JP2020189825A - 生理活性を持つボツリヌス神経毒素の調製方法及び多層多相ナノ粒子 - Google Patents
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Abstract
【課題】生理活性を持つボツリヌス神経毒素の調製方法及び経皮送達のための多層多相ナノ粒子の提供。【解決手段】動物由来成分を含まない発酵培地でボツリヌス菌を発酵させ、発酵培地を陰イオン交換培地スラリーと接触させ、遠心分離によりボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を得、この上澄み液を透析してボツリヌス神経毒素を含む透析溶液を収集し、透析後の溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させ、その溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させて溶出液を収集する。また、上記のボツリヌス神経毒素及び/又はヒアルロン酸などの活性分子が含まれる、最内層の水相コア又は油相コア、水相層、油相層、及び最外層のクリーム層を含み、水相層と油相層は交互にカプセル化された、経皮送達のための多層多相ナノセル粒子も提供する。【選択図】なし
Description
本発明は、タンパク質の調製および経皮送達の分野に関し、より具体的には、ボツリヌス神経毒素Aの調製と、ボツリヌス神経毒素Aを含有するナノカプセル化された生体分子および他の高分子量生体分子の経皮送達に関する。
ボツリヌス毒素は、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)によって産生される神経毒素であり、ボツリヌス菌は、植物、土壌、水、および動物の腸で一般的に見られるグラム陽性胞子形成嫌気性菌である。ボツリヌス菌の抗原性に応じて、7種類(A、B、C、D、E、F、G)に分類することができる。すべての血清型は、神経筋接合部での主要な神経伝達物質であるアセチルコリンの放出を遮断することにより、筋肉を麻痺させて神経伝達を妨げる。今日、ボツリヌス神経毒素は、斜視、限局性ジストニア、片側顔面痙攣、さまざまな痙性ジスキネジア、頭痛、ポリープおよび多汗症など、さまざまな治療用途で重要な役割を果たし、かつその適用範囲は依然として急速に拡大している。ボツリヌス神経毒素は、顔、あご、首、胸全体の紋様、フリルおよびしわの修正、および多汗症とにきびなどのその他の皮膚科学的適用を含む、顔とボディ美容の用途でも一般的に使用される。2002年、米国食品医薬品局(FDA)は、一時的に眉間しわと見上げしわを減らすために、顔とボディ美容の用途向けにBotox(登録商標)(ボツリヌス神経毒素Aがその有効成分であるボトックス)を承認した。
得られたボツリヌス神経毒素(ボツリヌス菌完全毒素、または完全BoNT−Aとも呼ばれる)の活性は比較的低く、軽鎖と重鎖はジスルフィド結合で結合して、分子量約150kDa以上の活性を持つコア小分子ボツリヌス毒素(SM毒素または完全毒素またはヌード毒素)を形成する。図1は、ボツリヌス神経毒素の概略構造を示す。図1に示すとおり、ボツリヌス神経毒素ポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合で結合されたそれぞれ約100KDaの重(H)鎖と50KDaの軽(L)鎖を含む。ボツリヌス神経毒素Aは、ニューロンのタンパク質の加水分解により可溶性のN−エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体(SNARE)を攻撃するために使用される、特異的な酵素活性を有し、ここで、酵素活性はL鎖によって付与される。H鎖は、受容体の結合とサイトゾルへの移行に必要である。完全BoNT−Aは、非血球凝集素タンパク質および血球凝集素を含む他のタンパク質に結合して、より高い分子量(例えば、960KDa)のボツリヌス毒素複合体(BoNT−Aとも呼ばれる)を形成する。150KDa完全BoNT−A(毒性および治療効果がある)とは異なり、ボツリヌス毒素複合体に存在する関連タンパク質は非毒性であるため、薬理作用には必要ではない。
動物由来の成分を含む発酵培地でボツリヌス神経毒素を培養し、それらをヒトの治療に使用することは、当技術分野で知られている。しかしながら、動物由来の製品を使用すると、潜在的な汚染物質(例えば、動物由来の製品からのウイルス)が臨床使用のために調製されたボツリヌス毒素に入る可能性があり、それにより治療適用中のリスクが増加する可能性がある。
さらに、BoNT−A(960KDa)と完全BoNT−A(150KDa)の分子量が比較的大きいため、最も一般的な投与方法は臨床現場での注射器注射である。しかしながら、注射器注射は不便であり、使用時に痛みと不安を引き起こし、患者のコンプライアンスは低い。したがって、特に治療、皮膚病理学、および薬用化粧品の分野において、ボツリヌス神経毒素の便利かつ安全で痛みのない送達のための代替方法を開発する必要がある。例えば、注射器注射または機器を使用する他の侵襲的送達手順ではなく、手による経皮送達など、ボツリヌス神経毒素の局所適用を含む、高分子量タンパク質の非侵襲的送達方法を開発することが望ましい。
人体の皮膚には、厚さ20μmから数百μm(例えば、一部の面領域では約250μm)の角質層(SC)、表皮(ED)、および真皮などの三層構造の様々な組織および細胞層を含む。一般的に、人体の皮膚は、外皮細胞から内皮細胞までの明確なネットワーク構造を備えた三層の精緻な多層(油相−水相)nシステムとみることができる。したがって、外皮細胞から内皮細胞への精緻かつ非常に厚い障害物を通過させての、特に高分子量の生体分子の送達は非常に困難である。
本発明の開示されたボツリヌス神経毒素Aの調製方法およびナノカプセル化形態でのその経皮送達は、上記の問題の1つまたは複数ならびに当技術分野の他の問題に対処することを意図している。
本発明は、複数の態様を含み、そのうちの1つの態様は、生理活性を持つボツリヌス神経毒素を調製する方法を提供する。該方法は、
1)細菌であるボツリヌス菌を動物由来の成分を含まない発酵培地で発酵させるステップと、
2)細菌であるボツリヌス菌を含む発酵培地を陰イオン交換培地のスラリーと接触させ、かつ、ボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を遠心分離により取得するステップと、
3)上澄み液を透析し、かつ、ボツリヌス神経毒素を含む透析後の溶液を収集するステップと、
4)ボツリヌス神経毒素を含む透析後の溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
5)ステップ3)および4)を繰り返し、ボツリヌス神経毒素を含む溶出液を取得し、かつ陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
6)陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得したボツリヌス神経毒素を含む溶出液を収集するステップと、を含む。
1)細菌であるボツリヌス菌を動物由来の成分を含まない発酵培地で発酵させるステップと、
2)細菌であるボツリヌス菌を含む発酵培地を陰イオン交換培地のスラリーと接触させ、かつ、ボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を遠心分離により取得するステップと、
3)上澄み液を透析し、かつ、ボツリヌス神経毒素を含む透析後の溶液を収集するステップと、
4)ボツリヌス神経毒素を含む透析後の溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
5)ステップ3)および4)を繰り返し、ボツリヌス神経毒素を含む溶出液を取得し、かつ陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
6)陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得したボツリヌス神経毒素を含む溶出液を収集するステップと、を含む。
背景技術で説明したとおり、ボツリヌス神経毒素複合体は、比較的大きな分子量(例えば、960KDa)を持つ。高分子量のタンパク質を使用する場合、経皮送達を促進しないため、通常は注射の形を採用する。より大きな分子量(例えば、960KDa)のボツリヌス神経毒素複合体とは異なり、本発明の方法に従って得られた低分子量のボツリヌス神経毒素Aは、多くの利点を有し得る。例えば、約150KDaの分子量を有するボツリヌス神経毒素Aは、ボツリヌス神経毒素複合体と比較して20%未満の重量のみを有する。したがって、ボツリヌス神経毒素Aは、抗原性および免疫原性を著しく低下させる可能性がある。得られたボツリヌス神経毒素Aは、より大きな分子量の複合体よりも臨床使用に対して安全であり得る。さらに、得られたボツリヌス神経毒素Aはサイズが小さいため、拡散速度が高くなる可能性があり、様々な適用(例えば、限局および局所適用)で皮膚バリアを簡単に通過でき、注射器注射などの侵襲的な送達方法を回避する。
本発明によって他の非毒性タンパク質の解離から生成されたボツリヌス神経毒素Aは、150KDaのより小さな分子量を有し得る。解離したボツリヌス神経毒素Aは正に帯電し(ボツリヌス神経毒素複合体は負に帯電している)、それに応じて、本発明は、連続透析、陰イオン交換、および陽イオン交換クロマトグラフィーを使用するボツリヌス神経毒素Aの精製方法を提供する。例えば、残りの核酸不純物、その他のタンパク質不純物、およびボツリヌス神経毒素Aから解離した非毒性タンパク質のすべてを、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体と陽イオン交換クロマトグラフィー媒体を連続して使用することで、実質的に除去し、それにより、低分子量の正に帯電したボツリヌス神経毒素Aの精製が達成される(従来技術には150KDaのボツリヌス神経毒素Aの調製方法もあるが、本発明の方法は技術的に異なる)。
さらに、従来技術において、ボツリヌス神経毒素は、動物由来の成分を含む発酵培地で培養され、かつ、それがヒトの治療に使用される。しかしながら、本発明のチームは、動物由来の製品を使用すると、潜在的な汚染物質(例えば、動物由来の製品からのウイルス)が臨床使用のために調製されたボツリヌス毒素に入る可能性があり、それにより治療適用中のリスクが増加する可能性があることを研究で発見した。本発明は、発酵培地に動物由来の成分を使用せず、それにより、動物源による調製物の潜在的な汚染を回避し、したがって、本発明の方法により得られるボツリヌス神経毒素はより安全である。
好ましくは、動物由来の成分を含まない発酵培地は、植物ペプトンを含む。
好ましくは、動物由来の成分を含まない発酵培地は、デキストロース、酵母抽出物、および自己分解酵母スラッジの少なくとも1つをさらに含む。
好ましくは、植物性ペプトンは、大豆、ジャガイモ、または米の少なくとも1つから得られる。
好ましくは、ステップ2)において、ボツリヌス菌を含む発酵培地の収穫時に酸を加えて酸性スラッジを形成して沈殿させる。
本発明は、収穫時に酸性スラッジ形成を行って発酵培地を酸性化することにより、標的タンパク質とするボツリヌス神経毒素Aの抽出を開始することをさらに含むことができる。
好ましくは、ステップ2)とステップ3)との間に、さらに、
細菌であるボツリヌス菌を含む発酵培地を陰イオン交換培地スラリーと接触させるステップを繰り返し、かつ、遠心分離によりボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を得ること、
発酵培地を陰イオン交換培地スラリーと繰り返し接触させることにより得られたボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を混合すること、を含む。
細菌であるボツリヌス菌を含む発酵培地を陰イオン交換培地スラリーと接触させるステップを繰り返し、かつ、遠心分離によりボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を得ること、
発酵培地を陰イオン交換培地スラリーと繰り返し接触させることにより得られたボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を混合すること、を含む。
好ましくは、ステップ5)は、さらに、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから得られたボツリヌス神経毒素を含む溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させる前に、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから得られたボツリヌス神経毒素の溶出液を透析することを含む。
好ましくは、ボツリヌス神経毒素は、ボツリヌス神経毒素Aである。
好ましくは、ボツリヌス神経毒素Aの生物学的比活性は、マウスLD50を用いて測定して、100〜400 unit/ngである。
好ましくは、ステップ6)の後、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから得られたボツリヌス神経毒素を含む溶出液を、エチレングリコール、グリセリン、およびプロピレングリコールを含む安定剤と混合することをさらに含む。
高分子量ボツリヌス神経毒素と比較した低分子量ボツリヌス神経毒素の生物活性の安定性は比較的低いため、本発明は、保存中の安定剤製剤を最適化し、本発明は、広範な研究の後、安定剤としての既存の単一エチレングリコールと比較して、エチレングリコール+グリセリン+プロピレングリコールの組み合わせを使用すると、効果の著しい改善が見られた。
好ましくは、安定剤は、エチレングリコール、グリセリン、およびプロピレングリコールを含み、溶出液への添加後の安定剤の濃度は、総体積に基づいて10〜30(w/v)%の範囲である。
好ましくは、安定剤において、
溶出液に添加された後のエチレングリコールの濃度は、5〜20(w/v)%の範囲であり、
溶出液に添加された後のグリセリンの濃度は、1〜10(w/v)%の範囲であり、
溶出液に添加された後のプロピレングリコールの濃度は、1〜5(w/v)%の範囲である。
溶出液に添加された後のエチレングリコールの濃度は、5〜20(w/v)%の範囲であり、
溶出液に添加された後のグリセリンの濃度は、1〜10(w/v)%の範囲であり、
溶出液に添加された後のプロピレングリコールの濃度は、1〜5(w/v)%の範囲である。
本発明の別の態様は、多層多相ナノ粒子(ナノセル顆粒またはナノ粒子と略される)を提供する。該ナノ粒子は、最内層の水相コアまたは油相コア、複数の水相層、複数の油相層、および最外層のクリーム層を含み、複数の水相層のそれぞれおよび複数の油相層のそれぞれは、水相コアまたは油相コアを交互に囲み、水相と油相が互い違いになった多層多相ナノ粒子を形成する。水相コアおよび水相層には、生体分子を含み、生体分子は、ボツリヌス神経毒素および/またはヒアルロン酸などの水溶性分子を含む。油相コアおよび油相層には、油溶性分子を含む。
本発明の多層多相ナノ粒子は、図5A/Bに示すとおり、水相と油相が交互にカプセル化された構造を有する(本発明の層の数は、出願人の先の出願の数よりも多く、図8Fに示すとおり、本発明の実施例では8層を含む製品の調製が成功した)。該構造は、3次元の微細な多層(油相−水相)nシステムなど、多層の人間の皮膚構造と人間の細胞構造をシミュレートする多層ナノセル構造(すなわち、水相、油相が積み重ねられる)である。このような多層多相ナノ粒子は、内皮細胞への活性成分の輸送および送達を促進することができる。例えば、皮膚または細胞構造の水層にある場合、水層中の水溶性活性物質が溶解され、該水層から除去された残りのナノ粒子は油相層に浸透し続け、その時点で油相層中の油溶性活性物質(選択的に添加または非添加)が溶解され、このように層ごとに深層まで浸透することができ、高分子物質が経皮送達しにくいという技術的問題が解決される。また、各水相または油相層には、内層と同じまたは異なる活性成分分子が含まれる可能性がある。異なる治療法、薬用化粧品、およびその他の用途向けに異なる活性成分を含む2層以上を備えた多機能ナノセルが製造される。
好ましくは、多層多相ナノ粒子の平均サイズは1〜200ナノメートルである。
好ましくは、水性または油相コアの平均サイズは1〜200ナノメートルの範囲である。
好ましくは、最外層のクリーム層は、水相混合物および油相混合物を含む。
水相混合物は、グリセリン、グリチルリチン酸二カリウム、ペンタンジオール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、メチルパラベン、およびカルボマーのうちの少なくとも1つを含み、
油相混合物は、鉱油、セテアリルアルコール、プロピルパラベン、メチルパラベン、PEG−100ステアリン酸塩、PEG−40硬化ヒマシ油、カプリル酸/カプリン酸トリグリセリド、Tween−80、Cremophor EL、ステアリン酸グリセリル、Tween−65、Tween−60、Tween−20、Labrafac Lipophile WL 1349、大豆油、茶油、植物油、ひまわり油、魚油、ゴマ油、ビタミンE、動物性脂肪、グリセリルオクタノエート、レシチン卵ホスファチジルコリン、ポリ(プロピレンオキシド)、ポリ(D、L−乳酸)、ポリ(ε−カプロラクトン)、ポリ(L−アスパラギン酸)およびポロキサマー、PEG−ポリグルタミン酸、PEG−ポリアスパラギン酸、PEG−ポリ−L−ラクチド、PEG誘導体、ソルビタンモノパルミテートおよびソルビタンオレイン酸塩のうちの少なくとも1つを含む。
油相混合物は、鉱油、セテアリルアルコール、プロピルパラベン、メチルパラベン、PEG−100ステアリン酸塩、PEG−40硬化ヒマシ油、カプリル酸/カプリン酸トリグリセリド、Tween−80、Cremophor EL、ステアリン酸グリセリル、Tween−65、Tween−60、Tween−20、Labrafac Lipophile WL 1349、大豆油、茶油、植物油、ひまわり油、魚油、ゴマ油、ビタミンE、動物性脂肪、グリセリルオクタノエート、レシチン卵ホスファチジルコリン、ポリ(プロピレンオキシド)、ポリ(D、L−乳酸)、ポリ(ε−カプロラクトン)、ポリ(L−アスパラギン酸)およびポロキサマー、PEG−ポリグルタミン酸、PEG−ポリアスパラギン酸、PEG−ポリ−L−ラクチド、PEG誘導体、ソルビタンモノパルミテートおよびソルビタンオレイン酸塩のうちの少なくとも1つを含む。
好ましくは、ボツリヌス神経毒素は、ボツリヌス神経毒素複合体および完全ボツリヌス神経毒素のうちの1つを含む。
好ましくは、複数の水相層の1つ以上は親水性分子を含み、および/または複数の油相層の1つ以上は疎水性分子を含む。
好ましくは、親水性分子は、ヒアルロン酸、細胞増殖因子、幹細胞、幹細胞液、ペプチド、タンパク質、アプタマー、オリゴヌクレオチド、ビタミン、Snap−8オクタペプチド、ジペプチド、アクイリンヘキサペプチド、アラントイン、ナイアシンアミド、アロエベラ、アントシアニン、グリチルリチン酸二カリウム、アルブチン、アミノ酪酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、アミノ糖、N−アセチルカルノシン、L−カルノシン、補酵素、フロスアルビジアエ抽出物、キビ草抽出物、ベタイン、トレハロース、エリスリトール、マンニトール、カルボマー、ビタミンC、ヒドロキシエチルセルロース、銅トリペプチド、アセチルキトサミン、ガストロジン、アセチルヘキサペプチド−8、アセチルヘキサペプチド−1、L−トリプトファン、5−ヒドロキシトリプトファン、クエン酸、リパーゼ、ルブラジェル、セラミド3、ミルク抽出物、アロエベラの葉の水、高麗人参の根の水、加水分解コラーゲン、ノナペプチド−1、ヘキサペプチド−1、β−グルカン、プロピレングリコール、グリセリン、エチレングリコール、ブタンジオール、ニコチン酸、フィト酸、プエラリン、カンゾウ、スノーグラス抽出物、ジンセノシド、レスベラトロール、パルミトイルペンタペプチド−4、パルミトイルトリペプチド−1、パルミトイルテトラペプチド−7、パルミトイルオリゴペプチド、アプタマー、si−RNA、幹細胞および治療剤などのうちの少なくとも1つを含む。
好ましくは、疎水性分子は、ワクシニアミルティラス種子油、プルケネチアヴォルビリス種子油、アルガニアスピノサカーネルオイル、ペンタクレスラマクロロバ種子油、バートホルレチアエクセルサ種子油、ブチロスパーマムパーキーフルーツ脂肪、ゼラニウムオイル、ココナッツ油、小麦胚芽油、オリーブオイル、シアバター、月見草オイル、ラノリン、蜜蝋、レシチン、ホホバワックス、メントール、サリチル酸メチル、ビタミンE、ルテイン、ゼアキサンチン、シナモン油、ジンジャールートオイル、バニリルブチルエーテル、ラノステロール、ビタミンA、大豆イソフラボン、フィトステロール、フィトステロールエステル、大豆油、ティーシードオイル、シーバックソーンオイル、グレープシードオイル、アーモンドオイル、ウィンターグリーンオイル、ホホバオイルなどのうちの少なくとも1つを含む。
好ましくは、治療剤は、インスリン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、5−フルオロウラシル、ダカルバジン、イブプロフェン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、エストリオール、プロゲステロン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、エストラジオール、AgNO3をはじめとする銀イオン、ZnOをはじめとするZnイオン、抗生物質、ホルモン、フェロモン、フェロモン、原薬分子と植物抽出物などのうちの少なくとも1つを含む。
本発明の他の態様は、説明、特許請求の範囲および図面を参照して当業者によって理解され得る。
本発明の実施形態における技術的解決手段をより明確に説明するために、実施形態を説明するための図面を以下に簡単に説明する。以下の説明の図面は本発明の実施形態の一部を示すに過ぎず、かつ、当業者は、発明の努力を必要とせずにこれらの図面から他の派生図面を導き出すことができることは明らかである。
本明細書は、本発明の原理および実装に関して説明するが、実施形態の説明は、本発明の方法および方法の中核概念の理解を助けることのみを意図している。同時に、当業者は、本発明の思想に従って特定の実施形態および適用範囲を修正することができる。結論として、明細書の内容は、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
本発明は、本発明の様々な実施形態による低分子量ボツリヌス神経毒素Aを調製する方法を提供する。ボツリヌス神経毒素Aは、ボツリヌス菌A型Hall株の発酵によって生成され、さらに発酵培地から抽出および精製される。図2は、本発明の様々な実施形態による低分子量ボツリヌス神経毒素Aを調製するための例示的な方法のフローチャートを示す。
図2において、例示的な方法は、細胞接種および発酵を含むことができ、この時間中、細菌であるボツリヌス菌は制御された方法で培養され、ボツリヌス神経毒素Aを生成することができる(例えば、図2のS201において)。該方法は、収穫時に酸性スラッジ形成を行って発酵培地を酸性化し、それにより標的タンパク質としてのボツリヌス神経毒素Aの抽出を開始することをさらに含むことができる(例えば、図2のS203において)。発酵培地を酸性化して沈殿物(酸性スラッジ)を形成した後、例示的な方法は、核酸不純物および他のタンパク質不純物を除去するためのフラッシュ抽出および透析をさらに含むことができる(例えば、図2のS205において)。残りの核酸不純物および他の関連する非毒性タンパク質をさらに除去して低分子量の高純度ボツリヌス神経毒素Aを得るために、例示的な方法は、透析およびクロマトグラフィーを使用した逐次精製をさらに含むことができる(例えば、図2のS207〜S211において)。例えば、例示的な方法は、透析、陰イオン交換クロマトグラフィープロセス、および陽イオン交換クロマトグラフィープロセスを含む反復可能な精製サイクルをさらに含むことができる。精製プロセスが完了すると、得られたボツリヌス神経毒素Aをさらにろ過し、かつ長期保存を実現するためにそれを低温(例、≦−70℃)で保存することができる(例えば、図2のS213において)。
標的タンパク質としてのボツリヌス神経毒素Aが、制御された方法で生成、抽出、および精製されるように、図2による例示的なステップのそれぞれを異なる方法を使用して監視することができる。再び図2を参照すると、例えば、高濃度の酸を加えることで形成された沈殿物(スラッジ)と硫酸アンモニウムを含む沈殿物をそれぞれ計量することにより、S203での酸性スラッジの形成およびS205でのフラッシュ抽出および透析を監視することができる。あるいは、蛍光アッセイを実行して、酸性スラッジの形成を監視することができる。例えば、RiboGreen核酸定量試薬として使用される超高感度蛍光色素は、水溶液中のDNA、例えばタンパク質を含む水溶液中のDNA不純物を定量する。したがって、核酸の蛍光強度の減少を測定することにより、タンパク質含有溶液中の核酸不純物の除去を監視することができる。いくつかの任意の実施形態では、蛍光アッセイを使用して、図2の1つまたは複数のステップ(例えば、S203およびS205)で核酸不純物の除去を監視することができる。
本発明の別の実施形態では、SDS−PAGEを、図2の実質的にすべての例示的なステップでボツリヌス神経毒素Aの純度を監視するために使用することができる。あるいは、UV分光法も、タンパク質の濃度を監視し、タンパク質溶液中の核酸不純物を測定するために使用することができる。例えば、278nmの波長でのUV吸光度を、タンパク質濃度を測定および決定するために使用することができる。さらに、タンパク質溶液中の核酸不純物を測定するように260nmおよび280nmの波長でのUV吸光度比(A260/A280比)を測定することができる。さらに、例えば、核酸不純物の濃度が特に低い場合に、ボツリヌス神経毒素Aを含む溶液中の核酸不純物を決定するように、qPCR方法で測定することを含むことができる。本発明の一実施形態では、最終製品からのクロストリジウムDNA不純物の除去を確実にするために、精製ボツリヌス神経毒素Aサンプル中の残留ボツリヌス菌A型ゲノムDNAを検出するようにTaqMan qPCRアッセイを実施することができる。
図2の例示的なステップを監視するために、1つまたは複数の方法を組み合わせることができることに留意されたい。例えば、本発明はこれを限定することを意図しないが、SDS−PAGE法およびUV分光法を組み合わせて、抽出および精製プロセスを監視することができる。また、本発明はこれを限定することを意図しないが、ボツリヌス神経毒素Aの生成および精製を監視する際に他の方法を含めることができることにさらに留意されたい。
細胞接種および発酵(S201)では、低分子量ボツリヌス神経毒素Aの調製には、作動細胞バンク(Working Cell Bank, WCB)の調製、調製されたWCBの接種および発酵を含むことができる。本発明の一実施形態では、WCBは高圧蒸気処理された発酵培地で解凍することができ、解凍プロセスは周囲温度または37℃で実施することができる。続いて、解凍したWCBは、高圧蒸気処理された発酵培地に接種することができる。一実施形態では、接種プロセスは、約33℃から40℃の範囲の温度で約4時間から20時間実施することができる。例えば、接種プロセスは37℃で12時間実施することができる。
本発明のいくつかの任意の実施形態では、WCB中の細菌であるボツリヌス菌が利用可能なマスター細胞バンク(MCB)を特徴付けて、細菌であるボツリヌス菌の様々な特性を検証することができる。特徴付けプロセスは、接種および発酵プロセスの前に実施することができ、かつ、発酵プロセスに動物由来の成分が含まれる場合、ボツリヌス菌の特徴的な特性には、同一性、生物学的純度、安定性、形態、DNA配列決定、およびウイルス検出を含むことができる。例えば、細菌の表現型または遺伝子型の特徴を決定することにより、同一性の特徴づけを達成することができる。生物学的活性は、血漿汚染を測定することにより決定することができる。所望の標的産物の所望の産生として定義される安定性は、細胞の性質、培養方法などによって決定することができる。生存能力は、限定された条件下での保存中に生成を維持する能力として定義することができる。本発明はこれを限定することを意図しないが、MCBの他のいくつかの特徴的な特性を識別および測定することができることに留意されたい。
本発明の一実施形態では、細胞の接種および発酵中に、好ましくは、動物由来の成分が実質的に使用されず、それにより、動物源による調製物の潜在的な汚染が回避される。一般的なブリスター培地、および接種と発酵プロセス用の動物由来の他の成分(例えば、ウシおよびブタ出発材料を使用するNZ−Amineおよびグリセリン)の代替物として、本発明の一実施形態には、実質的に非動物由来の発酵培地を含むことができる。本発明の別の実施形態は、植物ペプトンベースの発酵培地を任意に含むことができる。
例えば、大豆、ジャガイモ、および/または米を含むがこれらに限定されない植物ベースのタンパク質製品を発酵培地に含めることができる。さらに、自己分解酵母スラッジ、酵母抽出物、およびグルコースも発酵培地に含めることができる。本発明の一実施形態では、非動物由来の発酵培地は、培地の総体積に対して、重量(w/v)で5%の大豆粉、2%の酵母抽出物、および2%の自己分解酵母スラッジを含むことができる。任意に、非動物由来の発酵培地は、3%の大豆粉、2%のジャガイモ粉、2%の酵母抽出物、および1%の自己分解酵母スラッジを含むことができる。任意に、非動物由来の発酵培地は、3%の大豆粉、1%の酵母抽出物、2%の自己分解酵母スラッジ、および1%のグルコースを含むことができる。非動物由来の発酵培地は、pH調整のためにデキストロースおよび水酸化ナトリウム(例えば、約10%〜50%水溶液)をさらに含むことができる。一実施形態では、発酵培地中のデキストロースの濃度は、1リットル当たり5グラム(5g/L)であってもよい。本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、本発明に記載される成分の割合は、総体積に対する重量割合を指す。
調製された非動物由来の発酵培地は、適切なpHに調整することができる。一実施形態では、発酵培地のpHは、pH6.5からpH8.5の範囲であり得る。例えば、発酵培地のpHはpH7.0からpH7.5の範囲であり得る。いくつかの任意の実施形態では、発酵培地のpHをpH7.2に調整することができ、かつ、水酸化ナトリウムを追加することによりpH調整を実現することができ、例えば、0.3mLの50%水酸化ナトリウムを1Lの発酵培地に追加することによりpH調整を実現する。
図2のステップS201をさらに参照し、接種溶液中の作動細胞は、ボツリヌス菌が嫌気性環境で成長および拡大できるように、より大量の発酵培地に移すことができる。発酵プロセスの期間は、約33℃から40℃の範囲の温度で70時間から120時間であり得る。本発明の一実施形態では、発酵プロセスは、35℃から39℃の範囲の温度で約96時間であり得る。各バッチの様々な例によると、9Lの非動物由来の発酵培地は、20億(109)以上のマウスLD50ユニットのボツリヌス神経毒素Aを生成することができ、ここで、各マウスLD50ユニットは、マウスLD50アッセイで約2.5〜10ピコグラムに対応するボツリヌス神経毒素Aの致死量として定義することができ、その生物学的活性は100〜400LD50 unit/ngである。
図2のステップS203を参照し、本発明の様々な実施形態によれば、細菌であるボツリヌス菌を含む発酵培地を収穫時に沈殿させて、酸性スラッジ形成を実現することができる。一実施形態では、細胞破片を除去するために、ボツリヌス菌を含む発酵培地に高濃度の酸を加えることができる。例えば、pHが少なくとも3時間3.5まで低下するまで、3N H2SO4を発酵培地に加えて実質的にすべての細胞が沈殿して沈殿物を形成できるようにすることができる。
本発明の一実施形態では、発酵培地を酸性化することによって形成された沈殿物は、pH5.5の100mMクエン酸緩衝液で所定の時間抽出するために遠心分離によって収集し、再懸濁することができる。同時に、ボツリヌス神経毒素A、核酸不純物、およびその他のタンパク質不純物を含む遠心分離によって得られた上澄み液を収集することができる。いくつかの任意の実施形態では、ボツリヌス神経毒素Aの大部分または実質的にすべてを上澄み液に抽出できるように、遠心分離および再懸濁プロセスを繰り返すことができる。
例えば、酸性化発酵培地は、上澄み液を沈殿物から分離できるように、1回目の遠心分離を実行することができる。残りの沈殿物は、抽出のために100mMクエン酸緩衝液に1時間再懸濁し、続いて、2回目の遠心分離を実行することができる。その後、2回目の遠心分離によって得られた上澄み液を沈殿物から分離することができ、ここで、上澄み液を1回目の遠心分離によって得られた上澄み液と混合することができ、かつ、沈殿物に対する3回目の再懸濁を実行することができる。さらに沈殿させるために、硫酸アンモニウムを混合した上澄み液に加えることができる。本発明の一実施形態では、混合した上澄み液の沈殿プロセスは、2〜8℃で約4〜20時間実施することができる。前記実施形態によれば、各酸沈殿サイクルの核酸不純物の除去を監視するように、RiboGreenアッセイとUV吸光度アッセイからのA260/A280比を実行することができる。
本発明の様々な実施形態による図2のステップS205を参照し、上記上澄み液への高濃度の硫酸アンモニウムの添加は、上澄み液中のタンパク質の溶解度の低減をもたらし得る。硫酸アンモニウムの濃度が十分に高い場合、タンパク質が溶液から沈殿する可能性がある。一実施形態では、沈殿物を遠心分離によって収集し、かつ、pH5.5の50mMクエン酸緩衝液に再懸濁することができる。次に、再懸濁した沈殿物をさらに処理して、核酸不純物および他のタンパク質不純物を実質的に除去することができる。本発明の一実施形態では、再懸濁した沈殿物を陰イオン交換体と混合して、標的タンパク質としてのボツリヌス神経毒素Aをさらに抽出することができ、ここで、陰イオン交換体は、ジエチルアミノエチル(DEAE)Sephadex A−50ビーズスラリーを含むことができる。いくつかの任意の実施形態によれば、ボツリヌス神経毒素Aに対する効率的な抽出を達成するように、陰イオン交換体の上記抽出プロセスを繰り返すことができる。例えば、50mMのpH5.5のクエン酸緩衝液中の再懸濁溶液をDEAE Sephadex A−50ビーズスラリーと1:1の比率で混合し、かつ、1時間振盪する(1回目の抽出)。上澄み液を収集するために得られたスラリー混合物を遠心分離して、同時に沈殿物をpH5.5の50mMクエン酸緩衝液に再懸濁することができる。再懸濁した溶液は、DEAE Sephadex A−50ビーズスラリーと1:1の比率で混合し、かつ、1時間振盪する(2回目の抽出)。1回目と2回目の遠心分離後の上澄み液をすべて混合し、かつ、硫酸アンモニウムを加えてさらに沈殿させる。本発明の一実施形態では、混合した上澄み液の沈殿プロセスは、2〜8℃で約4〜20時間実施することができる。
上記のように、非血球凝集素タンパク質と血球凝集素などの他の非毒性タンパク質に関連するボツリヌス神経毒素とを含むボツリヌス神経毒素複合体は、比較的大きな分子量(たとえば960KDa)を持ち、かつ、負に帯電している。従来技術では、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体が、ボツリヌス神経毒素複合体を精製するために主に使用される。本発明の様々な実施形態では、他の非毒性タンパク質からの解離によって生成されたボツリヌス神経毒素Aは、150kDaという著しく小さい分子量を有し得る。さらに、解離したボツリヌス神経毒素Aは正に帯電している。それに応じて、本発明は、連続透析、陰イオン交換、および陽イオン交換クロマトグラフィーを使用するボツリヌス神経毒素Aの精製方法を提供する。例えば、残りの核酸不純物、その他のタンパク質不純物、およびボツリヌス神経毒素Aから解離した非毒性タンパク質のすべてを、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体と陽イオン交換クロマトグラフィー媒体を連続して使用することで実質的に除去し、それにより、低分子量の正に帯電したボツリヌス神経毒素Aの精製が達成される。前記実施形態によれば、上記の精製プロセスのそれぞれを監視するために異なる方法を使用することができる。例えば、SDS−PAGE法とUV分光法の両方が、核酸不純物およびその他のタンパク質不純物の除去を検出するために使用することができる。
本発明の一実施形態による図2のステップS207を参照し、アニオン樹脂抽出および透析によってステップS205から得られた硫酸アンモニウム含有沈殿物を処理することができる。例えば、硫酸アンモニウムを含む沈殿物を遠心分離によって収集し、かつ、pH5.5の50mMクエン酸緩衝液に再懸濁することができる。再懸濁した溶液をさらに透析することができる。本発明の一実施形態では、再懸濁された溶液は、pH5.5の50mMクエン酸緩衝液において2℃〜8℃で約4〜20時間透析することができる。その後、透析チューブから収集した透析後の生成物を陰イオン交換クロマトグラフィー用のDEAE Sephadex A−50カラムに装填し、それにより、負に帯電した核酸不純物とその他のタンパク質不純物を大幅に除去することができる。
本発明の一実施形態では、透析チューブから収集された透析後の生成物の重量を測定し、次いでDEAE Sephadex A−50カラムに装填することができる。さらに、UV分光法を使用して核酸不純物の除去を監視することができる。例えば、0.6未満のA260/A280比を有する収集製品を混合することができ、特に小さなA260/A280比は、より低い濃度の核酸不純物を示すことができる。さらに、陰イオン交換クロマトグラフィープロセス後に得られた結合生成物を秤量し、装填前の透析後の生成物と比較して、不純物の除去を制御可能な方法で操作および監視することができるようにする。
本発明の一実施形態および図2のステップS209によれば、陰イオン交換クロマトグラフィープロセスをさらに繰り返して、核酸不純物および他のタンパク質不純物を効率的に除去することができる。例えば、1回目の透析と陰イオン交換クロマトグラフィープロセスの後、0.6未満のA260/A280比を有する生成物を混合し、かつ、硫酸アンモニウムを加えることでさらに沈殿させ、このプロセスを2℃〜8℃で約4〜20時間実行することができる。その後、硫酸アンモニウムを含む沈殿物を遠心分離によって収集し、pH7.9の20mMリン酸緩衝液に再懸濁することができる。7.9の高いpHにより、ボツリヌス神経毒素Aを非毒性タンパク質から解離することができ、これは低分子量ボツリヌス神経毒素Aの精製を促進することができ、続いて解離した非毒性タンパク質を除去する。再懸濁した溶液をさらに透析することができる。本発明の一実施形態では、再懸濁された溶液は、pH7.9の20mMリン酸緩衝液において2℃〜8℃で約4〜20時間透析することができる。続いて、透析チューブから収集された透析生成物をさらに2回目のクロマトグラフィー処理のためにDEAE Sephadex A−50カラムに装填することができ、それにより実質的にすべての残留核酸不純物とほとんどのタンパク質不純物を除去することができる。
本発明の前記実施形態による2回目の透析および陰イオン交換クロマトグラフィーの完了により、得られた結合生成物を陽イオン交換クロマトグラフィーによってさらに処理することができ、それにより正に帯電したボツリヌス神経毒素Aを精製することができる。例えば、得られた生成物を硫酸アンモニウムと一緒に加えてさらに沈殿させることができ、このプロセスは2℃〜8℃で約4〜20時間実行することができる。遠心分離によって沈殿物を収集することができ、3回目の透析のためにpH7.0の20mMリン酸緩衝液に再懸濁することができる。本発明の一実施形態では、再懸濁された溶液は、pH7.0の20mMリン酸緩衝液において2℃〜8℃で約4〜20時間透析することができる。その後、透析チューブから収集された透析後の生成物は、陽イオン交換クロマトグラフィープロセスのためにさらに処理することができる。本発明の一実施形態では、SuperloopおよびP−50ポンプを使用する予め充填されたSP陽イオン交換カラムは、陽イオン交換クロマトグラフィープロセスを実施することができる。
本発明の一実施形態では、3回目の透析後に得られた生成物を秤量し、次いで陽イオン交換クロマトグラフィー用のSP陽イオン交換カラムに装填することができる。さらに、純度を監視し、ボツリヌス神経毒素Aの溶出曲線を確立するために、それぞれ260nm、270nm、278nm、280nm、320nmなどの波長での陽イオン交換クロマトグラフィー後に収集された生成物のUV吸光度を測定することができる。さらに、陽イオン交換クロマトグラフィープロセス後に得られた混合生成物を秤量し、装填前の透析生成物と比較し、それにより不純物の除去を制御可能な方法で操作および監視することができる。ボツリヌス神経毒素Aの純度は、SDS−PAGE法によりさらに測定することができる。
いくつかの任意の実施形態では、逐次透析およびクロマトグラフィーを使用して高分子量のボツリヌス神経毒素A複合体を精製することもできる。例えば、960KDa BoNT−Aは、例えば図2に従って、透析とそれに続くイオン交換クロマトグラフィーによって調製することができる。特に、960KDa BoNT−A複合体を調製するために、透析→陰イオン交換クロマトグラフィー→透析→陰イオン交換クロマトグラフィー→透析→陽イオン交換クロマトグラフィーのステップを含む連続精製プロセスを実施することができる。高分子量のBoNT−A複合体を得るために、pH7.9のリン酸緩衝液を使用する必要がないことに留意されたい。
陽イオン交換クロマトグラフィープロセス後に収集された高純度ボツリヌス神経毒素Aを含む混合生成物は、長期使用のために保存することができる。本発明の一実施形態では、15%のエチレングリコール、3%のグリセリン、および2%のプロピレングリコールを混合生成物に加え、混合物を−70℃以下の温度で保存することができる。任意に、生成物を−80℃で保存することができる。
BoNT−Aおよび完全BoNT−A分子は両方とも、pH、他のタンパク質の存在、イオン強度、光、温度などの局所的な微小環境要因に応じて大きな酵素活性を持つ大きなタンパク質化合物である。いくつかの任意の実施形態では、安定した毒素および長期保存の目的で、ヒト血清アルブミン(HSA)または組換えヒトアルブミン(RHA)を毒素溶液に添加することができる。
完全BoNT−Aを他の関連タンパク質から分離した後、特に保存または後で使用するために希釈した場合、同じ保存条件下でBoNT−A複合体よりも不安定になる可能性がある。一実施形態では、エチレングリコール、グリセリン(グリセロール)、およびプロピレングリコールのうちの1つ以上を安定剤として使用して、低分子量のBoNT−A複合体および完全なBoNT−Aを安定化することができる。いくつかの任意の実施形態では、エチレングリコール、グリセリン(グリセロール)、およびプロピレングリコールのうちの1つ以上を含む安定剤は、10%〜30%の総濃度、例えば20%〜25%の総濃度を有し得る。一実施形態では、安定剤は、エチレングリコール(5〜20重量%)、グリセリン(1〜10重量%)、およびプロピレングリコール(1〜5重量%)を含むことができる。別の実施形態では、安定剤は、10%エチレングリコール、3%グリセリン、および2%プロピレングリコールを含むことができる。
本発明はまた、多層多相ナノカプセル化生体分子を調製する方法を提供する。いくつかの任意の実施形態では、カプセル化生体分子は、広範囲の分子量を有し得る。例えば、カプセル化生体分子は、BoNT−A複合体(960KDa)およびヒアルロン酸(≦1500KDa)など、1000KDaに近いまたはそれを超える高分子量を有する1つ以上の生体分子を含むことができる。別の実施形態では、カプセル化生体分子は、完全BoNT−A(150KDa)を含む中分子量の1つ以上の生体分子、そして、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ビタミン分子(例、ビタミンCおよび/またはビタミンD)、Snap−8オクタペプチド、ジペプチド、アラントイン、ニコチンアミド、アロエベラ、コエンザイムQ10、レスベラトロール、パルミトイルペンタペプチド−4、パルミトイルトリペプチド−1、パルミトイルテトラペプチド−7、パルミトイルオリゴペプチド、アプタマー(核酸アプタマー)、si−RNA、幹細胞とマトリックス、幹細胞、アプタマー、幹細胞液、EGF、FGF、KGF、AGF、BGFなどの様々な細胞増殖因子、インスリン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、5−フルオロウラシル、ダカルバジン、イブプロフェン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、エストリオール、プロゲステロン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、エストラジオールなどの多くの治療剤、銀イオン(AgNO3など)、Znイオン(ZnOなど)、および植物抽出物などの低分子を含むことができるが、本発明はこれに限定することを意図しない。
図5Aは本発明の様々な実施形態による多層多相ナノカプセル化生体分子を調製するための例示的な方法のフローチャートである。
図5AのS501によれば、まず、水相層に囲まれた油相コア(水中油(O/W)構造とも呼ばれる)を含むナノセル1Aを形成することができ、ここで、水溶性化合物と油溶性化合物とはそれぞれ水相と油相とに溶解することができる。水中油型ナノセル1Aは、親水性頭部と疎水性尾部などの2つの異なる分子領域を持つ両親媒性物質の存在下でミセルを形成することで実現することができ、ここで、疎水性コアは油相を表し、親水性シェルは水相を表すことができる。
本発明において、用語「水相」および「親水性相」は互換的に使用され、用語「油相」および「疎水性相」は互換的に使用されることに留意されたい。
本発明の一実施形態では、複数の水溶性化合物は、カプセル化構造内の1つ以上の水層に溶解することができ、様々な油溶性化合物は、カプセル化構造内の1つ以上の油相層に溶解することができる。例えば、水溶性生体分子(タンパク質、ペプチド、核酸など)は、カプセル化構造内の1つ以上の水層に溶解することができるが、いくつかの任意の実施形態では、タンパク質は油相層に含まれる疎水性部分を有し得る。別の実施形態では、1つ以上の水相層を水溶性生体分子で溶解することができ、1つ以上の油相層を油溶性化合物で溶解することができ、それにより、2種類以上の分子を含むナノセルを形成し、2つ以上のタイプの分子は、疎水性分子および親水性分子の少なくとも1つであってもよい。
一実施形態では、磁気的または機械的撹拌によって撹拌を達成することができる。かつ、撹拌速度は、300rpm〜3000rpm、例えば、500rpm〜2000rpmに設定することができる。いくつかの実施形態では、攪拌速度は約800rpmに設定することができる。
別の実施形態では、油相と水相の重量比(油相:水相)は、1:99〜40:60、例えば5:95〜20:80に設定することができる。さらに、一実施形態では、油相中の界面活性剤と油の重量比(界面活性剤:油)は、10:1〜1:10、例えば3:1〜1:3である。
いくつかの実施形態では、油および界面活性剤は、油相を形成するために、ミセル形成剤として使用することができ、Tween−80、Tween−65、Tween−60、Tween−20、Tween−40、Cremophor EL、Labrafac Lipophile WL 1349、大豆油、茶油、オクタン酸グリセリル、レシチン卵ホスファチジルコリン(EPC)、PEG−40硬化ヒマシ油、ポリ(プロピレンオキシド)(PPO)、ポリ(D、L−乳酸)(PDLLA)、ポリ(ε−カプロラクトン)(PCL)、ポリ(L−アスパラギン酸)、ポロキサマー、PEG−ポリグルタミン酸、PEG−ポリアスパラギン酸、PEG−ポリ−L−プロパノイド エステル、オレイン酸ソルビタン(Span−80)などのうちの1つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、混合プロセスは、室温(25℃)または室温未満(例えば、4℃〜25℃)で実施することができる。別の実施形態では、混合プロセスは、高温(例えば、約40℃)で実施することができる。例えば、油相または水相の溶解を促進するために加熱が必要な場合、高温は約60℃〜70℃の範囲であってもよいが、例えば90℃以下である。50℃〜70℃のより高い温度と比較して、低い製造温度(例えば、4℃〜25℃または4℃〜40℃)を使用した穏やかな調製プロセスは、特により高い温度がカプセル化生体分子活性の損失または保持をもたらし得る場合、開示された方法にさらなる利点を提供することができる。
前記実施形態によれば、水中油構造を有する調製されたナノセル1Aは、図5AのS503に従ってナノセル2Aを形成するために、反対の極性の相溶液、すなわち油相層にさらにカプセル化されてもよい。形成されたナノセル2Aは、水相層に連続的にカプセル化され、シェルの別の油相層として少なくとも油相コアを含む多層構造があってもよい。前記実施形態によれば、油相層のそれぞれは、同じまたは異なる疎水性活性成分を含むことができ、かつ、水相コアは、追加の親水性活性成分を含むことができる。
図5AによるS505の一実施形態では、上記カプセル化ステップを繰り返して、1つ以上のタイプの活性成分を含む追加のカプセル化層を新たに形成された水相シェルに封入し、安定なナノセル3Aを形成する。
本発明の一実施形態では、ヒト皮膚構造およびヒト細胞構造の複数の層を模倣することができる多層ナノ細胞構造を形成するために、上記カプセル化ステップを複数回繰り返すことができる。この多層多相ナノセル構造は、内皮細胞への活性成分の輸送および送達を促進することができる。本発明の別の実施形態による各カプセル化ステップでは、新たに形成された水相および油相カプセル化層は、内層のものと同じ活性成分分子を含むことができる。あるいは、新たに形成されたカプセル化層は、異なる活性成分を含むことができ、異なる治療、薬用化粧品、および他の適用のための異なる活性成分を含む2つ以上の層を有する多機能ナノセルを生成する。
いくつかの任意の実施形態では、形成された内部油相コアから外部水相シェルの方向に沿った油−水−油層を有する多層構造のナノセル3Aは、図5AのS507によるナノセル4Aを得るために、油相でさらに再カプセル化されてもよい。別の実施形態では、形成された内部油相コアから外部油相シェルの方向に沿った油−水−油−水−油層を有する多層構造のナノセル4Aは、図5AのS509によるナノセル5Aを得るために、油相でさらに再カプセル化されてもよい。
本発明の前記実施形態によれば、形成されたナノセルの層の数は限定されないことに留意されたい。すなわち、親水性相の層の数および疎水性相の層の数は、異なる適用に従って決定することができ、本発明はこれを限定することを意図しない。さらに、活性成分の極性および層の極性との適合性に応じて、1つ以上の種類の活性成分を1つ以上の異なる相層に溶解することができる。
図5AのS511による本発明の一実施形態では、安定なエッセンスの形のナノセル6Aを生成するために調製されたナノセル5Aをさらにクリームでカプセル化することができ、ここでナノセル6Aの平均粒子サイズは、1〜200nmの間、一般的には1〜100nmの間、時には50nm未満、時には30nm未満である。一実施形態では、ナノセル6Aの平均粒径は30nm未満である。別の実施形態では、ナノセル6Aの平均粒径は、20nm未満、または10nm未満、さらには1nmに近いことができる。
本発明の一実施形態では、生成されたナノセルは、1つ以上のクリーム層にカプセル化することができる。クリーム層の追加により、経皮送達、治療および薬用化粧品用途におけるナノセルの特性を改善することができる。さらに、生成されたナノセルのクリーム層は、ユーザーエクスペリエンスを向上させることもできる。
図5Bは、本発明の様々な実施形態によるナノカプセル化生体分子を調製するための別の例示的な方法のフロー図を示す。図5BのS502によれば、まずナノセル1Bを形成することができ、それは、油相層で囲まれた水相コア(油中水(W/O)構造とも呼ばれる)を含み、ここで、水溶性化合物および油溶性化合物は、それぞれ水相および油相に溶解することができる。油中水構造を有するナノセル1Bは、界面活性剤の存在下で水相溶液を撹拌された油相に加えることにより調製することができる。一実施形態では、ボツリヌス神経毒素および/またはヒアルロン酸などの生体分子を水相コアに溶解することができ、ここで、コアは油相層にカプセル化することができる。いくつかの任意の実施形態では、いくつかのタンパク質は、油相層に含まれる疎水性部分も有し得る。
前記実施形態によれば、油中水構造を有する調製されたナノセル1Bは、図5BのS504によるナノセル2Bを形成するために、その反対の極性の相溶液、すなわち水相層にカプセル化されてもよい。形成されたナノセル2Bは、油相層に連続的にカプセル化され、外側シェルの別の水相層として少なくとも水相コアを含む多層構造があってもよい。さらに、ナノセルの外側シェルの極性に応じて、外側シェルとは異なる極性の追加層を適用することができる。図5BのS508によれば、例えば、追加の水相層を形成して、内部水コアから外部水シェルの方向に沿った水−油−水−油−水の多層構造を有するナノセル4Bを生形成することができる。いくつかの実施形態では、図5BのS510によるナノセル5Bを形成するために上記カプセル化をさらに繰り返すことができ、それは、内部水コアから外部油シェルの方向に沿った水−油−水−油−水−油の多層構造を有する。
図5BのS512による本発明の一実施形態では、安定なエッセンスの形のナノセル6Bを生成するために調製されたナノセル5Bをさらにクリームでカプセル化することができ、ここでナノセル6Bの平均粒子サイズは、1〜200nmの間、一般的には1〜100nmの間、時には50nm未満、時には30nm未満である。一実施形態では、ナノセル6Bの平均粒径は30nm未満である。別の実施形態では、ナノセル6Bの平均粒径は、20nm未満、または10nm未満、さらには1nmに近いことができる。
以下で詳細に説明するクリーム層の追加は、図5のS511による多層多相ナノセル5Aの親水性外側シェルおよび図5BのS512によるナノセル5Bの疎水性外側シェルと適合性がある。それは、形成されたナノカプセル化構造の外側シェルとしてクリーム層を追加する製造プロセスを大幅に簡素化することができ、これらの構造は、その特定の用途に応じて異なる層分布を持つことができる。他方、クリーム層の追加は、形成されたナノカプセル化構造をエッセンスの形で安定化し、それによりユーザーエクスペリエンスを向上させることができる。
同様に、実施形態は、様々な多層多相ナノセルラー粒子を含む。例示的なナノ粒子は、油相層によってカプセル化されて油中水構造を形成する生体分子を含む最内層の水相コア、複数の水相層、複数の油相層、および最外層のクリーム層を含むことができる。生体分子には、ボツリヌス神経毒素および/またはヒアルロン酸を含む。複数の水相層のそれぞれと複数の油相層のそれぞれは、油中水構造を交互に囲む。例えば、ナノ粒子は、1ナノメートルから20ナノメートルの範囲など、平均サイズが50ナノメートル未満の多層多相ナノ粒子である。
様々な実施形態では、クリーム層は、開示されたナノ粒子の最外層であり得る。例えば、最外層のクリーム層は、水相混合物および油相混合物を含むことができる。一実施形態では、水相混合物は、グリセリン、グリチルリチン酸二カリウム、プロピレングリコール、メチルパラベン、およびカルボマーのうちの少なくとも1つを含む。油相混合物鉱油、セテアリルアルコール、プロピルパラベン、メチルパラベン、PEG−100ステアリン酸塩、PEG−40硬化ヒマシ油、カプリル酸/カプリン酸トリグリセリド、Tween−80、Cremophor EL、ステアリン酸グリセリル、Tween−65、Tween−60、Tween−20、Labrafac Lipophile WL 1349、大豆油、茶油、植物油、ひまわり油、魚油、ゴマ油、ビタミンE、動物性脂肪、グリセリルオクタノエート、レシチン卵ホスファチジルコリン(EPC)、ポリ(プロピレンオキシド)(PPO)、ポリ(D、L−乳酸)(PDLLA)、ポリ(ε−カプロラクトン)(PCL)、ポリ(L−アスパラギン酸)、ポロキサマー、PEG−ポリグルタミン酸、PEG−ポリアスパラギン酸、PEG−ポリ−L−プロパノイド、PEG誘導体、ソルビタンモノパルミテートおよびソルビタンオレイン酸(Span−80)などのうちの少なくとも1つを含む。
(実施例)
説明される実施例は、本発明の前記実施例のいくつかを説明するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことに留意されたい。
説明される実施例は、本発明の前記実施例のいくつかを説明するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことに留意されたい。
(実施例1:非動物由来の発酵培地を使用したボツリヌス神経毒素Aの調製)
実施例1は、図2に示す上記ステップの少なくとも一部を含む。以下の詳細な説明によれば、上流プロセスについて、実施例1は、動物由来のものを含まない発酵培地を使用して作動細胞に接種および発酵するステップを含む。
実施例1は、図2に示す上記ステップの少なくとも一部を含む。以下の詳細な説明によれば、上流プロセスについて、実施例1は、動物由来のものを含まない発酵培地を使用して作動細胞に接種および発酵するステップを含む。
下流プロセスについて、実施例1は、発酵培地を酸性化することによる酸性スラッジの形成、その後の抽出および透析を含む。ボツリヌス神経毒素Aの精製を達成するために、実施例1は、繰り返して実行した透析プロセスおよび連続クロマトグラフィープロセスのステップも含み、異なる方法を使用してこれらのステップを監視する。
接種および発酵用の作動細胞バンク(WCB)はマスターセルバンク(MCB)に由来し、ここで、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)検出方法を使用して、MCBは血清型特異的プライマーでA型ボツリヌス菌として明確に同定され、B、Eまたは破傷風配列は存在しなかった。具体的には、表1にリストされたタイプA、B、およびEの神経毒素のボツリヌス菌構造遺伝子のDNA配列を使用して3対のプライマーを合成した。発酵培地でのMCB株の24時間培養物から分離されたMCB細胞のゲノムDNAを、さらにPPYG(培地500mLあたり、植物ペプトン25g、酵母抽出物15g、自己分解酵母スラッジ5g、グルコース5g)を培地で継代し、さらに24時間増殖させた後、DNAを分離した。ミニスピンカラムの形のDNeasy Blood&Tissueキット(Qiagen、Inc.,Germantown,MD)を使用してDNAを分離した。
図3は、本発明の様々な実施例によるマスター細胞バンクから収集された血清型A DNAサンプルおよび異なる血清型プライマーを使用したPCR増幅の結果である。図3に示すとおり、血清型AのPCR増幅産物(983 bp)は、タイプAプライマーを使用して生成された(図3のレーン1)が、血清型BおよびCプライマーを使用した場合は増幅産物は生成されなかった(図3のレーン2および3)。図3のレーンMに示す断片サイズは、λDNA HindIIIおよびX174 HaeIII Digest Marker Mix(New England Biotechnology Co.、Ltd.,Ipswich,MA)との比較によって決定された。さらに、血清型特異的(神経毒素)配列データのBlast分析は、各サンプルが対応する血清型特異的プライマーの存在下でのみ正しいサイズの増幅産物を生成し、かつ、血清型A増幅産物の配列がボツリヌス菌A型Hall株と一致したことを示した。
MCB細胞株の検証後、WCB細胞株はMCB細胞株に由来し、かつ10mLの高圧蒸気処理された非動物由来の発酵培地に37℃で少なくとも一晩接種した。非動物由来の発酵培地の主要成分を表2に示す。接種が完了した後、接種物5mLを使用して9Lの非動物由来の発酵培地に接種し、ここで、接種は35℃〜39℃の範囲の温度で96時間行われた。
発酵後の酸性スラッジの形成プロセスについて、3.5の目標pHに到達するまで、収穫時に3N H2SO4を発酵液に添加し、最低3時間作動細胞を沈殿させて沈殿物を形成した。沈殿物を遠心分離によって収集し、1回目の酸沈殿抽出(1回目の酸沈殿)のために、pH5.5の100mMクエン酸緩衝液に再懸濁した。再懸濁溶液をさらに遠心分離した。得られた上澄み液をデカントして保存し、同時に残りの沈殿物を2回目の酸沈殿抽出(2回目の酸沈殿)のために100mMクエン酸緩衝液に再懸濁した。再懸濁溶液に対して3回目の遠心分離を行い、得られた上澄み液をデカントして保存した。1回目および2回目の酸沈殿から得られた2つの上澄み液を混合し、次いで硫酸アンモニウムを加えて冷蔵温度で一晩さらに沈殿させた。
1回目と2回目の酸沈殿中に、RiboGreenアッセイ、および260nmと280nm(A260/A280比)での吸光度測定に使用されるUVスペクトルを使用して、核酸不純物を監視し、各沈殿および抽出ステップは、制御可能な方法で操作および監視される。表3に、抽出溶液に含まれる核酸不純物の定量化を示す。例えば、サンプルID1「酸性沈殿抽出物#1」には、1回目の酸沈殿(359.3μg/mgタンパク質)後の核酸不純物濃度がリストされ、サンプルID2「混合した酸沈殿抽出物#1および#2」には、2回目の酸沈殿後の混合した上澄み液の核酸不純物濃度(514.0μg/mgタンパク質)がリストされる。表4に、実施例1における各抽出および精製ステップ後に測定されたUV A260/A280比をさらに示す。例えば、サンプルID1「酸性沈殿抽出物#1」には、1回目の酸沈殿後のA260/A280比が1.54であったことがリストされ、かつサンプルID2「混合した酸沈殿抽出物#1および#2」には、2回目の酸沈殿後に混合した上澄み液中の核酸不純物の濃度(514.0μg/mgタンパク質)がリストされる。
後続のフラッシュ抽出および透析ステップについて、硫酸アンモニウムを、さらなる沈殿のために、1回目および2回目の酸沈殿から得られた混合した上澄み液に加えた。沈殿物を遠心分離により収集し、かつ新たに調製されたpH5.5の50mMクエン酸緩衝液に再懸濁した。表3および4に示すように、サンプルID3「硫酸アンモニウム沈殿後に再懸濁された抽出物」は、硫酸アンモニウムの添加および遠心分離後の抽出溶液中の核酸不純物の濃度とA260/A280比がリストされる。抽出物をさらにDEAE Sephadex A−50ビーズスラリーと1:1の比率で混合し、1時間揺動した(1回目のDEAE A50スラリー)。1回目のDEAE A50スラリーの上澄み液をデカントして保存し、同時に残りの沈殿物を新たに調製されたpH5.5の50mMクエン酸緩衝液でさらに再懸濁し、かつ1:1の比率でDEAE Sephadex A−50ビーズスラリーを加えて1時間揺動した(2回目のDEAE A50スラリー)。その後、第二スラリー混合物を遠心分離し、得られた上澄み液をデカントして保存した。1回目および2回目の酸沈殿により得られた2つの上澄み液を混合し、続いて硫酸アンモニウムを加えて、冷蔵温度で一晩さらに沈殿させた。
表3および表4に示すように、核酸不純物の濃度は、各抽出ステップ中に監視される。DEAE Sephadex A−50ビーズスラリーを添加すると、核酸不純物が大幅に除去されることが分かった。たとえば、表3に示すように、サンプルID4「1回目のDEAE A50スラリー」は、サンプルID3「硫酸アンモニウムの沈殿後に再懸濁された抽出」と比較して、核酸不純物濃度の大幅な減少を示した。さらに、例えば、サンプルID4「1回目のDEAE A50スラリー」中の189.1μg/mgタンパク質の核酸不純物濃度とサンプルID5「2回目のDEAE A50スラリー」中の91.4μg/mgタンパク質の核酸不純物濃度を比較することにより、繰り返し添加できる抽出用DEAE A50ビーズスラリーが残りの核酸不純物を効果的に除去したことがわかる。
RiboGreenアッセイは、酸性スラッジ形成ステップ、およびDEAE Sephadex A−50ビーズスラリーを使用したフラッシュ抽出を含む、抽出および精製プロセスの初期段階で使用されることに注意されたい。上記ステップで核酸不純物を実質的に除去した後、比較的高濃度のタンパク質がRiboGreenアッセイに干渉を引き起こす可能性がある。したがって、UV分光法によるA260/A280比の測定およびSDS−PAGEによる後続の抽出および精製プロセスの監視を含む、他の方法を使用する。
フラッシュ抽出は、DEAE A50ビーズスラリーを繰り返し添加することにより達成され、得られた生成物は透析および連続クロマトグラフィーで処理され、残留核酸不純物、他のタンパク質不純物、およびボツリヌス神経毒素Aから解離した非毒性タンパク質を除去し、これにより、高純度で低分子量のボツリヌス神経毒素Aが生成される。
具体的には、硫酸アンモニウムを含む沈殿物を遠心分離によって収集し、かつpH5.5の50mMクエン酸緩衝液に再懸濁した。その後、再懸濁した溶液を透析チューブに移し、pH5.5の50mMクエン酸緩衝液中の核酸不純物をさらに除去した。透析プロセスを冷蔵温度で一晩実施した(1回目の透析)。1回目の透析後に得られた生成物をDEAE Sephadex A−50カラムに装填し、1回目の陰イオン交換クロマトグラフィー(1回目の陰イオン交換)を実施した。図4は、ボツリヌス神経毒素Aに従って精製された連続クロマトグラフィープロセスの各ステップのSDS−PAGEの結果を示す。例えば、図4Aおよび4Bは、それぞれ非還元および還元条件下でクロマトグラフィープロセスをモニタリングする各ステップに含まれるタンパク質のSDS−PAGE結果を示す。図4Aおよび4Bのレーン1「1回目のA−50の混合」は、1回目の陰イオン交換クロマトグラフィープロセス後の混合したサンプルに存在するタンパク質バンドを表す。1回目の透析および陰イオン交換プロセスは、負に帯電した残留核酸不純物およびその他のタンパク質不純物を本質的に除去した。1回目の陰イオン交換クロマトグラフィー(A260/A280比が0.6未満)の後に収集された生成物は、2回目の透析のために混合し、続いて別の陰イオン交換クロマトグラフィープロセスを実施した。例えば、表4に示すとおり、サンプルID8「1回目のDEAE A−50の混合」のA260/A280比は0.48であった。
1回目の透析と1回目の陰イオン交換クロマトグラフィーのプロセスが完了すると、沈殿のために硫酸アンモニウムを混合した生成物に加えた。得られた沈殿物を遠心分離によって収集し、pH7.9の20mMリン酸緩衝液に再懸濁した。pH7.9の弱アルカリ性条件下では、低分子量のボツリヌス神経毒素Aは、非毒性タンパク質を含むボツリヌス神経毒素複合体から解離する可能性がある。再懸濁した溶液を、pH7.9の50mMクエン酸緩衝液透析チューブに移した。透析プロセスを冷蔵温度で一晩実施した(2回目の透析)。2回目の透析後に得られた生成物をDEAE Sephadex A−50カラムに装填し、2回目の陰イオン交換クロマトグラフィー(2回目の陰イオン交換)を実施した。図4に示すとおり、2回目の陰イオン交換前のサンプル(レーン3)と2回目の陰イオン交換後の混合サンプル(レーン4)を比較することにより、pH7.9のクエン酸緩衝液を使用して、ボツリヌス神経毒素Aを非毒性タンパク質(2回目の陰イオン交換クロマトグラフィーで実質的に除去された)から効果的に解離されたことがわかる。同様に、2回目の陰イオン交換クロマトグラフィープロセス後に収集されたA260/A280比が0.6未満の生成物を混合した。例えば、表4に示すとおり、サンプルID10「2回目のDEAE A−50の混合」のA260/A280比は0.47であった。
上記の繰り返し可能な透析−陰イオン交換サイクルは、陰イオン交換クロマトグラフィープロセスの単一ステップと比較して、製品中のすべての核酸不純物およびタンパク質不純物のほとんどを実質的に除去した。例えば、図4に示すとおり、1回目の陰イオン交換プロセスから収集された生成物を示すレーン1(1回目のA−50の混合)を、2回目の陰イオン交換プロセスから収集された生成物を示すレーン3(2回目のA−50の混合)と比較した。繰り返し可能な陰イオン交換プロセスの後、大量のタンパク質不純物が除去された。
ボツリヌス神経毒素Aは、加工条件下で正電荷を持つ低分子量タンパク質であるため、本明細書に記載の実施例には、高純度のボツリヌス神経毒素Aを得るための陽イオン交換クロマトグラフィープロセスも含まれる。具体的には、2回目の透析と2回目の陰イオン交換クロマトグラフィーのプロセスが完了すると、混合した生成物に硫酸アンモニウムを加えて沈殿させた。得られた沈殿物を遠心分離によって収集し、pH7.0の20mMリン酸緩衝液に再懸濁した。再懸濁した溶液を透析チューブに移し、pH7.0の20mMリン酸緩衝液中に残っている非毒性タンパク質をさらに除去した。透析プロセスを冷蔵温度で一晩実施した(3回目の透析)。SuperloopおよびP−50ポンプを使用して、3回目の透析後に得られた生成物を陽イオン交換クロマトグラフィー用の事前充填されたSPカラムに装填した。図4に示すとおり、陽イオン交換クロマトグラフィープロセスの後、混合した生成物は分子量150KDaの透明なタンパク質バンドを示した(例えば、図4Aのレーン6参照)。さらに、得られたボツリヌス神経毒素Aは、100KDaの重鎖と50KDaの軽鎖を含む(例えば、図4Bのレーン6参照)。上記のSPカラムの陽イオン交換クロマトグラフィープロセスを使用して、低分子量ボツリヌス神経毒素Aが効率的に精製されたことがわかる。
より大きな分子量(例えば、960KDa)のボツリヌス神経毒素複合体とは異なり、本発明の前記実施例に従って生成された低分子量ボツリヌス神経毒素Aは、様々な利点を有し得る。例えば、約150KDaの分子量を有するボツリヌス神経毒素Aは、ボツリヌス神経毒素複合体と比較して20%未満の重量を有する。したがって、ボツリヌス神経毒素Aは、抗原性および免疫原性を著しく低減させる可能性がある。得られたボツリヌス神経毒素Aは、より大きな分子量の複合体よりも臨床使用にとって安全である可能性がある。さらに、生成されたボツリヌス神経毒素Aはサイズが小さいため、拡散速度が速くなる可能性があり、これにより、様々な適用(例えば、限局および局所適用)で皮膚バリアを簡単に通過でき、注射器注射などの侵襲的な送達方法を回避する。
さらに、本発明の様々なバッチの様々な実施例に従って生成されたボツリヌス神経毒素Aは、100〜400 unit/ng、一般に200LD50 unit/ngより高く、ほとんどの場合300LD50 unit/ngを超える生体分子活性を有し得る。生成されたボツリヌス神経毒素Aの活性は、20 LD50/ngの生体分子活性を有するボツリヌス神経毒素複合体と比較して15倍以上の効力を達成することができる。臨床使用中に同じ治療効果を達成するために、生成に必要なボツリヌス神経毒素Aの量は、より大きな分子量のボツリヌス神経毒素複合体の量の15分の1であり、患者への毒性は著しく低減された。
より重要なことに、本発明の前記実施例によれば、低分子量のボツリヌス神経毒素Aの調製は、動物由来の成分(例えば、動物源からの調理済みの肉培地またはグリセリン)を含まなくてもよい。このようにして、調製プロセス中の安全性を大幅に改善することができ、調製されたボツリヌス神経毒素A製品に対する動物由来の潜在的な汚染を回避することができる。
さらに、本発明の前記実施例によれば、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体を使用する2つのクロマトグラフィープロセスおよび陽イオン交換クロマトグラフィー媒体を使用するクロマトグラフィープロセスを含むボツリヌス神経毒素Aの調製は、調製プロセスの効率を改善することができる。例えば、9Lの発酵培地を使用することにより、約10〜50mg(例えば、完全毒素BoNT−A)のボツリヌス神経毒素Aを生成することができる。調製プロセスを簡単にスケールアップして、大量のボツリヌス神経毒素Aを生成することができる。
実施例1は、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことに留意されたい。前記実施例のいくつかによれば、実施例1に開示された方法はまた、高分子量(例えば、960KDa)のBoNT−A複合体を調製するために使用でき、例えば透析およびクロマトグラフィープロセス中にpH値が7以下の緩衝液を使用して精製中に修飾することができる。
(実施例2:多層多相ナノカプセル化ボツリヌス神経毒素Aの調製および経皮送達)
実施例2は、ボツリヌス神経毒素Aの多相多相ナノカプセル化の調製方法を説明する。該実施例では、ナノカプセル化を調製するために、低分子量(例えば、150KDa)の完全BoNT−Aが使用されたことに留意されたい。あるいは、高分子量のBoNT−A複合体を使用してナノカプセル化を調製することもでき、本発明はこれに限定することを意図しない。
実施例2は、ボツリヌス神経毒素Aの多相多相ナノカプセル化の調製方法を説明する。該実施例では、ナノカプセル化を調製するために、低分子量(例えば、150KDa)の完全BoNT−Aが使用されたことに留意されたい。あるいは、高分子量のBoNT−A複合体を使用してナノカプセル化を調製することもでき、本発明はこれに限定することを意図しない。
(毒素ナノセル1の調製)
生体分子(例:完全BoNT−A)を含む活性成分をナノサイズのセルまたはエマルジョンにカプセル化して、毒素ナノセルを形成することができる。毒素ナノセル1(例えば、図5AのS501または図5BのS502)を調製するために、73mgのTween−80を、完全BoNT−A生体分子を含む10gの撹拌された水性毒素作動溶液に加え、前記完全BoNT−A生体分子の効力は、1グラムあたり1000ユニット(LD50)(1000 unit/g)である。毒素作動溶液は、完全BoNT−Aストック溶液をリン酸緩衝液(20mM、pH6.8、10%エチレングリコール、3%グリセリン、2%プロピレングリコールを含む)で室温で連続希釈することで調製された。Tween−80と水性毒素作動溶液の混合物を、透明な溶液が形成されるまで約15分間撹拌した。得られた毒素ナノセル1を含む透明な溶液を、粒子サイズ分析器(Malvern PanalyticalTechnologies,Westborough,MA)で粒子サイズとゼータ(Zeta)電位について測定した。図6Aおよび表5は、毒素ナノセル1の粒径強度分布および毒素ナノセル1の粒径体積分布を示す。平均強度の粒子サイズは9.79nm(z平均値)であったことがわかる。さらに、毒素ナノセル1の粒子サイズ体積分布は、6.96nm(10%累積体積)から14.90 nm(90%累積体積)であった。
生体分子(例:完全BoNT−A)を含む活性成分をナノサイズのセルまたはエマルジョンにカプセル化して、毒素ナノセルを形成することができる。毒素ナノセル1(例えば、図5AのS501または図5BのS502)を調製するために、73mgのTween−80を、完全BoNT−A生体分子を含む10gの撹拌された水性毒素作動溶液に加え、前記完全BoNT−A生体分子の効力は、1グラムあたり1000ユニット(LD50)(1000 unit/g)である。毒素作動溶液は、完全BoNT−Aストック溶液をリン酸緩衝液(20mM、pH6.8、10%エチレングリコール、3%グリセリン、2%プロピレングリコールを含む)で室温で連続希釈することで調製された。Tween−80と水性毒素作動溶液の混合物を、透明な溶液が形成されるまで約15分間撹拌した。得られた毒素ナノセル1を含む透明な溶液を、粒子サイズ分析器(Malvern PanalyticalTechnologies,Westborough,MA)で粒子サイズとゼータ(Zeta)電位について測定した。図6Aおよび表5は、毒素ナノセル1の粒径強度分布および毒素ナノセル1の粒径体積分布を示す。平均強度の粒子サイズは9.79nm(z平均値)であったことがわかる。さらに、毒素ナノセル1の粒子サイズ体積分布は、6.96nm(10%累積体積)から14.90 nm(90%累積体積)であった。
水中油構造を有する上記毒素ナノセル1の調製は、例示のみを目的とすることに留意されたい。あるいは、図5BのS502によれば、完全BoNT−Aは、油相層によって囲まれた水相コアに含まれてもよく、本発明はそれに限定されるものではない。完全BoNT−Aがナノセル1Bの構造、すなわち、ナノセルの水相コアに含まれる場合、それに応じて、次の繰り返し可能なカプセル化ステップを調整して、新しく形成された各外層の極性がカプセル化プロセス前の現在の外層の極性と異なることを確認することもできる。
(毒素ナノセル2の調製)
カプリル酸/カプリン酸トリグリセリド(10g)を別の容器でのPEG−40硬化ヒマシ油(20g)に加え、かつ約40℃で完全に混合して室温に冷却させた。その後、0.5gの上記プロセスで調製された毒素ナノセル1を上記混合物に加え、かつ毒素ナノセル2を含む透明な溶液が形成されるまで約15分間撹拌を続けた。粒子サイズ分析器で溶液の粒子サイズとゼータ(Zeta)電位について測定した。図6Bおよび表5に示すとおり、毒素ナノセル2の平均強度粒子サイズは12.82nm(z平均値)であり、粒子サイズ体積分布は8.27nm〜25.30nmであった。
カプリル酸/カプリン酸トリグリセリド(10g)を別の容器でのPEG−40硬化ヒマシ油(20g)に加え、かつ約40℃で完全に混合して室温に冷却させた。その後、0.5gの上記プロセスで調製された毒素ナノセル1を上記混合物に加え、かつ毒素ナノセル2を含む透明な溶液が形成されるまで約15分間撹拌を続けた。粒子サイズ分析器で溶液の粒子サイズとゼータ(Zeta)電位について測定した。図6Bおよび表5に示すとおり、毒素ナノセル2の平均強度粒子サイズは12.82nm(z平均値)であり、粒子サイズ体積分布は8.27nm〜25.30nmであった。
(毒素ナノセル3の調製)
毒素ナノセル3を調製するために、上記プロセスから得られた5gの毒素ナノセル2を45gの毒素作動溶液に加えた(1000unit/gの効力)。混合物を、明るい青色の透明な溶液が形成されるまで、室温(例えば、25℃)で約15分間、約1000rpmでさらに撹拌した。毒素ナノセル3を含む得られた溶液(ナノ粒子またはナノエマルジョンとも呼ばれる)の粒子サイズとゼータ(Zeta)電位を測定した。図6Cおよび表5に示すとおり、毒素ナノセル3の平均強度粒子サイズは16.21nm(z平均値)であり、粒子サイズ体積分布は11.40nm〜25.40nmであった。
毒素ナノセル3を調製するために、上記プロセスから得られた5gの毒素ナノセル2を45gの毒素作動溶液に加えた(1000unit/gの効力)。混合物を、明るい青色の透明な溶液が形成されるまで、室温(例えば、25℃)で約15分間、約1000rpmでさらに撹拌した。毒素ナノセル3を含む得られた溶液(ナノ粒子またはナノエマルジョンとも呼ばれる)の粒子サイズとゼータ(Zeta)電位を測定した。図6Cおよび表5に示すとおり、毒素ナノセル3の平均強度粒子サイズは16.21nm(z平均値)であり、粒子サイズ体積分布は11.40nm〜25.40nmであった。
(毒素ナノセル4の調製)
毒素ナノセル4の調製は、上記毒素ナノセル2の調製と同様である。具体的には、PEG−40硬化ヒマシ油(20g)およびカプリル酸/カプリン酸トリグリセリド(10g)を約40℃の容器で完全に混合し、室温まで冷却させた。混合物を撹拌しながら上記プロセスで調製された毒素ナノセル3(0.5g)を加えた。毒素ナノセル4を含む透明な溶液が形成されるまで、混合物を約15分間撹拌し続けた。得られた透明な溶液の粒子サイズとゼータ(Zeta)電位を測定した。図6Dおよび表5に示すとおり、毒素ナノセル4の平均強度粒子サイズは20.00nm(z平均値)であり、粒子サイズ体積分布は13.80nm〜31.90nmであった。
毒素ナノセル4の調製は、上記毒素ナノセル2の調製と同様である。具体的には、PEG−40硬化ヒマシ油(20g)およびカプリル酸/カプリン酸トリグリセリド(10g)を約40℃の容器で完全に混合し、室温まで冷却させた。混合物を撹拌しながら上記プロセスで調製された毒素ナノセル3(0.5g)を加えた。毒素ナノセル4を含む透明な溶液が形成されるまで、混合物を約15分間撹拌し続けた。得られた透明な溶液の粒子サイズとゼータ(Zeta)電位を測定した。図6Dおよび表5に示すとおり、毒素ナノセル4の平均強度粒子サイズは20.00nm(z平均値)であり、粒子サイズ体積分布は13.80nm〜31.90nmであった。
(毒素ナノセル5の調製)
毒素ナノセル5の調製は、上記毒素ナノセル3の調製と同様である。具体的には、上記プロセスから得られた5gの毒素ナノセル4を45gの毒素作動溶液に加えた(1000unit/gの効力)。混合物を、明るい青色の透明な溶液が形成されるまで、約1000rpmで、室温で約15分間さらに撹拌した。毒素ナノセル5を含む得られた明るい青色の透明な溶液の粒子サイズとゼータ(Zeta)電位を測定した。図6Eおよび表5に示すとおり、毒素ナノセル5の平均強度粒子サイズは24.53nm(z平均値)であり、粒子サイズ体積分布は17.30nm〜37.70nmであった。
毒素ナノセル5の調製は、上記毒素ナノセル3の調製と同様である。具体的には、上記プロセスから得られた5gの毒素ナノセル4を45gの毒素作動溶液に加えた(1000unit/gの効力)。混合物を、明るい青色の透明な溶液が形成されるまで、約1000rpmで、室温で約15分間さらに撹拌した。毒素ナノセル5を含む得られた明るい青色の透明な溶液の粒子サイズとゼータ(Zeta)電位を測定した。図6Eおよび表5に示すとおり、毒素ナノセル5の平均強度粒子サイズは24.53nm(z平均値)であり、粒子サイズ体積分布は17.30nm〜37.70nmであった。
(毒素ナノセル6の調製)
まず、表6にリストされた成分に従ってクリーム1を調製した。具体的には、「容器1の相1」としてリストされた成分と「容器2の相2」としてリストされた成分を調製し、約70℃に加熱し、かつ容器内のすべての成分が溶解されるまで別々に撹拌した。その後、約70℃で約15分間撹拌しながら、容器2内の溶解した成分を容器1に移した。混合成分をさらに室温まで冷却させてクリーム1を形成した。
まず、表6にリストされた成分に従ってクリーム1を調製した。具体的には、「容器1の相1」としてリストされた成分と「容器2の相2」としてリストされた成分を調製し、約70℃に加熱し、かつ容器内のすべての成分が溶解されるまで別々に撹拌した。その後、約70℃で約15分間撹拌しながら、容器2内の溶解した成分を容器1に移した。混合成分をさらに室温まで冷却させてクリーム1を形成した。
形成されたクリーム1が約50℃に冷却されたとき、1グラムのクリーム1を、室温で別の容器内で上記プロセスによって調製された撹拌毒素ナノセル5に加えた。毒素ナノセル6(ナノ毒素生成物とも呼ばれる)が形成されるまで、混合物を約15分間撹拌し続けた。次に、形成された明るい青色の毒素ナノセル6の粒子サイズとゼータ電位を測定した。図6Fおよび表5に示すとおり、毒素ナノセル6の平均強度粒子サイズは25.84nm(z平均値)であり、かつ粒子サイズ体積分布は16.30nm〜53.10nmであり、全体の粒子サイズは110nm未満であった。
(毒素ナノセル6の熱安定性)
上記プロセスに従って調製された毒素ナノセル6の安定性は、様々な保存条件、例えば180日間でさらに試験され、前記保存条件には、凍結融解サイクル、冷凍条件(例えば、−20℃)、冷蔵条件(例えば、2〜8℃)、および室温(例えば、25℃)が含まれる。表7に、各凍結融解サイクル中の毒素ナノセル6の平均粒子サイズとサイズ変化を示す。さらに、表8に、様々な熱条件下での毒素ナノセル6の平均粒子サイズとサイズ変化を示す。調製された毒素ナノセル6は、6か月の試験期間中に異なる熱条件で保存される期間に(複数の凍結融解サイクル、2℃〜8℃の冷蔵保存条件、冷凍保存条件(例:−20℃)、室温(25℃など))、良好な安定性と小さな寸法変化を示す。毒素ナノセル6は、生物活性の損失を避けるために、上記の様々な保存温度条件を比較することにより、低温(例:−20℃)で保存された。
上記プロセスに従って調製された毒素ナノセル6の安定性は、様々な保存条件、例えば180日間でさらに試験され、前記保存条件には、凍結融解サイクル、冷凍条件(例えば、−20℃)、冷蔵条件(例えば、2〜8℃)、および室温(例えば、25℃)が含まれる。表7に、各凍結融解サイクル中の毒素ナノセル6の平均粒子サイズとサイズ変化を示す。さらに、表8に、様々な熱条件下での毒素ナノセル6の平均粒子サイズとサイズ変化を示す。調製された毒素ナノセル6は、6か月の試験期間中に異なる熱条件で保存される期間に(複数の凍結融解サイクル、2℃〜8℃の冷蔵保存条件、冷凍保存条件(例:−20℃)、室温(25℃など))、良好な安定性と小さな寸法変化を示す。毒素ナノセル6は、生物活性の損失を避けるために、上記の様々な保存温度条件を比較することにより、低温(例:−20℃)で保存された。
(毒素ナノセル6を使用した治療および薬用化粧品の適用)
調製された毒素ナノセル6は、エッセンスの形で調製され、かつ治療および薬用化粧品の適用で患者の顔面領域で試験された。具体的には、毒素ナノセル6の塗布前の各患者の顔面領域をカラー画像で記録した。その後、上記プロセスで調製された毒素ナノセル6を含む約0.2mLのエッセンスを、交差したカラスの顔面領域の片側に1回だけ塗布した。その後、それらを連続して観察し、かつそれぞれ1週間、2週間、4週間に記録した。図7は、本発明の様々な実施例に従って調製されたナノカプセル化ボツリヌス神経毒素Aを塗布した患者の顔面領域の比較を示す。2週間後、毒素ナノセル6を使用して局所的に塗布された顔のしわの緩和と減少がはっきりと観察され、かつ、効果が引き続き顕著であることがわかる。さらに、毒素ナノセル6を使用して顔面領域を1回だけ塗布しても、4週間後に皮膚の引き締めとしわの開きが観察された。
調製された毒素ナノセル6は、エッセンスの形で調製され、かつ治療および薬用化粧品の適用で患者の顔面領域で試験された。具体的には、毒素ナノセル6の塗布前の各患者の顔面領域をカラー画像で記録した。その後、上記プロセスで調製された毒素ナノセル6を含む約0.2mLのエッセンスを、交差したカラスの顔面領域の片側に1回だけ塗布した。その後、それらを連続して観察し、かつそれぞれ1週間、2週間、4週間に記録した。図7は、本発明の様々な実施例に従って調製されたナノカプセル化ボツリヌス神経毒素Aを塗布した患者の顔面領域の比較を示す。2週間後、毒素ナノセル6を使用して局所的に塗布された顔のしわの緩和と減少がはっきりと観察され、かつ、効果が引き続き顕著であることがわかる。さらに、毒素ナノセル6を使用して顔面領域を1回だけ塗布しても、4週間後に皮膚の引き締めとしわの開きが観察された。
(実施例3:多層多相ナノカプセル化ヒアルロン酸の調製と経皮送達)
本発明の前記実施例によれば、ナノカプセル化生体分子を調製する例示的な方法は、1500KDaのヒアルロン酸(HA)を含む複数の高分子量生体分子を調製するために使用することができる。実施例3は、ナノカプセル化HAを調製する方法、および治療および薬用化粧品適用におけるその経皮送達を説明する。
本発明の前記実施例によれば、ナノカプセル化生体分子を調製する例示的な方法は、1500KDaのヒアルロン酸(HA)を含む複数の高分子量生体分子を調製するために使用することができる。実施例3は、ナノカプセル化HAを調製する方法、および治療および薬用化粧品適用におけるその経皮送達を説明する。
(HAナノセル1の調製)
前述実施例、例えば図5Aおよび5Bに従って、HA生体分子でカプセル化されたナノセルを形成し、かつ各調製プロセス中のHAナノセルのサイズ分布を監視した。特に、HAナノセル1を調製するために、180mgのPEG−40硬化ヒマシ油液(融解のために約40℃に加熱する)に、容器での0.1%HA(および20ppmの銅トリペプチド−1、10ppmのパルミトイルペンタペプチド−4、および10ppmのヘキサペプチドアクイリン)を含む10gの水溶液を加えて撹拌しながら完全に混合させた。透明な溶液が形成されるまで、撹拌を約30分間維持した。HAナノセル1を含む得られた透明な溶液の粒子サイズとゼータ(Zeta)電位を、粒子サイズアナライザーを使用して測定した。図8Aおよび表9に示すとおり、形成されたHAナノセル1の平均強度粒子サイズは9.91nm(z平均値)であった。さらに、粒子サイズ体積分布は7.04nm(10%の累積体積)から15.30nm(90%の累積体積)であった。
前述実施例、例えば図5Aおよび5Bに従って、HA生体分子でカプセル化されたナノセルを形成し、かつ各調製プロセス中のHAナノセルのサイズ分布を監視した。特に、HAナノセル1を調製するために、180mgのPEG−40硬化ヒマシ油液(融解のために約40℃に加熱する)に、容器での0.1%HA(および20ppmの銅トリペプチド−1、10ppmのパルミトイルペンタペプチド−4、および10ppmのヘキサペプチドアクイリン)を含む10gの水溶液を加えて撹拌しながら完全に混合させた。透明な溶液が形成されるまで、撹拌を約30分間維持した。HAナノセル1を含む得られた透明な溶液の粒子サイズとゼータ(Zeta)電位を、粒子サイズアナライザーを使用して測定した。図8Aおよび表9に示すとおり、形成されたHAナノセル1の平均強度粒子サイズは9.91nm(z平均値)であった。さらに、粒子サイズ体積分布は7.04nm(10%の累積体積)から15.30nm(90%の累積体積)であった。
水中油構造を有する上記HAナノセル1の調製は、例示目的のみであることに留意されたい。あるいは、図5BのS502に従って、油相層によってカプセル化された水相コアにHAを含めることができ、本発明は限定することを意図していない。HAがナノセル1Bの構造、すなわち、ナノセルの水相コアに含まれる場合、それに応じて、次の繰り返し可能なカプセル化ステップを調整することにより、新しく形成された各外層の極性がカプセル化プロセス前の現在の外層の極性と異なることを確認することもできる。
(HAナノセル2の調製)
別の容器で、カプリル酸/カプリン酸トリグリセリド(10g)をCremophor EL(20g)に加え、かつ約40℃で完全に混合した。その後、上記プロセスで調製された0.5gのHAナノセル1を混合物に加え、かつ、透明な溶液が形成されるまで約30分間撹拌し続けた。HAナノセル2を含む得られた透明な溶液の粒子サイズとゼータ(Zeta)電位を測定した。図8Bおよび表9に示すとおり、形成されたHAナノセル2の平均強度粒子サイズは12.90nm(z平均値)であり、粒子サイズ体積分布は8.47nmから23.70nmであった。
別の容器で、カプリル酸/カプリン酸トリグリセリド(10g)をCremophor EL(20g)に加え、かつ約40℃で完全に混合した。その後、上記プロセスで調製された0.5gのHAナノセル1を混合物に加え、かつ、透明な溶液が形成されるまで約30分間撹拌し続けた。HAナノセル2を含む得られた透明な溶液の粒子サイズとゼータ(Zeta)電位を測定した。図8Bおよび表9に示すとおり、形成されたHAナノセル2の平均強度粒子サイズは12.90nm(z平均値)であり、粒子サイズ体積分布は8.47nmから23.70nmであった。
(HAナノセル3の調製)
上記プロセスで調製された5グラム(5g)のHAナノセル2を、約40℃で、約800rpmの撹拌速度で、0.1%HA(および20ppmの銅トリペプチド−1、10ppmのパルミトイルペンタペプチド−4、および10ppmのヘキサペプチドアクイリン)を含む45gの水溶液に加えた。透明な溶液が形成されるまで、撹拌を約30分間維持した。HAナノセル1を含む得られた透明な溶液の粒子サイズとゼータ(Zeta)電位を測定した。図8Cおよび表9に示すとおり、HAナノセル3の平均強度粒子サイズは18.70nm(z平均値)であり、粒子サイズ体積分布は12.50nmから29.90nmであった。
上記プロセスで調製された5グラム(5g)のHAナノセル2を、約40℃で、約800rpmの撹拌速度で、0.1%HA(および20ppmの銅トリペプチド−1、10ppmのパルミトイルペンタペプチド−4、および10ppmのヘキサペプチドアクイリン)を含む45gの水溶液に加えた。透明な溶液が形成されるまで、撹拌を約30分間維持した。HAナノセル1を含む得られた透明な溶液の粒子サイズとゼータ(Zeta)電位を測定した。図8Cおよび表9に示すとおり、HAナノセル3の平均強度粒子サイズは18.70nm(z平均値)であり、粒子サイズ体積分布は12.50nmから29.90nmであった。
(HAナノセル4の調製)
HAナノセル4の調製は、上記HAナノセル2の調製と同様である。特に、カプリル酸/カプリン酸トリグリセリド(10g)をCremophor EL(20g)に加えて約40℃で完全に混合した。その後、上記プロセスで調製されたHAナノセル3(0.5g)を混合物に加えた。HAナノセル4を含む透明な溶液が形成されるまで約30分間撹拌し続けた。得られた透明な溶液の粒子サイズとゼータ(Zeta)電位を測定した。図8Dおよび表9に示すとおり、HAナノセル4の平均強度粒子サイズは21.95nm(z平均値)であり、粒子サイズ体積分布は16.10nmから33.40nmであった。
HAナノセル4の調製は、上記HAナノセル2の調製と同様である。特に、カプリル酸/カプリン酸トリグリセリド(10g)をCremophor EL(20g)に加えて約40℃で完全に混合した。その後、上記プロセスで調製されたHAナノセル3(0.5g)を混合物に加えた。HAナノセル4を含む透明な溶液が形成されるまで約30分間撹拌し続けた。得られた透明な溶液の粒子サイズとゼータ(Zeta)電位を測定した。図8Dおよび表9に示すとおり、HAナノセル4の平均強度粒子サイズは21.95nm(z平均値)であり、粒子サイズ体積分布は16.10nmから33.40nmであった。
(HAナノセル5の調製)
HAナノセル5の調製は、上記HAナノセル3の調製と同様である。特に、上記プロセスで調製されたHAナノセル4(5g)を、約40℃で、約800rpmの撹拌速度で、0.1%HA(および20ppmの銅トリペプチド−1、10ppmのパルミトイルペンタペプチド−4、および10ppmのヘキサペプチドアクイリン)を含む45gの水溶液に加えた。混合物を、HAナノセル5を含む明るい青色の溶液が得られるまで約30分間撹拌し続けた。得られた明るい青色の溶液の粒子サイズとゼータ(Zeta)電位を測定した。図8Eおよび表9に示すとおり、HAナノセル5の平均強度粒子サイズは27.65nm(z平均値)であり、粒子サイズ体積分布は17.00nmから52.80nmであった。
HAナノセル5の調製は、上記HAナノセル3の調製と同様である。特に、上記プロセスで調製されたHAナノセル4(5g)を、約40℃で、約800rpmの撹拌速度で、0.1%HA(および20ppmの銅トリペプチド−1、10ppmのパルミトイルペンタペプチド−4、および10ppmのヘキサペプチドアクイリン)を含む45gの水溶液に加えた。混合物を、HAナノセル5を含む明るい青色の溶液が得られるまで約30分間撹拌し続けた。得られた明るい青色の溶液の粒子サイズとゼータ(Zeta)電位を測定した。図8Eおよび表9に示すとおり、HAナノセル5の平均強度粒子サイズは27.65nm(z平均値)であり、粒子サイズ体積分布は17.00nmから52.80nmであった。
(HAナノセル6の調製)
実施例2に記載された完全BoNT−Aを含む毒素ナノセル6の調製プロセスと同様に、まず、表5にリストされた成分に従ってクリーム1を調製した。さらに、調製したクリーム1を約50℃に冷却させ、1グラムのクリーム1を、40℃の別の容器で上記プロセスによって調製された撹拌したHAナノセル5に加えた。HAナノセル6(HAナノ製品とも呼ばれる)が形成されるまで、混合物を約30分間撹拌し続けた。その後、形成されたHAナノセル6の粒子サイズとゼータ(Zeta)電位を測定した。図8Fおよび表9に示すとおり、HAナノセル6の平均強度粒子サイズは29.72nm(z平均値)であり、粒子サイズ体積分布は18.00nmから61.10nmであり、全体の粒子サイズは130nm未満であった。
実施例2に記載された完全BoNT−Aを含む毒素ナノセル6の調製プロセスと同様に、まず、表5にリストされた成分に従ってクリーム1を調製した。さらに、調製したクリーム1を約50℃に冷却させ、1グラムのクリーム1を、40℃の別の容器で上記プロセスによって調製された撹拌したHAナノセル5に加えた。HAナノセル6(HAナノ製品とも呼ばれる)が形成されるまで、混合物を約30分間撹拌し続けた。その後、形成されたHAナノセル6の粒子サイズとゼータ(Zeta)電位を測定した。図8Fおよび表9に示すとおり、HAナノセル6の平均強度粒子サイズは29.72nm(z平均値)であり、粒子サイズ体積分布は18.00nmから61.10nmであり、全体の粒子サイズは130nm未満であった。
(HAナノセル6の熱安定性)
同様に、上記プロセスに従って調製されたHAナノセル6の安定性は、様々な保存条件、例えば180日間でさらに試験され、前記保存条件には、凍結融解サイクル、冷蔵条件(例えば、2〜8℃)、室温(例えば、25℃)および高温(例えば、40℃)が含まれる。表10に、各凍結融解サイクル中のHAナノセル6の平均粒子サイズとサイズ変化を示す。さらに、表11に、様々な熱条件下でのHAナノセル6の平均粒子サイズとサイズ変化を示す。調製されたHAナノセル6は、6か月の試験期間中に異なる熱条件で保存される期間に(複数の凍結融解サイクル、冷蔵保存条件(例えば、2〜8℃)、室温(例えば、25℃)および高温(例えば、40℃))、良好な安定性と小さな寸法変化を示す。上記の様々な保存熱条件を比較することにより、HAナノセル6を室温で保存され、HAの生物活性の依存に十分である。
(HAナノセル6を使用した治療および薬用化粧品の適用)
調製されたHAナノセル6はエッセンスの形態であり、かつ治療および薬用化粧品適用(例えば、創傷治癒ならびにたるみおよび肌荒れ修復)で患者の異なる皮膚領域で試験される。
調製されたHAナノセル6はエッセンスの形態であり、かつ治療および薬用化粧品適用(例えば、創傷治癒ならびにたるみおよび肌荒れ修復)で患者の異なる皮膚領域で試験される。
創傷治癒のために、HAナノセル6の塗布前の各患者の皮膚領域をカラー画像で記録した。その後、上記プロセスで調製されたHAナノセル6を含む約1mLのエッセンスを、1日2回、新たに損傷した皮膚領域(もはや出血しない)に塗布した。観察は順番に行われ、それぞれ1日間、3日間、5日間記録された。図9のケース5〜7は、本発明の様々な実施例による創傷治癒のために調製されたナノカプセル化HAを塗布した患者の皮膚領域の比較を示す。新たに損傷した皮膚領域については、ナノカプセル化HAを含むエッセンスを1週間塗布した後、創傷領域は完全に治癒し、皮膚はきれいになり、瘢痕はなかった。
たるみと肌荒れの修復については、ナノカプセル化HAを含むエッセンスによる皮膚領域の治療は、創傷修復用途の治療と同様である。観察は、それぞれ1週間、2週間、3週間で連続して行われ、記録された。図9のケース8−9は、本発明の様々な実施例に従って、たるみと肌荒れの修復のために調製されたナノカプセル化HAを塗布した患者の皮膚領域の比較を示す。3週間の治療後に、肌の引き締めと目に見える肌の色/色合いの増白およびしわの減少が観察されたことがわかる。
本発明の前記実施例と実施例によれば、ナノカプセル化生体分子(例えば、BoNT−A毒素ナノセルおよびHAナノセル)を調製するための開示された方法は、安定で生理活性を持つナノ粒子を生成することができ、それは、様々な適用で示されるように臨床的改善を示した。この改善は、コアカプセル化、または多層ナノ粒子の間、またはナノ粒子の表面に固定された活性成分(BoNT−AまたはHA)の皮下細胞への迅速かつ効率的な送達によってもたらされた。
ナノカプセル化生体分子を調製するための開示された方法は、ミセル形成プロセスと複数のカプセル化プロセスを組み合わせてシステムプログラムとすることができる。各親水性活性成分は、カプセル化プロセスのために親水性相に溶解することができ、各疎水性活性成分は、カプセル化プロセスのために疎水性相に溶解することができる。したがって、異なる極性および溶解度を有する様々な活性成分を、経皮バリア送達タスクのために単一の多層ナノ粒子内にカプセル化することができ、その結果、複数の機能を達成するために異なる活性成分を運ぶ多層ナノ粒子が得られ、単一のタイプの成分のみを含むナノ粒子よりも、非常に幅広い用途がある。
本発明の原理および実施は、本発明の特定の実施例に関して説明されるが、実施例の前記説明は、本発明の方法および方法の中核思想の理解を助けることのみを意図している。同時に、当業者は、本発明の思想に従って特定の実施例および適用範囲を修正することができる。結論として、明細書の内容は、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
[付記]
[付記1]
生理活性を持つボツリヌス神経毒素を調製する方法であって、
1)細菌であるボツリヌス菌を動物由来の成分を含まない発酵培地で発酵させるステップと、
2)細菌である前記ボツリヌス菌を含む前記発酵培地を陰イオン交換培地のスラリーと接触させ、かつ、前記ボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を遠心分離により取得するステップと、
3)前記上澄み液を透析し、かつ、前記ボツリヌス神経毒素を含む透析後の溶液を収集するステップと、
4)前記ボツリヌス神経毒素を含む前記透析後の溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
5)ステップ3)および4)を繰り返し、前記ボツリヌス神経毒素を含む溶出液を取得し、かつ、前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した前記溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
6)前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した前記ボツリヌス神経毒素を含む前記溶出液を収集するステップと、
を含む、
ことを特徴とする、方法。
[付記1]
生理活性を持つボツリヌス神経毒素を調製する方法であって、
1)細菌であるボツリヌス菌を動物由来の成分を含まない発酵培地で発酵させるステップと、
2)細菌である前記ボツリヌス菌を含む前記発酵培地を陰イオン交換培地のスラリーと接触させ、かつ、前記ボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を遠心分離により取得するステップと、
3)前記上澄み液を透析し、かつ、前記ボツリヌス神経毒素を含む透析後の溶液を収集するステップと、
4)前記ボツリヌス神経毒素を含む前記透析後の溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
5)ステップ3)および4)を繰り返し、前記ボツリヌス神経毒素を含む溶出液を取得し、かつ、前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した前記溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
6)前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した前記ボツリヌス神経毒素を含む前記溶出液を収集するステップと、
を含む、
ことを特徴とする、方法。
[付記2]
動物由来の成分を含まない前記発酵培地は植物ペプトンを含む、
付記1に記載の方法。
動物由来の成分を含まない前記発酵培地は植物ペプトンを含む、
付記1に記載の方法。
[付記3]
動物由来の成分を含まない前記発酵培地は、デキストロース、酵母抽出物、および自己分解酵母スラッジの少なくとも1つをさらに含む、
付記2に記載の方法。
動物由来の成分を含まない前記発酵培地は、デキストロース、酵母抽出物、および自己分解酵母スラッジの少なくとも1つをさらに含む、
付記2に記載の方法。
[付記4]
前記植物性ペプトンは、大豆、ジャガイモ、または米の少なくとも1つから得られる、
付記2に記載の方法。
前記植物性ペプトンは、大豆、ジャガイモ、または米の少なくとも1つから得られる、
付記2に記載の方法。
[付記5]
ステップ2)において、前記ボツリヌス菌を含む前記発酵培地の収穫時に酸を加えて酸性スラッジを形成して沈殿させる、
付記1に記載の方法。
ステップ2)において、前記ボツリヌス菌を含む前記発酵培地の収穫時に酸を加えて酸性スラッジを形成して沈殿させる、
付記1に記載の方法。
[付記6]
ステップ2)とステップ3)との間に、さらに、
細菌である前記ボツリヌス菌を含む前記発酵培地を陰イオン交換培地スラリーと接触させるステップを繰り返し、かつ、遠心分離によりボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を得ることと、
前記発酵培地を前記陰イオン交換培地スラリーと繰り返し接触させることにより得られた前記ボツリヌス神経毒素を含む前記上澄み液を混合することと、を含む、
付記1に記載の方法。
ステップ2)とステップ3)との間に、さらに、
細菌である前記ボツリヌス菌を含む前記発酵培地を陰イオン交換培地スラリーと接触させるステップを繰り返し、かつ、遠心分離によりボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を得ることと、
前記発酵培地を前記陰イオン交換培地スラリーと繰り返し接触させることにより得られた前記ボツリヌス神経毒素を含む前記上澄み液を混合することと、を含む、
付記1に記載の方法。
[付記7]
ステップ5)は、さらに、
前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから得られた前記ボツリヌス神経毒素を含む前記溶出液を前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させる前に、前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから得られた前記ボツリヌス神経毒素の前記溶出液を透析することを含む、
付記1に記載の方法。
ステップ5)は、さらに、
前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから得られた前記ボツリヌス神経毒素を含む前記溶出液を前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させる前に、前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから得られた前記ボツリヌス神経毒素の前記溶出液を透析することを含む、
付記1に記載の方法。
[付記8]
前記ボツリヌス神経毒素はボツリヌス神経毒素Aである、
付記1に記載の方法。
前記ボツリヌス神経毒素はボツリヌス神経毒素Aである、
付記1に記載の方法。
[付記9]
前記ボツリヌス神経毒素Aの生物学的比活性は、マウスLD50を用いて測定して、100〜400unit/ngである、
付記8に記載の方法。
前記ボツリヌス神経毒素Aの生物学的比活性は、マウスLD50を用いて測定して、100〜400unit/ngである、
付記8に記載の方法。
[付記10]
ステップ6)の後、
前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから得られた前記ボツリヌス神経毒素を含む前記溶出液を、エチレングリコール、グリセリン、およびプロピレングリコールを含む安定剤と混合することをさらに含む、
付記1に記載の方法。
ステップ6)の後、
前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから得られた前記ボツリヌス神経毒素を含む前記溶出液を、エチレングリコール、グリセリン、およびプロピレングリコールを含む安定剤と混合することをさらに含む、
付記1に記載の方法。
[付記11]
前記安定剤は、エチレングリコール、グリセリン、およびプロピレングリコールを含み、前記溶出液への添加後の前記安定剤の濃度は、総体積に基づいて10〜30(w/v)%の範囲である、
付記10に記載の方法
前記安定剤は、エチレングリコール、グリセリン、およびプロピレングリコールを含み、前記溶出液への添加後の前記安定剤の濃度は、総体積に基づいて10〜30(w/v)%の範囲である、
付記10に記載の方法
[付記12]
前記安定剤において、
前記溶出液に添加された後の前記エチレングリコールの濃度は、5〜20(w/v)%の範囲であり、
前記溶出液に添加された後の前記グリセリンの濃度は、1〜10(w/v)%の範囲であり、
前記溶出液に添加された後の前記プロピレングリコールの濃度は、1〜5(w/v)%の範囲である、
付記11に記載の方法。
前記安定剤において、
前記溶出液に添加された後の前記エチレングリコールの濃度は、5〜20(w/v)%の範囲であり、
前記溶出液に添加された後の前記グリセリンの濃度は、1〜10(w/v)%の範囲であり、
前記溶出液に添加された後の前記プロピレングリコールの濃度は、1〜5(w/v)%の範囲である、
付記11に記載の方法。
[付記13]
最内層の水相コアまたは油相コアと、
複数の水相層と、
複数の油相層と、
最外層のクリーム層と、を含み、
前記複数の水相層のそれぞれおよび前記複数の油相層のそれぞれは、前記水相コアまたは前記油相コアを交互に囲み、水相と油相が互い違いになった多層多相ナノ粒子を形成し、
前記水相コアおよび前記水相層には、生体分子を含み、
前記生体分子は、ボツリヌス神経毒素および/またはヒアルロン酸などの水溶性分子を含み、
前記油相コアおよび前記油相層には、油溶性分子を含む、
多層多相ナノ粒子。
最内層の水相コアまたは油相コアと、
複数の水相層と、
複数の油相層と、
最外層のクリーム層と、を含み、
前記複数の水相層のそれぞれおよび前記複数の油相層のそれぞれは、前記水相コアまたは前記油相コアを交互に囲み、水相と油相が互い違いになった多層多相ナノ粒子を形成し、
前記水相コアおよび前記水相層には、生体分子を含み、
前記生体分子は、ボツリヌス神経毒素および/またはヒアルロン酸などの水溶性分子を含み、
前記油相コアおよび前記油相層には、油溶性分子を含む、
多層多相ナノ粒子。
[付記14]
付記13に記載の多層多相ナノ粒子であって、
前記ボツリヌス神経毒素の調製方法が、
1)細菌であるボツリヌス菌を動物由来の成分を含まない発酵培地で発酵させるステップと、
2)細菌である前記ボツリヌス菌を含む前記発酵培地を陰イオン交換培地のスラリーと接触させ、かつ、前記ボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を遠心分離により取得するステップと、
3)前記上澄み液を透析し、かつ、前記生体分子を含む透析後の溶液を収集するステップと、
4)前記ボツリヌス神経毒素を含む前記透析後の溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
5)ステップ3)および4)を繰り返し、前記ボツリヌス神経毒素を含む溶出液を取得し、かつ、前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した前記溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
6)前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した前記ボツリヌス神経毒素を含む前記溶出液を収集するステップと、
を含む、
多層多相ナノ粒子。
付記13に記載の多層多相ナノ粒子であって、
前記ボツリヌス神経毒素の調製方法が、
1)細菌であるボツリヌス菌を動物由来の成分を含まない発酵培地で発酵させるステップと、
2)細菌である前記ボツリヌス菌を含む前記発酵培地を陰イオン交換培地のスラリーと接触させ、かつ、前記ボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を遠心分離により取得するステップと、
3)前記上澄み液を透析し、かつ、前記生体分子を含む透析後の溶液を収集するステップと、
4)前記ボツリヌス神経毒素を含む前記透析後の溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
5)ステップ3)および4)を繰り返し、前記ボツリヌス神経毒素を含む溶出液を取得し、かつ、前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した前記溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
6)前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した前記ボツリヌス神経毒素を含む前記溶出液を収集するステップと、
を含む、
多層多相ナノ粒子。
[付記15]
前記多層多相ナノ粒子の平均サイズは1〜200ナノメートルである、
付記13に記載の多層多相ナノ粒子。
前記多層多相ナノ粒子の平均サイズは1〜200ナノメートルである、
付記13に記載の多層多相ナノ粒子。
[付記16]
前記水性コアまたは前記油相コアの平均サイズは1〜200ナノメートルの範囲である、
付記13に記載の多層多相ナノ粒子。
前記水性コアまたは前記油相コアの平均サイズは1〜200ナノメートルの範囲である、
付記13に記載の多層多相ナノ粒子。
[付記17]
前記最外層のクリーム層は、水相混合物および油相混合物を含み、
前記水相混合物は、グリセリン、グリチルリチン酸二カリウム、ペンタンジオール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、メチルパラベン、およびカルボマーのうちの少なくとも1つを含み、
前記油相混合物は、鉱油、セテアリルアルコール、プロピルパラベン、メチルパラベン、PEG−100ステアリン酸塩、PEG−40硬化ヒマシ油、カプリル酸/カプリン酸トリグリセリド、Tween−80、Cremophor EL、ステアリン酸グリセリル、Tween−65、Tween−60、Tween−20、Labrafac Lipophile WL 1349、大豆油、茶油、植物油、ひまわり油、魚油、ゴマ油、ビタミンE、動物性脂肪、グリセリルオクタノエート、レシチン卵ホスファチジルコリン、ポリ(プロピレンオキシド)、ポリ(D、L−乳酸)、ポリ(ε−カプロラクトン)、ポリ(L−アスパラギン酸)およびポロキサマー、PEG−ポリグルタミン酸、PEG−ポリアスパラギン酸、PEG−ポリ−L−ラクチド、PEG誘導体、ソルビタンモノパルミテートおよびソルビタンオレイン酸塩のうちの少なくとも1つを含む、
付記13に記載の多層多相ナノ粒子。
前記最外層のクリーム層は、水相混合物および油相混合物を含み、
前記水相混合物は、グリセリン、グリチルリチン酸二カリウム、ペンタンジオール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、メチルパラベン、およびカルボマーのうちの少なくとも1つを含み、
前記油相混合物は、鉱油、セテアリルアルコール、プロピルパラベン、メチルパラベン、PEG−100ステアリン酸塩、PEG−40硬化ヒマシ油、カプリル酸/カプリン酸トリグリセリド、Tween−80、Cremophor EL、ステアリン酸グリセリル、Tween−65、Tween−60、Tween−20、Labrafac Lipophile WL 1349、大豆油、茶油、植物油、ひまわり油、魚油、ゴマ油、ビタミンE、動物性脂肪、グリセリルオクタノエート、レシチン卵ホスファチジルコリン、ポリ(プロピレンオキシド)、ポリ(D、L−乳酸)、ポリ(ε−カプロラクトン)、ポリ(L−アスパラギン酸)およびポロキサマー、PEG−ポリグルタミン酸、PEG−ポリアスパラギン酸、PEG−ポリ−L−ラクチド、PEG誘導体、ソルビタンモノパルミテートおよびソルビタンオレイン酸塩のうちの少なくとも1つを含む、
付記13に記載の多層多相ナノ粒子。
[付記18]
前記ボツリヌス神経毒素は、ボツリヌス神経毒素複合体および完全ボツリヌス神経毒素のうちの1つを含む、
付記13に記載の多層多相ナノ粒子。
前記ボツリヌス神経毒素は、ボツリヌス神経毒素複合体および完全ボツリヌス神経毒素のうちの1つを含む、
付記13に記載の多層多相ナノ粒子。
[付記19]
前記複数の水相層の1つ以上は親水性分子を含み、および/または、前記複数の油相層の1つ以上は疎水性分子を含む、
付記13に記載の多層多相ナノ粒子。
前記複数の水相層の1つ以上は親水性分子を含み、および/または、前記複数の油相層の1つ以上は疎水性分子を含む、
付記13に記載の多層多相ナノ粒子。
[付記20]
前記親水性分子は、ヒアルロン酸、細胞増殖因子、幹細胞、幹細胞液、ペプチド、タンパク質、アプタマー、オリゴヌクレオチド、ビタミン、Snap−8オクタペプチド、ジペプチド、アクイリンヘキサペプチド、アラントイン、ナイアシンアミド、アロエベラ、アントシアニン、グリチルリチン酸二カリウム、アルブチン、アミノ酪酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、アミノ糖、N−アセチルカルノシン、L−カルノシン、補酵素、フロスアルビジアエ抽出物、キビ草抽出物、ベタイン、トレハロース、エリスリトール、マンニトール、カルボマー、ビタミンC、ヒドロキシエチルセルロース、銅トリペプチド、アセチルキトサミン、ガストロジン、アセチルヘキサペプチド−8、アセチルヘキサペプチド−1、L−トリプトファン、5−ヒドロキシトリプトファン、クエン酸、リパーゼ、ルブラジェル、セラミド3、ミルク抽出物、アロエベラの葉の水、高麗人参の根の水、加水分解コラーゲン、ノナペプチド−1、ヘキサペプチド−1、β−グルカン、プロピレングリコール、グリセリン、エチレングリコール、ブタンジオール、ニコチン酸、フィト酸、プエラリン、カンゾウ、スノーグラス抽出物、ジンセノシド、レスベラトロール、パルミトイルペンタペプチド−4、パルミトイルトリペプチド−1、パルミトイルテトラペプチド−7、パルミトイルオリゴペプチド、アプタマー、si−RNA、幹細胞、および治療剤などのうちの少なくとも1つを含む、
付記19に記載の多層多相ナノ粒子。
前記親水性分子は、ヒアルロン酸、細胞増殖因子、幹細胞、幹細胞液、ペプチド、タンパク質、アプタマー、オリゴヌクレオチド、ビタミン、Snap−8オクタペプチド、ジペプチド、アクイリンヘキサペプチド、アラントイン、ナイアシンアミド、アロエベラ、アントシアニン、グリチルリチン酸二カリウム、アルブチン、アミノ酪酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、アミノ糖、N−アセチルカルノシン、L−カルノシン、補酵素、フロスアルビジアエ抽出物、キビ草抽出物、ベタイン、トレハロース、エリスリトール、マンニトール、カルボマー、ビタミンC、ヒドロキシエチルセルロース、銅トリペプチド、アセチルキトサミン、ガストロジン、アセチルヘキサペプチド−8、アセチルヘキサペプチド−1、L−トリプトファン、5−ヒドロキシトリプトファン、クエン酸、リパーゼ、ルブラジェル、セラミド3、ミルク抽出物、アロエベラの葉の水、高麗人参の根の水、加水分解コラーゲン、ノナペプチド−1、ヘキサペプチド−1、β−グルカン、プロピレングリコール、グリセリン、エチレングリコール、ブタンジオール、ニコチン酸、フィト酸、プエラリン、カンゾウ、スノーグラス抽出物、ジンセノシド、レスベラトロール、パルミトイルペンタペプチド−4、パルミトイルトリペプチド−1、パルミトイルテトラペプチド−7、パルミトイルオリゴペプチド、アプタマー、si−RNA、幹細胞、および治療剤などのうちの少なくとも1つを含む、
付記19に記載の多層多相ナノ粒子。
[付記21]
前記疎水性分子は、ワクシニアミルティラス種子油、プルケネチアヴォルビリス種子油、アルガニアスピノサカーネルオイル、ペンタクレスラマクロロバ種子油、バートホルレチアエクセルサ種子油、ブチロスパーマムパーキーフルーツ脂肪、ゼラニウムオイル、ココナッツ油、小麦胚芽油、オリーブオイル、シアバター、月見草オイル、ラノリン、蜜蝋、レシチン、ホホバワックス、メントール、サリチル酸メチル、ビタミンE、ルテイン、ゼアキサンチン、シナモン油、ジンジャールートオイル、バニリルブチルエーテル、ラノステロール、ビタミンA、大豆イソフラボン、フィトステロール、フィトステロールエステル、大豆油、ティーシードオイル、シーバックソーンオイル、グレープシードオイル、アーモンドオイル、ウィンターグリーンオイル、ホホバオイルなどのうちの少なくとも1つを含む、
付記19に記載の多層多相ナノ粒子。
前記疎水性分子は、ワクシニアミルティラス種子油、プルケネチアヴォルビリス種子油、アルガニアスピノサカーネルオイル、ペンタクレスラマクロロバ種子油、バートホルレチアエクセルサ種子油、ブチロスパーマムパーキーフルーツ脂肪、ゼラニウムオイル、ココナッツ油、小麦胚芽油、オリーブオイル、シアバター、月見草オイル、ラノリン、蜜蝋、レシチン、ホホバワックス、メントール、サリチル酸メチル、ビタミンE、ルテイン、ゼアキサンチン、シナモン油、ジンジャールートオイル、バニリルブチルエーテル、ラノステロール、ビタミンA、大豆イソフラボン、フィトステロール、フィトステロールエステル、大豆油、ティーシードオイル、シーバックソーンオイル、グレープシードオイル、アーモンドオイル、ウィンターグリーンオイル、ホホバオイルなどのうちの少なくとも1つを含む、
付記19に記載の多層多相ナノ粒子。
[付記22]
前記治療剤は、インスリン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、5−フルオロウラシル、ダカルバジン、イブプロフェン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、エストリオール、プロゲステロン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、エストラジオール、AgNO3をはじめとする銀イオン、ZnOをはじめとするZnイオン、抗生物質、ホルモン、フェロモン、フェロモン、原薬分子と植物抽出物などのうちの少なくとも1つを含む、
付記20または21に記載の多層多相ナノ粒子。
前記治療剤は、インスリン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、5−フルオロウラシル、ダカルバジン、イブプロフェン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、エストリオール、プロゲステロン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、エストラジオール、AgNO3をはじめとする銀イオン、ZnOをはじめとするZnイオン、抗生物質、ホルモン、フェロモン、フェロモン、原薬分子と植物抽出物などのうちの少なくとも1つを含む、
付記20または21に記載の多層多相ナノ粒子。
Claims (22)
- 生理活性を持つボツリヌス神経毒素を調製する方法であって、
1)細菌であるボツリヌス菌を動物由来の成分を含まない発酵培地で発酵させるステップと、
2)細菌である前記ボツリヌス菌を含む前記発酵培地を陰イオン交換培地のスラリーと接触させ、かつ、前記ボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を遠心分離により取得するステップと、
3)前記上澄み液を透析し、かつ、前記ボツリヌス神経毒素を含む透析後の溶液を収集するステップと、
4)前記ボツリヌス神経毒素を含む前記透析後の溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
5)ステップ3)および4)を繰り返し、前記ボツリヌス神経毒素を含む溶出液を取得し、かつ、前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した前記溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
6)前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した前記ボツリヌス神経毒素を含む前記溶出液を収集するステップと、
を含む、
ことを特徴とする、方法。 - 動物由来の成分を含まない前記発酵培地は植物ペプトンを含む、
請求項1に記載の方法。 - 動物由来の成分を含まない前記発酵培地は、デキストロース、酵母抽出物、および自己分解酵母スラッジの少なくとも1つをさらに含む、
請求項2に記載の方法。 - 前記植物性ペプトンは、大豆、ジャガイモ、または米の少なくとも1つから得られる、
請求項2に記載の方法。 - ステップ2)において、前記ボツリヌス菌を含む前記発酵培地の収穫時に酸を加えて酸性スラッジを形成して沈殿させる、
請求項1に記載の方法。 - ステップ2)とステップ3)との間に、さらに、
細菌である前記ボツリヌス菌を含む前記発酵培地を陰イオン交換培地スラリーと接触させるステップを繰り返し、かつ、遠心分離によりボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を得ることと、
前記発酵培地を前記陰イオン交換培地スラリーと繰り返し接触させることにより得られた前記ボツリヌス神経毒素を含む前記上澄み液を混合することと、を含む、
請求項1に記載の方法。 - ステップ5)は、さらに、
前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから得られた前記ボツリヌス神経毒素を含む前記溶出液を前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させる前に、前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから得られた前記ボツリヌス神経毒素の前記溶出液を透析することを含む、
請求項1に記載の方法。 - 前記ボツリヌス神経毒素はボツリヌス神経毒素Aである、
請求項1に記載の方法。 - 前記ボツリヌス神経毒素Aの生物学的比活性は、マウスLD50を用いて測定して、100〜400unit/ngである、
請求項8に記載の方法。 - ステップ6)の後、
前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから得られた前記ボツリヌス神経毒素を含む前記溶出液を、エチレングリコール、グリセリン、およびプロピレングリコールを含む安定剤と混合することをさらに含む、
請求項1に記載の方法。 - 前記安定剤は、エチレングリコール、グリセリン、およびプロピレングリコールを含み、前記溶出液への添加後の前記安定剤の濃度は、総体積に基づいて10〜30(w/v)%の範囲である、
請求項10に記載の方法 - 前記安定剤において、
前記溶出液に添加された後の前記エチレングリコールの濃度は、5〜20(w/v)%の範囲であり、
前記溶出液に添加された後の前記グリセリンの濃度は、1〜10(w/v)%の範囲であり、
前記溶出液に添加された後の前記プロピレングリコールの濃度は、1〜5(w/v)%の範囲である、
請求項11に記載の方法。 - 最内層の水相コアまたは油相コアと、
複数の水相層と、
複数の油相層と、
最外層のクリーム層と、を含み、
前記複数の水相層のそれぞれおよび前記複数の油相層のそれぞれは、前記水相コアまたは前記油相コアを交互に囲み、水相と油相が互い違いになった多層多相ナノ粒子を形成し、
前記水相コアおよび前記水相層には、生体分子を含み、
前記生体分子は、ボツリヌス神経毒素および/またはヒアルロン酸などの水溶性分子を含み、
前記油相コアおよび前記油相層には、油溶性分子を含む、
多層多相ナノ粒子。 - 請求項13に記載の多層多相ナノ粒子であって、
前記ボツリヌス神経毒素の調製方法が、
1)細菌であるボツリヌス菌を動物由来の成分を含まない発酵培地で発酵させるステップと、
2)細菌である前記ボツリヌス菌を含む前記発酵培地を陰イオン交換培地のスラリーと接触させ、かつ、前記ボツリヌス神経毒素を含む上澄み液を遠心分離により取得するステップと、
3)前記上澄み液を透析し、かつ、前記生体分子を含む透析後の溶液を収集するステップと、
4)前記ボツリヌス神経毒素を含む前記透析後の溶液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
5)ステップ3)および4)を繰り返し、前記ボツリヌス神経毒素を含む溶出液を取得し、かつ、前記陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した前記溶出液を陽イオン交換クロマトグラフィーカラムと接触させるステップと、
6)前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから取得した前記ボツリヌス神経毒素を含む前記溶出液を収集するステップと、
を含む、
多層多相ナノ粒子。 - 前記多層多相ナノ粒子の平均サイズは1〜200ナノメートルである、
請求項13に記載の多層多相ナノ粒子。 - 前記水性コアまたは前記油相コアの平均サイズは1〜200ナノメートルの範囲である、
請求項13に記載の多層多相ナノ粒子。 - 前記最外層のクリーム層は、水相混合物および油相混合物を含み、
前記水相混合物は、グリセリン、グリチルリチン酸二カリウム、ペンタンジオール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、メチルパラベン、およびカルボマーのうちの少なくとも1つを含み、
前記油相混合物は、鉱油、セテアリルアルコール、プロピルパラベン、メチルパラベン、PEG−100ステアリン酸塩、PEG−40硬化ヒマシ油、カプリル酸/カプリン酸トリグリセリド、Tween−80、Cremophor EL、ステアリン酸グリセリル、Tween−65、Tween−60、Tween−20、Labrafac Lipophile WL 1349、大豆油、茶油、植物油、ひまわり油、魚油、ゴマ油、ビタミンE、動物性脂肪、グリセリルオクタノエート、レシチン卵ホスファチジルコリン、ポリ(プロピレンオキシド)、ポリ(D、L−乳酸)、ポリ(ε−カプロラクトン)、ポリ(L−アスパラギン酸)およびポロキサマー、PEG−ポリグルタミン酸、PEG−ポリアスパラギン酸、PEG−ポリ−L−ラクチド、PEG誘導体、ソルビタンモノパルミテートおよびソルビタンオレイン酸塩のうちの少なくとも1つを含む、
請求項13に記載の多層多相ナノ粒子。 - 前記ボツリヌス神経毒素は、ボツリヌス神経毒素複合体および完全ボツリヌス神経毒素のうちの1つを含む、
請求項13に記載の多層多相ナノ粒子。 - 前記複数の水相層の1つ以上は親水性分子を含み、および/または、前記複数の油相層の1つ以上は疎水性分子を含む、
請求項13に記載の多層多相ナノ粒子。 - 前記親水性分子は、ヒアルロン酸、細胞増殖因子、幹細胞、幹細胞液、ペプチド、タンパク質、アプタマー、オリゴヌクレオチド、ビタミン、Snap−8オクタペプチド、ジペプチド、アクイリンヘキサペプチド、アラントイン、ナイアシンアミド、アロエベラ、アントシアニン、グリチルリチン酸二カリウム、アルブチン、アミノ酪酸、ニコチンアミドモノヌクレオチド、アミノ糖、N−アセチルカルノシン、L−カルノシン、補酵素、フロスアルビジアエ抽出物、キビ草抽出物、ベタイン、トレハロース、エリスリトール、マンニトール、カルボマー、ビタミンC、ヒドロキシエチルセルロース、銅トリペプチド、アセチルキトサミン、ガストロジン、アセチルヘキサペプチド−8、アセチルヘキサペプチド−1、L−トリプトファン、5−ヒドロキシトリプトファン、クエン酸、リパーゼ、ルブラジェル、セラミド3、ミルク抽出物、アロエベラの葉の水、高麗人参の根の水、加水分解コラーゲン、ノナペプチド−1、ヘキサペプチド−1、β−グルカン、プロピレングリコール、グリセリン、エチレングリコール、ブタンジオール、ニコチン酸、フィト酸、プエラリン、カンゾウ、スノーグラス抽出物、ジンセノシド、レスベラトロール、パルミトイルペンタペプチド−4、パルミトイルトリペプチド−1、パルミトイルテトラペプチド−7、パルミトイルオリゴペプチド、アプタマー、si−RNA、幹細胞、および治療剤などのうちの少なくとも1つを含む、
請求項19に記載の多層多相ナノ粒子。 - 前記疎水性分子は、ワクシニアミルティラス種子油、プルケネチアヴォルビリス種子油、アルガニアスピノサカーネルオイル、ペンタクレスラマクロロバ種子油、バートホルレチアエクセルサ種子油、ブチロスパーマムパーキーフルーツ脂肪、ゼラニウムオイル、ココナッツ油、小麦胚芽油、オリーブオイル、シアバター、月見草オイル、ラノリン、蜜蝋、レシチン、ホホバワックス、メントール、サリチル酸メチル、ビタミンE、ルテイン、ゼアキサンチン、シナモン油、ジンジャールートオイル、バニリルブチルエーテル、ラノステロール、ビタミンA、大豆イソフラボン、フィトステロール、フィトステロールエステル、大豆油、ティーシードオイル、シーバックソーンオイル、グレープシードオイル、アーモンドオイル、ウィンターグリーンオイル、ホホバオイルなどのうちの少なくとも1つを含む、
請求項19に記載の多層多相ナノ粒子。 - 前記治療剤は、インスリン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、5−フルオロウラシル、ダカルバジン、イブプロフェン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、エストリオール、プロゲステロン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、エストラジオール、AgNO3をはじめとする銀イオン、ZnOをはじめとするZnイオン、抗生物質、ホルモン、フェロモン、フェロモン、原薬分子と植物抽出物などのうちの少なくとも1つを含む、
請求項20または21に記載の多層多相ナノ粒子。
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