PL180300B1 - wektor zawierajacy taki fragment DNA, a takze mikroorganizmzawierajacy wskazany fragment DNA badz wektor oraz biotechnologiczny sposób wytwarzania L-karnityny PL PL PL PL PL - Google Patents
wektor zawierajacy taki fragment DNA, a takze mikroorganizmzawierajacy wskazany fragment DNA badz wektor oraz biotechnologiczny sposób wytwarzania L-karnityny PL PL PL PL PLInfo
- Publication number
- PL180300B1 PL180300B1 PL94313968A PL31396894A PL180300B1 PL 180300 B1 PL180300 B1 PL 180300B1 PL 94313968 A PL94313968 A PL 94313968A PL 31396894 A PL31396894 A PL 31396894A PL 180300 B1 PL180300 B1 PL 180300B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- bcod
- dna fragment
- rhizobium
- bcoa
- bcoc
- Prior art date
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 130
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 79
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 58
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 title claims abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 24
- PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-N (R)-carnitine Chemical compound C[N+](C)(C)C[C@H](O)CC([O-])=O PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-N 0.000 title abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 141
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 70
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 claims abstract description 68
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims abstract description 67
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 44
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 28
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 claims abstract description 24
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 17
- GUYHPGUANSLONG-SNAWJCMRSA-N (E)-4-(trimethylammonio)but-2-enoate Chemical compound C[N+](C)(C)C\C=C\C([O-])=O GUYHPGUANSLONG-SNAWJCMRSA-N 0.000 claims abstract description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims abstract description 13
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 8
- 241000589519 Comamonas Species 0.000 claims abstract description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 4
- 229940022663 acetate Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 claims abstract description 4
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 229960005150 glycerol Drugs 0.000 claims abstract description 4
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims abstract 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 47
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 20
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 16
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 10
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims description 9
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 6
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 claims description 4
- JHPNVNIEXXLNTR-UHFFFAOYSA-O 4-(trimethylammonio)butanoic acid Chemical compound C[N+](C)(C)CCCC(O)=O JHPNVNIEXXLNTR-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 62
- JHPNVNIEXXLNTR-UHFFFAOYSA-N 4-(trimethylammonio)butanoate Chemical compound C[N+](C)(C)CCCC([O-])=O JHPNVNIEXXLNTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 12
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 5
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 5
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 5
- 229930195714 L-glutamate Natural products 0.000 description 4
- 241000589187 Rhizobium sp. Species 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 241000589159 Agrobacterium sp. Species 0.000 description 3
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 2
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000020446 Cardiac disease Diseases 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 108010067121 Gamma-butyrobetaine dioxygenase Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 101150105245 HK4 gene Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 102000004879 Racemases and epimerases Human genes 0.000 description 1
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 description 1
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 241000589194 Rhizobium leguminosarum Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 102000052653 gamma-Butyrobetaine Dioxygenase Human genes 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007102 metabolic function Effects 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/007—Carnitine; Butyrobetaine; Crotonobetaine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/743—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Agrobacterium; Rhizobium; Bradyrhizobium
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
obejmujacej a) fragment 10,6 kb EcoRI, wstawiony w plazmid pVK100q, zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, oraz jego podfragmenty, jak równiez b) fragmenty, które hybrydyzuja ze wskazanym wyzej fragmentem 10,6 kb EcoRI lub jego podfragmentami i koduja enzymy o aktywnosciach dehydroge- nazy ? -butyrobetainy-CoA, syntetazy ? -butyrobetainy/krotonobetainy-CoA i/lub hydrolazy krotonobetainy-CoA 8 Wektor zawierajacy fragment DNA, obejmujacy co najmniej jeden sposród genów bcoC, bcoA/B oraz bcoD dla biosyntezy L-karnityny, kodujacy dehy- drogenaze y -butyrobetainy-CoA (bcoC), syntetaze ? -butyrobetaina/krotonobetaina-CoA (bcoA/B) lub hydrolaze krotonobetainy-CoA (bcoD), wybrany z gru- py obejmujacej a) fragment 10,6 kb EcoRI, wstawiony w plazmid pVK100q, zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, oraz jego podfragmenty, jak równiez b) fragmenty, które hybrydyzuja ze wskazanym wyzej fragmentem 10,6 kb EcoRI lub jego podfragmentami i koduja enzymy o aktywnosciach dehydroge- nazy ? -butyrobetainy-CoA, syntetazy ? -butyrobetainy/krotonobetainy-CoA i/lub hydrolazy krotonobetainy-CoA 16 Mikroorganizm rekombinacyjny, wybrany sposród mikroorganizmów rodzajów Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Comamonas oraz Rhizobium/Agrobacterium i zawierajacy fragment DNA, obejmujacy co najmniej jeden sposród genów bcoC, bcoA/B oraz bcoD dla biosyntezy L-karnity- ny, kodujacy dehydrogenaze ? -butyrobetainy-CoA (bcoC), syntetaze ? -butyrobetaina/krotonobetaina-CoA (bcoA/B) lub hydrolaze krotonobetainy-CoA (bcoD), wybrany z grupy obejmujacej a) fragment 10,6 kb EcoRI, wstawiony w plazmid pVK100q, zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, oraz jego podfragmenty, jak równiez b) fragmenty, które hybrydyzuja ze wskazanym wyzej fragmentem 10,6 kb EcoRI lub jego podfragmentami i koduja enzymy o aktywnosciach dehydroge- nazy ? -butyrobetainy-CoA, syntetazy ? -butyrobetainy/krotonobetainy-CoA i/lub hydrolazy krotonobetainy-CoA, lub wektor, zawierajacy wskazany wyzej fragment DNA 25 Biotechnologiczny sposób wytwarzania L-karnityny, znamienny tym, ze krotonobetaine i/lub ? -butyrobetaine poddaje sie fermentacji w obecnosci od- powiedniego zródla wegla i azotu, jak glutaminian, octan i betaina, badz gliceryna i betaina, stosujac mikroorganizm rekombinacyjny, wybrany sposród mikro- organizmów rodzajów Escherichia, Pseudomonas, Agrobactertum, Rhizobium, Comamonas oraz Rhizobium/Agrobacterium i zawierajacy fragment DNA, obejmujacy co najmniej jeden sposród genów bcoC , b c o A/B oraz bcoD dla biosyntezy L-karnityny, kodujacy dehydrogenaze ? -butyrobetainy-CoA (bcoD), synteta- ze ? -butyrobetaina/krotonobetaina-CoA (bcoA/B) lub hydrolaze krotonobetainy-CoA (bcoD). wybrany z grupy obejmujacej a) fragment 10,6 kb EcoRI, wstawiony w plazmid pVK100q, zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, oraz jego podfragmenty, jak ró w n ie z ..................................... PL PL PL PL PL
Description
Niniejszy wynalazek dotyczy wyodrębnionego fragmentu DNA, obejmującego geny metabolizmu butyrobetaina/krotonobetaino-L-kamityna, wektora, zawierającego taki fragment DNA, a także mikroorganizmu, zawierającego wskazany fragment DNA bądź wektor, oraz biotechnologicznego sposobu wytwarzania L-kamityny.
L-Kamityna jest naturalną witaminopodobnąsubstancją o dużym znaczeniu w metabolizmie u człowieka. Przy wykorzystaniu kwasów tłuszczowych, L-kamityna ma zasadnicze znaczenie jako substancja-transmiter błony mitochondrialnej, a zatem transporter energii metabolicznej. Jeśli L-kamityna jest syntetyzowana w nieodpowiednich ilościach przez organizm, należy ją dodawać do pożywienia dla uniknięcia objawów niedoboru. Zwłaszcza w pożywieniu małych dzieci, które są wciąż niezdolne do biosyntezy własnej L-kamityny, L-kamityna jest zasadniczym składnikiem odżywczym.
Preparaty L-kamityny stosuje się jako składniki aktywne produktów farmaceutycznych. Uzupełnienie L-kamityną jest wskazane w przypadku niedoboru kamityny i innych wskazań terapeutycznych, zwłaszcza w zaburzeniach sercowych itp.
Znana jest biosynteza L-kamityny u wyższych organizmów, dalsze funkcje metaboliczne oraz znaczenie dla metabolizmu są przedmiotami intensywnych działań badawczych. Oprócz drogi metabolizmu, opisanej dla mikroorganizmów, zwłaszcza gatunku Pseudomonas (kataliza hydroksylazy γ -butyrobetainy, Lindtstedt i in., Biochemistry 16,2181 -2188,1977), L-kamityna jest tworzona jako metaboliczny produkt pośredni pewnych mikroorganizmów, np. Agrobacterium/Rhizobium sp. EP-A-0 158 194 ujawnia proces mikrobiologicznego wytwarzania L-kamityny, poczynając od, np. γ -butyrobetainy, w której mutanty produkcyjne negatywne względem dehydrogenazy L-kamitylu otrzymuje się za pomocą tradycyjnych procesów selekcji mikrobiologicznej, przy użyciu których uzyskuje się stosunkowo dobre wydajności L-kamityny już przy czasach reakcji od 20 do 30 godz. Dalsza optymalizacja tego procesu względem wydajności w funkcji objętości/czasu, me jest jednak możliwa przy użyciu klasycznej metody mikrobiologicznej.
Celem niniejszego wynalazku jest zatem dostarczenie bardziej ekonomicznego procesu biotechnologicznego wytwarzania L-kamityny, w których L-kamitynę otrzymuje się przy znacząco krótszym czasie reakcji przy jeszcze wyższych wydajnościach.
Badania nad metabolizmem γ -butyrobetaina/krotonobetaina doprowadziły do identyfikacji pięciu genów, bcoA/B, bcoC, bcoD. bcoE i bcoT, które kodują enzymy drogi metabolizmu γ -butyrobetaina/krotonobetaina i są zawarte m.in. w operonie tzw. operonie butyrobetaino-L-kamityny (bco). W tym kontekście skróty mają następujące znaczenie:
bcoA/B: gen syntetazy γ -butyrobetainy-CoA (bcoA)/syntetazy krotonobetainy-CoA (bcoB) tzn. unikalny gen kodujący produkt enzymu, o aktywności syntetazy γ -butyrobetainy-CoA oraz syntetazy krotonobetainy-CoA.
bcoC: gen dehydrogenazy γ -butyrobetainy-CoA.
bcoD: gen hydrolazy krotonobetainy-CoA.
180 300 bcoE: gen dehydrogenazy L-kamitylu; oraz bcoT: potencjalny gen układu transportu.
Ustalono, że produkty genowe genów bcoA/B. bcoC oraz bcoD są odpowiedzialne za biosyntezę L-kamityny, podczas gdy bcoE koduje dehydrogenazę kamityny, co powoduje degradację metabolicznego produktu pośredniego L-kamitylu-CoA do betainy. bcoT jest prawdopodobnie genem kodującym proteinę transportową układu transportu przypisanego do metabolizmu butyrobetainy. Gen ten nie jest istotny dla biosyntezy L-kamityny.
Niniejszy wynalazek dotyczy zatem fragmentów DNA i wektorów, które obejmująjeden lub więcej genów bcoC. bcoA/B oraz bcoD. kodujących enzymy biosyntezy L-kamityny w metabolizmie γ -butyrobetaina/krotonobetaina i ewentualnie dodatkowo potencjalny gen transportu bcoT.
Wynalazkiem objęty jest wyodrębniony fragment DNA, obejmujący co najmniej jeden spośród genów bcoC. bcoA/B oraz bcoD dla biosyntezy L-kamityny, kodujący dehydrogenazę γ -butyrobetainy-CoA (bcoC), syntetazę γ -butyrobetaina/krotonobetaina-CoA (bcoA/B) lub hydrolazę krotonobetainy-CoA (bcoD). wybrany z grupy obejmującej:
a) fragment 10,6 kb EcoRI, wstawiony w plazmid pVK100q, zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium E1K 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, oraz jego podfragmenty; jak również
b) fragmenty, które hybrydyzująze wskazanym wyżej fragmentem 10,6 kb EcoRI lub jego podfragmentami i kodują enzymy o aktywnościach dehydrogenazy γ -butyrobetainy-CoA, syntetazy γ -butyrobetainy/krotonobetainy-CoA i/lub hydrolazy krotonobetainy-CoA.
Korzystnie, fragment DNA według wynalazku obejmuje ponadto gen bcoT przypisany do metabolizmu γ -butyrobetaina/krotonobetaina i kodujący proteinę potencjalnego transportu.
Korzystnie, we fragmencie DNA według wynalazku geny bcoC, bcoA/B, bcoD i ewentualnie bcoT są wyprowadzone z mikroorganizmów rodzaj ów Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium oraz Rhizobium/Agrobactenum.
We fragmencie DNA według wynalazku wskazane geny są operacyjnie połączone z elementami kontroli genetycznej niezbędnymi dla ekspresji, takimi jak promotory i miejsca wiązania rybosomów. Korzystnie, geny biosyntezy L-kamityny są ustawione w sekwencji bcoC, bcoA/B i bcoD lub ewentualnie bcoC. bcoA/B. bcoD oraz bcoT i są obecne jako pojedyncza jednostka transkrypcyjna, zaś element regulacyjny genów obejmuje promotor naturalnego operonu bco, P^.
Korzystnie, we fragmencie DNA według wynalazku geny bcoC, bcoA/B. bcoD oraz bcoT są scharakteryzowane poniższą mapą restrykcyjną:
0’23^5678 bcoC bcoA/B bcoD bco T
180 300
Wynalazek obecny obejmuje także wektor, zawierający fragment DNA obejmujący co najmniej jeden spośród genów bęoC, bcoA/B oraz bcoD dla biosyntezy L-kamityny, kodujący dehydrogenazę γ -butyrobetainy-CoA (bcoO, syntetazę γ -butyrobetaina/krotonobetaina-CoA (bcoA/B) lub hydrolazę krotonobetainy-CoA (bcoD), wybrany z grupy obejmującej:
a) fragment 10,6 kb EcoRI, wstawiony w plazmid pVK100q, zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, oraz jego podfragmenty; jak również
b) fragmenty, które hybrydyzująze wskazanym wyżej fragmentem 10,6 kb EcoRI lub jego podfragmentami i kodują enzymy o aktywnościach dehydrogenazy γ -butyrobetainy-CoA, syntetazy γ -butyrobetainy/krotonobetainy-CoA i/lub hydrolazy krotonobetainy-CoA.
Korzystnie, w wektorze według wynalazku fragment DNA obejmuje ponadto gen bcoT przypisany do metabolizmu γ -butyrobetaina/krotonobetaina i kodujący proteinę potencjalnego transportu.
Korzystnie, wektor według wynalazku ma we fragmencie DNA geny bcoC, bcoA/B. bcoD i ewentualnie bcoT. wyprowadzone z mikroorganizmów rodzajów Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium oraz Rhizobium/Agrobacterium.
Korzystnie, wektor według wynalazku ma we fragmencie DNA geny operacyjnie połączone z elementami kontroli genetycznej niezbędnymi dla ekspresji, takimi jak promotory i miejsca wiązania rybosomów. Korzystnie, we fragmencie DNA geny biosyntezy L-kamityny sąustawione w sekwencji bcoC. bcoA/B i bcoD lub ewentualnie bcoC. bcoA/B. bcoD oraz bcoT i sąobecne jako pojedyncza jednostka transkrypcyjna, zaś element regulacyjny genów obejmuje promotor naturalnego operonu bco, Pbc0.
W wektorze według wynalazku geny bcoC. bcoA/B, bcoD oraz bcoT we fragmencie DNA są scharakteryzowane powyższą mapą restrykcyjną.
Korzystnym wektorem według wynalazku jest plazmid pVK100q taki, jak zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, plazmid pVK1011 scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 3 i plazmid pAZIOl scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 4.
Wynalazek obejmuje także mikroorganizm rekombinacyjny, wybrany spośród mikroorganizmów rodzajów Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Comamonas oraz Rhizobium/Agrobacterium i zawierający fragment DNA, obejmujący co najmniej jeden spośród genów bcoC. bcoA/B oraz bcoD dla biosyntezy L-kamityny, kodujący dehydrogenazę γ -butyrobetainy-CoA (bcoC), syntetazę γ-butyrobetaina/krotonobetaina-CoA (bcoA/B) lub hydrolazę krotonobetainy-CoA (bcoD), wybrany z grupy obejmującej:
a) fragment 10,6 kb EcoRI, wstawiony w plazmid pVK100q, zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, oraz jego podfragmenty; jak również
b) fragmenty, które hybrydyzująze wskazanym wyżej fragmentem 10,6 kb EcoRI lub jego podfragmentami i kodują enzymy o aktywnościach dehydrogenazy γ -butyrobetainy-CoA, syntetazy γ -butyrobetainy/krotonobetainy-CoA i/lub hydrolazy krotonobetainy-CoA; lub wektor, zawierający wskazany wyżej fragment DNA.
Korzystnie, w mikroorganizmie według wynalazku fragment DNA obejmuje ponadto gen bcoT przypisany do metabolizmu γ -butyrobetaina/krotonobetaina i kodujący proteinę potencjalnego transportu, przy czym we fragmencie DNA geny bcoC. bcoA/B. bcoD i ewentualnie bcoT są korzystnie wyprowadzone z mikroorganizmów rodzajów Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium oraz Rhizobium/Agrobacterium. Ponadto, korzystnie we fragmencie DNA geny sąoperacyjnie połączone z elementami kontroli genetycznej niezbędnymi dla ekspresji, takimi jak promotory i miejsca wiązania rybosomów, a w szczególności geny biosyntezy L-kamityny sąustawione w sekwencji bcoC. bcoA/B i bcoD lub, jeśli ma to zastosowanie, bcoC. bcoA/B. bcoD oraz bcoT i sąobecne jako pojedyncza jednostka transkrypcyjna, zaś element regulacyjny genów obejmuje promotor naturalnego operonu bco, Pbco.
180 300
Korzystnie, w mikroorganizmie według wynalazku, we fragmencie DNA geny bcoC, bcoA/B, bcoD oraz bcoT są scharakteryzowane mapą restrykcyjną przedstawioną powyżej.
Korzystnym mikroorganizmem według wynalazku jest Rhizobium/Agrobacterium HK 1349, obejmującym plazmid pVK100q taki, jak zdeponowany pod numerem depozytowym DSM 8726, plazmid pVKl 011, jak scharakteryzowany mapąrestrykcyjnąwedług fig. 3 lub plazmid pAZIOl, jak scharakteryzowany mapąrestrykcyjnąwedług fig. 4 oraz genetyczne odmiany i mutanty wyprowadzone z takich mikroorganizmów, o zdolności do biosyntezy L-kamityny.
Korzystnym mikroorganizmem według wynalazku jest Rhizobium/Agrobacterium HK 1349.4, obejmującym plazmid pVK100q taki, jak zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, plazmid pVK1011, jak scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 3 lub plazmid pAZIOl, jak scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 4 oraz genetyczne odmiany i mutanty wyprowadzone z takich mikroorganizmów o zdolności do biosyntezy L-kamityny.
Biotechnologiczny sposób wytwarzania L-kamityny, według wynalazku polega na tym, że krotonobetamę i/lub γ -butyrobetainę poddaje się fermentacji w obecności odpowiedniego źródła węgla i azotu, jak glutaminian, octan i betaina, bądź gliceryna i betaina, stosując mikroorganizm rekombmacyjny, wybrany spośród mikroorganizmów rodzajów Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Comamonas oraz Rhizobium/Agrobacterium i zawierający fragment DNA, obejmujący co najmniej jeden spośród genów bcoC, bcoA/B oraz bcoD dla biosyntezy L-kamityny, kodujący dehydrogenazę γ -butyrobetainy-CoA (bcoC), syntetazę γ -butyrobetaina/krotonobetaina-CoA (bcoA/B) lub hydrolazę krotonobetainy-CoA (bcoD), wybrany z grupy obejmującej:
a) fragment 10,6 kb EcoRI, wstawiony w plazmid pVK100q, zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, oraz jego podfragmenty; jak również
b) fragmenty, które hybrydyzująze wskazanym wyżej fragmentem 10,6 kb EcoRI lub jego podfragmentami i kodują enzymy o aktywnościach dehydrogenazy γ -butyrobetainy-CoA, syntetazy γ -butyrobetainy/krotonobetainy-CoA i/lub hydrolazy krotonobetainy-CoA; lub wektor, zawierający wskazany wyżej fragment DNA, a następnie wyodrębnia się wytworzonąL-kamitynę.
Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny, w którym fragment DNA obejmuje ponadto gen bcoT przypisany do metabolizmu γ -butyrobetaina/krotonobetaina i kodujący proteinę potencjalnego transportu.
Korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny, w którym fragment DNA obejmuje geny bcoC. bcoA/B. bcoD i ewentualnie bcoT wyprowadzone z mikroorganizmów rodzajów Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium oraz Rhizobium/Agrobacterium, a zwłaszcza taki, w którym we fragmencie DNA geny są operacyjnie połączone z elementami kontroli genetycznej niezbędnymi dla ekspresji, takimi jak promotory i miejsca wiązania rybosomów. Korzystnie przy tym, we fragmencie DNA geny biosyntezy L-karnityny są ustawione w sekwencji bcoC. bcoA/B i bcoD lub, jeśli ma to zastosowanie, bcoC. bęoA/B, bcoD oraz bcoT i są obecne jako pojedyncza jednostka transkrypcyjna, zaś element regulacyjny genów obejmuje promotor naturalnego operonu bco, Pbco.
Szczególnie korzystnie, w sposobie według wynalazku stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny, w którym we fragmencie DNA fragment DNA, geny bcoC, bcoA/B. bcoD oraz bcoT są scharakteryzowane mapą restrykcyjną podaną powyżej.
W sposobie według wynalazku, korzystnie stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny Rhizobium/Agrobacterium HK 1349, obejmujący plazmid pVKl 00q taki, jak zdeponowany pod numerem depozytowym DSM 8726, plazmid pVK1011, jak scharakteryzowany mapą restrykcyjnąwedług fig. 3 lub plazmid pAZ 101, jak scharakteryzowany mapąrestrykcyjnąwedług fig. 4, bądź genetyczne odmiany i mutanty wyprowadzone z takich mikroorganizmów o zdolności do biosyntezy L-kamityny.
W sposobie według wynalazku, korzystnie stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny Rhizobium/Agrobacterium HK 1349.4, obejmujący plazmid pVKl 00q taki, jak zdeponowany w
180 300
Rhizobium/Agrobacterium HK1349 pod numerem depozytu DSM 8726, plazmid pVK1011, jak scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 3 lub plazmid pAZIOl, jak scharakteryzowany mapąrestrykcyjną według fig. 4, bądź genetyczne odmiany i mutanty wyprowadzone z takich mikroorganizmów o zdolności do biosyntezy L-kamityny.
Oznaczenia bcoA/B. bcoC. bcoD oraz bcoT, tak jak stosuje się je w niniejszym opisie i zastrzeżeniach, obejmują jak określono, zarówno geny organizmów dzikiego typu, które kodują enzymy metabolizmu γ -butyrobetainy/krotonobetainy-L-kamityny o wyżej wspomnianych aktywnościach enzymu, zwłaszcza geny operonu butyrobetainy-L-kamityny (bco), i ich funkcjonalnie równoważne genetyczne warianty i mutanty, tzn. geny, które są wyprowadzone z genów organizmów dzikiego typu i których produkty genowe sązasadniczo niezmienione co do ich funkcji biologicznych. Funkcjonalnie równoważne genetyczne warianty i mutanty zawierajązatem, np. wymiany zasad w kontekście znanej degeneracji kodu genetycznego, jak to można wytworzyć np. sztucznie, aby zaadaptować sekwencję genu do korzystnego zastosowania kodonu pewnego mikroorganizmu, w którym ekspresja ma mieć miejsce. Warianty i mutanty obejmują ponadto delecje, insercje oraz podstawienia zasad lub kodonów, w takim stopniu, że pozostawiaj ąprodukty genowe zmodyfikowane w ten sposób zasadniczo niezmienione co do ich funkcji biologicznej. Włączone są w to np. sekwencje genowe o wysokim stopniu homologii np. wyższym niż 70%, do sekwencji dzikiego typu i sązdolne do hybrydyzowania z komplementem sekwencji dzikiego typu przy ścisłych warunkach hybrydyzacji np. w temperaturach między 50 i 70°C oraz przy zawartości soli 0,5 do 1,5 M.
Określenie jednostka transkrypcji, tak jak jest stosowane w niniejszym tekście, jest rozumiane jako sekwencje DNA, w których geny są ustawione w jednym kierunku transkrypcji i są transkrybowane pod wspólną kontrolą transkrybcji w nieprzerwanym transkrypcie, przy czym sekwencje DNA oprócz genów dodatkowo mają elementy kontroli genetycznej niezbędne dla ekspresji genu, takie jak promotory i miejsca wiązania rybosomów.
Niniejszy wynalazekjest zilustrowany bardziej szczegółowo za pomocąnastępujących figur.
Figura 1 przedstawia enzymy drogi metabolizmu γ -butyrobetainy- lub krotonobetainy-L-kamityny, fig. 2 przedstawia mapę restrykcyjną fragmentu 10,6 kb DNA z Rhizobium/Agrobacterium posiadającego operon bco, fig. 3 oraz fig. 4 przedstawiają plazmid pVK1011 oraz pAZIOl; strzałki wskazują pozycję i orientację genów bco oraz genów beu (geny wykorzystujące betainę; EP-A-0 543 344). Część insertu plazmidu zaznaczono przez pogrubienie, fig. 5 przedstawia plazmid pCC49 jako możliwy materiał wyjściowy do wytwarzania szczepu gospodarza rec A, fig. 6 przedstawia schemat budowy plazmidów pVK 1011, pAZ 101, pVK 100q oraz pAZ7, fig. 7 przedstawia schemat budowy szczepu gospodarza recA.
Materiałami wyjściowymi do wyodrębnienia genów bcoA/B. bcoC. bcoD oraz bcoT drogi metabolizmu γ - butyrobetaina/krotonobetaino-L-kamityna mogą być wszystkie mikroorganizmy, które metabolizują butyrobetainę i/lub krotonobetainę według fig. 1.
Przykładami odpowiednich szczepów są mikroorganizmy rodzaju Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium oraz Agrobacterium/Rhizobium, przy czym korzystne sąte ostatnie. Przykładem korzystnego mikroorganizmu rodzaju Agrobacterium/Rhizobium jest mikroorganizm gatunku Agrobacterium/Rhizobium sp. HK4 (DSM 2938), jak już opisano w EP-A-0158 194. Te mikroorganizmy sązwłaszcza korzystnie stosowane, które sąjuż negatywne względem dehydrogenazy kamitynowej tzn. nie mają lub mają jedynie defektywny gen bcoE (poniżej oznaczany także jako bcoET Przykładami korzystnych mikroorganizmów negatywnych względem dehydrogenazy kamitynowej są mikroorganizmy gatunku Agrobacterium/Rhizobium sp. HK13 (DSM 2903) oraz HK1331b (DSM 3225), które opisano już w EP-A-0 158 194, lub gatunek Agrobacterium/Rhizobium sp. HK1349 (DSM 3944), który opisano w EP-A-0 543 344.
Geny bcoA/B, bcoC, bcoD oraz bcoT metabolizmu γ -butyrobetaina/krotonobetaino-L-karnityna mogą być zlokalizowane w chromosomie mikroorganizmu przez poddanie mikroorganizmów np. mutagenezie insercji transpozonu i przez to znaczenie genów metabolizmu γ -butyrobetaina/krotonobetaino-L-karnityna odpowiednim znacznikiem, np. odpornością na kanamycynę (Km). Mutanty znaczone w ten sposób, które nie mogąjuż wykorzystywać związków pośrednich metabo
180 300
Π hzmu butyrobetainy, można następnie wyodrębnić. W ten sposób, geny metabolizmu γ -butyrobetama/krotonobetaino-L-kamityna można zidentyfikować i powiązać z ich funkcjami. Znaczone geny można następnie klonować i scharakteryzować bardziej szczegółowo przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych. Wyodrębnienie nienaruszonych genów lub fragmentów DNA według niniejszego wynalazku można następnie przeprowadzić wychodząc z banku genów odpowiedniego niemutowanego organizmu, z którego można wyodrębnić geny bco lub ich fragmenty i zidentyfikować w znany sposób przez hybrydyzację przy użyciu sklonowanych genów mutagenowanego szczepu otrzymanego jak wyżej. Otrzymane geny można następnie klonować w żądane wektory i mapować przy pomocy enzymów restrykcyjnych.
Jedynie geny bcoA/B. bcoC oraz bcoD są odpowiedzialne za biosyntezę L-kamityny. Zgodnie z tym również tylko obecność tych genów jest niezbędna do wytwarzania kamityny. W zależności od wybranych warunków początkowych, np. wybranego materiału wyjściowego lub wybranego szczepu produkcyjnego, fragmenty DNA lub wektory użyte przy wytwarzaniu L-kamityny mogą zawierać jeden lub więcej genów biosyntezy kamityny.
Oprócz genów bcoA/B. bcoC i bcoD. fragmenty DNA i wektory według niniejszego wynalazku mogą, jeśli jest to pożądane, zawierać także potencjalny gen transportu bcoT.
Obecność genu dehydrogenazy L-kamitylu, tzn. genu bcoE, jest niepożądana, ponieważ w jego obecności ma miejsce degradacja L-kamityny. Obecność defektywnego genu bcoE (bcoE') jest jednak nieszkodliwa.
Korzystnie, geny biosyntezy L-kamityny, mianowicie bcoC, bcoA/B oraz bcoD i ewentualnie potencjalny gen transportu bcoT. do stosowania w wytwarzaniu L-kamityny, są obecne razem w jednym fragmencie DNA lub cząsteczce wektora, np. korzystnie w konwencjonalnym kierunku 5'-3' w dół od elementów regulacyjnych genu, w sekwencji bcoC. bcoA/B oraz bcoD lub bcoD lub bcoC, bcoA/B. bcoD i bcoT i w pojedynczej jednostce transkrypcyjnej określonej jak wyżej, odpowiadając ustawieniu w naturalnie występującym operonie butyrobetainy-L-kamityny. Geny bcoC. bcoA/B. bcoD oraz bcoT takiej jednostki transkrypcyjnej można scharakteryzować np. za pomocą odpowiednich sekcji mapy restrykcyjnej z fig. 2.
Transkrypcja lub ekspresja genów bco z korzyściąma miejsce pod kontrolą odpowiedniego, korzystnie silnego, promotora, Wybór promotora zależy od żądanych warunków ekspresji, np. od tego czy jest pożądana ekspresja konstytutywna lub indukowana, lub od organizmu, w którym ekspresja ma mieć miejsce. Odpowiednim promotorem jest np. promotor Pbco naturalnego operonu butyrobetainy-L-kamityny. Jeśli wyodrębnienie genów bco odpowiedzialnych za biosyntezę L-kamityny ma miejsce, np. z mikroorganizmu o defektywnym genie bcoE (bcoE'), korzystnie cały operon bco można np. wyodrębnić i klonować przy użyciu genu bcoE' i związanych z tym elementów regulacyjnych genu z tych mikroorganizmów i następnie użyć w odpowiednich mikroorganizmach do wytwarzania L-kamityny. Jednostkę transkrypcyjną tego typu o zmutowanym genie bcoE, takim jaki może być wyodrębniony, np. z Rhizobium/Agrobacterium HK1349, można ewentualnie scharakteryzować za pomocą mapy restrykcyjnej przedstawionej na fig. 2, jeśli defekt w bcoE przypisać np. jedynie do mutacji punktowej i nie wiązać z miejscem rozszczepiania restrykcyjnego. Dalszymi promotorami odpowiednimi dla ekspresji sąnp., promotory PNm, PSI (M. Labes i in., Gene, 89, 37-46, 1990), promotor trp (Amann i m., Gene, 25, 167-178,1983), promotor lac (Amann i in., Gene 25,167-178,1983) oraz promotor tac, hybryda wspomnianych promotorów trp i lac, którą można zastosować jako promotor konstytutywny lub indukowalny (Russell i Bennett, Gene, 20, 231-243, 1982). Dla stosowania przy wytwarzaniu L-kamityny w odpowiednim szczepie produkcyjnym, fragmenty DNA według niniejszego wynalazku, obejmujące wspomniane geny bco, korzystnie razem w pojedynczej jednostce transkrypcyjnej, są włączone, z korzyścią przy pomocy znanych technik, w znane wektory, zwłaszcza wektory ekspresyjne, np. fagi lub plazmidy. Zastosowane wektory mogą to być wektory autonomiczne lub samoreplikujące lub alternatywnie tzw. wektory integracyjne. Wektor integracyjny rozumie się w tym kontekście jako wektor, np. plazmid, który ma co najmniej jedną sekwencję homologiczną do sekwencji genomowej szczepu biorcy i pozwala na insercję obcych genów do
180 300 genomu szczepu biorcy przez homologiczną rekombinację przy użyciu tej sekwencji. Korzystnie stosuje się wektory autonomiczne i samoreplikujące.
W zależności od charakteru wybranych wektorów, geny enzymów biosyntezy L-kamityny można poddać ekspresji w różnych organizmach. Odpowiednimi wektorami sązarówno wektory o specyficznym spektrum gospodarzy oraz wektory o szerokim spektrum gospodarzy (szeroki zakres gospodarzy) oraz wektory integracyjne opisane powyżej.
Zastosowane wektory o szerokim spektrum gospodarzy mogą być wszystkie wektorami, które są odpowiednie do bakterii gram-ujemnych. Przykładami takich wektorów o szerokim zakresie gospodarzy sąpVK100 (Knauf i Nester, Plasmid, 8, 45-54, 1982), pME285 (Haas i Itch, Gene, 36, 27-36, 1985), oraz pKT240 (Bagdasarian i in., Gene, 25, 273-282, 1983) lub ich pochodne. Użytą pochodną pVKl00 może być np. pVK1001, użytą pochodnąpME285 może być np. pAZIO, aużytąpochodnąpKT240 może być np. pL032 (jak już opisano w EP-A-O 543 344).
Wektorami integracyjnymi użytymi w przypadku Rhizobium/Agrobacterium mogą być wektory oparte na pACYC184 lub pBR322 (Comai i in., Plasmid, 10,21-30, 1983). W ten sposób, otrzymano np. plazmidy pVK100q, pVK1011 (fig. 3), pAZ7, pAZ7::beu, pAZIOl (fig. 4) orazpLO41. Plazmid pVK100q w Rhizobium/Agrobacterium HK1349 złożono 16. 11. 1993 w Niemieckiej Kolekcji Mikroorganizmów i Hodowli Komórkowych sp. z o. o., D-38124 Braunschweig, Mascheroderweg lb, pod numerem depozyt DSM 8726.
Dla wytwarzania szczepów produkcyjnych dla fermentacji tzn. szczepów wytwarzania L-kamityny, fragmenty DNA lub wektory według niniejszego wynalazku muszą być włączone do szczepów gospodarzy, które sąpożądane i odpowiednie dla ekspresji. Z korzyścią, mikroorganizmy są transformowane w tym celu w sposób, który jest typowy i znany samo przez się przy użyciu wektorów zawierających fragmenty DNA według niniejszego wynalazku. Mikroorganizmy te mogą następnie zawierać fragment DNA według niniejszego wynalazku na cząsteczce wektora lub wintegrowany w jego chromosom.
Odpowiednie szczepy produkcyjne są wszystkie mikroorganizmami, które są zdolne do wytwarzania L-kamityny z krotonobetainy i/lub γ -butyrobetamy i których zdolność degradacji (katabolizm) L-kamityny jest całkowicie lub częściowo inhibitowana. Mikroorganizmy, których katabolizm L-kamityny jest inhibitowany, sąnp. szczepami, które sąnegatywne względem dehydrogenazy kamityny tzn. szczepami, w których gen dehydrogenazy kamityny bcoEiest wyłączany, np., przez mutację lub delecję, i/lub szczepami, które są negatywne względem racemazy L,D-kamityny oraz negatywne względem dehydratazy L-kamityny.
Odpowiednie szczepy gospodarza, korzystnie szczepy o wysokiej tolerancji substratu i materiału wyjściowego, sąnp. mikroorganizmami rodzaj ów Escherischia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Comamonas oraz Rhizobium/Agrobacterium, przy czym te ostatnie są korzystne. Mikroorganizmy gatunkuRhizobium/Agrobacterium sp. HK13, HK133 lb oraz HK1349już opisane powyżej oraz również rodzaje HK1349.4 (jak opisano w EP-A-0 543 344) są szczególnie korzystne.
Ponadto ustalono, wydajność L-kamityny można jeszcze bardziej zwiększyć, jeśli jest zmniejszona zdolność szczepu gospodarza do rekombinacji tzn. jego tendencja do rekombinacji i częstotliwość rekombinacji. Rekombinacja z wektorem na podstawie homologii chromosomalnej jest przez to ograniczona. Zdolność do rekombinacji można zmniejszyć np. w znany sposób przez specyficzną mutację jego genu recA (mutacja recA). Szczególnie korzystnymi mikroorganizmami, o mniejszej zdolności do rekombinacji są mikroorganizmy gatunku Rhizobium/Agrobacterium sp., np. szczepy Rhizobium/Agrobacterium HK 1349.49 według niniejszego wynalazku otrzymane jak opisano poniżej.
Odpowiednie szczepy produkcyjne są zatem np. mikroorganizmami gatunku Rhizobium/Agrobacterium HK1349, HK1349.4 oraz HK1349.49, w każdym przypadku zawierającymi plazmid pVK100q, pVK1001, pAZ7, pAZ7::beu, pAZIOl lub pL041.
Transformowane szczepy gospodarza (szczepy produkcyjne) można wyodrębnić z selektywnej pożywki, do której jest dodany antybiotyk względem którego szczepy są odporne dzięki genowi markerowi umiejscowionemu na wektorze lub fragmencie DNA. Jeśli mikroorganizmy według EP-A-0 543 344 stosuje się jako szczepy produkcyjne, tzn. mikroorganizmy, których ko
180 300 dowanie genu chromosomowego dla wykorzystania betainy jest mutowane i transformowane przy użyciu plazmidu, który zawiera gen kodujący wykorzystanie betainy, można również selekcjonować ze względu na wykorzystanie betainy. Przykładami mikroorganizmów selekcjonowalnych ze względu na wykorzystanie betainy sąjuż wspomniane HK1349.4 oraz HK1349.49, które zawierają np. plazmid pL041, pAZIOl, pAZ7::beu lub pVK1011.
Biotechnologiczne wytwarzanie L-kamityny przeprowadza się przy użyciu mikroorganizmów, zawierających fragmenty DNA lub wektory według niniejszego wynalazku. Proces wytwarzania L-kamityny jest przeprowadzany sposobami znanymi samo przez się np. jak opisano w EP-A-0 158 194, poczynając od np. γ -butyrobetainy w obecności odpowiedniego źródła węgla i azotu. Użytymi źródłami węgla i azotu mogąbyć np. glutaminian, octan i betaina, lub gliceryna oraz betaina. Jeśli biotechnologiczne wytwarzanie jest przeprowadzane za pomocą mikroorganizmów selekcjonowalnych ze względu na wykorzystanie betainy, betainę stosuje się jako jedyne źródło azotu.
Fermentację i następujące po tym wyodrębnienie L-kamityny można wykonać analogicznie do sposobu opisanego w EP-A-0 158 194.
Poprzez zmianę składników odżywczych w pożywce oraz przez adaptację warunków fermentacji do konkretnego mikroorganizmu w zwykły sposób można wydajność L-kamityny jeszcze poprawić.
Przykład 1. Wytwarzanie mutantów insercji transpozonu (Tn5) i ich identyfikacja fenotypowa.
Spowodowano, że dzikiego typu szczep Rhizobium/Agrobacterium HK4 (DSM 2938, EP-B 0158 194) rozwinął spontaniczną odporność na streptomycynę (Sm, 1000 pg/ml) przez ciśnienie selekcji. Odporność ta była widocznie trwała przez 50 pokoleń bez selekcji i zastosowano ją jako marker selekcji.
0,2mlhodowli dawcy TnózE'. co li 817-l/pSUP2021 (R. Simoniin.,Biotechnology, 1983, 1, 784-790), zmieszano z 2 ml hodowli biorcy HK4 i odwirowano. Komórki przemyto w 0,9% roztworze soli (roztwór NaCl) i ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 100 μΐ 0,9% roztworu soli. Koniugację szczepu biorcy ze szczepem dawcy wykonano przez noc w 30°C na suchym agarze odżywczym. Zebrane komórki płytkowano w rozcieńczeniach na pożywce selekcyjnej dla biorcy (SmR) i transpozonu (odporność na neomycynę (NmR)).
Mutanty Tn5 otrzymano na agarze odżywczym przy użyciu Sm (1000 pg/ml) i Nm (100 pg/ml). Fenotypowa identyfikacja mutantów miała miejsce przez detekcję niewykorzystywania związków pośrednich metabolizmu butyrobetainy według fig. 1 jako źródła węgla (C) w pożywce minimalnej.
Przykład 2. Klonowanie fragmentów DNA znaczonych Tn5 z genomu HK4.
Wyodrębniony genomowy DNA z HK4 mutowanego Tn5 (5 pg) wytrawiono całkowicie przy użyciu EcoRI (4 U/pg). Na pBR325 (2,5 pg) (Gens, 1977, 2, 95-113) podziałano fosfatazą alkaliczną po całkowitym wytrawieniu za pomocą EcoRI. Rekombinacyjne plazmidy hybrydowe otrzymano po zmieszaniu genomowego DNA i pBR325 z ligaząT4-DNA (0,2 U (jedn.)/pg DNA) w 400 pl buforu ligacyjnego (20 mM tris-HCl, pH 7,2, 10 mM DTT (ditiotreitol), 10 mM MgC12, 0,6 mM ATP) oraz inkubacji przez noc w 12°C.
Próbki mieszaniny ligacyjnej użyto do transformacji (Cohen i in., 1972, PNAS 69, 2110-2114)E. co/zED8654(Barekiin.,Mol. Gen. Genet., 146,199-207, 1976). Transformanty wyselekcjonowano w pożywce na ich odporność na ampicylinę (Ap, 100 pg/ml) i kanamycynę (Km, 25 pg/ml). Wszystkie wyselekcjonowane plazmidy hybrydowe miały insert HK4, który był znaczony Tn5. Inserty mapowano na różne enzymy restrykcyjne, odpowiadające mapie restrykcyjnej na fig. 2. Porównania map restrykcyjnych potwierdziły insercję transpozonu w tym samym fragmencie genomowym w szeregu mutantów Tn5 o różnym fenotypie.
Było możliwe potwierdzenie tej obserwacji przez hybrydyzację „Southern błot” („Gentechnische Methoden” [Metody Inżynierii Genetycznej], red. S. Bertram i H. G. Gassen, G. Fischer Verlag 1991, 219) identycznie rozszczepionego DNA plazmidu i następujący po tym rozdział elektroforetyczny. Użyte sondy były podfragmentami tego klonowanego z mutantów transpozonu.
180 300
Przykład 3. Ustanowienie banku genów genomowego HK4 w fagach lambda.
Aby można było DNA upakować w fagach lambda, musi mieć on wielkość 40-52 kb i „cos-site”. Aby ustanowić bank genów genomowego HK 4 w fagach lambda, użyto wektor kosmidu pVKl 00 (Knauf i Nester, 1982, Plasmid 8,45-54), który ma wielkość 23 kb i tym samym pozwala na klonowanie fragmentów DNA między 17 a 29 kb.
pVK100 wytrawiono przy użyciu EcoRI, defosforylowano i ligowano przy użyciu HK4 DNA, który częściowo wytrawiono EcoRI. Idealne stężenie EcoRI dla częściowego wytrawiania HK4 DNA określono za pomocą trawienia próbnego jako 0,58 U/pg DNA lub 0,02 U/μΙ mieszaniny reakcyjnej, przy czym w mieszaninie reakcyjnej jest stosowane 8,5 pg HK4 DNA. Fragmenty DNA w zakresie wielkości większej niż 17 kb wyodrębniono z żelu elektroforetycznego z agarozą. Ligację przeprowadzono w objętościach 10 pl zawierających 100 ng wektora kosmidu oraz 400 ng Passenger-DNA. Następnie wykonano „pakowanie in vitro” odpowiadające protokołowi wytwórcy w mieszaninie Promega Biotec w ciągu 2 godz. w 25°C. Po transfekacji E. coli S17-1, przeprowadzono selekcję na odporność na Km wektora kosmidu. Około 5500 kolonii (indywidualne klony) otrzymano przy użyciu jednej szarży. Kolonie banku genów przechowywano w -70°C w pięciu szarżach około 1000 klonów każda w pożywce zamrażającej (Nutrient Yeast Broth, NYB, Oxoid oraz 50% gliceryny). Amplifikację banku genów wykonano przy użyciu 50pl każdej z tych szarż w 10 ml hodowli NYB przez noc, a następnie porcjowania.
Przykład 4. Skrining banku genów kosmidu HK4, identyfikacja klonów kosmidu noszącego gen bco za pomocą hybrydyzacji kolonii, hybrydyzacji „Dot blotting” lub bezpośredniej komplementacji mutantów HK.
Możliwe było użycie klonowanych, znaczonych Tn5 fragmentów DNA jako prób hybrydyzacyjnych. Klony o odpowiednich sekwencjach DNA wykazywały sygnały hybrydyzacyjne i prowadziły do komplementacji defektywnego genu w każdym przypadku w mutancie HK4. Hybrydyzacje krzyżowe DNA z różnych mutantów potwierdziły „klasterowanie” kilku genów metabolizmu butyrobetainy na fragmencie DNA o 10,6 kb (fig. 2).
Hybrydyzację kolonii wykonano w zwykły sposób (S. Bertram i H. G. Gassen, 1991, ibid. 221). Próbę „Dot blotting” również wykonano znanym sposobem (S. Bertram i H. G. Gassen, 1991, ibid. 217£).
Przykład 5. KomplementacjamutantówHK.
Po dokładnej lokalizacji indywidualnych genów metabolizmu butyrobetainy uwzględniając wielkości molekularne na podstawie zidentyfikowanych łańcuchów peptydowych, było możliwe osiągnięcie komplementacji indywidualnych mutantów przez poszczególne odcinki genów.
Konkretny plazmid ekspresyjny pVK100: :HK-DNA wintegrowano poprzez koniugację E. coli SI7-1 w szczepy HK4 Rhizobium/Agrobacterium sp. według przykładu 1, które zawierały mutacje dla różnych etapów metabolicznych (zob. fig. 1). Selekcję wykonano względem auksotrofii proliny (pro) dawcy oraz na odporność antybiotykową wektora (KmRTc (tetracyklina)13).
Przykład 6
6.1 Klonowanie fragmentu bco ze szczepu HK1349 (DSM 3944) i pochodnych.
Aby osiągnąć wpływ dawki genu oraz wzrost produktywności w szczepie produkcyjnym, sklonowano operon bco z HK 1349 (DSM 3944, EP-A-0 543 344). W tym szczepie, cały operon bco jest zawarty w pełnej postaci, lecz pierwszy gen, bcoE. dla dehydrogenazy kamityny-CoA jest mutowany. Fragment DNA zawierający operon bco i otrzymany z tego szczepu jest zatem idealny dla wzrostu produktywności na skutek dużej liczby kopii wektorów ekspresji.
Klonowania wykonano w znany sposób w E. coli SI7-1, odpowiednio do przykładu 3 z EP-A-0 543 344. W tym celu, operon bco o 10,6 kb wyodrębniono z banku genów HK1349 i ligowano w pVK100. W wyniku tego uzyskano plazmid pVK100q (zob. schemat budowy według fig. 6). Selekcję przeprowadzono w E. coli S17-1 na Km (25 pg/ml) NYB. Poprawny insert zidentyfikowano na mutantach HK według sposobu opisanego w przykładzie 5. DNA z HK1349 rozszczepione za pomocąEcoRI oddzielono elektroforetycznie i fragmenty w zakresie wielkości 10,6 kb wyodrębniono z żelu. Wyodrębnione fragmenty ligowano w pVK100 rozszczepionym EcoRI. Przy użyciu tej mieszaniny plazmidu hybrydowego, SI7-1 (auksotrof) E.
180 300 coli transformowano i selekcjonowano na pożywce agarowej Km (25 pg/ml). Poprawny klon plazmidu hybrydowego z wektora i fragmentu DNA o wielkości 10,6 kb zawierający operon bco zidentyfikowano za pomocą „patch-mating” na trawniku z mutanta (HK4V4) negatywnego względem syntetazy butyrobetainy-CoA na pożywce minimalnej z 0,2% (wag./obj.) butyrobetainy jako źródła C i N. Poprawny klon był zdolny, po koniugatywnym przeniesieniu tego rodzaju do mutanta, do komplementowania komórek w wykorzystywaniu tego źródła C. Klon pVKl 00q zidentyfikowany w ten sposób został użyty bezpośrednio jako plazmid produkcyjny lub jako rezerwuar dla fragmentu DNA posiadającego operon bco dla dalszego subklonowania.
6.2 . Konstruowanie pAZIOl, pAZ7, pVK1011 i pVK100q, pL041 oraz pAZ7::beu.
pAZIOl, pAZ7, pVK1011 i pVK100q skonstruowano według schematu budowy z fig. 6. pLO41 skonstruowano poczynając od pLO32 (EP-A-0 543 344) przez insercję genów bco (fragment 10,6 kb EcoRI/EcoRI) i skonstruowano plazmid pAZ7::beu wychodząc z pAZ7 (fig. 6) przez insercję genów beo (fragment Pstl/Pstl 3 kb, EP-A-0 543 344). Zastosowano odpowiednie enzymy restrykcyjne z 3-5 U/pg DNA według danych podanych przez wytwórcę. Plazmid pVK100q otrzymano przez insercję genów bco w pVK100 (Knauf i Nester; ibid). Wyjściowy plazmid pVKl 00sl (schemat budowy fig. 6) otrzymano przez klonowania delecji EcoRI plazmidu pVK100s (EP-A-0 543 344).
Przykład 7. Wprowadzenie mutacji recA do HK1349.4.
7.1. Identyfikacja klonu banku genów kodującego recA.
Bank genów kosmidu genomowego HK4 zbadano na klony kodujące recA z pomocą metody hybrydyzacji kolonii (S. Bertram i H. G. Gassen, 1991, ibid, 221). Sondą użytą do hybrydyzacji był klonowany gen recA z Rhizobium leguminosarum (W. Selbitschka i in., Mol. Gen. Genet., 299, 1991, 86-95). Znaczony klon kosmidu wyodrębniono i fragmenty insertu DNA EcoRI otrzymane po wytrawianiu EcoRI zbadano na sekwencje homologiczne do recA za pomocą hybrydyzacji „Southern biot” względem sondy recA (S. Bertram i H. G. Gassen, 1991, ibid, 219). Fragment EcoRI znaczony w ten sposób ligowano do wektora pVK100, który rozszczepiono w tym samym stopniu. Przy użyciu uzyskanego plazmidu hybrydowego pVK100rl, komórki SI 7-1 E. coli transformowano dla replikacji DNA.
7.2. Wprowadzenie genu odporności na kanamycynę do HK1349.4 dla inaktywacji chromosomalnego genu recA.
Fragment EcoRI 11,0 kb reklonowano z pVK100rl do pACYC184 (A. C. Y. Chang i S. N. Cohen, J. BacterioL, 134, 1978, 1141-1156), który rozszczepiono EcoRI.
Odpowiednio do oznaczonej mapy restrykcyjnej, podfragment o wielkości 3,1 kb rozszczepiony przez Bglll-Nrul, który znaczono względem sondy recA w hybrydyzacji „Southern biot”, sklonowane do wektora pWS233, który był rozszczepiony przez BamHI-Hindin. pWS233 jest wektorem „gene replacement” i jest opisany w: W. Selbitschka i in., Appl. Microbiol. Biotechnol. 38, 1993,615-618.
Fragment DNA Xhol z Tn5 (pSUP2021, R. Simon i in., Biotechnology, 1,1983, ibid), kodujący odporność na Km sklonowane w miejscu rozszczepiania Xhol uzyskanego plazmidu pCC45. W wyniku tego uzyskano pCC49. Analogicznie do procedury według W. Selbitschka i in., 1993, ibid, „zastępowanie genu” wykonano w następujący sposób:
ml eksponencjalnej hodowli HK1349.4 połączono z 1 ml eksponencjalnej hodowli dawcy (S17-l/pCC49), odwirowano i przemyto 0,9?/o roztworuNaCl. Komórki inkubowano w 30°C przez noc na agarze odżywczym w 50 μΐ NYB. Komórki, które przeprowadzono ponownie w stan zawiesiny w 0,9% roztworze NaCl, następnie naniesiono w odpowiednim rozcieńczeniu na selektywne pożywki. Transkoniuganty biorców HK1349.4 odpornych na Sm otrzymano na agarze odżywczym przy użyciu Sm (1000 pg/ml) oraz Nm (150 pg/ml) i wykazały one wrażliwość na 5% sacharozy w złożonej pożywce odpowiadającej genom sacRB na wektorze „replacement”.
Podwójne rekombinacje otrzymano z niskączęstotliwością(l 0’8) po wyhodowaniu wybranych transkoniugantów bez ciśnienia selekcji na agarze odżywczym: Po około 1 tygodniu było możliwe wyodrębnienie komórek, które tolerowały 5% sacharozy w pożywce, pozostały odporne na Nm, lecz stały się znów wrażliwe na gentamycynę (Gm) (marker wektora). Ten fenotyp po
180 300 twierdza wymianę allejowego markera i wskazuje na mutację recA w HK1349.4. Można zaobserwować typowy fenotyp (np. wrażliwość na UV itp.) mutantów recA.
W szczepie HK1349.49 otrzymanym w ten sposób, tendencja chromosomowej integracji plazmidów z sekwencjami homologicznymi (homologiczna rekombinacja) jest wyraźnie zmniejszona. Szczep jest zatem wysoce odpowiednim gospodarzem dla plazmidów hybrydowych przedstawionych w przykładzie 6.2.
Przykład 8. Biotransformacja.
Biotransformację przeprowadzono w kolbach do wytrząsania (100 ml) przy użyciu pożywki minimalnej wolnej odN (MM; Kulla i in., Arch. Microbiol., 1983,135, s. 1-7), zawierającej 0,2% (wag./obj.) γ -butyrobetainy (materiał wyjściowy) oraz, jako źródło C, 0,4% (wag./obj.) gliceryny. Jako źródło N i dodatkowe źródło C, dodano 0,2% (wag./obj.) L-glutaminianu (ze szczepami negatywnymi w wykorzystaniu betainy) lub 0,2% (wag./obj.) betainy. Zastosowane szczepy produkcyjne były szczepami według wynalazku HK1349.4/pL041, HK1349.4/pVK1011, HK1349.4/pAZ7::beu, HK1349.4/pAZ101,HK1349/pVK100q oraz HK1349/pAZ7. Wyniki podanowtabeli 1 wporównaniu z pochodnymi HK13: HK1349 (DSM 3944) oraz HK1349.4 znanymi z EP-A-0 543 344.
Tworzenie L-kamityny z γ -butyrobetainy oznaczono metodąDTNB (5,5'-dwutiobis(2-nitrobenzoesanu) opisaną u Bergmeyera (Η. K. Bergmeyer, 1974, Methoden der enzymatischen Analyse [Metody analizy enzymatycznej], Yerlag Chemie, 1810).
| Szczepy | Pożywka MM & gliceryna | Aktywność właściwa mmoIi/l/h/OD |
| HK1349 (nie według wynalazku) | & betaina | 0,24 |
| K1349/pVK100q | & betaina | 0,36 |
| HK1349/pAZ7 | & betaina | 0,49 |
| HK1349 (nie według wynalazku) | & L-glutaminian | 0,14 |
| HK1349.4 (nie według wynalazku) | & L-glutaminian | 0,11 |
| HK1349.4/pL041 | & L-glutaminian | 0,29 |
| HK1349.4 (nie według wynalazku) | & amoniak | 0,12 |
| HK1349.4/pVK1011 | & betaina | 0,54 |
| HK1349.4/pAZ7::beu | & betaina | 0,47 |
| HK1349.4/pAZ101 | & betaina | 1,08 |
180 300
Claims (33)
- Zastrzeżenia patentowe1. Wyodrębniony fragment DNA, obejmujący co najmniej jeden spośród genów bęoC, bcoA/B oraz bcoD dla biosyntezy L-kamityny, kodujący dehydrogenazę γ -butyrobetainy-CoA (bcoC), syntetazę γ -butyrobetaina/krotonobetaina-CoA (bcoA/B) lub hydrolazę krotonobetainy-CoA (bcoD), wybrany z grupy obejmującej:a) fragment 10,6 kb EcoRI, wstawiony w plazmid pVK100q, zdeponowany w RhizobiumlAgrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, oraz jego podfragmenty; jak równieżb) fragmenty, które hybrydyzująze wskazanym wyżej fragmentem 10,6 kb EcoRI lub jego podfragmentami i kodują enzymy o aktywnościach dehydrogenazy γ -butyrobetainy-CoA, syntetazy γ -butyrobetainy/krotonobetainy-CoA i/lub hydrolazy krotonobetainy-CoA.
- 2. Fragment DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje ponadto gen bcoT przypisany do metabolizmu γ -butyrobetaina/krotonobetaina i kodujący proteinę potencjalnego transportu.
- 3. Fragment DNA według zastrz. 1, albo 2, znamienny tym, że geny bcoC, bcoA/B. bcoD i ewentualnie bcoT są wyprowadzone z mikroorganizmów rodzajów Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium oraz Rhizobium/Agrobacterium.
- 4. Fragment DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że geny są operacyjnie połączone z elementami kontroli genetycznej niezbędnymi dla ekspresji, takimi jak promotory i miejsca wiązania rybosomów.
- 5. Fragment DNA według zastrz. 4, znamienny tym, że geny biosyntezy L-kamityny są ustawione w sekwencji bcoC, bcoA/B i bcoD lub ewentualnie bcoC. bcoA/B. bcoD oraz bcoT i są obecne jako pojedyncza jednostka transkrypcyjna.
- 6. Fragment DNA według zastrz. 4, znamienny tym, że element regulacyjny genów obejmuje promotor naturalnego operonu bco, Pbco.
- 7. Fragment DNA według zastrz. 1 albo 4, albo 5, albo 6, znamienny tym, że geny bcoC, bcoA/B, bcoD oraz bcoT są scharakteryzowane poniższą mapą restrykcyjną:0 I 2 3 ą S 6 7 B bcoC bcoA/ B bcoD bco T180 300
- 8. Wektor zawierający fragment DNA, obejmujący co najmniej jeden spośród genów bcoC. bcoA/B oraz bcoD dla biosyntezy L-kamityny, kodujący dehydrogenazę γ -butyrobetainy-CoA (bcoC), syntetazę γ -butyrobetaina/krotonobetaina-CoA (bęoA/B) lub hydrolazę krotonobetainy-CoA (bcoD), wybrany z grupy obejmującej:a) fragment 10,6 kb EcoRI, wstawiony w plazmid pVK100q, zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, oraz jego podfragmenty; jak równieżb) fragmenty, które hybrydyzują ze wskazanym wyżej fragmentem 10,6 kb EcoRI lub jego podfragmentami i kodują enzymy o aktywnościach dehydrogenazy γ -butyrobetainy-CoA, syntetazy γ -butyrobetainy/krotonobetamy-CoA i/lub hydrolazy krotonobetainy-CoA.
- 9. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że fragment DNA obejmuje ponadto gen bcoT przypisany do metabolizmu γ -butyrobetaina/krotonobetaina i kodujący proteinę potencjalnego transportu.
- 10. Wektor według zastrz. 8 albo 9, znamienny tym, że we fragmencie DNA geny bcoC, bcoA/B. bcoD i ewentualnie bcoT są wyprowadzone z mikroorganizmów rodzajów Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium oraz Rhizobium/Agrobacterium.
- 11. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że we fragmencie DNA geny są operacyjnie połączone z elementami kontroli genetycznej niezbędnymi dla ekspresji, takimi jak promotory i miejsca wiązania rybosomów.
- 12. Wektor według zastrz. 11, znamienny tym, że we fragmencie DNA geny biosyntezy L-kamityny są ustawione w sekwencji bcoC, bcoA/B i bcoD lub ewentualnie bcoC. bcoA/B. bcoD oraz bcoT są obecne jako pojedyncza jednostka transkrypcyjna.
- 13. Wektor według zastrz. 11, znamienny tym, że we fragmencie DNA element regulacyj ny genów obejmuje promotor naturalnego operonu bco, Pbco.
- 14. Wektor według zastrz. 8 albo 11, albo 12, albo 13, znamienny tym, że we fragmencie DNA geny bcoC. bcoA/B, bcoD oraz bcoT są scharakteryzowane poniższą mapąrestrykcyjną:0 ί 23^5678 bcoC bcoA/B bcoD bCO T
- 15. Wektor według zastrz. 8, którym jest plazmid pVK100q zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, plazmid pVK1011 scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 3 i plazmid pAZIOl scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 4.
- 16. Mikroorganizm rekombinacyjny, wybrany spośród mikroorganizmów rodzajów Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Comamonas oraz Rhizobium/Agrobacterium i zawierający fragment DNA, obejmujący co najmniej jeden spośród genów bcoC. bcoA/B oraz bcoD dla biosyntezy L-kamityny, kodujący dehydrogenazę γ -butyrobetainy-CoA (bcoC),180 300 syntetazę γ -butyrobetaina/krotonobetaina-CoA (bcoA/B) lub hydrolazę krotonobetainy-CoA (bcoD). wybrany z grupy obejmującej:a) fragment 10,6 kb EcoRI, wstawiony w plazmid pVK100q, zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, oraz jego podfragmenty; jak równieżb) fragmenty, które hybrydyzująze wskazanym wyżej fragmentem 10,6 kb EcoRI lub jego podfragmentami i kodują enzymy o aktywnościach dehydrogenazy γ -butyrobetamy-CoA, syntetazy γ -butyrobetainy/krotonobetainy-CoA i/lub hydrolazy krotonobetainy-CoA; lub wektor, zawierający wskazany wyżej fragment DNA.
- 17. Mikroorganizm według zastrz. 16, znamienny tym, że fragment DNA obejmuje ponadto gen bcoT przypisany do metabolizmu γ -butyrobetaina/krotonobetaina i koduj ący proteinę potencjalnego transportu.
- 18. Mikroorganizm według zastrz. 16 albo 17, znamienny tym, że we fragmencie DNA geny bcoC, bęoA/B, bcoD i ewentualnie bcoT są wyprowadzone z mikroorganizmów rodzajów Escherischia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium oraz Rhizobium/Agrobacterium.
- 19. Mikroorganizm według zastrz. 16, znamienny tym, że we fragmencie DNA geny są operacyjnie połączone z elementami kontroli genetycznej niezbędnymi dla ekspresji, takimi jak promotory i miejsca wiązania rybosomów.
- 20. Mikroorganizm według zastrz. 19, znamienny tym, że we fragmencie DNA geny biosyntezy L-kamityny są ustawione w sekwencji bcoC. bcoA/B i bcoD lub, jeśli ma to zastosowanie, bcoC. bcoA/B, bcoD oraz bcoT i są obecne jako pojedyncza jednostka transkrypcyjna.
- 21. Mikroorganizm według zastrz. 19, znamienny tym, że we fragmencie DNA element regulacyjny genów obejmuje promotor naturalnego operonu bco, Pbco.
- 22. Mikroorganizm według zastrz. 16 albo 19, albo 20, albo 21, znamienny tym, że we fragmencie DNA geny bcoC. bcoA/B. bcoD oraz bcoT są scharakteryzowane poniższą mapąrestrykcyjną:0 ί 2 3 q S 6 7 8 bcoA/B bcoD bco T
- 23. Mikroorganizm będący Rhizobium/Agrobacterium HK 1349, obejmującym plazmid pVK100q zdeponowany pod numerem depozytowym DSM 8726, plazmid pVK1011, scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 3 lub plazmid pAZIOl, scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 4 oraz genetyczne odmiany i mutanty wyprowadzone z takich mikro- organizmów, o zdolności do biosyntezy L-kamityny.
- 24. Mikroorganizm będący Rhizobium/Agrobacterium HK 1349.4, obejmującym plazmid pVK100q zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM180 3008726, plazmid pVK1011, scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 3 lub plazmid pAZl 01, scharakteryzowany mapąrestrykcyjną według fig. 4 oraz genetyczne odmiany i mutanty wyprowadzone z takich mikroorganizmów o zdolności do biosyntezy L-kamityny.
- 25. Biotechnologiczny sposób wytwarzania L-kamityny, znamienny tym, że krotonobetainę i/lub γ -butyrobetainę poddaje się fermentacji w obecności odpowiedniego źródła węgla i azotu, jak glutaminian, octan i betaina, bądź gliceryna i betaina, stosując mikroorganizm rekombinacyjny, wybrany spośród mikroorganizmów rodzajów Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Comamonas oraz Rhizobium/Agrobacterium i zawierający fragment DNA, obejmujący co najmniej jeden spośród genów bcoC. bcoA/B oraz bcoD dla biosyntezy L-kamityny, kodujący dehydrogenazę γ -butyrobetainy-CoA (bcoCL syntetazę γ -butyrobetaina/krotonobetaina-CoA (bęoA/B) lub hydrolazę krotonobetainy-CoA (bcoD), wybrany z grupy obejmującej:a) fragment 10,6 kb EcoRI, wstawiony w plazmid pVK100q, zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, oraz jego podfragmenty; jak równieżb) fragmenty, które hybrydyzująze wskazanym wyżej fragmentem 10,6 kb EcoRI lub jego podfragmentami i kodują enzymy o aktywnościach dehydrogenazy γ -butyrobetainy-CoA, syntetazy γ -butyrobetainy/krotonobetainy-CoA i/lub hydrolazy krotonobetainy-CoA; lub wektor, zawierający wskazany wyżej fragment DNA, a następnie wyodrębnia się wytworzonąL-kamitynę.
- 26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny, w którym fragment DNA obejmuje ponadto gen bcoT przypisany do metabolizmu γ -butyrobetaina/krotonobetaina i kodujący proteinę potencjalnego transportu.
- 27. Sposób według zastrz. 25 albo 26, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny, w którym fragment DNA obejmuje geny bcoC. bęoA/B, bcoD i ewentualnie bcoT wyprowadzone z mikroorganizmów rodzajów Escherischia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium oraz Rhizobium/Agrobacterium.
- 28. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny, w którym we fragmencie DNA geny są operacyjnie połączone z elementami kontroli genetycznej niezbędnymi dla ekspresji, takimi jak promotory i miejsca wiązania rybosomów.
- 29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny, w którym we fragmencie DNA geny biosyntezy L-kamityny są ustawione w sekwencji bcoC. bcoA/B i bcoD lub, jeśli ma to zastosowanie, bcoC. bcoA/B. bcoD oraz bcoT i są obecne jako pojedyncza jednostka transkrypcyjna.
- 30. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że stosuje się mikroorgaznim rekombinacyjny, w którym we fragmencie DNA element regulacyjny genów obejmuje promotor naturalnego operonu bco, Pbco.
- 31. Sposób według zastrz. 25 albo 28, albo 29, albo 30, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny, w którym we fragmencie DNA fragment DNA geny bcoC. bcoA/B, bcoD oraz bcoT są scharakteryzowane poniższą mapą restrykcyjną:0 123^5678 bcoC bcoA/B bcoD bco T180 300
- 32. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny Rhizobium/Agrobacterium HK1349, obejmujący plazmid pVK100q zdeponowany pod numerem depozytowym DSM 8726, plazmid pVK1011, scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 3 lub plazmid pAZIOl, scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 4, bądź genetyczne odmiany i mutanty wyprowadzone z takich mikroorganizmów o zdolności do biosyntezy L-kamityny.
- 33. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm rekombinacyjny Rhizobium/Agrobacterium HK 1349.4, obejmujący plazmid pVK100q zdeponowany w Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod numerem depozytu DSM 8726, plazmid pVK1011, scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 3 lub plazmid pAZIOl, scharakteryzowany mapą restrykcyjną według fig. 4, bądź genetyczne odmiany i mutanty wyprowadzone z takich mikroorganizmów o zdolności do biosyntezy L-kamityny.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH303693 | 1993-10-08 | ||
| CH3694 | 1994-01-06 | ||
| PCT/EP1994/003317 WO1995010613A1 (de) | 1993-10-08 | 1994-10-07 | Gene für den butyrobetain/crotonobetain-l-carnitin-stoffwechsel und ihre verwendung zur mikrobiologischen herstellung von l-carnitin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL313968A1 PL313968A1 (en) | 1996-08-05 |
| PL180300B1 true PL180300B1 (pl) | 2001-01-31 |
Family
ID=25683317
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL94313968A PL180300B1 (pl) | 1993-10-08 | 1994-10-07 | wektor zawierajacy taki fragment DNA, a takze mikroorganizmzawierajacy wskazany fragment DNA badz wektor oraz biotechnologiczny sposób wytwarzania L-karnityny PL PL PL PL PL |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5759824A (pl) |
| EP (1) | EP0722500B1 (pl) |
| JP (1) | JP3708543B2 (pl) |
| KR (1) | KR100346293B1 (pl) |
| CN (2) | CN1058523C (pl) |
| AT (1) | ATE257515T1 (pl) |
| AU (1) | AU7854694A (pl) |
| CA (1) | CA2173115C (pl) |
| CZ (1) | CZ288247B6 (pl) |
| DE (1) | DE59410350D1 (pl) |
| FI (1) | FI118568B (pl) |
| HU (1) | HU220798B1 (pl) |
| NO (1) | NO319058B1 (pl) |
| PL (1) | PL180300B1 (pl) |
| RU (1) | RU2133773C1 (pl) |
| SK (1) | SK280580B6 (pl) |
| WO (1) | WO1995010613A1 (pl) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6337197B2 (en) | 1998-10-27 | 2002-01-08 | Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. | Coenzymes useful for the synthesis of L-carnitine |
| ATE290096T1 (de) * | 1998-10-27 | 2005-03-15 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Coenzym zur herstellung von l-carnitin |
| DE19850426A1 (de) * | 1998-10-27 | 2000-05-04 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | gamma-Butyrobetainyl-Coenzym A und Verfahren zu seiner Herstellung |
| DE19850433A1 (de) * | 1998-10-27 | 2000-05-25 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Crotonobetainyl-Coenzym A, Verfahren zu seiner Herstellung |
| MXPA03001026A (es) * | 2000-08-04 | 2003-09-22 | Genencor Int | Incremento de la produccion industrial por aumentar el transporte de substratos. |
| US6720168B2 (en) | 2000-08-04 | 2004-04-13 | Genencor International, Inc. | 2,5-DKG permeases |
| WO2002061094A2 (de) * | 2001-01-31 | 2002-08-08 | Lonza Ag | Mikrobiologisches verfahren zur herstellung von l-carnitin |
| US7229811B2 (en) | 2001-08-03 | 2007-06-12 | Genencor International, Inc. | 2,5-diketo-D-gluconic acid (2,5-DKG) permeases |
| US7335496B2 (en) | 2003-06-05 | 2008-02-26 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance |
| KR101166026B1 (ko) | 2004-07-12 | 2012-07-19 | 씨제이제일제당 (주) | 뉴로스포라 크라사 유래 ｌ-카르니틴 생합성 관련유전자를 포함하는 엔테로박테리아세 속 미생물 및 이를이용한 ｌ-카르니틴의 제조방법 |
| BRPI0612611A2 (pt) | 2005-07-05 | 2010-12-07 | Lonza Ag | processo de secagem por pulverização para produzir um pó ou granulado seco de carnitina |
| DE602005022120D1 (de) * | 2005-07-19 | 2010-08-12 | Cj Cheiljedang Corp | Mikroorganismus der gattung enterobacteriacae mit genen in zusammenhang mit der biosynthese von l-carnitin sowie verfahren zur produktion von l-carnitin mit dem mikroorganismus |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59192095A (ja) * | 1983-04-13 | 1984-10-31 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−カルニチンの製造法 |
| JPH0751071B2 (ja) * | 1989-07-28 | 1995-06-05 | ロンザ リミテッド | Ｌ―カルニチンの微生物学的方法による断続的製造方法 |
| IT1240833B (it) * | 1990-05-14 | 1993-12-17 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Procedimento biocatalitico per la produzione di l-(-)- carnitina da crotonilbetaina e ceppi di proteeae per l'uso in tale procedimento |
| RU2099418C1 (ru) * | 1991-11-21 | 1997-12-20 | Лонца Аг | Фрагмент днк, обеспечивающий использование бетаина, рекомбинантная плазмидная днк с фрагментом днк, обеспечивающим использование бетаина, штамм бактерий rhizobium/agrobacterium, предназначенный для стабильного хранения плазмиды с фрагментом днк, способ получения штамма бактерий |
-
1994
- 1994-10-07 AT AT94929520T patent/ATE257515T1/de active
- 1994-10-07 CN CN94193701A patent/CN1058523C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-10-07 US US08/615,191 patent/US5759824A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-07 HU HU9600904A patent/HU220798B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-10-07 CA CA002173115A patent/CA2173115C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-10-07 SK SK431-96A patent/SK280580B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1994-10-07 JP JP51125795A patent/JP3708543B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-10-07 PL PL94313968A patent/PL180300B1/pl unknown
- 1994-10-07 EP EP94929520A patent/EP0722500B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-07 CN CNB991207033A patent/CN1157480C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-10-07 KR KR1019960701836A patent/KR100346293B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1994-10-07 DE DE59410350T patent/DE59410350D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-07 AU AU78546/94A patent/AU7854694A/en not_active Abandoned
- 1994-10-07 RU RU96108818A patent/RU2133773C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-10-07 CZ CZ19961005A patent/CZ288247B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-10-07 WO PCT/EP1994/003317 patent/WO1995010613A1/de not_active Ceased
-
1996
- 1996-04-03 NO NO19961385A patent/NO319058B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-04-04 FI FI961537A patent/FI118568B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI118568B (fi) | 2007-12-31 |
| CZ100596A3 (en) | 1996-10-16 |
| CA2173115A1 (en) | 1995-04-20 |
| US5759824A (en) | 1998-06-02 |
| SK280580B6 (sk) | 2000-04-10 |
| EP0722500A1 (de) | 1996-07-24 |
| NO961385D0 (no) | 1996-04-03 |
| CA2173115C (en) | 2005-07-26 |
| KR100346293B1 (ko) | 2002-11-30 |
| FI961537L (fi) | 1996-04-04 |
| CN1133066A (zh) | 1996-10-09 |
| HU220798B1 (hu) | 2002-05-28 |
| DE59410350D1 (de) | 2004-02-12 |
| JP3708543B2 (ja) | 2005-10-19 |
| CN1282791A (zh) | 2001-02-07 |
| CN1058523C (zh) | 2000-11-15 |
| CN1157480C (zh) | 2004-07-14 |
| WO1995010613A1 (de) | 1995-04-20 |
| PL313968A1 (en) | 1996-08-05 |
| NO961385L (no) | 1996-06-03 |
| FI961537A0 (fi) | 1996-04-04 |
| AU7854694A (en) | 1995-05-04 |
| EP0722500B1 (de) | 2004-01-07 |
| HUT74825A (en) | 1997-02-28 |
| ATE257515T1 (de) | 2004-01-15 |
| SK43196A3 (en) | 1996-10-02 |
| NO319058B1 (no) | 2005-06-13 |
| CZ288247B6 (en) | 2001-05-16 |
| JPH09503390A (ja) | 1997-04-08 |
| RU2133773C1 (ru) | 1999-07-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2944094B2 (ja) | 細菌染色体上ヘの目的遺伝子の組み込み方法及び該方法によって得られた細菌 | |
| EP0955368B1 (en) | L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing l-glutamic acid | |
| CN104561050B (zh) | 编码生物膜形成抑制蛋白质的基因和使用具有失活基因的细菌菌株生产l-赖氨酸的方法 | |
| CN102165056B (zh) | 生产l-氨基酸的微生物和使用其生产l-氨基酸的方法 | |
| WO1997008294A1 (fr) | Procede de production d'acide l-glutamique par fermentation | |
| Walter et al. | Genetic characterization of the pdu operon: use of 1, 2-propanediol in Salmonella typhimurium | |
| Gibson et al. | Analysis of the cbbXYZ operon in Rhodobacter sphaeroides | |
| Thiel et al. | [13] Conjugal transfer of plasmids to cyanobacteria | |
| PL180300B1 (pl) | wektor zawierajacy taki fragment DNA, a takze mikroorganizmzawierajacy wskazany fragment DNA badz wektor oraz biotechnologiczny sposób wytwarzania L-karnityny PL PL PL PL PL | |
| Miyagawa et al. | Cloning of the Bacillus subtilis IMP dehydrogenase gene and its application to increased production of guanosine | |
| CN113461789B (zh) | 一种来源于伯克霍尔德氏菌的LysR家族转录调控蛋白、基因及应用 | |
| CA2083407C (en) | Microorganisms for the stabilization of plasmids | |
| CN111763699A (zh) | 用于发酵生产1,5-戊二胺的重组dna、菌株及其应用 | |
| EP0240105B1 (en) | A gene coding for biotin synthetase and utilization thereof | |
| CN116536231A (zh) | 一种减少乙酸生成的大肠杆菌色氨酸合成菌株 | |
| Iijima et al. | Effects of nutrients on α‐amyiase production and plasmid stability in fed‐batch culture of recombinant bacteria | |
| US6197590B1 (en) | Process for integration of a chosen gene on the chromosome of a bacterium obtained by the said process | |
| Umeda et al. | In vivo cloning of genes determining lithoautotrophy (Aut) on a plasmid from Alcaligenes hydrogenophilus | |
| JP2025012969A (ja) | ５－アミノレブリン酸生産菌、その作製方法及びそれを用いた５－アミノレブリン酸の製造方法 | |
| Nishimura et al. | Transductional construction of aspartase-hyperproducing strain of Escherichia coli B | |
| Kim et al. | Optimization of Culture Conditions and Analysis of Plasmid Stability of a Transformant Bacillus subtilis for Cytidine Deaminase Production | |
| KR20220148694A (ko) | L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법 | |
| JPH04325086A (ja) | セラチア属に属する形質転換微生物及びそれを用いるビオチンの製造方法 |