JPH10286091A - テトラサイクリン生合成に関与する遺伝子 - Google Patents
テトラサイクリン生合成に関与する遺伝子Info
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- JPH10286091A JPH10286091A JP9097232A JP9723297A JPH10286091A JP H10286091 A JPH10286091 A JP H10286091A JP 9097232 A JP9097232 A JP 9097232A JP 9723297 A JP9723297 A JP 9723297A JP H10286091 A JPH10286091 A JP H10286091A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 テトラサイクリン系抗生物質の生産に有用な
ＴＣＤＨの欠損形質を相補する遺伝子を取得し、テトラ
サイクリン系抗生物質を効率的に生産する微生物を作製
する育種材料を提供することにある。 【解決手段】 ＴＣＤＨの欠損形質を相補する遺伝子を
含むＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を組み込んだ組換えベク
ター、該組換えベクターで形質転換されたストレプトミ
セス属に属する組換え微生物、および該組換えベクター
が染色体上に組み込まれた組換え微生物、およびそれを
用いたテトラサイクリン系抗生物質の生産方法を提供す
る。
ＴＣＤＨの欠損形質を相補する遺伝子を取得し、テトラ
サイクリン系抗生物質を効率的に生産する微生物を作製
する育種材料を提供することにある。 【解決手段】 ＴＣＤＨの欠損形質を相補する遺伝子を
含むＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を組み込んだ組換えベク
ター、該組換えベクターで形質転換されたストレプトミ
セス属に属する組換え微生物、および該組換えベクター
が染色体上に組み込まれた組換え微生物、およびそれを
用いたテトラサイクリン系抗生物質の生産方法を提供す
る。
Description
【０００１】
【発明に属する技術分野】本発明は、５ａ，１１ａ−デ
ヒドロテトラサイクリン（5a,11a-dehydrotetracyclin
e）の５ａ位および１１ａ位の還元反応を触媒するテト
ラサイクリンデヒドロゲナーゼ（tetracycline dehydro
genase）の欠損形質を相補する遺伝子（以下、ＴＣＤＨ
遺伝子と略す）を含むＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を組み
込んだ組換えベクター、該組換えベクターで形質転換さ
れた組換え微生物、および該組換えベクターが染色体上
に組み込まれた組換え微生物に関する。
ヒドロテトラサイクリン（5a,11a-dehydrotetracyclin
e）の５ａ位および１１ａ位の還元反応を触媒するテト
ラサイクリンデヒドロゲナーゼ（tetracycline dehydro
genase）の欠損形質を相補する遺伝子（以下、ＴＣＤＨ
遺伝子と略す）を含むＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を組み
込んだ組換えベクター、該組換えベクターで形質転換さ
れた組換え微生物、および該組換えベクターが染色体上
に組み込まれた組換え微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】テトラサイクリン系抗生物質やその誘導
体は性感染症やおうむ病、恙虫病などに有効な抗生物質
として使われており、それらの製造はストレプトミセス
・オウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciens
）やストレプトミセス・リモーサス（Streptomyces ri
mosus）などの微生物を用いた発酵法で行われている。
体は性感染症やおうむ病、恙虫病などに有効な抗生物質
として使われており、それらの製造はストレプトミセス
・オウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciens
）やストレプトミセス・リモーサス（Streptomyces ri
mosus）などの微生物を用いた発酵法で行われている。
【０００３】これらのテトラサイクリン系抗生物質生産
菌については、これまでにかなりの研究が成されてい
る。ポリケタイド合成酵素によるテトラサイクリン骨格
の形成反応に始まってテトラサイクリンデヒドロゲナー
ゼ（以下、ＴＣＤＨと略す）による５ａ位および１１ａ
位の還元反応で完結する生合成を始め、生産菌の改良や
培養条件に関する知見がバイオテクノロジー［（Biotec
hnology）4, 393-429 Weinheim, VCH Publish(1986)］
に概説されている。
菌については、これまでにかなりの研究が成されてい
る。ポリケタイド合成酵素によるテトラサイクリン骨格
の形成反応に始まってテトラサイクリンデヒドロゲナー
ゼ（以下、ＴＣＤＨと略す）による５ａ位および１１ａ
位の還元反応で完結する生合成を始め、生産菌の改良や
培養条件に関する知見がバイオテクノロジー［（Biotec
hnology）4, 393-429 Weinheim, VCH Publish(1986)］
に概説されている。
【０００４】さらに、近年、両菌種のテトラサイクリン
系抗生物質の生合成に関与する遺伝子群を含むＤＮＡが
クローニングされ、分子遺伝学的解析が行われている。
ストレプトミセス・オウレオファシエンスからは約３２
ｋｂのＤＮＡ断片が単離され、該断片を導入することに
よって、テトラサイクリン非生産性のストレプトミセス
・リビダンス（Streptomyces lividans ）はテトラサイ
クリン抵抗性とテトラサイクリン生産能を獲得すること
が特開平５−６８５７３に記載されている。しかし、ス
トレプトミセス・リビダンスの形質転換体が産生するク
ロロテトラサイクリン力価は記載されておらず、また、
この約３２ｋｂのＤＮＡの一部またはすべてをテトラサ
イクリン系抗生物質生産性微生物に導入したときのテト
ラサイクリン系抗生物質の生産性についても記されてい
ない。また、開示されている約３２ｋｂのＤＮＡ断片に
ＴＣＤＨ遺伝子が含まれているとの記述もない。
系抗生物質の生合成に関与する遺伝子群を含むＤＮＡが
クローニングされ、分子遺伝学的解析が行われている。
ストレプトミセス・オウレオファシエンスからは約３２
ｋｂのＤＮＡ断片が単離され、該断片を導入することに
よって、テトラサイクリン非生産性のストレプトミセス
・リビダンス（Streptomyces lividans ）はテトラサイ
クリン抵抗性とテトラサイクリン生産能を獲得すること
が特開平５−６８５７３に記載されている。しかし、ス
トレプトミセス・リビダンスの形質転換体が産生するク
ロロテトラサイクリン力価は記載されておらず、また、
この約３２ｋｂのＤＮＡの一部またはすべてをテトラサ
イクリン系抗生物質生産性微生物に導入したときのテト
ラサイクリン系抗生物質の生産性についても記されてい
ない。また、開示されている約３２ｋｂのＤＮＡ断片に
ＴＣＤＨ遺伝子が含まれているとの記述もない。
【０００５】ストレプトミセス・リモーサスからは、約
３４ｋｂのＤＮＡ断片が単離されており、該断片にオキ
シテトラサイクリン耐性遺伝子、ポリケタイド合成酵素
遺伝子およびアンヒドロテトラサイクリンオキシゲナー
ゼ遺伝子（以下、ＡＯＸ遺伝子と略す）などが存在して
いること、さらに該断片を含む低コピー型の組換えプラ
スミドをストレプトミセス・リビダンスに導入すると、
オキシテトラサイクリン抵抗性とオキシテトラサイクリ
ン生産能が付与されることが報告されている［ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriolog
y ）171, 887-895(1989) 、モレキュラー・アンド・ジ
ェネラル・ジェネティックス（Molecularand General G
enetics）215, 231-238(1989) ］。しかし、このＤＮＡ
断片中にＴＣＤＨ遺伝子は見出されていない。本菌株に
おけるＴＣＤＨ遺伝子の所在に関しては、染色体上でオ
キシテトラサイクリン耐性遺伝子やポリケタイド合成酵
素遺伝子とは離れた部位に存在するとの報告もある［ジ
ャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー
（Journal of General Microbiology）124, 329-338(19
81) ］。
３４ｋｂのＤＮＡ断片が単離されており、該断片にオキ
シテトラサイクリン耐性遺伝子、ポリケタイド合成酵素
遺伝子およびアンヒドロテトラサイクリンオキシゲナー
ゼ遺伝子（以下、ＡＯＸ遺伝子と略す）などが存在して
いること、さらに該断片を含む低コピー型の組換えプラ
スミドをストレプトミセス・リビダンスに導入すると、
オキシテトラサイクリン抵抗性とオキシテトラサイクリ
ン生産能が付与されることが報告されている［ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriolog
y ）171, 887-895(1989) 、モレキュラー・アンド・ジ
ェネラル・ジェネティックス（Molecularand General G
enetics）215, 231-238(1989) ］。しかし、このＤＮＡ
断片中にＴＣＤＨ遺伝子は見出されていない。本菌株に
おけるＴＣＤＨ遺伝子の所在に関しては、染色体上でオ
キシテトラサイクリン耐性遺伝子やポリケタイド合成酵
素遺伝子とは離れた部位に存在するとの報告もある［ジ
ャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー
（Journal of General Microbiology）124, 329-338(19
81) ］。
【０００６】ストレプトミセス・オウレオファシエン
ス、ストレプトミセス・リモーサスをはじめ、テトラサ
イクリン系抗生物質生産性微生物を起源にしてＴＣＤＨ
の合成に関与する遺伝子を含むＤＮＡがクローン化され
たとの報告はこれまでになく、従ってＴＣＤＨ遺伝子の
発現強化によってテトラサイクリン生産性微生物のテト
ラサイクリン系抗生物質の生産性が改善できることも知
られていない。
ス、ストレプトミセス・リモーサスをはじめ、テトラサ
イクリン系抗生物質生産性微生物を起源にしてＴＣＤＨ
の合成に関与する遺伝子を含むＤＮＡがクローン化され
たとの報告はこれまでになく、従ってＴＣＤＨ遺伝子の
発現強化によってテトラサイクリン生産性微生物のテト
ラサイクリン系抗生物質の生産性が改善できることも知
られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、テト
ラサイクリン系抗生物質の生産に有用なＴＣＤＨの欠損
形質を相補する遺伝子を含むＤＮＡを取得することにあ
る。さらには、遺伝子工学的な手法を用いて該遺伝子の
増幅および発現を強化することによりＴＣＤＨ反応を改
善し、延いてはテトラサイクリン系抗生物質を効率的に
生産する微生物を作製する育種材料を提供することにあ
る。
ラサイクリン系抗生物質の生産に有用なＴＣＤＨの欠損
形質を相補する遺伝子を含むＤＮＡを取得することにあ
る。さらには、遺伝子工学的な手法を用いて該遺伝子の
増幅および発現を強化することによりＴＣＤＨ反応を改
善し、延いてはテトラサイクリン系抗生物質を効率的に
生産する微生物を作製する育種材料を提供することにあ
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、６−デメ
チルクロロテトラサイクリン（6-demethylchlortetracy
cline 、以下ＤＭＣＴと略す）非生産性のクロロテトラ
ミドブルー（chlortetramid blue、以下ＣＴＢと略す）
生産変異株および６−デメチルテトラサイクリン（6-de
methyltetracycline、以下ＤＭＴと略す）非生産性のテ
トラミドブルー（tetramid blue 、以下ＴＢと略す）生
産変異株の中にＴＣＤＨ欠損変異株が含まれることを見
いだした。この知見に基づき、ＴＣＤＨを欠損したＴＢ
生産変異株を宿主に用いて、ＤＭＴ生産性の回復を指標
にしたＴＣＤＨ遺伝子のショットガンクローニングを行
い、テトラサイクリン系抗生物質の生産能を有するスト
レプトミセス・オウレオファシエンスの菌株からＴＣＤ
Ｈ遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離することに成功した。
さらに、このＴＣＤＨ遺伝子を含む組換えプラスミドを
用いた染色体上でのＴＣＤＨ遺伝子の増幅が、ＤＭＴ生
産菌の生産性を向上させることを見い出した。
チルクロロテトラサイクリン（6-demethylchlortetracy
cline 、以下ＤＭＣＴと略す）非生産性のクロロテトラ
ミドブルー（chlortetramid blue、以下ＣＴＢと略す）
生産変異株および６−デメチルテトラサイクリン（6-de
methyltetracycline、以下ＤＭＴと略す）非生産性のテ
トラミドブルー（tetramid blue 、以下ＴＢと略す）生
産変異株の中にＴＣＤＨ欠損変異株が含まれることを見
いだした。この知見に基づき、ＴＣＤＨを欠損したＴＢ
生産変異株を宿主に用いて、ＤＭＴ生産性の回復を指標
にしたＴＣＤＨ遺伝子のショットガンクローニングを行
い、テトラサイクリン系抗生物質の生産能を有するスト
レプトミセス・オウレオファシエンスの菌株からＴＣＤ
Ｈ遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離することに成功した。
さらに、このＴＣＤＨ遺伝子を含む組換えプラスミドを
用いた染色体上でのＴＣＤＨ遺伝子の増幅が、ＤＭＴ生
産菌の生産性を向上させることを見い出した。
【０００９】本発明は、ＴＣＤＨの欠損形質を相補する
遺伝子を含むＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を組み込んだ組
換えベクター、該組換えベクターで形質転換された組換
え微生物および該組換えベクターが染色体上に組み込ま
れた組換え微生物、およびそれらを用いたテトラサイク
リン系抗生物質の生産方法に関する。
遺伝子を含むＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を組み込んだ組
換えベクター、該組換えベクターで形質転換された組換
え微生物および該組換えベクターが染色体上に組み込ま
れた組換え微生物、およびそれらを用いたテトラサイク
リン系抗生物質の生産方法に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明におけるテトラサイクリン
系抗生物質とは、テトラサイクリン類抗生物質を総称し
ており、クロロテトラサイクリン、テトラサイクリン、
６−デメチルクロロテトラサイクリン、６−デメチルテ
トラサイクリンおよびオキシテトラサイクリンなどが含
まれる。
系抗生物質とは、テトラサイクリン類抗生物質を総称し
ており、クロロテトラサイクリン、テトラサイクリン、
６−デメチルクロロテトラサイクリン、６−デメチルテ
トラサイクリンおよびオキシテトラサイクリンなどが含
まれる。
【００１１】テトラサイクリンデヒドロゲナーゼ（ＴＣ
ＤＨ）とは、テトラサイクリン生合成経路におけるテト
ラサイクリンの前駆体５ａ，１１ａ−デヒドロテトラサ
イクリンの５ａ位および１１ａ位を還元してテトラサイ
クリンに変換する反応を触媒する酵素であり、詳細につ
いてはメソッヅ・イン・エンザイモロジー［（Methods
in Enzymology ）, 43, 606-607 (1975) ］およびFEMS
シンポジウム［(FEMS Symposium) No55, 137-143(199
1)］に記述されている。
ＤＨ）とは、テトラサイクリン生合成経路におけるテト
ラサイクリンの前駆体５ａ，１１ａ−デヒドロテトラサ
イクリンの５ａ位および１１ａ位を還元してテトラサイ
クリンに変換する反応を触媒する酵素であり、詳細につ
いてはメソッヅ・イン・エンザイモロジー［（Methods
in Enzymology ）, 43, 606-607 (1975) ］およびFEMS
シンポジウム［(FEMS Symposium) No55, 137-143(199
1)］に記述されている。
【００１２】本発明におけるＴＣＤＨ遺伝子とは、前述
のＴＣＤＨの欠損形質を相補する遺伝子を示している。
本発明のＴＣＤＨ遺伝子としては、ＴＣＤＨ欠損形質を
相補するＤＮＡ断片であればいずれでもよいが、例えば
配列番号１の１９０位から１３５６位の塩基配列で表さ
れるＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし、かつテトラサイクリンデヒドロ
ゲナーゼ欠損形質を相補する遺伝子を含むＤＮＡなどが
あげられる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするＤＮＡとは、例えば、配列番号１記載の塩基配列
を含むＤＮＡをプローブとして、コロニーハイブリダイ
ゼーション法またはプラークハイブリダイゼーション法
［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マ
ニュアル 第２版（Molecular Cloning : A laboratory
manual ,second edition) コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor La
boratory Press) 1989年］などを用いることにより得ら
れるＤＮＡを意味する。
のＴＣＤＨの欠損形質を相補する遺伝子を示している。
本発明のＴＣＤＨ遺伝子としては、ＴＣＤＨ欠損形質を
相補するＤＮＡ断片であればいずれでもよいが、例えば
配列番号１の１９０位から１３５６位の塩基配列で表さ
れるＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし、かつテトラサイクリンデヒドロ
ゲナーゼ欠損形質を相補する遺伝子を含むＤＮＡなどが
あげられる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするＤＮＡとは、例えば、配列番号１記載の塩基配列
を含むＤＮＡをプローブとして、コロニーハイブリダイ
ゼーション法またはプラークハイブリダイゼーション法
［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マ
ニュアル 第２版（Molecular Cloning : A laboratory
manual ,second edition) コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor La
boratory Press) 1989年］などを用いることにより得ら
れるＤＮＡを意味する。
【００１３】ＴＣＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、ＴＣ
ＤＨ酵素活性を有する微生物より取得することができ
る。好ましくは、ストレプトミセス属に属し、かつＴＣ
ＤＨ酵素活性を有する微生物より取得することができ
る。より好ましくは、テトラサイクリン系抗生物質生産
性を有する微生物、たとえばストレプトミセス・オウレ
オファシエンス（Streptomyces aureofaciens ） NRRL
3203 、ストレプトミセス・オウレオファシエンス（St
reptomyces aureofaciens ） ATCC 10762、ストレプト
ミセス・オウレオファシエンス（Streptomyces aureofa
ciens ） ATCC 12416、ストレプトミセス・オウレオフ
ァシエンス（Streptomyces aureofaciens ）ATCC 1389
9、ストレプトミセス・アベラネウス（Streptomyces av
ellaneus ）ATCC 23730 、ストレプトミセス・サーモチ
カス（Streptomyces psammoticus）ATCC 14125 、スト
レプトミセス・リモーサス（Streptomyces rimosus）
ATCC10970、ストレプトミセス・ビリディファシエンス
（Streptomyces viridifaciens） NRRL 2964などが挙げ
られる。
ＤＨ酵素活性を有する微生物より取得することができ
る。好ましくは、ストレプトミセス属に属し、かつＴＣ
ＤＨ酵素活性を有する微生物より取得することができ
る。より好ましくは、テトラサイクリン系抗生物質生産
性を有する微生物、たとえばストレプトミセス・オウレ
オファシエンス（Streptomyces aureofaciens ） NRRL
3203 、ストレプトミセス・オウレオファシエンス（St
reptomyces aureofaciens ） ATCC 10762、ストレプト
ミセス・オウレオファシエンス（Streptomyces aureofa
ciens ） ATCC 12416、ストレプトミセス・オウレオフ
ァシエンス（Streptomyces aureofaciens ）ATCC 1389
9、ストレプトミセス・アベラネウス（Streptomyces av
ellaneus ）ATCC 23730 、ストレプトミセス・サーモチ
カス（Streptomyces psammoticus）ATCC 14125 、スト
レプトミセス・リモーサス（Streptomyces rimosus）
ATCC10970、ストレプトミセス・ビリディファシエンス
（Streptomyces viridifaciens） NRRL 2964などが挙げ
られる。
【００１４】本発明の組換えベクターとしては、放線菌
内で自律複製できるもののみならず、自律複製できなく
ても宿主放線菌の染色体に組み込みが可能なＤＮＡも含
まれる。なお、本発明における形質転換体とは、宿主細
胞内で自律複製可能な組換えベクターで形質転換された
組換え体を意味し、組み込み体とは、組換えベクターが
宿主染色体ＤＮＡに組み込まれた組換え体を意味する。
内で自律複製できるもののみならず、自律複製できなく
ても宿主放線菌の染色体に組み込みが可能なＤＮＡも含
まれる。なお、本発明における形質転換体とは、宿主細
胞内で自律複製可能な組換えベクターで形質転換された
組換え体を意味し、組み込み体とは、組換えベクターが
宿主染色体ＤＮＡに組み込まれた組換え体を意味する。
【００１５】ＴＣＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入す
るためのクローニングベクターとしては、ストレプトミ
セス属に属する宿主微生物内で自律複製できるレプリコ
ンを備えたプラスミドＤＮＡまたは相同組換えや部位特
異的組換えによってストレプトミセス属に属する宿主微
生物の染色体に組み込むための機能を備えたクローニン
グベクターであればいずれでもよい。放線菌で自律複製
するプラスミドとしてはｐＩＪ７０２［ジャーナル・オ
ブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー(Journal of Ge
neral Microbiology) 129, 2703(1983)］やｐＩＪ６１
［ジーン（Gene）20, 51-62(1982) ］などがあげられ、
放線菌染色体への組み込み用クローニングベクターとし
てはプラスミドｐＳＥ１１９などがあげられる。好まし
くは、以下に記す放線菌−大腸菌シャトル型プラスミド
ｐＳＥ１０１や放線菌染色体への組み込み用プラスミド
ｐＳＥ１１９などがあげられる。
るためのクローニングベクターとしては、ストレプトミ
セス属に属する宿主微生物内で自律複製できるレプリコ
ンを備えたプラスミドＤＮＡまたは相同組換えや部位特
異的組換えによってストレプトミセス属に属する宿主微
生物の染色体に組み込むための機能を備えたクローニン
グベクターであればいずれでもよい。放線菌で自律複製
するプラスミドとしてはｐＩＪ７０２［ジャーナル・オ
ブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー(Journal of Ge
neral Microbiology) 129, 2703(1983)］やｐＩＪ６１
［ジーン（Gene）20, 51-62(1982) ］などがあげられ、
放線菌染色体への組み込み用クローニングベクターとし
てはプラスミドｐＳＥ１１９などがあげられる。好まし
くは、以下に記す放線菌−大腸菌シャトル型プラスミド
ｐＳＥ１０１や放線菌染色体への組み込み用プラスミド
ｐＳＥ１１９などがあげられる。
【００１６】プラスミドｐＳＥ１０１は、第１図に示し
た構造を有しており、大腸菌での組換えＤＮＡ実験など
に用いられるプラスミドｐＵＣ１９［ジーン（Gene）3
3, 103-119(1985) ］の制限酵素ＡａｔＩＩ切断部位に
ＢｇｌＩＩリンカーを挿入して作製したプラスミドｐＵ
Ｃ１９- Ｂｇｌの複製領域を含むＫｐｎＩ- ＢｇｌＩＩ
ＤＮＡ断片とプラスミドｐＩＪ７０２のレプリコンを含
むＫｐｎＩ- ＢｇｌＩＩＤＮＡ断片とを連結して作製さ
れる。プラスミドｐＳＥ１０１の形質転換体は宿主が大
腸菌のときにはアンピシリン抵抗性のコロニーとして、
宿主が放線菌のときはチオペプチン抵抗性のコロニーと
して分離できる。
た構造を有しており、大腸菌での組換えＤＮＡ実験など
に用いられるプラスミドｐＵＣ１９［ジーン（Gene）3
3, 103-119(1985) ］の制限酵素ＡａｔＩＩ切断部位に
ＢｇｌＩＩリンカーを挿入して作製したプラスミドｐＵ
Ｃ１９- Ｂｇｌの複製領域を含むＫｐｎＩ- ＢｇｌＩＩ
ＤＮＡ断片とプラスミドｐＩＪ７０２のレプリコンを含
むＫｐｎＩ- ＢｇｌＩＩＤＮＡ断片とを連結して作製さ
れる。プラスミドｐＳＥ１０１の形質転換体は宿主が大
腸菌のときにはアンピシリン抵抗性のコロニーとして、
宿主が放線菌のときはチオペプチン抵抗性のコロニーと
して分離できる。
【００１７】プラスミドｐＳＥ１１９は、第２図に示し
た構造を有しており、上記に述べたプラスミドｐＵＣ１
９- Ｂｇｌの制限酵素ＢｇｌＩＩ切断部位にプラスミド
ｐＩＪ７０２から切り出したチオストレプトン耐性遺伝
子を含む１．１ｋｂのＢｃｌＩＤＮＡ断片を挿入して作
製した、放線菌のレプリコンを持たないハイブリッドプ
ラスミドである。該ハイブリッドプラスミドは、放線菌
宿主染色体ＤＮＡと相同な配列を有するＤＮＡ断片を適
当な制限酵素切断部位に挿入することによって、そのＤ
ＮＡ断片に対応する宿主染色体ＤＮＡとの間で起こる相
同組換えによって宿主放線菌染色体に組み込むことが可
能なプラスミドである。このような組換えプラスミドが
放線菌染色体に組み込まれた組み込み体は、チオストレ
プトン耐性遺伝子の発現に基づきチオペプチン抵抗性の
コロニーとして分離することができる。
た構造を有しており、上記に述べたプラスミドｐＵＣ１
９- Ｂｇｌの制限酵素ＢｇｌＩＩ切断部位にプラスミド
ｐＩＪ７０２から切り出したチオストレプトン耐性遺伝
子を含む１．１ｋｂのＢｃｌＩＤＮＡ断片を挿入して作
製した、放線菌のレプリコンを持たないハイブリッドプ
ラスミドである。該ハイブリッドプラスミドは、放線菌
宿主染色体ＤＮＡと相同な配列を有するＤＮＡ断片を適
当な制限酵素切断部位に挿入することによって、そのＤ
ＮＡ断片に対応する宿主染色体ＤＮＡとの間で起こる相
同組換えによって宿主放線菌染色体に組み込むことが可
能なプラスミドである。このような組換えプラスミドが
放線菌染色体に組み込まれた組み込み体は、チオストレ
プトン耐性遺伝子の発現に基づきチオペプチン抵抗性の
コロニーとして分離することができる。
【００１８】以下にＴＣＤＨ遺伝子の取得方法について
示す。まず、ＴＣＤＨ欠損変異株を以下のように分離す
る。テトラサイクリン構造類縁体の物性とそれらの推定
生合成経路に基づくと、ＣＴＢおよびＴＢの合成経路は
次の２通りが想定される［バイオテクノロジー(Biotech
nology) Vol.4, 393-429, Weinheim, VCH Publish(198
6) ］。一つはＤＭＣＴ生合成経路におけるＤＭＣＴ前
駆体である６−デメチルデヒドロクロロテトラサイクリ
ン（ＴＢの場合は、ＤＭＴ生合成前駆体６−デメチルデ
ヒドロテトラサイクリン）がＴＣＤＨ反応を受けずに分
岐して生じる経路、もう一つは、ＤＭＣＴ生合成経路に
おけるＤＭＣＴの６段階前の合成中間体６−デメチル−
６−デオキシテトラミドグリーン（別名：４−オキソプ
レテトラミド、以下４−オキソプレテトラミドと称す）
が、本来受けるべき４ａ，１２ａ水和酵素反応を受けず
に以降の合成反応を受けて生じる経路である。従って、
ＤＭＣＴ非生産性のＣＴＢ生産変異株およびＤＭＴ非生
産性のＴＢ生産変異株は、ＴＣＤＨ反応を進行できない
変異株あるいは４ａ，１２ａ水和酵素の欠損変異株のい
ずれかである。
示す。まず、ＴＣＤＨ欠損変異株を以下のように分離す
る。テトラサイクリン構造類縁体の物性とそれらの推定
生合成経路に基づくと、ＣＴＢおよびＴＢの合成経路は
次の２通りが想定される［バイオテクノロジー(Biotech
nology) Vol.4, 393-429, Weinheim, VCH Publish(198
6) ］。一つはＤＭＣＴ生合成経路におけるＤＭＣＴ前
駆体である６−デメチルデヒドロクロロテトラサイクリ
ン（ＴＢの場合は、ＤＭＴ生合成前駆体６−デメチルデ
ヒドロテトラサイクリン）がＴＣＤＨ反応を受けずに分
岐して生じる経路、もう一つは、ＤＭＣＴ生合成経路に
おけるＤＭＣＴの６段階前の合成中間体６−デメチル−
６−デオキシテトラミドグリーン（別名：４−オキソプ
レテトラミド、以下４−オキソプレテトラミドと称す）
が、本来受けるべき４ａ，１２ａ水和酵素反応を受けず
に以降の合成反応を受けて生じる経路である。従って、
ＤＭＣＴ非生産性のＣＴＢ生産変異株およびＤＭＴ非生
産性のＴＢ生産変異株は、ＴＣＤＨ反応を進行できない
変異株あるいは４ａ，１２ａ水和酵素の欠損変異株のい
ずれかである。
【００１９】ＤＭＣＴ非生産性のＣＴＢ生産変異株また
はＤＭＴ非生産性のＴＢ生産変異株を分離するために
は、ＤＭＣＴ生産性微生物またはＤＭＴ生産性微生物を
Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（ＮＴＧ）などの変異剤処理、ＵＶ照射、γ線照射によ
る変異処理を施した後、適当な寒天平板培地に塗布し、
生じたコロニーを抗生物質生産培地で培養して、培養物
の主要成分を３次元高速液体クロマトグラフィー装置を
用いて解析し、ＣＴＢまたはＴＢを生産してＤＭＣＴま
たはＤＭＴを生産しない変異株をスクリーニングする。
このようにして得られた変異株としては、ＮＰ１３株ま
たはＮＰ７１１株などがあげられる。
はＤＭＴ非生産性のＴＢ生産変異株を分離するために
は、ＤＭＣＴ生産性微生物またはＤＭＴ生産性微生物を
Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（ＮＴＧ）などの変異剤処理、ＵＶ照射、γ線照射によ
る変異処理を施した後、適当な寒天平板培地に塗布し、
生じたコロニーを抗生物質生産培地で培養して、培養物
の主要成分を３次元高速液体クロマトグラフィー装置を
用いて解析し、ＣＴＢまたはＴＢを生産してＤＭＣＴま
たはＤＭＴを生産しない変異株をスクリーニングする。
このようにして得られた変異株としては、ＮＰ１３株ま
たはＮＰ７１１株などがあげられる。
【００２０】ＮＰ１３株およびＮＰ７１１株の４ａ，１
２ａ水和酵素が正常に機能していることは、ＤＭＣＴ生
合成経路におけるＤＭＣＴの２段階前の合成中間体であ
る６−デメチルアンヒドロクロロテトラサイクリン（6-
demethylanhydrochlortetracycline、以下クロロ化ＤＭ
ＡＴＣと略す）およびＤＭＴの２段階前の合成中間体で
ある６−デメチルアンヒドロテトラサイクリン（6-deme
thylanhydrotetracycline 、以下ＤＭＡＴＣと略す）を
合成するために４ａ，１２ａ水和酵素反応が必須である
との知見を利用して、以下のように確認できる。すなわ
ち、ＮＰ１３株またはＮＰ７１１株からＤＭＣＴ生合成
経路における最後から２番目の反応を行う酵素アンヒド
ロテトラサイクリンオキシゲナーゼ（以下ＡＯＸと略
す）の欠損変異株を誘導し、得られたＮＰ１３株または
ＮＰ７１１株のＡＯＸ欠損変異株がクロロ化ＤＭＡＴＣ
またはＤＭＡＴＣを蓄積することを確かめればよい。な
お、組換えＤＮＡ技法を用いたＡＯＸ欠損変異株の作製
方法は、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アン
ド・バイオケミストリー［Bioscience, Biotechnology,
and Biochemistry 59, 1099-1106(1995) ］に記載され
ている。
２ａ水和酵素が正常に機能していることは、ＤＭＣＴ生
合成経路におけるＤＭＣＴの２段階前の合成中間体であ
る６−デメチルアンヒドロクロロテトラサイクリン（6-
demethylanhydrochlortetracycline、以下クロロ化ＤＭ
ＡＴＣと略す）およびＤＭＴの２段階前の合成中間体で
ある６−デメチルアンヒドロテトラサイクリン（6-deme
thylanhydrotetracycline 、以下ＤＭＡＴＣと略す）を
合成するために４ａ，１２ａ水和酵素反応が必須である
との知見を利用して、以下のように確認できる。すなわ
ち、ＮＰ１３株またはＮＰ７１１株からＤＭＣＴ生合成
経路における最後から２番目の反応を行う酵素アンヒド
ロテトラサイクリンオキシゲナーゼ（以下ＡＯＸと略
す）の欠損変異株を誘導し、得られたＮＰ１３株または
ＮＰ７１１株のＡＯＸ欠損変異株がクロロ化ＤＭＡＴＣ
またはＤＭＡＴＣを蓄積することを確かめればよい。な
お、組換えＤＮＡ技法を用いたＡＯＸ欠損変異株の作製
方法は、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アン
ド・バイオケミストリー［Bioscience, Biotechnology,
and Biochemistry 59, 1099-1106(1995) ］に記載され
ている。
【００２１】次に、ＴＣＤＨ遺伝子のクローニング方法
を以下に述べる。ＴＣＤＨ酵素活性を有する微生物、好
ましくはストレプトミセス属の微生物から、通常のＤＮ
Ａ単離方法、例えばジェネティック・マニピュレーショ
ン・オブ・ストレプトミセス：ア・ラボラトリー・マニ
ュアル(Genetic Manipulation ofStreptmyces:A Labora
tory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, 1
985) に記載の方法に従って染色体ＤＮＡを調製する。
得られたＴＣＤＨ遺伝子を含む染色体ＤＮＡとクローニ
ングベクターとを、同じ付着末端を生じる適当な制限酵
素でそれぞれ切断し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて再連
結する。該Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応混合物で適当な宿主
を形質転換し、ゲノムライブラリーを作製する。クロー
ニングベクターとしては、ｐＳＥ１１９などのハイブリ
ッドプラスミドがあげられ、宿主としては、ＪＭ１１０
（ＡＴＣＣ ４７０１３）などの大腸菌があげられる。
同じ付着末端を生じる制限酵素としては、Ｓａｕ３ＡＩ
とＢａｍＨＩ（突出末端がともに5'-CTAG-3'）などがあ
げられる。
を以下に述べる。ＴＣＤＨ酵素活性を有する微生物、好
ましくはストレプトミセス属の微生物から、通常のＤＮ
Ａ単離方法、例えばジェネティック・マニピュレーショ
ン・オブ・ストレプトミセス：ア・ラボラトリー・マニ
ュアル(Genetic Manipulation ofStreptmyces:A Labora
tory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, 1
985) に記載の方法に従って染色体ＤＮＡを調製する。
得られたＴＣＤＨ遺伝子を含む染色体ＤＮＡとクローニ
ングベクターとを、同じ付着末端を生じる適当な制限酵
素でそれぞれ切断し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて再連
結する。該Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応混合物で適当な宿主
を形質転換し、ゲノムライブラリーを作製する。クロー
ニングベクターとしては、ｐＳＥ１１９などのハイブリ
ッドプラスミドがあげられ、宿主としては、ＪＭ１１０
（ＡＴＣＣ ４７０１３）などの大腸菌があげられる。
同じ付着末端を生じる制限酵素としては、Ｓａｕ３ＡＩ
とＢａｍＨＩ（突出末端がともに5'-CTAG-3'）などがあ
げられる。
【００２２】作製したゲノムライブラリーから抽出した
組換えプラスミドと、前述したＮＰ１３株あるいはＮＰ
７１１株などのＴＣＤＨ欠損変異株のプロトプラストと
をポリエチレングリコール存在下で混合し、クローニン
グベクターに組み込まれているマーカー遺伝子に対応す
る薬剤含有再生培地に塗布して培養し、再生した組み込
み体コロニーの中からテトラサイクリン系抗生物質の生
産能が回復したコロニーを単離する。
組換えプラスミドと、前述したＮＰ１３株あるいはＮＰ
７１１株などのＴＣＤＨ欠損変異株のプロトプラストと
をポリエチレングリコール存在下で混合し、クローニン
グベクターに組み込まれているマーカー遺伝子に対応す
る薬剤含有再生培地に塗布して培養し、再生した組み込
み体コロニーの中からテトラサイクリン系抗生物質の生
産能が回復したコロニーを単離する。
【００２３】テトラサイクリン系抗生物質の生産能が回
復した組み込み体のスクリーニングは、再生した組み込
み体のコロニーをテトラサイクリン系抗生物質生産用の
寒天平板培地にレプリカして培養し、テトラサイクリン
感受性の大腸菌などを被検菌としたバイオアッセイを行
い、被検菌にハローを与え、かつテトラサイクリン系抗
生物質を生産しているコロニーを選択することで行う。
テトラサイクリン系抗生物質の定量分析は、ジャーナル
・オブ・クロマトグラフィー［（Journal of Chromatog
raphy ） 140, 293-299 （1979）］などに記載の方法
に従い、対応するテトラサイクリン系抗生物質を標品と
した高速液体クロマトグラフィー法で行うことができ
る。ＤＭＴ標品はＵＳＰ２８７８２８９( １９５９) 記
載の方法に従って調製することができる。
復した組み込み体のスクリーニングは、再生した組み込
み体のコロニーをテトラサイクリン系抗生物質生産用の
寒天平板培地にレプリカして培養し、テトラサイクリン
感受性の大腸菌などを被検菌としたバイオアッセイを行
い、被検菌にハローを与え、かつテトラサイクリン系抗
生物質を生産しているコロニーを選択することで行う。
テトラサイクリン系抗生物質の定量分析は、ジャーナル
・オブ・クロマトグラフィー［（Journal of Chromatog
raphy ） 140, 293-299 （1979）］などに記載の方法
に従い、対応するテトラサイクリン系抗生物質を標品と
した高速液体クロマトグラフィー法で行うことができ
る。ＤＭＴ標品はＵＳＰ２８７８２８９( １９５９) 記
載の方法に従って調製することができる。
【００２４】得られた組み込み体から染色体ＤＮＡを抽
出し、組み込まれたハイブリッドプラスミドＤＮＡ部分
を１ヶ所切断し且つ放線菌染色体ＤＮＡを切断しにくい
制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ）で切断した後、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて自己環化させたＤＮＡで大腸菌を形
質転換し、その大腸菌形質転換体からプラスミドとして
回収することによってＴＣＤＨ遺伝子を含む染色体ＤＮ
Ａ断片が得られる。ＴＣＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片含
有組換えプラスミドとしては、プラスミドｐＫＮ３１が
あげられる。
出し、組み込まれたハイブリッドプラスミドＤＮＡ部分
を１ヶ所切断し且つ放線菌染色体ＤＮＡを切断しにくい
制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ）で切断した後、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて自己環化させたＤＮＡで大腸菌を形
質転換し、その大腸菌形質転換体からプラスミドとして
回収することによってＴＣＤＨ遺伝子を含む染色体ＤＮ
Ａ断片が得られる。ＴＣＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片含
有組換えプラスミドとしては、プラスミドｐＫＮ３１が
あげられる。
【００２５】上記の方法で得られたＴＣＤＨ遺伝子を含
むＤＮＡ内のＴＣＤＨ遺伝子の存在領域の特定方法を記
す。ＴＣＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を適当な制限酵素
で切断した後、アガロースゲル電気泳動を行うことによ
り該ＤＮＡ断片の制限酵素地図を作成する。制限酵素地
図に基づき、該ＤＮＡ断片の一部を放線菌内で自律複製
可能なクローニングベクターにサブクローニングし、そ
れらの組換えプラスミドでＴＣＤＨ欠損株を形質転換し
てＴＣＤＨ欠損形質が相補される領域を絞り込むことで
ＴＣＤＨ遺伝子の存在領域が特定できる。具体的には、
プラスミドｐＫＮ３１の挿入ＤＮＡ断片の一部がプラス
ミドｐＳＥ１０１に連結された組換えプラスミドを大腸
菌内で調製し、これらの組換えプラスミドでＮＰ１３株
またはＮＰ７１１株を形質転換し、ＤＮＡ断片の挿入方
向と無関係にＮＰ１３株またはＮＰ７１１株にＤＭＣＴ
またはＤＭＴ生産能を付与するＤＮＡの領域がＴＣＤＨ
遺伝子の存在領域となる。ＴＣＤＨ遺伝子含有組換えプ
ラスミドとしてはｐＫＮ２０１およびｐＫＮ２０２があ
げられる。プラスミドｐＫＮ２０１を含む大腸菌である
Escherichia coli JM110/pKN201 株は、平成８年８月１
日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つ
くば市東１丁目１番３号）に、FERM BP-5614として寄託
されている。
むＤＮＡ内のＴＣＤＨ遺伝子の存在領域の特定方法を記
す。ＴＣＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を適当な制限酵素
で切断した後、アガロースゲル電気泳動を行うことによ
り該ＤＮＡ断片の制限酵素地図を作成する。制限酵素地
図に基づき、該ＤＮＡ断片の一部を放線菌内で自律複製
可能なクローニングベクターにサブクローニングし、そ
れらの組換えプラスミドでＴＣＤＨ欠損株を形質転換し
てＴＣＤＨ欠損形質が相補される領域を絞り込むことで
ＴＣＤＨ遺伝子の存在領域が特定できる。具体的には、
プラスミドｐＫＮ３１の挿入ＤＮＡ断片の一部がプラス
ミドｐＳＥ１０１に連結された組換えプラスミドを大腸
菌内で調製し、これらの組換えプラスミドでＮＰ１３株
またはＮＰ７１１株を形質転換し、ＤＮＡ断片の挿入方
向と無関係にＮＰ１３株またはＮＰ７１１株にＤＭＣＴ
またはＤＭＴ生産能を付与するＤＮＡの領域がＴＣＤＨ
遺伝子の存在領域となる。ＴＣＤＨ遺伝子含有組換えプ
ラスミドとしてはｐＫＮ２０１およびｐＫＮ２０２があ
げられる。プラスミドｐＫＮ２０１を含む大腸菌である
Escherichia coli JM110/pKN201 株は、平成８年８月１
日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つ
くば市東１丁目１番３号）に、FERM BP-5614として寄託
されている。
【００２６】ＴＣＤＨ遺伝子を含む染色体ＤＮＡとＴＣ
ＤＨ欠損変異株の染色体ＤＮＡとの間に高いホモロジー
が無い場合には、相同組み込み法でクローニングする代
わりに、ＴＣＤＨ欠損変異株で自律複製可能なレプリコ
ンとマーカーを備えたクローニングベクターを用いてゲ
ノムライブラリーを作製し、ＴＣＤＨ欠損変異株に形質
転換してＴＣＤＨ欠損形質が相補された形質転換体を分
離し、その形質転換体から組換えプラスミドを抽出する
ことでＴＣＤＨ遺伝子を含むＤＮＡをクローニングする
こともできる。
ＤＨ欠損変異株の染色体ＤＮＡとの間に高いホモロジー
が無い場合には、相同組み込み法でクローニングする代
わりに、ＴＣＤＨ欠損変異株で自律複製可能なレプリコ
ンとマーカーを備えたクローニングベクターを用いてゲ
ノムライブラリーを作製し、ＴＣＤＨ欠損変異株に形質
転換してＴＣＤＨ欠損形質が相補された形質転換体を分
離し、その形質転換体から組換えプラスミドを抽出する
ことでＴＣＤＨ遺伝子を含むＤＮＡをクローニングする
こともできる。
【００２７】さらに、本発明によって開示された塩基配
列に基づいて、市販の核酸合成機などを用いてオリゴ合
成ヌクレオチドを作製し、ポリマー・チェイン・リアク
ション（Polymer Chain Reaction: 以下、ＰＣＲ）法や
コロニーハイブリダイゼーション法などにより調製した
ゲノムライブラリーからＴＣＤＨ遺伝子を含むＤＮＡを
クローニングすることもできる。
列に基づいて、市販の核酸合成機などを用いてオリゴ合
成ヌクレオチドを作製し、ポリマー・チェイン・リアク
ション（Polymer Chain Reaction: 以下、ＰＣＲ）法や
コロニーハイブリダイゼーション法などにより調製した
ゲノムライブラリーからＴＣＤＨ遺伝子を含むＤＮＡを
クローニングすることもできる。
【００２８】以上の方法により得られたＴＣＤＨ遺伝子
を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、pUC19 、pBlues
cript KS(+) 等のプラスミドにクローニングし、通常用
いられる塩基配列分析方法、例えばサンガーらのジデオ
キシ法［プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad.Sci.,US
A),74, 5463(1977)］あるいはダイプライマーシークエ
ンシングキット（アプライドバイオシステムズ社製）な
どを用いて行うことができる。塩基配列分析装置として
は、３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイ
オシステムズ社製）などを用いる。
を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、pUC19 、pBlues
cript KS(+) 等のプラスミドにクローニングし、通常用
いられる塩基配列分析方法、例えばサンガーらのジデオ
キシ法［プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad.Sci.,US
A),74, 5463(1977)］あるいはダイプライマーシークエ
ンシングキット（アプライドバイオシステムズ社製）な
どを用いて行うことができる。塩基配列分析装置として
は、３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイ
オシステムズ社製）などを用いる。
【００２９】本発明の組換え微生物の培養は、通常の培
養方法に従って行うことができる。培養に用いられる培
地は、用いる微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機
塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地
であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。炭素源
としては、用いる微生物が資化し得るものであればよ
く、グルコース、フラクトース、シュークロース、マル
トース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの糖類や、酢
酸、乳酸、グルコン酸などの有機酸、あるいはエタノー
ル、プロパノールなどのアルコール類、あるいは大豆
油、オリーブ油などの油脂を用いることができる。
養方法に従って行うことができる。培養に用いられる培
地は、用いる微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機
塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地
であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。炭素源
としては、用いる微生物が資化し得るものであればよ
く、グルコース、フラクトース、シュークロース、マル
トース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの糖類や、酢
酸、乳酸、グルコン酸などの有機酸、あるいはエタノー
ル、プロパノールなどのアルコール類、あるいは大豆
油、オリーブ油などの油脂を用いることができる。
【００３０】窒素源としては、用いる微生物が資化しう
るかぎり、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の
各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化
合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コー
ン・スティープ・リカー、カゼイン加水分解物、大豆粕
および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化
物等を用いることができる。
るかぎり、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、等の
各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化
合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コー
ン・スティープ・リカー、カゼイン加水分解物、大豆粕
および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化
物等を用いることができる。
【００３１】無機塩としては、用いる微生物が利用しう
るかぎり、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
第一鉄、硫酸マンガンなどを用いることができる。他に
微量元素としてカルシウム、亜鉛、銅、コバルト、モリ
ブデンなどの塩類を加えてもよい。また必要に応じてチ
アミン、ビオチンのようなビタミン、グルタミン酸、ア
スパラギン酸、リジンのようなアミノ酸、アデニン、グ
アニンのような核酸関連物質などを添加してもよい。
るかぎり、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸
第一鉄、硫酸マンガンなどを用いることができる。他に
微量元素としてカルシウム、亜鉛、銅、コバルト、モリ
ブデンなどの塩類を加えてもよい。また必要に応じてチ
アミン、ビオチンのようなビタミン、グルタミン酸、ア
スパラギン酸、リジンのようなアミノ酸、アデニン、グ
アニンのような核酸関連物質などを添加してもよい。
【００３２】さらに培地には必要に応じて、テトラサイ
クリン系抗生物質の前駆体を添加することもできる。培
養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条
件下で行う。培養温度は１５〜３７℃の範囲内（好まし
くは２６〜３０℃）で行い、培養ｐＨは５．０〜９．０
に保持する。培養時間は通常１〜１０日間である。ｐＨ
の調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿
素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
クリン系抗生物質の前駆体を添加することもできる。培
養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条
件下で行う。培養温度は１５〜３７℃の範囲内（好まし
くは２６〜３０℃）で行い、培養ｐＨは５．０〜９．０
に保持する。培養時間は通常１〜１０日間である。ｐＨ
の調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿
素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
【００３３】培養終了後、培養液にｎ−プロパノールな
どの溶媒と塩酸などの酸を加えてテトラサイクリン系抗
生物質を溶解させ、遠心分離などで沈殿物を除去した
後、各種カラムクロマトグラフィーなどを行いテトラサ
イクリン系抗生物質を単離・精製する。 以下に実施例
をあげて本発明を具体的に説明する。
どの溶媒と塩酸などの酸を加えてテトラサイクリン系抗
生物質を溶解させ、遠心分離などで沈殿物を除去した
後、各種カラムクロマトグラフィーなどを行いテトラサ
イクリン系抗生物質を単離・精製する。 以下に実施例
をあげて本発明を具体的に説明する。
【００３４】
実施例１．ＴＣＤＨ欠損変異株の分離 ３０ｍｌのSK No.2 培地（可溶性でんぷん２０ｇ、グル
コース５ｇ、ペプトン５ｇ、酵母エキス５ｇ、肉エキス
３ｇ、燐酸一カリウム０．２ｇ、硫酸マグネシウム０．
６ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整した培地）で増
殖させたストレプトミセス・オウレオファシエンスに属
するＤＭＣＴ生産性変異株ＮＲＲＬ ３２０３［バイオ
サイエンス・アンド・バイオテクノロジー・アンド・バ
イオケミストリー（Bioscience and Biotechnology and
Biochemistry ）, 59,1099-1106(1995)］の種培養液を
ＩＳＰ−２寒天平板培地（グルコース４ｇ、麦芽エキス
１０ｇ、酵母エキス４ｇ、寒天２２ｇを水１Ｌに含み、
ｐＨ７．０に調整した培地）に塗布して３０℃にて２週
間培養し、着生した胞子を滅菌水に懸濁して集めた。胞
子濃度約１０9 個/ml の懸濁液２ｍｌをＴＭ緩衝液
［０．１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、
０．１Ｍマレイン酸、ｐＨ６. ０］３０ｍｌで洗浄後、
同緩衝液３０ｍｌに懸濁した。この懸濁液にＮ−メチル
−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを終濃度１ｍ
ｇ／ｍｌになるように添加して室温にて３０分静置した
後、遠心分離して胞子を集めた。集めた胞子は滅菌水で
十分に洗浄してから適宣懸濁し、抗生物質生産用のＡＢ
Ｍ４寒天平板培地（グルコース１ｇ、ペプトン６ｇ、酵
母エキス３ｇ、肉エキス１．５ｇ、ＫＣｌ０．５ｇを寒
天１５ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．０に調整した培地）
に塗布して３０℃にて７日間培養した。生育したコロニ
ーを寒天培地ごとくり抜いて一部をジメチルスルホキシ
ドに懸濁し、各々の抽出液を３次元高速液体クロマトグ
ラフィーで分析した。このようなスクリーニングによっ
て得られたＮＰ１３株はＤＭＣＴを生産せず、アセトニ
トリル４５％含有０．１M クエン酸水溶液（ｐＨ２．
０）中での吸収極大が２８１ｎｍ、３３２ｎｍ、５３０
ｎｍのスペクトルを示す物質を生産した。この物質は1
Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよびＭＳスペクトルの解析など
により、ＣＴＢと同定された。
コース５ｇ、ペプトン５ｇ、酵母エキス５ｇ、肉エキス
３ｇ、燐酸一カリウム０．２ｇ、硫酸マグネシウム０．
６ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整した培地）で増
殖させたストレプトミセス・オウレオファシエンスに属
するＤＭＣＴ生産性変異株ＮＲＲＬ ３２０３［バイオ
サイエンス・アンド・バイオテクノロジー・アンド・バ
イオケミストリー（Bioscience and Biotechnology and
Biochemistry ）, 59,1099-1106(1995)］の種培養液を
ＩＳＰ−２寒天平板培地（グルコース４ｇ、麦芽エキス
１０ｇ、酵母エキス４ｇ、寒天２２ｇを水１Ｌに含み、
ｐＨ７．０に調整した培地）に塗布して３０℃にて２週
間培養し、着生した胞子を滅菌水に懸濁して集めた。胞
子濃度約１０9 個/ml の懸濁液２ｍｌをＴＭ緩衝液
［０．１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、
０．１Ｍマレイン酸、ｐＨ６. ０］３０ｍｌで洗浄後、
同緩衝液３０ｍｌに懸濁した。この懸濁液にＮ−メチル
−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを終濃度１ｍ
ｇ／ｍｌになるように添加して室温にて３０分静置した
後、遠心分離して胞子を集めた。集めた胞子は滅菌水で
十分に洗浄してから適宣懸濁し、抗生物質生産用のＡＢ
Ｍ４寒天平板培地（グルコース１ｇ、ペプトン６ｇ、酵
母エキス３ｇ、肉エキス１．５ｇ、ＫＣｌ０．５ｇを寒
天１５ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．０に調整した培地）
に塗布して３０℃にて７日間培養した。生育したコロニ
ーを寒天培地ごとくり抜いて一部をジメチルスルホキシ
ドに懸濁し、各々の抽出液を３次元高速液体クロマトグ
ラフィーで分析した。このようなスクリーニングによっ
て得られたＮＰ１３株はＤＭＣＴを生産せず、アセトニ
トリル４５％含有０．１M クエン酸水溶液（ｐＨ２．
０）中での吸収極大が２８１ｎｍ、３３２ｎｍ、５３０
ｎｍのスペクトルを示す物質を生産した。この物質は1
Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよびＭＳスペクトルの解析など
により、ＣＴＢと同定された。
【００３５】ＮＰ１３株を分離した方法を用いて、スト
レプトミセス・オウレオファシエンスに属するＤＭＴ生
産変異株ＮＰ３８５［バイオサイエンス・バイオテクノ
ロジー・アンド・バイオケミストリー（Bioscience, Bi
otechnology, and Biochemistry ） 59, 1099-1106(19
95) ］からＤＭＴを生産せず、アセトニトリル４５％含
有０．１M クエン酸水溶液（ｐＨ２．０）中での吸収極
大が２８１ｎｍ、３３２ｎｍ、５３０ｎｍのスペクトル
を示すＴＢを生産する変異株ＮＰ７１１株を分離した。
この物質は各種ＮＭＲスペクトル、およびそのアセチル
誘導体の1Ｈ−ＮＭＲ、ＭＳスペクトルの解析などによ
り、ＴＢと同定された。
レプトミセス・オウレオファシエンスに属するＤＭＴ生
産変異株ＮＰ３８５［バイオサイエンス・バイオテクノ
ロジー・アンド・バイオケミストリー（Bioscience, Bi
otechnology, and Biochemistry ） 59, 1099-1106(19
95) ］からＤＭＴを生産せず、アセトニトリル４５％含
有０．１M クエン酸水溶液（ｐＨ２．０）中での吸収極
大が２８１ｎｍ、３３２ｎｍ、５３０ｎｍのスペクトル
を示すＴＢを生産する変異株ＮＰ７１１株を分離した。
この物質は各種ＮＭＲスペクトル、およびそのアセチル
誘導体の1Ｈ−ＮＭＲ、ＭＳスペクトルの解析などによ
り、ＴＢと同定された。
【００３６】文献［バイオサイエンス・バイオテクノロ
ジー・アンド・バイオケミストリー（Bioscience, Biot
echnology, and Biochemistry ） 59, 1099-1106(199
5) ］に記載されている方法に従い、ＡＯＸ遺伝子を含
む１．８ＫｂのＳａｃＩ- ＤＮＡ断片の制限酵素Ｎｃｏ
Ｉ切断部位を４塩基フレームシフトさせたＤＮＡ断片を
プラスミドｐＩＪ７０２ＤＮＡに挿入して構築した組換
えプラスミドでＮＰ１３株およびＮＰ７１１株を形質転
換し、２０μｇ／ｍｌ濃度のチオペプチン抵抗性を示す
形質転換体を得た。これら形質転換体を各々プロトプラ
スト化して再生培地で再生させた。再生したコロニーの
中から、２０μｇ／ｍｌ濃度のチオペプチン抵抗性を示
さず、且つＣＴＢおよびＴＢを生産しないコロニーを選
抜した。選抜したコロニーから各々染色体ＤＮＡを抽出
し、サザン解析を行って、染色体ＡＯＸ遺伝子にフレー
ムシフト変異が導入されていることを確認した。このよ
うにしてＮＰ１３株およびＮＰ７１１株から誘導された
ＡＯＸ欠損変異株がＮＰＤＣ１３株およびＮＰＤＣ７１
１株である。ＮＰＤＣ１３株およびＮＰＤＣ７１１株の
主生産物は、1Ｈ−ＮＭＲ、ＭＳスペクトルの解析など
により、それぞれクロロ化ＤＭＡＴＣおよびＤＭＡＴＣ
と決定された。こうしてＮＰ１３株およびＮＰ７１１株
の４ａ，１２ａ水和酵素は機能していることが確認さ
れ、ＮＰ１３株およびＮＰ７１１株はＴＣＤＨ欠損変異
株であることが明らかになった。
ジー・アンド・バイオケミストリー（Bioscience, Biot
echnology, and Biochemistry ） 59, 1099-1106(199
5) ］に記載されている方法に従い、ＡＯＸ遺伝子を含
む１．８ＫｂのＳａｃＩ- ＤＮＡ断片の制限酵素Ｎｃｏ
Ｉ切断部位を４塩基フレームシフトさせたＤＮＡ断片を
プラスミドｐＩＪ７０２ＤＮＡに挿入して構築した組換
えプラスミドでＮＰ１３株およびＮＰ７１１株を形質転
換し、２０μｇ／ｍｌ濃度のチオペプチン抵抗性を示す
形質転換体を得た。これら形質転換体を各々プロトプラ
スト化して再生培地で再生させた。再生したコロニーの
中から、２０μｇ／ｍｌ濃度のチオペプチン抵抗性を示
さず、且つＣＴＢおよびＴＢを生産しないコロニーを選
抜した。選抜したコロニーから各々染色体ＤＮＡを抽出
し、サザン解析を行って、染色体ＡＯＸ遺伝子にフレー
ムシフト変異が導入されていることを確認した。このよ
うにしてＮＰ１３株およびＮＰ７１１株から誘導された
ＡＯＸ欠損変異株がＮＰＤＣ１３株およびＮＰＤＣ７１
１株である。ＮＰＤＣ１３株およびＮＰＤＣ７１１株の
主生産物は、1Ｈ−ＮＭＲ、ＭＳスペクトルの解析など
により、それぞれクロロ化ＤＭＡＴＣおよびＤＭＡＴＣ
と決定された。こうしてＮＰ１３株およびＮＰ７１１株
の４ａ，１２ａ水和酵素は機能していることが確認さ
れ、ＮＰ１３株およびＮＰ７１１株はＴＣＤＨ欠損変異
株であることが明らかになった。
【００３７】実施例２．ストレプトミセス・オウレオフ
ァシエンスのＴＣＤＨの合成に関与する遺伝子（ＴＣＤ
Ｈ遺伝子）のクローン化 SK No. 2培地で増殖させた供与体ストレプトミセス・オ
ウレオファシエンスＮＲＲＬ３２０３株の種培養液３ｍ
ｌをグリシン１％、Ｄ−マンニトール５％を含むSK No.
2培地３０ｍｌに接種して３０℃で２０時間培養した。
培養液を遠心分離して集菌し、文献［ジェネティック・
マニピュレーション・オブ・ストレプトミセス(Genetic
Manipulation of Streptomyces): ア・ラボラトリー・
マニュアル(A Laboratory Manual )(The John Innes Fo
undation, Norwich, 1985)］に記載の方法に従って染色
体ＤＮＡを抽出した。
ァシエンスのＴＣＤＨの合成に関与する遺伝子（ＴＣＤ
Ｈ遺伝子）のクローン化 SK No. 2培地で増殖させた供与体ストレプトミセス・オ
ウレオファシエンスＮＲＲＬ３２０３株の種培養液３ｍ
ｌをグリシン１％、Ｄ−マンニトール５％を含むSK No.
2培地３０ｍｌに接種して３０℃で２０時間培養した。
培養液を遠心分離して集菌し、文献［ジェネティック・
マニピュレーション・オブ・ストレプトミセス(Genetic
Manipulation of Streptomyces): ア・ラボラトリー・
マニュアル(A Laboratory Manual )(The John Innes Fo
undation, Norwich, 1985)］に記載の方法に従って染色
体ＤＮＡを抽出した。
【００３８】以下の実施例における試験管内での制限酵
素によるＤＮＡの消化、アルカリフォスファターゼによ
るＤＮＡの５'-末端の脱リン酸化およびＤＮＡリガーゼ
によるＤＮＡの連結はすべて宝酒造( 株) 社製の制限酵
素、アルカリフォスファターゼおよびＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用い、宝酒造( 株) 社が推奨する反応条件下で実施
した。
素によるＤＮＡの消化、アルカリフォスファターゼによ
るＤＮＡの５'-末端の脱リン酸化およびＤＮＡリガーゼ
によるＤＮＡの連結はすべて宝酒造( 株) 社製の制限酵
素、アルカリフォスファターゼおよびＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用い、宝酒造( 株) 社が推奨する反応条件下で実施
した。
【００３９】供与体の染色体ＤＮＡ２００μｇを制限酵
素Ｓａｕ３ＡＩ ０．５単位を加えた総量２ｍｌの制限
酵素反応液にて室温で約２０分間反応させて部分消化
し、フェノール／クロロホルム溶液［１Ｍトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）
で飽和させたフェノールとクロロホルムの１：１混合
物］を等量添加して混合した後、遠心分離にて上層のＤ
ＮＡ画分を取り出した。ＤＮＡ画分は０．７％濃度のア
ガロースゲルで電気泳動を行い、４〜８ｋｂに相当する
ＤＮＡ断片を含む画分を切り出してQIAEX ゲルエクスト
ラクションキット［キアジェン（QIAGEN）社製］を用い
てＤＮＡを回収した。
素Ｓａｕ３ＡＩ ０．５単位を加えた総量２ｍｌの制限
酵素反応液にて室温で約２０分間反応させて部分消化
し、フェノール／クロロホルム溶液［１Ｍトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）
で飽和させたフェノールとクロロホルムの１：１混合
物］を等量添加して混合した後、遠心分離にて上層のＤ
ＮＡ画分を取り出した。ＤＮＡ画分は０．７％濃度のア
ガロースゲルで電気泳動を行い、４〜８ｋｂに相当する
ＤＮＡ断片を含む画分を切り出してQIAEX ゲルエクスト
ラクションキット［キアジェン（QIAGEN）社製］を用い
てＤＮＡを回収した。
【００４０】制限酵素ＢａｍＨＩで切断後アルカリフォ
スファターゼで脱リン酸化処理したプラスミドｐＳＥ１
１９ＤＮＡ２０μｇと回収した供与体ＤＮＡ断片２０μ
ｇとをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させた。こ
のリガーゼ反応混合物で大腸菌ＪＭ１１０株を形質転換
し、アンピシリン抵抗性を示す形質転換体を集菌してゲ
ノムライブラリーを作製した。
スファターゼで脱リン酸化処理したプラスミドｐＳＥ１
１９ＤＮＡ２０μｇと回収した供与体ＤＮＡ断片２０μ
ｇとをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させた。こ
のリガーゼ反応混合物で大腸菌ＪＭ１１０株を形質転換
し、アンピシリン抵抗性を示す形質転換体を集菌してゲ
ノムライブラリーを作製した。
【００４１】該ゲノムライブラリーから抽出した組換え
プラスミドのストレプトミセス・オウレオファシエンス
ＮＰ７１１株染色体への組み込み操作は本発明者らが開
示しているストレプトミセス・オウレオファシエンスの
形質転換方法［バイオサイエンス・バイオテクノロジー
・アンド・バイオケミストリー（Bioscience, Biotechn
ology, and Biochemistry ） 59, 1099-1106(1995) ］
に従って行った。遺伝子ライブラリーから抽出したプラ
スミド１μｇあたり約２×１０1の頻度で得られた２０
μｇ／ｍｌ濃度のチオペプチン抵抗性を示すＮＰ７１１
株の組み込み体をＡＢＭ４寒天平板培地にレプリカし
た。３０℃にて４日間培養した後、大腸菌ＪＭ１１０株
のＬｂ培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、Ｎａ
Ｃｌ ５ｇを水１ｌに含み、ＰＨ７．０に調整した培
地）培養液を１／５００容混合した４５℃のＬｂ軟寒天
培地（寒天０．６％を溶解させたＬｂ培地）を重層し、
３０℃で一晩培養してＪＭ１１０株の生育阻止円を形成
する組み込み体をスクリーニングした。このようなスク
リーニングによって得られた組み込み体の一つがＴＢＺ
１株である。
プラスミドのストレプトミセス・オウレオファシエンス
ＮＰ７１１株染色体への組み込み操作は本発明者らが開
示しているストレプトミセス・オウレオファシエンスの
形質転換方法［バイオサイエンス・バイオテクノロジー
・アンド・バイオケミストリー（Bioscience, Biotechn
ology, and Biochemistry ） 59, 1099-1106(1995) ］
に従って行った。遺伝子ライブラリーから抽出したプラ
スミド１μｇあたり約２×１０1の頻度で得られた２０
μｇ／ｍｌ濃度のチオペプチン抵抗性を示すＮＰ７１１
株の組み込み体をＡＢＭ４寒天平板培地にレプリカし
た。３０℃にて４日間培養した後、大腸菌ＪＭ１１０株
のＬｂ培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、Ｎａ
Ｃｌ ５ｇを水１ｌに含み、ＰＨ７．０に調整した培
地）培養液を１／５００容混合した４５℃のＬｂ軟寒天
培地（寒天０．６％を溶解させたＬｂ培地）を重層し、
３０℃で一晩培養してＪＭ１１０株の生育阻止円を形成
する組み込み体をスクリーニングした。このようなスク
リーニングによって得られた組み込み体の一つがＴＢＺ
１株である。
【００４２】ＴＢＺ１株の染色体ＤＮＡを上述したＮＲ
ＲＬ３２０３株の場合と同様な方法で抽出し、いくつか
の制限酵素で切断してアガロースゲル電気泳動を行い、
常法にしたがってサザンハイブリダイゼーション用のナ
イロン膜に転写し、ＵＶ処理して固定した。プラスミド
ｐＵＣ１９ＤＮＡをＤＩＧ- ＤＮＡラベリングアンドデ
ィテクションキット［ベーリンガー・マンハイム（株）
社製］を用いてラベリングし、同キットを用いてベーリ
ンガー・マンハイム( 株) 社の推奨する条件でサザンハ
イブリダイゼーションを行った。ＴＢＺ１株の染色体サ
ザン解析の結果、クローニングされた組換えプラスミド
は染色体にタンデムに複数個組み込まれていることがわ
かった。
ＲＬ３２０３株の場合と同様な方法で抽出し、いくつか
の制限酵素で切断してアガロースゲル電気泳動を行い、
常法にしたがってサザンハイブリダイゼーション用のナ
イロン膜に転写し、ＵＶ処理して固定した。プラスミド
ｐＵＣ１９ＤＮＡをＤＩＧ- ＤＮＡラベリングアンドデ
ィテクションキット［ベーリンガー・マンハイム（株）
社製］を用いてラベリングし、同キットを用いてベーリ
ンガー・マンハイム( 株) 社の推奨する条件でサザンハ
イブリダイゼーションを行った。ＴＢＺ１株の染色体サ
ザン解析の結果、クローニングされた組換えプラスミド
は染色体にタンデムに複数個組み込まれていることがわ
かった。
【００４３】ＴＢＺ１株の染色体ＤＮＡ３μｇを制限酵
素ＥｃｏＲＩで完全消化した後、６５℃で１５分間処理
して制限酵素を失活させ、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結反応させた。このリガーゼ反応混合物で大腸
菌ＪＭ１１０株を形質転換し、得られたアンピシリン抵
抗性を示す形質転換体からプラスミドを抽出して組換え
プラスミドｐＫＮ３１を得た。プラスミドｐＫＮ３１Ｄ
ＮＡをいくつかの制限酵素で切断し、アガロースゲル電
気泳動を行って各断片の大きさを分析することにより制
限酵素地図を作成した。プラスミドｐＫＮ３１は約４．
８ｋｂのＳａｕ３Ａ ＤＮＡ断片がｐＳＥ１１９の制限
酵素ＢａｍＨＩ切断部位に挿入された構造を有してい
た。プラスミドｐＫＮ３１の制限酵素地図を第３図に示
す。
素ＥｃｏＲＩで完全消化した後、６５℃で１５分間処理
して制限酵素を失活させ、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結反応させた。このリガーゼ反応混合物で大腸
菌ＪＭ１１０株を形質転換し、得られたアンピシリン抵
抗性を示す形質転換体からプラスミドを抽出して組換え
プラスミドｐＫＮ３１を得た。プラスミドｐＫＮ３１Ｄ
ＮＡをいくつかの制限酵素で切断し、アガロースゲル電
気泳動を行って各断片の大きさを分析することにより制
限酵素地図を作成した。プラスミドｐＫＮ３１は約４．
８ｋｂのＳａｕ３Ａ ＤＮＡ断片がｐＳＥ１１９の制限
酵素ＢａｍＨＩ切断部位に挿入された構造を有してい
た。プラスミドｐＫＮ３１の制限酵素地図を第３図に示
す。
【００４４】実施例３．ＴＣＤＨ遺伝子の存在領域の特
定 プラスミドｐＫＮ３１ ＤＮＡを制限酵素ＳｐｈＩで切
断し、アガロースゲル電気泳動を行って２．４ｋｂのＤ
ＮＡ断片を含む画分を切り出し、QIAEX ゲルエクストラ
クションキット（キアジェン社製）を用いてＤＮＡを回
収した。この２．４ｋｂのＳｐｈＩＤＮＡ断片と制限酵
素ＳｐｈＩで切断したプラスミドｐＳＥ１０１ ＤＮＡ
とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させ、このリ
ガーゼ反応混合物で大腸菌ＪＭ１１０株を形質転換し
た。得られたアンピシリン抵抗性を示す形質転換体から
プラスミドを抽出して２．４ｋｂのＳｐｈＩＤＮＡ断片
を含む組換えプラスミドｐＫＮ２０１およびｐＫＮ２０
２を得た。プラスミドｐＫＮ２０１およびｐＫＮ２０２
とは第４図から明らかなように２．４ｋｂのＳｐｈＩＤ
ＮＡ断片の挿入方向が異なる以外は同じ構造を有してい
る。プラスミドｐＳＥ１０１、ｐＫＮ２０１およびｐＫ
Ｎ２０２でＮＰ１３株およびＮＰ７１１株をそれぞれ形
質転換し、２０μｇ／ｍｌ濃度のチオペプチン抵抗性を
示す形質転換体ＮＰ１３/ ｐＳＥ１０１株、ＮＰ１３/
ｐＫＮ２０１株、ＮＰ１３/ ｐＫＮ２０２株、ＮＰ７１
１/ ｐＳＥ１０１株、ＮＰ７１１/ ｐＫＮ２０１株およ
びＮＰ７１１/ ｐＫＮ２０２株をそれぞれ得た。SK No.
2培地で増殖させたＮＰ１３株およびＮＰ７１１株とチ
オペプチンを２０μｇ／ｍｌ含有するSK No. 2培地で増
殖させたＮＰ１３/ ｐＳＥ１０１株、ＮＰ１３/ ｐＫＮ
２０１株、ＮＰ１３/ ｐＫＮ２０２株、ＮＰ７１１/ ｐ
ＳＥ１０１株、ＮＰ７１１/ ｐＫＮ２０１株およびＮＰ
７１１/ ｐＫＮ２０２株の種培養液１ｍｌをそれぞれPK
No.2 培地（でんぷん５０ｇ、大豆粕６０ｇ、大豆油４
０ｇ、塩化カリウム５ｇ、硫酸マグネシウム０．０５
ｇ、硫酸銅 ０．０５ｇ、硫酸亜鉛 ０．０５ｇ、炭酸
カルシウム １０ｇを水１ｌに含み、ｐＨ５．０に調整
した培地）３０ｍｌを含む３００ｍｌ容三角フラスコに
接種し、２８℃で７日間振とう培養した。培養終了後、
各々の培養液１ｍｌにｎ−プロパノール３ｍｌと0.1 規
定の塩酸７ｍｌを添加して攪拌した後、遠心分離して菌
体などの沈殿物を除去し、上清のＤＭＣＴおよびＤＭＴ
含有量を高速液体クロマトグラフィーで定量分析した。
ＮＰ１３株、ＮＰ１３/ ｐＳＥ１０１株、ＮＰ１３/ ｐ
ＫＮ２０１株およびＮＰ１３/ ｐＫＮ２０２株培養物中
のＤＭＣＴ濃度は、それぞれ０ｇ/ ｌ、０ｇ/ ｌ、１．
７ｇ/ ｌおよび１．６ｇ/ ｌであった。ＮＰ７１１株、
ＮＰ７１１/ ｐＳＥ１０１株、ＮＰ７１１/ｐＫＮ２０
１株およびＮＰ７１１/ ｐＫＮ２０２株培養物中のＤＭ
Ｔ濃度は、それぞれ ０ｇ/ ｌ、０ｇ/ ｌ、０．８ｇ/
ｌおよび０．８ｇ/ ｌであった。プラスミドｐＫＮ２０
１およびｐＫＮ２０２としてクローン化した２．４Ｋｂ
のＳｐｈＩＤＮＡ断片に、ＴＣＤＨ遺伝子がコードされ
ていることが明らかとなった。組換えプラスミドｐＫＮ
２０１を保有する大腸菌ＪＭ１１０/ ｐＫＮ２０１株は
平成８年８月１日付けでFERM BP-5614として工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託されている。
定 プラスミドｐＫＮ３１ ＤＮＡを制限酵素ＳｐｈＩで切
断し、アガロースゲル電気泳動を行って２．４ｋｂのＤ
ＮＡ断片を含む画分を切り出し、QIAEX ゲルエクストラ
クションキット（キアジェン社製）を用いてＤＮＡを回
収した。この２．４ｋｂのＳｐｈＩＤＮＡ断片と制限酵
素ＳｐｈＩで切断したプラスミドｐＳＥ１０１ ＤＮＡ
とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させ、このリ
ガーゼ反応混合物で大腸菌ＪＭ１１０株を形質転換し
た。得られたアンピシリン抵抗性を示す形質転換体から
プラスミドを抽出して２．４ｋｂのＳｐｈＩＤＮＡ断片
を含む組換えプラスミドｐＫＮ２０１およびｐＫＮ２０
２を得た。プラスミドｐＫＮ２０１およびｐＫＮ２０２
とは第４図から明らかなように２．４ｋｂのＳｐｈＩＤ
ＮＡ断片の挿入方向が異なる以外は同じ構造を有してい
る。プラスミドｐＳＥ１０１、ｐＫＮ２０１およびｐＫ
Ｎ２０２でＮＰ１３株およびＮＰ７１１株をそれぞれ形
質転換し、２０μｇ／ｍｌ濃度のチオペプチン抵抗性を
示す形質転換体ＮＰ１３/ ｐＳＥ１０１株、ＮＰ１３/
ｐＫＮ２０１株、ＮＰ１３/ ｐＫＮ２０２株、ＮＰ７１
１/ ｐＳＥ１０１株、ＮＰ７１１/ ｐＫＮ２０１株およ
びＮＰ７１１/ ｐＫＮ２０２株をそれぞれ得た。SK No.
2培地で増殖させたＮＰ１３株およびＮＰ７１１株とチ
オペプチンを２０μｇ／ｍｌ含有するSK No. 2培地で増
殖させたＮＰ１３/ ｐＳＥ１０１株、ＮＰ１３/ ｐＫＮ
２０１株、ＮＰ１３/ ｐＫＮ２０２株、ＮＰ７１１/ ｐ
ＳＥ１０１株、ＮＰ７１１/ ｐＫＮ２０１株およびＮＰ
７１１/ ｐＫＮ２０２株の種培養液１ｍｌをそれぞれPK
No.2 培地（でんぷん５０ｇ、大豆粕６０ｇ、大豆油４
０ｇ、塩化カリウム５ｇ、硫酸マグネシウム０．０５
ｇ、硫酸銅 ０．０５ｇ、硫酸亜鉛 ０．０５ｇ、炭酸
カルシウム １０ｇを水１ｌに含み、ｐＨ５．０に調整
した培地）３０ｍｌを含む３００ｍｌ容三角フラスコに
接種し、２８℃で７日間振とう培養した。培養終了後、
各々の培養液１ｍｌにｎ−プロパノール３ｍｌと0.1 規
定の塩酸７ｍｌを添加して攪拌した後、遠心分離して菌
体などの沈殿物を除去し、上清のＤＭＣＴおよびＤＭＴ
含有量を高速液体クロマトグラフィーで定量分析した。
ＮＰ１３株、ＮＰ１３/ ｐＳＥ１０１株、ＮＰ１３/ ｐ
ＫＮ２０１株およびＮＰ１３/ ｐＫＮ２０２株培養物中
のＤＭＣＴ濃度は、それぞれ０ｇ/ ｌ、０ｇ/ ｌ、１．
７ｇ/ ｌおよび１．６ｇ/ ｌであった。ＮＰ７１１株、
ＮＰ７１１/ ｐＳＥ１０１株、ＮＰ７１１/ｐＫＮ２０
１株およびＮＰ７１１/ ｐＫＮ２０２株培養物中のＤＭ
Ｔ濃度は、それぞれ ０ｇ/ ｌ、０ｇ/ ｌ、０．８ｇ/
ｌおよび０．８ｇ/ ｌであった。プラスミドｐＫＮ２０
１およびｐＫＮ２０２としてクローン化した２．４Ｋｂ
のＳｐｈＩＤＮＡ断片に、ＴＣＤＨ遺伝子がコードされ
ていることが明らかとなった。組換えプラスミドｐＫＮ
２０１を保有する大腸菌ＪＭ１１０/ ｐＫＮ２０１株は
平成８年８月１日付けでFERM BP-5614として工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００４５】実施例４．３つのテトラサイクリン耐性遺
伝子を含むＤＮＡ領域をカバーする２つのコスミドｐＧ
ＬＡ２、ｐＧＬＡ１１とのサザンハイブリダイゼーショ
ン ３つのテトラサイクリン耐性遺伝子を含む約４０ｋｂの
ＤＮＡ領域をカバーする２つのコスミドｐＧＬＡ２、ｐ
ＧＬＡ１１［バイオサイエンス・バイオテクノロジー・
アンド・バイオケミストリー（Bioscience, Biotechnol
ogy, and Biochemistry） 59, 1835-1841(1995)］ＤＮ
Ａを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、プラスミドｐＫＮ２
０１ＤＮＡを制限酵素ＳｐｈＩで切断した。これらの制
限酵素処理した３種のＤＮＡは０．７％濃度のアガロー
スゲルで電気泳動を行った後、常法にしたがってサザン
ハイブリダイゼーション用のナイロン膜に転写し、ＵＶ
処理して固定した（ナイロン膜Ａ）。制限酵素ＳｐｈＩ
で切断した約２０μｇのプラスミドｐＫＮ２０１ＤＮＡ
をアガロースゲル電気泳動し、ＴＣＤＨ遺伝子を含む
２．４ＫｂのＳｐｈＩＤＮＡ断片を含む画分を切り出し
て市販のＤＮＡ抽出キットを用いてＤＮＡを回収した。
この２．４ＫｂのＳｐｈＩ ＤＮＡ断片１μｇをＤＩＧ
−ＤＮＡラベリングアンドディテクションキット［ベー
リンガー・マンハイム( 株) 社製］を用いてラベリング
し、上記ナイロン膜Ａとのサザンハイブリダイゼーショ
ンをベーリンガー・マンハイム( 株) 社の推奨する条件
で行った。ＴＣＤＨ遺伝子を含む２．４ＫｂのＳｐｈＩ
ＤＮＡ断片はコスミドｐＧＬＡ２、ｐＧＬＡ１１には
全くハイブリダイズしなかった。この結果からＴＣＤＨ
遺伝子はテトラサイクリン耐性遺伝子近傍に位置するＤ
ＮＡ領域（いわゆるクロロテトラサイクリン生合成遺伝
子クラスター）とは別の領域にあることが示された。
伝子を含むＤＮＡ領域をカバーする２つのコスミドｐＧ
ＬＡ２、ｐＧＬＡ１１とのサザンハイブリダイゼーショ
ン ３つのテトラサイクリン耐性遺伝子を含む約４０ｋｂの
ＤＮＡ領域をカバーする２つのコスミドｐＧＬＡ２、ｐ
ＧＬＡ１１［バイオサイエンス・バイオテクノロジー・
アンド・バイオケミストリー（Bioscience, Biotechnol
ogy, and Biochemistry） 59, 1835-1841(1995)］ＤＮ
Ａを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、プラスミドｐＫＮ２
０１ＤＮＡを制限酵素ＳｐｈＩで切断した。これらの制
限酵素処理した３種のＤＮＡは０．７％濃度のアガロー
スゲルで電気泳動を行った後、常法にしたがってサザン
ハイブリダイゼーション用のナイロン膜に転写し、ＵＶ
処理して固定した（ナイロン膜Ａ）。制限酵素ＳｐｈＩ
で切断した約２０μｇのプラスミドｐＫＮ２０１ＤＮＡ
をアガロースゲル電気泳動し、ＴＣＤＨ遺伝子を含む
２．４ＫｂのＳｐｈＩＤＮＡ断片を含む画分を切り出し
て市販のＤＮＡ抽出キットを用いてＤＮＡを回収した。
この２．４ＫｂのＳｐｈＩ ＤＮＡ断片１μｇをＤＩＧ
−ＤＮＡラベリングアンドディテクションキット［ベー
リンガー・マンハイム( 株) 社製］を用いてラベリング
し、上記ナイロン膜Ａとのサザンハイブリダイゼーショ
ンをベーリンガー・マンハイム( 株) 社の推奨する条件
で行った。ＴＣＤＨ遺伝子を含む２．４ＫｂのＳｐｈＩ
ＤＮＡ断片はコスミドｐＧＬＡ２、ｐＧＬＡ１１には
全くハイブリダイズしなかった。この結果からＴＣＤＨ
遺伝子はテトラサイクリン耐性遺伝子近傍に位置するＤ
ＮＡ領域（いわゆるクロロテトラサイクリン生合成遺伝
子クラスター）とは別の領域にあることが示された。
【００４６】実施例５．組換えプラスミドｐＫＮ３１組
み込み体および組換えプラスミドｐＫＮ２０１形質転換
体の作製 ストレプトミセス・オウレオファシエンスＮＲＲＬ３２
０３株から誘導したＤＭＣＴ非生産変異株ＮＰ１３７株
に組換えプラスミドｐＫＮ３１を導入し、２０μｇ／ｍ
ｌ濃度のチオペプチン抵抗性を示す組み込み体ＮＰ１３
７１株を得た。また、ＮＰ１３７株に組換えプラスミド
ｐＫＮ２０１を導入し、５０μｇ／ｍｌ濃度以上のチオ
ペプチン抵抗性を示す形質転換体ＮＰ１３７２株を得
た。実施例２と同様の方法を用いて、ＮＰ１３７１株の
染色体のサザン解析を実施した。その結果、ＮＰ１３７
１株は染色体上でＴＣＤＨ遺伝子の数が増幅されている
ことが確認された。
み込み体および組換えプラスミドｐＫＮ２０１形質転換
体の作製 ストレプトミセス・オウレオファシエンスＮＲＲＬ３２
０３株から誘導したＤＭＣＴ非生産変異株ＮＰ１３７株
に組換えプラスミドｐＫＮ３１を導入し、２０μｇ／ｍ
ｌ濃度のチオペプチン抵抗性を示す組み込み体ＮＰ１３
７１株を得た。また、ＮＰ１３７株に組換えプラスミド
ｐＫＮ２０１を導入し、５０μｇ／ｍｌ濃度以上のチオ
ペプチン抵抗性を示す形質転換体ＮＰ１３７２株を得
た。実施例２と同様の方法を用いて、ＮＰ１３７１株の
染色体のサザン解析を実施した。その結果、ＮＰ１３７
１株は染色体上でＴＣＤＨ遺伝子の数が増幅されている
ことが確認された。
【００４７】実施例６．組換えプラスミドｐＫＮ３１組
み込み体および組換えプラスミドｐＫＮ２０１形質転換
体によるＤＭＴの生産 ＮＰ１３７株、ＮＰ１３７１株およびＮＰ１３７２株を
用いてＤＭＡＴＣからＤＭＴへの変換反応を実施し、Ｄ
ＭＴ蓄積量を比較した。SK No. 2培地で培養したＮＰ１
３７株、チオペプチン２０μｇ／ｍｌ含有SK No. 2培地
で培養したＮＰ１３７１株およびＮＰ１３７２株の種培
養液１ｍｌをそれぞれPK No.2 培地３０ｍｌを含む３０
０ｍｌ容三角フラスコに接種し２８℃で振とう培養し
た。培養２日後に文献［バイオサイエンス・バイオテク
ノロジー・アンド・バイオケミストリー（Bioscience,
Biotechnology, and Biochemistry ） 59, 1099-1106
(1995)]に記載の方法に従ってＮＰＤＣ７１１株の培養
液から調製したＤＭＡＴＣ１５mgを添加し、２８℃でさ
らに７２時間振盪培養した。培養終了後、各々の培養液
１ｍｌにｎ−プロパノール３ｍｌと０．１規定の塩酸７
ｍｌを添加して攪拌した後、遠心分離して菌体などの沈
殿物を除去し、上清のＤＭＴ含有量を高速液体クロマト
グラフィーで定量分析した。また、各々の培養液１ｍｌ
にジメチルスルホキシド９ｍｌを添加して撹拌した後、
遠心分離して菌体などの沈殿物を除去し、上清のＤＭＡ
ＴＣ・ＴＢ含有量を高速液体クロマトグラフィーで定量
分析した。結果を第１表に示す。
み込み体および組換えプラスミドｐＫＮ２０１形質転換
体によるＤＭＴの生産 ＮＰ１３７株、ＮＰ１３７１株およびＮＰ１３７２株を
用いてＤＭＡＴＣからＤＭＴへの変換反応を実施し、Ｄ
ＭＴ蓄積量を比較した。SK No. 2培地で培養したＮＰ１
３７株、チオペプチン２０μｇ／ｍｌ含有SK No. 2培地
で培養したＮＰ１３７１株およびＮＰ１３７２株の種培
養液１ｍｌをそれぞれPK No.2 培地３０ｍｌを含む３０
０ｍｌ容三角フラスコに接種し２８℃で振とう培養し
た。培養２日後に文献［バイオサイエンス・バイオテク
ノロジー・アンド・バイオケミストリー（Bioscience,
Biotechnology, and Biochemistry ） 59, 1099-1106
(1995)]に記載の方法に従ってＮＰＤＣ７１１株の培養
液から調製したＤＭＡＴＣ１５mgを添加し、２８℃でさ
らに７２時間振盪培養した。培養終了後、各々の培養液
１ｍｌにｎ−プロパノール３ｍｌと０．１規定の塩酸７
ｍｌを添加して攪拌した後、遠心分離して菌体などの沈
殿物を除去し、上清のＤＭＴ含有量を高速液体クロマト
グラフィーで定量分析した。また、各々の培養液１ｍｌ
にジメチルスルホキシド９ｍｌを添加して撹拌した後、
遠心分離して菌体などの沈殿物を除去し、上清のＤＭＡ
ＴＣ・ＴＢ含有量を高速液体クロマトグラフィーで定量
分析した。結果を第１表に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】ＮＰ１３７２株、ＮＰ１３７１株およびＮ
Ｐ１３７株の培養液のＤＭＴ蓄積量は、それぞれ３２３
mg/l、３１３mg/lおよび２５６mg/lであり、ＴＣＤＨ遺
伝子増幅株ＮＰ１３７２およびＮＰ１３７１株のＤＭＴ
蓄積量は宿主ＮＰ１３７株のＤＭＴ蓄積量に比べて有意
に高かった。この結果からＴＣＤＨ遺伝子の増幅によっ
てＴＣＤＨの発現が強化されＤＭＴ生産性が改善される
ことが示された。
Ｐ１３７株の培養液のＤＭＴ蓄積量は、それぞれ３２３
mg/l、３１３mg/lおよび２５６mg/lであり、ＴＣＤＨ遺
伝子増幅株ＮＰ１３７２およびＮＰ１３７１株のＤＭＴ
蓄積量は宿主ＮＰ１３７株のＤＭＴ蓄積量に比べて有意
に高かった。この結果からＴＣＤＨ遺伝子の増幅によっ
てＴＣＤＨの発現が強化されＤＭＴ生産性が改善される
ことが示された。
【００５０】実施例７．ＴＣＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断
片の塩基配列の決定 組換えプラスミドｐＫＮ３１ＤＮＡを制限酵素ＳｐｈＩ
で切断し、アガロースゲル電気泳動を行って２．４ｋｂ
のＤＮＡ断片を含む画分を切り出し、QIAEX ゲルエクス
トラクションキット（キアジェン社製）を用いてＤＮＡ
を回収した。この２．４ｋｂのＳｐｈＩＤＮＡ断片と制
限酵素ＳｐｈＩで切断したプラスミドｐＵＣ１９ＤＮＡ
とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させた。この
リガーゼ反応混合物で大腸菌を形質転換し、形質転換体
からプラスミドを抽出して２．４ｋｂのＳｐｈＩＤＮＡ
断片が互いに異なる向きに挿入された２つのプラスミド
を得た。これらのプラスミドからキロシークエンス用デ
リーションキット［宝酒造( 株) 社製］を用いて欠失プ
ラスミドを調製し、これらで形質転換された大腸菌から
ＤＮＡ塩基配列決定用のプラスミドを調製した。
片の塩基配列の決定 組換えプラスミドｐＫＮ３１ＤＮＡを制限酵素ＳｐｈＩ
で切断し、アガロースゲル電気泳動を行って２．４ｋｂ
のＤＮＡ断片を含む画分を切り出し、QIAEX ゲルエクス
トラクションキット（キアジェン社製）を用いてＤＮＡ
を回収した。この２．４ｋｂのＳｐｈＩＤＮＡ断片と制
限酵素ＳｐｈＩで切断したプラスミドｐＵＣ１９ＤＮＡ
とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させた。この
リガーゼ反応混合物で大腸菌を形質転換し、形質転換体
からプラスミドを抽出して２．４ｋｂのＳｐｈＩＤＮＡ
断片が互いに異なる向きに挿入された２つのプラスミド
を得た。これらのプラスミドからキロシークエンス用デ
リーションキット［宝酒造( 株) 社製］を用いて欠失プ
ラスミドを調製し、これらで形質転換された大腸菌から
ＤＮＡ塩基配列決定用のプラスミドを調製した。
【００５１】塩基配列の決定は、ダイプライマーシーク
エンシングキットおよびＤＮＡシークエンサー（ともに
アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。決
定した塩基配列および該塩基配列から推定されるアミノ
酸配列を配列番号１および配列番号２に示した。
エンシングキットおよびＤＮＡシークエンサー（ともに
アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。決
定した塩基配列および該塩基配列から推定されるアミノ
酸配列を配列番号１および配列番号２に示した。
【００５２】
【発明の効果】本発明によれば、テトラサイクリン系抗
生物質を生産するテトラサイクリンデヒドロゲナーゼの
欠損形質を相補するＴＣＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を
取得できる。該ＤＮＡ断片を用いて、染色体上のＴＣＤ
Ｈ遺伝子の数が増幅されたデメチルテトラサイクリン生
産菌を作製することにより、ＤＭＴ生産性の改善が可能
となる。
生物質を生産するテトラサイクリンデヒドロゲナーゼの
欠損形質を相補するＴＣＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片を
取得できる。該ＤＮＡ断片を用いて、染色体上のＴＣＤ
Ｈ遺伝子の数が増幅されたデメチルテトラサイクリン生
産菌を作製することにより、ＤＭＴ生産性の改善が可能
となる。
【００５３】
配列番号：１ 配列の長さ：1362 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源：ストレプトミセス・オウレオファシエンス(Strep
tomyces aureofaciens) 株名：NP385 存在位置：190-1356 配列 GAGATCCTGG GGGTCGAGGG GATCCCCGAG GTCGACGCCG GGGCGGACCT CGCCGGACTG 60 ATCGCCAAGG CCGGGACGTA CCGGGACGGC GACATCCTGC TGGTCACCTC GAAGGTCGTC 120 AGCAAGGCCG AGGGGCGGCT GCTGCACGCC GCCGACCGCG ACGCCGCGAT CGACGCCGAG 180 ACCGTCCGG GTG GTC GCC CGG CGC GGA CCG GCC CGG ATC GTC GAG AAC CGC 231 Val Val Ala Arg Arg Gly Pro Ala Arg Ile Val Glu Asn Arg 1 5 10 AAC GGC TTC GTC ATG GCC GCC GCC GGG GTC GAC GCC TCC AAC ACC GCC 279 Asn Gly Phe Val Met Ala Ala Ala Gly Val Asp Ala Ser Asn Thr Ala 15 20 25 30 CCC GGC ACC GTG CTG CTG CTG CCC GAG GAC CCG GAC GCC TCG GCG CGG 327 Pro Gly Thr Val Leu Leu Leu Pro Glu Asp Pro Asp Ala Ser Ala Arg 35 40 45 GCG CTG CGC TCC CGG CTC CAG CAG CTG ACC GGG TGC CGG CTC GCC GTC 375 Ala Leu Arg Ser Arg Leu Gln Gln Leu Thr Gly Cys Arg Leu Ala Val 50 55 60 GTC GTC ACC GAC ACC TTC GGA CGG CCC TGG CGC AAC GGG CTC ACC GAC 423 Val Val Thr Asp Thr Phe Gly Arg Pro Trp Arg Asn Gly Leu Thr Asp 65 70 75 GTC GCG ATC GGC GCC GCC GGG CTG TCC GTC CTC GAG GAC CAC CGG GGG 471 Val Ala Ile Gly Ala Ala Gly Leu Ser Val Leu Glu Asp His Arg Gly 80 85 90 CGC ACC GAC AGC CAC GGC AAC GAG CTG GTG CTG ACC GTC ACC GCG ACC 519 Arg Thr Asp Ser His Gly Asn Glu Leu Val Leu Thr Val Thr Ala Thr 95 100 105 110 GCC GAC GAA CTC GCC GCC GCC GCC GAC CTG GTG AAG GGC AAG GCC ACC 567 Ala Asp Glu Leu Ala Ala Ala Ala Asp Leu Val Lys Gly Lys Ala Thr 115 120 125 GGC GTC CCG GTC GCG ATC GTG CGC GGC CTC GGA CAC CTG GTC ACC GCC 615 Gly Val Pro Val Ala Ile Val Arg Gly Leu Gly His Leu Val Thr Ala 130 135 140 GAG GAC GGC GCC GGC ACC CGG CCG CTG GTG CGG GCC GCC GCC GAC GAC 663 Glu Asp Gly Ala Gly Thr Arg Pro Leu Val Arg Ala Ala Ala Asp Asp 145 150 155 ATG TTC CGG CTC GGC ACC TCC GAG GCA CTG CGC CAG GCC GTC ACC CTG 711 Met Phe Arg Leu Gly Thr Ser Glu Ala Leu Arg Gln Ala Val Thr Leu 160 165 170 CGG CGC ACC GTC CGC TCC TTC ACC ACC GAC CCG GTC GAC CCG GCC GCC 759 Arg Arg Thr Val Arg Ser Phe Thr Thr Asp Pro Val Asp Pro Ala Ala 175 180 185 190 GTC CGG CGC GCG GTC GCC GCC GCG GTC ACC GCG CCC GCG CCG CAC CAC 807 Val Arg Arg Ala Val Ala Ala Ala Val Thr Ala Pro Ala Pro His His 195 200 205 ACC ACG CCC TGG CGC TTC GTG CTG CTG GAG TCC GCC GGG ACC CGG GTC 855 Thr Thr Pro Trp Arg Phe Val Leu Leu Glu Ser Ala Gly Thr Arg Val 210 215 220 CGG CTG CTC GAC GCC ATG CTC GGC GCC TGG CAG CGC GAC CTG CGC GAA 903 Arg Leu Leu Asp Ala Met Leu Gly Ala Trp Gln Arg Asp Leu Arg Glu 225 230 235 CTC GAC GGC TGG GAC GAG GCC AGG ATC GCC CGC CGC ACC GCC CGG GGC 951 Leu Asp Gly Trp Asp Glu Ala Arg Ile Ala Arg Arg Thr Ala Arg Gly 240 245 250 GAC GTC CTG CGG GAC GCG CCG TAC CTG GTC GTG CCG TGC CTG GTG ATG 999 Asp Val Leu Arg Asp Ala Pro Tyr Leu Val Val Pro Cys Leu Val Met 255 260 265 270 GAC GGC TCG CAC GAC TAC CCG GAC CCG CGC CGG GCC GCG GCG GAG CGG 1047 Asp Gly Ser His Asp Tyr Pro Asp Pro Arg Arg Ala Ala Ala Glu Arg 275 280 285 GAG ATG TTC ACG GTC GCC GCC GGA GCG GGG GTG CAG AAC CTG CTC GTC 1095 Glu Met Phe Thr Val Ala Ala Gly Ala Gly Val Gln Asn Leu Leu Val 290 295 300 GCC CTG ACC GGC GAG GGG TAC GGC TCC GCC TGG GTG TCG TCG ACG ATG 1143 Ala Leu Thr Gly Glu Gly Tyr Gly Ser Ala Trp Val Ser Ser Thr Met 305 310 315 TTC TGC CGC GAC ACC GTC CGG GAG GTG CTG GAC CTG CCG GAG GGG TGG 1191 Phe Cys Arg Asp Thr Val Arg Glu Val Leu Asp Leu Pro Glu Gly Trp 320 325 330 GAC CCG ATG GGG GCG GTG GCG GTC GGC CGG CCG GCG GAG GTG CCG CGG 1239 Asp Pro Met Gly Ala Val Ala Val Gly Arg Pro Ala Glu Val Pro Arg 335 340 345 350 GAG CGG CGG CGC GGA GTG CGG AGG CGT TCG TCG AGG TGC GGT AGG GGG 1287 Glu Arg Arg Arg Gly Val Arg Arg Arg Ser Ser Arg Cys Gly Arg Gly 355 360 365 TGC TGT TCG AAG GGC GGG CTC TCG GGA GGG TGG GTG ACG CCG GGG CGC 1314 Cys Cys Ser Lys Gly Gly Leu Ser Gly Gly Trp Val Thr Pro Gly Arg 370 375 380 GTC CCT CTC GCC TTG GTC GGG TGA GGG 1362 Val Pro Leu Ala Leu Val Gly *** 385
tomyces aureofaciens) 株名：NP385 存在位置：190-1356 配列 GAGATCCTGG GGGTCGAGGG GATCCCCGAG GTCGACGCCG GGGCGGACCT CGCCGGACTG 60 ATCGCCAAGG CCGGGACGTA CCGGGACGGC GACATCCTGC TGGTCACCTC GAAGGTCGTC 120 AGCAAGGCCG AGGGGCGGCT GCTGCACGCC GCCGACCGCG ACGCCGCGAT CGACGCCGAG 180 ACCGTCCGG GTG GTC GCC CGG CGC GGA CCG GCC CGG ATC GTC GAG AAC CGC 231 Val Val Ala Arg Arg Gly Pro Ala Arg Ile Val Glu Asn Arg 1 5 10 AAC GGC TTC GTC ATG GCC GCC GCC GGG GTC GAC GCC TCC AAC ACC GCC 279 Asn Gly Phe Val Met Ala Ala Ala Gly Val Asp Ala Ser Asn Thr Ala 15 20 25 30 CCC GGC ACC GTG CTG CTG CTG CCC GAG GAC CCG GAC GCC TCG GCG CGG 327 Pro Gly Thr Val Leu Leu Leu Pro Glu Asp Pro Asp Ala Ser Ala Arg 35 40 45 GCG CTG CGC TCC CGG CTC CAG CAG CTG ACC GGG TGC CGG CTC GCC GTC 375 Ala Leu Arg Ser Arg Leu Gln Gln Leu Thr Gly Cys Arg Leu Ala Val 50 55 60 GTC GTC ACC GAC ACC TTC GGA CGG CCC TGG CGC AAC GGG CTC ACC GAC 423 Val Val Thr Asp Thr Phe Gly Arg Pro Trp Arg Asn Gly Leu Thr Asp 65 70 75 GTC GCG ATC GGC GCC GCC GGG CTG TCC GTC CTC GAG GAC CAC CGG GGG 471 Val Ala Ile Gly Ala Ala Gly Leu Ser Val Leu Glu Asp His Arg Gly 80 85 90 CGC ACC GAC AGC CAC GGC AAC GAG CTG GTG CTG ACC GTC ACC GCG ACC 519 Arg Thr Asp Ser His Gly Asn Glu Leu Val Leu Thr Val Thr Ala Thr 95 100 105 110 GCC GAC GAA CTC GCC GCC GCC GCC GAC CTG GTG AAG GGC AAG GCC ACC 567 Ala Asp Glu Leu Ala Ala Ala Ala Asp Leu Val Lys Gly Lys Ala Thr 115 120 125 GGC GTC CCG GTC GCG ATC GTG CGC GGC CTC GGA CAC CTG GTC ACC GCC 615 Gly Val Pro Val Ala Ile Val Arg Gly Leu Gly His Leu Val Thr Ala 130 135 140 GAG GAC GGC GCC GGC ACC CGG CCG CTG GTG CGG GCC GCC GCC GAC GAC 663 Glu Asp Gly Ala Gly Thr Arg Pro Leu Val Arg Ala Ala Ala Asp Asp 145 150 155 ATG TTC CGG CTC GGC ACC TCC GAG GCA CTG CGC CAG GCC GTC ACC CTG 711 Met Phe Arg Leu Gly Thr Ser Glu Ala Leu Arg Gln Ala Val Thr Leu 160 165 170 CGG CGC ACC GTC CGC TCC TTC ACC ACC GAC CCG GTC GAC CCG GCC GCC 759 Arg Arg Thr Val Arg Ser Phe Thr Thr Asp Pro Val Asp Pro Ala Ala 175 180 185 190 GTC CGG CGC GCG GTC GCC GCC GCG GTC ACC GCG CCC GCG CCG CAC CAC 807 Val Arg Arg Ala Val Ala Ala Ala Val Thr Ala Pro Ala Pro His His 195 200 205 ACC ACG CCC TGG CGC TTC GTG CTG CTG GAG TCC GCC GGG ACC CGG GTC 855 Thr Thr Pro Trp Arg Phe Val Leu Leu Glu Ser Ala Gly Thr Arg Val 210 215 220 CGG CTG CTC GAC GCC ATG CTC GGC GCC TGG CAG CGC GAC CTG CGC GAA 903 Arg Leu Leu Asp Ala Met Leu Gly Ala Trp Gln Arg Asp Leu Arg Glu 225 230 235 CTC GAC GGC TGG GAC GAG GCC AGG ATC GCC CGC CGC ACC GCC CGG GGC 951 Leu Asp Gly Trp Asp Glu Ala Arg Ile Ala Arg Arg Thr Ala Arg Gly 240 245 250 GAC GTC CTG CGG GAC GCG CCG TAC CTG GTC GTG CCG TGC CTG GTG ATG 999 Asp Val Leu Arg Asp Ala Pro Tyr Leu Val Val Pro Cys Leu Val Met 255 260 265 270 GAC GGC TCG CAC GAC TAC CCG GAC CCG CGC CGG GCC GCG GCG GAG CGG 1047 Asp Gly Ser His Asp Tyr Pro Asp Pro Arg Arg Ala Ala Ala Glu Arg 275 280 285 GAG ATG TTC ACG GTC GCC GCC GGA GCG GGG GTG CAG AAC CTG CTC GTC 1095 Glu Met Phe Thr Val Ala Ala Gly Ala Gly Val Gln Asn Leu Leu Val 290 295 300 GCC CTG ACC GGC GAG GGG TAC GGC TCC GCC TGG GTG TCG TCG ACG ATG 1143 Ala Leu Thr Gly Glu Gly Tyr Gly Ser Ala Trp Val Ser Ser Thr Met 305 310 315 TTC TGC CGC GAC ACC GTC CGG GAG GTG CTG GAC CTG CCG GAG GGG TGG 1191 Phe Cys Arg Asp Thr Val Arg Glu Val Leu Asp Leu Pro Glu Gly Trp 320 325 330 GAC CCG ATG GGG GCG GTG GCG GTC GGC CGG CCG GCG GAG GTG CCG CGG 1239 Asp Pro Met Gly Ala Val Ala Val Gly Arg Pro Ala Glu Val Pro Arg 335 340 345 350 GAG CGG CGG CGC GGA GTG CGG AGG CGT TCG TCG AGG TGC GGT AGG GGG 1287 Glu Arg Arg Arg Gly Val Arg Arg Arg Ser Ser Arg Cys Gly Arg Gly 355 360 365 TGC TGT TCG AAG GGC GGG CTC TCG GGA GGG TGG GTG ACG CCG GGG CGC 1314 Cys Cys Ser Lys Gly Gly Leu Ser Gly Gly Trp Val Thr Pro Gly Arg 370 375 380 GTC CCT CTC GCC TTG GTC GGG TGA GGG 1362 Val Pro Leu Ala Leu Val Gly *** 385
【００５４】配列番号：２ 配列の長さ：389 配列の型：アミノ酸 配列の種類：蛋白質 配列 Val Val Ala Arg Arg Gly Pro Ala Arg Ile Val Glu Asn Arg Asn Gly 1 5 10 15 Phe Val Met Ala Ala Ala Gly Val Asp Ala Ser Asn Thr Ala Pro Gly 20 25 30 Thr Val Leu Leu Leu Pro Glu Asp Pro Asp Ala Ser Ala Arg Ala Leu 35 40 45 Arg Ser Arg Leu Gln Gln Leu Thr Gly Cys Arg Leu Ala Val Val Val 50 55 60 Thr Asp Thr Phe Gly Arg Pro Trp Arg Asn Gly Leu Thr Asp Val Ala 65 70 75 80 Ile Gly Ala Ala Gly Leu Ser Val Leu Glu Asp His Arg Gly Arg Thr 85 90 95 Asp Ser His Gly Asn Glu Leu Val Leu Thr Val Thr Ala Thr Ala Asp 100 105 110 Glu Leu Ala Ala Ala Ala Asp Leu Val Lys Gly Lys Ala Thr Gly Val 115 120 125 Pro Val Ala Ile Val Arg Gly Leu Gly His Leu Val Thr Ala Glu Asp 130 135 140 Gly Ala Gly Thr Arg Pro Leu Val Arg Ala Ala Ala Asp Asp Met Phe 145 150 155 160 Arg Leu Gly Thr Ser Glu Ala Leu Arg Gln Ala Val Thr Leu Arg Arg 165 170 175 Thr Val Arg Ser Phe Thr Thr Asp Pro Val Asp Pro Ala Ala Val Arg 180 185 190 Arg Ala Val Ala Ala Ala Val Thr Ala Pro Ala Pro His His Thr Thr 195 200 205 Pro Trp Arg Phe Val Leu Leu Glu Ser Ala Gly Thr Arg Val Arg Leu 210 215 220 Leu Asp Ala Met Leu Gly Ala Trp Gln Arg Asp Leu Arg Glu Leu Asp 225 230 235 240 Gly Trp Asp Glu Ala Arg Ile Ala Arg Arg Thr Ala Arg Gly Asp Val 245 250 255 Leu Arg Asp Ala Pro Tyr Leu Val Val Pro Cys Leu Val Met Asp Gly 260 265 270 Ser His Asp Tyr Pro Asp Pro Arg Arg Ala Ala Ala Glu Arg Glu Met 275 280 285 Phe Thr Val Ala Ala Gly Ala Gly Val Gln Asn Leu Leu Val Ala Leu 290 295 300 Thr Gly Glu Gly Tyr Gly Ser Ala Trp Val Ser Ser Thr Met Phe Cys 305 310 315 320 Arg Asp Thr Val Arg Glu Val Leu Asp Leu Pro Glu Gly Trp Asp Pro 325 330 335 Met Gly Ala Val Ala Val Gly Arg Pro Ala Glu Val Pro Arg Glu Arg 340 345 350 Arg Arg Gly Val Arg Arg Arg Ser Ser Arg Cys Gly Arg Gly Cys Cys 355 360 365 Ser Lys Gly Gly Leu Ser Gly Gly Trp Val Thr Pro Gly Arg Val Pro 370 375 380 Leu Ala Leu Val Gly 385 389
【図１】 ハイブリッドプラスミドｐＳＥ１０１の制限
酵素地図を示す。白抜きのボックス型矢印はアンピシリ
ン耐性遺伝子とチオストレプトン耐性遺伝子の位置と向
きを示している。
酵素地図を示す。白抜きのボックス型矢印はアンピシリ
ン耐性遺伝子とチオストレプトン耐性遺伝子の位置と向
きを示している。
【図２】 ハイブリッドプラスミドｐＳＥ１１９の制限
酵素地図を示す。白抜きのボックス型矢印はアンピシリ
ン耐性遺伝子とチオストレプトン耐性遺伝子の位置と向
きを示している。
酵素地図を示す。白抜きのボックス型矢印はアンピシリ
ン耐性遺伝子とチオストレプトン耐性遺伝子の位置と向
きを示している。
【図３】 組換えプラスミドｐＫＮ３１の制限酵素地図
を示す。白抜きのボックス型矢印はアンピシリン耐性遺
伝子とチオストレプトン耐性遺伝子の位置と向きを示し
ている。黒塗りのボックスがＴＣＤＨ遺伝子を含むＤＮ
Ａに相当する部分である。黒塗りのボックスは制限酵素
Sau3A 部分切断断片としてｐＳＥ１１９の制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ切断部位に組み込まれている。黒塗りのボックス
の内側に示した矢印はＴＣＤＨ遺伝子の位置と方向を示
している。
を示す。白抜きのボックス型矢印はアンピシリン耐性遺
伝子とチオストレプトン耐性遺伝子の位置と向きを示し
ている。黒塗りのボックスがＴＣＤＨ遺伝子を含むＤＮ
Ａに相当する部分である。黒塗りのボックスは制限酵素
Sau3A 部分切断断片としてｐＳＥ１１９の制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ切断部位に組み込まれている。黒塗りのボックス
の内側に示した矢印はＴＣＤＨ遺伝子の位置と方向を示
している。
【図４】 組換えプラスミドｐＫＮ２０１とｐＫＮ２０
２の制限酵素地図を示す。白抜きのボックス型矢印はア
ンピシリン耐性遺伝子とチオストレプトン耐性遺伝子の
位置と向きを示している。黒塗りのボックスがプラスミ
ドｐＫＮ３１のＴＣＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片に相当
する部分である。黒塗りのボックスはＳｐｈＩDNA 断片
としてｐＳＥ１０１の制限酵素ＳｐｈＩ切断部位に組み
込まれている。黒塗りのボックスの内側に示した矢印は
ＴＣＤＨ遺伝子の位置と方向を示している。
２の制限酵素地図を示す。白抜きのボックス型矢印はア
ンピシリン耐性遺伝子とチオストレプトン耐性遺伝子の
位置と向きを示している。黒塗りのボックスがプラスミ
ドｐＫＮ３１のＴＣＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片に相当
する部分である。黒塗りのボックスはＳｐｈＩDNA 断片
としてｐＳＥ１０１の制限酵素ＳｐｈＩ切断部位に組み
込まれている。黒塗りのボックスの内側に示した矢印は
ＴＣＤＨ遺伝子の位置と方向を示している。
ｂｌａ アンピシリン耐性遺伝子 ｔｓｒ チオストレプトン耐性遺伝子 BamHI/Sau3A 制限酵素ＢａｍＨＩ切断断片と制限酵
素Sau3A 切断断片とが連結した位置 ＢａｍＨＩ 制限酵素ＢａｍＨＩによる切断部位 ＢｃｌＩ 制限酵素ＢｃｌＩによる切断部位 ＳａｃＩ 制限酵素ＳａｃＩによる切断部位 ＢｇｌＩＩ 制限酵素ＢｇｌＩＩによる切断部位 ＨｉｎｄＩＩＩ 制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによる切断
部位 ＳｐｈＩ 制限酵素ＳｐｈＩによる切断部位 ＰｓｔＩ 制限酵素ＰｓｔＩによる切断部位 ＫｐｎＩ 制限酵素ＫｐｎＩによる切断部位 ＥｃｏＲＩ 制限酵素ＥｃｏＲＩによる切断部位
素Sau3A 切断断片とが連結した位置 ＢａｍＨＩ 制限酵素ＢａｍＨＩによる切断部位 ＢｃｌＩ 制限酵素ＢｃｌＩによる切断部位 ＳａｃＩ 制限酵素ＳａｃＩによる切断部位 ＢｇｌＩＩ 制限酵素ＢｇｌＩＩによる切断部位 ＨｉｎｄＩＩＩ 制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによる切断
部位 ＳｐｈＩ 制限酵素ＳｐｈＩによる切断部位 ＰｓｔＩ 制限酵素ＰｓｔＩによる切断部位 ＫｐｎＩ 制限酵素ＫｐｎＩによる切断部位 ＥｃｏＲＩ 制限酵素ＥｃｏＲＩによる切断部位
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１０年４月１４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】本発明におけるＴＣＤＨ遺伝子とは、前述
のＴＣＤＨの欠損形質を相補する遺伝子を示している。
本発明のＴＣＤＨ遺伝子としては、ＴＣＤＨ欠損形質を
相補するＤＮＡ断片であればいずれでもよいが、例えば
配列番号１の１９０位から１３５６位の塩基配列で表さ
れるＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし、かつテトラサイクリンデヒド
ロゲナーゼ欠損形質を相補する遺伝子を含むＤＮＡなど
があげられる。ストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズするＤＮＡとは、例えば、配列番号１記載の塩基配
列を含むＤＮＡをプローブとして、コロニーハイブリダ
イゼーション法またはプラークハイブリダイゼーション
法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・
マニュアル 第２版（Molecular Cloning : A laborato
ry manual ,second edition) コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor
Laboratory Press)1989年］などを用いることにより得
られるＤＮＡを意味する。
のＴＣＤＨの欠損形質を相補する遺伝子を示している。
本発明のＴＣＤＨ遺伝子としては、ＴＣＤＨ欠損形質を
相補するＤＮＡ断片であればいずれでもよいが、例えば
配列番号１の１９０位から１３５６位の塩基配列で表さ
れるＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし、かつテトラサイクリンデヒド
ロゲナーゼ欠損形質を相補する遺伝子を含むＤＮＡなど
があげられる。ストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズするＤＮＡとは、例えば、配列番号１記載の塩基配
列を含むＤＮＡをプローブとして、コロニーハイブリダ
イゼーション法またはプラークハイブリダイゼーション
法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・
マニュアル 第２版（Molecular Cloning : A laborato
ry manual ,second edition) コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor
Laboratory Press)1989年］などを用いることにより得
られるＤＮＡを意味する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２１】次に、ＴＣＤＨ遺伝子のクローニング方法
を以下に述べる。ＴＣＤＨ酵素活性を有する微生物、好
ましくはストレプトミセス属の微生物から、通常のＤＮ
Ａ単離方法、例えばジェネティック・マニピュレーショ
ン・オブ・ストレプトミセス：ア・ラボラトリー・マニ
ュアル(Genetic Manipulation ofStreptmyces:A Labora
tory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, 1
985) に記載の方法に従って染色体ＤＮＡを調製する。
得られたＴＣＤＨ遺伝子を含む染色体ＤＮＡとクローニ
ングベクターとを、同じ付着末端を生じる適当な制限酵
素でそれぞれ切断し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて再連
結する。該Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応混合物で適当な宿主
を形質転換し、ゲノムライブラリーを作製する。クロー
ニングベクターとしては、ｐＳＥ１１９などのハイブリ
ッドプラスミドがあげられ、宿主としては、ＪＭ１１０
（ＡＴＣＣ ４７０１３）などの大腸菌があげられる。
同じ付着末端を生じる制限酵素としては、Ｓａｕ３ＡＩ
とＢａｍＨＩ（突出末端がともに5'-GATC-3'）などがあ
げられる。
を以下に述べる。ＴＣＤＨ酵素活性を有する微生物、好
ましくはストレプトミセス属の微生物から、通常のＤＮ
Ａ単離方法、例えばジェネティック・マニピュレーショ
ン・オブ・ストレプトミセス：ア・ラボラトリー・マニ
ュアル(Genetic Manipulation ofStreptmyces:A Labora
tory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, 1
985) に記載の方法に従って染色体ＤＮＡを調製する。
得られたＴＣＤＨ遺伝子を含む染色体ＤＮＡとクローニ
ングベクターとを、同じ付着末端を生じる適当な制限酵
素でそれぞれ切断し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて再連
結する。該Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応混合物で適当な宿主
を形質転換し、ゲノムライブラリーを作製する。クロー
ニングベクターとしては、ｐＳＥ１１９などのハイブリ
ッドプラスミドがあげられ、宿主としては、ＪＭ１１０
（ＡＴＣＣ ４７０１３）などの大腸菌があげられる。
同じ付着末端を生じる制限酵素としては、Ｓａｕ３ＡＩ
とＢａｍＨＩ（突出末端がともに5'-GATC-3'）などがあ
げられる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:485）
Claims (11)
- 【請求項１】 配列番号１の１９０位から１３５６位の
塩基配列で表わされるＤＮＡ、あるいは該ＤＮＡとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつテトラ
サイクリンデヒドロゲナーゼ欠損形質を相補する遺伝子
を含むＤＮＡ。 - 【請求項２】 ＤＮＡが微生物由来である、請求項１記
載のＤＮＡ。 - 【請求項３】 微生物が、ストレプトミセス属に属する
請求項２記載のＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ
を含んでなる組換えベクター。 - 【請求項５】 請求項４記載の組換えベクターで形質転
換されるか、または組換えベクターを染色体上に組み込
んだ組換え微生物。 - 【請求項６】 ６−デメチルアンヒドロテトラサイクリ
ンを６−デメチルテトラサイクリンに変換する能力を有
する請求項５記載の組換え微生物。 - 【請求項７】 該微生物がストレプトミセス属に属する
ことを特徴とする請求項４または５記載の組換え微生
物。 - 【請求項８】 該微生物がストレプトミセス・オウレオ
ファシエンスに属することを特徴とする請求項７記載の
組換え微生物。 - 【請求項９】 請求項５〜８のいずれかに記載の微生物
を培地に培養し、培養物中にテトラサイクリン系抗生物
質を生成蓄積させ、該培養物からテトラサイクリン系抗
生物質を採取することを特徴とするテトラサイクリン系
抗生物質の製造方法。 - 【請求項１０】 請求項９記載のテトラサイクリン系抗
生物質が、クロロテトラサイクリン、テトラサイクリ
ン、デメチルクロロテトラサイクリン、デメチルテトラ
サイクリンあるいはオキシテトラサイクリンである、請
求項９記載の製造方法。 - 【請求項１１】 請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮ
Ａにより発現される蛋白質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9097232A JPH10286091A (ja) | 1997-04-15 | 1997-04-15 | テトラサイクリン生合成に関与する遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9097232A JPH10286091A (ja) | 1997-04-15 | 1997-04-15 | テトラサイクリン生合成に関与する遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10286091A true JPH10286091A (ja) | 1998-10-27 |
Family
ID=14186886
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9097232A Withdrawn JPH10286091A (ja) | 1997-04-15 | 1997-04-15 | テトラサイクリン生合成に関与する遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10286091A (ja) |
-
1997
- 1997-04-15 JP JP9097232A patent/JPH10286091A/ja not_active Withdrawn
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20040706 |