KR102336323B1 - 생체활성을 갖는 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 제조하는 방법 및 다층 다상 나노입자 - Google Patents

생체활성을 갖는 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 제조하는 방법 및 다층 다상 나노입자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 제조 및 경피전달 분야에 관한 것으로 생체활성을 갖는 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 제조하는 방법 및 다층 다상 나노입자를 개시한다. 상기 방법은 동물 유래 성분이 없는 발효배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 세균을 발효시키고 발효배지와 음이온 교환 배지 슬러리를 접촉하도록 하며 원심분리를 통해 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 함유하는 상등액을 획득하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 상등액을 투석하여 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 함유하는 투석액을 수집하고 투석액을 음이온 교환 크로마토 그래피 컬럼과 접촉시키며 음이온 교환 크로마토 그래피 컬럼으로부터 수집한 용출액을 양이온 교환 크로마토 그래피 컬럼과 접촉시켜 용출액을 수집하는 단계를 더 포함한다. 나노입자는 최내층의 수상 코어 또는 유상 코어, 수상층, 유상층 및 최외층의 크림층을 포함한다. 수상층과 유상층은 번갈아 봉입되어 다층 다상 나노입자를 형성한다. 생체분자는 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 및/또는 히알루론산 등 활성분자를 포함한다.

Description

생체활성을 갖는 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 제조하는 방법 및 다층 다상 나노입자 {METHOD FOR PREPARING CLOSTRIDIUM BOTULINUM NEUROTOXIN WITH BIOACTIVITY AND MULTILAYERED MULTIPHASE NANOPARTICLES}
본 발명은 단백질 제조 및 경피전달 분야에 관한 것으로서, 구체적으로 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A의 제조, 나노 봉입된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 함유하는 생체분자 및 기타 고분자량 생체분자의 경피전달에 관한 것이다.
클로스트리디움 보툴리눔 독소는 클로스트리디움 보툴리눔 세균(Clostridium botulinum)이 만드는 신경독소이며 상기 클로스트리디움 보툴리눔균은 식물, 토양, 물 및 동물장내(腸內)에서 흔히 발견되는 그람 양성 혐기성 간균이다. 클로스트리디움 보툴리눔 항원성에 따라 7가지(A, B, C, D, E, F 및 G)로 나눌 수 있다. 모든 혈청형은 신경근육 접합부의 중요한 신경전달 물질인 아세틸콜린의 방출을 차단하여 근육을 마비시킴으로써 신경 전달에 간섭한다. 현재, 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소는 사시, 국소 근긴장 이상, 반얼굴 연축, 다양한 경련성 운동 장애, 두통, 유연증 및 다한증을 포함하는 다양한 치료용도에서 중요한 역할을 하고 있으며 그 적용 범위는 여전히 빠르게 확대되고 있다. 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소는 얼굴 전체 교정, 턱 교정, 목과 가슴의 라인 교정, 목 주름 개선 및 얼굴 주름 개선을 포함하는 미용 및 체형 관리에 주로 사용되며, 또한 다한증, 여드름 치료과 같은 피부병학에도 사용된다. 2002년 미국 식품의약국(FDA)으로부터 허가받은 Botox®(보톡스, 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A가 유효성분임)가 미용 및 체형 관리에 사용됨으로써 미간(glabella) 주름과 이마 주름 등을 일시적으로 감소시킬 수 있었다.
생성된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소(클로스트리디움 보툴리눔 홀로톡신(holo-toxin)혹은 홀로(holo-)BoNT-A라고도 칭함)의 활성은 비교적 낮아 경쇄과 중쇄는 이황화결합으로 연결되어 분자량이 약 150KDa이고 활성이 더 높은 핵심 소분자 보툴리눔 독소(SM독소 혹은 홀로 톡신 혹은 누드(Nude) 독소)를 형성한다. 도 1은 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소의 개략적인 구조를 나타냈다. 도 1에 도시된 바와 같이, 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 폴리펩티드 사슬은 이황화결합으로 연결되는 각각의 분자량이 약 100KDa인 중(H)쇄와 50KDa인 경(L)쇄를 포함한다. 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A는 가용성 노르말-에틸말레이미드 민감인자 부착 단백질 수용체(SNARE)를 공격하기 위해 신경원에서의 단백질 분해에 대한 특이적 효소 활성을 가지며, 여기서 효소 활성은 L쇄에 의해 부여된다. H쇄는 수용체 결합 및 시토졸로의 전좌에 필요하다. 홀로 BoNT-A는 비헤마글루티닌 단백질 및 헤마글루티닌을 포함하는 기타 단백질과 결합하여 분자량이 더 큰(예를 들어 960KDa) 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합물(BoNT-A라고도 칭함)을 형성한다. 150KDa 홀로 BoNT-A(독성 및 치료효과를 구비함)과 달리, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합물에 존재하는 관련 단백질은 비독성이므로 약리학적 작용에 필요하지 않다.
동물 유래 성분을 함유하는 발효배지를 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 배양하여 인체치료에 사용하는 기술이 공지되어 있다. 그러나 동물 유래 산물의 사용으로 인해 임상적 적용을 위해 제조된 클로스트리디움 보툴리눔 독소에 잠재적 오염 물질(예를 들어 동물 유래 산물의 바이러스)이 유입될 가능성이 있으므로 치료적용시 위험성을 증가시킬 수 있다.
또한, BoNT-A(960KDa) 및 홀로 BoNT-A(150KDa)는 비교적 큰 분자량을 갖고 있어 임상에서 일반적으로 사용되는 투여방식은 주사기 주입방식이다. 그러나 주사기 주입은 불편하여 사용시 통증 및 불안을 일으켜 환자의 순응도가 낮다. 따라서, 특히 치료, 피부병학 및 기능성 화장품 분야에서 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 편리하고 안전하며 통증이 없이 전달하는 대안적인 방법을 개발할 필요가 있다. 주사기 주입 또는 기타 장비를 사용하는 침습성 전달과 달리 손으로 진행하는 경피전달과 같은 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소의 국소 적용을 포함하는 고분자량 단백질의 비-침습적 전달방법 등을 개발하는 것이 바람직하다.
인체 피부는 각질층(SC), 표피(ED) 및 진피 등의 3차원으로 설정되는 다양한 조직과 세포층을 포함하고 그 두께는 20 μm내지 수백 μm(예를 들어, 일부 얼굴 영역에서 약 250 μm이다)이다. 일반적으로 인체 피부를 상피세포에서 내피세포까지 한정된 네트워크 구조를 구비하는 3차원 미세 다층(유상-수상)n 시스템으로 볼 수 있다. 따라서, 상피세포로보터 내피세포까지의 미세하고 두터운 장벽을 통과함으로써 생체분자 특히 고분자량의 생체분자를 전달하는 것이 어렵다.
본 발명에 따른 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A 제조방법 및 그의 나노 봉입방식에 따른 경피전달은 하나 이상의 상기 문제 및 당업계의 다른 문제를 해결하기 위한 것이다.
본 발명은 다양한 실시방식을 포함하며 본 발명의 일 실시방식은 생체활성을 갖는 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법은,
동물 유래 성분이 없는 발효배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 세균을 발효시키는 제 1 단계,
상기 클로스트리디움 보툴리눔 세균을 함유하는 상기 발효배지와 음이온 교환 배지 슬러리를 접촉하도록 하며 원심분리를 통해 상기 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 함유하는 상등액을 획득하는 제 2 단계,
상기 상등액을 투석하여 상기 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 함유하는 투석액을 수집하는 제 3 단계,
상기 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 함유하는 상기 투석액을 음이온 교환 크로마토 그래피 컬럼과 접촉시키는 제 4 단계,
제 3 단계와 제 4 단계를 반복하여 상기 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 함유하는 용출액을 획득하며 상기 음이온 교환 크로마토 그래피 컬럼으로부터 획득한 상기 용출액을 양이온 교환 크로마토 그래피 컬럼과 접촉시키는 제 5 단계,
상기 양이온 교환 크로마토 그래피 컬럼으로부터 획득한 상기 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 함유하는 용출액을 수집하는 제 6 단계를 포함한다.
배경기술에서 설명한 바와 같이, 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 복합물은 큰 분자량을 갖는다(예를 들어 960KDa). 고분자량 단백질을 사용하는 경우 경피전달에 불리함으로 일반적으로 주입방식으로 사용된다. 고분자량(예를 들어, 960 KDa)의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 복합물과 달리 본 발명의 방법으로 획득한 소분자량의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A는 여러가지 이점이 있다. 예를 들어, 분자량이 약 150 KDa인 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A는 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 복합물에 비하여 20％ 미만의 중량을 갖는다. 따라서 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A는 현저히 저감된 항원성 및 면역원성을 가질 수 있다. 생성된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A는 고분자량의 복합물에 비하여 임상적 적용시 더욱 높은 안전성을 가질 수 있다. 또한, 생성된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A는 크기가 작아 더욱 빠른 확산 속도를 가질 수 있어 다양한 적용(예를 들어, 국소 병변 적용 및 국소 적용)하에서 피부장벽을 쉽게 통과할 수 있음으로 주사기 주입과 같은 침습성 전달방법을 피면할 수 있다.
본 발명의 기타 비독성 단백질로부터 분리되어 생성된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A는 작은 분자량 150 KDa를 가질 수 있다. 분리된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A는 양전하를 띠며(클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 복합물은 음전하를 띤다), 따라서 본 발명은 순차적 투석, 음이온 교환 및 양이온 교환 크로마토 그래피를 사용하여 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 정제하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 음이온 교환 크로마토 그래피 매질 및 양이온 교환 크로마토 그래피 매질의 순차적 사용을 통해 나머지 모든 핵산 불순물, 기타 단백질 불순물 및 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A로부터 분리된 비독성 단백질을 실질적으로 제거함으로써 소분자량인 양전하를 띤 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 정제할 수 있다 (150 KDa클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A에 관한 제조방법이 공지되어 있지만, 이는 본 발명의 방법에 따른 기술적 사상과는 다르다).
또한, 동물 유래 성분을 함유하는 발효배지를 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 배양하여 인체치료에 사용하는 기술이 공지되어 있다. 그러나, 본 발명의 발명자들이 연구한 결과, 동물 유래 산물의 사용으로 인해 임상적 적용을 위해 제조된 클로스트리디움 보툴리눔 독소에 잠재적 오염 물질(예를 들어 동물 유래 산물의 바이러스)이 유입될 가능성이 있으므로 치료적용시 위험성을 증가시킬 수 있는 것을 발견하였다. 따라서 본 발명은 발효배지에 동물 유래 성분을 사용하지 않음으로써 동물 유래에 인한 제조된 산물의 잠재적 오염을 피면할 수 있으므로 본 발명의 방법으로 획득한 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소의 안전성이 더욱 향상된다.
바람직하게는, 상기 동물 유래 성분이 없는 발효배지는 식물성 펩톤을 함유한다.
바람직하게는, 상기 동물 유래 성분이 없는 발효배지는 덱스트로오스, 효모 추출물 및 자기분해 효모 슬러리(autolysis yeast slurry) 중 적어도 하나를 더 포함한다.
바람직하게는, 상기 식물성 펩톤은 대두, 감자 혹은 쌀 중 적어도 하나 이상으로부터 획득한다.
바람직하게는, 제 2 단계에서 클로스트리디움 보툴리눔 세균을 함유하는 발효배지를 수거 할 시, 산을 첨가하여 산 슬러리를 형성함으로써 침전시킨다.
본 발명은 수거 시 산 슬러리를 형성하여 발효배지를 산성화 시킴으로써 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 목적 단백질로서 추출하기 시작하는 단계를 더 포함 할 수 있다.
바람직하게는, 제 2 단계와 제 3 단계 사이에,
상기 클로스트리디움 보툴리눔 세균을 함유하는 상기 발효배지와 상기 음이온 교환 배지 슬러리를 접촉시키는 단계를 반복하고, 원심분리를 통해 상기 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 함유하는 상등액을 획득하는 단계, 및
상기 발효배지와 음이온 교환 매질 슬러리를 반복적으로 접촉시킴으로써 획득한 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 함유하는 상등액을 합치는 단계를 더 포함한다.
바람직하게는, 제 5 단계는 상기 음이온 교환 크로마토 그래피 컬럼으로부터 획득한 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 함유하는 용출액과 상기 양이온 교환 크로마토 그래피 컬럼을 접촉시키기 전에, 상기 음이온 교환 크로마토 그래피 컬럼으로부터 획득한 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 함유하는 용출액을 투석하는 단계를 더 포함한다.
바람직하게는, 상기 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소는 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A 이다.
바람직하게는, 마우스 LD50측정에 따른 상기 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A의 생물학적 비활성도(biological activity)는 100 내지 400 단위/ng 이다.
바람직하게는, 제 6 단계 이후, 상기 양이온 교환 크로마토 그래피 컬럼으로부터 획득한 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 함유하는 용출액과 에틸렌글리콜, 글리세린 및 프로필렌 글리콜 중의 하나 혹은 다수개를 포함하는 안정제를 혼합하는 단계를 더 포함한다.
소분자량의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소는 대분자량의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소에 비해 생물학적 활성의 안정성이 상대적으로 낮기 때문에 본 발명은 저장을 위한 안정제 배합성분을 최적화한다. 본 발명의 발명자들이 많은 연구를 진행한 결과, 에틸렌글리콜을 단일적으로 안정제로 사용하는 기존상황에 비하여 에틸렌글리콜 + 글리세린 + 프로필렌 글리콜의 조합이 효과상 현저한 개선이 있는 것으로 발견하였다.
바람직하게는, 상기 안정제는 에틸렌글리콜, 글리세린 및 프로필렌 글리콜을 포함하고, 총 체적당 중량 기준으로 상기 안정제가 용출액에 첨가된 후의 농도범위는 10~30(w/v)％ 이다.
바람직하게는, 상기 안정제에 있어서,
상기 에틸렌글리콜이 용출액에 첨가된 후의 농도범위는 5~20(w/v)％ 이며,
상기 글리세린이 용출액에 첨가한 후의 농도범위는 1~10(w/v)％ 이며,
상기 프로필렌 글리콜이 용출액에 첨가된 후의 농도범위는 1~5(w/v)％ 이다.
본 발명의 다른 실시방식은 다층 다상 나노입자(나노입자라고 약칭함)를 제공한다. 상기 나노입자는 최내층의 수상 코어 또는 유상 코어, 다수개의 수상층, 다수개의 유상층 및 최외층의 크림층을 포함하며, 여기서, 다수개의 수상층 중의 각각의 수상층 및 다수개의 유상층 중의 각각의 유상층이 수상 코어 또는 유상 코어를 번갈아 봉입하여, 수상, 유상이 번갈아 있는 다층 다상 나노입자를 형성한다. 상기 수상 코어, 수상층은 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 및/또는 히알루론산 등 수용성 분자를 포함하는 생체분자를 포함한다. 상기 유상 코어, 유상층은 유용성(oil soluble) 분자를 포함한다.
본 발명에 따른 다층 다상 나노입자는 도 5a/B에 도시된 것처럼 수상, 유상이 번갈아 봉입된 구조를 갖는다(본 발명은 본 출원인의 선 출원에 비하여 층수가 더 많고 도 8F에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예에서는 8층을 포함하는 산물을 성공적으로 제조하였다). 상기 구조는 3차원 미세 다층 (유상-수상)n시스템과 같은 다층 인체 피부구조 및 인체 세포구조를 모방한 다층 나노 세포구조(수상, 유상이 서로 겹치는 구조)이다. 이러한 다층 다상 나노입자는 활성성분이 내피세포로 수송 및 전달되는 것을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 피부 혹은 세포구조에 있는 수상층 일 경우, 수상층중의 수용성 활성 물질이 용해되고, 상기 수상층이 제거된 나머지 나노입자는 계속 침투하여 유상층으로 유입되며, 이 경우 유상층중의 유용성 활성 물질(선택적으로 첨가할 수 있다)이 용해된다. 이러한 방식으로 층층이 침투되어 깊은 층에 도달함으로써 큰 분자 물질의 경피전달이 어려운 기술적 문제를 해결할 수 있다. 또한, 각 층의 수상 혹은 유상은 내층과 동일하거나 상이한 활성성분 분자를 포함할 수 있다. 부동한 치료, 기능성 화장품 및 기타 용도를 위한 부동한 활성성분을 함유하는 두층 이상을 갖는 다기능 나노 세포를 생성한다.
바람직하게는, 상기 다층 다상 나노입자의 평균 사이즈는 1~200 nm 범위에 있다.
바람직하게는, 상기 수상 코어 또는 유상 코어의 평균 사이즈는 1 nm 내지 200 nm범위에 있다.
바람직하게는, 상기 최외층의 크림층은 수상 혼합물과 유상 혼합물을 포함한다.
상기 수상 혼합물은 글리세린, 글리시리진산 디칼륨, 펜탄디올, 프로필렌 글리콜, 부탄디올, 메틸파라벤 및 카보머 중 적어도 하나를 포함하며, 또한,
상기 유상 혼합물은 미네랄 오일, 세테아릴 알코올, 프로필파라벤, 메틸파라벤, PEG-100 스테아레이트, PEG-40 하이드로제네이티드 캐스터오일, 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드, 트윈-80, 크레모포 이엘 (Cremophor EL), 글리세릴 스테아레이트, 트윈-65, 트윈-60, 트윈-20, 라브라팍 친유성기 WL 1349(Labrafac Lipophile WL 1349), 대두유, 차유, 식물유, 해바라기씨유, 어유, 참기름, 비타민 E, 동물성 유지, 글리세릴 카프릴레이트 / 카프레이트, 레시틴 달걀노른자 포스파티딜콜린, 폴리 프로필렌옥사이드, 폴리 (D,L-락트산), 폴리 (ε-카프로 락톤), 폴리 (L-아스파르트산), 폴록사머, PEG-폴리글루탐산, PEG-폴리아스파르트산, PEG-폴리-L-락티드, PEG유도체, 소르비탄 모노팔미테이트 및 소르비탄 올리에이트 중 적어도 하나를 포함한다.
바람직하게는, 상기 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소는 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 복합물 및 홀로(holo-) 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 중의 하나를 포함한다.
바람직하게는, 상기 다수개의 수상층 중의 하나 이상은 친수성 분자를 포함하며, 및/또는 상기 다수개의 유상층 중의 하나 이상은 소수성 분자를 포함한다.
바람직하게는, 상기 친수성 분자는 히알루론산, 세포 성장인자, 줄기 세포, 줄기 세포액, 펩타이드, 단백질, 압타머, 올리고 뉴클레오티드, 비타민, Snap-8 옥타펩티드, 디펩타이드, 아세틸헥사펩타이드, 알란토인, 니아신아미드, 알로에, 안토시아닌, 글리시리진산 디칼륨, 알부틴, 아미노 부티르산, 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드, 글루코사민, N-아세틸카르노신, L-카르노신, 보효소, 합환화 (合歡花, Albiziae Flos) 추출물, 소미초 (小米草, Euphrasia pectinata Ten) 추출물, 베타인, 트레할로스, 에리스리톨, 만니톨, 카보머, 비타민 C, 히드록시에틸 셀룰로오스, 카퍼트라이펩타이드(copper tripeptide), 아세틸 글루코사민, 게스트로딘(gastrodin), 아세틸 헥사펩타이드-8, 아세틸 헥사펩타이드-1, L-트립토판, 5-하이드록시 트립토판, 구연산, 리파아제, 루브라젤(lubrajel), 세라미드 3, 우유 추출물, 알로에베라 잎즙, 인삼 즙, 가수분해 콜라겐, 노나펩타이드-1, 헥사펩타이드-1, β-글루칸, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 에틸렌글리콜, 부탄디올, 니아신, 트라넥삼산, 프에라린, 유럽감초(Glycyrrhiza glabra L.), 병풀(Centella asiatica (L.) Urban) 추출물, 진세노사이드, 레스베라트롤, 팔미토일 펜타펩타이드-4, 팔미토일 트리펩타이드-1, 팔미토일 테트라펩타이드-7, 팔미토일 올리고펩타이드, 압타머, si-RNA, 줄기 세포 및 치료제 중 적어도 하나를 포함한다.
바람직하게는, 상기 소수성 분자는 유럽산 빌베리 오일(vaccinium myrtillus seed oil), 아프리칸 월넛 씨드 오일(plukenetia volubilis seed oil), 아르간트리커넬오일(argania spinosa kernel oil), 프라칵시씨오일(pentaclethra macroloba seed oil), 브라질넛씨오일(bertholletia excelsa seed oil), 시어버터(butyrospermum parkii shea butter), 제라늄 오일, 코코넛 오일, 밀 배아유, 올리브유, 시어버터, 월견초유, 라놀린, 밀랍, 레시틴, 호호바 왁스, 멘톨, 살리실산메틸, 비타민 E, 루테인, 제아잔틴, 계피유, 진저 오일, 바닐릴부틸에틸, 라노스테롤, 비타민 A, 대두 이소플라본, 식물스테롤, 식물스테롤 에스테르, 대두유, 차유, 씨벅톤 오일, 포도씨유, 아몬드유, 윈터그린 오일, 호호바 오일 중 적어도 하나를 포함한다.
바람직하게는, 상기 치료제는 인슐린, 셀레콕시브, 로페콕시브, 5-플루오로우라실, 다카바진, 이부프로펜, 테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 에스트리올, 프로게스테론, 독시사이클린, 미노사이클린, 에스트라디올, AgNO3를 함유하는 은 이온, ZnO를 함유하는 Zn이온, 항생제, 호르몬, 페로몬, API 분자 및 식물 추출물 중의 하나 이상을 포함한다. 5-플루오로우라실, 다카바진, 이부프로펜, 테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 에스트리올, 프로게스테론, 독시사이클린, 미노사이클린, 에스트라디올, AgNO3를 함유하는 은 이온, ZnO를 함유하는 Zn이온, 항생제, 호르몬, 페로몬, API 분자 및 식물 추출물 중의 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 다른 실시방식에 있어서 당업계의 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 기재, 청구범위 및 도면에 기초하여 이해할 수 있다.
본 발명의 실시예중의 기술방안을 보다 명확히 설명하기 위해, 실시예를 설명하기 위한 도면을 하기에서 간략히 설명한다. 물론, 아래에서 설명한 도면들은 본 발명의 일부 실시예의 예시 뿐 당업계의 통상의 지식을 가진 자들은 진보성적인 노력이 필요없이도 하기 도면으로부터 다른 변형형식의 도면을 도출해 낼 수 있다.
도 1 은 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소의 구조의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 소분자량의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 제조하는 예시적 방법의 흐름도이다.
도 3은 본 발명의 다양한 실시예에 따른 마스터 셀 뱅크로부터 수집한 혈청형 A DNA샘플과 부동한 혈청형 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭 결과이다.
도 4는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 소분자량의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 제조하는 예시적 방법중의 부동한 정제방법 단계에 대한 도데실 황산 나트륨 폴리아크릴 아미드겔 전기영동(SDS-PAGE) 결과이다.
도 5a는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 나노 봉입된 생체분자를 제조하는 예시적 방법의 흐름도이다.
도 5b는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 나노 봉입된 생체분자를 제조하는 다른 예시적 방법의 흐름도이다.
도 6는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 나노 봉입된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 제조하는 예시적 방법을 사용하여 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소로 봉입한 나노 세포의 입도 및 분포도이다.
도 7은 본 발명의 다양한 실시예에 따른 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소로 봉입한 나노 세포를 적용한 환자 피부영역의 비교도이다.
도 8은 본 발명의 다양한 실시예에 따른 나노 봉입된 생체분자를 제조하는 예시적 방법을 사용하여, 고분자량 히알루론산으로 봉입한 나노 세포의 입도 및 분포도이다.
도 9는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 고분자량 히알루론산으로 봉입한 나노 세포를 적용한 환자 피부영역의 비교도이다.
명세서의 구체적인 실시예는 본 발명의 원리 및 실현에 대하여 설명하였지만 실시예에 대한 설명은 본 발명의 방법 및 방법의 핵심 사상을 이해하기 위한 것이다. 또한 당업계의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 사상에 기초하여 구체적인 실시방식 및 적용 범위를 수정할 수 있다. 즉 본 명세서의 내용은 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명은 본 발명의 다양한 실시예에 따른 소분자량의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 제조하는 방법을 제공한다. 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A는 A 형 클로스트리디움 보툴리눔 Hall 균주의 발효에 의해 생성 될 수 있으며 발효배지로부터 진일보 추출 및 정제될 수 있다. 도 2는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 소분자량의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 제조하는 예시적 방법의 흐름도를 나타냈다.
도 2에 있어서, 예시적 방법은 세포 시딩 및 발효를 포함 할 수 있으며, 이 동안 제어 가능한 방식으로 클로스트리디움 보툴리눔 세균을 배양하여 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 생성 할 수 있다(예를 들어, 도 2의 S201에서). 상기 방법은 수거 시 산 슬러리를 형성하여 발효배지를 산성화 시킴으로써 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 목적 단백질로서 추출하기 시작하는 단계를 더 포함 할 수 있다(예를 들어, 도 2의 S203에서). 발효배지를 산성화시켜 침전물(산 슬러리)을 형성 한 후, 예시적 방법은 전격 추출(blitzkrieg extractor) 및 투석을 통해 핵산 불순물 및 기타 단백질 불순물을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다(예를 들어, 도 2의 S205에서). 나머지 핵산 불순물 및 기타 관련된 비독성 단백질을 추가로 제거하여 소분자량의 고순도 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 획득하기 위하여 예시적 방법은 투석 및 크로마토 그래피를 사용하여 순차적으로 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다(예를 들어, 도 2의 S207~S211에서). 예를 들어, 예시적 방법은 투석, 음이온 교환 크로마토 그래피 과정 및 양이온 교환 크로마토 그래피 과정을 포함하는 반복 가능한 정제 사이클을 더 포함할 수 있다. 정제 과정의 완성에 따라 획득한 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 추가로 여과하여 저온 (예를 들어, ≤-70℃)으로 저장함으로써 장기적으로 저장 할 수 있다(예를 들어, 도 2의 S213에서).
제어 가능한 방식으로 목적 단백질인 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 생성, 추출 및 정제할 수 있도록 부동한 방법으로 도 2에 따른 각각의 예시적 단계를 모니터링 할 수 있다. 다시 도 2를 참조하면, 예를 들어, 고농도 산을 첨가하여 형성한 침전물(산 슬러리)과 황산 암모늄을 함유하는 침전물을 각각 칭량함으로써 S203중의 산 슬러리 형성과 S205중의 전격 추출 및 투석을 모니터링 할 수 있다. 또한 형광 측정을 진행하여 산 슬러리 형성을 모니터링 할 수 있다. 예를 들어, RiboGreen핵산 정량 시약인 초민감 형광 염료는 수용액중의 DNA를 정량하고, 예를 들어, 단백질을 함유하는 수용액중의 DNA 불순물을 정량한다. 이렇게 핵산의 형광 강도 감소를 측량함으로써 단백질을 함유하는 용액중의 핵산 불순물의 제거를 모니터링 할 수 있다. 일부 선택적인 실시예에 있어서, 형광 측정은 도 2중의 하나 혹은 다수개의 단계(예를 들어, S203과 S205에서)에서 핵산 불순물 제거를 모니터링 할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, SDS-PAGE는 도 2의 실질적인 모든 예시적 단계에서 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A의 순도를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 또한, UV-분광법은 단백질 농도 모니터링 및 단백질 용액중의 핵산 불순물 측량에 사용될 수 있다. 예를 들어, 278 nm파장에서의 UV흡광도는 단백질 농도의 측량 및 측정에 사용될 수 있다. 또한, 260 nm과 280 nm파장에서의 UV흡광도 비율(A260/A280 비율)을 측량하여 단백질 용액중의 핵산 불순물을 측정할 수 있다. 또한, 예를 들어 핵산 불순물의 농도가 매우 낮을 경우, qPCR방법으로 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 함유하는 용액중의 핵산 불순물을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, TaqMan qPCR 측정을 진행하여 정제한 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A샘플중에 잔존한 A 형 클로스트리디움 보툴리눔 게놈 DNA를 검출함으로써 최종 생성물로부터 클로스트리듐 DNA 불순물이 제거된 것을 확보할 수 있다.
하나 혹은 다수개 방법을 조합함으로써 도 2중의 예시적 단계를 모니터링할 수 있음에 유의하여야 한다. 예를 들어, SDS-PAGE방법 및 UV-분광법을 조합하여 추출 및 정제 과정을 모니터링할 수 있으며, 본 발명은 이에 한정되지 않는다. 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A 생성 및 정제를 모니터링하는 단계는 기타 방법을 포함할 수 있음에 유의하여야 하며, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
세포 시딩 및 발효에 있어서(S201에서), 소분자량의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A의 제조는 워킹 셀 뱅크(WCB), 시딩 및 발효 준비된 WCB를 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, WCB는 고압증기처리된 발효배지에서 해동될 수 있으며, 여기서 해동과정은 주변 온도 혹은 37℃에서 진행될 수 있다. 이후, 해동된 WCB를 고압증기처리된 발효배지에서 시딩할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 시딩과정은 약 33℃ 내지 40℃ 온도범위에서 약 4시간 내지 20시간동안 진행할 수 있다. 예를 들어, 시딩과정은 37℃에서 12시간동안 진행할 수 있다.
본 발명의 일부 선택적인 실시예에 있어서, WCB중의 클로스트리디움 보툴리눔 세균을 획득할 수 있는 마스터 셀 뱅크(MCB)를 특성화하여 클로스트리디움 보툴리눔 세균의 다양한 특성을 검증할 수 있다. 특성화 과정은 시딩 및 발효과정 전에 진행할 수 있으며, 발효과정이 동물 유래 성분을 포함할 경우, 클로스트리디움 보툴리눔 세균의 특정화 특성은 동일성, 생물학적 순도, 안전성, 형태성, DNA염기서열 결정 및 바이러스 검출을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세균의 표현형 혹은 유전자형 특징을 결정함으로써 동일성을 특성화할 수 있다. 혈장오염을 측량함으로써 생체활성을 측정할 수 있다. 원하는 표적 생성물의 일관적 생성으로 정의한 안전성은 세포의 특성, 배양 방법 등에 의해 측정할 수 있다. 생존력은 한정된 조건에서 저장하는 동안 생성을 유지하는 능력으로 정의할 수 있다. MCB의 일부 기타 특성을 식별 및 측량할 수 있음에 유의하여야 하며, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 세포 시딩 및 발효과정에서 동물 유래 성분을 실질적으로 사용하지 않음으로써 동물 유래에 인한 산물의 잠재적 오염을 피면하는 것이 바람직하다. 일반적인 쿠크트 미트 배지(cooked meat medium) 및 시딩, 발효과정에 사용되는 동물 유래의 기타 성분(예를 들어, 소과 돼지를 출발재료로 사용하는 N-Z-Amine과 글리세린)의 대체물로서, 본 발명의 일 실시예는 실질적인 비 동물 유래 성분인 발효배지를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 실시예는 식물성 펩톤에 기반한 발효배지를 선택적으로 포함할 수 있다.
예를 들어, 대두, 감자 및/또는 쌀을 포함하는 식물성 단백질 산물은 발효배지에 포함될 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 또한, 자기분해 효모 슬러리, 효모 추출물 및 포도당도 발효배지에 포함될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 배지의 총 체적에 대한 중량(w/v)으로, 비동물 유래 성분 발효배지는 5％ 대두분말, 2％ 효모 추출물 및 2％ 자기분해 효모 슬러리를 포함할 수 있다. 비동물 유래 성분 발효배지는 3％ 대두분말, 2％ 감자분말, 2％ 효모 추출물 및 1％ 자기분해 효모 슬러리를 선택적으로 포함할 수 있다. 비동물 유래 성분 발효배지는 3％ 대두분말, 1％ 효모 추출물, 2％ 자기분해 효모 슬러리 및 1％ 포도당를 선택적으로 포함할 수 있다. 비동물 유래 성분 발효배지는 pH를 조정하기 위한 덱스트로오스 및 수산화 나트륨(예를 들어, 약 10％ 내지 50％ 수용액)을 더 포함할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 발효배지중의 덱스트로오스의 농도는 5그램/리터 (5g/L)일 수 있다. 본문에 사용된 바와 같이, 별도로 설명하지 않은 한 본 발명에 기술한 성분 백분율은 총 체적에 대한 중량 백분율을 말한다.
제조된 비동물 유래 성분 발효배지는 적절한 pH 값으로 조정될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 발효배지의 pH는 pH 6.5 내지 pH 8.5범위 일 수 있다. 예를 들어, 발효배지의 pH는 pH 7.0 내지 pH 7.5범위 일 수 있다. 일부 선택적인 실시예에 있어서, 발효배지의 pH를 pH 7.2로 조정할 수 있으고 수산화 나트륨을 첨가하여 pH 값을 조정할 수 있다. 예를 들어, 1L발효배지에 0.3mL의 50％ 수산화 나트륨을 첨가하여 pH 값을 조정한다.
도 2의 단계S201를 진일보 참조하면, 시딩용액중의 워킹 셀(working cell)은 클로스트리디움 보툴리눔이 혐기적 환경에서 성장 및 확대될 수 있도록 더 큰 체적의 발효배지로 옮겨질 수 있다. 발효과정의 지속시간은 약 33℃ 내지 40℃의 온도범위에서 70시간 내지 120시간일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 발효과정은 35℃ 내지 39℃의 온도범위에서 약 96시간으로 지속될 수 있다. 각 로트(lot)의 다양한 실시예에 따르면, 9L비동물 유래 성분 발효배지는 20억(109)개 마우스LD50 단위를 초과하는 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 생성할 수 있고, 여기서 각 마우스LD50 단위는 마우스LD50측정에서 약 2.5 내지 10 피코 그램(pg)의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A에 대응되는 치사량으로 정의될 수 있으며, 그 생물학적 비활성도는 100-400LD50 단위 / ng이다.
도 2의 단계S203를 참조하면, 본 발명의 다양한 실시예에 따르면, 클로스트리디움 보툴리눔 세균을 함유하는 발효배지를 수거 할 시 침전하여 산 슬러리 형성을 실현할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 고농도 산을 클로스트리디움 보툴리눔 세균을 함유하는 발효배지에 첨가하여 세포 찌꺼기를 제거할 수 있다. 예를 들어, pH가 3.5로 떨어질 때까지 3N H2SO4 를 발효배지에 첨가하여 3시간 동안 유지함으로써, 모든 세포가 실질적으로 침전되어 침전물을 형성할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 발효배지를 산성화하여 형성한 침전물은 원심분리를 통해 수집하여 재현탁함으로써, 100mM의 pH 값이 5.5인 구연산염 완충액에서 소정의 시간으로 추출하는데 사용할 수 있다. 동시에, 원심분리하여 획득한 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A, 핵산 불순물 및 기타 단백질 불순물을 함유하는 상등액을 수집할 수 있다. 일부 선택적인 실시예에 있어서, 원심분리 및 재현탁과정을 반복함으로써, 대부분 혹은 실질적인 모든 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A이 상등액으로 추출될 수 있다. 예를 들어, 산성화된 발효배지를 제 1 차 원심분리하여, 상등액을 침전물로부터 분리할 수 있다. 나머지 침전물을 100mM 구연산염 완충액에 1시간동안 재현탁시켜 추출한 후 제 2 차 원심분리를 진행할 수 있다. 이후, 제 2 차 원심분리하여 획득한 상등액과 침전물을 분리할 수 있고 그 상등액은 제 1 차 원심분리하여 획득한 상등액과 합칠 수 있으며 침전을 제 3 차 재현탁할 수 있다. 합친 상등액에 황산 암모늄을 첨가하여 추가로 침전시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 합친 상등액의 침전과정은 2 내지 8℃에서 약 4 내지 20시간동안 진행될 수 있다. 상기 실시예에 따르면, RiboGreen측정 및 UV 흡수 측정에 의한A260/A280 비율에 기반하여, 각각의 산 침전 사이클에 의한 핵산 불순물의 제거를 모니터링할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시예에 따른 도 2의 단계S205를 참조하면, 상기 상등액에 고농도의 황산 암모늄을 첨가하면 상등액중의 단백질의 용해도가 감소될 수 있다. 황산 암모늄의 농도가 충분히 높으면 단백질이 용액에서 침전되어 석출될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 원심분리를 통해 침전물을 수집하고 50mM의 pH 값이 5.5인 구연산염 완충액에 재현탁시킬 수 있다. 이후, 재현탁한 침전물을 추가로 처리하여 핵산 불순물 및 기타 단백질 불순물을 실질적으로 제거할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 재현탁한 침전물과 음이온 교환체를 혼합하여 목적 단백질인 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 추가로 추출할 수 있으며, 여기서 음이온 교환체는 디 에틸 아미노 에틸(DEAE)Sephadex A-50 비드 슬러리를 포함할 수 있다. 일부 선택적인 실시예에 따르면, 음이온 교환체를 사용하는 상기 추출 과정을 반복하여 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A을 효율적으로 추출할 수 있다. 예를 들어, 50mM의 pH가 5.5인 구연산염 완충액중의 재현탁 용액을 DEAE Sephadex A-50 비드 슬러리와 1:1의 비율로 혼합하여 1시간동안 흔들 수 있다(제 1 차 추출). 상등액을 수집하도록 획득한 슬러리 혼합물을 원심분리 할 수 있으며, 동시에 침전물을 50mM의 pH 값이 5.5인 구연산염 완충액에 재현탁시킬 수 있다. 재현탁한 용액과 DEAE Sephadex A-50 비드 슬러리를 1:1의 비율로 혼합하여 1시간동안 흔들 수 있다(제 2 차 추출). 제 1 차 및 제 2 차 원심분리 후의 모든 상등액을 합쳐서 황산 암모늄을 첨가하여 추가로 침전시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 합친 상등액의 침전과정은 2 내지 8℃에서 약 4 내지 20시간동안 진행할 수 있다.
전술한 바와 같이 비헤마글루티닌 단백질 및 헤마글루티닌과 같은 기타 비독성 단백질과 관련된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 함유하는 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 복합물은 큰 분자량은 가지며(예를 들어 960KDa) 음전하를 띤다. 기존기술에서 음이온 교환 크로마토 그래피 매질은 주로 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 복합물을 정제하는데 사용된다. 본 발명의 다양한 실시예에 있어서, 기타 비독성 단백질로부터 분리되어 생성된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A는 상당히 작은 분자량150KDa을 갖는다. 또한, 분리된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A는 양전하를 띤다. 따라서, 본 발명은 순차적 투석, 음이온 교환 및 양이온 교환 크로마토 그래피를 사용하여 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 정제하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 음이온 교환 크로마토 그래피 매질 및 양이온 교환 크로마토 그래피 매질의 순차적 사용에 의해 나머지 모든 핵산 불순물, 기타 단백질 불순물 및 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A로부터 분리된 비독성 단백질을 실질적으로 제거함으로써 소분자량인 양전하를 띤 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 정제할 수 있다. 상기 실시예에 따르면, 부동한 방법으로 상기 정제 과정의 각각을 모니터링할 수 있다. 예를 들어, SDS-PAGE방법과 UV-분광법은 모두 핵산 불순물 및 기타 단백질 불순물의 제거를 검출하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 도 2의 단계S207를 참조하면, 단계S205에서 획득한 황산 암모늄을 함유하는 침전물을 음이온 수지 추출 및 투석으로 처리할 수 있다. 예를 들어, 원심분리를 통해 황산 암모늄을 함유하는 침전물을 수집하여 50mM의 pH 값이 5.5인 구연산염 완충액에 재현탁시킬 수 있다. 재현탁한 용액을 추가로 투석할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 재현탁한 용액을 50mM의 pH 값이 5.5인 구연산염 완충액에서 2℃ 내지 8℃에서 약 4 내지 20시간동안 투석시킬 수 있다. 이후, 투석 튜브로부터 수집한 투석을 거친 생성물을 DEAE Sephadex A-50 컬럼으로 로딩시켜 음이온 교환 크로마토 그래피 과정에 사용함으로써 음전하를 띠는 핵산 불순물 및 기타 단백질 불순물을 현저히 제거할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 투석 튜브로부터 수집한 투석을 거친 생성물을 칭량한 후 DEAE Sephadex A-50 컬럼으로 로딩시킬 수 있다. 또한, UV-분광법은 핵산 불순물의 제거를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, A260/A280 비율이 0.6보다 낮은 수집 생성물을 합칠 수 있으며, 여기서 특히 작은A260/A280 비율은 낮은 농도의 핵산 불순물을 나타낼 수 있다. 또한, 제어 가능한 방식으로 불순물 제거를 수행 및 모니터링할 수 있도록, 음이온 교환 크로마토 그래피 과정 후 획득한 합친 생성물을 칭량하여 로딩전의 투석을 거친 생성물과 비교할 수 있다.
본 발명의 실시예 및 도 2의 단계S209에 따라서, 음이온 교환 크로마토 그래피 과정을 추가로 반복하여 핵산 불순물 및 기타 단백질 불순물을 효율적으로 제거할 수 있다. 예를 들어, 제 1 차 투석 및 연이어 음이온 교환 크로마토 그래피 과정을 진행 한 후, A260/A280 비율이 0.6보다 낮은 산물을 합쳐 황산 암모늄을 추가로 첨가하여 침전시킬 수 있으며, 이 과정은 2℃ 내지 8℃에서 약 4 내지 20시간동안 진행할 수 있다. 이후, 원심분리를 통해 황산 암모늄을 함유하는 침전물을 수집하여 20mM의 pH 값이 7.9인 인산염 완충액에 재현탁시킬 수 있다. 7.9의 높은 pH 값은 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A가 비독성 단백질로부터 분리도록 하며, 이는 소분자량 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A의 정제를 촉진시키고, 이후 분리된 비독성 단백질을 제거할 수 있다. 재현탁한 용액을 추가로 투석할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 재현탁한 용액을 20mM의 pH 값이 7.9인 인산염 완충액에서 2℃ 내지 8℃에서 약 4 내지 20시간동안 투석할 수 있다. 이후, 투석 튜브로부터 수집한 투석을 거친 생성물을 DEAE Sephadex A-50 컬럼에 추가로 로딩시켜 제 2 차 크로마토 그래피 처리를 진행함으로써 모든 나머지 핵산 불순물 및 대부분 단백질 불순물을 실질적으로 제거할 수 있다.
본 발명의 상기 실시예에 따른 제 2 차 투석 및 음이온 교환 크로마토 그래피가 완성됨에 따라, 획득한 합친 생성물을 양이온 교환 크로마토 그래피로 추가로 처리함으로써 양전하를 띤 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 정제할 수 있다. 예를 들어 획득한 합친 생성물과 황산 암모늄을 함께 첨가하여 추가로 침전할 수 있으며, 이 과정은 2℃ 내지 8℃에서 약 4 내지 20시간동안 진행할 수 있다. 원심분리를 통해 침전을 수집할 수 있으며, 이를 20 mM의 pH 값이 7.0인 인산염 완충액에 재현탁시켜 제 3 차 투석을 진행할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 재현탁한 용액을 20 mM의 pH 값이 7.0인 인산염 완충액에서 2℃ 내지 8℃에서 약 4 내지 20시간동안 투석시킬 수 있다. 이후, 투석 튜브로부터 수집한 투석을 거친 생성물을 추가로 처리하여 양이온 교환 크로마토 그래피 과정에 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, Superloop과 P-50 펌프를 사용한 미리 충진된 SP 양이온 교환 컬럼은 양이온 교환 크로마토 그래피 과정에 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 제 3 차 투석한 후 획득한 생성물을 칭량하여 양이온 교환 크로마토 그래피에 사용되는 SP 양이온 교환 컬럼에 로딩할 수 있다. 또한, 순도를 모니터링하고 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A의 용출 곡선을 형성하기 위하여, 양이온 교환 크로마토 그래피 후 수집한 생성물의 260 nm, 270 nm, 278 nm, 280 nm 및 320 nm 등 각 파장에서의 UV 흡광도를 측량할 수 있다. 또한, 양이온 교환 크로마토 그래피 과정 후 획득한 합친 생성물을 칭량하여, 로딩전의 투석을 거친 생성물과 비교함으로써 제어 가능한 방식으로 불순물 제거를 수행 및 모니터링할 수 있다. 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A의 순도는 SDS-PAGE방법에 의해 추가로 측정될 수 있다.
일부 선택적인 실시예에 있어서, 순차적 투석 및 크로마토 그래피는 고분자량 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A 복합물의 정제에도 사용될 수 있다. 예를 들어, 960 KDa BoNT-A는 도 2와 같이 투석 후 이온 교환 크로마토 그래피에 의해 제조될 수 있다. 구체적으로 투석 →음이온 교환 크로마토 그래피→ 투석 →음이온 교환 크로마토 그래피→ 투석 → 양이온 교환 크로마토 그래피 단계를 포함하는 연속적인 정제 과정을 거쳐 960 KDa BoNT-A 복합물을 제조할 수 있다. 고분자량 BoNT-A 복합물을 획득하기 위하여, pH 값이 7.9인 인산염 완충액이 불필요할 가능성이 있음에 유의하여야 한다.
양이온 교환 크로마토 그래피 과정후에 수집한 고순도 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 함유한 합친 생성물을 저장하여 장기적으로 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 15％의 에틸렌글리콜, 3％의 글리세린 및 2％의 프로필렌 글리콜을 합친 생성물에 첨가하고 -70℃이하의 온도에서 혼합물을 저장할 수 있다. 선택적으로, 생성물은 -80℃에서 저장할 수 있다.
BoNT-A과 홀로 BoNT-A분자는 모두 높은 효소 활성을 갖는 큰 단백질 화합물이며, 그 활성은 pH, 기타 단백질의 존재, 이온강도, 빛, 온도 등과 같은 국소 미세 환경 인자에 의존한다. 일부 선택적인 실시예에 있어서, 독소의 안정적이고 장기적인 저장을 위하여 독소 용액에 사람 혈청 알부민(HSA) 혹은 재조합 인간 알부민(RHA)을 첨가할 수 있다.
동일한 저장조건하의 BoNT-A 복합물에 비하여, 홀로 BoNT-A는 기타 관련 단백질과 분리된 후 불안정성 할 수 있으며, 특히 저장 혹은 나중에 사용하기 위해 희석 된 경우 불안정성 할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 소분자량 BoNT-A 복합물 및 홀로 BoNT-A를 안정시키기 위하여 에틸렌글리콜, 글리세린(글리세롤) 및 프로필렌 글리콜중의 하나 혹은 다수개가 안정제로서 사용될 수 있다. 일부 선택적인 실시예에 있어서, 에틸렌글리콜, 글리세린(글리세롤) 및 프로필렌 글리콜중의 하나 혹은 다수개를 포함하는 안정제는 총 농도가 10％ 내지 30％ 일 수 있으며, 예를 들어, 총 농도가 20％ 내지 25％ 일 수 있다. 일 실시예에 있어서, 안정제는 에틸렌글리콜(5 내지 20중량％), 글리세린(1 내지 10중량％) 및 프로필렌 글리콜(1 내지 5중량％)을 포함할 수 있다. 다른 실시예에 있에서, 안정제는 10％ 에틸렌글리콜, 3％ 글리세린 및 2％ 프로필렌 글리콜을 포함할 수 있다.
본 발명은 다층 다상 나노방식으로 봉입된 생체분자를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 선택적인 실시예에 있어서, 봉입된 생체분자는 광범위한 분자량을 가질 수 있다. 예를 들어, 봉입된 생체분자는 하나 혹은 다수개의 BoNT-A 복합물(960 KDa) 및 히알루론산(≤1500 KDa)과 같은 1000 KDa에 근접하거나 1000 KDa를 초과한 고분자량 생체분자를 포함할 수 있다. 다른 실시예에 있에서, 봉입된 생체분자는 하나 혹은 다수개의 중등 분자량의 생체분자를 포함할 수 있고 중등 분자량의 생체분자는 홀로 BoNT-A(150 KDa)와 소분자를 포함할 수 있으며 소분자는 아미노산, 단백질, 펩타이드, 올리고 뉴클레오티드, 비타민 분자(예를 들어, 비타민 C 및/또는 비타민 D), Snap-8 옥타펩티드, 디펩타이드, 알란토인, 니아신아미드, 알로에, 보효소Q10, 레스베라트롤, 팔미토일 펜타펩타이드-4, 팔미토일 트리펩타이드-1, 팔미토일 테트라펩타이드-7, 팔미토일 올리고펩타이드, 압타머(핵산 압타머), si-RNA, 줄기 세포와 간질(stromal), 줄기 세포, 압타머, 줄기 세포액, EGF, FGF, KGF, AGF, BGF과 같은 다양한 세포 성장인자,인슐린, 셀레콕시브, 로페콕시브, 5-플루오로우라실, 다카바진, 이부프로펜, 테트라사이클린, 옥시테트라사이클린（oxytetracycline）, 에스트리올, 프로게스테론, 독시사이클린, 미노사이클린, 에스트라디올, 은 이온 (예를 들어, AgNO3), Zn이온 (예를 들어, ZnO) 및 식물추출물과 같은 많은 치료제 등을 포함하며, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
도 5a는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 다층 다상 나노방식으로 봉입된 생체분자를 제조하는 예시적 방법의 흐름도이다.
도 5a의 S501에 따르면, 우선 수상층으로 감싼 유상 코어(수중 유적형(O/W)구조라고도 칭함)를 포함하는 나노 세포1A를 형성 할 수 있으며, 여기서 수용성 화합물과 유용성 화합물은 각각 수상과 유상에 용해될 수 있다. 수중 유적형 나노 세포1A는 두개 부동한 분자영역(친수성 헤드 그룹 및 소수성 단말 부분 등)을 갖는 양친성(amphiphile) 물질의 존재하에 미셀을 형성함으로써 구현될 수 있으며, 여기서 소수성 코어는 유상을 대표하고, 친수성 쉘은 수상을 대표할 수 있다.
본 발명에서 용어 “수상”과 “친수성 상(hydrophilic phase)”은 교환하여 사용할 수 있으며, 용어 “유상”과 “소수성 상(hydrophobic phase)”은 교환하여 사용할 수 있음에 유의하여야 한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 다양한 수용성 화합물은 봉입구조내의 하나 혹은 다수개의 수상층에 용해될 수 있고, 다양한 유용성 화합물은 봉입구조내의 하나 혹은 다수개의 유상층에 용해될 수 있다. 예를 들어, 수용성 생체분자(예를 들어, 단백질, 펩타이드, 핵산 등)는 봉입구조내의 하나 혹은 다수개의 수상층에 용해될 수 있지만, 일부 선택적인 실시예에서 단백질은 유상층에 포함된 소수성 부분을 가질 수 있다. 다른 실시예에 있에서, 하나 혹은 다수개의 수상층은 수용성 생체분자로 용해할 수 있고, 하나 혹은 다수개의 유상층은 유용성 화합물로 용해할 수 있어, 두개 혹은 다양한 유형의 분자를 포함하는 나노 세포를 형성할 수 있으며, 여기서 두개 혹은 다양한 유형의 분자는 소수성 분자 및 친수성 분자 중 적어도 하나 이상일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 자기적 교반 혹은 기계적 교반으로 교반을 진행할 수 있다. 또한 교반속도는 300 rpm 내지 3000 rpm, 예를 들어 500 rpm 내지 2000 rpm로 설정할 수 있다. 일부 실시예에 있어서, 교반속도는 약 800 rpm로 설정할 수 있다.
다른 실시예에 있에서, 유상과 수상의 중량비는 1:99 내지 40:60, 예를 들어, 5:95 내지 20:80로 설정할 수 있다. 또한, 일 실시예에 있어서, 유상중의 계면활성제와 오일의 중량비는 10:1 내지 1:10, 예를 들어 3:1 내지 1:3 일 수 있다.
일부 실시예에 있어서, 오일과 계면활성제는 유상을 형성할 수 있거나 미셀 형성제로서 사용될 수 있으며, 트윈-80, 트윈-65, 트윈-60, 트윈-20, 트윈-40, 크레모포 이엘 (Cremophor EL), 라브라팍 친유성기 WL 1349(Labrafac Lipophile WL 1349), 대두유, 차유, 글리세릴 카프릴레이트 / 카프레이트, 레시틴 달걀노른자 포스파티딜콜린(EPC), PEG-40 하이드로제네이티드 캐스터오일, 폴리 프로필렌옥사이드(PPO), 폴리 (D,L-락트산) (PDLLA), 폴리 (ε-카프로 락톤) (PCL), 폴리 (L-아스파르트산), 폴록사머, PEG-폴리글루탐산, PEG-폴리아스파르트산, PEG-폴리-L-락티드, 소르비탄 올리에이트(스판-80) 중의 하나 혹은 다수개를 포함할 수 있다.
일부 실시예에 있어서, 혼합과정은 실온(25℃) 혹은 실온보다 낮은 온도(예를 들어, 4℃ 내지 25℃)에서 진행될 수 있다. 다른 실시예에 있에서, 혼합과정은 상승된 온도 (예를 들어, 약 40℃)에서 진행될 수 있다. 예를 들어, 유상 혹은 수상의 용해를 가속화하기 위하여 가열이 필요할 경우, 상승된 온도는 약 60℃ 내지 70℃일 수 있지만 90℃를 초과하지 않을 수 있다. 특히 높은 온도가 봉입된 생체분자 활성의 손실 혹은 정지를 초래할 경우, 50℃ 내지 70℃인 높은 온도에 비하여, 낮은 제조온도 (예를 들어, 4℃ 내지 25℃ 혹은 4℃ 내지 40℃)로 진행하는 온화한 제조공정은 개시된 방법에 추가적인 이점을 제공할 수 있다.
상기 실시예에 따르면, 제조된 수중 유적형 구조를 갖는 나노 세포1A는 그 반대극성인 상용액(phase solution) 즉 유상층에 추가로 봉입되어 도 5a의 S503에 따라 나노 세포2A를 형성할 수 있다. 형성된 나노 세포2A는 적어도 수상층과 외부 쉘인 다른 유상층에 순차적으로 봉입된 유상 코어를 포함하는 다층 구조를 가질 수 있다. 상기 실시예에 따르면, 각 유상층은 동일하거나 상이한 소수성 활성성분을 함유할 수 있고, 수상 코어는 다른 친수성 활성성분을 함유할 수 있다.
도 5a의 S505에 따른 일 실시예에 있어서, 상기 봉입단계는 안정된 나노 세포3A를 형성하기 위하여 새롭게 형성된 수상 외부 쉘이 하나 혹은 다수개 유형의 활성성분을 함유하는 추가 봉입층을 감싸도록 반복될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 봉입단계는 다층 인체 피부구조 및 인체 세포구조를 모방할 수 있는 다층 나노 세포구조를 형성하도록 수차례 반복될 수 있다. 이러한 다층 다상 나노 세포구조는 내피세포로의 활성성분의 수송 및 전달을 촉진할 수 있다. 본 발명의 다른 실시예에 따른 각 봉입단계에 있어서, 새롭게 형성된 수상 및 유상 봉입층은 내층과 동일한 활성성분 분자를 포함할 수 있다. 또한, 새롭게 형성된 봉입층은 부동한 활성성분을 함유할 수 있어 부동한 치료, 기능성 화장품 및 기타 용도를 위한 부동한 활성성분을 함유하는 두층 이상을 갖는 다기능 나노 세포를 생성할 수 있다.
일부 선택적인 실시예에 있어서, 내부 유상 코어로부터 외부 수상 쉘 방향에 따른 오일-물-오일-물층의 다층 구조를 갖도록 형성된 나노 세포3A는 유상에서 추가로 재봉입되어 도 5a의 S507에 따른 나노 세포4A를 획득할 수 있다. 다른 실시예에 있에서, 내부 유상 코어로부터 외부 유상 쉘 방향에 따른 오일-물-오일-물-오일층의 다층 구조를 갖도록 형성된 나노 세포4A는 수상에서 추가로 재봉입되어 도 5a의 S509에 따른 나노 세포5A를 획득할 수 있다.
본 발명의 상기 실시예에 따르면, 형성된 나노 세포의 층수는 제한되지 않을 수 있음에 유의하여야 한다. 즉, 부동한 용도에 따라 친수성 상 층(phase layer)의 수 및 소수성 상 층(phase layer)의 수를 확정할 수 있으며, 본 발명은 이에 한정되지 않는다. 또한, 활성성분의 극성 및 층 극성의 상용성에 따라 하나 혹은 다수개 유형의 활성성분은 하나 혹은 다수개의 부동한 상 층(phase layer)에 용해될 수 있다.
도 5a의 S511에 따른 본 발명의 일 실시예에 있어서, 제조된 나노 세포5A가 크림에 추가로 감싸져 안정된 에센스(essence) 형식의 나노 세포6A를 형성할 수 있으며, 여기서 나노 세포6A의 평균 입도는 1~200 nm이며, 일반적으로 1~100 nm이며, 50 nm 미만이거나 30 nm 미만일 수 있다. 일 실시예에 있어서, 나노 세포6A의 평균 입도는 30 nm 미만일 수 있다. 다른 실시예에 있에서, 나노 세포6A의 평균 입도는 20 nm 미만, 10 nm 미만이거나 1 nm에 근접할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 생성된 나노 세포는 하나 혹은 다수개의 크림층에 감싸져 있을 수 있다. 크림층의 첨가는 경피전달 뿐만아니라 치료 및 기능성 화장품 용도에서 나노 세포의 특성을 개선시킬 수 있다. 또한, 생성된 나노 세포의 크림층은 사용자 체감을 개선시킬 수 있다.
도 5b는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 나노 봉입된 생체분자를 제조하는 다른 예시적 방법의 흐름도를 나타냈다. 도 5b의 S502에 따르면, 먼저 유상층으로 감싼 수상 코어(유중 수적형(W/O)구조라고도 칭함)를 포함하는 나노 세포1B을 형성할 수 있으며, 여기서 수용성 화합물과 유용성 화합물은 각각 용해 수상과 유상에 용해될 수 있다. 유중 수적형 구조를 갖는 나노 세포1B는 계면활성제 존재하에 교반된 유상에 수상용액을 첨가함으로써 제조될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 및/또는 히알루론산과 같은 생체분자는 수상 코어에 용해될 수 있으며, 여기서 코어는 유상층에 봉입될 수 있다. 일부 선택적인 실시예에 있어서, 일부 단백질은 유상층에 포함된 소수성 부분을 가질 수 있다.
상기 실시예에 따르면, 제조된 유중 수적형 구조를 갖는 나노 세포1B는 그 극성이 반대인 상용액, 즉 수상층에 봉입되어 도 5b의 S504에 따른 나노 세포2B를 형성할 수 있다. 형성된 나노 세포2B는 적어도 유상층과 외부 쉘인 다른 수상층에 순차적으로 봉입된 수상 코어를 포함하는 다층 구조를 가질 수 있다. 또한, 나노 세포의 외부 쉘 극성에 따라, 외부 쉘과 다른 극성의 추가 층을 적용할 수 있다. 도 5b의 S508에 따르면, 예를 들어, 다른 수상층을 형성하여 내부 물 코어(water core　)로부터 외부 물 쉘(outer water shell)방향에 따른 물-오일-물-오일-물의 다층 구조를 갖는 나노 세포4B를 생성할 수 있다. 일부 실시예에 있어서, 내부 물 코어로부터 외부 오일 쉘방향에 따른 물-오일-물-오일-물-오일의 다층 구조를 갖는 도 5b의 S510에 따른 나노 세포5B를 형성하도록 상기 봉입을 추가로 반복할 수 있다.
도 5b의 S512에 따른 본 발명의 일 실시예에 있어서, 제조된 나노 세포5B가 크림에 추가로 감싸져 안정된 에센스 형식의 나노 세포6B를 생성할 수 있으며, 여기서 나노 세포6B의 평균 입도는 1~200 nm이며, 일반적으로 1~100 nm이며, 50 nm 미만이거나 30 nm 미만일 수 있다. 일 실시예에 있어서, 나노 세포6B의 평균 입도는 30 nm 미만일 수 있다. 다른 실시예에 있에서, 나노 세포6B의 평균 입도는 20 nm 미만, 10 nm 미만이거나 1 nm에 근접할 수 있다.
아래에 상세히 설명한 크림층을 첨가함으로써 도 5의 S511에 따른 다층 다상 나노 세포5A의 친수성 외부 쉘 및 도 5b의 S512에 따른 나노 세포5B의 소수성 외부 쉘과 상용성을 가질 수 있다. 이는 형성된 나노 봉입구조의 외부 쉘로서 크림층을 첨가하는 제조과정을 현저히 단순화 할 수 있으며, 이러한 구조는 구체적인 용도에 따라 부동한 층 분포를 가질 수 있다. 한편, 크림층의 첨가는 형성된 나노 봉입구조를 에센스 형식으로 안정화 시킴으로써 사용자 체감을 개선시킬 수 있다.
마찬가지로, 실시예는 다양한 다층 다상 나노 세포입자를 더 포함할 수 있다. 예시적 나노입자는 유중 수적형 구조를 형성하기 위한 유상층으로 봉입된 생체분자를 포함하는 최내층의 수상 코어, 다수개의 수상층, 다수개의 유상층 및 최외층의 크림층을 포함할 수 있다. 생체분자는 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 및/또는 히알루론산을 포함한다. 다수개의 수상층 중의 각각의 수상층 및 다수개의 유상층 중의 각각의 유상층이 유중 수적형 구조를 번갈아 봉입한다. 예를 들어, 나노입자는 다층 다상 나노입자이고, 평균 사이즈는 50 nm보다 작으며, 예를 들어 1 nm 내지 20 nm의 범위에 있다.
다양한 실시예에 있어서, 크림층은 개시된 나노입자의 최외층일 수 있다. 예를 들어, 최외층의 크림층은 수상 혼합물 및 유상 혼합물을 포함할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 수상 혼합물은 글리세린, 글리시리진산 디칼륨, 프로필렌 글리콜, 메틸파라벤 및 카보머 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 유상 혼합물은 미네랄 오일, 세테아릴 알코올, 프로필파라벤, 메틸파라벤, PEG-100 스테아레이트, PEG-40 하이드로제네이티드 캐스터오일, 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드, 트윈-80, 크레모포 이엘 (Cremophor EL), 글리세릴 스테아레이트, 트윈-65, 트윈-60, 트윈-20, 라브라팍 친유성기 WL 1349(Labrafac Lipophile WL 1349), 대두유, 차유, 식물유, 해바라기씨유, 어유, 참기름, 비타민 E, 동물성 유지, 글리세릴 카프릴레이트 / 카프레이트, 레시틴 달걀노른자 포스파티딜콜린(EPC), 폴리 프로필렌옥사이드(PPO), 폴리 (D,L-락트산) (PDLLA), 폴리 (ε-카프로 락톤) (PCL), 폴리 (L-아스파르트산), 폴록사머, PEG-폴리글루탐산, PEG-폴리아스파르트산, PEG-폴리-L-락티드, PEG유도체, 소르비탄 모노팔미테이트 및 소르비탄 올리에이트(스판-80) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 일부 상기 실시예를 나타내며, 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님에 유의하여야 한다.
실시예1：비동물 유래 성분 발효배지를 사용하여 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 제조하였다
실시예1 는 도 2에 도시된 상기 단계중 적어도 일부를 포함한다. 아래의 상세한 설명에 따르면, 상류 공정에 있어서, 실시예1은 비동물 유래 성분 발효배지를 사용하여 워킹 셀을 시딩 및 발효시키는 단계를 포함한다. 하류 공정에 있어서, 실시예1은 발효배지의 산성화에 의해 산 슬러리를 형성한 후 추출 및 투석하는 단계를 포함한다. 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A의 정제를 위하여, 실시예1은 반복하여 진행되는 투석 과정 및 연속적인 크로마토 그래피 과정의 단계를 더 포함하며, 부동한 방법으로 상기 단계들을 모니터링한다.
시딩 및 발효를 위한 워킹 셀 뱅크(WCB)은 마스터 셀 뱅크(MCB)에서 유래되며, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 검출 방법으로 혈청형 특이적인 프라이머로 MCB를 A 형 클로스트리디움 보툴리눔로 명확히 감별하고 B, E 혹은 파상풍 서열이 존재하지 않음을 검출하였다. 구체적으로 표 1에 기재된 A 형, B 형 및 E 형 신경독소의 클로스트리디움 보툴리늄 구조 유전자를 암호화하는 DNA서열을 사용하여 3쌍의 프라이머를 합성하였다. 발효배지중의 MCB균주의 24시간 배양물로부터 MCB세포의 게놈 DNA를 분리하여, 이를 PPYG(500 mL배지 당, 25 g 식물성 펩톤, 15 g 효모 추출물, 5 g 자기분해 효모 슬러리, 5 g 포도당)배지에서 추가로 계대 배양시키고, 24시간동안 추가로 성장시킨 후 DNA분리를 진행하였다. 미니 스핀 컬럼(mini spin column)타입 DNeasy Blood ＆ Tissue키트(Qiagen 회사, Germantown, MD)를 사용하여 게놈 DNA를 분리하였다.
도 3은 본 발명의 다양한 실시예에 따른 마스터 셀 뱅크로부터 수집한 혈청형 A DNA샘플과 부동한 혈청형 프라이머를 사용한 PCR증폭 결과이다. 도 3에 도시된 바와 같이, 혈청형 A PCR증폭 생성물(983 bp)은 A 형 프라이머를 사용하여 생성된 것이며(도 3중의 라인1), 혈청형 B과 C프라이머를 사용할 경우 증폭 생성물이 형성되지 않았다(도 3중의 라인2과 라인3). 도 3의 라인M에 도시된 절편 크기는 λDNA HindIII 및 X174 HaeIII Digest Marker Mix(New England Biolabs,Inc., Ipswich, MA)와 비교하여 확정된다. 또한, 혈청형 특이적인(신경독소) 서열 데이터의 Blast분석은, 각 샘플은 상응된 혈청형 특이적인 프라이머의 존재에서만 정확한 사이즈의 증폭 생성물을 생성하고 혈청형 A 증폭 생성물의 서열은 A 형 클로스트리디움 보툴리눔 Hall 균주과 일치함을 나타냈다.
표 1. 클로스트리디움 보툴리눔 타이핑 PCR 프라이머.
Figure 112019105671947-pat00001
MCB세포주 검증 후, WCB의 세포주는 MCB세포주로부터 유래되었고 10 mL의 고압 증기 처리된 비동물 유래 성분 발효배지에서 37℃에서 적어도 밤새 시딩하였다. 비동물 유래 성분 발효배지의 주요 성분은 표 2에 나타냈다. 시딩 완성 후, 5 mL 시딩물질을 사용하여 9 L 비동물 유래 성분 발효배지에서 35℃ 내지 39℃의 온도범위에서 96시간동안 시딩시켰다.
표 2. 비동물 유래 성분 발효배지의 주요 성분.
Figure 112019105671947-pat00002
발효 후의 산 슬러리 형성 과정에 있어서, 수거 시 목표치 pH 3.5에 도달할 때까지 3N H2SO4를 발효물에 첨가하여, 워킹 셀을 최소로 3시간동안 침전시켜 침전물을 형성하도록 하였다. 원심분리를 통해 침전을 수집하고, 100 mM의 pH가 5.5인 구연산염 완충액에 재현탁하여 처음으로 산 침전 추출을 진행하였다 (제 1 차 산 침전). 재현탁한 용액을 추가로 원심분리하였다. 획득한 상등액을 디켄트(decant)하고 저장하는 동시에 나머지 침전물을 100 mM 구연산염 완충액에 재현탁시켜 제 2 차 산 침전 추출을 진행하였다(제 2 차 산 침전). 재현탁한 용액을 제 3 차 원심분리를 진행하고 획득한 상등액을 디켄트하고 저장하였다. 제 1 차 및 제 2 차 산 침전에 의해 획득한 두가지 상등액을 합친 후 황산 암모늄을 첨가하여 냉장 온도에서 추가로 밤새 침전시켰다.
각 침전 및 추출 단계를 제어 가능한 방식으로 수행 및 모니터링하도록, 제 1 차 와 제 2 차 산 침전과정에서 RiboGreen측정과 260 nm 및 280 nm파장에서의 흡광도 비율(A260/A280 비율)을 측량하는 UV-분광법을 통해 핵산 불순물을 모니터링하였다. 표 3은 추출 용액에 포함된 핵산 불순물의 정량을 나타냈다. 예를 들어, 샘플 ID 1 “산 침전 추출물＃1”은 제 1 차 산 침전 후의 핵산 불순물 농도(359.3 μg/mg 단백질)을 나타내고, 샘플 ID 2 “합친 산 침전 추출물＃1및 ＃2”는 제 2 차 산 침전 후 합친 상등액중의 핵산 불순물 농도(514.0 μg/mg 단백질)를 나타냈다. 표 4는 실시예1중의 각 추출 및 정제 단계 후 측량한 UV A260/A280 비율을 추가로 나타냈다. 예를 들어, 샘플 ID 1“산 침전 추출물＃1”은 제 1 차 산 침전후의A260/A280 비율이 1.54인 것을 나타내고, 샘플 ID 2“합친 산 침전 추출물＃1 및 ＃2”는 제 2 차 산 침전 후 합친 상등액중의 핵산 불순물 농도(514.0 μg/mg 단백질)를 나타냈다.
표 3. RiboGreen측정에 의해 핵산 불순물 측정.
Figure 112019105671947-pat00003
이후의 전격 추출 및 투석 단계에 있어서, 제 1 차 및 제 2 차 산 침전하여 획득한 합친 상등액에 황산 암모늄을 첨가하여 추가로 침전시켰다. 원심분리를 통해 침전을 수집하고 새롭게 제조한 50 mM의 pH가 5.5인 구연산염 완충액에 재현탁시켰다. 표 3 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 샘플 ID 3 “황산 암모늄 침전 후 재현탁한 추출물”은 황산 암모늄 첨가 및 원심분리 후 추출 용액중의 핵산 불순물 농도 및A260/A280 비율을 나타냈다. 추출물을 DEAE Sephadex A-50 비드 슬러리과 1:1의 비율로 추가로 혼합하고 1시간동안 흔들었다(제 1 차 DEAE A50 슬러리). 그 후, 획득한 제 1 슬러리 혼합물을 원심분리하였다. 제 1 차 DEAE A50 슬러리의 상등액을 디켄트하고 저장한 동시에 새롭게 제조된 50 mM의 pH가 5.5인 구연산염 완충액으로 나머지 침전물을 추가로 재현탁시키고, 1:1의 비율로 DEAE Sephadex A-50 비드 슬러리를 첨가하여 1시간(제 2 차 DEAE A50 슬러리)동안 흔들었다. 그 후, 제 2슬러리 혼합물을 원심분리하고, 획득한 상등액을 디켄트하고 저장하였다. 제 1 차 및 제 2 차 산 침전하여 획득한 두가지 상등액을 합친 후, 황산 암모늄을 첨가하여 냉장 온도에서 추가로 밤새 침전시켰다.
표 4. UV-분광법에 의해 측량한 A260/A280 비율을 사용하여 핵산 불순물을 측정하였다.
Figure 112019105671947-pat00004
표 3 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 핵산 불순물의 농도는 각 추출 단계동안 모니터링되었다. DEAE Sephadex A-50 비드 슬러리의 첨가에 의해 핵산 불순물이 현저히 제거된 것이 발견하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 예를 들어, 샘플 ID 3 “황산 암모늄 침전 후 재현탁한 추출물”에 비하여, 샘플 ID 4 “제 1 차 DEAE A50 슬러리”는 핵산 불순물 농도가 현저히 감소된 것으로 나태냈다. 또한, 예를 들어 샘플 ID 4 “제 1 차 DEAE A50 슬러리” 중 189.1 μg/mg 단백질의 핵산 불순물 농도와 샘플 ID 5 “제 2 차 DEAE A50 슬러리” 중 91.4 μg/ mg 단백질의 핵산 불순물 농도를 비교하여 알 수 있다 싶이, 반복적으로 첨가 가능한 추출을 위한 DEAE A50 비드 슬러리는 나머지 핵산 불순물을 효율적으로 제거하였다.
RiboGreen측정은 산-슬러리 형성 단계 및 DEAE Sephadex A-50 비드 슬러리를 사용한 전격 추출 단계를 포함한 추출 및 정제 과정의 초기 단계에 사용됨에 유의하여야 한다. 상기 단계에서 핵산 불순물을 실질적으로 제거한 후, 상대적으로 높은 농도의 단백질은 RiboGreen측정에서 간섭을 일으킬 수 있다. 따라서, 후속 추출 및 정제 과정을 모니터링하기 위한 UV-분광법에 의한A260/A280 비율측량 및 SDS-PAGE방법을 포함하는 기타 방법을 사용하였다.
반복적으로 첨가 가능한 DEAE A50 비드 슬러리에 의해 전격 추출을 완성하고, 획득한 생성물은 잔존한 핵산 불순물, 기타 단백질 불순물 및 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A로부터 분리된 비독성 단백질을 제거하기 위하여 투석 및 연속적인 크로마토 그래피로 처리함으로써, 고순도 소분자량 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 생성하였다.
구체적으로 원심분리를 통해 황산 암모늄을 함유하는 침전을 수집하고 50 mM의 pH가 5.5인 구연산염 완충액에 재현탁시켰다. 그 후, 재현탁한 용액을 투석 튜브에 옮겨 50 mM의 pH가 5.5인 구연산염 완충액중의 핵산 불순물을 추가로 제거하였다. 투석 과정은 냉장 온도에서 밤새 진행되었다(제 1 차 투석). 제 1 차 투석 후 획득한 생성물을 DEAE Sephadex A-50 컬럼에 넣어 제 1 차 음이온 교환 크로마토 그래피 처리를 진행하였다(제 1 차 음이온 교환). 도 4는 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A정제를 위한 연속적인 크로마토 그래피 과정에 따른 각 단계의 SDS-PAGE 결과를 나타냈다. 예를 들어, 도 4A 및 도 4B는 각 비 환원 및 환원조건 하에서 크로마토 그래피 과정을 모니터링하는 각 단계에 포함된 단백질의 SDS-PAGE결과를 나타냈다. 도 4A 및 도 4B중의 라인1 “제 1 차 A-50 합침”은 제 1 차 음이온 교환 크로마토 그래피 과정후 합친 샘플중에 존재하는 단백질 밴드를 나타냈다. 제 1 차 투석 및 음이온 교환 과정은 임의의 나머지 핵산 불순물 및 음전하를 띠는 기타 단백질 불순물을 실질적으로 제거하였다. 제 1 차 음이온 교환 크로마토 그래피 후 수집한 생성물(A260/A280 비율이 0.6보다 작다)을 합쳐 제 2 차 투석을 진행한 후 다른 음이온 교환 크로마토 그래피 과정을 진행하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 예를 들어, 샘플 ID 8 “제 1 차 DEAE A-50 합침”의 A260/A280 비율은 0.48이다.
제 1 차 투석 및 제 1 차 음이온 교환 크로마토 그래피 과정의 완성에 따라, 합친 생성물에 황산 암모늄을 첨가하여 침전처리를 진행하였다. 원심분리를 통해 획득한 침전을 수집하고, 20 mM의 pH가 7.9인 인산염 완충액에 재현탁시켰다. pH 7.9의 약염기성 조건에서, 소분자량을 갖는 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A는 비독성 단백질을 함유하는 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 복합물과 분리될 수 있다. 재현탁한 용액을 투석 튜브에 옮겨 50 mM의 pH가 7.9인 구연산염 완충액에서 투석시켰다. 투석 과정은 냉장 온도에서 밤새(제 2 차 투석) 진행되었다. 제 2 차 투석 후 획득한 생성물을 DEAE Sephadex A-50 컬럼에 넣어 제 2 차 음이온 교환 크로마토 그래피처리를 진행하였다(제 2 차 음이온 교환). 도 4에 도시된 바와 같이, 제 2 차 음이온 교환 전에 로딩된 샘플(라인3)과 제 2 차 음이온 교환 후에 합친 샘플(샘플4)을 비교하여 알 수 있다 싶이, pH 7.9인 구연산염 완충액을 사용하여 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A과 비독성 단백질(제 2 차 음이온 교환 크로마토 그래피 과정에서 실질적으로 제거하였다)을 효율적으로 분리시켰다. 마찬가지로, 제 2 차 음이온 교환 크로마토 그래피 과정후에 수집한A260/A280 비율이 0.6보다 작은 생성물을 합쳤다. 도 4에 도시된 바와 같이, 예를 들어, 샘플 ID 10 “제 2 차 DEAE A-50 합침”의 A260/A280 비율은 0.47이다.
음이온 교환 크로마토 그래피 과정의 단일 단계에 비하여, 상기의 반복 가능한 투석-음이온 교환 사이클은 생성물중의 모든 핵산 불순물 및 대부분 단백질 불순물을 실질적으로 제거하였다. 예를 들어, 도 4에 도시된 바와 같이, 제 1 차 음이온 교환 과정의 수집된 생성물을 나타낸 라인1 (제 1 차 A-50 합침)과 제 2 차 음이온 교환 과정으로부터 수집된 생성물을 나타낸 라인3(제 2 차 A-50합침)을 비교하였다. 반복 가능한 음이온 교환 과정 후 대량 단백질 불순물을 제거하였다.
클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A는 가공조건하에서 양전하를 갖는 소분자량 단백질이므로 본원에 기재된 상기 실시예는 고순도 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 획득하기 위한 양이온 교환 크로마토 그래피 과정을 더 포함한다. 구체적으로 제 2 차 투석 및 제 2 차 음이온 교환 크로마토 그래피 과정의 완성에 따라, 합친 생성물에 황산 암모늄을 첨가하여 침전처리를 진행하였다. 원심분리를 통해 획득한 침전을 수집하고, 20 mM의 pH가 7.0인 인산염 완충액에 재현탁시켰다. 재현탁한 용액을 투석 튜브에 옮겨, 20 mM의 pH가 7.0인 인산염 완충액중의 임의의 나머지 비독성 단백질을 추가로 제거하였다. 투석과정은 냉장 온도에서 밤새 진행되었다(제 3 차 투석). 제 3 차 투석 후 획득한 생성물을 양이온 교환 크로마토 그래피 처리를 위하여 Superloop 및 P-50 펌프를 사용하여 미리 충진된 SP컬럼에 로딩하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 양이온 교환 크로마토 그래피 과정 후, 합친 생성물은 분자량이 150 KDa인 투명한 단백질 밴드를 나타냈다(예를 들어 도 4A의 라인6을 참조). 또한, 획득한 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A 는 100 KDa중쇄 및 50 KDa경쇄를 포함한다(예를 들어 도 4B의 라인6을 참조). 이로부터 알 수 있다 싶이, 상기와 같은 SP컬럼을 사용한 양이온 교환 크로마토 그래피 과정은 소분자량의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 효율적으로 정제하였다.
더 큰 분자량(예를 들어, 960 KDa)의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 복합물과 달리, 본 발명의 상기 실시예에 따른 생성된 소분자량의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A은 다양한 이점을 가질 수 있다. 예를 들어, 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 복합물에 비하여, 분자량이 약 150 KDa인 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A는 20％ 미만인 중량을 갖는다. 따라서 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A는 현저히 저감된 항원성 및 면역원성을 갖는다. 고분자량의 복합물에 비하여, 생성된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A는 임상적 적용시 더욱 높은 안전성을 가질 수 있다. 또한, 생성된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A는 크기가 작아 더욱 빠른 확산 속도를 가질 수 있어 다양한 적용(예를 들어, 국소 병변 적용 및 국소 적용)하에서 피부장벽을 쉽게 통과할 수 있음으로 주사기 주입과 같은 침습성 전달방법을 피면할 수 있다.
또한, 본 발명의 각 로트의 다양한 실시예에 따른 생성된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A는 100 내지 400단위/ng의 생체분자활성을 가질 수 있으며, 일반적으로 200 LD50 단위/ng를 초과하며, 대부분은 300 LD50 단위/ng이다. 20 LD50/ng 생체분자활성을 갖는 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 복합물에 비하여, 생성된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A의 활성은 15배를 초과하는 효능에 달성할 수 있다. 임상적 적용 동안 동일한 치료효과를 달성하기 위하여, 고분자량 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 복합물에 비하여, 필요되는 생성된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A의 양은 15배로 감소할 수 있어 환자에 대한 독성을 현저히 감소시킬 수 있었다.
더욱 중요하게는, 본 발명의 상기 실시예에 따르면, 소분자량의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A의 제조는 동물 유래성 성분을 포함하지 않을 수 있다(예를 들어, 동물에서 유래된 쿠크트 미트 배지 혹은 글리세린). 이렇게 제조된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A산물에 대한 동물 유래에 의한 잠재적 오염을 피면할 수 있어 제조과정중의 안전성이 현저히 개선될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 실시예에 따르면, 음이온 교환 크로마토 그래피 매질을 사용하는 두개 크로마토 그래피 과정 및 양이온 교환 크로마토 그래피 매질을 사용하는 하나의 크로마토 그래피 과정을 포함하는 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A의 제조는 제조과정의 효율을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 9 L 발효배지를 사용함으로써 약 10 내지 50 mg(예를 들어 홀로 톡신BoNT-A)의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 생성할 수 있다. 대량의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A를 제조하기 위하여 제조과정은 스케일 업하여 쉽게 제조할 수 있다.
실시예1은 본 발명의 임의의 범위를 한정하는 것이 아님에 유의하여야 한다. 일부 상기 실시예에 있어서, 실시예1에 개시된 방법도 고분자량(예를 들어, 960 KDa)의 BoNT-A 복합물을 제조하는데 사용될 수 있고 정제 과정에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 투석 및 크로마토 그래피 과정에서 pH 값이 7보다 낮은 완충용액을 사용한다.
실시예2：다층 다상 나노방식으로 봉입된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A 제조 및 경피전달
실시예2는 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A의 다층 다상 나노 봉입에 따른 제조방법을 기술한다. 상기 실시예에 있어서, 소분자량(예를 들어 150 KDa)인 홀로 BoNT-A를 사용하여 나노 봉입에 따른 제조를 진행함에 유의하여야 한다. 또한 고분자량인 BoNT-A 복합물을 사용하여 나노 봉입에 따른 제조를 진행할 수 있으며, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
독소 나노 세포1의 제조
생체분자(예를 들어 홀로 BoNT-A)를 포함하는 활성성분은 나노 사이즈의 세포 혹은 에멀젼에 봉입되어 독소 나노 세포를 형성할 수 있다. 독소 나노 세포1를 제조하기 위하여(예를 들어, 도 5a의 S501 혹은 도 5b의 S502), 73 mg 트윈-80을 10 g의 교반된 홀로 BoNT-A생체분자를 포함하는 수성 독소 작동 용액에 첨가하며, 상기 홀로 BoNT-A생체분자의 효능은 1000단위 (LD50)/그람 (1000단위/그람)이다. 실온에서 인산염 완충액(20 mM, pH 6.8, 10％ 에틸렌글리콜, 3％ 글리세린 및 2％ 프로필렌 글리콜을 함유)을 사용하여 홀로 BoNT-A저장액(stock solution)을 연속적으로 희석하여 독소 작동 용액을 제조하였다. 맑은 용액이 형성 될 때까지 트윈-80 및 수성 독소 작동 용액의 혼합물의 교반을 약 15분 동안으로 유지하였다. 입도 분석기(Malvern PanalyticalTechnologies, Westborough, MA)로 획득한 독소 나노 세포1를 포함하는 맑은 용액의 입도 및 ζ(Zeta)전위를 측량하였다. 도 6A 및 표 5는 독소 나노 세포1의 입도 강도 분포 및 독소 나노 세포1의 입도 체적 분포를 나타냈다. 이로부터 알 수 있다 싶이, 평균 강도입도는 9.79 nm(z평균치)이다. 또한, 독소 나노 세포1의 입도 체적 분포는 6.96 nm(10％ 누적 체적) 내지 14.90 nm(90％ 누적 체적)이다.
상기 수중 유적형 구조를 갖는 독소 나노 세포1의 제조는 예시적 목적을 위한 것임에 유의하여야 한다. 또한 도 5b의 S502에 따르면, 홀로 BoNT-A는 유상층으로 봉입한 수상 코어에 포함될 수 있으며 본 발명은 이에 한정되지 않는다. 홀로 BoNT-A가 나노 세포1B의 구조에 포함될 경우, 즉, 나노 세포의 수상 코어에서, 다음의 반복 가능한 봉입단계는 봉입과정 이전에 새롭게 형성된 각각의 외층 극성이 현재 외층의 극성과 상이하도록 확보하기 위하여 조정될 수 있다.
독소 나노 세포2의 제조
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드(10 g)를 별도의 용기중의 PEG-40 하이드로제네이티드 캐스터오일(20 g)에 첨가하고, 약 40℃에서 충분히 혼합하며 실온까지 냉각시켰다. 그 후, 0.5 g의 상기 과정에 의해 제조된 독소 나노 세포1를 상기 혼합물에 첨가하며 독소 나노 세포2를 함유하는 맑은 용액이 형성될 때까지 교반을 약 15분동안으로 유지하였다. 입도 분석기를 사용하여 용액의 입도 및 ζ(Zeta)전위를 측량하였다. 도 6B 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 독소 나노 세포2의 평균 강도입도는 12.82 nm(z평균치)이며, 입도 체적 분포는 8.27 nm내지 25.30 nm이다.
독소 나노 세포3의 제조
독소 나노 세포3을 제조하기 위하여, 5 g의 상기 과정에서 획득한 독소 나노 세포2를 45 g의 독소 작동 용액(효능은 1000단위/그람이다)에 첨가하였다. 실온 (예를 들어 25℃)에서, 연한 파랑색 투명 용액을 형성할 때까지 약 1000 rpm의 속도로 혼합물을 약 15분동안 추가로 교반하였다. 독소 나노 세포3을 함유하는 획득한 용액(나노입자 혹은 나노 에멀젼이라고도 칭함)의 입도 및 ζ(Zeta)전위를 측량하였다. 도 6C 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 독소 나노 세포3의 평균 강도입도는 16.21 nm(z평균치)이며, 입도 체적 분포는 11.40 nm 내지 25.40 nm이다.
독소 나노 세포4의 제조
독소 나노 세포4의 제조는 상기 독소 나노 세포2의 제조와 유사하다. 구체적으로 PEG-40 하이드로제네이티드 캐스터오일(20 g)과 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드(10 g)를 용기에서 약 40℃에서 충분히 혼합하고 실온까지 냉각시켰다. 혼합물을 교반하면서 상기 과정에 의해 제조된 독소 나노 세포3(0.5 g)을 첨가하였다. 독소 나노 세포4를 함유하는 맑은 용액을 형성할 때까지 혼합물 교반을 약 15분동안으로 유지하였다. 획득한 맑은 용액의 입도 및 ζ(Zeta)전위를 측량하였다. 도 6D 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 독소 나노 세포4의 평균 강도입도는 20.00 nm(z평균치)이며, 입도 체적 분포는 13.80 nm 내지 31.90 nm이다.
독소 나노 세포5의 제조
독소 나노 세포5의 제조는 상기 독소 나노 세포3의 제조와 유사하다. 구체적으로 5 g의 상기 과정에 의해 제조된 독소 나노 세포4를 45 g 독소 작동 용액(효능은 1000단위/그람이다)에 첨가하였다. 연한 파랑색 투명 용액을 형성할 때까지 혼합물을 실온에서 약 1000 rpm의 속도로 약 15분동안 추가로 교반하였다. 획득한 독소 나노 세포5를 함유하는 연한 파랑색 투명 용액의 입도 및 ζ(Zeta)전위를 측량하였다. 도 6E 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 독소 나노 세포5의 평균 강도입도는 24.53 nm(z평균치)이며, 입도 체적 분포는 17.30 nm 내지 37.70 nm이다.
독소 나노 세포6의 제조
우선, 표 6에 기재된 성분에 따라 크림1을 제조하였다. 구체적으로 “용기 1중의 상 1”로 나열된 성분 및 “용기 2중의 상 2”로 나열된 성분을 제조하고 용기중의 모든 성분이 용해될 때까지 약 70℃까지 가열하여 각각 교반하였다. 그 후, 용기2중의 용해된 성분을 약 70℃에서 약 15분동안 교반하면서 용기1로 옮겼다. 혼합한 성분을 추가로 실온까지 냉각시켜 크림1을 형성하였다.
표 5. 독소 나노 세포의 입도 및 분포
Figure 112019105671947-pat00005
형성한 크림1을 약 50℃까지 냉각시킬 경우, 실온에서 별도의 용기에서 1 g의 크림1을 상기 과정에 의해 제조된 교반된 독소 나노 세포5에 첨가하였다. 독소 나노 세포6(나노 독소 생성물이라고도 칭함)을 형성할 때까지 혼합물의 교반을 약 15분동안으로 유지하였다. 그 후, 형성한 연한 파랑색 독소 나노 세포6의 입경 및 ζ전위를 측량하였다. 도 6F 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 독소 나노 세포6의 평균 강도입도는 25.84 nm(z평균치)이며, 입도 체적 분포는 16.30 nm 내지 53.10 nm이며, 전체 입도는 110 nm보다 작다.
표 6. 크림1의 구성
Figure 112019105671947-pat00006
독소 나노 세포6의 열 안전성
각각 부동한 저장조건에서 상기 과정에 의해 제조된 독소 나노 세포6의 안전성을 추가로 검출하였고, 검출기간은 예를 들어 180일이고, 상기 저장조건은 동결 해동 사이클, 냉동 조건 (예를 들어, -20℃), 냉장 조건 (예를 들어, 2 내지 8℃) 및 실온 (예를 들어, 25℃)을 포함한다. 표 7은 각 동결 해동 사이클 동안의 독소 나노 세포6의 평균 입도 및 치수 변화를 나타냈다. 또한, 표 8은 부동한 열 조건하에서의 독소 나노 세포6의 평균 입도 및 치수 변화를 나타냈다. 이로부터 알 수 있다 싶이, 제조된 독소 나노 세포6은 6개월의 검출 기간 동안, 부동한 열 조건하에서 저장동안(다수개의 동결 해동 사이클, 2℃ 내지 8℃ 냉장 저장조건, 냉동 저장조건 (예를 들어, -20℃), 실온 (예를 들어, 25℃)을 포함한다) 우수한 안전성 및 작은 치수 변화를 나타냈다. 독소 나노 세포6은 생물학적 활성의 손실을 피면하기 위하여 상기 부동한 저장 열 조건을 비교함으로써 저온 (예를 들어 -20℃)에서 저장하였다.
표 7. 동결 해동 사이클 동안 독소 나노 세포6의 열 안전성
Figure 112019105671947-pat00007
표 8. 독소 나노 세포6의 열 안전성
Figure 112019105671947-pat00008
독소 나노 세포6을 사용한 치료 및 기능성 화장품 용도
제조된 독소 나노 세포6는 에센스 형식으로 제조되고, 치료 및 기능성 화장품 용도로 환자의 얼굴영역에서 검출을 진행하였다. 구체적으로 컬러화상으로 독소 나노 세포6을 적용하기 전의 각 환자 얼굴영역을 기록하였다. 그 후, 상기 과정에 의해 제조된 독소 나노 세포6을 함유하는 약 0.2 mL의 에센스를 눈 주름(crow's feet)의 얼굴영역의 일측에 적용하여 1회로만 발랐다. 그 후 순차적으로 관찰하고 각각 1주, 2주 및 4주에 기록하였다. 도 7은 본 발명의 다양한 실시예에 따라 제조된 나노 봉입된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A을 적용한 환자 얼굴영역의 비교를 나타냈다. 이로부터 알 수 있다 싶이, 2주 후, 독소 나노 세포6을 사용하여 국소적으로 적용한 얼굴영역에서 주름이 완화 및 감소된 것이 명백히 관찰되었으며 효과가 지속적으로 뚜렷하였다. 또한, 독소 나노 세포6을 사용하여 얼굴영역을 1회로만 발라서 처리하여도, 4주 후 여전히 피부수렴 및 주름이 펴지는 효과가 관찰되었다.
실시예3：다층 다상 나노방식으로 봉입된 히알루론산 제조 및 경피전달
본 발명의 상기 실시예에 따르면, 나노 봉입된 생체분자를 제조하는 예시적 방법에 의해 1500 KDa 히알루론산(HA)을 포함하는 다수개의 고분자량 생체분자를 제조할 수 있다. 실시예3은 나노 봉입된 HA의 제조방법, 치료 및 기능성 화장품 용도에서의 경피전달을 기술하였다.
HA 나노 세포1의 제조
상기 실시예, 도 5a 및 5B 등에 따르면, HA생체분자로 봉입한 나노 세포를 형성하고, 각 제조과정의 HA 나노 세포의 사이즈 분포를 모니터링하였다. 구체적으로 HA 나노 세포1를 제조하기 위하여, 약 40℃에서, 180 mg의 PEG-40 하이드로제네이티드 캐스터오일 액체(약 40℃까지 가열하여 용융시켰다)를 용기중의 10 g의 0.1％ HA(20 ppm카퍼트라이펩타이드(copper tripeptide)-1, 10 ppm팔미토일 펜타펩타이드-4 및 10 ppm아세틸헥사펩타이드 함유)를 함유하는 수용액에 첨가하고 교반하면서 충분히 혼합하였다. 맑은 용액을 형성할 때까지 교반을 약 30분동안으로 유지하였다. 입도 분석기를 사용하여 HA 나노 세포1를 포함하는 획득한 맑은 용액의 입도 및 ζ(Zeta)전위를 측량하였다. 도 8A 및 표 9에 나타낸 바와 같이, 형성한 HA 나노 세포1의 평균 강도입도는 9.91 nm(z평균치)이다. 또한, 입도 체적 분포는 7.04 nm(10％ 누적 체적) 내지 15.30 nm(90％ 누적 체적)이다.
상기 수중 유적형 구조를 갖는 HA 나노 세포1의 제조는 예시적 목적을 위한 것임에 유의하여야 한다. 또한, 도 5b의 S502에 따르면, HA는 유상층으로 봉입한 수상 코어에 포함될 수 있으며 본 발명은 이에 한정되지 않는다. HA가 나노 세포1B의 구조에 포함될 경우, 즉, 나노 세포의 수상 코어에서, 다음의 반복 가능한 봉입단계는 봉입과정 이전에 새롭게 형성된 각각의 외층 극성이 현재 외층의 극성과 상이하도록 확보하기 위하여 조정될 수 있다.
HA 나노 세포2의 제조
별도의 용기에서, 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드(10 g)를 크레모포 이엘 (Cremophor EL)(20 g)에 첨가하고, 약 40℃에서 충분히 혼합하였다. 그 후, 0.5 g의 상기 과정에 의해 제조된 HA 나노 세포1을 혼합물에 첨가하고 맑은 용액을 형성할 때까지 교반을 약 30분동안으로 유지하였다. HA 나노 세포2를 함유하는 획득한 맑은 용액의 입도 및 ζ(Zeta)전위를 측량하였다. 도 8B 및 표 9에 나타낸 바와 같이, 형성한 HA 나노 세포2의 평균 강도입도는 12.90 nm(z평균치)이며, 입도 체적 분포는 8.47 nm 내지 23.70 nm이다.
HA 나노 세포3의 제조
약 40℃에서, 약 800 rpm의 교반속도로, 5 그람(5 g)의 상기 과정에 의해 제조된 HA 나노 세포2를 0.1％ HA(20 ppm카퍼트라이펩타이드(copper tripeptide)-1, 10 ppm팔미토일 펜타펩타이드-4 및 10 ppm아세틸헥사펩타이드 등 함유)를 함유하는 45 g수용액에 첨가하였다. 연한 파랑색 투명 용액을 획득할 때까지 혼합물의 교반을 약 30분동안으로 유지하였다. 획득한 HA 나노 세포3을 함유하는 연한 파랑색 용액의 입도 및 ζ(Zeta)전위를 측량하였다. 도 8C 및 표 9에 나타낸 바와 같이, HA 나노 세포3의 평균 강도입도는 18.70 nm(z평균치)이며, 입도 체적 분포는 12.50 nm 내지 29.90 nm이다.
HA 나노 세포4의 제조
HA 나노 세포4의 제조는 상기 HA 나노 세포2의 제조와 유사하다. 구체적으로 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드(10 g) 및 크레모포 이엘 (Cremophor EL)(20 g)를 약 40℃에서 충분히 혼합한 후 교반하면서 상기 과정에 의해 제조된 HA 나노 세포3(0.5 g)를 첨가하였다. HA 나노 세포4를 함유하는 맑은 용액을 획득할 때까지 혼합물의 교반을 약 30분동안으로 유지하였다. 획득한 맑은 용액의 입도 및 ζ(Zeta)전위를 측량하였다. 도 8D 및 표 9에 나타낸 바와 같이, HA 나노 세포4의 평균 강도입도는 21.95 nm(z평균치)이며, 입도 체적 분포는 16.10 nm 내지 33.40 nm이다.
HA 나노 세포5의 제조
HA 나노 세포5의 제조는 상기 HA 나노 세포3의 제조와 유사하다. 구체적으로 약 800 rpm의 교반속도 및 약 40℃의 온도에서 용기에 상기 과정에 의해 제조된 HA 나노 세포4(5 g)를 0.1％ HA(20 ppm카퍼트라이펩타이드(copper tripeptide)-1, 10 ppm팔미토일 펜타펩타이드-4 및 10 ppm아세틸헥사펩타이드 등 함유)를 함유하는 45g수용액에 첨가하였다. HA 나노 세포5를 함유하는 연한 파랑색 용액을 획득할 때까지, 혼합물의 교반을 약 30분동안으로 유지하였다. 획득한 연한 파랑색 용액의 입도 및 ζ(Zeta)전위를 측량하였다. 도 8E 및 표 9에 나타낸 바와 같이, HA 나노 세포5의 평균 강도입도는 27.65 nm(z평균치)이며, 입도 체적 분포는 17.00 nm 내지 52.80 nm이다.
HA 나노 세포6의 제조
실시예2에서 기술한 홀로 BoNT-A를 함유하는 독소 나노 세포6의 제조과정과 유사하며, 우선 표 5에 기재된 성분에 따라 크림1을 제조하였다. 또한, 제조된 크림1을 약 50℃까지 냉각시키고, 40℃에서, 별도의 용기에서 1g의 크림1을 상기 과정에 의해 제조된 교반된 HA 나노 세포5에 첨가하였다. HA 나노 세포6(HA 나노 산물이라고도 칭함)를 형성할 때까지 혼합물의 교반을 약 30분동안으로 유지하였다. 그 후 형성한 HA 나노 세포6의 입도 및 ζ(Zeta)전위를 측량하였다. 도 8F 및 표 9에 나타낸 바와 같이, HA 나노 세포6의 평균 강도입도는 29.72 nm(z평균치)이며, 입도 체적 분포는 18.00 nm 내지 61.10 nm이며, 전체 입도는 130 nm보다 작다.
표 9. HA 나노 세포의 입도 및 분포
Figure 112019105671947-pat00009
HA 나노 세포6의 열 안전성
표 10. 동결 해동 사이클 동안 HA 나노 세포6의 열 안전성
Figure 112019105671947-pat00010
표 11. HA 나노 세포6의 열 안전성
Figure 112019105671947-pat00011
마찬가지로, 각각 부동한 저장조건에서 상기 과정에 의해 제조된 HA 나노 세포6의 안전성을 추가로 검출하였고, 검출기간은 예를 들어 180일이고, 상기 저장조건은 동결 해동 사이클, 냉장 조건 (예를 들어, 2~8℃), 실온 (예를 들어, 25℃) 및 상승된 온도 (예를 들어, 40℃) 포함한다. 표 10은 각 동결 해동 사이클 동안의 HA 나노 세포6의 평균 입도 및 치수 변화를 나타냈다. 또한, 표 11은 부동한 열 조건하에서의 HA 나노 세포6의 평균 입도 및 치수 변화를 나타냈다. 이로부터 알 수 있다 싶이, 제조된 HA 나노 세포6는 6개월의 검출기간 동안, 부동한 열 조건하에서 저장동안(다수개의 동결 해동 사이클, 냉장 저장조건 (예를 들어, 2℃-8℃), 실온 (예를 들어, 25℃) 및 상승된 온도 (예를 들어, 40℃)를 포함한다) 우수한 안전성 및 작은 치수 변화를 나타냈다. HA 나노 세포6은 HA의 생물학적 활성을 유지하기 위하여 상기 부동한 저장 열 조건을 비교함으로써 실온에서 저장하였다.
HA 나노 세포6을 사용한 치료 및 기능성 화장품 용도
제조된 HA 나노 세포6는 에센스 형식이고 치료 및 기능성 화장품 용도(예를 들어, 상처 치유 및 피부 처짐, 거친 피부 복구)로 환자의 부동한 피부영역에서 검출을 진행하였다.
상처 치유에 있어서, 컬러화상으로 HA 나노 세포6을 적용하기 전의 각 환자의 피부영역을 기록하였다. 그 후, 약 1 mL의 상기 과정에 의해 제조된 HA 나노 세포6을 함유하는 에센스를 새롭게 손상된 피부영역(더이상 출혈하지 않음)에 매일 2회로 적용하였다. 순차적으로 관찰하고 각각 1일, 3일 및 5일에 기록하였다. 도 9의 사례5~7은 본 발명의 다양한 실시예에 따라 제조된 나노 봉입된 HA를 상처 치유에 적용한 환자 피부영역의 비교를 나타냈다. 새롭게 손상된 피부영역에 국소적으로 나노 봉입된 HA를 함유하는 에센스를 1주 적용한 후 상처 영역이 완전히 치유되였고 피부가 깨끗하고 흉터가 없었다.
피부 처짐 및 거친 피부 복구에 있어서, 나노 봉입된 HA를 함유하는 에센스로 피부영역을 처리하는 것이 상처 복구 용도와 유사하다. 순차적으로 관찰하고 각각 1주, 2주 및 3주에 기록하였다. 도 9의 사례8~9는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 제조된 나노 봉입된 HA를 피부 처짐 및 거친 피부복구에 적용한 환자 피부영역의 비교를 나타냈다. 3주 처리 후 피부가 탄성이 있고 가시적인 피부색/색조 및 주름 개선이 관찰되었다.
본 발명의 상기 실시예에 따르면, 개시된 나노 봉입된 생체분자(예를 들어, BoNT-A독소 나노 세포 및 HA 나노 세포)를 제조하는 방법은 안정적이고 생체활성을 갖는 나노입자를 생성할 수 있어 다양한 용도에서 임상적 개선을 나타냈다. 이러한 개선은 코어로 봉입된, 다층 나노입자 사이 혹은 나노입자 표면에 고정된 활성성분(예를 들어, BoNT-A 혹은 HA)가 신속하고 효율적으로 전달되어 피하세포내로 유입됨으로써 발생한 것이다.
개시한 나노 봉입된 생체분자를 제조하는 방법은 미셀 형성 과정 및 다수개의 봉입 과정을 전반적인 절차로서 조합할 수 있다. 각 친수성 활성성분은 친수성 상에 용해되어 봉입과정에 사용되고, 각 소수성 활성성분은 소수성 상에 용해되어 봉입과정에 사용된다. 이렇게 부동한 극성 및 용해도를 갖는 다양한 활성성분은 피부장벽을 넘어 전달하는 작업을 위하여 단일 다층 나노입자내에 봉입될 수 있어, 부동한 활성성분을 갖는 다층 나노입자를 생성하여 다양한 기능을 수행할 수 있으며, 단일 유형 성분만 함유하는 나노입자에 비하여, 현저히 넓은 적용범위를 가질 수 있다.
본 발명의 원리 및 실시가 명세서에서 구체적인 실시예와 과련하여 설명되었지만, 상기 실시예의 설명은 본 발명의 방법 및 방법의 핵심 사상을 이해하는데 도움을 주기 위한 것이다. 동시에, 당업계의 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상에 따라 구체적인 실시방식 및 적용범위를 수정할 수 있다. 결론적으로, 명세서의 내용은 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

Claims (22)

  1. 최내층의 수상 코어 또는 유상 코어,
    다수개의 수상층,
    다수개의 유상층, 및
    최외층의 크림층를 포함하는 다층 다상 나노입자에 있어서,
    여기서 다수개의 수상층 중의 각각의 수상층 및 다수개의 유상층 중의 각각의 유상층이 수상 코어 또는 유상 코어를 번갈아 봉입하여, 수상, 유상이 번갈아 있는 다층 다상 나노입자를 형성하며
    상기 수상 코어, 수상층은 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 포함하는 생체분자를 포함하며,
    상기 유상 코어, 유상층은 유용성 분자를 포함하고;
    상기 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소의 제조방법은,
    동물 유래 성분이 없는 발효배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 세균을 발효시키는 제 1 단계,
    상기 클로스트리디움 보툴리눔 세균을 함유하는 발효배지와 음이온 교환 매질 슬러리를 접촉하도록 하며 원심분리를 통해 상기 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 함유하는 상등액을 획득하는 제 2 단계,
    상기 상등액을 투석하여 상기 생체분자를 포함하는 투석액을 수집하는 제 3 단계,
    상기 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 함유하는 상기 투석액을 음이온 교환 크로마토 그래피 컬럼과 접촉시키는 제 4 단계,
    제 3 단계와 제 4 단계를 반복하여 상기 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 함유하는 용출액을 획득하며 상기 음이온 교환 크로마토 그래피 컬럼으로부터 획득한 상기 용출액을 양이온 교환 크로마토 그래피 컬럼과 접촉시키는 제 5 단계, 및
    상기 양이온 교환 크로마토 그래피 컬럼으로부터 획득한 상기 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 함유하는 용출액을 수집하는 제 6 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 다층 다상 나노입자.
  2. 청구항1에 있어서,
    상기 다층 다상 나노입자의 평균 사이즈는 1~200 nm 범위에 있는 것을 특징으로 하는 다층 다상 나노입자.
  3. 청구항1에 있어서,
    상기 수상 코어 또는 유상 코어의 평균 사이즈는 1 nm 내지 200 nm범위에 있는 것을 특징으로 하는 다층 다상 나노입자.
  4. 청구항1에 있어서,
    상기 최외층의 크림층은 수상 혼합물과 유상 혼합물을 포함하며,
    상기 수상 혼합물은 글리세린, 글리시리진산 디칼륨, 펜탄디올, 프로필렌 글리콜, 부탄디올, 메틸파라벤 및 카보머 중 적어도 하나를 포함하며, 또한,
    상기 유상 혼합물은 미네랄 오일, 세테아릴 알코올, 프로필파라벤, 메틸파라벤, PEG-100 스테아레이트, PEG-40 하이드로제네이티드 캐스터오일, 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드, 트윈-80, 크레모포 이엘 (Cremophor EL), 글리세릴 스테아레이트, 트윈-65, 트윈-60, 트윈-20, 라브라팍 친유성기 WL 1349(Labrafac Lipophile WL 1349), 대두유, 차유, 식물유, 해바라기씨유, 어유, 참기름, 비타민 E, 동물성 유지, 글리세릴 카프릴레이트 / 카프레이트, 레시틴 달걀노른자 포스파티딜콜린, 폴리 프로필렌옥사이드, 폴리 (D,L-락트산), 폴리 (ε-카프로 락톤), 폴리 (L-아스파르트산), 폴록사머, PEG-폴리글루탐산, PEG-폴리아스파르트산, PEG-폴리-L-락티드, PEG유도체, 소르비탄 모노팔미테이트 및 소르비탄 올리에이트 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 다층 다상 나노입자.
  5. 청구항1에 있어서,
    상기 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소는 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 복합물 및 홀로 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 중의 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 다층 다상 나노입자.
  6. 청구항1에 있어서,
    상기 다수개의 수상층 중의 하나 이상은 친수성 분자를 포함하며, 및/또는
    상기 다수개의 유상층 중의 하나 이상은 소수성 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 다층 다상 나노입자.
  7. 청구항6에 있어서,
    상기 친수성 분자는, 히알루론산, 세포 성장인자, 줄기 세포, 줄기 세포액, 펩타이드, 단백질, 압타머, 올리고 뉴클레오티드, 비타민, Snap-8 옥타펩티드, 디펩타이드, 아세틸헥사펩타이드, 알란토인, 니아신아미드, 알로에, 안토시아닌, 글리시리진산 디칼륨, 알부틴, 아미노 부티르산, 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드, 글루코사민, N-아세틸카르노신, L-카르노신, 보효소, 합환화 (合歡花, Albiziae Flos) 추출물, 소미초 (小米草, Euphrasia pectinata Ten) 추출물, 베타인, 트레할로스, 에리스리톨, 만니톨, 카보머, 비타민 C, 히드록시에틸 셀룰로오스, 카퍼트라이펩타이드(copper tripeptide), 아세틸 글루코사민, 게스트로딘(gastrodin), 아세틸 헥사펩타이드-8, 아세틸 헥사펩타이드-1, L-트립토판, 5-하이드록시 트립토판, 구연산, 리파아제, 루브라젤(lubrajel), 세라미드 3, 우유 추출물, 알로에베라 잎즙, 인삼 즙, 가수분해 콜라겐, 노나펩타이드-1, 헥사펩타이드-1, β-글루칸, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 에틸렌글리콜, 부탄디올, 니아신, 트라넥삼산, 프에라린, 유럽감초(Glycyrrhiza glabra L.), 병풀(Centella asiatica (L.) Urban) 추출물, 진세노사이드, 레스베라트롤, 팔미토일 펜타펩타이드-4, 팔미토일 트리펩타이드-1, 팔미토일 테트라펩타이드-7, 팔미토일 올리고펩타이드, 압타머, si-RNA, 줄기 세포 및 치료제 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 다층 다상 나노입자.
  8. 청구항6에 있어서,
    상기 소수성 분자는, 유럽산 빌베리 오일, 아프리칸 월넛 씨드 오일, 아르간트리커넬오일, 프라칵시씨오일, 브라질넛씨오일, 시어버터, 제라늄 오일, 코코넛 오일, 밀 배아유, 올리브유, 시어버터, 월견초유, 라놀린, 밀랍, 레시틴, 호호바 왁스, 멘톨, 살리실산메틸, 비타민 E, 루테인, 제아잔틴, 계피유, 진저 오일, 바닐릴부틸에틸, 라노스테롤, 비타민 A, 대두 이소플라본, 식물스테롤, 식물스테롤 에스테르, 대두유, 차유, 씨벅톤 오일, 포도씨유, 아몬드유, 윈터그린 오일, 호호바 오일 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 다층 다상 나노입자.
  9. 청구항7 또는 청구항8에 있어서,
    상기 치료제는, 인슐린, 셀레콕시브, 로페콕시브, 5-플루오로우라실, 다카바진, 이부프로펜, 테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 에스트리올, 프로게스테론, 독시사이클린, 미노사이클린, 에스트라디올, AgNO3를 함유하는 은 이온, ZnO를 함유하는 Zn이온, 항생제, 호르몬, 페로몬, API 분자 및 식물 추출물 중의 하나 혹은 다수개를 포함하는 것을 특징으로 하는 다층 다상 나노입자.
  10. 청구항1에 있어서,
    상기 동물 유래 성분이 없는 발효배지는 식물성 펩톤을 함유하는 것을 특징으로 하는 다층 다상 나노입자.
  11. 청구항10에 있어서,
    상기 동물 유래 성분이 없는 발효배지는 덱스트로오스, 효모 추출물 및 자기분해 효모 슬러리 중 적어도 하나를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다층 다상 나노입자.
  12. 청구항10에 있어서,
    상기 식물성 펩톤은 대두, 감자 또는 쌀 중 적어도 하나 이상으로부터 획득하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항1에 있어서,
    제 2 단계에서 클로스트리디움 보툴리눔 세균을 함유하는 발효배지를 수거 할 시, 산을 첨가하여 산 슬러리를 형성함으로써 침전시키는 것을 특징으로 하는 다층 다상 나노입자.
  14. 청구항1에 있어서,
    제 2 단계와 제 3 단계 사이에,
    상기 클로스트리디움 보툴리눔 세균을 함유하는 상기 발효배지와 상기 음이온 교환 매질 슬러리를 접촉시키는 단계를 반복하고, 원심분리를 통해 상기 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 함유하는 상등액을 획득하는 단계, 및
    상기 발효배지와 음이온 교환 매질 슬러리를 반복적으로 접촉시킴으로써 획득한 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 함유하는 상등액을 합치는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다층 다상 나노입자.
  15. 청구항1에 있어서,
    제 5 단계는 상기 음이온 교환 크로마토 그래피 컬럼으로부터 획득한 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 함유하는 용출액과 상기 양이온 교환 크로마토 그래피 컬럼을 접촉시키기 전에, 상기 음이온 교환 크로마토 그래피 컬럼으로부터 획득한 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 함유하는 용출액을 투석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다층 다상 나노입자.
  16. 청구항1에 있어서,
    상기 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소는 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A인 것을 특징으로 하는 다층 다상 나노입자.
  17. 청구항9에 있어서,
    마우스 LD50측정에 따른 상기 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 A의 생물학적 비활성도는 100 내지 400 단위/ng 인 것을 특징으로 하는 다층 다상 나노입자.
  18. 청구항1에 있어서,
    제 6 단계 이후, 상기 양이온 교환 크로마토 그래피 컬럼으로부터 획득한 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소를 함유하는 용출액과 에틸렌글리콜, 글리세린 및 프로필렌 글리콜 중의 하나 혹은 다수개를 포함하는 안정제를 혼합하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다층 다상 나노입자.
  19. 청구항18에 있어서,
    상기 안정제는 에틸렌글리콜, 글리세린 및 프로필렌 글리콜을 포함하고,
    총 체적당 중량 기준으로 상기 안정제가 용출액에 첨가된 후의 농도범위는 10~30(w/v)％인 것을 특징으로 하는 다층 다상 나노입자.
  20. 청구항19에 있어서,
    상기 안정제에 있어서,
    상기 에틸렌글리콜이 용출액에 첨가된 후의 농도범위는 5~20(w/v)％ 이며,
    상기 글리세린이 용출액에 첨가한 후의 농도범위는 1~10(w/v)％ 이며,
    상기 프로필렌 글리콜이 용출액에 첨가된 후의 농도범위는 1~5(w/v)％ 인 것을 특징으로 하는 다층 다상 나노입자.
  21. 삭제
  22. 삭제
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