CZ288247B6 - DNA fragment, vector a microorganism containing genes for metabolic transformation of butyrobetaine/crotonobetaine-L-carnitine and process for preparing L-carnitine - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká rekombinantního genetického materiálu pro expresi genů látkové přeměny butyrobetain/krotonobetain-L-kamitinu, mikroorganismů, které obsahují tento rekombinantní genetický materiál a použití takových mikroorganismů při biotechnologickém způsobu přípravy L-kamitinu.

L-kamitin je přírodní látka podobná vitaminu s velkým významem při látkové přeměně u člověka. Podstatný je L-kamitin při zpracování mastných kyselin jako přenosná látka mitochondriální membrány a tím jako přenašeč metabolické energie. Jestliže organismus syntetizuje L-kamitin v nedostatečném množství, musí se nutně dodávat v potravě pro zamezení nedostatečného výskytu. Zejména při výživě malých dětí, které ještě nejsou schopné samostatné biosyntézy Lkamitin, představuje L-kamitin podstatnou živinu.

Preparáty s L-kamitinem se používají jako aktivní složky farmaceutických produktů. Prospěšné je doplnění L-kamitinem při nedostatku kamitinu a dalších terapeutických indikacích, speciálně při onemocnění srdce, atd.

Dosavadní stav techniky

Biosyntéza L-kamitinu ve vyšších organismech je známá, další funkce při látkové přeměně a význam pro látkovou přeměnu jsou předmětem intenzivního zkoumání. Vedle sledu reakcí látkové přeměny, který je popsán pro mikroorganismy speciálně rodu Pseudomonas (katalýza γbutyrobetainhydroxylázy, Linstedt a spol., Biochemistry 16, 2181-2188, 1977), tvoří se Lkamitin jako intermediát látkové přeměny určitých mikroorganismů, například Agrobacterium/Rhizobium sp.

Z evropské patentové přihlášky EP-A-0 158 194 je znám způsob mikrobiologické přípravy Lkamitinu, kdy se vychází například z γ-butyrobetainu, při kterém se získá pomocí tradičních mikrobiologických selekčních postupů negativní produkční mutant L-kamityldehydrogenázy. S tímto mutantem se získají relativně dobré výtěžky L-kamitinu během reakční doby 20 až 30 hodin. Další zlepšení tohoto postupu s ohledem na objem-/čas-výtěžky není však při této klasické mikrobiologické metodě možné.

Podstata vynálezu

Úkolem předloženého vynálezu je tedy poskytnout hospodárný biotechnologický způsob výroby L-kamitinu, při kterém se získá L-kamitin za podstatně kratší reakční dobu s ještě lepšími výtěžky.

Předmětem vynálezu je izolovaný fragment DNA obsahující jeden nebo více genů bcoC. bcoA/B a bcoD kódujících enzymy biosyntézy L-kamitinu. Každý z těchto genů kóduje buď γbutyrobetain-CoA-dehydrogenázu (bcoC). γ-butyrobetain/krotonobetain-CoA-syntetázu (bcoA/B). nebo krotonobetain-CoA-hydrolázu (bcoD), přičemž fragment DNA obsahuje buď

A) alespoň jeden nebo více sekvenčních štěpů z 10,6 kb-EcoRI-fragmentu, který je obsažen vplazmidu pVKlOOq, uloženém v Rhizobium/Agrobacterium HK1349 pod depozitním číslem DSM 8726, včetně jeho funkčně ekvivalentních genetických variant a mutantů,

-1CZ 288247 B6 nebo

B) alespoň jeden nebo více sekvenčních štěpů z homologní DNA, které s uvedeným 10,6 kbEcoRI-fragmentem hybridizují za stringentních podmínek a které kódují enzymovou aktivitu γ-butyrobetain-CoA-dehydrogenázy, γ-butyrobetain/krotonobetain-CoA-syntetázy nebo krotonobetain-CoA-hydrolázy.

Předmětem předloženého vynálezu jsou fragmenty DNA a vektory, zahrnující jeden nebo více genů bcoC. bcoA/B a bcoD, které kódují enzymy biosyntézy L-kamitinu při látkové přeměně γbutyrobetain/krotonobetainu a obsahují popřípadě dále potencionální přenašečový gen bcoT.

Předmětem vynálezu jsou dále mikroorganismy, které obsahují tyto fragmenty DNA, popřípadě vektory. Dalším předmětem je biotechnologický způsob výroby L-kamitinu za použití mikroorganismů podle vynálezu.

Pokusy související s látkovou přeměnou γ-butyrobetain/krotonobetainu vedly k identifikaci pěti genů, bcoA/B. bcoC. bcoD. bcoE a bcoT, které kódují enzymy reakčního sledu při látkové přeměně γ-butyrobetain/krotonobetainu a obecně jsou obsaženy v operonu, tzv. butyrobetain-Lkamitinovém operonu (bco). Zde znamená bcoA/B: gen y-butvrobetain-CoA-syntetázv(bcoA)/krotonobetain-CoA-syntetázy(bcoB). tzn. jediný gen, který kóduje enzymový produkt, který má aktivitu jak γ-butyrobetainCoA-syntetázy, tak také aktivitu krotonobetain-CoA-syntetázy.

bcoC: gen y-butyrobetain-CoA-dehydrogenázy bcoD: gen krotonobetain-CoA-hydrolázy bcoE: gen L-kamityldehydrogenázy a bcoT: potenciální gen transportního systému.

Zjistilo se, že genové produkty genů bcoA/B. bcoC a bcoD jsou zodpovědné za biosyntézu L-kamitinu, zatímco bcoE kóduje kamitindehydrogenázu, která ovlivňuje odbourání intermediátu látkové přeměny L-kamityl-CoA na betain. U bcoT se asi jedná o gen, kteiý kóduje přenašečový protein transportního systému patřícího k látkové přeměně butyrobetainu. Tento gen není pro biosyntézu L-kamitinu podstatný.

Označení bcoA/B. bcoC. bcoD. bcoE a bcoT. jak jsou zde v popise a v nárocích používána, zahrnují podle definice jak geny organismů divokého typu, které kódují enzymy látkové přeměny γ-butyrobetain/krotonobetain-L-kamitinu s výše uvedenými enzymovými aktivitami, zejména geny operonu butyrobetain-L-kamitin(bco), tak také jejich funkčně ekvivalentní genetické varianty a mutanty, tzn. geny, které se odvozují od genů organismů divokého typu a jejichž genetické produkty jsou v podstatě ve své biologické funkci nezměněné. Funkčně ekvivalentní genetické varianty a mutanty tak zahrnují například záměny bází v rámci známých degenerací genetického kódu, jak mohou být například vytvořeny uměle, aby se genetická sekvence přizpůsobila pro výhodné použití kodonu určitého mikroorganismu, ve kterém se má uskutečnit exprese. Varianty a mutanty dále zahrnují delece, inzerce a substituce bází nebo kodonů, dokud ponechají genovým produktům takto změněných genů jejich biologické funkce v podstatě nezměněné. Tím jsou zahrnuty například genové sekvence, které prokazují velkou homologii k sekvencím divokého typu, například větší než 70 % a za přísných hybridizačních podmínek, například při teplotách mezi 50 a 70 °C a při 0,5 až 1,5 M podílu soli, jsou schopné hybridizace s komplementem sekvence divokého typu.

Pod pojmem transkripční jednotka, jak se zde používá, se rozumí sekvence DNA, ve kterých jsou geny uspořádány v jednom transkripčním směru a při společné kontrole transkripce jsou

-2CZ 288247 B6 přepisovány do průběžného transkriptu, přičemž sekvence DNA mají vedle genů ještě genetické, kontrolní prvky potřebné pro genovou expresi, jako promotory a vazebná místa ribozomů.

Vynález je blíže objasněn následujícími výkresy.

Obr. 1 ukazuje enzymy reakčního sledu látkové přeměny γ-butyrobetain- popřípadě krotonobetain-L-kamitinu.

Obr. 2 znázorňuje restrikční mapu 10,6 kb fragmentu DNA z Rhizobium/Agrobacterium s operonem bco.

Obr. 3 a obr. 4 znázorňují plazmid pVKlOll popřípadě pAZlOl: šipky naznačují polohu a orientaci genů bco a genů beu (geny zužitkující betain: EP-A-0 543 344). Inzertovaná část plazmidů je znázorněna tučně.

Obr. 5 znázorňuje plazmid pCC49 jako možný výchozí materiál pro přípravu hostitelského kmene recA“.

Obr. 6 ukazuje konstrukční schéma pro plazmidy pVKlOl 1, pAZlOl, pVKlOOq a pAZ7.

Obr. 7 ukazuje konstrukční schéma pro hostitelský kmen recA.

Jako výchozí materiál pro izolaci genů bcoA/B. bcoC. bcoD a bcoT pro sled reakcí při látkové přeměně γ-butyrobetain/krotonobetain-L-kamitinu mohou sloužit všechny mikroorganismy, které látkově přeměňují butyrobetain a/nebo krotonobetain podle obr. 1. Příklady vhodných kmenů jsou mikroorganismy rodů Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium a Agrobacterium/Rhizobium, přičemž výhodné jsou posledně jmenované. Příkladem výhodného mikroorganismu rodu Agrobacterium/Rhizobium je mikroorganismus druhu Agrobacterium/Rhizobium sp. HK4 (DSM2938), jak je již popsán v EP-A-0 158 194. Obzvláště výhodně se používají mikroorganismy, které jsou negativní vzhledem ke kamitindehydrogenáze, tedy například nemají žádný nebo mají jen defektní gen bcoE (následně označovaný také jako bcoE‘). Příklady pro výhodné mikroorganismy s negativní kamitindehydrogenázou jsou mikroorganismy druhu Agrobacterium/Rhizobium sp. HK13 (DSM 2903) a HK1331b (DSM 3225), které jsou již popsané v EP-A-0 158 194, nebo druhu Agrobacterium/Rhizobium sp. HK1349 (DSM 3944), který je popsán v EP-A-0 543 344.

Geny bcoA/B. bcoC. bcoD. a bcoT pro sled reakcí při látkové přeměně γ-butyrobetain/krotonobetain-L-kamitinu mohou být lokalizovány v chromozomu mikroorganismu tím, že se mikroorganismy podrobí například transposon-inzerční mutagenezi a tím se geny látkové přeměny γ-butyrobetain/krotonobetain-L-kamitinu označí vhodným markérem, například kanamycin-(Km)-rezistencí. Tím se následně mohou izolovat takto označené mutanty, které již nemohou zužitkovat intermediáty látkové přeměny butyrobetainu. Takto lze geny látkové přeměny γ-butyrobetain/krotonobetain-L-kamitinu identifikovat a přiřadit jim jejich funkci. Označené geny se mohou pak klonovat a blíže charakterizovat pomocí vhodných restrikčních enzymů. Izolaci intaktních genů, popřípadě fragmentů DNA podle vynálezu lze pak uskutečnit tím, že se vyjde z genové banky odpovídajícího nemutovaného mikroorganismu, ze které se mohou geny bco nebo fragmenty z toho známým způsobem izolovat a identifikovat pomocí hybridizace se shora získanými klonovanými geny kmene podrobeného mutagenezi. Získané geny se pak mohou do žádoucích vektorů klonovat a mapovat pomocí restrikčních enzymů.

Za biosyntézu L-kamitinu jsou zodpovědné jen geny bcoA/B. bcoC a bcoD. Proto je také pro produkci L-kamitinu nutná jen přítomnost těchto genů. V závislosti na zvolených výchozích podmínkách, například na zvoleném výchozím materiálu nebo na zvoleném produkčním kmenu, mohou fragmenty DNA nebo vektory použité při produkci L-kamitinu obsahovat jeden nebo více genů biosyntézy L-kamitinu.

-3CZ 288247 B6

Pokud je to žádoucí, mohou DNA fragmenty a vektory podle vynálezu vedle genů bcoA/B. bcoC a bcoD také zahrnovat potencionální transportní gen bcoT.

Přítomnost genu L-kamityldehydrogenázy, tedy genu bcoE. je nežádoucí, protože v jeho přítomnosti se uskutečňuje odbourání L-kamitinu. Přítomnost defektního bcoE genu (bcoE‘) je však neškodná.

Účelně se nacházejí geny pro bíosyntézu L-kamitinu, totiž bcoC. bcoA/B a bcoD a popřípadě potenciální transportní gen bcoT. pro použití při výrobě L-kamitinu společně na jednom fragmentu DNA nebo molekule vektoru. Výhodně se nacházejí v konvencionálním 5‘-3‘-směru po směru genově regulačních prvků v pořadí bcoC. bcoA/B a bcoD. popřípadě bcoC. bcoA/B a bcoD a bcoT v jediné shora definované transkripční jednotce, odpovídající uspořádání v přírodním operonu butyrobetain-L-kamitinu. Geny bcoC. bcoA/B a bcoD a bcoT takové transkripční jednotky se mohou charakterizovat například odpovídajícími štěpy restrikční mapy z obr. 2.

Transkripce popřípadě exprese genů bco se účelně uskutečňuje pod kontrolou výhodně silného vhodného promotoru. Volba promotoru závisí na žádoucích podmínkách exprese, například na tom, zda je žádoucí konstitutivní nebo indukovaná exprese, nebo závisí na mikroorganismu, ve kterém se má exprese uskutečnit. Vhodným promotorem je například promotor Pbco přírodního operonu butyrobetain-L-kamitinu. Jestliže se uskutečňuje izolace genů bco odpovědných za biosyntézu L-kamitinu například z mikroorganismu s defektním genem bcoE (bcoE‘). může se například výhodně z těchto mikroorganismů izolovat a klonovat celý bco-operon s bcoE‘-genem a příslušnými genově regulačními prvky a pak se použije pro produkci L-kamitinu ve vhodných mikroorganismech. Taková transkripční jednotka s mutovaným bcoE-genem. která se může izolovat například z Rhizobium/Agrobacterium HK1349, se popřípadě rovněž může charakterizovat pomocí restrikční mapy uvedené na obr. 2, když je defekt v bcoE způsoben například pouze bodovou mutací a netýká se žádného místa štěpení. Dalšími promotory vhodnými pro expresi jsou například promotory P_Nm, P_Si (M. Labes a spol., Gene, 89, 37-46, 1990), trp-promotor (Amann a spol., Gene, 25, 167-178, 1983), lac-promotor (Amann a spol., Gene, 25, 167-178, 1983) a tac-promotor. hybrid ze jmenovaných trp- a lac-promotorů. který se může použít jako konstitutivní nebo indukovatelný promotor (Russell a Bennett, Gene, 20, 231243,1982).

Pro použití při výrobě L-kamitinu ve vhodném produkčním kmenu se fragmenty DNA podle vynálezu, které zahrnují jmenované bco-genv. výhodně společně v jediné transkripční jednotce, zabudují účelně pomocí známých technik do známých vhodných vektorů, zejména do expresních vektorů, například fágů nebo plazmidů. Jako vektory se mohou použít autonomně a samoreplikující vektory nebo také tzv. integrační vektory. Pod integračním vektorem se přitom rozumí vektor, například plazmid, který má alespoň jednu homologní sekvenci ke genomické sekvenci kmene recipienta a pomocí homologové rekombinace s touto sekvencí dovolí propašování cizích genů do genomu kmene recipienta. Výhodně se používají autonomně a samoreplikující vektory.

V závislosti na druhu zvolených vektorů se mohou geny pro enzymy biosyntézy L-kamitinu exprimovat v různých organismech. Jako vektory se hodí jak vektory se specifickým hostitelským spektrem, tak také vektory se širokým hostitelským spektrem („broad host range“) a shora popsané integrační vektory.

Jako vektory „broad host range“ se mohou použít všechny vektory, které jsou vhodné pro gram-negativní bakterie. Příklady takových „broad host range“ vektorů jsou pVK.100 (Knauf aNester, Plasmid, 8, 45-54, 1982), pME285 (Haas a Itoh, Gene, 36, 27-36, 1985) a pTK240 (Bagdasarian a spol., Gene, 26, 273-282, 1983) nebo jejich deriváty. Jako derivát pVK.100 se může například použít pVK.1001, jako derivát pME285 například pAZlO a jako derivát pKT240 například pLO32 (jak je popsané v EP-A-0 543 344).

-4CZ 288247 B6

V případě Rhizobium/Agrobacterium se jako integrační vektory mohou použít vektory na bázi pACYC184 nebo pBR322 (Comai a spol., Plasmid, 10,21-30, 1983).

Tímto způsobem se například získaly plazmidy pVKlOOq, pVKlOl 1 (obr. 3), pAZ7, pAZ7::beu, pAZlOl (obr. 4) a pLO41. Plazmid pVKlOOq byl uložen 16. 11. 1993 u Německé sbírky pro mikroorganismy a buněčné kultury GmbH. D-38124 Braunschweig, Mascheroderweg lb, v Rhizobium/Agrobacterium HK1349 pod depozitním číslem DSM 8726.

Pro přípravu produkčních kmenů pro fermentaci, tzn. kmenů pro výrobu L-kamitinu, se musí DNA fragmenty, popřípadě vektory podle vynálezu vpravit do žádoucích a pro expresi vhodných hostitelských kmenů. Účelně se ktomu mikroorganismy transformují obvyklým a o sobě známým způsobem pomocí vektorů obsahujících fragmenty DNA podle vynálezu. Mikroorganismy mohou pak mít fragment DNA podle vynálezu buď na molekule vektoru nebo integrovaný ve svém chromozomu.

Jako produkční kmeny jsou vhodné všechny mikroorganismy, které jsou schopné z krotonobetainu a/nebo γ-butyrobetainu produkovat L-kamitin a jejichž schopnost odbourávat (katabolizovat) L-kamitin je úplně nebo částečně potlačena. Mikroorganismy, které mají potlačený katabolismus L-kamitinu, jsou například kmeny, které jsou kamitindehydrogenáza-negativní. Jsou to tedy kmeny, ve kterých je kamitindehydrogenázový gen bcoE vyřazen například mutací nebo delecí, a/nebo kmeny, které jsou L,D-kamitinracemáza-negativní a L-kamitindehydratázanegativní.

Vhodné hostitelské kmeny, výhodně kmeny s velkou substrátovou a eduktovou tolerancí jsou například mikroorganismy rodů Escherichia. Pseudomonas, Agrobacterium. Rhizobium, Comamonas a Rhizobium/Agrobacterium, přičemž poslední jsou výhodné. Mikroorganismy již shora uvedeného druhu Rhizobium/Agrobacterium sp. KH13, HK1331b a HK1349, jakož i druhu HK1349.4 (jak je popsáno v EP-A-0 543 344) jsou obzvláště výhodné.

Navíc se zjistilo, že se výtěžek L-kamitinu může ještě zlepšit, jestliže schopnost rekombinace hostitelského kmene, tedy jeho rekombinační tendence a frekvence je snížena. Tím se omezí rekombinace s vektorem na základě chromozomální homologie. Rekombinační schopnost hostitelského kmene se může snížit například známým způsobem cílenou mutací jeho recA-genu (rec-mutace). Obzvláště výhodné mikroorganismy se sníženou rekombinační schopností jsou mikroorganismy druhu Rhizobium/Agrobacterium sp. například kmeny podle vynálezu získané jak je dále popsáno druhu Rhizobium/Agrobacterium HK1349.49.

Vhodnými produkčními kmeny jsou tak například mikroorganismy druhu Rhizobium/Agrobacterium HK1349, HK1349.4 a HK1349.49, které právě obsahují plazmid pVKlOOq, pVKlOOl, pAZ7, pAZ7::beu, pAZlOl nebo pLO41.

Izolace transformovaných hostitelských kmenů (produkčních kmenů) se může uskutečnit ze selektivního živného média, ke kterému se přidá antibiotikum, vůči kterému jsou kmeny rezistentní, pomocí markerového genu na vektoru nebo fragmentu DNA. Jestliže se jako produkční kmeny použijí mikroorganismy podle EP-A-0 543 344, tzn. mikroorganismy, které jsou ve svém chromozomálním genu, který kóduje zužitkování betainu, mutovány a transformovány plazmidem, který obsahuje gen kódující zužitkování betainu, může se provádět selekce také vzhledem k zužitkování betainu. Příklady mikroorganismů schopných selekce vzhledem k zužitkování betainu jsou již zmíněné HK1349.4 a HK1349.49, které například obsahují plazmid pLO41, pAZlOl, pAZ7::beu nebo pVKlOl 1.

Biotechnologická příprava L-kamitinu se uskuteční za použití mikroorganismů, které obsahují fragmenty DNA, popřípadě vektory podle vynálezu. Způsob přípravy L-kamitinu se uskuteční osobě známými postupy, například jak jsou popsané vEP-A-0 158 194, kdy se vychází například z γ-butyrobetainu v přítomnosti vhodného zdroje uhlíku a dusíku. Jako zdroj uhlíku

-5CZ 288247 B6 a dusíku se mohou použít například glutamát, acetát a betain, nebo glycerin a betain. Jestliže se biotechnologická příprava provádí pomocí mikroorganismů selektovatelných vzhledem k zužitkování betainu, použije se betain jako jediný zdroj dusíku.

Fermentace a následná izolace L-kamitinu se může uskutečnit způsobem podobným jako je popsán v EP-A-0 158 194.

Obměnou živin v médiu a přizpůsobením fermentačních podmínek obvyklým způsobem na právě použitý mikroorganismus se může dále zvýšit výtěžek L-kamitinu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Výroba transposon-inzerčních mutantů (Tn5) a jejich fenotypická identifikace

Divoký kmen Rhizobium/Agrobacterium HK4 (DSM 2938, EP-B-0 158 194) se přiměje selekčním tlakem k vyvinutí spontánní rezistence k streptomycinu (Sm, 1000 pg/ml). Tato rezistence byla stabilní prokazatelně přes 50 generací bez selekce a použila se jako markér.

0,2 ml Tn5-donorové kultury z E. coli S17-l/pSUP2021 (R. Simon a spol., Biotechnology, 1983, 1, 784-790) se smíchají s 2 ml recipientově kultury HK4 a odstředí. Buňky se promyjí v 0,9% roztoku NaCl a resuspendují v 100 μΐ 0,9% roztoku NaCl. Konjugace recipientového kmene s donorovým kmenem se uskuteční přes noc při 30 °C na suchém živném agaru. Sebrané buňky se ve zředěních rozprostřely na selekční médium pro recipient (Sm^R) a transposon (neomycinová rezistence Nm^R)).

Získají se Tn5-mutanty na živném agaru sSm (1000 pg/ml) a Nm (100 pg/ml). Fenotypická identifikace mutantů se uskuteční pomocí průkazu nezužitkování intermediátů látkové přeměny butyrobetainu podle obr. 1 jako zdroje uhlíku v minimálním médiu.

Příklad 2

Klonování Tn5-značených fragmentů DNA z HK4-genomu

Izolovaná genomická DNA z Tn5-mutovaného HK4 (5 pg) se úplně štěpí pomocí EcoRI (4 U/pg, U znamená jednotku). pBR325 (2,5 pg) (Gene, 1977, 2, 95-113) se po úplném štěpení s EcoRI zpracuje s alkalickou fosfatázou. Po smíchání genomické DNA a pBR325 s T4-DNAligázou (0,2 U/pg DNA) ve 400 pl ligačního pufru (20 mM Tris-HCl, pH7,2, 10 mM DTT (dithiothreitol), 10 mM MgCl₂, 0,6 mM ATP) a inkubaci přes noc při 12 °C se získají hybridní plazmidy.

Alikvotní části ligační směsi se použijí pro transformaci (Cohen a spol., 1972, PNAS 69, 21102114) E. coli ED 8654 (Bárek a spol., Mol. Gen. Genet., 146, 199-207, 1976). Transformanty se podrobí selekci na živném médiu na rezistenci k ampicilinu (Ap, 100 pg/ml) a kanamycinu (Km, 25 pg/ml). Všechny selektované hybridní plazmidy mají HK4-inzert, který je označen Tn5. Inzerty se mapují pro různé restrikční enzymy podle restrikční mapy na obr. 2. Srovnání restrikčních map doložila transposonovou inzerci ve stejném genomickém fragmentu u řady Tn5-mutantů s rozdílným fenotypem.

-6CZ 288247 B6

Potvrzení tohoto pozorování lze získat pomocí Southem Blot-hybridizace („Gentechnische methoden“, vydané S. Bertramem a H.G. Gassenem, nakladatelství G. Fischer 1991, 219 a další) identicky štěpené plazmidové DNA a následujícím elektroforetickým rozdělením. Jako sondy slouží subfragmenty této klonované DNA z transposonmutantů.

Příklad 3

Vytvoření genomické HK4-genové banky v lambda-fázích

DNA potřebuje být velká 40 - 52 kb a mít místo „cos-site“, aby mohla být sbalena do lambdafágů. Pro vytvoření genomické HK4-genové banky v lambda-fázích se použije cosmidvektor pVKlOO (Knauf a Nester, 1982, Plasmid 8, 45-54), který je velký 23 kb a tím dovolí klonování fragmentů DNA mezi 17-29 kb.

pVKlOO se štěpí s EcoRI. defosfoiyluje a liguje sHK4-DNA, která je částečně rozštěpena s EcoRI. Ideální koncentrace Eco-RI pro parciální štěpení HK4-DNA se zjistila pomocí testu štěpení jako 0,58 U/pg DNA, popřípadě 0,02 U/μΙ reakční směsi, přičemž se použilo 8,5 pg HK4-DNA v reakční směsi. Fragmenty DNA se v rozsahu velikostí větším než 17 kb izolují z elektroforetických agarosových gelů. Ligace se uskuteční νΙΟμΙ objemu s obsahem lOOng cosmid-vektoru a 400 ng pasenger-DNA. Pak se uskuteční „In vitro-packing“ podle návodu výrobce v mixu firmy Promega Biotec. během 2 hod. při 25 °C. Po transfekci E. coli S17-1 se podrobí selekci na Km-rezistenci cosmid-vektoru. Jedním nasazením se získá cca 5500 kolonií (individuální klony). Kolonie genové banky se uchovávají v 5 dávkách (batches) po cca 1000 klonech v mrazicím médiu (Nutrient Yeast Broth (kvasinkové živné prostředí), NYB, Oxoid a 50 % glycerin) při -70 °C. Amplifikace genové banky se uskuteční s vždy 50 μΐ z těchto batches v 10 ml NYB-kultury přes noc a porcováním.

Příklad 4

Screening genové banky HK4-cosmid, identifikace cosmidových klonů nesoucích bco-geny přes hybridizaci kolonií, hybridizace dot-blotting nebo přímá komplementace na HK-mutantech

Jako sondy hybridizace se mohou přímo použít klonované Tn5 značené fragmenty DNA.

Klony s odpovídajícími sekvencemi DNA ukazují hybridizační signály a vedou ke komplementaci právě defektního genu v HK4-mutantu. Křížové hybridizace DNA z různých mutantů dokládají nahromadění více genů látkové přeměny butyrobetainu na fragmentu DNA o 10,6 kb (obr. 2).

Hybridizace kolonií se provádí obvyklým způsobem (S. Bertram a H.G. Gassen, 1991, tamtéž, 221 a další). Dot-blotting se rovněž provádí známým způsobem (S. Bertram a H.G. Gassen, 1991, tamtéž, 217 a další).

Příklad 5

Komplementace HK-mutantů

Po přesné lokalizaci jednotlivých genů látkové přeměny butyrobetainu s ohledem na molekulární velikosti na základě identifikovaných peptidových řetězců se mohla docílit komplementace jednotlivých mutantů pomocí právě se vyskytujících genových štěpů.

-7CZ 288247 B6

Právě expresní plazmid pVK100::HK-DNA se vpraví konjugací zE. coli S17-1 do kmenů Rhizobium/Agrobacterium sp. HK4 podle příkladu 1, které mají mutace pro rozdílné kroky látkové přeměny (viz obr. 1). Selekce se uskuteční vůči prolinové (pro)-auxotrofii donoru a na rezistenci vektoru na antibiotika (Km^RTc (tetracyklin)^R).

Příklad 6

6.1 Klonování bco-fragmentu z kmene HK1349 (DSM 3944) a potomků

Pro dosažení genově-dávkových účinků a zvýšení produktivity na produkčním kmenu se klonuje bco-operon z HK 1349 (DSM 3944, EP-A-0 543 344). V tomto kmeni je celý bco-operon úplně obsažený, avšak první gen, bcoE. pro kamitin-CoA-dehydrogenázu je mutován. Fragment DNA získaný z tohoto kmenu s bco-operonem je tím ideální pro zvyšování produktivity z důvodu velkého počtu kopií expresních vektorů.

Klonování se uskutečnila známým způsobem vE. coli S17-1 podle příkladu 3 EP-A-0 543 344. K tomuto účelu se izoluje bco-operon 10,6 kb velký z genové banky HK1349 a liguje do pVKlOO. Z toho vznikne plazmid pVKlOOq (viz konstrukční schéma podle obr. 6). Selekce se uskuteční v E. coli S17-1 na NYB Km (25 pg/ml). Identifikace správného inzertu se daří na HKmutantech podle metody popsané v příkladě 5. DNA ZHK1349 štěpená EcoRI se rozdělí elektroforeticky a z gelu se izolují fragmenty v rozmezí velikosti 10,6 kb. Izolované fragmenty se ligují do pVKlOO štěpeném v EcoRI.

Touto směsí hybridních plazmidů se transformuje E. coli S17-1 (prolin-auxotrofní) a podrobí selekci na živném agaru Km (25 pg/ml). Identifikování správného klonu hybridního plazmidů z vektoru a fragmentu DNA 10,6 kb nesoucího bco-operon se docílí pomocí „patch-mating“ na „trávníku“ butyrobetain-CoA-syntetáza-negativním mutantu (HK4V4) na minimálním médiu s 0,2 % (hmotnost/objem) butyrobetainu jako zdroje uhlíku a dusíku. Správný klon je sto po takovém konjugativním přenosu do mutantu komplementovat buňky v zužitkování tohoto zdroje uhlíku. Takto identifikovaný klon pVKlOOq slouží přímo jako produkční plazmid nebo jako rezervoár fragmentu DNA s bco-operonem pro další subklonování.

6.2 Vytvoření pAZlOl, pAZ7, pVKlOl 1 a pVKlOOq, pLO41 a pAZ::beu

Vytvoření pAZlOl, pAZ7, pVKlOl 1 a pVKlOOq se uskuteční podle schématu vytvoření na obr. 6. Při vytvoření pLO41 se vychází z pLO32 (EP-A-0 543 344) a použije se inzerce bco-genů (10,6 kb velký fragment EcoRI/EcoRD. Při vytvoření plazmidů pAZ7::beu se vychází zpAZ7 (obr. 6) a použije se inzerce beu-genů (3 kb velký fragment Pstl/Pstl, EP-A-0 543 344). Použijí se odpovídající restrikční enzymy s 3-5 U/pg DNA podle údajů výrobců. Plazmid pVKlOOq se získá inzercí bco-genů do pVKlOO (Knauf a Nester, tamtéž). Výchozí plazmid pVKlOOsl (schéma vytvoření obr. 6) se získá EcoRI-delečními klonováními plazmidů pVKlOOs (EP-A-0 543 344).

Příklad 7

Vpravení recA-mutace do HK1349.4

7.1 Identifikace klonu genové banky kódujícího recA

Pomocí metody hybridizace kolonií (S. Bertram a H.G. Gassen, 1991, tamtéž, 221 a další) se zkoumá genomická HK4-cosmid-genová banka na recA-kódující klony. Jako sonda pro hybridizaci slouží klonovaný rec-gen z Rhizobium leguminosarum (W. Selbitschka a spol., Mol. Gen. Genet., 299, 1991, 86-95). Označený cosmidklon se izoluje a EcoRI-DNA-inzertfragmenty

-8CZ 288247 B6 získané po štěpení EcoRI se zkoumají pomocí Southem Blot-hybridizace vůči recA-sondě (S. Bertram a H.G. Gassen, 1991, tamtéž, 219 a další) na recA-homologní sekvence. Takto označený EcoRI-fragment se liguje do stejně štěpeného vektoru pVK.100. Se vzniklým hybridním plazmidem pVKlOOrl se pro namnožení DNA transformují buňky E.coli S17-1.

7.2 Vpravení genu pro kanamycin-rezistenci do HK1349.4 pro inaktivaci chromozomálního recA-genu

EcoRI-fragment 11.0 kb velký se překlonuje z pVKlOOrl do pACYC184 (A.C.Y. Chang a S.N. Cohen, J. Bacteriol., 134,1978,1141-1156), který byl štěpen EcoRI.

Podle zjištěné restrikční mapy se klonuje štěpený BglII-Nrul subfragment velký 3,1 kb, který se při Southem Blot-hybridizaci označil vůči recA-sondě. do vektoru pWS233, štěpeného BamHIHindlII. pWS233 je „gene replacement“ vektor (vektor výměny genů) a je popsaný autory W. Selbitschka a spol., Appl. Microbiol. Biotechnol. 38,1993, 615-618.

Do místa štěpení Xhol výsledného plazmidu pCC45 se vklonuje fragment Xhol-DNA zTn5 (pSUP2021, R. Simon a spol., Biotechnology, 1, 1983, tamtéž), který· kóduje Km-rezistenci. Z toho vznikne pCC49. Podle postupu W. Selbitschka a spol., 1993 tamtéž, se uskuteční „gene replacement“ následovně:

ml exponenciální kultury (S17-l/pCC49), odstředí a promyjí s 0,9% roztokem NaCl. Buňky se inkubují v 50 μΐ NYB na živném agaru přes noc při 30 °C. Pak se buňky' resuspendované v 0,9% roztoku NaCl nanesou na selektivní média ve vhodném zředění. Získají se transkonjugáty Smrezistentního recipientu HK1349.4 na živném agaru s Sm (1000 pg/ml) a Nm (150 pg/ml) a ty vykazují senzitivitu k 5% sacharóze v komplexním médiu což odpovídá genům sacRB na „replacement“ vektoru.

Získají se dvojnásobné rekombinace po kultivaci selektovaných transkonjugátů bez selekčního tlaku na živném agaru s malou frekvencí (10'⁸): Po cca 1 týdnu se mohou izolovat buňky, které tolerují 5% sacharózu v médiu, zůstaly Nm-rezistentní, ale opět se staly gentamycin (Gm)senzitivní (vektorový markér).

Tento fenotyp potvrzuje alelovou markerovou výměnu a ukazuje na recA-mutaci v HK1349.4. Je pozorovatelný typický fenotyp (např. UV-senzitivita atd.) recA-mutantů.

V takto získaném kmeni HK1349.4 je výrazně snížena tendence chromozomální integrace plazmidů s homologními sekvencemi (homologová rekombinace). Kmen je proto vhodným hostitelem pro hybridní plazmidy připravené v příkladu 6.2.

Příklad 8

Biotransformace

Biotransformace se provádí vtřepacích baňkách (100 ml) s bezdusíkatým minimálním médiem (MM, Kulla a spol., Arch. Microbiol., 1983, 135, str. 1-7), které obsahuje 0,2% (hmotnost/objem) glycerinu. Jako zdroj dusíku a dodatkový zdroj uhlíku se přidá 0,2 % (hmotnost/objem) L-glutamátu (u negativních kmenů pro zužitkování betainu) nebo 0,2% (hmotnost/objem) betainu.

Jako produkční kmeny se použijí kmeny podle vynálezu HK1349.4/pLO41, HK1349.4/pVKlOl 1, HK1349.4/pAZ7::beu, HK1349.4/pAZ101, HK1349/pVK100q a HK1349/pAZ7.

-9CZ 288247 B6

Výsledky jsou shrnuty v tabulce 1 ve srovnání s HK13-potomky HK1349 (DSM3944) a HK1349.4, které jsou známé z EP-A-0 543 344.

Tvorba L-kamitinu z γ-butyrobetainu se stanoví pomocí DTNB (5-5‘-dithiobis-(2-nitro5 benzoát)-metody popsané Bergmeyerem (H.K. Bergmeyer, 1974, Methoden der enzymatischen Analyse, nakladatelství Chemie, Weinheim, 1810a další).

Kmeny	Médium MM & glycerin	Spec, aktivita mmol/l/h/OD
HK1349 (ne podle vynálezu)	& betain	0,24
HK1349/pVK100q	& betain	0,36
HK1349pAZ	& betain	0,49
HK1349 (ne podle vynálezu)	& L-glutamát	0,14
HK1349 (ne podle vynálezu)	& L-glutamát	0,11
HK1349.4/pLO41	& L-glutamát	0,29
HK 1349.4 (ne podle vynálezu)	& amonium	0,12
HK1349.4/pVK1011	& betain	0,54
HK1349.4/pAZ7::beu	& betain	0,47
HK1349.4/pAZ101	& betain	1,08

ío Příklad 9

Detekce homologní DNA z Agrobacterium/Rhizobium sp. HK 1331b (DSM3944) pomocí hybridizace podle Southem

Pomocí PCR se z 10,9 kb inzertu zpVKlOO podle obr. 2 vyrobí cca 500 bp dlouhý fragment odpovídající části sekvence bcoD. Vsázka do PCR se čistí extrakcí fenolem a vysrážením ethanolem a fragment se radioaktivně značí translací podle Nicka (Sambrook a spol., Molecular Cloning: A laboratory manual, CSH tisk 1989) pomocí ³²P (alfa-³²P dATP, 3000 Ci/mmol) a DNA polymerázy. Specifická aktivita značené DNA-sondy je 10⁷-10⁸ cpm/mikrogram DNA.

Přibližně 10-50 mikrogramů preparátu genomické DNA štěpené sNotl zDSM3944 se elektroforeticky rozdělí na agarosovém gelu a rozdělení se UV fotograficky dokumentuje barvením s ethidium-bromidem. Gel se pak krátce 2x15 min inkubuje v 0,25 M HC1 při teplotě místnosti. Pak se gel inkubuje v neutralizujícím roztoku a přenese na nylonovou membránu 25 (Amersham Hybond N) (Southem-Blotting), jak je popsáno v Sambrook a spol. DNA se naváže na membránu pomoci UV zesítění („Stratagene Stratalinker autocrosslink“). Vysušená membrána se uchová pro další zpracování.

Hybridizace se uskuteční za stringentních podmínek v podstatě podle Sambrooka a spol. Sušina 30 se nejprve inkubuje s vodním předhybridizačním roztokem (6xSSC, 0,5 % SDS, 5xDenhard‘s a

100 mikrogramů/ml denaturovaného spermatu lososa) za mírného třepání při 65 °C 5 až 16 hodin. 20xSSC kmenový roztok obsahuje 0,3 M Na-citrát a 3 M NaCl. Pak se roztok vymění za hybridizační roztok (6xSSC, 0,5 % SDS, 5xDenhard‘s, 100 mikrogramů/ml denaturovaného spermatu lososa, 0,01 M EDTA, 10⁷ cpm/ml značené sondy), přičemž se sonda před přidáním 35 k roztoku temperovanému na 68 °C povaří 5 min na 95 °C a pak se ledem ochladí šokem.

Membrána se inkubuje v hybridizačním roztoku přes noc při 68 °C při mírném třepání. Pak se membrána dvakrát až třikrát promyje v 5x až 3xSSC/0,l % SDS při 50 °C po 20 min za mírného třepání. Membrána se testuje Geigerovým počítačem (s vhodnou počítačovou trubkou) zhruba na zbylou radioaktivitu a pak se může exponovat. Při příliš velké aktivitě pozadí se přidají další 40 promývací kroky za podmínek postupně se dále zvyšující stringence, tj. s postupně se zvyšující inkubační teplotou 50 až 55 °C a optimálně sníženou koncentraci solí na 3 až lxSSC.

-10CZ 288247 B6

Expozice se uskuteční v rentgenové filmové kazetě se zesilující clonou při -70 °C přes noc. Identifikované homologní soubory se mohou z agarosového gelu izolovat a klonovat, jestliže se na membránu nanesla jen polovina agarosového gelu.

Claims (16)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaný fragment DNA obsahující jeden nebo více genů bcoC. bcoA/B a bcoD kódujících enzymy biosyntézy L-kamitinu, přičemž každý z těchto genů kóduje buď y-butyrobetain-CoAdehydrogenázu, bcoC. γ-butyrobetain/krotonobetain-CoA-syntetázu, bcoA/B. nebo krotonobetain-CoA-hydrolázu, bcoD. a přičemž fragment DNA obsahuje buď

   A) alespoň jeden nebo více sekvenčních štěpů z 10,6 kb-EcoRI-fragmentu, který je obsažen vplazmidu pVKlOOq, uloženém v Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod depozitním číslem DSM 8726, včetně jeho funkčně ekvivalentních genetických variant a mutantů, nebo

   B) alespoň jeden nebo více sekvenčních štěpů z homologní DNA, které s uvedeným 10,6 kbEcoRI-fragmentem hybridizují za stringentních podmínek a které kódují enzymovou aktivitu y-butyrobetain-CoA-dehydrogenázy, y-butyrobetain/krotonobetain-CoA-syntetázy nebo krotonobetain-CoA-hydrolázy.
2. 2. Fragment DNA podle nároku 1 dodatečně obsahující gen bcoT. přiřazený pro látkovou přeměnu γ-butyrobetainu/krotonobetainu, který kóduje potencionální transportní protein.
3. 3. Fragment DNA podle některého z nároků 1 a 2, v němž se geny bcoC, bcoA/B. bcoD a popřípadě bcoT odvozují z mikroorganismů rodů Escherichia, Pseudomonas. Agrobacterium, Rhizobium a Rhizobium/Agrobacterium.
4. 4. Fragment DNA podle některého z nároků 1 až 3, v němž jsou geny operativně spojeny s genetickými kontrolními prvky potřebnými pro expresi.
5. 5. Fragment DNA podle jednoho z nároků 1 až 4, v němž geny biosyntézy L-kamitinu tvoří jedinou transkripční jednotku, výhodně v pořadí bcoC. bcoA/B a bcoD nebo v pořadí bcoC. bcoA/B. bcoD a bcoT.
6. 6. Fragment DNA podle jednoho z nároků 4 a 5, v němž genově regulační prvek obsahuje promotor přírodního bco-operonu. Pbc₀.
7. 7. Fragment DNA podle jednoho z nároků 1 až 6, v němž jsou geny bcoC. bcoA/B. bcoD a bcoT charakterizovány restrikční mapou podle obr. 2.
8. 8. Vektor, obsahující fragment DNA podle jednoho z nároků 1 až 7.
9. 9. Vektor podle nároku 8, kterým je plazmid zvolený ze skupiny plazmidů zahrnující pVKlOOq uložený v Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod depozitním číslem DSM 8726, plazmid pVKlOll, jak je charakterizován restrikční mapou podle obr. 3, a plazmid pAZlOl, jak je charakterizován restrikční mapou podle obr. 4.
10. 10. Rekombinantní mikroorganismus obsahující fragment DNA nebo vektor podle jednoho z nároků 1 až 9.

    -11CZ 288247 B6
11. 11. Mikroorganismus podle nároku 10, u něhož je jeho schopnost katabolizovat L-kamitin úplně nebo částečně omezena.
12. 12. Mikroorganismus podle jednoho z nároků 10 a 11, u něhož je jeho schopnost rekombinace snížena.
13. 13. Mikroorganismus podle jednoho z nároků 10 až 12 vybraný z mikrorganismů rodů Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Comamonas a Rhizobium/Agrobacterium.
14. 14. Mikroorganismus Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 obsahující plazmid zvolený ze skupiny zahrnující plazmid pVKlOOq uložený v Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod depozitním číslem DSM 8726, plazmid pVKlOll, jak je charakterizován restrikční mapou podle obr. 3, a plazmid pAZlOl, jak je charakterizován restrikční mapou podle obr. 4, jakož i z takových mikroorganismů odvozené genetické varianty a mutanty se schopností k biosyntéze L-kamitinu.
15. 15. Mikroorganismus Rhizobium/Agrobacterium HK 1349.4 obsahující plazmid zvolený ze skupiny zahrnující plazmid pVKlOOq uložený v Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod depozitním číslem 8726, plazmid pVKlOl 1, jak je charakterizován restrikční mapou podle obr. 3, a plazmid pAZlOl, jak je charakterizován restrikční mapou podle obr. 4, jakož i z takových mikroorganismů odvozené genetické varianty a mutanty se schopností k biosyntéze L-kamitinu.
16. 16. Způsob biotechnologické výroby L-kamitinu, vyznačující se tím, že se krotonobetain a/nebo γ-butyrobetain v přítomnosti vhodného zdroje uhlíku a dusíku fermentuje pomocí mikroorganismu podle jednoho z nároků 10 až 15 a L-kamitin se izoluje.