HU220798B1 - A butiro-betain/krotono-betain-L-karnitin-anyagcsere génjeit kódoló DNS-molekulák és alkalmazásuk L-karnitin mikrobiológiai előállítására - Google Patents

Description

A találmány tárgyát a butiro-betain/krotono-betain-Lkamitin-anyagcsere génjeinek kifejezésére alkalmas rekombináns genetikai anyag képezi, továbbá a genetikai anyagot tartalmazó mikroorganizmusok, valamint az ilyen mikroorganizmusok alkalmazása L-kamitin előállítására szolgáló biotechnológiai eljárásban.

Az L-kamitin természetes, vitaminszerű anyag, amely fontos szerepet játszik a humán anyagcserében. A zsírsavak feldolgozásában az L-kamitin a mitokondriális membrán esszenciális átvivő anyaga, és ily módon az L-kamitin a metabolikus energia transzportereként működik. Amennyiben az L-kamitin nem szintetizálódik megfelelő mennyiségben a testben, akkor a táplálékkal kell magunkhoz venni, hogy elkerüljük az L-kamitin-deficienciával kapcsolatos tüneteket. A gyermekek étrendjében az L-kamitin esszenciális tápanyag, mivel a kisgyermekek nem képesek a szervezetük számára szükséges L-kamitint bioszintetizálni.

Az L-kamitin-készítményeket hatóanyagként alkalmazzák gyógyászati termékekben is. Az étrend L-karnitinnel történő kiegészítése ajánlatos kamitindeficiencia esetén, valamint egyéb terápiás körülmények között, különösen szívpanaszok esetén stb.

Az L-kamitin bioszintézise magasabbrendű élőlények esetén ismert, és az L-kamitin anyagcserében játszott további lehetséges szerepeit kiterjedten vizsgálják. Az L-kamitin mikroorganizmusokban leírt anyagcsere-reakcióútján túl, melyet elsősorban a Pseudomonas nemzetség esetén írtak le [γ-butiro-betain-hidroxiláz-katalízis, Lindstedt és munkatársai: Biochemistry 16, 2181 (1977)], az L-kamitin anyagcsere-intermedierként is termelődik bizonyos mikroorganizmusokban, például az Agrobacterium/Rhizobium fajokban. Az EP-A-0 158 194 számú közzétételi irat egy olyan mikrobiológiai L-kamitin-előállítási eljárást tár fel, amely például γ-butiro-betainból indul ki, mely eljárás szerint L-kamitil-dehidrogenáz-negatív L-kamitin-termelő mutánst állítanak elő hagyományos mikrobiológiai szelekciós eljárásokkal, és az így előállított termelőtörzs alkalmazásával már 20-30 órás reakcióidő alatt is viszonylag jó kitermelés érhető el. A klasszikus mikrobiológiai eljárások alkalmazásával azonban ez a folyamat a térfogat/idő kitermelés vonatkozásában tovább már nem optimalizálható.

A találmány szerinti megoldás kidolgozásánál tehát célul tűztük ki, hogy egy gazdaságosabb biotechnológiai eljárást fejlesszünk ki L-kamitin termelésére, amely szerint az L-kamitin jelentősen rövidebb reakcióidő alatt az eddig elértnél jobb kitermeléssel állítható elő.

A γ-butiro-betain/krotono-betain-anyagcsere vizsgálata során azonosítottunk öt gént: bcoA/B, bcoC, bcoD, bcoE és bcoT, mely gének a γ-butiro-betain/krotonobetain anyagcsere-reakcióútban szerepet játszó enzimeket kódolnak, mely gének más génekkel együtt egy közös operonban találhatók, az úgynevezett butiro-L-karnitin-operonban (bco). A leírásban használt értelemben az alább megadott rövidítések jelentése a következő:

bcoA/B: egy γ-butiro-betain-CoA-szintetáz (BcoA) és krotono-betain-CoA-szintetáz (BcoB) aktivitású enzim génje, azaz a gén egy olyan különleges enzimet kódol, melynek mind γ-butiro-betain-CoA-szintetáz aktivitása, mind pedig krotono-betain-CoA-szintetáz aktivitása van;

bcoC: γ-butiro-betain-CoA-dehidrogenáz gén;

bcoD: krotono-betain-CoA-hidroláz gén;

bocE: L-kamitin-dehidrogenáz gén; és bcoT: feltehetőleg a transzportrendszerben szerepet játszó gén.

Azt találtuk, hogy a bcoA/B, bcoC és bcoD gének termékei szerepet játszanak a L-kamitin bioszintézisében, a bcoE gén viszont a kamitin-dehidrogenázt kódolja, amely az L-kamitil-CoA anyagcsere-intermedier degradációját idézi elő betainná. A bcoT gén feltehetőleg egy transzportfehérjét kódol, amely a butiro-betain anyagcserével kapcsolt transzportrendszerben játszik szerepet. Ez a gén az L-kamitin-bioszintézis szempontjából nem esszenciális. A találmány tárgyát képezik tehát olyan DNS-fragmensek és vektorok, amelyek a bcoC, bcoA/B és bcoD gének közül egyet vagy többet tartalmaznak, mely gének az L-kamitin-bioszintézisben szerepet játszó enzimeket kódolnak, a γ-butiro-betain/krotono-betain-anyagcsere keretein belül, és a találmány tárgyát képezik továbbá a bcoT gént tartalmazó fragmensek és vektorok is, mely gén feltehetőleg egy transzportfehérjét kódol.

A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti DNS-fragmenseket és/vagy vektorokat tartalmazó mikroorganizmusok is. A találmány tárgyát képezi egy biotechnológiai eljárás is L-kamitin előállítására, a találmány szerinti mikroorganizmusok alkalmazásával.

A leírásban és az igénypontokban használt értelemben a bcoA/B, bcoC, bcoD és bcoT rövidítések a megadott definíció értelmében jelentik mind a vad típusú organizmusok génjeit, melyek a γ-butiro-betain/krotonobetain-L-kamitin-anyagcsere enzimeit kódolják, és a fent említett enzimaktivitásokkal bírnak, mely gének a butiro-betain-L-kamitin-operon (bco-operon) génjei, mind pedig funkcionálisan ekvivalens genetikai variánsaikat és mutánsaikat, azaz olyan géneket, melyek a vad típusú organizmusok génjeiből származnak, és amelyek géntermékének biológiai működése lényegében változatlan. Funkcionálisan ekvivalens genetikai variáns és mutáns többek között az olyan gén, amelyben a genetikai kód ismert degenerációja alapján „csendes” báziscserék történtek, ilyen gének előállíthatók például mesterségesen abból a célból, hogy az illető gént a termelésre használt mikroorganizmus kodonhasználatához igazítsuk. Variánsok és mutánsok továbbá a bázisvagy kodondeléciókat, -inszerciókat és -szubsztitúciókat tartalmazó gének, abban az esetben, ha géntermékük biológiai funkciója lényegében változatlan. Ide tartoznak például azok a génszekvenciák is, melyek nagy mértékben homológok, például több mint 70%-ban homológok a vad típusú génszekvenciával, és képesek hibridizálódni a vad típusú szekvenciák komplementer szálaihoz, sztringens hibridizációs körülmények között, például 50-70 °C közötti hőmérsékleten, és 0,5-1,5 mol/1 sókoncentrációjú oldatban.

A „transzkripciós egység” kifejezés a leírásban használt értelemben olyan DNS-szekvenciákat jelent,

HU 220 798 Bl melyekben a gének egy transzkripciós irányba vannak rendeződve, és közös transzkripciós szabályozás alatt íródnak át, és az átírás eredményeként egy folytonos transzkriptum részeit képezik, és az ilyen DNS-szekvenciák a struktúrgéneken túl tartalmaznak genetikai szabályozóelemeket is, melyek szükségesek a génkifejeződéshez, például promotereket és riboszómakötő helyeket.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.

Az 1. ábrán a γ-butiro-betain- és krotono-betain-Lkamitin anyagcsere-reakcióutak enzimeit láthatjuk.

A 2. ábrán a Rhizobium/AgrobacteriumbiA izolált 10,6 kb-os DNS-fragmens restrikciós térképét láthatjuk, amely tartalmazza a bco-operont.

A 3. és 4. ábrákon a pVKlOll- és pAZlOl-plazmidok szerkezetét láthatjuk; a nyilak a bco- és beugének (betain-hasznosításért felelős gének; EP-A0 543 344) elhelyezkedését és orientációját mutatják. A plazmidokban található inszerteket vastag vonallal jelöltük.

Az 5. ábrán a pCC49-plazmid szerkezetét láthatjuk, amely plazmid kiindulási anyagként használható egy recA~-gazdatörzs előállításához.

A 6. ábrán a pVKlOll-, ρΑΖΙΟΙ-, pVKlOOq- és pAZ7-plazmidok előállításának vázlatát láthatjuk.

A 7. ábrán egy recA--gazdatörzs előállításának vázlatát láthatjuk.

A γ-butiro-betain/krotono-betain-L-kamitin anyagcsere-reakcióút bcoA/B, bcoC, bcoD és bcoT génjeinek izolálásához kiindulási anyagként felhasználhatunk bármely olyan mikroorganizmust, amely képes a butirobetaint és/vagy a krotono-betaint metabolizálni, az

1. ábrán látható anyagcsere-reakcióút szerint. A gének izolálására alkalmas mikroorganizmusok példáiként megemlítjük a következő nemzetségeket: Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium és Agrobacterium/Rhizobium, melyek közül előnyösen az utolsót alkalmazzuk. Előnyösen alkalmazható Agrobacterium/Rhizobium nemzetséghez tartozó mikroorganizmus például az Agrobacterium/Rhizobium HK4-törzs (DSM 2938), mely törzset már leírtak az EP-A0 158 194 számú közzétételi iratban. Különösen előnyösen alkalmazhatók a találmány szerinti megoldásban azok a mikroorganizmusok, amelyek kamitin-dehidrogenáz-negatívok, azaz például azok a mikroorganizmusok, melyek nem tartalmaznak bco-E gént, vagy csak működésképtelen bcoE génnel rendelkeznek (a továbbiakban a működésképtelen bcoE gént bcoE’ génnek is fogjuk nevezni). Előnyös kamitin-dehidrogenáz-negatív mikroorganizmusok például az Agrobacterium/Rhizobium HK13(DSM 2903) és HK1331b-törzsek (DSM 3225), melyeket feltártak az EP-A- 0 158 194 számú közzétételi iratban, valamint az Agrobacterium/Rhizobium HK1349-törzs (DSM 3944), melynek leírása megtalálható az EP-A-0 543 344 számú közzétételi iratban.

A γ-butiro-betain/krotono-betain-L-kamitin-anyagcsere bcoA/B, bcoC, bcoD és bcoT génjeit lokalizálhatjuk egy mikroorganizmus kromoszómájában például oly módon, hogy a mikroorganizmust transzpozoninszerciós mutagenezisnek vetjük alá, és ily módon megjelöljük a γ-butiro-betain/krotono-betain-L-karnitin-anyagcserében szerepet játszó enzimek génjeit egy megfelelő jelzővel, például egy kanamycin- (Km) rezisztenciát kódoló génnel. Ezután izolálhatjuk azokat az ily módon megjelölt mutánsokat, melyek nem képesek a butiro-betain-anyagcsere különböző intermediereit hasznosítani. Ezzel az eljárással azonosíthatjuk a γbutiro-betain/krotono-betain-L-kamitin-anyagcserében szerepet játszó enzimek génjeit, és azt is megállapíthatjuk, hogy az adott gén ilyen enzimaktivitásért felelős. A megjelölt géneket azután klónozhatjuk és ily módon nagyobb részletességgel jellemezhetjük azokat, alkalmas restrikciós enzimek felhasználásával. A találmány szerinti érintetlen géneket vagy DNS-fragmenseket azután a megfelelő nem mutáns mikroorganizmusból készített génbankból kiindulva izolálhatjuk, mely génbankból a bco géneket önmagában ismert eljárás szerint hibridizáció alkalmazásával izolálhatjuk, a fentiek szerint mutagenizált törzsből kinyert klónozott gének felhasználásával. Az ily módon izolált géneket ezután kívánt vektorokba klónozhatjuk, és restrikciós enzimekkel térképezhetjük.

Az L-kamitin bioszintéziséért csak a bcoA/B, bcoC és bcoD gének felelősek. Ennek megfelelően az L-karnitin bioszintéziséhez csak ezen gének jelenléte szükséges valamely mikroorganizmusban. A kiindulási körülményektől függően, például a kiválasztott termelőtörzs és a kiválasztott kiindulási anyagok figyelembevételével az L-kamitin-termelésre használt DNS-ffagmensek és vektorok tartalmazhatnak az L-kamitin-bioszintézisben szerepet játszó gének közül egyet vagy többet.

A bcoA/B, bcoC és bcoD géneken felül a találmány szerinti DNS-ffagmensek és vektorok kívánt esetben tartalmazhatják a feltehetőleg transzportfehéijét kódoló bcoT gént is.

A találmány szerinti megoldás szempontjából L-karnitil-dehidrogenáz-gén jelenléte - például a bocE gén jelenléte - nem kívánatos, mivel az ilyen gén által kódolt enzim jelenlétében az L-kamitin degradálódik. Működésképtelen bcoE gén (bcoE’) jelenléte azonban nem káros.

Előnyösen az L-karnitin-bioszintézis génjeit a bcoC, bcoA/B és bcoD, valamint adott esetben a feltehetőleg transzportfehéijét kódoló bcoT-gént egy DNSfragmensen vagy vektormolekulán elhelyezve alkalmazzuk L-kamitin termelésére, például a géneket a szabályozóelemektől 3’-irányban helyezzük el, a következő sorrendben: bcoC, bcoA/B és bcoD vagy bcoC, bcoA/B, bcoD és bcoT, oly módon, hogy azok a fenti definíció szerint egy transzkripciós egységet alkossanak, amely ismertetett elrendezés megegyezik a gének természetben előforduló butaro-betain-L-kamitin-operonban való elhelyezkedésével. Az ilyen transzkripciós egység bcoC, bcoA/B, bcoD és bcoT génjeit jellemezhetjük például a 2. ábrán bemutatott restrikciós térkép megfelelő részleteivel.

A bco-gének transzkripciója alkalmas, előnyösen erős promoter szabályozása alatt történik. Az alkalma3

HU 220 798 Bl zandó promotert a kívánt expressziós körülményeknek megfelelően választjuk meg, az alkalmas promoter megválasztása függ például attól, hogy konstitutív vagy indukált expressziót kívánunk-e végezni, valamint az expresszióhoz használt mikroorganizmus fajtájától is. Alkalmas promoter például a természetben előforduló butirobetain-L-kamitin-operon P^-promotere. Amennyiben az L-kamitín-bioszintézisért felelős bco-géneket például olyan mikroorganizmusból izoláljuk, amelyben a bcoE gén működésképtelen (bcoE’), előnyösen az egész bcooperon izolálható és megklónozható a bcoE’ génnel és a szabályozóelemekkel együtt, és alkalmas mikroorganizmusba klónozva az egész operon fölhasználható az Lkamitin termelésére. Ilyen transzkripciós egységet, amelyben mutáns bcoE gén található, izolálhatunk például a Rhizobium/Agrobacterium HK1349-törzsből, és ez a transzkripciós egység jellemezhető a 2. ábrán látható restrikciós térképpel, amennyiben a bcoE enzimben található mutáció például kizárólag egy pontmutáció, és nem érint restrikciós hasítóhelyet. A bco gének expresszáltatására alkalmas további promoterek például: a P_Nm- és P_sl-promoterek [M. Labes és munkatársai: Gene, 89, 3Ί (1990)], a trp-promoter [Amann és munkatársai: Gene, 25, 167 (1983)], a tac-promoter [Amann és munkatársai: Gene, 25, 167 (1983)], valamint a tacpromoter, amely az említett trp- és lac-promoterekből kialakított hibrid promoter, amely alkalmazható konstitutív és indukálható promoterként is [Russell és Bennett: Gene, 20, 231 (1982)].

A találmány szerinti bco géneket tartalmazó DNSfragmenseket, melyek a bco géneket előnyösen egyetlen transzkripciós egység részeként tartalmazzák, L-karnitín termelésére alkalmas termelőtörzsben oly módon használhatjuk fel, hogy önmagában ismert eljárások alkalmazásával a DNS-ffagmenseket alkalmas vektorokba építjük, előnyösen expressziós vektorokba, például fágokba vagy plazmidokba. Az alkalmazott vektorok lehetnek autonóm vagy önreplikálódó vektorok, de lehetnek úgynevezett integrálódó vektorok is. Az „integrálódó vektor” kifejezés a leírásban használt értelemben olyan vektort, például plazmidot jelent, amely tartalmaz legalább egy olyan szekvenciarészletet, amely homológ a recipiens törzs valamely genomi szekvenciarészletével és ilyen módon az integrálódó vektor lehetővé teszi az említett szekvencia mentén történő homológ rekombináció útján az idegen gének beépülését a recipiens törzs genomjába. Előnyösen autonóm és önreplikálódó vektorokat alkalmazunk.

A kiválasztott vektor sajátságaitól függően az Lkamitin-bioszintézis génjeit különböző élőlényekben expresszálhatjuk. Alkalmas vektorok mind a szűk, mind a széles gazdaspecifitású vektorok, valamint a fent leírt integrálódó vektorok is.

Széles gazdaspecifitású vektorként alkalmazhatunk valamely gramnegatív baktériumokban működő vektort. Ilyen széles gazdaspecifitású vektorok példáiként megemlítjük a következőket: pVKlOO [Knauf és Nester: Plasmid, 8, 45 (1982)], pME285 [Haas és Itoh: Gene 36, 27 (1985)] és pKT240 [Bagdasarian és munkatársai: Gene, 26, 273 (1983)] valamint ezek származékai. pVKlOO származékként alkalmazhatjuk például a pVK.1100-plazmidot, pME285-származékként alkalmazhatjuk például a pAZlO-plazmidot, és pKT240származékként alkalmazhatjuk például a pL032-plazmidot (EP-A-0 5423 344).

A Rhizobium/Agrobacterium nemzetségben alkalmazható integrálódó vektorok alapulhatnak például a pACYC184- vagy pBR322-plazmidokon [Comai és munkatársai: Plasmid, 10, 21 (1983)].

Találmány szerinti vektorok példáiként többek között alábbi vektorokat állítottuk elő: pVKlOOq, pVKlOll (3. ábra), pAZ7, pAZ7::beu, pAZlOl (4. ábra) és pLO41. A pVKl OOq-plazmidot 1993. november 16-án letétbe helyeztük a német Nemzeti Mikroorganizmus és Sejttenyészet Gyűjteményben (D38124, Braunschweig, Mascheroderweg lb, Rhizobium/Agrobacterium HK1349-sejtekbe transzformálva, DSM 8726 deponálási számon).

A találmány szerinti DNS-fragmenseket vagy vektorokat fermentálásra - azaz L-kamitin-termelésre - alkalmas termelőtörzsek előállítása céljából be kell juttatni a kívánt gazdasejtbe, amely alkalmas a találmány szerinti gének expresszálására. Ebből a célból a találmány szerinti DNS-ffagmenseket tartalmazó vektorokat előnyösen önmagában ismert eljárás szerint a kiválasztott mikroorganizmusokba transzformáljuk. A transzformációt követően a mikroorganizmus a találmány szerinti DNS-fragmens tartalmazhatja a vektormolekulán, de tartalmazhatja kromoszómájába integrálódva is.

Alkalmas termelőtörzs lehet minden olyan mikroorganizmus, amely képes L-kamitint előállítani krotonobetainból és/vagy γ-butiro-betainból, és amelynek L-karnitin-degradáló (katabolizáló) képessége teljesen vagy részlegesen gátol. L-kamitin-katabolizmusban gátolt mikroorganizmusok például a kamitin-dehidrogenáznegatív törzsek, azaz az olyan törzsek, melyekben a kamitín-dehidrogenáz gén (bcoE) ki van kapcsolva, például mutáció vagy deléció következtében, és/vagy az olyan törzsek, melyek L,D-kamitin-racemáz-negatívak és L-kamitin-dehidratáz-negatívak.

Előnyösen alkalmazható gazdatörzsek azok a törzsek, melyek magas szubsztrát- és kiindulásianyagtűrőképességűek, például a következő nemzetségekhez tartozó mikroorganizmusok: Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Comamonas és Rhizobium/Agrobacterium, melyek közül előnyösen az utolsót alkalmazzuk. A Rhizobium/Agrobacterium HK13-, HK1331B- és HK1349-törzseket már korábban ismertettük, és a HK1349.4-törzs is (EP-A-0 543 344) különösen előnyös.

Azt találtuk továbbá, hogy az L-kamitin-kitermelés tovább fokozható, amennyiben a gazdatörzs rekombinációs képességét, azaz rekombinációs tendenciáját és rekombinációs frekvenciáját csökkentjük. Ilyen módon csökkenthetjük annak lehetőségét, hogy a vektor kromoszomális homológia alapján rekombinálódjék. A gazdatörzs rekombinációs képességét csökkenthetjük például ismert módon, recA génjének specifikus mutáltatása útján (recA-mutáció). Különösen előnyös rekombinációs képességükben gátolt mikroorganizmusok a Rhizo4

HU 220 798 BI bium/Agrobacterium fajhoz tartozó törzsek, például a Rhizobium/Agrobacterium HK1349.49-törzs találmány szerint előállított változatai, melyek előállítását a későbbiekben ismertetjük. Alkalmas termelőtörzsek tehát például a Rhizobium/Agrobacterium HK1349-, HK1349.4és HK1349.49-törzsek, melyek tartalmazzák a pVKlOOq-, pVKlOOl-, pAZ7-, pAZ7: :beu-, pAZlOlvagy pL041-plazmidokat.

A transzformált gazdatörzseket (termelőtörzseket) szelektív táptalajon izolálhatjuk, mely táptalajhoz olyan antibiotikumot adunk, amelyre a termelőtörzs egy a találmány szerinti vektoron vagy DNS-fragmensen található markergén jelenlétének következtében rezisztens. Amennyiben termelőtörzsként az EP-A-0 543 344 szerinti mikroorganizmusokat használjuk, azaz olyan mikroorganizmusokat, melyeknek a bétáin hasznosításáért felelős kromoszomális génje mutációt szenvedett, és egy ilyen törzset olyan plazmiddal transzformálunk, amely tartalmazza a bétáin hasznosításáért felelős gént, az ilyen transzformáns törzset szelektálhatjuk betainhasznosítás alapján is. A betainhasznosítás alapján szelektálható törzsek példáiként megemlíthetjük a már korábban említett HK1349.4 és HK1349.49-törzseket, melyek például a pLO41-, ρΑΖΙΟΙ-, pAZ7::beu- vagy pVKlOll-plazmidokat tartalmazzák.

A találmány szerinti biotechnológiai eljárást L-karnitin előállítására a találmány szerinti DNS-fragmenseket vagy vektorokat tartalmazó mikroorganizmusok alkalmazásával hajtjuk végre. Az L-kamitin termelésére szolgáló eljárást önmagukban ismert lépések szerint hajtjuk végre, például az EP-A-0 158 194 számú közzétételi iratban leírtak szerint, például γ-butiro-betainból kiindulva, alkalmas szén- és nitrogénforrások jelenlétében. Szén- és nitrogénforrásként alkalmazhatunk például glutamátot, acetátot és betaint, vagy glicerint és betaint. Amennyiben a biotechnológiai termelési eljárást olyan mikroorganizmusok alkalmazásával hajtjuk végre, melyek betainhasznosítás alapján szelektálhatok, egyedüli nitrogénforrásként betaint alkalmazunk. A fermentációt és az előállított L-kamitin fermentációt követő izolálását végrehajthatjuk az EP-A-0 158 194 számú közzétételi iratban leírtakhoz hasonlóan. Az Lkamitin-kitermelést tovább optimalizálhatjuk, amennyiben szakember számára ismert módon a távközeg összetételét és a fermentációs körülményeket a kiválasztott termelő mikroorganizmus vonatkozásában optimalizáljuk.

1. példa

Transzpozon-inszerciós (Tn5) mutánsok előállítása és fenotípusos azonosítások

A vad típusú Rhizobium/Agrobacterium HK4-törzset (DSM 2938, EP-B-0 158 194) szelekciós nyomással spontán streptomyinrezisztencia kialakítására késztettük (Sm, 1000 pg/ml). Az ily módon kialakított rezisztencia több mint 50 generáción keresztül stabilnak bizonyult, és a továbbiakban ezt szelekciós markerként használtuk.

Összekevertünk 0,2 ml Tn5-donortenyészetet (Escherichia coli S17-l/pSUP2021; R. Simon és munkatársai: Biotechnology, 1, 784 (1983)] 2 ml HK4recipiens tenyészettel, majd a sejtkeveréket lecentrifugáltuk. A törzseket ezután 0,9%-os sóoldattal (NaCloldattal) mostuk, majd 100μ1 0,9%-os sóoldatban felszuszpendáltuk őket. A recipiens törzs konjugációját a donor törzzsel egy éjszakán át 30 °C-on hajtottuk végre, szárazagar-táptalajon. Ezután a begyűjtött sejteket különböző hígításokban szelekciós táptalajra szélesztettük, amely mind a recipiens törzsre (Sm^R), mind pedig a transzpozonra nézve (neomycinrezisztencia, Nm^R) szelektív volt.

A Tn5-mutánsokat Sm (1000 pg/ml) és Nm-tartalmú (100 pg/ml) agartáptalajon szelektáltuk. A mutánsokat fenotípusosan azon az alapon azonosítottuk, hogy minimáltáptalajban egyedüli szénforrásként nem képesek a butiro-betain-anyagcsere intermediereit hasznosítani (lásd 1. ábra).

2. példa

A HK4-genom Tn5-jelzett DNS-fragmenselnek klónozása

A Tn5-mutáltatott HK4-törzsből izolált genomi DNS-t (5 pg) teljes mértékben megemésztettünk EcoRI-enzimmel (4 E/pg). Megemésztettünk 2,5 pg pBR325-plazmidot is [Gene, 2, 95 (1977)] teljes mértékben EcoRI-enzimmel, majd a megemésztett plazmidot alkalikus foszfatázzal kezeltük. Rekombináns hibrid plazmidokat úgy állítottunk elő, hogy a megemésztett genomi DNS-t és pBR325-plazmidot összekevertük, majd az elegyhez T4 DNS ligázt adtunk (0,2 E/pg DNS), 400 pl ligációs pufferben [20 mmol/1 tris-HCl, pH=7,2, 10 mmol/1 DTT (ditiotreitol), 10 mmol/1 MgCl₂, 0,6 mmol/1 ATP], majd a reakcióelegyet egy éjszakán át 12 °C-on állni hagytuk.

A ligációs elegy alikvotrészeivel Escherichia coli ED8654-törzset [Barek és munkatársai: Mól. Gén. Génét., 146, 199 (1976)] transzformáltunk [Cohen és munkatársai: PNAS 69, 2110 (1972)]. A transzformánsokat rezisztenciáiknak megfelelően ampicillint (AP, 100 pg/ml) és kanamycint (Km, 25 pg/ml) tartalmazó táptalajon szelektáltuk. Valamennyi kiválasztott hibridplazmid tartalmazott egy Tn5-transzpozonnal jelölt HK4-inszertet. Az inszerteket a 2. ábrán látható restrikciós térképnek megfelelő restrikciós enzimekkel térképeztük. A kapott restrikciós térképek összehasonlításából megállapítottuk, hogy a transzpozon-inszerció azonos genomi fragmensben egy sor különböző fenotípusú Tn5-mutánst eredményezett.

Ezt a megfigyelést az azonos módon elhasított plazmid DNS „Southem-blot”-hibridizációja [„Gentechnische Methoden”, szerk.: S. Bertram és H. G. Gassen, G. Fischer Verlag, 219. oldal (1991)] útján is megerősítettük. Hibridizációs próbaként a transzpozonmutánsok klónozott DNS-ének szubfragmenseit használtuk.

3. példa

Genomi HK4-génbank előállítása lambda-fágokban

Ahhoz, hogy valamely DNS-fragmens lambda-fágokba csomagolható legyen, szükséges, hogy mérete

HU 220 798 Bl

40-52 kb közé essen, és tartalmazzon egy „cos helyet”. A genomi HK4-génbank lambda-fágokban történő előállításához a pVKlOO-jelü kozmidvektort [Knauf és Nester: Plasmid 8, 45 (1982)] használtuk, amely 23 kb méretű, és ily módon lehetővé teszi 17-29 kb méretű DNS-fragmensek klónozását.

A pVKlOO-kozmidot megemésztettük EcoRI-enzimmel, defoszforiláltuk, és összeligáltuk a részlegesen EcoRI-enzimmel emésztett HK4-DNS-sel. A részleges emésztéshez ideális EcoRI-koncentrációt próbaemésztésekkel határoztuk meg, és az ideális koncentráció 0,58 E/pg DNS-nek vagy 0,02 E/μΙ reakcióelegynek adódott, a reakcióelegy 8,5 pg HK4-DNS-t tartalmazott. Az emésztést követően a 17 kb-nál nagyobb méretű DNS-fragmenseket izoláltuk az agaróz-elektroforézisgélből. A ligálást 10 pl térfogatú reakcióelegyben hajtottuk végre, amely 100 ng kozmidvektort és 400 ng részlegesen emésztett HK4-DNS-t tartalmazott. A ligálás után in vitro „csomagolást” hajtottunk végre, a gyártó utasításai szerint (Promega Biotec. által forgalmazott reagenskészletet használtunk), két óra reakcióidővel, 25 °C-on. A becsomagolt fágrészecskékkel Escherichia coli ST17-l-törzset transzferáltunk, majd a kozmidvektorban található Km-rezisztenciára szelektáltunk. Körülbelül 5500 transzformáns kiónt (egyedi kiónokat) kaptunk. A génbank kiónokat -70 °C-on tároltuk öt részre elosztva, minden rész körülbelül 1000 kiónt tartalmazott, és a ki ónokat fagyasztó táptalajban fagyasztottuk le [„nutrient yeast broth”: NYB, (Oxoid) és 50% glicerin]. A génbank sokszorozását úgy hajtottuk végre, hogy a lefagyasztott kiónokat tartalmazó reakcióedények mindegyikéből 50-50 pl-t 10 ml egy éjszakán át NYB-táptalajban tenyésztett sejtekhez adtunk, majd a keveréket egyenlő részekre osztottuk.

4. példa

A HK4-kozmidgénbank szkrinelése a bco géneket hordozó kozmidklónok azonosítása kolónia hibridizációs módszerrel „dot-blot-hibridizációval vagy a HK-mutánsok közvetlen komplementáciöjával

A klónozott TN5-jelzett DNS-fragmenseket közvetlenül hibridizációs próbaként tudtuk alkalmazni.

A megfelelő DNS-szekvenciákat tartalmazó kiónok pozitív hibridizációs jelet adtak, és az ilyen kiónokban valamennyi HK4-mutáns esetén megtörtént a hibás gén komplementációja. A különböző mutánsok által adott kereszthibridizációs reakciók arra utaltak, hogy a butiro-betain-anyagcsere néhány génje egymás közelében helyezkedik el egy 10,6 kb-os DNS-fragmensen (2. ábra).

A kolóniahibridizációt önmagában ismert eljárás szerint hajtottuk végre (Bertram és Gassen: lásd fent). A „dot-blot”-eljárást is a szakirodalomból ismert eljárás szerint hajtottuk végre (Bertram és Gassen: lásd fent).

5. példa

A HK-mutánsok komplementációja

Miután a butiro-betain-anyagcsere egyes génjeit pontosan lokalizáltuk, molekuláris méretük figyelembevételével, az azonosított peptidláncok alapján, lehetségessé vált, hogy a különböző génekben mutációt hordozó különböző mutánsokat komplementáljuk.

A vizsgálni kívánt pVKlOO: :HK-DNS expressziós plazmidot Escherichia coli ST17-l-sejtekkel történő konjugáció útján Rhizobium/Agrobacterium HK4-törzsbe juttattuk, az 1. példában leírtak szerint, amely recipiens törzs mutációt hordozott a különböző metabolikus lépések valamelyikében (lásd 1. ábra). A szelekciót a donor prolin-auxotrófiája (pro) alapján végeztük, valamint a vektor antibiotikum-rezisztenciája alapján (Km^RTc: tetraciklin^R).

6. példa

6.1 A bco fragmens klónozása a HK1349-törzsből (DSM 3944) és származékaiból

A termelőtörzs termelőképességét a génkópiák számának növelésével kívántuk fokozni, és ezért megklónoztuk a bco-operont a HK1349-törzsből (DSM 3944, EP-A-0 543 344). Ebben a törzsben megtalálható a teljes hosszúságú bco-operon, de az operon első génje a bcoE, amely a kamitin-CoA-dehidrogenázt kódolja, mutációt szenvedett. Az ebből a törzsből izolált bco-operon tehát ideális a termelékenység növelésére, amennyiben nagy kópiaszámú expressziós vektoron juttatjuk a termelőtörzsbe.

A klónozást önmagában ismert eljárás szerint hajtottuk végre, Escherichia coli SÍ7-1-törzsben, az EP-A-0 543 344 számú közzétételi irat 3. példájában leírtaknak megfelelően. Úgy jártunk el, hogy egy HK1349-génbankból izoláltuk a 10,6 kb-os bco-operont tartalmazó fragmenst, és azt a pVKlOO-vektorba ligáltuk. így állítottuk elő a pVKlOOq-plazmidot (az előállítás vázlatát a 6. ábrán mutatjuk be). A szelekciót Escherichia coli SÍ7-1-sejtekben, NYB-Km-táptalajon (25 pg/ml) hajtottuk végre. A megfelelő inszertet hordozó HK-mutánsokat az 5. példában leírtak szerint azonosítottuk. A HK1349-törzsből izolált, EcoRI-enzimmel hasított DNS-t elektroforetikusan elválasztottuk, és a körülbelül 10,6 kb méretű fragmenseket izoláltuk a gélből. Az izolált fragmenseket EcoRI-enzimmel hasított PVKlOO-vektorba ligáltuk. A ligálás eredményeként kapott hibrid plazmid keverékkel Escherichia coli S17-l-sejteket (polin-auxotróf sejtek) transzformáltunk, majd a transzformánsokat Km-tartalmú (25 pg/ml) agartáptalajon szelektáltuk. A vektorból és a 10,6 kb-os DNS-fragmensből álló megfelelő hibridplazmid kiónt, amely tartalmazta a bco-operont, „foltképzéses” eljárással azonosítottuk, egy butiro-betain-CoA-szintetáz-negatív mutánsból (HK4V4) kialakított pázsiton, szén- és nitrogénforrásként 0,2 vegyes% butiro-betaint tartalmazó minimáltáptalajon. A megfelelő klón konjugációs transzfer után a mutáns sejtekben komplementálni a rendelkezésre álló szénfonás hasznosításában mutatkozó defícienciát. Az ily módon azonosított pVKlOOqklónt egyrészt közvetlenül plazmidelőállításra használtuk, másrészt pedig a bco-operont tartalmazó DNSfragmens fenntartására, a további szubklónozási lépésekhez.

HU 220 798 Β1

6.2 A ρΑΖΙΟΙ-, ρΑΖ7-, pVKlOll-, pVKlOOq-, pLO41és pAZ7:: beu-plazmidok előállítása

A ρΑΖΙΟΙ-, pAZ7-, pVKlOll- és pVKlOOq-plazmidokat a 6. ábrán bemutatott vázlat szerint állítottuk elő, a pLO41-plazmidot pedig a pLO32-plazmidból kiindulva (EP-A-0 543 344), a bco gének beépítése útján (10,6 kb-os EcoRI/EcoRI-fragmens), a pAZ7: :beu-plazmidot pedig a pAZ7-plazmidból kiindulva (6. ábra), a beu gének beépítése útján (3 kb-os Pstl/Pstl-fragmens, EP-A-0 543 344). A restrikciós enzimeket a gyártó utasításai szerint 3-5 E/pg DNSkoncentrációban alkalmaztuk. A pVKlOOq-plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a bco géneket beépítettük a pVKlOO-plazmidba (Knauf és Nester: lásd fent). A pVKlOOsl-jelű kiindulási plazmidot (6. ábra) a pVKlOOs-plazmidból (EP-A-0 543 344) kiindulva EcoRI-enzimmel végrehajtott deléciós klónozással állítottuk elő.

7. példa recA-mutáció létrehozása HK1349.4-törzsben

7.1 A recA-gént hordozó génbankklón azonosítása

A HK4-sejtekből készített genomi kozmidgénbankot kolóniahibridizációs módszerrel szkríneltük recA-kódoló kiónokat keresve (Bestram és Gassen: 1991, lásd fent). Hibridizációs próbaként a Rhizobium leguminosarumból klónozott recA-gént használtuk [W. Selbitschka és munkatársai: Mól. Gén. Génét., 299, 86 (1991)]. A pozitív hibridizációs reakciót adó kozmidklónt izoláltuk, és az EcoRI-emésztés után kinyert EcoRI-inszert-fragmensekben a recA-próbával végzett „Southem-blot”-hibridizáció útján kerestünk recA-homológ szekvenciákat (Bertram és Gassen: 1991, lásd fent). A „Southem-blot”-hibridizáció során pozitív jelet adó EcoRI-fragmenst a pVKlOO-vektorba ligáltuk, melyet hasonló módon hasítottunk. A kapott pVKlOOrljelű hibrid plazmiddal a DNS felszaporítása céljából Escherichia coli S—17— 1 sejteket transzformáltunk.

7.2 Kanamycinrezisztencia gén bejuttatása HK1349.4sejtekbe, a kromoszomális recA-gén inaktiválása céljából

A 11,0 kb-os EcoRI-fragmenst a pVKlOOrl-plazmidból kiindulva újra klónoztuk a pACYC 184-vektorba [A. C. Y. Chang és S. N. Cohen: J. Bacteriol., 134, 1141 (1978)], a vektort EcoRI-el hasítottuk.

A meghatározott restrikciós térkép alapján egy 3,1 kb-os BglII/NruI-szubfragmenst - amely a „Southem-blot”-hibridizáció során a recA-próbával pozitív jelet adott - a BamHI/HindlIl-hasított pWS233-vektorba klónoztunk. A pWS233 egy „géncsere”-vektor, melyet W. Selbitschka és munkatársai írtak le [Appl. Microbiol. Biotechnoi.: 38, 615 (1993)].

A kapott pCC45-plazmid Xhol-hasítóhelyére beklónoztuk a Tn5-transzpozon Km-rezisztenciát kódoló Xhol-fragmensét [pSUP2021, R. Simon és munkatársai: Biotechnology, 1, (1983)], előállítva ily módon a pCC49-plazmidot. A W. Selbitschka és munkatársai által leírt eljáráshoz hasonlóan (lásd fent) az alábbiak szerint „géncserét” hajtottunk végre.

Összekevertünk 3 ml exponenciális fázisban levő HK1349.4-tenyészetet 1 ml exponenciális fázisban levő donor tenyészettel (ST17-l/pCC49), a sejteket lecentrifugáltuk és 0,49%-os NaCl-oldattal mostuk őket. A sejteket ezután egy éjszakán át 30 °C-on inkubáltuk, agartáptalajon, 50 μΐ NYB-tápoldatban szélesztve. Ezek után a sejteket 0,9%-os NaCl-oldatban felszuszpendáltuk, majd alkalmas hígításban szelektív táptalajra vittük őket. Az Sm-rezisztens HK1349.4-transzkonjugánsokat Sm-(1000 pg/ml és Nm-tartalmú 150 pg/ml) agartáptalajon szelektáltunk, és a megfelelő transzkonjugánsok 5% szacharózra érzékenynek mutatkoztak komplex táptalajban, a „géncsere”-vektoron található sacRB-géneknek köszönhetően.

Kétszeres rekombinációt kis gyakorisággal tapasztaltunk (10-⁸), miután a kiválasztott transzkonjugánsokat szelekciós nyomás nélkül agartáptalajon tenyésztettük. Körülbelül egy hét elteltével izolálni tudtunk olyan sejteket, amelyek elviselték a táptalajhoz adott 5% szacharóz jelenlétét, Nm-rezisztensek maradtak, azonban gentamycinérzékenyekké (Gm-érzékenyekké) váltak (a Gm-rezisztenciagén a vektorban található markergén).

Ez a fenotípus azt igazolja, hogy allélikus markercsere történt, és azt jelzi, hogy a HK1349.4-törzsben recA-mutáció történt. Az izolált mutánsok vonatkozásában ki tudtuk mutatni a tipikus recA-mutáns fenotípust (például UV-érzékenység stb.). Az ily módon előállított HK1349.49-törzsben a homológ szekvenciákat tartalmazó plazmidok kromoszomális integrációjának (homológ rekombináció) tendenciája nyilvánvalóan csökkent. Ez a törzs tehát rendkívül alkalmas gazdatörzs a 6.2 példa szerinti hibrid plazmidok számára.

8. példa

Biotranszformáciö

A biotranszformációt 100 ml-es rázólombikokban hajtottuk végre, nitrogénmentes minimáltáptalaj alkalmazásával [Kulla és munkatársai: Arch. Microbiol. 135, 1 (1983)], amely kiindulási anyagként tartalmazott 0,2 vegyes% γ-butiro-betaint, szénforrásként pedig 0,4 vegyes% glicerint. A betainhasznosításra képtelen törzsek esetén nitrogénforrásként és további szénforrásként 0,2 vegyes% L-glutamátot adtunk a táptalajhoz, más törzsek esetén pedig 0,2 vegyes% betaint.

Termelőtörzsként az alábbi törzseket használtuk: HK1349.4/pLO41, HK1349.4/pVK1011, HK1349/pAZ7: :beu, HK1349/pAZ101, HK1349/pVK100q és HK1349/pAZ7.

Az 1. táblázatban összehasonlítjuk a kapott eredményeket az EP-A-0-543 344 számú közzétételi iratból ismert HK13-származékokkal (HK1349, DSM 3944; HK1349.4) elért eredményekkel.

A γ-butiro-betainból keletkező L-kamitin mennyiségét a DNTB-eljárással [5,5’-ditiobisz(2-nitro-benzoát)] határoztuk meg, melynek leírása megtalálható a Bergmeyer-féle kézikönyvben [Η. K. Bergmeyer: „Methoden dér enzymatischen Analyse”, Verlag Chemie, 1810. oldal (1974)].

HU 220 798 Β1

1. táblázat

Törzsek	Minimáltáptalaj+ glicerin	Specifikus aktivitás (mmol/óra/OD)
HK1349 (nem találmány szerinti törzs)	+ bétáin	0,24
HK1349/pVK100q	+ bétáin	0,36
HK1349/pAZ7	+ bétáin	0,49
HK1349 (nem találmány szerinti törzs)	+ L-glutamát	0,14
HK1349.4 (nem találmány szerinti törzs)	+ L-glutamát	0,11
HK1349.4/pL041	+ L-glutamát	0,29
HK1349.4 (nem találmány szerinti törzs)	+ ammónia	0,12
HK1349.4/pVK1011	+ bétáin	0,54
HK1349/pAZ7: :beu	+ bétáin	0,47
HK1349/pAZ101	+ bétáin	1,08

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (16)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Izolált DNS-fragmens, amely tartalmaz egyet vagy többet az L-kamitin-bioszintézisben szerepet játszó következő gének közül: bcoC, bcoA/B és bcoD, mely gének a következő enzimeket kódolják: γ-butiro-betain-CoAdehidrogenáz (bcoC), y-butiro-betain/krotono-betainCoA szintetáz (bcoA/B) és krotono-betain-CoA-hidroláz (bcoD), és amely fragmens az alábbiak valamelyike:

   a) egy 10,6 kb-os EcoRI-fragmens, amely a pVKlOOq-plazmidba van inszertálva, amely plazmid Rhizobium/Agrobacterium HK1349-sejtekbe transzformálva DSM 8726 számon letétbe van helyezve, vagy ezen fragmens szubfragmensei; és

   b) az a) pont szerinti 10,6 kb-os EcoRI-fragmenssel sztringens körülmények között - azaz 50-70 °C-on, 0,5-1,5 mol/1 sókoncentráció mellett - hibridizálódni képes fragmensek és azok szubfragmensei, melyek olyan enzimeket kódolnak, melyek γ-butiro-betainCoA-dehidrogenáz, és/vagy γ-butiro-betain/krotono-betain-CoA-szintetáz és/vagy krotono-betain-CoA-hidroláz aktivitásúak.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti DNS-fragmens, amely tartalmazza továbbá a bcoT gént is, amely gén a γbutiro-betain/krotono-betain-anyagcserével kapcsolt, és feltételezhetően egy transzportfehérjét kódol.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti DNS-fragmens, amely az Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium és Rhizobium/Agrobacterium nemzetségek valamelyikéből származó bcoC, bcoA/B, bcoD és adott esetben bcoT géneket tartalmaz.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti DNSfragmens, amelyben a gének funkcionálisan hozzá vannak kapcsolva az expresszióhoz szükséges genetikai szabályozóelemekhez.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti DNSfragmens, amelyben az L-kamitin-bioszintézisben szerepet játszó gének a következő sorrendben vannak elrendezve : bcoC, bcoA/B és bcoD, vagy adott esetben bcoC, bcoA/B, bcoD és bcoT, és egyetlen transzkripciós egységen belül találhatók.
6. 6. A 4. vagy 5. igénypont szerinti DNS-fragmens, amely genetikai szabályozóelemként tartalmazza a természetben előforduló bco-operon promoterét, a Ρ^θpromotert.
7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti DNSfragmens, amelyben a bcoC, bcoA/B, bcoD és bcoT gének a 2. ábra szerinti restrikciós térképpel jellemezhetők.
8. 8. Vektor, amely 1-7. igénypontok bármelyike szerinti DNS-fragmenst tartalmaz.
9. 9. A 8. igénypont szerinti vektor, amely a pVKlOOqjelű plazmid - mely plazmid DSM 8726 számon, Rhizobium/Agrobacterium HK1349-törzsbe transzformálva letétbe van helyezve a pVKlOl 1-jelű plazmid - mely plazmid a 3. ábra szerinti restrikciós térképpel jellemezhető -; vagy a ρΑΖΙΟΙ-jelű plazmid - mely plazmid a 4. ábra szerinti restrikciós térképpel jellemezhető.
10. 10. Rekombináns mikroorganizmus, amely az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti DNS-fragmenst vagy vektort tartalmaz.
11. 11. A 10. igénypont szerinti mikroorganizmus, amelynek L-kamitin-katabolizáló képessége teljesen vagy részben gátolt.
12. 12. A 10. vagy 11. igénypont szerinti mikroorganizmus, amely csökkent rekombinációs képességű.
13. 13. A 10-12. igénypontok bármelyike szerinti mikroorganizmus, amely az alábbi nemzetségek bármelyikéhez tartozik: Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Comamonas és Rhizobium/Agrobacterium.
14. 14. Rhizobium/Agrobacterium HK1349-törzshöz tartozó mikroorganizmus, amely tartalmazza a pVKlOOq-plazmidot - DSM 8726 számon deponálva -, a pVKlOll-plazmidot - amely a 3. ábrán bemutatott restrikciós térképpel jellemezhető -, vagy a pAZlOl-plazmidot - amely a 4. ábrán bemutatott restrikciós térképpel jellemezhető -, valamint az említett mikroorganizmusok genetikai variánsai és mutánsai, melyek képesek L-kamitint bioszintetizálni.
15. 15. Rhizobium/Agrobacterium HK1349.4-törzshöz tartozó mikroorganizmus, amely tartalmazza a pVKlOOq-plazmidot - DSM 8726 számon deponálva -; a pVKlOll-plazmidot - amely a 3. ábrán bemutatott restrikciós térképpel jellemezhető -; vagy a pAZlOl-plazmidot - amely a 4. ábrán bemutatott restrikciós térképpel jellemezhető valamint az említett mikroorganizmusok genetikai variánsai és mutánsai, melyek képesek L-kamitint bioszintetizálni.
16. 16. Biotechnológiai eljárás L-kamitin előállítására, azzal jellemezve, hogy alkalmas szén- és nitrogénforrás jelenlétében krotono-betaint és/vagy γ-butiro-betaint fermentálunk, a 10-15. igénypontok bármelyike szerinti mikroorganizmus alkalmazásával, és a termelődött L-kamitint izoláljuk.