JPH0856673A

JPH0856673A - ウロポルフィリノーゲンｉｉｉメチルトランスフェラーゼをコードするｄｎａ及びこれを用いるビタミンｂ１２の生産方法

Info

Publication number: JPH0856673A
Application number: JP6227302A
Authority: JP
Inventors: Kenji Maruhashi; 健司丸橋; Tetsuhisa Yada; 哲久矢田; Kimiko Watanabe; 君子渡邉; Takaaki Amari; 崇皓甘利
Original assignee: Nippon Oil Corp
Current assignee: Eneos Corp
Priority date: 1994-08-29
Filing date: 1994-08-29
Publication date: 1996-03-05

Abstract

(57)【要約】【構成】プロピオン酸菌由来のウロポルフィリノーゲ
ンIII メチルトランスフェラーゼをコードするDNA （配
列表配列番号１）。この遺伝子をプロピオン酸菌に導入
して遺伝子工学的手法によりビタミンＢ₁₂を生産する方
法。【効果】上記方法によりビタミンＢ₁₂の産生をいちじ
るしく向上し、工業的に量産することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ビタミンＢ₁₂の生合成
に関係するウロポルフィリノーゲンIII メチルトランス
フェラーゼをコードするDNA 、これを含有するプラスミ
ド及びこのプラスミドを導入した微生物に関する。さら
に本発明は、このウロポルフィリノーゲンIII メチルト
ランスフェラーゼをコードするDNA を用い、遺伝子工学
的手法によりビタミンＢ₁₂を工業的に大量に生産する方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ビタミンＢ₁₂は抗悪性貧血剤、末梢神経
治療剤、総合ビタミン剤などの医療用途および飼料添加
物として重要なビタミンである。工業的な製造法は、ビ
タミンＢ₁₂の構造の複雑さから全量発酵法で行われてい
る。従来、ウロポルフィリノーゲンIII メチルトランス
フェラーゼをコードするDNA 配列は、大腸菌のCysG遺伝
子として、またバチルスメガテリウム (Bacillusmegat
erium) 〔(Journal of Biotechnology,173 (15) 4893
(1991) 〕、メタノバクテリウムバノビ (Methanobact
erium ivanovii) 〔同誌, 173 (15) 4637(1991)〕あ
るいはシュードモナスデニトリフィカンス(Pseudomon
as denitrificans)〔同誌, 172 (10) 5980 (1991)〕で
単離されている。しかし、ビタミンＢ₁₂の高生産菌であ
るプロピオバクテリウムシャーマニー(Propionibacte
riumshermanii)ではそのDNA はまだ単離されておらず、
従ってこの遺伝子を用いてビタミンＢ₁₂を大量に増産さ
せようとすることも行なわれていない。

【０００３】このようにビタミンＢ₁₂の高生産菌である
プロピオニバクテリウムシャーマニーのビタミンＢ₁₂
生合成遺伝子は、ウロポルフィリノーゲンIII メチルト
ランスフェラーゼをコードする遺伝子を含めていまだ単
離されておらず、これを用いる遺伝子操作系も確立して
いない。従って、遺伝子操作によるビタミンＢ₁₂の増産
も試みられていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
状況を考慮し、ビタミンＢ₁₂の高生産菌であるプロピオ
ン酸菌から、ウロポルフィリノーゲンIII メチルトラン
スフェラーゼをコードするDNA （遺伝子）を単離し、こ
れを用いて遺伝子工学的手法によりビタミンＢ₁₂を大量
に生産することを課題としている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、プロピオ
ニバクテリウムシャーマニーにおけるビタミンＢ₁₂生
合成の律速段階の酵素がヘム経路より分岐直後のウロポ
ルフィリノーゲンIIIメチルトランスフェラーゼである
と考えられることから、当該遺伝子を活性化することに
よりこの遺伝子を単離し、これを用いて遺伝子工学的手
段によりビタミンＢ₁₂の増産を図ることを鋭意研究し
た。その結果、プロピオニバクテリウムシャーマニーに
おける遺伝子操作系を確立し、ウロポルフィリノーゲン
III メチルトランスフェラーゼをコードするDNA を単離
し、当該遺伝子を用いてビタミンＢ₁₂を増産することに
成功し、本発明に至った。すなわち、本発明は、ビタミ
ンＢ₁₂高生産菌のプロピオン酸菌からウロポルフィリノ
ーゲンIII メチルトランスフェラーゼ遺伝子を単離し、
この遺伝子をプロピオン酸菌に導入し、当該遺伝子の増
幅効果によりウロポルフィリノーゲンIIIメチルトラン
スフェラーゼを活性化することにより、ビタミンンＢ₁₂
生産菌のビタミンＢ₁₂を増産する方法である。

【０００６】次に、本発明を詳細に説明する。まず、ウ
ロポルフィリノーゲンIII メチルトランスフェラーゼを
プロピオン酸菌より単離・精製し、その蛋白のアミノ基
末端の配列を決定し、その配列を基にPCR 法(Science,
239, 487 (1988))等により当該酵素遺伝子の一部分を増
幅させ、それをプローブとして用いてプロピオン酸菌の
染色体ライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーシ
ョン法によりウロポルフィリノーゲンIII メチルトラン
スフェラーゼをコードする遺伝子をクローン化する。

【０００７】ウロポルフィリノーゲンIII メチルトラン
スフェラーゼのプロピオン酸菌からの単離精製は、通常
の蛋白の精製単離法によりおこなうことができる。活性
の測定は、該酵素がウロポルフィリノーゲンIII をモノ
メチル化、ジメチル化する酵素であることより、基質で
あるウロポルフィリノーゲンIII の減少および生成物で
あるウロポルフィリノーゲンIII のモノ、ジメチル体の
生成を高速液体クロマトグラフィーによって測定するこ
とにより行なうことができる。

【０００８】ウロポルフィリノーゲンIII メチルトラン
スフェラーゼをコードするDNA 断片のクローン化は、こ
の酵素のアミノ酸配列の情報をもとに通常の方法で行な
うことができる。すなわち、プロピオン酸菌の場合に
は、単離されたウロポルフィリノーゲンIII メチルトラ
ンスフェラーゼのアミノ基末端の配列より、ＧＣ含量が
約７０％と高いのを考慮して〔J. Bacteriol. 109,1047
(1972)〕、何種類かの両向きのプライマーを合成しPCR
法その他の方法によってウロポルフィリノーゲンIII メ
チルトランスフェラーゼ遺伝子の一部分のDNA 断片を増
巾する。次いで、これをプローブとして、ウロポルフィ
リノーゲンIII メチルトランスフェラーゼ全体をコード
するDNA 断片を、大腸菌等を用い通常のコロニーハイブ
リダイゼーション法によりクローン化する。

【０００９】次に、プロピオン酸菌におけるベクターは
次のようにして創製することができる。ベクターの要件
であるプロピオン酸菌中で複製可能なレプリコンとして
は、種種のプロピオン酸菌中より抽出される固有のプラ
スミドを用いることができる。好ましくはプロピオニバ
クテリウムペントサセウム(Propionibacterium pent
osaceum)より抽出されるプラスミドpTY1をあげることが
できる（図１参照）。また選択マーカーとしては、大腸
菌、枯草菌、放線菌などで使われる抗生物質耐性マーカ
ーをプロピオン酸菌でも用いることができる。好ましく
は、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性、テ
トラサイクリン耐性等をあげることができる。具体的に
は、大腸菌、枯草菌，放線菌等に由来する抗生物質耐性
遺伝子の上流に、プロピオン酸菌中で発現可能ならしめ
るプロピオン酸菌由来のプロモーターを配置し、該遺伝
子を発現させることにより行う。以上の条件を満たすプ
ラスミドであればいずれのものでもプロピオン酸菌用の
ベクターとして用いることができるが、好ましくはプラ
スミドpTY10024を例示することができる（図３参照）。
得られたプラスミドpTY10024を用いて、ウロポルフィリ
ノーゲンIII メチルトランスフェラーゼ遺伝子をプロピ
オン酸菌中で発現させるには、プロピオン酸菌由来のプ
ロモーターの支配下にウロポルフィリノーゲンIII メチ
ルトランスフェラーゼ遺伝子を配置し、プラスミドpTY1
0024のクローニングサイトに連結してやればよい。この
ようなプラスミドとして好ましくはプラスミドpNC202を
例示することができる（図４参照）。

【００１０】プロピオン酸菌の形質転換法は、通常の方
法すなわち、コンピテントセル法、プロトプラスト法、
エレクトロポレーション法などで行うことができる。

【００１１】本発明は、ウロポルフィリノーゲンIII メ
チルトランスフェラーゼ遺伝子を用いて、プロピオン酸
菌、特にプロピオニバクテリウムシャーマニーのビタ
ミンＢ₁₂の生産量を向上させる。すなわち、クローン化
したウロポルフィリノーゲンIII メチルトランスフェラ
ーゼ遺伝子をプロピオン酸菌用のプロモーターで発現で
きるようにした状態でベクターに連結し、プロピオン酸
菌に導入して、ビタミンＢ₁₂の高生産微生物を得る。こ
の微生物の培養は、嫌気条件下、導入した遺伝子の発現
に適当な条件で培養することができる。培養物からビタ
ミンＢ₁₂を得るには、通常の方法、例えば、菌体より80
℃以上の熱水で抽出し、菌体を分離後、シアン化し、カ
ラムクロマト、晶析などを行い得ることができる。ビタ
ミンＢ₁₂の定量は、培養菌体を集菌後、熱水抽出し、シ
アンイオンでシアン化後、シアノコバラミンとして高速
液体クロマトグラフィーで定量できる。

【００１２】以下、本発明を実施例により詳細に説明す
る。

【実施例１】ウロポルフィリノーゲンIII メチルトランスフェラーゼ
の精製単離プロピオニバクテリウムシャーマニーの種菌〔NOC 11
012 (FERM BP-86)〕を表１の組成の培地2.5Lを含む5L発
酵槽に植菌（２％）して、pHをアルカリで6.5に連続調
整し、グルコースを15g/L の一定レベルに調節して、窒
素通気の嫌気条件下で３日間撹拌培養した。

【００１３】

【表１】コーンスティープリカー(CSL) 80g グルコース 15g バントテン酸カルシウム 10mg ニコチン酸アミド 30mg Na₂HPO₄・12H₂O 1.5g KH₂PO₄ 0.4g Co(NO₃)₂・6H₂O 45mg ZnSO₄・7H₂O 10mg 消泡剤 (BC-51Y) 100mg 水 1L

【００１４】得られた培養液17L を遠心分離して850gの
湿菌体を得た。この湿菌体をpH6.8の50mMリン酸カリウ
ム緩衝液3.5Lに懸濁して20分間超音波処理した。遠心分
離後、上澄みを硫酸アンモニウム飽和の30％および60％
の間で沈殿する蛋白を集め、pH6.8 の50mMリン酸カリウ
ム緩衝液(0.5mMジチオトレイトール(DTT),10％エチレン
グリコール(EG)に溶解しゲル濾過カラムスーパーロース
(Superose 12) にかけ、目的画分を該酵素活性をHPLCで
測定して分画した。つぎにpH6.8 の20mMビストリスプロ
パン(0.5mM DTT, 10％ EG)に再溶解させアフィニティー
カラム(MatrexBlue B) にかけて、1M NaCl 含有のpH6.8
の20mMビストリスプロパン(0.5mM DTT, 10％ EG)で溶
離させた。さらにpH6.8 の20mMビストリスプロパン(0.5
mM DTT,10％ EG)に溶解後、陰イオン交換カラム(Mono
Q)にかけ、pH6.8 の20mMビストリスプロパン(0.5mM DT
T, 10％ EG)に対して1MのNaClで 0％から100 ％のグラ
ジエントをかけて溶出した。この陰イオンカラムを再度
繰り返して行った。精製工程における収率、比活性を表
２に示す。

【００１５】

【表２】

【００１６】なお、ウロポルフィリノーゲンIII メチル
トランスフェラーゼの活性測定は次のようにして行っ
た。反応組成物として、5mM のＳ−アデノシルメチオニ
ン、1mM のEDTA、1mM の還元型グルタチオン、0.5mg の
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)、
1mgのATP 、0.16mgのシステイン塩酸塩、25mgのジチオ
ネイトNa塩を含む1mLの100mM リン酸カリウム緩衝液に
酵素蛋白2mg を溶解し、窒素でバブリングして還元状態
にした後、基質である87mMのウロポルフィリノーゲンII
I 液1mL を添加して、35℃、17時間の反応を行った。ウ
ロポルフィリノーゲンIII 液の調製は、ウロポルフィリ
ンIII を0.025NKOH に溶解し、暗所でナトリウムアマル
ガムで還元した後、KH₂PO₄で中和することにより行っ
た。反応後は、0.4mL の6NHCl を添加し、100 ℃に 5
分間加熱し、反応を止めた。その後、遠心分離を行いそ
の上澄みをHPLCで分析した。HPLC条件は、C18 のODS カ
ラムを用いて、5mM 硫酸水素テトラブチルアンモニウム
/ メタノール(52:48) で展開し、403nm の吸収によりウ
ロポルフィリノーゲンIII のモノメチル体、ジメチル体
を測定した。

【００１７】

【実施例２】ウロポルフィリノーゲンIII メチルトランスフェラーゼ
遺伝子のクローン化ウロポルフィリノーゲンIII メチルトランスフェラーゼ
遺伝子のクローン化は、当該酵素のアミノ酸配列をもと
にプライマーを合成し、これを用いてPCR 法により当該
酵素のDNA の一部断片を増幅させた後、コロニーハイブ
リダイゼーション法により当該酵素遺伝子の全領域を含
むDNA 断片をクローン化した。すなわち、実施例１によ
り精製単離されたウロポルフィリノーゲンIII メチルト
ランスフェラーゼのＮ末端配列を (株) アプライドバイ
オシステムズのアミノ酸シーケンサー471 A 型を用いて
決定し、最初の30個のアミノ酸を以下のように決定し
た。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Thr Thr Thr Leu Leu Pro Gly Thr Val Thr Leu Val Gly Ala Gly Pro Gly 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Asp Pro Glu Leu Val Thr Val Ala Gly Leu Arg Ala Val

【００１８】この12番目のVal から21番目のLeu にかけ
ての10個のアミノ酸に対応するDNAを以下のように合成
した。29マーで、コドンの 3番目の変化に対して何種類
かの候補を考慮し、全体で 8種類の混合物として合成
し、PCR 法用のプラスプライマーとした。

【００１９】マイナスプライマーとしては、当該酵素の
ドメイン部分と考えられアミノ酸配列の保存性が高いと
思われる、Ｎ末端より92番目から98番目の次のアミノ酸
配列を基に、21マーのDNA を合成した。

【００２０】次に、これらのプライマー用いて、プロピ
オニバクテリウムシャーマニーの染色体DNA より当該
酵素遺伝子の一部分の断片をPCR 法で増幅させたとこ
ろ、約250bp の断片が増幅してきた。この断片の長さは
プライマーで挟まれた約86アミノ酸残基に対応するDNA
の長さであった。

【００２１】この増幅された約250bp 断片をプローブと
して、プラスミドpBR322のBamHI サイトにプロピオニバ
クテリウムシャーマニーの染色体DNA を制限酵素BamH
I で消化した断片を挿入したライブラリーを作製し、コ
ロニーハイブリダイゼーション法により、当該酵素遺伝
子のクローン化を行った。すなわち、プロピオニバクテ
リウムシャーマニーの染色体DNA のpBR322によるライ
ブラリー 1μg を0.1MCaCl₂で30分間処理した 1×10⁹
個のE.coliRR１株に導入し、 100μg/mlアンピシリン含
有LB (Luria-Bertani's broth)プレートにまき、37℃で
培養し、コロニーを生育させた。生育したコロニーを0.
5M NaOH で変成させた後、ナイロンフィルターにコロニ
ーのDNA を移入させた。このフィルター上のDNA と250b
p のプローブとを、ベーリンガーマンハイム社製、ノン
ラジオ核酸標識検出キット(DIG-DNA Labeling Kit)を用
いてサザンハブリダイゼーションを行い、目的の遺伝子
が導入されたコロニーを特定し、当該遺伝子を得た。ク
ローン化されたBamHI-BamHI 断片は約3.5kb の長さであ
った。この断片上のウロポルフィリノーゲンIII メチル
トランスフェラーゼ遺伝子の位置をサザンハイブリダイ
ゼーション法により特定した後、その特定された約1.2k
b のBamHI-EcoRI 断片の塩基配列を決定し、当該酵素遺
伝子の配列を決定した（図５）。当該酵素遺伝子は771b
p であった。

【００２２】

【実施例３】ウロポルフィリノーゲンIII メチルトランスフェラーゼ
遺伝子のプロピオニバクテリウムシャーマニー中での
発現プロピオニバクテリウムシャーマニー用のベクターpTY1
0024を以下のようにして調製した。複製必須領域用の部
分としてプロピオニバクテリウムペントサセウム IF0
12425 より内在性プラスミドpTY1（図１参照）を通常の
アルカリ抽出法で抽出し、そのBamHI サイトに大腸菌用
のプロモータ検索用ベクターpKK232-8(Gene, 27.151(19
84),図２参照）の制限酵素BamHI 消化物を連結した。

【００２３】次にマーカーとしてプラスミドpKK232-8上
のクロラムフェニコール耐性遺伝子(CAT遺伝子) をプロ
ピオニバクテリウムシャーマニーの中で発現させるた
めのプロモーターを、プロピオニバクテリウムシャー
マニーの染色体DNA ライブラリーよりスクリーニングし
た。すなわち、CAT 遺伝子の上流にあるマルチクローニ
ングサイト中のHind IIIサイトをBgl IIサイトに変えた
ものを用いて、そのBgl IIサイトにプロピオニバクテリ
ウムシャーマニーの染色体DNA を制限酵素Sau3A で消
化したものを連結してスクリーニングを行い、約60bpの
プロモーター活性を有する断片が挿入されたプラスミド
を得た(pTY10024, 図３参照）。

【００２４】次に、プラスミドpTY10024マルチクローニ
ングサイト中のSmaIサイトをEcoRVサイトに変換し、そ
のEcoRV サイトにウロポルフィリノーゲンIII メチルト
ランスフェラーゼ遺伝子を含む実施例２で得られた約1.
2kb のBamHI-EcoRI 断片を挿入し、プラスミドpNOC202
を作製した（図４参照）。ウロポルフィリノーゲンIII
メチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は、プラスミド
pTY1部分のプロモーターからのリードスルーで行った。

【００２５】得られたプラスミドpNOC202 をエレクトロ
ポレーション法（バイオラッド製、ジーンバルサー装
置）によりプロピオニバクテリウムシャーマニーの菌
体中に導入した。この導入は、まずプロピオニバクテリ
ウムシャーマニーの種菌を次の表３の組成のLL培地10mL
を含む試験管に植菌し、一晩静置培養した。培養ブロス
（OD₆₁₀＝１〜２）より集菌後、10％グリセロールで２
回洗浄し、OD₆₁₀＝２〜５になるように10％グリセロー
ルに再懸濁した。

【００２６】

【表３】酵母エキス 8.5g トマトジュース末 3.7g ペプトン 8.5g Tween 80 1.0g ブドウ糖 11g 水 1L KH₂PO₄ 2g pH 6.5

【００２７】次に、この懸濁液40μL にプラスミドpNOC
202 含有のTE(10mM Tris-HCl(pH7.5)-1mM EDTA) バッフ
ァー液 2μL を混合し、氷冷したキュベットに移し、電
気パルスをかけた。この条件は電圧：2.5Kv 、キャパシ
ター：25μF 、レジスター：200 Ωであった。電気パル
スをかけた後はすばやく1mL のLL培地を添加し、30℃、
１時間静置後、クロラムフェニコール含有LLプレートに
まいた。このプレートを 7〜14日間嫌気培養し、出現し
たコロニーを取得した。取得したコロニー（形質転換
体）のウロポルフィリノーゲンIII メチルトランスフェ
ラーゼの活性は、実施例１の方法により測定した。その
結果、形質転換体の当該酵素活性は1.9 ×10⁶カウント
／蛋白mgで元株の0.9 ×10⁶カウント／蛋白mgと比較し
て約２倍高くなっていた。

【００２８】

【実施例４】形質転換体のビタミンＢ₁₂の生産取得した形質転換体のビタミンＢ₁₂の評価培養は、表４
の組成のCSL 培地を用いて行った。

【００２９】

【表４】 CSL 80g KH₂PO₄ 0.4g グルコース 15g (コントロール) Co(NO₃)₂・6H₂O 45mg パントテン酸カルシウム 10mg BC-51Y 100mg ニコチン酸アミド 30mg 5,6ジメチルベンズイミダゾール(DBI) 20mg(４日目添加） Na₂HPO₄ ・12H₂O 1.5g 水 1L

【００３０】2.5Lの発酵槽中CSL 培地1.2Lを入れ、CSL
培地で前培養した前培養液 (フラスコ培養) から２％植
菌した。培養温度は30℃で、pHはアルカリ(2N-Na₂CO₃+3
N-NH₄OH)で6.5 に連続調整し、培養４日目までは窒素通
気(1/40vvm) で撹拌し(180rpm)、DBI 添加以後は空気通
気(1/20vvm) に切り替え、撹拌速度を上げた(400rpm)。
培養７日間行った。

【００３１】ビタミンＢ₁₂の定量は、培養生成物である
補酵素型Ｂ₁₂をシアン化してシアノＢ₁₂としてHPLCで行
った。培養液からサンプリング後、遠心分離で上澄みを
除去し、同量のpH4.7 の酢酸緩衝液に再懸濁したのち同
量のKCN 液(1mg/L) を加え、85℃、15分間加熱抽出し
た。次に遠心分離後、上澄みを採取し、蛍光灯下、2 時
間光照射し、シアン化した。シアン化液をHPLCにかけ、
シアノＢ₁₂を定量した。HPLC条件は、C18 のODS カラム
を用いて、pH3.7 酒石酸−リン酸緩衝液：アセトニトリ
ル＝88.2:11.8 の移動相で361nm で検出した。ウロポル
フィリノーゲンIII メチルトランスフェラーゼ遺伝子を
導入した形質転換体の2.5L発酵槽でのビタミンＢ₁₂生産
量は115mg/L となった。これに対し、元株を同様に培養
した場合のビタミンＢ₁₂の生産量は88mg/Lであり、本発
明による組換え菌株を使用した場合が元株を使用した場
合よりビタミンＢ₁₂の生産量が約30％増加した。

【００３２】本発明ではこのようにして得られる上澄み
をビタミンＢ₁₂として用いてもよいし、また通常の方法
で上澄みを濃縮しビタミンＢ₁₂を精製単離してもよい。

【００３３】

【発明の効果】本発明によるとプロピオン酸菌由来のウ
ロポルフィリノーゲンIII メチルトランスフェラーゼを
コードするDNA を提供することができる。また、プロピ
オン酸菌で発現することができる発現シグナル、抗生物
質耐性遺伝子及びウロポルフィリノーゲンIII メチルト
ランスフェラーゼをコードするDNA よりなるプラスミド
を作成し、これでプロピオン酸菌を形質転換し、培養す
ることによってビタミンＢ₁₂を高収率に産生させること
ができる。

【００３４】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：774 配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：gemomic DNA 起源生物名：プロピオニバクテリウムシャーマニー(Propionibacterium shermanii) 配列 ATG ACC ACC ACA CTG TTG CCC GGC ACT GTC ACC CTC GTC GGC GCC GGG 48 Met Thr Thr Thr Leu Leu Pro Gly Thr Val Thr Leu Val Gly Ala Gly 1 5 10 15 CCC GGC GAC CCT GAA CTC GTC ACC GTG GCC GGC CTG CGG GCC GTG CAG 96 Pro Gly Asp Pro Glu Leu Val Thr Val Ala Gly Leu Arg Ala Val Gln 20 25 30 CAG GCC GAG GTG ATC CTC TAC GAC CGG CTC GCC CCG CAG GAC CTG CTG 144 Gln Ala Glu Val Ile Leu Tyr Asp Arg Leu Ala Pro Gln Asp Leu Leu 35 40 45 TCG GAG GCG TCC GAC GAC GCC GAA CTC GTG CCG GTC GGC AAG ATC CCG 192 Ser Glu Ala Ser Asp Asp Ala Glu Leu Val Pro Val Gly Lys Ile Pro 50 55 60 CGC GGC CAC TAT GTG CCC CAG GAG GAG ATC AAC CAA CTG CTC GTC GCG 240 Arg Gly His Tyr Val Pro Gln Glu Glu Ile Asn Gln Leu Leu Val Ala 65 70 75 80 CAC GCC CGC GAG GGC CGC AAG GTG GTG CGC CTC AAG GGT GGC GAC TCG 288 His Ala Arg Glu Gly Arg Lys Val Val Arg Leu Lys Gly Gly Asp Ser 85 90 95 TTC GTC TTC GGG CGT GGC GGC GAG GAA TGG CAG GCC TGC GCC GAG GCC 336 Phe Val Phe Gly Arg Gly Gly Glu Glu Trp Gln Ala Cys Ala Glu Ala 100 105 110 GGC ATC CCG GTG CGC GTG ATC CCG GGA GTC TCC TCG GCC ACC GCG GGC 384 Gly Ile Pro Val Arg Val Ile Pro Gly Val Ser Ser Ala Thr Ala Gly 115 120 125 CCG GCG CTG GCC GGC ATC CCG CTG ACC CAT CGC CAC CTG GTG CAG GGG 432 Pro Ala Leu Ala Gly Ile Pro Leu Thr His Arg His Leu Val Gln Gly 130 135 140 TTC ACC GTC GTG TCG GGG CAT GTA TCG CCC AGC GAC GAG CGC TCC GAG 480 Phe Thr Val Val Ser Gly His Val Ser Pro Ser Asp Glu Arg Ser Glu 145 150 155 160 GTG CCA TGG CGC CAA CTC GCC AAG GAC CGG CTC ACG CTG GTG ATC CTG 528 Val Pro Trp Arg Gln Leu Ala Lys Asp Arg Leu Thr Leu Val Ile Leu 165 170 175 ATG GGC GTG GCC CAT ATG CGC GAC ATC GCG CCG GAA TTG ATG GCC GGC 576 Met Gly Val Ala His Met Arg Asp Ile Ala Pro Glu Leu Met Ala Gly 180 185 190 GGG CTG CCT GCC GAC ACC CCC GTG CGC GTG GTG AGC AAT GCG AGC CTG 624 Gly Leu Pro Ala Asp Thr Pro Val Arg Val Val Ser Asn Ala Ser Leu 195 200 205 GCC AGC CAG GAA TCG TGG CGC ACC ACG CTG GGC GAT GCC GTG GCC GAC 672 Ala Ser Gln Glu Ser Trp Arg Thr Thr Leu Gly Asp Ala Val Ala Asp 210 215 220 ATG GAC GCG CAC CAC GTG CGT CCG CCC GCG CTG GTG GTG GTG GGT ACC 720 Met Asp Ala His His Val Arg Pro Pro Ala Leu Val Val Val Gly Thr 225 230 235 240 CTG GCC GGC GTC GAC CTG TCG CAT CCC GAC CAT CGC GCG CCC AGC GAC 768 Leu Ala Gly Val Asp Leu Ser His Pro Asp His Arg Ala Pro Ser Asp 245 250 255 CAC TGA 774 His ***

【００３５】配列番号：２配列の長さ：３０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Thr Thr Thr Leu Leu Pro Gly Thr Val Thr Leu Val Gly Ala Gly Pro 5 10 15 Gly Asp Pro Glu Leu Val Thr Val Ala Gly Leu Arg Ala Val 20 25 30

【００３６】配列番号：３配列の長さ：７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Lys Gly Gly Asp Ser Phe Val 1 5

【００３７】配列番号：４配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA 配列の特徴：1-29 primer bind

【００３８】配列番号：５配列の長さ：21 配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成 DNA 配列の特徴：1-21 primer bind

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドpTY1の制限酵素地図を示す。

【図２】プラスミドpKK232-8を示す。図中、CAT はクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、
APR はアンピシリン耐性遺伝子、T はターミネーター、
ori はプラスミドpBR322由来のオリジンを示す。

【図３】プラスミドpTY10024を示す。図中、P はプロモ
ーターを示す。CAT,APR,T,oriは図１と同様の意味で用
いられる。

【図４】プラスミドpNOC202 を示す。図中、SUMTはウロ
ポルフィリノーゲンIII メチルトランスフェラーゼ遺伝
子を示し、プラスミドpTY1上のP(プロモーター) の矢印
はその向きを示す。CAT,APR,P,T,ori は図１及び図３と
同様の意味で用いられる。

【図５】ウロポルフィリノーゲンIII メチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子の塩基配列とそれに対応するアミノ酸配
列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者甘利崇皓神奈川県横浜市中区千鳥町８番地日本石油株式会社中央技術研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ウロポルフィリノーゲンIII メチルトラ
ンスフェラーゼをコードするDNA 。
【請求項２】プロピオン酸菌由来のウロポルフィリノ
ーゲンIII メチルトランスフェラーゼをコードするDNA
。
【請求項３】配列表配列番号１記載のウロポルフィリ
ノーゲンIII メチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列
をコードするDNA 。
【請求項４】プロピオン酸菌での発現シグナルのコン
トロール下に配置されている請求項１記載のDNA 。
【請求項５】プロピオン酸菌で発現することのできる
プロモーター、抗生物質耐性遺伝子及びウロポルフィリ
ノーゲンIII メチルトランスフェラーゼをコードするDN
A を含有するプラスミド。
【請求項６】プラスミドがプラスミドpNOC 202である
請求項５記載のプラスミド。
【請求項７】請求項５または６記載のプラスミドでプ
ロピオン酸菌を形質転換して得られるビタミンＢ₁₂産生
プロピオン酸菌形質転換体。
【請求項８】プロピオン酸菌がプロピオニバクテリウ
ムシャーマニー(Propionibacterium shermanii)であ
る請求項７記載の形質転換体。
【請求項９】請求項７〜８記載のいずれかの形質転換
体を培地中で嫌気条件下に培養し、培養液中にビタミン
Ｂ₁₂を産生せしめ、これを採取することを特徴とするビ
タミンＢ₁₂の生産方法。