrobetainy-CoA, syntetazy γ -butyrobetainy/krotonobetainy-CoA i/lub hydrolazy krotonobetainy-CoA; lub wektor, zawierający wskazany wyżej fragment DNA.

Korzystnie, w mikroorganizmie według wynalazku fragment DNA obejmuje ponadto gen bcoT przypisany do metabolizmu γ -butyrobetaina/krotonobetaina i kodujący proteinę potencjalnego transportu, przy czym we fragmencie DNA geny bcoC. bcoA/B. bcoD i ewentualnie bcoT są korzystnie wyprowadzone z mikroorganizmów rodzajów Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium oraz Rhizobium/Agrobacterium. Ponadto, korzystnie we fragmencie DNA geny sąoperacyjnie połączone z elementami kontroli genetycznej niezbędnymi dla ekspresji, takimi jak promotory i miejsca wiązania rybosomów, a w szczególności geny biosyntezy L-kamityny sąustawione w sekwencji bcoC. bcoA/B i bcoD lub, jeśli ma to zastosowanie, bcoC. bcoA/B. bcoD oraz bcoT i sąobecne jako pojedyncza jednostka transkrypcyjna, zaś element regulacyjny genów obejmuje promotor naturalnego operonu bco, P_bco.

180 300

Korzystnie, w mikroorganizmie według wynalazku, we fragmencie DNA geny bcoC, bcoA/B, bcoD oraz bcoT są scharakteryzowane mapą restrykcyjną przedstawioną powyżej.

Korzystnym mikroorganizmem według wynalazku jest Rhizobium/Agrobacterium HK 1349, obejmującym plazmid pVK100q taki, jak zdeponowany pod numerem depozytowym DSM 8726, plazmid pVKl 011, jak scharakteryzowany mapąrestrykcyjnąwedług fig. 3 lub plazmid pAZIOl, jak scharakteryzowany mapąrestrykcyjnąwedług fig. 4 oraz genetyczne odmiany i mutanty wyprowadzone z takich mikroorganizmów, o zdolności do biosyntezy L-kamityny.

Korzystnym mikroorganizmem według wynalazku jest Rhizobium/Agrobacterium HK 1349.4, obejmującym plazmid pVK100q taki, jak zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, plazmid pVK1011, jak scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 3 lub plazmid pAZIOl, jak scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 4 oraz genetyczne odmiany i mutanty wyprowadzone z takich mikroorganizmów o zdolności do biosyntezy L-kamityny.

Biotechnologiczny sposób wytwarzania L-kamityny, według wynalazku polega na tym, że krotonobetamę i/lub γ -butyrobetainę poddaje się fermentacji w obecności odpowiedniego źródła węgla i azotu, jak glutaminian, octan i betaina, bądź gliceryna i betaina, stosując mikroorganizm rekombmacyjny, wybrany spośród mikroorganizmów rodzajów Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Comamonas oraz Rhizobium/Agrobacterium i zawierający fragment DNA, obejmujący co najmniej jeden spośród genów bcoC, bcoA/B oraz bcoD dla biosyntezy L-kamityny, kodujący dehydrogenazę γ -butyrobetainy-CoA (bcoC), syntetazę γ -butyrobetaina/krotonobetaina-CoA (bcoA/B) lub hydrolazę krotonobetainy-CoA (bcoD), wybrany z grupy obejmującej:

b) fragmenty, które hybrydyzująze wskazanym wyżej fragmentem 10,6 kb EcoRI lub jego podfragmentami i kodują enzymy o aktywnościach dehydrogenazy γ -butyrobetainy-CoA, syntetazy γ -butyrobetainy/krotonobetainy-CoA i/lub hydrolazy krotonobetainy-CoA; lub wektor, zawierający wskazany wyżej fragment DNA, a następnie wyodrębnia się wytworzonąL-kamitynę.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny, w którym fragment DNA obejmuje ponadto gen bcoT przypisany do metabolizmu γ -butyrobetaina/krotonobetaina i kodujący proteinę potencjalnego transportu.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny, w którym fragment DNA obejmuje geny bcoC. bcoA/B. bcoD i ewentualnie bcoT wyprowadzone z mikroorganizmów rodzajów Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium oraz Rhizobium/Agrobacterium, a zwłaszcza taki, w którym we fragmencie DNA geny są operacyjnie połączone z elementami kontroli genetycznej niezbędnymi dla ekspresji, takimi jak promotory i miejsca wiązania rybosomów. Korzystnie przy tym, we fragmencie DNA geny biosyntezy L-karnityny są ustawione w sekwencji bcoC. bcoA/B i bcoD lub, jeśli ma to zastosowanie, bcoC. bęoA/B, bcoD oraz bcoT i są obecne jako pojedyncza jednostka transkrypcyjna, zaś element regulacyjny genów obejmuje promotor naturalnego operonu bco, P_bco.

Szczególnie korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny, w którym we fragmencie DNA fragment DNA, geny bcoC, bcoA/B. bcoD oraz bcoT są scharakteryzowane mapą restrykcyjną podaną powyżej.

W sposobie według wynalazku, korzystnie stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny Rhizobium/Agrobacterium HK 1349, obejmujący plazmid pVKl 00q taki, jak zdeponowany pod numerem depozytowym DSM 8726, plazmid pVK1011, jak scharakteryzowany mapą restrykcyjnąwedług fig. 3 lub plazmid pAZ 101, jak scharakteryzowany mapąrestrykcyjnąwedług fig. 4, bądź genetyczne odmiany i mutanty wyprowadzone z takich mikroorganizmów o zdolności do biosyntezy L-kamityny.

W sposobie według wynalazku, korzystnie stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny Rhizobium/Agrobacterium HK 1349.4, obejmujący plazmid pVKl 00q taki, jak zdeponowany w

180 300

Rhizobium/Agrobacterium HK1349 pod numerem depozytu DSM 8726, plazmid pVK1011, jak scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 3 lub plazmid pAZIOl, jak scharakteryzowany mapąrestrykcyjną według fig. 4, bądź genetyczne odmiany i mutanty wyprowadzone z takich mikroorganizmów o zdolności do biosyntezy L-kamityny.

Oznaczenia bcoA/B. bcoC. bcoD oraz bcoT, tak jak stosuje się je w niniejszym opisie i zastrzeżeniach, obejmują jak określono, zarówno geny organizmów dzikiego typu, które kodują enzymy metabolizmu γ -butyrobetainy/krotonobetainy-L-kamityny o wyżej wspomnianych aktywnościach enzymu, zwłaszcza geny operonu butyrobetainy-L-kamityny (bco), i ich funkcjonalnie równoważne genetyczne warianty i mutanty, tzn. geny, które są wyprowadzone z genów organizmów dzikiego typu i których produkty genowe sązasadniczo niezmienione co do ich funkcji biologicznych. Funkcjonalnie równoważne genetyczne warianty i mutanty zawierajązatem, np. wymiany zasad w kontekście znanej degeneracji kodu genetycznego, jak to można wytworzyć np. sztucznie, aby zaadaptować sekwencję genu do korzystnego zastosowania kodonu pewnego mikroorganizmu, w którym ekspresja ma mieć miejsce. Warianty i mutanty obejmują ponadto delecje, insercje oraz podstawienia zasad lub kodonów, w takim stopniu, że pozostawiaj ąprodukty genowe zmodyfikowane w ten sposób zasadniczo niezmienione co do ich funkcji biologicznej. Włączone są w to np. sekwencje genowe o wysokim stopniu homologii np. wyższym niż 70%, do sekwencji dzikiego typu i sązdolne do hybrydyzowania z komplementem sekwencji dzikiego typu przy ścisłych warunkach hybrydyzacji np. w temperaturach między 50 i 70°C oraz przy zawartości soli 0,5 do 1,5 M.

Określenie jednostka transkrypcji, tak jak jest stosowane w niniejszym tekście, jest rozumiane jako sekwencje DNA, w których geny są ustawione w jednym kierunku transkrypcji i są transkrybowane pod wspólną kontrolą transkrybcji w nieprzerwanym transkrypcie, przy czym sekwencje DNA oprócz genów dodatkowo mają elementy kontroli genetycznej niezbędne dla ekspresji genu, takie jak promotory i miejsca wiązania rybosomów.

Niniejszy wynalazekjest zilustrowany bardziej szczegółowo za pomocąnastępujących figur.

Figura 1 przedstawia enzymy drogi metabolizmu γ -butyrobetainy- lub krotonobetainy-L-kamityny, fig. 2 przedstawia mapę restrykcyjną fragmentu 10,6 kb DNA z Rhizobium/Agrobacterium posiadającego operon bco, fig. 3 oraz fig. 4 przedstawiają plazmid pVK1011 oraz pAZIOl; strzałki wskazują pozycję i orientację genów bco oraz genów beu (geny wykorzystujące betainę; EP-A-0 543 344). Część insertu plazmidu zaznaczono przez pogrubienie, fig. 5 przedstawia plazmid pCC49 jako możliwy materiał wyjściowy do wytwarzania szczepu gospodarza rec A, fig. 6 przedstawia schemat budowy plazmidów pVK 1011, pAZ 101, pVK 100q oraz pAZ7, fig. 7 przedstawia schemat budowy szczepu gospodarza recA.

Materiałami wyjściowymi do wyodrębnienia genów bcoA/B. bcoC. bcoD oraz bcoT drogi metabolizmu γ - butyrobetaina/krotonobetaino-L-kamityna mogą być wszystkie mikroorganizmy, które metabolizują butyrobetainę i/lub krotonobetainę według fig. 1.

Przykładami odpowiednich szczepów są mikroorganizmy rodzaju Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium oraz Agrobacterium/Rhizobium, przy czym korzystne sąte ostatnie. Przykładem korzystnego mikroorganizmu rodzaju Agrobacterium/Rhizobium jest mikroorganizm gatunku Agrobacterium/Rhizobium sp. HK4 (DSM 2938), jak już opisano w EP-A-0158 194. Te mikroorganizmy sązwłaszcza korzystnie stosowane, które sąjuż negatywne względem dehydrogenazy kamitynowej tzn. nie mają lub mają jedynie defektywny gen bcoE (poniżej oznaczany także jako bcoET Przykładami korzystnych mikroorganizmów negatywnych względem dehydrogenazy kamitynowej są mikroorganizmy gatunku Agrobacterium/Rhizobium sp. HK13 (DSM 2903) oraz HK1331b (DSM 3225), które opisano już w EP-A-0 158 194, lub gatunek Agrobacterium/Rhizobium sp. HK1349 (DSM 3944), który opisano w EP-A-0 543 344.

Geny bcoA/B, bcoC, bcoD oraz bcoT metabolizmu γ -butyrobetaina/krotonobetaino-L-karnityna mogą być zlokalizowane w chromosomie mikroorganizmu przez poddanie mikroorganizmów np. mutagenezie insercji transpozonu i przez to znaczenie genów metabolizmu γ -butyrobetaina/krotonobetaino-L-karnityna odpowiednim znacznikiem, np. odpornością na kanamycynę (Km). Mutanty znaczone w ten sposób, które nie mogąjuż wykorzystywać związków pośrednich metabo

180 300

Π hzmu butyrobetainy, można następnie wyodrębnić. W ten sposób, geny metabolizmu γ -butyrobetama/krotonobetaino-L-kamityna można zidentyfikować i powiązać z ich funkcjami. Znaczone geny można następnie klonować i scharakteryzować bardziej szczegółowo przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych. Wyodrębnienie nienaruszonych genów lub fragmentów DNA według niniejszego wynalazku można następnie przeprowadzić wychodząc z banku genów odpowiedniego niemutowanego organizmu, z którego można wyodrębnić geny bco lub ich fragmenty i zidentyfikować w znany sposób przez hybrydyzację przy użyciu sklonowanych genów mutagenowanego szczepu otrzymanego jak wyżej. Otrzymane geny można następnie klonować w żądane wektory i mapować przy pomocy enzymów restrykcyjnych.

Jedynie geny bcoA/B. bcoC oraz bcoD są odpowiedzialne za biosyntezę L-kamityny. Zgodnie z tym również tylko obecność tych genów jest niezbędna do wytwarzania kamityny. W zależności od wybranych warunków początkowych, np. wybranego materiału wyjściowego lub wybranego szczepu produkcyjnego, fragmenty DNA lub wektory użyte przy wytwarzaniu L-kamityny mogą zawierać jeden lub więcej genów biosyntezy kamityny.

Oprócz genów bcoA/B. bcoC i bcoD. fragmenty DNA i wektory według niniejszego wynalazku mogą, jeśli jest to pożądane, zawierać także potencjalny gen transportu bcoT.

Obecność genu dehydrogenazy L-kamitylu, tzn. genu bcoE, jest niepożądana, ponieważ w jego obecności ma miejsce degradacja L-kamityny. Obecność defektywnego genu bcoE (bcoE') jest jednak nieszkodliwa.

Korzystnie, geny biosyntezy L-kamityny, mianowicie bcoC, bcoA/B oraz bcoD i ewentualnie potencjalny gen transportu bcoT. do stosowania w wytwarzaniu L-kamityny, są obecne razem w jednym fragmencie DNA lub cząsteczce wektora, np. korzystnie w konwencjonalnym kierunku 5'-3' w dół od elementów regulacyjnych genu, w sekwencji bcoC. bcoA/B oraz bcoD lub bcoD lub bcoC, bcoA/B. bcoD i bcoT i w pojedynczej jednostce transkrypcyjnej określonej jak wyżej, odpowiadając ustawieniu w naturalnie występującym operonie butyrobetainy-L-kamityny. Geny bcoC. bcoA/B. bcoD oraz bcoT takiej jednostki transkrypcyjnej można scharakteryzować np. za pomocą odpowiednich sekcji mapy restrykcyjnej z fig. 2.

Transkrypcja lub ekspresja genów bco z korzyściąma miejsce pod kontrolą odpowiedniego, korzystnie silnego, promotora, Wybór promotora zależy od żądanych warunków ekspresji, np. od tego czy jest pożądana ekspresja konstytutywna lub indukowana, lub od organizmu, w którym ekspresja ma mieć miejsce. Odpowiednim promotorem jest np. promotor P_bco naturalnego operonu butyrobetainy-L-kamityny. Jeśli wyodrębnienie genów bco odpowiedzialnych za biosyntezę L-kamityny ma miejsce, np. z mikroorganizmu o defektywnym genie bcoE (bcoE'), korzystnie cały operon bco można np. wyodrębnić i klonować przy użyciu genu bcoE' i związanych z tym elementów regulacyjnych genu z tych mikroorganizmów i następnie użyć w odpowiednich mikroorganizmach do wytwarzania L-kamityny. Jednostkę transkrypcyjną tego typu o zmutowanym genie bcoE, takim jaki może być wyodrębniony, np. z Rhizobium/Agrobacterium HK1349, można ewentualnie scharakteryzować za pomocą mapy restrykcyjnej przedstawionej na fig. 2, jeśli defekt w bcoE przypisać np. jedynie do mutacji punktowej i nie wiązać z miejscem rozszczepiania restrykcyjnego. Dalszymi promotorami odpowiednimi dla ekspresji sąnp., promotory P_Nm, P_SI (M. Labes i in., Gene, 89, 37-46, 1990), promotor trp (Amann i m., Gene, 25, 167-178,1983), promotor lac (Amann i in., Gene 25,167-178,1983) oraz promotor tac, hybryda wspomnianych promotorów trp i lac, którą można zastosować jako promotor konstytutywny lub indukowalny (Russell i Bennett, Gene, 20, 231-243, 1982). Dla stosowania przy wytwarzaniu L-kamityny w odpowiednim szczepie produkcyjnym, fragmenty DNA według niniejszego wynalazku, obejmujące wspomniane geny bco, korzystnie razem w pojedynczej jednostce transkrypcyjnej, są włączone, z korzyścią przy pomocy znanych technik, w znane wektory, zwłaszcza wektory ekspresyjne, np. fagi lub plazmidy. Zastosowane wektory mogą to być wektory autonomiczne lub samoreplikujące lub alternatywnie tzw. wektory integracyjne. Wektor integracyjny rozumie się w tym kontekście jako wektor, np. plazmid, który ma co najmniej jedną sekwencję homologiczną do sekwencji genomowej szczepu biorcy i pozwala na insercję obcych genów do

180 300 genomu szczepu biorcy przez homologiczną rekombinację przy użyciu tej sekwencji. Korzystnie stosuje się wektory autonomiczne i samoreplikujące.

W zależności od charakteru wybranych wektorów, geny enzymów biosyntezy L-kamityny można poddać ekspresji w różnych organizmach. Odpowiednimi wektorami sązarówno wektory o specyficznym spektrum gospodarzy oraz wektory o szerokim spektrum gospodarzy (szeroki zakres gospodarzy) oraz wektory integracyjne opisane powyżej.

Zastosowane wektory o szerokim spektrum gospodarzy mogą być wszystkie wektorami, które są odpowiednie do bakterii gram-ujemnych. Przykładami takich wektorów o szerokim zakresie gospodarzy sąpVK100 (Knauf i Nester, Plasmid, 8, 45-54, 1982), pME285 (Haas i Itch, Gene, 36, 27-36, 1985), oraz pKT240 (Bagdasarian i in., Gene, 25, 273-282, 1983) lub ich pochodne. Użytą pochodną pVKl00 może być np. pVK1001, użytą pochodnąpME285 może być np. pAZIO, aużytąpochodnąpKT240 może być np. pL032 (jak już opisano w EP-A-O 543 344).

Wektorami integracyjnymi użytymi w przypadku Rhizobium/Agrobacterium mogą być wektory oparte na pACYC184 lub pBR322 (Comai i in., Plasmid, 10,21-30, 1983). W ten sposób, otrzymano np. plazmidy pVK100q, pVK1011 (fig. 3), pAZ7, pAZ7::beu, pAZIOl (fig. 4) orazpLO41. Plazmid pVK100q w Rhizobium/Agrobacterium HK1349 złożono 16. 11. 1993 w Niemieckiej Kolekcji Mikroorganizmów i Hodowli Komórkowych sp. z o. o., D-38124 Braunschweig, Mascheroderweg lb, pod numerem depozyt DSM 8726.

Dla wytwarzania szczepów produkcyjnych dla fermentacji tzn. szczepów wytwarzania L-kamityny, fragmenty DNA lub wektory według niniejszego wynalazku muszą być włączone do szczepów gospodarzy, które sąpożądane i odpowiednie dla ekspresji. Z korzyścią, mikroorganizmy są transformowane w tym celu w sposób, który jest typowy i znany samo przez się przy użyciu wektorów zawierających fragmenty DNA według niniejszego wynalazku. Mikroorganizmy te mogą następnie zawierać fragment DNA według niniejszego wynalazku na cząsteczce wektora lub wintegrowany w jego chromosom.

Odpowiednie szczepy produkcyjne są wszystkie mikroorganizmami, które są zdolne do wytwarzania L-kamityny z krotonobetainy i/lub γ -butyrobetamy i których zdolność degradacji (katabolizm) L-kamityny jest całkowicie lub częściowo inhibitowana. Mikroorganizmy, których katabolizm L-kamityny jest inhibitowany, sąnp. szczepami, które sąnegatywne względem dehydrogenazy kamityny tzn. szczepami, w których gen dehydrogenazy kamityny bcoEiest wyłączany, np., przez mutację lub delecję, i/lub szczepami, które są negatywne względem racemazy L,D-kamityny oraz negatywne względem dehydratazy L-kamityny.

Odpowiednie szczepy gospodarza, korzystnie szczepy o wysokiej tolerancji substratu i materiału wyjściowego, sąnp. mikroorganizmami rodzaj ów Escherischia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Comamonas oraz Rhizobium/Agrobacterium, przy czym te ostatnie są korzystne. Mikroorganizmy gatunkuRhizobium/Agrobacterium sp. HK13, HK133 lb oraz HK1349już opisane powyżej oraz również rodzaje HK1349.4 (jak opisano w EP-A-0 543 344) są szczególnie korzystne.

Ponadto ustalono, wydajność L-kamityny można jeszcze bardziej zwiększyć, jeśli jest zmniejszona zdolność szczepu gospodarza do rekombinacji tzn. jego tendencja do rekombinacji i częstotliwość rekombinacji. Rekombinacja z wektorem na podstawie homologii chromosomalnej jest przez to ograniczona. Zdolność do rekombinacji można zmniejszyć np. w znany sposób przez specyficzną mutację jego genu recA (mutacja recA). Szczególnie korzystnymi mikroorganizmami, o mniejszej zdolności do rekombinacji są mikroorganizmy gatunku Rhizobium/Agrobacterium sp., np. szczepy Rhizobium/Agrobacterium HK 1349.49 według niniejszego wynalazku otrzymane jak opisano poniżej.

Odpowiednie szczepy produkcyjne są zatem np. mikroorganizmami gatunku Rhizobium/Agrobacterium HK1349, HK1349.4 oraz HK1349.49, w każdym przypadku zawierającymi plazmid pVK100q, pVK1001, pAZ7, pAZ7::beu, pAZIOl lub pL041.

Transformowane szczepy gospodarza (szczepy produkcyjne) można wyodrębnić z selektywnej pożywki, do której jest dodany antybiotyk względem którego szczepy są odporne dzięki genowi markerowi umiejscowionemu na wektorze lub fragmencie DNA. Jeśli mikroorganizmy według EP-A-0 543 344 stosuje się jako szczepy produkcyjne, tzn. mikroorganizmy, których ko

180 300 dowanie genu chromosomowego dla wykorzystania betainy jest mutowane i transformowane przy użyciu plazmidu, który zawiera gen kodujący wykorzystanie betainy, można również selekcjonować ze względu na wykorzystanie betainy. Przykładami mikroorganizmów selekcjonowalnych ze względu na wykorzystanie betainy sąjuż wspomniane HK1349.4 oraz HK1349.49, które zawierają np. plazmid pL041, pAZIOl, pAZ7::beu lub pVK1011.

Biotechnologiczne wytwarzanie L-kamityny przeprowadza się przy użyciu mikroorganizmów, zawierających fragmenty DNA lub wektory według niniejszego wynalazku. Proces wytwarzania L-kamityny jest przeprowadzany sposobami znanymi samo przez się np. jak opisano w EP-A-0 158 194, poczynając od np. γ -butyrobetainy w obecności odpowiedniego źródła węgla i azotu. Użytymi źródłami węgla i azotu mogąbyć np. glutaminian, octan i betaina, lub gliceryna oraz betaina. Jeśli biotechnologiczne wytwarzanie jest przeprowadzane za pomocą mikroorganizmów selekcjonowalnych ze względu na wykorzystanie betainy, betainę stosuje się jako jedyne źródło azotu.

Fermentację i następujące po tym wyodrębnienie L-kamityny można wykonać analogicznie do sposobu opisanego w EP-A-0 158 194.

Poprzez zmianę składników odżywczych w pożywce oraz przez adaptację warunków fermentacji do konkretnego mikroorganizmu w zwykły sposób można wydajność L-kamityny jeszcze poprawić.

Przykład 1. Wytwarzanie mutantów insercji transpozonu (Tn5) i ich identyfikacja fenotypowa.

Spowodowano, że dzikiego typu szczep Rhizobium/Agrobacterium HK4 (DSM 2938, EP-B 0158 194) rozwinął spontaniczną odporność na streptomycynę (Sm, 1000 pg/ml) przez ciśnienie selekcji. Odporność ta była widocznie trwała przez 50 pokoleń bez selekcji i zastosowano ją jako marker selekcji.

0,2mlhodowli dawcy TnózE'. co li 817-l/pSUP2021 (R. Simoniin.,Biotechnology, 1983, 1, 784-790), zmieszano z 2 ml hodowli biorcy HK4 i odwirowano. Komórki przemyto w 0,9% roztworze soli (roztwór NaCl) i ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 100 μΐ 0,9% roztworu soli. Koniugację szczepu biorcy ze szczepem dawcy wykonano przez noc w 30°C na suchym agarze odżywczym. Zebrane komórki płytkowano w rozcieńczeniach na pożywce selekcyjnej dla biorcy (Sm^R) i transpozonu (odporność na neomycynę (Nm^R)).

Mutanty Tn5 otrzymano na agarze odżywczym przy użyciu Sm (1000 pg/ml) i Nm (100 pg/ml). Fenotypowa identyfikacja mutantów miała miejsce przez detekcję niewykorzystywania związków pośrednich metabolizmu butyrobetainy według fig. 1 jako źródła węgla (C) w pożywce minimalnej.

Przykład 2. Klonowanie fragmentów DNA znaczonych Tn5 z genomu HK4.

Wyodrębniony genomowy DNA z HK4 mutowanego Tn5 (5 pg) wytrawiono całkowicie przy użyciu EcoRI (4 U/pg). Na pBR325 (2,5 pg) (Gens, 1977, 2, 95-113) podziałano fosfatazą alkaliczną po całkowitym wytrawieniu za pomocą EcoRI. Rekombinacyjne plazmidy hybrydowe otrzymano po zmieszaniu genomowego DNA i pBR325 z ligaząT4-DNA (0,2 U (jedn.)/pg DNA) w 400 pl buforu ligacyjnego (20 mM tris-HCl, pH 7,2, 10 mM DTT (ditiotreitol), 10 mM MgC12, 0,6 mM ATP) oraz inkubacji przez noc w 12°C.

Próbki mieszaniny ligacyjnej użyto do transformacji (Cohen i in., 1972, PNAS 69, 2110-2114)E. co/zED8654(Barekiin.,Mol. Gen. Genet., 146,199-207, 1976). Transformanty wyselekcjonowano w pożywce na ich odporność na ampicylinę (Ap, 100 pg/ml) i kanamycynę (Km, 25 pg/ml). Wszystkie wyselekcjonowane plazmidy hybrydowe miały insert HK4, który był znaczony Tn5. Inserty mapowano na różne enzymy restrykcyjne, odpowiadające mapie restrykcyjnej na fig. 2. Porównania map restrykcyjnych potwierdziły insercję transpozonu w tym samym fragmencie genomowym w szeregu mutantów Tn5 o różnym fenotypie.

Było możliwe potwierdzenie tej obserwacji przez hybrydyzację „Southern błot” („Gentechnische Methoden” [Metody Inżynierii Genetycznej], red. S. Bertram i H. G. Gassen, G. Fischer Verlag 1991, 219) identycznie rozszczepionego DNA plazmidu i następujący po tym rozdział elektroforetyczny. Użyte sondy były podfragmentami tego klonowanego z mutantów transpozonu.

180 300

Przykład 3. Ustanowienie banku genów genomowego HK4 w fagach lambda.

Aby można było DNA upakować w fagach lambda, musi mieć on wielkość 40-52 kb i „cos-site”. Aby ustanowić bank genów genomowego HK 4 w fagach lambda, użyto wektor kosmidu pVKl 00 (Knauf i Nester, 1982, Plasmid 8,45-54), który ma wielkość 23 kb i tym samym pozwala na klonowanie fragmentów DNA między 17 a 29 kb.

pVK100 wytrawiono przy użyciu EcoRI, defosforylowano i ligowano przy użyciu HK4 DNA, który częściowo wytrawiono EcoRI. Idealne stężenie EcoRI dla częściowego wytrawiania HK4 DNA określono za pomocą trawienia próbnego jako 0,58 U/pg DNA lub 0,02 U/μΙ mieszaniny reakcyjnej, przy czym w mieszaninie reakcyjnej jest stosowane 8,5 pg HK4 DNA. Fragmenty DNA w zakresie wielkości większej niż 17 kb wyodrębniono z żelu elektroforetycznego z agarozą. Ligację przeprowadzono w objętościach 10 pl zawierających 100 ng wektora kosmidu oraz 400 ng Passenger-DNA. Następnie wykonano „pakowanie in vitro” odpowiadające protokołowi wytwórcy w mieszaninie Promega Biotec w ciągu 2 godz. w 25°C. Po transfekacji E. coli S17-1, przeprowadzono selekcję na odporność na Km wektora kosmidu. Około 5500 kolonii (indywidualne klony) otrzymano przy użyciu jednej szarży. Kolonie banku genów przechowywano w -70°C w pięciu szarżach około 1000 klonów każda w pożywce zamrażającej (Nutrient Yeast Broth, NYB, Oxoid oraz 50% gliceryny). Amplifikację banku genów wykonano przy użyciu 50pl każdej z tych szarż w 10 ml hodowli NYB przez noc, a następnie porcjowania.

Przykład 4. Skrining banku genów kosmidu HK4, identyfikacja klonów kosmidu noszącego gen bco za pomocą hybrydyzacji kolonii, hybrydyzacji „Dot blotting” lub bezpośredniej komplementacji mutantów HK.

Możliwe było użycie klonowanych, znaczonych Tn5 fragmentów DNA jako prób hybrydyzacyjnych. Klony o odpowiednich sekwencjach DNA wykazywały sygnały hybrydyzacyjne i prowadziły do komplementacji defektywnego genu w każdym przypadku w mutancie HK4. Hybrydyzacje krzyżowe DNA z różnych mutantów potwierdziły „klasterowanie” kilku genów metabolizmu butyrobetainy na fragmencie DNA o 10,6 kb (fig. 2).

Hybrydyzację kolonii wykonano w zwykły sposób (S. Bertram i H. G. Gassen, 1991, ibid. 221). Próbę „Dot blotting” również wykonano znanym sposobem (S. Bertram i H. G. Gassen, 1991, ibid. 217£).

Przykład 5. KomplementacjamutantówHK.

Po dokładnej lokalizacji indywidualnych genów metabolizmu butyrobetainy uwzględniając wielkości molekularne na podstawie zidentyfikowanych łańcuchów peptydowych, było możliwe osiągnięcie komplementacji indywidualnych mutantów przez poszczególne odcinki genów.

Konkretny plazmid ekspresyjny pVK100: :HK-DNA wintegrowano poprzez koniugację E. coli SI7-1 w szczepy HK4 Rhizobium/Agrobacterium sp. według przykładu 1, które zawierały mutacje dla różnych etapów metabolicznych (zob. fig. 1). Selekcję wykonano względem auksotrofii proliny (pro) dawcy oraz na odporność antybiotykową wektora (Km^RTc (tetracyklina)¹³).

Przykład 6

6.1 Klonowanie fragmentu bco ze szczepu HK1349 (DSM 3944) i pochodnych.

Aby osiągnąć wpływ dawki genu oraz wzrost produktywności w szczepie produkcyjnym, sklonowano operon bco z HK 1349 (DSM 3944, EP-A-0 543 344). W tym szczepie, cały operon bco jest zawarty w pełnej postaci, lecz pierwszy gen, bcoE. dla dehydrogenazy kamityny-CoA jest mutowany. Fragment DNA zawierający operon bco i otrzymany z tego szczepu jest zatem idealny dla wzrostu produktywności na skutek dużej liczby kopii wektorów ekspresji.

Klonowania wykonano w znany sposób w E. coli SI7-1, odpowiednio do przykładu 3 z EP-A-0 543 344. W tym celu, operon bco o 10,6 kb wyodrębniono z banku genów HK1349 i ligowano w pVK100. W wyniku tego uzyskano plazmid pVK100q (zob. schemat budowy według fig. 6). Selekcję przeprowadzono w E. coli S17-1 na Km (25 pg/ml) NYB. Poprawny insert zidentyfikowano na mutantach HK według sposobu opisanego w przykładzie 5. DNA z HK1349 rozszczepione za pomocąEcoRI oddzielono elektroforetycznie i fragmenty w zakresie wielkości 10,6 kb wyodrębniono z żelu. Wyodrębnione fragmenty ligowano w pVK100 rozszczepionym EcoRI. Przy użyciu tej mieszaniny plazmidu hybrydowego, SI7-1 (auksotrof) E.

180 300 coli transformowano i selekcjonowano na pożywce agarowej Km (25 pg/ml). Poprawny klon plazmidu hybrydowego z wektora i fragmentu DNA o wielkości 10,6 kb zawierający operon bco zidentyfikowano za pomocą „patch-mating” na trawniku z mutanta (HK4V4) negatywnego względem syntetazy butyrobetainy-CoA na pożywce minimalnej z 0,2% (wag./obj.) butyrobetainy jako źródła C i N. Poprawny klon był zdolny, po koniugatywnym przeniesieniu tego rodzaju do mutanta, do komplementowania komórek w wykorzystywaniu tego źródła C. Klon pVKl 00q zidentyfikowany w ten sposób został użyty bezpośrednio jako plazmid produkcyjny lub jako rezerwuar dla fragmentu DNA posiadającego operon bco dla dalszego subklonowania.

6.2 . Konstruowanie pAZIOl, pAZ7, pVK1011 i pVK100q, pL041 oraz pAZ7::beu.

pAZIOl, pAZ7, pVK1011 i pVK100q skonstruowano według schematu budowy z fig. 6. pLO41 skonstruowano poczynając od pLO32 (EP-A-0 543 344) przez insercję genów bco (fragment 10,6 kb EcoRI/EcoRI) i skonstruowano plazmid pAZ7::beu wychodząc z pAZ7 (fig. 6) przez insercję genów beo (fragment Pstl/Pstl 3 kb, EP-A-0 543 344). Zastosowano odpowiednie enzymy restrykcyjne z 3-5 U/pg DNA według danych podanych przez wytwórcę. Plazmid pVK100q otrzymano przez insercję genów bco w pVK100 (Knauf i Nester; ibid). Wyjściowy plazmid pVKl 00sl (schemat budowy fig. 6) otrzymano przez klonowania delecji EcoRI plazmidu pVK100s (EP-A-0 543 344).

Przykład 7. Wprowadzenie mutacji recA do HK1349.4.

7.1. Identyfikacja klonu banku genów kodującego recA.

Bank genów kosmidu genomowego HK4 zbadano na klony kodujące recA z pomocą metody hybrydyzacji kolonii (S. Bertram i H. G. Gassen, 1991, ibid, 221). Sondą użytą do hybrydyzacji był klonowany gen recA z Rhizobium leguminosarum (W. Selbitschka i in., Mol. Gen. Genet., 299, 1991, 86-95). Znaczony klon kosmidu wyodrębniono i fragmenty insertu DNA EcoRI otrzymane po wytrawianiu EcoRI zbadano na sekwencje homologiczne do recA za pomocą hybrydyzacji „Southern biot” względem sondy recA (S. Bertram i H. G. Gassen, 1991, ibid, 219). Fragment EcoRI znaczony w ten sposób ligowano do wektora pVK100, który rozszczepiono w tym samym stopniu. Przy użyciu uzyskanego plazmidu hybrydowego pVK100rl, komórki SI 7-1 E. coli transformowano dla replikacji DNA.

7.2. Wprowadzenie genu odporności na kanamycynę do HK1349.4 dla inaktywacji chromosomalnego genu recA.

Fragment EcoRI 11,0 kb reklonowano z pVK100rl do pACYC184 (A. C. Y. Chang i S. N. Cohen, J. BacterioL, 134, 1978, 1141-1156), który rozszczepiono EcoRI.

Odpowiednio do oznaczonej mapy restrykcyjnej, podfragment o wielkości 3,1 kb rozszczepiony przez Bglll-Nrul, który znaczono względem sondy recA w hybrydyzacji „Southern biot”, sklonowane do wektora pWS233, który był rozszczepiony przez BamHI-Hindin. pWS233 jest wektorem „gene replacement” i jest opisany w: W. Selbitschka i in., Appl. Microbiol. Biotechnol. 38, 1993,615-618.

Fragment DNA Xhol z Tn5 (pSUP2021, R. Simon i in., Biotechnology, 1,1983, ibid), kodujący odporność na Km sklonowane w miejscu rozszczepiania Xhol uzyskanego plazmidu pCC45. W wyniku tego uzyskano pCC49. Analogicznie do procedury według W. Selbitschka i in., 1993, ibid, „zastępowanie genu” wykonano w następujący sposób:

ml eksponencjalnej hodowli HK1349.4 połączono z 1 ml eksponencjalnej hodowli dawcy (S17-l/pCC49), odwirowano i przemyto 0,9?/o roztworuNaCl. Komórki inkubowano w 30°C przez noc na agarze odżywczym w 50 μΐ NYB. Komórki, które przeprowadzono ponownie w stan zawiesiny w 0,9% roztworze NaCl, następnie naniesiono w odpowiednim rozcieńczeniu na selektywne pożywki. Transkoniuganty biorców HK1349.4 odpornych na Sm otrzymano na agarze odżywczym przy użyciu Sm (1000 pg/ml) oraz Nm (150 pg/ml) i wykazały one wrażliwość na 5% sacharozy w złożonej pożywce odpowiadającej genom sacRB na wektorze „replacement”.

Podwójne rekombinacje otrzymano z niskączęstotliwością(l 0’⁸) po wyhodowaniu wybranych transkoniugantów bez ciśnienia selekcji na agarze odżywczym: Po około 1 tygodniu było możliwe wyodrębnienie komórek, które tolerowały 5% sacharozy w pożywce, pozostały odporne na Nm, lecz stały się znów wrażliwe na gentamycynę (Gm) (marker wektora). Ten fenotyp po

180 300 twierdza wymianę allejowego markera i wskazuje na mutację recA w HK1349.4. Można zaobserwować typowy fenotyp (np. wrażliwość na UV itp.) mutantów recA.

W szczepie HK1349.49 otrzymanym w ten sposób, tendencja chromosomowej integracji plazmidów z sekwencjami homologicznymi (homologiczna rekombinacja) jest wyraźnie zmniejszona. Szczep jest zatem wysoce odpowiednim gospodarzem dla plazmidów hybrydowych przedstawionych w przykładzie 6.2.

Przykład 8. Biotransformacja.

Biotransformację przeprowadzono w kolbach do wytrząsania (100 ml) przy użyciu pożywki minimalnej wolnej odN (MM; Kulla i in., Arch. Microbiol., 1983,135, s. 1-7), zawierającej 0,2% (wag./obj.) γ -butyrobetainy (materiał wyjściowy) oraz, jako źródło C, 0,4% (wag./obj.) gliceryny. Jako źródło N i dodatkowe źródło C, dodano 0,2% (wag./obj.) L-glutaminianu (ze szczepami negatywnymi w wykorzystaniu betainy) lub 0,2% (wag./obj.) betainy. Zastosowane szczepy produkcyjne były szczepami według wynalazku HK1349.4/pL041, HK1349.4/pVK1011, HK1349.4/pAZ7::beu, HK1349.4/pAZ101,HK1349/pVK100q oraz HK1349/pAZ7. Wyniki podanowtabeli 1 wporównaniu z pochodnymi HK13: HK1349 (DSM 3944) oraz HK1349.4 znanymi z EP-A-0 543 344.

Tworzenie L-kamityny z γ -butyrobetainy oznaczono metodąDTNB (5,5'-dwutiobis(2-nitrobenzoesanu) opisaną u Bergmeyera (Η. K. Bergmeyer, 1974, Methoden der enzymatischen Analyse [Metody analizy enzymatycznej], Yerlag Chemie, 1810).

Szczepy	Pożywka MM & gliceryna	Aktywność właściwa mmoIi/l/h/OD
HK1349 (nie według wynalazku)	& betaina	0,24
K1349/pVK100q	& betaina	0,36
HK1349/pAZ7	& betaina	0,49
HK1349 (nie według wynalazku)	& L-glutaminian	0,14
HK1349.4 (nie według wynalazku)	& L-glutaminian	0,11
HK1349.4/pL041	& L-glutaminian	0,29
HK1349.4 (nie według wynalazku)	& amoniak	0,12
HK1349.4/pVK1011	& betaina	0,54
HK1349.4/pAZ7::beu	& betaina	0,47
HK1349.4/pAZ101	& betaina	1,08

180 300

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Wyodrębniony fragment DNA, obejmujący co najmniej jeden spośród genów bęoC, bcoA/B oraz bcoD dla biosyntezy L-kamityny, kodujący dehydrogenazę γ -butyrobetainy-CoA (bcoC), syntetazę γ -butyrobetaina/krotonobetaina-CoA (bcoA/B) lub hydrolazę krotonobetainy-CoA (bcoD), wybrany z grupy obejmującej:

a) fragment 10,6 kb EcoRI, wstawiony w plazmid pVK100q, zdeponowany w RhizobiumlAgrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, oraz jego podfragmenty; jak również

b) fragmenty, które hybrydyzująze wskazanym wyżej fragmentem 10,6 kb EcoRI lub jego podfragmentami i kodują enzymy o aktywnościach dehydrogenazy γ -butyrobetainy-CoA, syntetazy γ -butyrobetainy/krotonobetainy-CoA i/lub hydrolazy krotonobetainy-CoA.
2. Fragment DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje ponadto gen bcoT przypisany do metabolizmu γ -butyrobetaina/krotonobetaina i kodujący proteinę potencjalnego transportu.
3. Fragment DNA według zastrz. 1, albo 2, znamienny tym, że geny bcoC, bcoA/B. bcoD i ewentualnie bcoT są wyprowadzone z mikroorganizmów rodzajów Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium oraz Rhizobium/Agrobacterium.
4. Fragment DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że geny są operacyjnie połączone z elementami kontroli genetycznej niezbędnymi dla ekspresji, takimi jak promotory i miejsca wiązania rybosomów.
5. Fragment DNA według zastrz. 4, znamienny tym, że geny biosyntezy L-kamityny są ustawione w sekwencji bcoC, bcoA/B i bcoD lub ewentualnie bcoC. bcoA/B. bcoD oraz bcoT i są obecne jako pojedyncza jednostka transkrypcyjna.
6. Fragment DNA według zastrz. 4, znamienny tym, że element regulacyjny genów obejmuje promotor naturalnego operonu bco, P_bco.
7. Fragment DNA według zastrz. 1 albo 4, albo 5, albo 6, znamienny tym, że geny bcoC, bcoA/B, bcoD oraz bcoT są scharakteryzowane poniższą mapą restrykcyjną:

0 I 2 3 ą S 6 7 B bcoC bcoA/ B bcoD bco T

180 300
8. Wektor zawierający fragment DNA, obejmujący co najmniej jeden spośród genów bcoC. bcoA/B oraz bcoD dla biosyntezy L-kamityny, kodujący dehydrogenazę γ -butyrobetainy-CoA (bcoC), syntetazę γ -butyrobetaina/krotonobetaina-CoA (bęoA/B) lub hydrolazę krotonobetainy-CoA (bcoD), wybrany z grupy obejmującej:

a) fragment 10,6 kb EcoRI, wstawiony w plazmid pVK100q, zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, oraz jego podfragmenty; jak również

b) fragmenty, które hybrydyzują ze wskazanym wyżej fragmentem 10,6 kb EcoRI lub jego podfragmentami i kodują enzymy o aktywnościach dehydrogenazy γ -butyrobetainy-CoA, syntetazy γ -butyrobetainy/krotonobetamy-CoA i/lub hydrolazy krotonobetainy-CoA.
9. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że fragment DNA obejmuje ponadto gen bcoT przypisany do metabolizmu γ -butyrobetaina/krotonobetaina i kodujący proteinę potencjalnego transportu.
10. Wektor według zastrz. 8 albo 9, znamienny tym, że we fragmencie DNA geny bcoC, bcoA/B. bcoD i ewentualnie bcoT są wyprowadzone z mikroorganizmów rodzajów Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium oraz Rhizobium/Agrobacterium.
11. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że we fragmencie DNA geny są operacyjnie połączone z elementami kontroli genetycznej niezbędnymi dla ekspresji, takimi jak promotory i miejsca wiązania rybosomów.
12. Wektor według zastrz. 11, znamienny tym, że we fragmencie DNA geny biosyntezy L-kamityny są ustawione w sekwencji bcoC, bcoA/B i bcoD lub ewentualnie bcoC. bcoA/B. bcoD oraz bcoT są obecne jako pojedyncza jednostka transkrypcyjna.
13. Wektor według zastrz. 11, znamienny tym, że we fragmencie DNA element regulacyj ny genów obejmuje promotor naturalnego operonu bco, P_bco.
14. Wektor według zastrz. 8 albo 11, albo 12, albo 13, znamienny tym, że we fragmencie DNA geny bcoC. bcoA/B, bcoD oraz bcoT są scharakteryzowane poniższą mapąrestrykcyjną:

0 ί 23^5678 bcoC bcoA/B bcoD bCO T
15. Wektor według zastrz. 8, którym jest plazmid pVK100q zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, plazmid pVK1011 scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 3 i plazmid pAZIOl scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 4.
16. Mikroorganizm rekombinacyjny, wybrany spośród mikroorganizmów rodzajów Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Comamonas oraz Rhizobium/Agrobacterium i zawierający fragment DNA, obejmujący co najmniej jeden spośród genów bcoC. bcoA/B oraz bcoD dla biosyntezy L-kamityny, kodujący dehydrogenazę γ -butyrobetainy-CoA (bcoC),

180 300 syntetazę γ -butyrobetaina/krotonobetaina-CoA (bcoA/B) lub hydrolazę krotonobetainy-CoA (bcoD). wybrany z grupy obejmującej:

a) fragment 10,6 kb EcoRI, wstawiony w plazmid pVK100q, zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, oraz jego podfragmenty; jak również

b) fragmenty, które hybrydyzująze wskazanym wyżej fragmentem 10,6 kb EcoRI lub jego podfragmentami i kodują enzymy o aktywnościach dehydrogenazy γ -butyrobetamy-CoA, syntetazy γ -butyrobetainy/krotonobetainy-CoA i/lub hydrolazy krotonobetainy-CoA; lub wektor, zawierający wskazany wyżej fragment DNA.
17. Mikroorganizm według zastrz. 16, znamienny tym, że fragment DNA obejmuje ponadto gen bcoT przypisany do metabolizmu γ -butyrobetaina/krotonobetaina i koduj ący proteinę potencjalnego transportu.
18. Mikroorganizm według zastrz. 16 albo 17, znamienny tym, że we fragmencie DNA geny bcoC, bęoA/B, bcoD i ewentualnie bcoT są wyprowadzone z mikroorganizmów rodzajów Escherischia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium oraz Rhizobium/Agrobacterium.
19. Mikroorganizm według zastrz. 16, znamienny tym, że we fragmencie DNA geny są operacyjnie połączone z elementami kontroli genetycznej niezbędnymi dla ekspresji, takimi jak promotory i miejsca wiązania rybosomów.
20. Mikroorganizm według zastrz. 19, znamienny tym, że we fragmencie DNA geny biosyntezy L-kamityny są ustawione w sekwencji bcoC. bcoA/B i bcoD lub, jeśli ma to zastosowanie, bcoC. bcoA/B, bcoD oraz bcoT i są obecne jako pojedyncza jednostka transkrypcyjna.
21. Mikroorganizm według zastrz. 19, znamienny tym, że we fragmencie DNA element regulacyjny genów obejmuje promotor naturalnego operonu bco, P_bco.
22. Mikroorganizm według zastrz. 16 albo 19, albo 20, albo 21, znamienny tym, że we fragmencie DNA geny bcoC. bcoA/B. bcoD oraz bcoT są scharakteryzowane poniższą mapąrestrykcyjną:

0 ί 2 3 q S 6 7 8 bcoA/B bcoD bco T
23. Mikroorganizm będący Rhizobium/Agrobacterium HK 1349, obejmującym plazmid pVK100q zdeponowany pod numerem depozytowym DSM 8726, plazmid pVK1011, scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 3 lub plazmid pAZIOl, scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 4 oraz genetyczne odmiany i mutanty wyprowadzone z takich mikro- organizmów, o zdolności do biosyntezy L-kamityny.
24. Mikroorganizm będący Rhizobium/Agrobacterium HK 1349.4, obejmującym plazmid pVK100q zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM

180 300

8726, plazmid pVK1011, scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 3 lub plazmid pAZl 01, scharakteryzowany mapąrestrykcyjną według fig. 4 oraz genetyczne odmiany i mutanty wyprowadzone z takich mikroorganizmów o zdolności do biosyntezy L-kamityny.
25. Biotechnologiczny sposób wytwarzania L-kamityny, znamienny tym, że krotonobetainę i/lub γ -butyrobetainę poddaje się fermentacji w obecności odpowiedniego źródła węgla i azotu, jak glutaminian, octan i betaina, bądź gliceryna i betaina, stosując mikroorganizm rekombinacyjny, wybrany spośród mikroorganizmów rodzajów Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Comamonas oraz Rhizobium/Agrobacterium i zawierający fragment DNA, obejmujący co najmniej jeden spośród genów bcoC. bcoA/B oraz bcoD dla biosyntezy L-kamityny, kodujący dehydrogenazę γ -butyrobetainy-CoA (bcoCL syntetazę γ -butyrobetaina/krotonobetaina-CoA (bęoA/B) lub hydrolazę krotonobetainy-CoA (bcoD), wybrany z grupy obejmującej:

a) fragment 10,6 kb EcoRI, wstawiony w plazmid pVK100q, zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, oraz jego podfragmenty; jak również

b) fragmenty, które hybrydyzująze wskazanym wyżej fragmentem 10,6 kb EcoRI lub jego podfragmentami i kodują enzymy o aktywnościach dehydrogenazy γ -butyrobetainy-CoA, syntetazy γ -butyrobetainy/krotonobetainy-CoA i/lub hydrolazy krotonobetainy-CoA; lub wektor, zawierający wskazany wyżej fragment DNA, a następnie wyodrębnia się wytworzonąL-kamitynę.
26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny, w którym fragment DNA obejmuje ponadto gen bcoT przypisany do metabolizmu γ -butyrobetaina/krotonobetaina i kodujący proteinę potencjalnego transportu.
27. Sposób według zastrz. 25 albo 26, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny, w którym fragment DNA obejmuje geny bcoC. bęoA/B, bcoD i ewentualnie bcoT wyprowadzone z mikroorganizmów rodzajów Escherischia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium oraz Rhizobium/Agrobacterium.
28. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny, w którym we fragmencie DNA geny są operacyjnie połączone z elementami kontroli genetycznej niezbędnymi dla ekspresji, takimi jak promotory i miejsca wiązania rybosomów.
29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny, w którym we fragmencie DNA geny biosyntezy L-kamityny są ustawione w sekwencji bcoC. bcoA/B i bcoD lub, jeśli ma to zastosowanie, bcoC. bcoA/B. bcoD oraz bcoT i są obecne jako pojedyncza jednostka transkrypcyjna.
30. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że stosuje się mikroorgaznim rekombinacyjny, w którym we fragmencie DNA element regulacyjny genów obejmuje promotor naturalnego operonu bco, P_bco.
31. Sposób według zastrz. 25 albo 28, albo 29, albo 30, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny, w którym we fragmencie DNA fragment DNA geny bcoC. bcoA/B, bcoD oraz bcoT są scharakteryzowane poniższą mapą restrykcyjną:

0 123^5678 bcoC bcoA/B bcoD bco T

180 300
32. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny Rhizobium/Agrobacterium HK1349, obejmujący plazmid pVK100q zdeponowany pod numerem depozytowym DSM 8726, plazmid pVK1011, scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 3 lub plazmid pAZIOl, scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 4, bądź genetyczne odmiany i mutanty wyprowadzone z takich mikroorganizmów o zdolności do biosyntezy L-kamityny.
33. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny Rhizobium/Agrobacterium HK 1349.4, obejmujący plazmid pVK100q zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, plazmid pVK1011, scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 3 lub plazmid pAZIOl, scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 4, bądź genetyczne odmiany i mutanty wyprowadzone z takich mikroorganizmów o zdolności do biosyntezy L-kamityny.