CN115192545A - 多层多相纳米细胞粒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及透皮递送领域,公开了一种多层多相纳米细胞粒。该多层多相纳米细胞粒包括最里层的水相核或油相核、水相层、油相层和最外层的乳膏层。水相层和油相层交替地包封,形成多层多相纳米细胞粒。生物分子包括肉毒杆菌神经毒素和/或透明质酸等活性分子。
Description
技术领域
本发明涉及透皮递送领域,更具体地,涉及纳米细胞粒包封的包含肉毒杆菌神经毒素A的生物分子和其他大分子量生物分子的透皮递送。
背景技术
肉毒杆菌毒素是细菌肉毒杆菌(Clostridium botulinum)产生的神经毒素,所述肉毒杆菌是一种革兰氏阳性产芽胞厌氧杆状菌,通常存在于植物、土壤、水和动物肠道中。根据肉毒杆菌抗原性的不同可区分为七种(A、B、C、D、E、F和G)。所有血清型均通过阻断神经肌肉接合处的主要神经递质乙酰胆碱的释放,麻痹肌肉来干扰神经传递。如今,肉毒杆菌神经毒素在多种治疗应用中发挥着重要作用,包括斜视、局灶性肌张力障碍、半面痉挛、各种痉挛性运动障碍、头痛、多涎和多汗症,并且其应用范围仍在迅速扩大。肉毒杆菌神经毒素也常用于美容美体应用,包括矫正整个面部、下巴、颈部和胸部的纹路、褶皱和皱纹,以及其他皮肤病学应用,例如多汗症和多痘症。2002年,美国食品和药物管理局(FDA)批准(保妥适,肉毒杆菌神经毒素A是其有效成分)用于美容美体用途,以临时减少眉间纹和抬头纹等。
产生的肉毒杆菌神经毒素(也称为肉毒杆菌全毒素,或全BoNT-A)的活性相对较低,轻链和重链通过二硫键连接形成核心小分子肉毒素(SM毒素或全毒素或者裸体毒素),分子量约为150KDa,活性更高。图1示出了肉毒杆菌神经毒素的示意性结构。如图1中所示,肉毒杆菌神经毒素多肽链包括通过二硫键连接的分别为约100KDa的重(H)链和50KDa的轻(L)链。肉毒杆菌神经毒素A具有特异性酶活性,用于神经元内蛋白水解攻击可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE),其中酶活性由L链赋予。H链是受体结合和易位到胞质溶胶中所必需的。全BoNT-A与其他蛋白质,包括非血凝素蛋白和血凝素结合,形成更高分子量(例如960KDa)的肉毒杆菌毒素复合物(也称为BoNT-A)。与150KDa全BoNT-A(具有毒性和治疗效果)不同,肉毒杆菌毒素复合物中存在的相关蛋白质是无毒的,因而不是药理学作用所必需的。
现有技术中已有通过用含有动物源性成分的发酵培养基培养肉毒杆菌神经毒素并将其用于人类治疗。然而,动物源性产品的使用可能导致潜在的污染物(例如,来自动物源性产品的病毒)进入临床使用的制备的肉毒杆菌毒素,从而可能增加治疗应用期间的风险。
此外,由于BoNT-A(960KDa)和全BoNT-A(150KDa)的相对大的分子量,最常用的给药方式是在临床环境中的针筒注射。然而,针筒注射较为不便,使用时会造成疼痛且不安全,患者依从性较低。因此,需要开发替代方法以方便、安全且无痛地递送肉毒杆菌神经毒素,特别是在治疗、皮肤病学和药妆领域。例如,期望开发用于大分子量蛋白质的非侵入性递送方法,包括局部应用的肉毒杆菌神经毒素,例如经手施用的透皮递送,而不是针筒注射或其他使用设备的侵入性递送过程。
人体皮肤包括呈三维设置的各种组织和细胞层,例如角质层(SC)、表皮(ED)和真皮,其厚度为20μm至数百μm(例如,在一些面部区域为约250μm)。通常,可将人体皮肤视为三维精细多层(油相-水相)n系统,具有从外皮细胞到内皮细胞的确定的网络结构。因此,穿过从外皮细胞到内皮细胞的精细厚实屏障来递送尤其是大分子量的生物分子颇具挑战。
本发明所公开的纳米细胞粒包封形式的透皮递送旨在解决上述一个或多个问题以及本领域的其他问题。
发明内容
本发明包括多个方面,其中一个方面提供了一种用于制备具有生物活性的肉毒杆菌神经毒素的方法。该方法包括以下步骤:
1)在发酵培养基中发酵细菌肉毒杆菌,其中所述发酵培养基不含动物源性成分;
2)使包含所述细菌肉毒杆菌的所述发酵培养基与阴离子交换培养基浆料接触,并经离心获得包含所述肉毒杆菌神经毒素的上清液;
3)透析所述上清液并收集包含所述肉毒杆菌神经毒素的经透析溶液;
4)使包含所述肉毒杆菌神经毒素的所述经透析溶液与阴离子交换色谱柱接触;
5)重复步骤3)和步骤4)并获得包含所述肉毒杆菌神经毒素的洗脱液,并使从所述阴离子交换色谱柱获得的所述洗脱液与阳离子交换色谱柱接触;
6)收集包含从所述阳离子交换色谱柱获得的所述肉毒杆菌神经毒素的洗脱液。
如背景技术中所述,肉毒杆菌神经毒素复合物的分子量较大(例如960KDa)。而对于大分子量蛋白质的使用,由于不利于透皮传递,因此通常采用注射的形式。与更大分子量(例如,960KDa)的肉毒杆菌神经毒素复合物不同,根据本发明方法所得的小分子量的肉毒杆菌神经毒素A可具有多种优点。例如,与肉毒杆菌神经毒素复合物相比,分子量约150KDa的肉毒杆菌神经毒素A仅具有小于20%的重量。如此,肉毒杆菌神经毒素A可具有显著降低的抗原性和免疫原性。与较大分子量的复合物相比,产生的肉毒杆菌神经毒素A对于临床使用可能是更加安全的。此外,由于产生的肉毒杆菌神经毒素A的尺寸小,它可以具有更高的扩散速率,这使得它更容易在各种应用(例如,局灶和局部应用)中穿过皮肤屏障,避免诸如针筒注射等侵入性递送方法。
本发明从其他无毒蛋白质解离的产生的肉毒杆菌神经毒素A可具有较小的分子量150KDa。解离的肉毒杆菌神经毒素A带正电荷(肉毒杆菌神经毒素复合物带负电荷),相应地,本发明提供了使用顺序透析、阴离子交换和阳离子交换色谱纯化肉毒杆菌神经毒素A的方法。例如,可以通过阴离子交换色谱介质和阳离子交换色谱介质的顺序使用来基本上去除所有剩余的核酸杂质,其他蛋白质杂质以及从肉毒杆菌神经毒素A解离的无毒蛋白质,从而实现小分子量的带正电荷的肉毒杆菌神经毒素A的纯化(虽然现有技术中也有关于150KDa肉毒杆菌神经毒素A的制备方法,但是本发明方法技术构思不同)。
此外,现有技术中已有通过用含有动物源性成分的发酵培养基培养肉毒杆菌神经毒素并将其用于人类治疗。然而,本发明团队在研究中发现,动物源性产品的使用可能导致潜在的污染物(例如,来自动物源性产品的病毒)进入临床使用的制备的肉毒杆菌毒素,从而可能增加治疗应用期间的风险。而本发明在发酵培养基中不使用动物源性成分,从而避免动物源对制备的产品的潜在污染,因此本发明方法所得肉毒杆菌神经毒素安全性更高。
作为优选,所述不含动物源性成分的发酵培养基包含植物蛋白胨。
作为优选,所述不含动物源性成分的发酵培养基还包含右旋糖、酵母提取物和自溶酵母泥中的至少一种。
作为优选,所述植物蛋白胨由大豆、马铃薯或大米中的至少一种获得。
作为优选,步骤2)中,使包含细菌肉毒杆菌的发酵培养基在收获时添加酸形成酸泥进行沉淀。
本发明可以进一步包括在收获时进行酸泥形成以酸化发酵培养基,从而开始提取作为靶蛋白的肉毒杆菌神经毒素A。
作为优选,步骤2)与步骤3)之间还包括:
重复使包含所述细菌肉毒杆菌的所述发酵培养基与所述阴离子交换培养基浆料接触的步骤,并经离心获得包含所述肉毒杆菌神经毒素的上清液;和
合并所述包含使发酵培养基与阴离子交换介质浆料反复接触获得的肉毒杆菌神经毒素的上清液。
作为优选,步骤5)还包括:在使所述包含从阴离子交换色谱柱获得的肉毒杆菌神经毒素的洗脱液与所述阳离子交换色谱柱接触之前,透析所述包含从阴离子交换色谱柱获得的肉毒杆菌神经毒素的洗脱液。
作为优选,所述肉毒杆菌神经毒素是肉毒杆菌神经毒素A。
作为优选,使用小鼠LD50测定,所述肉毒杆菌神经毒素A的生物比活性为100至400单位/纳克。
作为优选,步骤6)之后还包括:将所述包含从阳离子交换色谱柱获得的肉毒杆菌神经毒素的洗脱液与包含乙二醇、甘油和丙二醇中的稳定剂混合。
由于小分子量肉毒杆菌神经毒素相对于大分子肉毒杆菌神经毒素生物活性稳定性相对较差,为此,本发明对其储存时的稳定剂配方进行了优化,本发明在经过大量研究后,发现采用乙二醇+甘油+丙二醇的组合相对于现有的单一乙二醇作为稳定剂,效果取得了显著进步。
作为优选,所述稳定剂包括乙二醇、甘油和丙二醇,并且以总体积重量计,所述稳定剂在添加至洗脱液后的浓度范围为10~-30(w/v)%。
作为优选,所述稳定剂中:
所述乙二醇添加至洗脱液后的浓度范围为5~20(w/v)%,
所述甘油添加至洗脱液后的浓度范围为1~10(w/v)%,
所述丙二醇添加至洗脱液后的浓度范围为1~5(w/v)%。
本发明的另一方面提供了一种多层多相纳米细胞粒(简称纳米细胞粒)。该纳米细胞粒包括:最里层的水相核或油相核;多个水相层;多个油相层;和最外层的乳膏层,其中:多个水相层中的每一水相层和多个油相层中的每一油相层交替包封水相核或油相核,形成水相、油相相间的多层多相纳米细胞粒。所述水相核、水相层中包含有生物分子,所述生物分子包括肉毒杆菌神经毒素和/或透明质酸等水溶性分子。所述油相核、油相层中包含有油溶性分子。
本发明的多层多相纳米细胞粒具有如图5A/B所示的水相、油相交替包封的结构(与本申请人的在先申请相比,本发明的层数更多,本发明实施例中成功制备得到了含有8层的产品,如图8F)。该结构是模拟多层人体皮肤结构和人体细胞结构的多层纳米细胞结构(也是水相、油相相叠),例如三维精细多层(油相-水相)n系统。这种多层多相纳米细胞粒可以促进活性成分向内皮细胞的运输和递送。例如,当处于皮肤或细胞结构的水相层时,水相层中的水溶性活性物质溶解;脱去该水相层的剩余纳米细胞粒继续渗透进入油相层,此时油相层中的油溶性活性物质(可作选择而是否添加)溶解,依此层层渗透,可达深层,解决大分子物质透皮传递难的技术难题。并且,在每一层水相或油相中,可包含有与内层相同或不同的活性成分分子。产生具有两层或更多层的多功能纳米细胞粒,其含有针对不同治疗、药妆以及其他应用的不同活性成分。
作为优选,所述多层多相纳米细胞粒的平均尺寸在1-200纳米范围。
作为优选,所述水相核或油相核的平均尺寸在1纳米至200纳米的范围内。
作为优选,所述最外层的乳膏层包含水相混合物和油相混合物。
所述水相混合物包括甘油、甘草酸二钾、戊二醇、丙二醇、丁二醇、对羟基苯甲酸甲酯和卡波姆中的至少一种,以及所述油相混合物包括以下物质中的至少一种:矿物油、鲸蜡硬脂醇、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸甲酯、PEG-100硬脂酸酯、PEG-40氢化蓖麻油、辛酸/癸酸甘油三酯、吐温-80、Cremophor EL、硬脂酸甘油酯、吐温-65、吐温-60、吐温-20、Labrafac Lipophile WL 1349、大豆油、茶油、植物油、葵花籽油、鱼油、芝麻油、维生素E、动物脂油、甘油辛酸癸酸酯、卵磷脂蛋磷脂酰胆碱、聚(环氧丙烷)、聚(D,L-乳酸)、聚(ε-己内酯)、聚(L-天冬氨酸)和泊洛沙姆、PEG-聚谷氨酸、PEG-聚天冬氨酸、PEG-聚-L-丙交酯、PEG衍生物、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯和脱水山梨糖醇油酸酯。
作为优选,所述肉毒杆菌神经毒素包括肉毒杆菌神经毒素复合物和全肉毒杆菌神经毒素中的一种。
作为优选,所述多个水相层中的一个或多个包含亲水性分子,和/或所述多个油相层中的一个或多个包含疏水性分子。
作为优选,所述亲水性分子包括以下物质中的至少一种:透明质酸、细胞生长因子、干细胞、干细胞液、多肽、蛋白质、适体、寡核苷酸、维生素、Snap-8八肽、二肽、阿基瑞林六肽,尿囊素、烟酰胺、芦荟、花青素、甘草酸二钾、熊果苷、氨基丁酸、烟酰胺单核苷酸、氨糖、N-乙酰肌肽、L-肌肽、辅酶、合欢花提取物、小米草提取物、甜菜碱、海藻糖、赤藓醇、甘露醇、卡波姆、维生素C、羟乙基纤维素、铜三肽、乙酰壳糖胺、天麻素、乙酰基六肽-8、乙酰基六肽-1、L-色氨酸、5-羟基色氨酸、柠檬酸、脂肪酶、芦芭胶、神经酰胺3、牛奶提取物、库拉索芦荟叶水、人参根水、水解胶原、九肽-1、六肽-1、β-葡聚糖、丙二醇、丙三醇、乙二醇、丁二醇、烟酸、传明酸、葛根素、光果甘草、积雪草提取物、人参皂苷、白藜芦醇、棕榈酰五肽-4、棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、棕榈酰寡肽、适体、si-RNA、干细胞和治疗剂等。
作为优选,所述疏水性分子包括以下物质中的至少一种:欧洲越桔籽油、印加果籽油、刺阿甘树仁油、大裂叶五桤木籽油、巴西果籽油、牛油果树果脂油、香叶天竺葵油、椰子油、小麦胚芽油、橄榄油、乳木果油、月见草油、羊毛脂、蜂蜡、卵磷脂、霍霍巴蜡、薄荷醇、水杨酸甲酯、维生素E、叶黄素、玉米黄质、肉桂油、姜根油、香草醇丁醚、羊毛甾醇、维生素A、大豆异黄酮、植物甾醇、植物甾醇酯、豆油、茶籽油、沙棘油、葡萄籽油、杏仁油、冬青油、霍霍巴油等。
作为优选,所述治疗剂包括以下物质中的一种或多种:胰岛素、塞来昔布、罗非考昔、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪、布洛芬、四环素、氧四环素、雌三醇、黄体酮、多西环素、米诺环素、雌二醇、包括AgNO3的银离子、包括ZnO的Zn离子、抗生素、激素、费洛蒙、原料药分子和植物提取物。啶、达卡巴嗪、布洛芬、四环素、氧四环素、雌三醇、黄体酮、多西环素、米诺环素、雌二醇、包括AgNO3的银离子、包括ZnO的Zn离子、抗生素、激素、费洛蒙、原料药分子和植物提取物等。
本发明的其他方面可以由本领域技术人员根据本发明的描述、权利要求和附图来理解。
附图说明
为了更清楚地描述本发明实施例中的技术方案,下面简要介绍了用于描述实施例的附图。显然,以下描述中的附图仅示出了本发明中的一些实施例,并且本领域技术人员仍然可以从这些附图中得出其他衍生图而无需创造性的努力。
图1为肉毒杆菌神经毒素的结构示意图;
图2为根据本发明各种实施例的用于制备小分子量的肉毒杆菌神经毒素A的示例性方法的流程图;
图3为根据本发明各种实施例的使用从主细胞库收集的血清型ADNA样品和不同血清型引物的聚合酶链式反应(PCR)扩增的结果;
图4为根据本发明各种实施例的按照用于制备小分子量的肉毒杆菌神经毒素A的示例性方法中的不同纯化方法步骤的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果;
图5A为根据本发明各种实施例的用于制备纳米细胞粒包封的生物分子的示例性方法的流程图;
图5B为本发明各种实施例的用于制备纳米细胞粒包封的生物分子的另一示例性方法的流程图;
图6为使用根据本发明各种实施例的用于制备纳米细胞粒包封的肉毒杆菌神经毒素的示例性方法,以肉毒杆菌神经毒素包封的纳米细胞粒的粒度和分布图;
图7为根据本发明各种实施例的施用有以肉毒杆菌神经毒素包封的纳米细胞粒的患者皮肤区域的对比图;
图8为根据本发明各种实施例的使用用于制备纳米细胞粒包封的生物分子的示例性方法,以大分子量透明质酸包封的纳米细胞粒的粒度和分布图;
图9为根据本发明各种实施例的施用有以大分子量透明质酸包封的纳米细胞粒的患者皮肤区域的对比图。
具体实施方式
尽管说明书中的具体实施例对本发明的原理和实现进行了描述,但是前述对实施例的描述仅旨在帮助理解本发明的方法和方法的核心思想。同时,本领域普通技术人员可以根据本发明的思想对具体实施方式和应用范围进行修改。总之,说明书的内容不应被解释为对本发明的限制。
本发明提供了根据本发明各种实施例的制备小分子量的肉毒杆菌神经毒素A的方法。肉毒杆菌神经毒素A可以通过A型肉毒杆菌Hall菌株的发酵产生,并进一步从发酵培养基中提取和纯化。图2示出了根据本发明各种实施例的用于制备小分子量的肉毒杆菌神经毒素A的示例性方法的流程图。
在图2中,示例性方法可以包括细胞接种和发酵,在此期间可以以可控方式培养细菌肉毒杆菌并产生肉毒杆菌神经毒素A(例如,在图2的S201中)。该方法可以进一步包括在收获时进行酸泥形成以酸化发酵培养基,从而开始提取作为靶蛋白的肉毒杆菌神经毒素A(例如,在图2的S203中)。在将发酵培养基酸化以形成沉淀物(酸泥)之后,示例性方法可以进一步包括闪式提取和透析以去除核酸杂质和其他蛋白质杂质(例如,在图2的S205中)。为了进一步去除剩余的核酸杂质和其他相关的无毒蛋白质并获得小分子量的高纯度肉毒杆菌神经毒素A,示例性方法可以进一步包括使用透析和色谱进行顺序纯化(例如,在图2的S207-S211中)。例如,示例性方法可以进一步包括可重复的纯化循环,包括透析、阴离子交换色谱过程和阳离子交换色谱过程。随着纯化过程的完成,可以进一步过滤所获得的肉毒杆菌神经毒素A并将其在低温(例如,≤-70℃)下储存,以实现长期储存(例如,在图2的S213中)。
可以使用不同的方法监测根据图2的每个示例性步骤,使得可以以可控的方式产生、提取和纯化作为靶蛋白的肉毒杆菌神经毒素A。再次参考图2,例如,可以通过分别称量加入高浓度酸形成的沉淀物(酸泥)和称量含有硫酸铵的沉淀物来监测S203中的酸泥形成和S205中的闪式提取和透析。或者,可以进行荧光测定以监测酸泥形成。例如,用作RiboGreen核酸定量试剂的超灵敏荧光染料定量水溶液中的DNA,例如,定量含有蛋白质的水溶液中的DNA杂质。如此,可以通过测量核酸的荧光强度的降低来监测含有蛋白质的溶液中核酸杂质的去除。在一些任选的实施例中,荧光测定可用于监测图2中一个或多个步骤(例如,在S203和S205中)中核酸杂质的去除。
在本发明的另一个实施例中,SDS-PAGE可用于监测图2中的基本上所有示例性步骤中的肉毒杆菌神经毒素A的纯度。或者,UV光谱法也可用于监测蛋白质浓度和测量蛋白质溶液中的核酸杂质。例如,在278nm波长处的UV吸光度可用于测量和测定蛋白质浓度。此外,可以测量在260nm和280nm波长处的UV吸光度比(A260/A280比)以测定蛋白质溶液中的核酸杂质。此外,还可以包括qPCR方法以测定含有肉毒杆菌神经毒素A的溶液中的核酸杂质,例如,当核酸杂质的浓度特别低时。在本发明的一个实施例中,可以进行TaqManqPCR测定以检测纯化的肉毒杆菌神经毒素A样品中残留的A型肉毒杆菌基因组DNA,从而确保从最终产物中去除梭菌DNA杂质。
应该注意,可以组合一种或多种方法来监测图2中的示例性步骤。例如,SDS-PAGE方法以及UV光谱法可以组合以监测提取和纯化过程,本发明并不意图对此进行限制。应进一步注意,在监测生产和纯化肉毒杆菌神经毒素A中可包括其他方法,本发明并不意图对此进行限制。
对于细胞接种和发酵(在S201中),小分子量的肉毒杆菌神经毒素A的制备可以包括制备工作细胞库(WCB)以及接种和发酵制备的WCB。在本发明的一个实施例中,WCB可以在高压蒸汽处理的发酵培养基中解冻,其中解冻过程可以在环境温度下,或者在37℃下进行。随后,可以将解冻的WCB接种在高压蒸汽处理的发酵培养基中。在一个实施例中,接种过程可以在约33℃至40℃的温度范围内进行约4小时至20小时。例如,接种过程可以在37℃下进行12小时。
在本发明的一些任选实施例中,可以对从其中可得到WCB中的细菌肉毒杆菌的主细胞库(MCB)进行表征,以验证细菌肉毒杆菌的各种性质。表征过程可以在接种和发酵过程之前进行,并且当发酵过程中包括动物源性成分时,细菌肉毒杆菌的特征化性质可以包括同一性、生物纯度、稳定性、形态学、DNA测序和病毒检测。例如,可以通过确定细菌的表型或基因型特征来实现同一性表征。可以通过测量血浆污染来测定生物活性。定义为期望目标产物的一致产生的稳定性可以通过细胞的性质、培养方法等来测定。生存力可以定义为于限定条件下在储存期间保持生产的能力。应当注意,可以识别和测量MCB的一些其他特征性质,本发明并不意图对此进行限制。
在本发明的一个实施例中,在细胞接种和发酵过程中,优选地,基本上不使用动物源性成分,从而避免动物源对制备的产品的潜在污染。作为常用的疱肉培养基和用于接种和发酵过程的源自动物的其他成分(例如,使用牛和猪起始材料的N-Z-Amine和甘油)的替代物,本发明的一个实施例可以包括基本上非动物源性成分发酵培养基。本发明的另一个实施例可任选地包括基于植物蛋白胨的发酵培养基。
例如,基于植物的蛋白质产品可以包含在发酵培养基中,包括但不限于大豆、马铃薯和/或大米。此外,自溶酵母泥、酵母提取物和葡萄糖也可以包含在发酵培养基中。在本发明的一个实施例中,相对于培养基的总体积,以重量计(w/v),非动物源性成分发酵培养基可包含5%大豆粉、2%酵母提取物和2%自溶酵母泥。任选地,非动物源性成分发酵培养基可包含3%大豆粉、2%马铃薯粉、2%酵母提取物和1%自溶酵母泥。任选地,非动物源性成分发酵培养基可包含3%大豆粉、1%酵母提取物、2%自溶酵母泥和1%葡萄糖。非动物源性成分发酵培养基可进一步包含右旋糖和氢氧化钠(例如,约10%至50%水溶液)用于调节pH。在一个实施例中,发酵培养基中右旋糖的浓度可以是5克/升(5g/L)。如本文所用,除非另有说明,否则本发明中描述的成分百分比是指相对于总体积的重量百分比。
可以将制备的非动物源性成分发酵培养基调节至适当的pH值。在一个实施例中,发酵培养基的pH可以在pH 6.5至pH 8.5的范围内。例如,发酵培养基的pH可以在pH7.0至pH7.5的范围内。在一些任选的实施例中,可以将发酵培养基的pH调节至pH 7.2,并且可以通过添加氢氧化钠来实现pH值的调节,例如,通过向1L发酵培养基中添加0.3mL的50%氢氧化钠来实现pH值的调节。
进一步参考图2的步骤S201,接种溶液中的工作细胞可以转移到更大体积的发酵培养基中,使得肉毒杆菌可以在厌氧环境中生长和扩大。发酵过程的持续时间在约33℃至40℃的温度范围内可以为70小时至120小时。在本发明的一个实施例中,发酵过程在35℃至39℃的温度范围下可以为约96小时。根据各批次各种实施例,9L非动物源性成分发酵培养基可以产生超过20亿(109)个小鼠LD50单位的肉毒杆菌神经毒素A,其中每一个小鼠LD50单位可以定义为小鼠LD50测定中对应于约2.5至10皮克的肉毒杆菌神经毒素A的致死剂量,其生物比活性在100-400LD50单位/纳克。
参考图2的步骤S203,根据本发明的各种实施例,可以使包含细菌肉毒杆菌的发酵培养基在收获时沉淀以实现酸泥形成。在一个实施例中,可以将高浓度酸加入到包含细菌肉毒杆菌的发酵培养基中,以去除细胞碎片。例如,可将3N H2SO4加入发酵培养基中直至pH降至3.5,保持至少3小时,使得基本上所有细胞均可沉降形成沉淀物。
在本发明的一个实施例中,通过酸化发酵培养基形成的沉淀物可以通过离心收集,并重悬浮,以用于在100mM pH值为5.5的柠檬酸盐缓冲液中提取预定时间。同时,可以收集离心获得的含有肉毒杆菌神经毒素A、核酸杂质和其他蛋白质杂质的上清液。在一些任选的实施例中,可以重复离心和再悬浮过程,使得大部分或甚至基本上所有的肉毒杆菌神经毒素A可以被提取到上清液中。例如,酸化的发酵培养基可以进行第一次离心,使得上清液可以与沉淀物分离。剩余的沉淀物可以重悬于100mM柠檬酸盐缓冲液中1小时进行提取,然后进行第二次离心。随后,可以将第二次离心获得的上清液与沉淀物分离,其中上清液可以与第一次离心获得的上清液合并,并且可以对沉淀进行第三次再悬浮。可以向合并的上清液中加入硫酸铵以进一步沉淀。在本发明的一个实施例中,合并的上清液的沉淀过程可以在2至8℃下进行约4至20小时。根据前述实施例,可以进行RiboGreen测定和来自UV吸收测定的A260/A280比,以监测每个酸沉淀循环的核酸杂质的去除。
参考根据本发明的各种实施例的图2的步骤S205,向上述上清液中添加高浓度的硫酸铵可导致蛋白质在上清液中的溶解度降低。当硫酸铵的浓度足够高时,蛋白质可能自溶液中沉淀析出。在一个实施例中,可经离心收集沉淀物并重悬于50mM pH值为5.5的柠檬酸盐缓冲液中。随后,可以将重悬的沉淀物进一步处理以基本上去除核酸杂质和其他蛋白质杂质。在本发明的一个实施例中,可以将重悬的沉淀物与阴离子交换剂混合以进一步提取作为靶蛋白的肉毒杆菌神经毒素A,其中阴离子交换剂可以包括二乙基氨基乙基(DEAE)Sephadex A-50珠浆料。根据一些任选的实施例,可以重复使用阴离子交换剂的上述提取过程以实现对肉毒杆菌神经毒素A的有效提取。例如,在50mM pH为5.5的柠檬酸盐缓冲液中的重悬溶液可以与DEAE Sephadex A-50珠浆料以1∶1的比例混合并摇动1小时(第一次提取)。可以对获得的浆料混合物进行离心,以便可以收集上清液,同时可以将沉淀物重新悬浮在50mM pH值为5.5的柠檬酸盐缓冲液中。可以将重悬的溶液与DEAE Sephadex A-50珠浆料以1∶1的比例混合并摇动1小时(第二次提取)。可以将第一次和第二次离心后的所有上清液合并,并加入硫酸铵以进一步沉淀。在本发明的一个实施例中,合并上清液的沉淀过程可以在2至8℃下进行约4至20小时。
如上所述,与其他无毒蛋白质如非血凝素蛋白和血凝素相关的含有肉毒杆菌神经毒素的肉毒杆菌神经毒素复合物的分子量较大(例如960KDa)并带负电荷。在现有技术中,阴离子交换色谱介质主要用于纯化肉毒杆菌神经毒素复合物。在本发明的各种实施例中,从其他无毒蛋白质解离的产生的肉毒杆菌神经毒素A可具有显著较小的分子量150KDa。此外,解离的肉毒杆菌神经毒素A带正电荷。相应地,本发明提供了使用顺序透析、阴离子交换和阳离子交换色谱纯化肉毒杆菌神经毒素A的方法。例如,可以通过阴离子交换色谱介质和阳离子交换色谱介质的顺序使用来基本上去除所有剩余的核酸杂质,其他蛋白质杂质以及从肉毒杆菌神经毒素A解离的无毒蛋白质,从而实现小分子量的带正电荷的肉毒杆菌神经毒素A的纯化。根据前述实施例,可以使用不同的方法来监测上述纯化过程中的每一种。例如,SDS-PAGE方法和UV光谱均可以用于检测核酸杂质和其他蛋白质杂质的去除。
参考根据本发明的实施例的图2的步骤S207,可以用阴离子树脂提取和透析对从步骤S205获得的含有硫酸铵的沉淀物进行处理。例如,可以经离心收集含有硫酸铵的沉淀物,并重悬于50mM pH值为5.5的柠檬酸盐缓冲液中。可以进一步透析重悬的溶液。在本发明的一个实施例中,重悬的溶液可以于50mM pH值为5.5的柠檬酸盐缓冲液中在2℃至8℃下透析约4至20小时。随后,可以将从透析管收集的经透析产物装载到DEAE Sephadex A-50柱中用于阴离子交换色谱过程,从而可以显著去除带负电荷的核酸杂质和其他蛋白质杂质。
在本发明的一个实施例中,可以对从透析管收集的经透析产物进行称重,然后装载到DEAE Sephadex A-50柱中。此外,UV光谱可用于监测核酸杂质的去除。例如,可以合并A260/A280比低于0.6的收集产物,其中特别小的A260/A280比可以指示较低浓度的核酸杂质。此外,还可以对阴离子交换色谱过程之后获得的合并产物进行称重,并与装载前的经透析产物进行比较,以便可以以可控的方式操作和监测杂质的去除。
根据本发明的实施例以及图2的步骤S209,可以进一步重复阴离子交换色谱过程以实现核酸杂质和其他蛋白质杂质的有效去除。例如,在第一次透析并接着进行阴离子交换色谱过程后,可以合并A260/A280比低于0.6的产品,并进一步加入硫酸铵进行沉淀,这一过程可以在2℃至8℃下进行约4至20小时。随后,可以经离心收集含有硫酸铵的沉淀物,并重悬于20mM pH值为7.9的磷酸盐缓冲液中。高pH值7.9可以使得肉毒杆菌神经毒素A从无毒蛋白质中解离,而这又可以促进小分子量肉毒杆菌神经毒素A的纯化,随后去除解离的无毒蛋白质。可以进一步透析重悬的溶液。在本发明的一个实施例中,重悬的溶液可以于20mM pH值为7.9的磷酸盐缓冲液中在2℃至8℃下透析约4至20小时。随后,可以将从透析管收集的经透析产物进一步装载到DEAE Sephadex A-50柱中,进行第二次色谱处理,从而可以基本上去除所有剩余的核酸杂质和大部分蛋白质杂质。
随着根据本发明的前述实施例的第二次透析和阴离子交换色谱的完成,可以进一步用阳离子交换色谱处理获得的合并产物,从而可以纯化带正电荷的肉毒杆菌神经毒素A。例如可以将获得的合并产物与硫酸铵一起加入以进一步沉淀,这一过程可以在2℃至8℃下进行约4至20小时。可以经离心收集沉淀,将其重悬于20mM pH值为7.0的磷酸盐缓冲液中,进行第三次透析。在本发明的一个实施例中,重悬的溶液可以于20mM pH值为7.0的磷酸盐缓冲液中在2℃至8℃下透析约4至20小时。随后,可以对从透析管收集的经透析产物进行进一步处理,用于阳离子交换色谱过程。在本发明的一个实施例中,使用Superloop和P-50泵的预填充SP阳离子交换柱可用于实现阳离子交换色谱过程。
在本发明的一个实施例中,可以对第三次透析之后获得的产物进行称重,然后装载到用于阳离子交换色谱的SP阳离子交换柱中。此外,为了监测纯度以及建立肉毒杆菌神经毒素A的洗脱曲线,可以测量阳离子交换色谱后收集的产物分别在波长例如260nm、270nm、278nm、280nm和320nm处的UV吸光度。此外,还可以对在阳离子交换色谱过程之后获得的合并产物进行称重,并与装载前的经透析产物进行比较,从而可以以可控的方式操作和监测杂质的去除。肉毒杆菌神经毒素A的纯度可以进一步通过SDS-PAGE方法测定。
在一些任选的实施例中,顺序透析和色谱也可用于纯化大分子量的肉毒杆菌神经毒素A复合物。例如,960KDa BoNT-A可以根据例如图2通过透析然后进行离子交换色谱来制备。特别地,可以进行连续纯化过程以制备960KDa BoNT-A复合物,包括透析→阴离子交换色谱→透析→阴离子交换色谱→透析→阳离子交换色谱的步骤。应注意,为了获得大分子量的BoNT-A复合物,可能不需要使用pH值为7.9的磷酸盐缓冲液。
可以储存在阳离子交换色谱过程之后收集的含有高纯度肉毒杆菌神经毒素A的合并产物以用于长期使用。在本发明的一个实施例中,可以将15%的乙二醇,3%的甘油和2%的丙二醇加入到合并产物中,并且可以将混合物储存在低于或等于-70℃的温度下。任选地,产物可以储存在-80℃。
BoNT-A和全BoNT-A分子都是具有较大酶活性的大蛋白质化合物,该活性依赖于其局部微环境因素,例如pH、其他蛋白质的存在、离子强度、光、温度等。在一些任选的实施例中,可以在毒素溶液中加入人血清白蛋白(HSA)或重组人白蛋白(RHA),以达到毒素稳定和长期储存的目的。
在将全BoNT-A与其他相关蛋白质分离后,与相同储存条件下的BoNT-A复合物相比,它可能变得较不稳定,尤其是当将其稀释用于储存或之后使用时。在一个实施例中,乙二醇、甘油(丙三醇)和丙二醇中的一种或多种可用作稳定剂,来稳定小分子量的BoNT-A复合物和全BoNT-A。在一些任选的实施例中,包括乙二醇、甘油(丙三醇))和丙二醇中的一种或多种的稳定剂可以具有10%至30%的总浓度,例如,总浓度为20%至25%。在一个实施例中,稳定剂可以包括乙二醇(5至20重量%),甘油(1至10重量%)和丙二醇(1至5重量%)。在另一个实施例中,稳定剂可以包括10%乙二醇,3%甘油和2%丙二醇。
本发明还提供了一种制备多层多相纳米细胞粒包封的生物分子的方法。在一些任选的实施例中,包封的生物分子可具有宽范围的分子量。例如,包封的生物分子可包括一种或多种具有接近或超过1000KDa的大分子量的生物分子,例如BoNT-A复合物(960KDa)和透明质酸(≤1500KDa)。在另一个实施例中,包封的生物分子可包括一种或多种具有中等分子量的生物分子,包括全BoNT-A(150KDa);和小分子,包括氨基酸、蛋白质、肽、寡核苷酸、维生素分子(例如,维生素C和/或维生素D)、Snap-8八肽、二肽、尿囊素、烟酰胺、芦荟、辅酶Q10、白藜芦醇、棕榈酰五肽-4、棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、棕榈酰寡肽、适体(核酸适配体)、si-RNA、干细胞和基质、干细胞、适配体、干细胞液、各种细胞生长因子如EGF、FGF、KGF、AGF、BGF、许多治疗剂如胰岛素、塞来昔布、罗非考昔、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪、布洛芬、四环素、氧四环素土霉素、雌三醇、黄体酮、多西环素、米诺环素、雌二醇、银离子(例如,AgNO3)、Zn离子(例如,ZnO)和植物提取物等,本发明并不意图对此进行限制。
图5A为根据本发明的各种实施例的用于制备多层多相纳米细胞粒包封的生物分子的示例性方法的流程图。
根据图5A的S501,首先可以形成纳米细胞粒1A,包括由水相层包裹的油相核(也称为水包油(O/W)结构),其中水溶性化合物和油溶性化合物可以分别溶解在水相和油相中。水包油纳米细胞粒1A可以通过在具有两个不同分子区域(如亲水性头基和疏水性尾部)的两亲物存在下形成胶束来实现,其中疏水性核可以代表油相,亲水性壳可代表水相。
应当注意,在本发明中,术语“水相”和“亲水相”可以互换使用,术语“油相”和“疏水相”可以互换使用。
在本发明的一个实施例中,多种水溶性化合物可以溶解在包封结构内的一个或多个水相层中,而各种油溶性化合物可以溶解在包封结构内的一个或多个油相层中。例如,水溶性生物分子(例如,蛋白质、肽、核酸等)可以溶解在包封结构内的一个或多个水相层中,尽管在一些任选的实施例中,蛋白质可以具有包含在油相层中的疏水性部分。在另一个实施例中,一个或多个水相层可以用水溶性生物分子溶解,而一个或多个油相层可以用油溶性化合物溶解,从而形成包含两种或更多种类型分子的纳米细胞粒,其中两种或更多种类型的分子可以是疏水性分子和亲水性分子中的至少一种。
在一个实施例中,可以通过磁力搅拌或机械搅拌来实现搅拌。并且搅拌速度可以设置在300rpm至3000rpm,例如500rpm至2000rpm。在一些实施例中,搅拌速度可以设置为约800rpm。
在另一个实施例中,油相与水相的重量比可以设置为1∶99至40∶60,例如,设置为5∶95至20∶80。此外,在一个实施例中,油相中表面活性剂与油的重量比为10∶1至1∶10,例如3∶1至1∶3。
在一些实施例中,油和表面活性剂可用于形成油相或用作胶束形成剂,包括以下物质中的一种或多种:吐温-80、吐温-65、吐温-60、吐温-20、吐温-40、Cremophor EL、Labrafac Lipophile WL 1349、大豆油、茶油、甘油辛酸癸酸酯、卵磷脂蛋磷脂酰胆碱(EPC)、PEG-40氢化蓖麻油、聚(环氧丙烷)(PPO)、聚(D,L-乳酸)(PDLLA)、聚(ε-己内酯)(PCL)、聚(L-天冬氨酸)、泊洛沙姆、PEG-聚谷氨酸、PEG-聚天冬氨酸、PEG-聚-L-丙交酯、脱水山梨糖醇油酸酯(司盘-80)等。
在一些实施例中,混合过程可以在室温(25℃)或甚至低于室温(例如,4℃至25℃)下进行。在另一个实施例中,混合过程可以在升高的温度(例如,约40℃)下进行。例如,当可能需要加热来加速油相或水相的溶解时,升高的温度可以为约60℃至70℃,但不超过例如90℃。与50℃至70℃的较高温度相比,使用低制造温度(例如,4℃至25℃或4℃至40℃)的温和制备工艺可以为所公开的方法提供额外的优点,尤其是当较高的温度可能导致包封的生物分子活性丧失或滞留时。
根据前述实施例,制备的具有水包油结构的纳米细胞粒1A可以进一步包封在其相反极性的相溶液中,即油相层中,以根据图5A的S503形成纳米细胞粒2A。形成的纳米细胞粒2A可以具有多层结构,其至少包括顺序包封在水相层和作为外壳的另一油相层中的油相核。根据前述实施例,每个油相层可含有相同或不同的疏水活性成分,并且水相核可含有另外的亲水活性成分。
在根据图5A的S505的一个实施例中,可以重复上述包封步骤,在新形成的水相外壳中包裹含有一种或多种类型的活性成分的附加包封层,以形成稳定的纳米细胞粒3A。
在本发明的一个实施例中,上述包封步骤可以重复多次,以形成可以模拟多层人体皮肤结构和人体细胞结构的多层纳米细胞粒结构。这种多层多相纳米细胞粒结构可以促进活性成分向内皮细胞的运输和递送。在根据本发明的另一个实施例的每个包封步骤中,新形成的水相和油相包封层可含有与内层中的那些相同的活性成分分子。或者,新形成的包封层可含有不同的活性成分,产生具有两层或更多层的多功能纳米细胞粒,其含有针对不同治疗、药妆以及其他应用的不同活性成分。
在一些任选的实施例中,形成的具有沿内部油相核到外部水相壳方向的油-水-油-水层的多层结构的纳米细胞粒3A可以进一步再包封在油相中以获得根据图5A的S507的纳米细胞粒4A。在另一个实施例中,形成的具有沿内部油相核到外部油相壳方向的油-水-油-水-油层的多层结构的纳米细胞粒4A可以进一步再包封在水相中以获得根据图5A的S509的纳米细胞粒5A。
应当注意,根据本发明的前述实施例,形成的纳米细胞粒的层数可以不受限制。也就是说,可以根据不同的应用来确定亲水相层的数量和疏水相层的数量,本发明并不意图对此进行限制。此外,依据活性成分的极性与层的极性的相容性,一种或多种类型的活性成分可以溶解在一个或多个不同的相层中。
在根据图5A的S511的本发明的一个实施例中,制备的纳米细胞粒5A可以进一步包裹在乳膏中以产生稳定精华液形式的纳米细胞粒6A,其中纳米细胞粒6A的平均粒度在1-200nm,一般会在1-100nm,有时小于50nm,有时小于30nm。在一个实施例中,纳米细胞粒6A的平均粒度可小于30nm。在另一个实施例中,纳米细胞粒6A的平均粒度可小于20nm,或甚至小于10nm,接近1nm。
在本发明的一个实施例中,所产生的纳米细胞粒可以包裹在一个或多个乳膏层中。添加乳膏层可改善透皮递送中以及治疗和药妆应用中的纳米细胞粒的性质。此外,所生产的纳米细胞粒的乳膏层还可以改善用户体验。
图5B示出了根据本发明的各种实施例的用于制备纳米细胞粒包封的生物分子的另一示例性方法的流程图。根据图5B的S502,可以首先形成纳米细胞粒1B,其包括由油相层包裹的水相核(也称为油包水(W/O)结构),其中水溶性化合物和油溶性化合物可以分别溶解在水相和油相中。具有油包水结构的纳米细胞粒1B可以通过在表面活性剂存在下将水相溶液加入搅拌的油相中来制备。在一个实施例中,生物分子例如肉毒杆菌神经毒素和/或透明质酸可以溶解在水相核中,其中核可以包封在油相层中。在一些任选的实施例中,一些蛋白质也可以具有包含在油相层中的疏水部分。
根据前述实施例,制备的具有油包水结构的纳米细胞粒1B可以包封在其相反极性的相溶液中,即水相层中,以形成根据图5B的S504的纳米细胞粒2B。形成的纳米细胞粒2B可以具有多层结构,其至少包括顺序包封在油相层和作为外壳的另一水相层中的水相核。此外,依据纳米细胞粒的外壳的极性,可以应用极性不同于外壳的附加层。根据图5B的S508,例如,可以形成另外的水相层以产生具有沿内部水核到外部水壳方向的水-油-水-油-水的多层结构的纳米细胞粒4B。在一些实施例中,可以进一步重复上述包封,以形成根据图5B的S510的纳米细胞粒5B,其具有沿内部水核到外部油壳方向的水-油-水-油-水-油的多层结构。
在根据图5B的S512的本发明的一个实施例中,制备的纳米细胞粒5B可以进一步包裹在乳膏中以产生稳定精华液形式的纳米细胞粒6B,其中纳米细胞粒6B的平均粒度在1-200nm,一般会在1-100nm,有时小于50nm,有时小于30nm。在一个实施例中,纳米细胞粒6B的平均粒度可小于30nm。在另一个实施例中,纳米细胞粒6B的平均粒度可小于20nm,或甚至小于10nm,接近1nm。
下面将详细描述的乳膏层的添加可以与根据图5A的S511的多层多相纳米细胞粒5A的亲水外壳和根据图5B的S512的纳米细胞粒5B的疏水外壳相容。它可以显著简化添加乳膏层作为所形成的纳米细胞粒包封结构的外壳的制造过程,其中这些结构可以基于其具体应用而具有不同的层分布。另一方面,添加乳膏层可以使形成的纳米细胞粒包封结构稳定在精华液形式,从而改善用户体验。
同样,实施例还包括各种多层多相纳米细胞粒。示例性纳米细胞粒可包括最里面的水相核,其包含由油相层包封的生物分子,从而形成油包水结构;多个水相层;多个油相层;和最外面的乳膏层。生物分子包括肉毒杆菌神经毒素和/或透明质酸。多个水相层中的每一个和多个油相层中的每一个交替地包封油包水结构。例如,纳米细胞粒是多层多相纳米细胞粒,且平均尺寸小于50纳米,例如在1纳米至20纳米的范围内。
在各种实施例中,乳膏层可以是所公开的纳米细胞粒的最外层。例如,最外面的乳膏层可包括水相混合物和油相混合物。在一个实施例中,水相混合物包括甘油、甘草酸二钾、丙二醇、对羟基苯甲酸甲酯和卡波姆中的至少一种。油相混合物可以包括以下中的至少一种:矿物油、鲸蜡硬脂醇、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸甲酯、PEG-100硬脂酸酯、PEG-40氢化蓖麻油、辛酸/癸酸甘油三酯、吐温-80、Cremophor EL、硬脂酸甘油酯、吐温-65、吐温-60、吐温-20、Labrafac Lipophile WL 1349、大豆油、茶油、植物油、葵花籽油、鱼油、芝麻油、维生素E、动物脂油、甘油辛酸癸酸酯、卵磷脂蛋磷脂酰胆碱(EPC)、聚(环氧丙烷)(PPO)、聚(D,L-乳酸)(PDLLA)、聚(ε-己内酯)(PCL)、聚(L-天冬氨酸)和泊洛沙姆、PEG-聚谷氨酸、PEG-聚天冬氨酸、PEG-聚-L-丙交酯、PEG衍生物、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯和脱水山梨糖醇油酸酯(司盘-80)等。
实施例
应当注意,所描述的实施例阐述了本发明的一些前述实施例,而并不意在限制本发明的范围。
实施例1:使用非动物源性成分发酵培养基制备肉毒杆菌神经毒素A
实施例1包括图2中所示的至少一部分上述步骤。根据如下的详细描述,对于上游工序,实施例1包括使用无动物源性成分发酵培养基接种和发酵工作细胞的步骤。对于下游工序,实施例1包括通过酸化发酵培养基形成酸泥,然后提取和透析。为了实现肉毒杆菌神经毒素A的纯化,实施例1还包括重复进行的透析过程和连续色谱过程的步骤,其中使用不同的方法来监测这些步骤。
用于接种和发酵的工作细胞库(WCB)源于主细胞库(MCB),其中使用聚合酶链式反应(PCR)检测方法,以血清型特异性引物将MCB明确鉴定为A型肉毒杆菌,不存在B、E或破伤风序列。特别地,用编码表1中列出的A型、B型和E型神经毒素的肉毒梭菌结构基因的DNA序列合成了三对引物。从发酵培养基中的MCB菌株的24小时培养物中分离出MCB细胞的基因组DNA,使其进一步在PPYG(每500mL培养基,25g植物蛋白胨,15g酵母提取物,5g自溶酵母泥,5g葡萄糖)培养基中传代,并另外生长24小时,然后进行DNA分离。使用迷你旋转柱形式的DNeasy Blood&Tissue试剂盒(Qiagen公司,Germantown,MD)分离基因组DNA。
图3为本发明各种实施例的使用从主细胞库收集的血清型A DNA样品和不同血清型引物的PCR扩增结果。如图3所示,血清型APCR扩增产物(983bp)用A型引物产生(图3中的泳道1),而当使用血清型B和C引物时没有产生扩增产物(图3中的泳道2和3)。如图3中的泳道M所示片段大小通过与λDNA HindIII和X174 HaeIII Digest Marker Mix(纽英伦生物技术有限公司,Ipswich,MA)比较确定。此外,血清型特异性(神经毒素)序列数据的Blast分析表明,每个样品仅在相应血清型特异性引物存在下产生正确大小的扩增产物,并且血清型A扩增产物的序列与A型肉毒杆菌Hall菌株匹配。
表1.肉毒杆菌分型PCR引物。
在MCB细胞系验证后,WCB的细胞系源自MCB细胞系,并接种到10mL高压蒸汽处理的非动物源性成分发酵培养基中,在37℃下至少过夜。非动物源性成分发酵培养基的主要组分列于表2中。接种完成后,使用5mL接种物在9L非动物源性成分发酵培养基中接种,其中接种在35℃至39℃的温度范围内进行96小时。
表2.非动物源性成分发酵培养基的主要组分。
培养基成分 | 百分比(w/v) |
植物蛋白胨 | 5% |
酵母提取物 | 3% |
自溶酵母泥 | 1% |
右旋糖 | 1% |
其他成分 | 1% |
对于发酵之后的酸泥形成过程,在收获时将3N H2SO4加入到发酵物中直至达到目标pH 3.5,使得允许工作细胞沉降最少3小时以形成沉淀物。经离心收集沉淀,并重悬于100mM pH为5.5的柠檬酸盐缓冲液中以进行首次酸沉淀提取(第一次酸沉淀)。将重悬的溶液进一步离心。将获得的上清液倾析并保存,同时将剩余的沉淀物重悬在100mM柠檬酸盐缓冲液中以进行第二次酸沉淀提取(第二次酸沉淀)。对重悬的溶液进行第三次离心,将获得的上清液倾析并保存。将从第一次和第二次酸沉淀得到的两种上清液合并,然后加入硫酸铵以在冷藏温度下进一步沉淀过夜。
在第一次和第二次酸沉淀过程中,使用RiboGreen测定和用于测量在260nm和280nm波长处的吸光度比(A260/A280比)的UV光谱来监测核酸杂质,使得每个沉淀和提取步骤以可控的方式操作和监测。表3列出了提取溶液中包含的核酸杂质的定量。例如,样品ID 1“酸沉淀提取物#1”列出了第一次酸沉淀后的核酸杂质浓度(359.3μg/mg蛋白质),样品ID 2“合并的酸沉淀提取物#1和#2”列出了第二次酸沉淀后合并的上清液中的核酸杂质浓度(514.0μg/mg蛋白质)。表4进一步列出了在实施例1中的每个提取和纯化步骤之后测量的UVA260/A280比。例如,样品ID 1“酸沉淀提取物#1”列出第一次酸沉淀后的A260/A280比为1.54,并且样品ID 2“合并的酸沉淀提取物#1和#2”列出了第二次酸沉淀后合并的上清液中的核酸杂质浓度(514.0μg/mg蛋白质)。
表3.使用RiboGreen测定来测定核酸杂质。
对于随后的闪式提取和透析步骤,向第一次和第二次酸沉淀获得的合并上清液中加入硫酸铵以进一步沉淀。通过离心收集沉淀并重悬于新制备的50mM pH为5.5的柠檬酸盐缓冲液中。如表3和表4所示,样品ID3“硫酸铵沉淀后重悬的提取物”列出了添加硫酸铵和离心后提取溶液中的核酸杂质浓度和A260/A280比。将提取物进一步与DEAE Sephadex A-50珠浆料以1∶1的比例混合并摇动1小时(第一次DEAE A50浆料)。然后,将获得的第一浆料混合物离心。将第一次DEAE A50浆料的上清液倾析并保存,同时用新制备的50mM pH为5.5的柠檬酸盐缓冲液对剩余的沉淀物进行进一步重悬,并以1∶1的比例加入DEAE Sephadex A-50珠浆料并摇动一小时(第二次DEAE A50浆料)。之后,将第二浆料混合物离心,倾析并保存所得上清液。将第一次和第二次酸沉淀获得的两个上清液合并,随后加入硫酸铵,以在冷藏温度下进一步沉淀过夜。
表4.使用通过UV光谱测量的A260/A280比测定核酸杂质。
样品ID | 样品溶液 | A<sub>260</sub>/A<sub>280</sub>比 |
1 | 酸沉淀提取物#1 | 1.54 |
2 | 合并的酸沉淀提取物#1和#2 | 1.55 |
3 | 硫酸铵沉淀后重悬的提取物 | 1.61 |
4 | 第一次DEAE A50浆料处理后的上清液 | 1.21 |
5 | 第二次DEAE A50浆料处理后的上清液 | 1.16 |
6 | 透析前的大量DEAE A50洗脱物 | 1.21 |
7 | 第一次DEAEA50装载 | 1.2 |
8 | 第一次DEAEA50合并 | 0.48 |
9 | 第二次DEAEA50装载 | 0.47 |
10 | 第二次DEAEA50合并 | 0.47 |
11 | SP(磺丙基)装载 | 0.48 |
12 | SP合并(不含甘油的最终产物) | 0.47 |
13 | SP合并(含甘油的最终产物) | 0.48 |
如表3和表4所示,在每个提取步骤期间监测核酸杂质的浓度。发现,添加DEAESephadex A-50珠浆料显著去除了核酸杂质。如表3所示,例如,与样品ID 3“在硫酸铵沉淀后重悬的提取物”相比,样品ID 4“第一次DEAE A50浆料处理后的上清液”显示出核酸杂质浓度显著降低。此外,通过比较例如样品ID 4“第一次DEAE A50浆料处理后的上清液”中189.1μg/mg蛋白质的核酸杂质浓度与样品ID5“第二次DEAE A50浆料处理后的上清液”中91.4μg/mg蛋白质的核酸杂质浓度,可重复添加的用于提取的DEAE A50珠浆料有效地去除了剩余的核酸杂质。
应当注意,RiboGreen测定用于提取和纯化过程的早期阶段,包括酸-泥形成步骤,以及使用DEAE SephadexA-50珠浆料的闪式提取。在上述步骤中基本上去除核酸杂质后,相对高浓度的蛋白质可能导致RiboGreen测定中的干扰。因此,使用其他方法,包括通过UV光谱测量A260/A280比以及SDS-PAGE来监测随后的提取和纯化过程。
通过可重复添加的DEAE A50珠浆料完成闪式提取,所得产物用透析和连续色谱过程处理,以去除残留的核酸杂质、其他蛋白质杂质以及从肉毒杆菌神经毒素A中解离的无毒蛋白质,从而产生高纯度的小分子量肉毒杆菌神经毒素A。
特别地,经离心收集含有硫酸铵的沉淀,并重悬于50mM pH为5.5的柠檬酸盐缓冲液中。之后,将重悬的溶液转移到透析管中,以进一步去除50mM pH为5.5的柠檬酸盐缓冲液中的核酸杂质。透析过程在冷藏温度下进行过夜(第一次透析)。将第一次透析后获得的产物装入DEAE Sephadex A-50柱中,进行第一次阴离子交换色谱(第一次阴离子交换)。图4示出了根据肉毒杆菌神经毒素A纯化的连续色谱过程的每个步骤的SDS-PAGE结果。例如,图4A和图4B显示了分别在非还原和还原条件下监测色谱过程的每个步骤中包括的蛋白质的SDS-PAGE结果。图4A和图4B中的泳道1“第一次A-50合并”表示在第一次阴离子交换色谱过程后存在于合并样品中的蛋白质条带。第一次透析和阴离子交换过程基本上去除了任何剩余的核酸杂质和带负电的其他蛋白质杂质。将第一次阴离子交换色谱后收集的产物(A260/A280比低于0.6)合并进行第二次透析,然后进行另一次阴离子交换色谱过程。如表4所示,例如,样品ID 8“第一次DEAEA-50合并”的A260/A280比为0.48。
随着第一次透析和第一次阴离子交换色谱过程的完成,向合并的产物中加入硫酸铵进行沉淀。离心收集所得沉淀,并重悬于20mM pH为7.9的磷酸盐缓冲液中。在pH 7.9的弱碱性条件下,具有小分子量的肉毒杆菌神经毒素A可能与含有无毒蛋白质的肉毒杆菌神经毒素复合物解离。将重悬的溶液转移到透析管中50mM pH为7.9的柠檬酸盐缓冲液中。透析过程在冷藏温度下过夜(第二次透析)。将第二次透析后获得的产物装入DEAE Sephadex A-50柱中,进行第二次阴离子交换色谱(第二次阴离子交换)。如图4所示,通过比较第二次阴离子交换之前装载的样品(泳道3)和第二次阴离子交换后的合并样品(样品4),使用pH 7.9的柠檬酸盐缓冲液有效地使肉毒杆菌神经毒素A与无毒蛋白质(在第二次阴离子交换色谱过程中基本上去除)解离。类似地,将第二次阴离子交换色谱过程之后收集的A260/A280比低于0.6的产物进行合并。如表4所示,例如,样品ID 10“第二次DEAEA-50合并”的A260/A280比为0.47。
与阴离子交换色谱过程的单步骤相比,如上所述的可重复的透析-阴离子交换循环基本上去除了产物中的所有核酸杂质和大部分蛋白质杂质。例如,如图4所示,将显示第一次阴离子交换过程的收集产物的泳道1(第一次A-50合并)与显示来自第二次阴离子交换过程的收集产物的泳道3(第二次A-50合并)进行比较。在可重复的阴离子交换过程后去除了大量蛋白质杂质。
由于肉毒杆菌神经毒素A是在加工条件下带有正电荷的小分子量蛋白质,因此本文所述的实施例还包括阳离子交换色谱过程以获得高纯度的肉毒杆菌神经毒素A。具体地,随着第二次透析和第二次阴离子交换色谱过程的完成,向合并的产物中加入硫酸铵以进行沉淀。经离心收集所得沉淀,并重悬于20mM pH为7.0磷酸盐缓冲液中。将重悬的溶液转移到透析管中,以进一步去除20mM pH为7.0磷酸盐缓冲液中的任何剩余的无毒蛋白质。透析过程在冷藏温度下过夜(第3次透析)。使用Superloop和P-50泵将第三次透析后获得的产物装载到预填充的SP柱中用于阳离子交换色谱。如图4所示,在阳离子交换色谱过程之后,合并的产物显示出分子量为150KDa的透明蛋白质条带(参见例如图4A的泳道6)。此外,获得的肉毒杆菌神经毒素A包括100KDa重链和50KDa轻链(参见,例如图4B的泳道6)。可见,使用如上所述的SP柱的阳离子交换色谱过程有效地纯化了小分子量的肉毒杆菌神经毒素A。
与更大分子量(例如,960KDa)的肉毒杆菌神经毒素复合物不同,根据本发明的前述实施例的所产生的小分子量的肉毒杆菌神经毒素A可具有多种优点。例如,与肉毒杆菌神经毒素复合物相比,分子量约150KDa的肉毒杆菌神经毒素A仅具有小于20%的重量。如此,肉毒杆菌神经毒素A可具有显著降低的抗原性和免疫原性。与较大分子量的复合物相比,产生的肉毒杆菌神经毒素A对于临床使用可能是更加安全的。此外,由于产生的肉毒杆菌神经毒素A的尺寸小,它可以具有更高的扩散速率,这使得它更容易在各种应用(例如,局灶和局部应用)中穿过皮肤屏障,避免诸如针筒注射等侵入性递送方法。
另外,根据本发明的各批次各种实施例的所产生的肉毒杆菌神经毒素A可具有100至400单位/纳克的生物分子活性,一般高于200LD50单位/纳克,大多情况为300LD50单位/纳克。与具有20LD50/纳克的生物分子活性的肉毒杆菌神经毒素复合物相比,所产生的肉毒杆菌神经毒素A的活性可以实现超过15倍的效力。为了在临床使用期间实现相同的治疗效果,与较大分子量的肉毒杆菌神经毒素复合物相比,所需的产生的肉毒杆菌神经毒素A的量可以少15倍,对患者的毒性显著降低。
更重要的是,根据本发明的前述实施例,小分子量的肉毒杆菌神经毒素A的制备可以不包括动物源性的成分(例如,来自动物来源的熟肉培养基或甘油)。如此,可以显著改善制备过程中的安全性,避免对制备的肉毒杆菌神经毒素A产品造成来自动物源性的潜在污染。
此外,根据本发明的前述实施例,包括使用阴离子交换色谱介质的两个色谱过程和使用阳离子交换色谱介质的一个色谱过程的肉毒杆菌神经毒素A的制备可以提高制备过程的效率。例如,通过使用9L发酵培养基可以产生大约10至50mg(例如全毒素BoNT-A)的肉毒杆菌神经毒素A。制备过程可以容易地按比例放大以制造大量的肉毒杆菌神经毒素A。
应当注意,实施例1不意在限制本发明的任何范围。根据一些前述实施例,实施例1中公开的方法也可用于制备大分子量(例如,960KDa)的BoNT-A复合物,并在纯化过程中进行修改,例如,在透析和色谱过程中使用pH值低于7的缓冲溶液。
实施例2:制备多层多相纳米细胞粒包封的肉毒杆菌神经毒素A和透皮递送实施例2描述了肉毒杆菌神经毒素A多层多相纳米细胞粒包封的制备方法。应注意,在该实施例中,使用小分子量(例如150KDa)的全BoNT-A来制备纳米细胞粒。或者,也可以使用大分子量的BoNT-A复合物来制备纳米细胞粒,本发明并不意图对此进行限制。
毒素纳米细胞粒1的制备
包括生物分子(例如全BoNT-A)的活性成分可以包封在纳米尺寸的细胞或乳液中以形成毒素纳米细胞粒。为了制备毒素纳米细胞粒1(例如,图5A的S501或图5B的S502),将73mg吐温-80加入到10g搅拌的含有全BoNT-A生物分子的水性毒素工作溶液中,所述全BoNT-A生物分子的效力为1000单位(LD50)/克(1000单位/克)。通过在室温下使用磷酸盐缓冲液(20mM,pH 6.8,含有10%乙二醇,3%甘油和2%丙二醇)连续稀释全BoNT-A储备溶液来制备毒素工作溶液。将吐温-80和水性毒素工作溶液的混合物搅拌保持约15分钟,直至形成澄清溶液。在粒度分析仪(Malvern PanalyticalTechnologies,Westborough,MA)上测量所得的包含毒素纳米细胞粒1的澄清溶液的粒度和ζ(Zeta)电位。图6A和表5示出了毒素纳米细胞粒1的粒度强度分布和毒素纳米细胞粒1的粒度体积分布。可以看出,平均强度粒度为9.79nm(z平均值)。此外,毒素纳米细胞粒1的粒度体积分布为6.96nm(10%累积体积)到14.90nm(90%累积体积)。
应注意,上述具有水包油结构的毒素纳米细胞粒1的制备仅用于示例性目的。或者,根据图5B的S502,全BoNT-A可以包含在由油相层包封的水相核中,本发明并不意图对此进行限制。当全BoNT-A包含在纳米细胞粒1B的结构中时,即,在纳米细胞粒的水相核中,还可以相应地调整以下可重复的包封步骤,从而在包封过程之前确保每个新形成外层的极性不同于当前外层的极性。
毒素纳米细胞粒2的制备
将辛酸/癸酸甘油三酯(10g)加入到在单独容器中的PEG-40氢化蓖麻油(20g)中,并在约40℃下充分混合并冷却至室温。之后,将0.5克由上述过程制备的毒素纳米细胞粒1加入上述混合物中并保持搅拌约15分钟,直至形成含有毒素纳米细胞粒2的澄清溶液。使用粒度分析仪测量溶液的粒度和ζ(Zeta)电位。如图6B和表5所示,毒素纳米细胞粒2的平均强度粒度为12.82nm(z平均值),粒度体积分布为8.27nm到25.30nm。
毒素纳米细胞粒3的制备
为了制备毒素纳米细胞粒3,将5克从上述过程获得的毒素纳米细胞粒2加入到45克毒素工作溶液(效力为1000单位/克)中。在室温(例如25℃)下,以约1000rpm的速度进一步搅拌混合物约15分钟,直至形成浅蓝色透明溶液。测量含有毒素纳米细胞粒3的所得溶液(也称为纳米颗粒或纳米乳液)的粒度和ζ(Zeta)电位。如图6C和表5所示,毒素纳米细胞粒3的平均强度粒度为16.21nm(z平均值),粒度体积分布为11.40nm到25.40nm。
毒素纳米细胞粒4的制备
毒素纳米细胞粒4的制备类似于上述毒素纳米细胞粒2的制备。特别地,将PEG-40氢化蓖麻油(20g)和辛酸/癸酸甘油三酯(10g)于容器中在约40℃下充分混合并冷却至室温。将混合物边搅拌边加入由上述过程制备的毒素纳米细胞粒3(0.5g)。保持搅拌混合物约15分钟,直至形成含有毒素纳米细胞粒4的澄清溶液。测量所得澄清溶液的粒度和ζ(Zeta)电位。如图6D和表5所示,毒素纳米细胞粒4的平均强度粒度为20.00nm(z平均值),粒度体积分布为13.80nm到31.90nm。
毒素纳米细胞粒5的制备
毒素纳米细胞粒5的制备类似于上述毒素纳米细胞粒3的制备。特别地,将5克由上述过程制备的毒素纳米细胞粒4加入到45克毒素工作溶液中(效力为1000单位/克)。将混合物在室温下以约1000rpm的速度进一步搅拌约15分钟,直至形成浅蓝色透明溶液。测量所得的含有毒素纳米细胞粒5的浅蓝色透明溶液的粒度和ζ(Zeta)电位。如图6E和表5所示,毒素纳米细胞粒5的平均强度粒度为24.53nm(z平均值),粒度体积分布为17.30nm到37.70nm。
毒素纳米细胞粒6的制备
首先根据表6中列出的组分制备乳膏1。特别地,制备列为“容器1中的相1”的组分和列为“容器2中的相2”的组分,加热至约70℃并分别搅拌,直至容器中的所有组分溶解。之后,在约70℃搅拌约15分钟的情况下,将容器2中溶解的组分转移到容器1中。将混合的组分进一步冷却至室温以形成乳膏1。
表5.毒素纳米细胞粒的粒度和分布
当将形成的乳膏1冷却至约50℃时,在室温下,在单独的容器中将1克乳膏1加入到由上述过程制备的搅拌毒素纳米细胞粒5中。保持搅拌混合物约15分钟,直至形成毒素纳米细胞粒6(也称为纳米毒素产物)。然后,测量形成的浅蓝色毒素纳米细胞粒6的粒径和ζ电位。如图6F和表5所示,毒素纳米细胞粒6的平均强度粒度为25.84nm(z平均值),并且粒度体积分布为16.30nm到53.10nm,总体粒度小于110nm。
表6.乳膏1的组成
毒素纳米细胞粒6的热稳定性
分别在不同的储存条件下进一步测试根据上述过程制备的毒素纳米细胞粒6的稳定性,测试期例如为180天,所述储存条件包括冻融循环、冷冻条件(例如,-20℃)、冷藏条件(例如,2至8℃)和室温(例如,25℃)。表7列出了每个冻融循环期间毒素纳米细胞粒6的平均粒度和尺寸变化。此外,表8列出了在不同热条件下毒素纳米细胞粒6的平均粒度和尺寸变化。可以看出,制备的毒素纳米细胞粒6在6个月的测试期内,在不同的热条件下储存期间(包括多个冻融循环、2℃至8℃冷藏储存条件、冷冻储存条件(例如,-20℃)、室温(例如,25℃))表现出良好的稳定性和较小的尺寸变化。通过上述不同储存热条件的比较,将毒素纳米细胞粒6在低温(例如-20℃)下储存,以避免生物活性损失。
表7.在冻融循环期间毒素纳米细胞粒6的热稳定性
表8.毒素纳米细胞粒6的热稳定性
使用毒素纳米细胞粒6的治疗和药妆应用
制备的毒素纳米细胞粒6以精华液形式制备,并于治疗和药妆应用中在患者的面部区域上进行测试。具体地,由彩色图像记录在施用毒素纳米细胞粒6之前每个患者的面部区域。之后,将含有由上述过程制备的毒素纳米细胞粒6的约0.2mL精华液施用于交叉鱼尾纹面部区域的一侧涂抹仅仅一次。然后依次进行观察并分别在持续1周、2周和4周时记录。图7示出了施用有根据本发明的各种实施例制备的纳米细胞粒包封的肉毒杆菌神经毒素A的患者面部区域的比较。可以看出,2周后,已经明显可见使用毒素纳米细胞粒6进行了局部施用的面部区域上的皱纹缓和和减少并且效果持续明显。此外,即使仅仅涂抹使用毒素纳米细胞粒6处理面部区域一次,在4周后仍观察到皮肤紧致和皱纹拉开。
实施例3:制备多层多相纳米细胞粒包封的透明质酸和透皮递送根据本发明的前述实施例,用于制备纳米细胞粒包封的生物分子的示例性方法可用于制备多个包含1500KDa的透明质酸(HA)的大分子量的生物分子。实施例3描述了纳米细胞粒包封的HA的制备方法及其在治疗和药妆应用中的透皮递送。
HA纳米细胞粒1的制备
根据前述实施例以及例如图5A和5B,形成用HA生物分子包封的纳米细胞粒,并监测每个制备过程中HA纳米细胞粒的尺寸分布。特别地,为了制备HA纳米细胞粒1,在约40℃下,将180mg PEG-40氢化蓖麻油液体(加热至约40℃以熔融)加入容器中的10g含有0.1%HA(和20ppm铜三肽-1、10ppm棕榈酰五肽-4和10ppm六肽阿基瑞林)的水溶液并在搅拌下充分混合。保持搅拌约30分钟直至形成澄清溶液。使用粒度分析仪测量包含HA纳米细胞粒1的所得澄清溶液的粒度和ζ(Zeta)电位。如图8A和表9所示,形成的HA纳米细胞粒1的平均强度粒度为9.91nm(z平均值)。此外,粒度体积分布为7.04nm(10%累积体积)到15.30nm(90%累积体积)。
应注意,上述具有水包油结构的HA纳米细胞粒1的制备仅用于示例性目的。或者,根据图5B的S502,HA可以包含在由油相层包封的水相核中,本发明并不意图对此进行限制。当HA包含在纳米细胞粒1B的结构中时,即,在纳米细胞粒的水相核中,还可以相应地调整以下可重复的包封步骤,从而在包封过程之前确保每个新形成外层的极性不同于当前外层的极性。
HA纳米细胞粒2的制备
在单独容器中,将辛酸/癸酸甘油三酯(10g)加入到Cremophor EL(20g)中,并在约40℃下充分混合。之后,将0.5克由上述过程制备的HA纳米细胞粒1加入混合物中并保持搅拌约30分钟,直至形成澄清溶液。测量含有HA纳米细胞粒2的所得澄清溶液的粒度和ζ(Zeta)电位。如图8B和表9所示,形成的HA纳米细胞粒2的平均强度粒度为12.90nm(z平均值),粒度体积分布为8.47nm到23.70nm。
HA纳米细胞粒3的制备
在约40℃下,以约800rpm的搅拌速度,将5克(5g)由上述过程制备的HA纳米细胞粒2加入到含有0.1%HA(和20ppm铜三肽-1、10ppm棕榈酰五肽-4和10ppm六肽阿基瑞林等)的45g水溶液中。保持搅拌混合物约30分钟,直至获得浅蓝色透明溶液。测量所得的含有HA纳米细胞粒3的浅蓝色溶液的粒度和ζ(Zeta)电位。如图8C和表9所示,HA纳米细胞粒3的平均强度粒度为18.70nm(z平均值),粒度体积分布为12.50nm到29.90nm。
HA纳米细胞粒4的制备
HA纳米细胞粒4的制备类似于上述HA纳米细胞粒2的制备。特别地,将辛酸/癸酸甘油三酯(10g)和Cremophor EL(20g)在约40℃下充分混合,然后在搅拌下,加入由上述过程制备的HA纳米细胞粒3(0.5g)。保持搅拌混合物约30分钟,直至获得含有HA纳米细胞粒4的澄清溶液。测量所得澄清溶液的粒度和ζ(Zeta)电位。如图8D和表9所示,HA纳米细胞粒4的平均强度粒度为21.95nm(z平均值),粒度体积分布为16.10nm到33.40nm。
HA纳米细胞粒5的制备
HA纳米细胞粒5的制备类似于上述HA纳米细胞粒3的制备。特别地,在约800rpm的搅拌速度和约40℃的温度下,在容器中,将由上述过程制备的HA纳米细胞粒4(5g)加入至含有0.1%HA(和20ppm铜三肽-1、10ppm棕榈酰五肽-4和10ppm六肽阿基瑞林等)的45g水溶液。保持搅拌混合物约30分钟,直至获得含有HA纳米细胞粒5的浅蓝色溶液。测量所得浅蓝色溶液的粒度和ζ(Zeta)电位。如图8E和表9所示,HA纳米细胞粒5的平均强度粒度为27.65nm(z平均值),粒度体积分布为17.00nm到52.80nm。
HA纳米细胞粒6的制备
类似于实施例2中描述的含有全BoNT-A的毒素纳米细胞粒6的制备过程,首先根据表5中列出的组分制备乳膏1。此外,将制备的乳膏1冷却至约50℃,在40℃下,在单独容器中,将1克乳膏1加入到由上述过程制备的搅拌的HA纳米细胞粒5中。保持搅拌混合物约30分钟,直至形成HA纳米细胞粒6(也称为HA纳米产品)。然后测量形成的HA纳米细胞粒6的粒度和ζ(Zeta)电位。如图8F和表9所示,HA纳米细胞6的平均强度粒度为29.72nm(z平均值),粒度体积分布为18.00nm到61.10nm,总体粒度小于130nm。
表9.HA纳米细胞粒的粒度和分布
HA纳米细胞粒6的热稳定性
表10.在冻融循环期间HA纳米细胞粒6的热稳定性
表11.HA纳米细胞粒6的热稳定性
类似地,分别在不同的储存条件下进一步测试根据上述过程制备的HA纳米细胞粒6的稳定性,测试期例如为180天,所述储存条件包括冻融循环、冷藏条件(例如,2-8℃)、室温(例如,25℃)和升高温度(例如,40℃)。表10列出了每个冻融循环期间HA纳米细胞粒6的平均粒度和尺寸变化。此外,表11列出了在不同热条件下HA纳米细胞粒6的平均粒度和尺寸变化。可以看出,制备的HA纳米细胞粒6在6个月的测试期内,在不同的热条件下储存期间(包括多个冻融循环、冷藏储存条件(例如,2℃-8℃)、室温(例如,25℃)和升高温度(例如,40℃))表现出良好的稳定性和较小的尺寸变化。通过上述不同储存热条件的比较,将HA纳米细胞粒6在室温下储存,足以保持HA的生物活性。
使用HA纳米细胞粒6的治疗和药妆应用
制备的HA纳米细胞粒6是精华液形式,并且在治疗和药妆应用(例如,伤口愈合以及松弛和粗糙皮肤修复)中在患者的不同皮肤区域上进行测试。
对于伤口愈合,由彩色图像记录在施用HA纳米细胞粒6之前每个患者的皮肤区域。之后,将约1mL含有由上述过程制备的HA纳米细胞粒6的精华液施用于新受伤的皮肤区域(其不再出血),每天两次。依次进行观察并分别在持续1天、3天和5天时记录。图9的案例5-7示出了根据本发明的各种实施例施用有制备的纳米细胞粒包封的HA用于伤口愈合的患者皮肤区域的比较。对于新近受伤的皮肤区域,局部施用含有纳米细胞粒包封的HA的精华液1周后,伤口区域完全愈合,皮肤清洁,无疤痕。
对于松弛和粗糙皮肤修复,用含有纳米细胞粒包封的HA的精华液处理皮肤区域与伤口修复应用中的那些类似。依次进行观察并分别在持续1周、2周和3周时记录。图9的案例8-9示出了根据本发明的各种实施例施用有制备的纳米细胞粒包封的HA用于松弛和粗糙皮肤修复的患者皮肤区域的比较。可以看出,在处理3周后观察到皮肤紧致和可见的皮肤颜色/色调增亮以及皱纹减少。
根据本发明的前述实施例和实施例,所公开的用于制备纳米细胞粒包封的生物分子(例如,BoNT-A毒素纳米细胞粒和HA纳米细胞粒)的方法可以产生稳定的和有生物活性的纳米细胞粒,其显示出在各种应用中所显示的临床改善。这种改善是由快速有效地递送用核包封,或者在多层纳米细胞粒之间,或者固定在纳米细胞粒的表面上的活性成分(例如,BoNT-A或HA)进入到皮下细胞产生的。
所公开的用于制备纳米细胞粒包封的生物分子的方法可以将胶束形成过程和多个包封过程组合作为系统程序。每种亲水活性成分可以溶解在亲水相中用于包封过程,而每种疏水活性成分可以溶解在疏水相中用于包封过程。如此,具有不同极性和溶解度的各种活性成分可以包封在单个多层多相纳米细胞粒内以用于跨皮肤屏障递送任务,从而产生携带不同活性成分的多层多相纳米细胞粒以实现多种功能,与仅含有单一类型成分的纳米细胞粒相比,其可以具有显著更广泛的应用。
尽管通过使用说明书中的具体实施例来描述本发明的原理和实施,但是实施例的前述描述仅旨在帮助理解本发明的方法和方法的核心思想。同时,本领域普通技术人员可以根据本发明的思想对具体实施方式和应用范围进行修改。总之,说明书的内容不应被解释为对本发明的限制。
Claims (10)
1.一种多层多相纳米细胞粒,其特征在于:包括:
最里层的水相核或油相核;
多个水相层;
多个油相层;和
最外层的乳膏层,其中:
多个水相层中的每一水相层和多个油相层中的每一油相层交替包封水相核或油相核,形成水相、油相相间的多层多相纳米细胞粒;
所述水相核、水相层中包含有生物分子,所述生物分子包括肉毒杆菌神经毒素和/或透明质酸;
所述油相核、油相层中包含有油溶性分子。
2.根据权利要求1所述的多层多相纳米细胞粒,其特征在于:
所述肉毒杆菌神经毒素的制备方法包括以下步骤:
1)在发酵培养基中发酵细菌肉毒杆菌,其中所述发酵培养基不含动物源性成分;
2)使所述包含细菌肉毒杆菌的发酵培养基与阴离子交换培养基浆料接触,并经离心获得包含所述肉毒杆菌神经毒素的上清液;
3)透析所述上清液并收集包含所述生物分子的经透析溶液;
4)使包含所述肉毒杆菌神经毒素的所述经透析溶液与阴离子交换色谱柱接触;
5)重复步骤3)和步骤4)并获得包含所述肉毒杆菌神经毒素的洗脱液,并使从所述阴离子交换色谱柱获得的所述洗脱液与阳离子交换色谱柱接触;以及
6)收集包含从所述阳离子交换色谱柱获得的所述肉毒杆菌神经毒素的洗脱液;将所述洗脱液与包含乙二醇、甘油和丙二醇的稳定剂混合;使用小鼠LD50测定,所述肉毒杆菌神经毒素为肉毒杆菌神经毒素A,生物比活性为100至400单位/纳克。
3.根据权利要求1所述的多层多相纳米细胞粒,其特征在于:
所述多层多相纳米细胞粒的平均尺寸在1-200纳米范围。
4.根据权利要求1所述的多层多相纳米细胞粒,其特征在于:
所述水相核或油相核的平均尺寸在1纳米至200纳米的范围内。
5.根据权利要求1所述的多层多相纳米细胞粒,其特征在于:
所述最外层的乳膏层包含水相混合物和油相混合物,
所述水相混合物包括甘油、甘草酸二钾、戊二醇、丙二醇、丁二醇、对羟基苯甲酸甲酯和卡波姆中的至少一种,以及
所述油相混合物包括以下物质中的至少一种:矿物油、鲸蜡硬脂醇、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸甲酯、PEG-100硬脂酸酯、PEG-40氢化蓖麻油、辛酸/癸酸甘油三酯、吐温-80、Cremophor EL、硬脂酸甘油酯、吐温-65、吐温-60、吐温-20、Labrafac Lipophile WL1349、大豆油、茶油、植物油、葵花籽油、鱼油、芝麻油、维生素E、动物脂油、甘油辛酸癸酸酯、卵磷脂蛋磷脂酰胆碱、聚(环氧丙烷)、聚(D,L-乳酸)、聚(ε-己内酯)、聚(L-天冬氨酸)和泊洛沙姆、PEG-聚谷氨酸、PEG-聚天冬氨酸、PEG-聚-L-丙交酯、PEG衍生物、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯和脱水山梨糖醇油酸酯。
6.根据权利要求1所述的多层多相纳米细胞粒,其特征在于:
所述肉毒杆菌神经毒素包括肉毒杆菌神经毒素复合物和全肉毒杆菌神经毒素中的一种。
7.根据权利要求1所述的多层多相纳米细胞粒,其特征在于:
所述多个水相层中的一个或多个包含亲水性分子,和/或
所述多个油相层中的一个或多个包含疏水性分子。
8.根据权利要求7所述的多层多相纳米细胞粒,其特征在于:
所述亲水性分子包括以下物质中的至少一种:透明质酸、细胞生长因子、干细胞、干细胞液、多肽、蛋白质、适体、寡核苷酸、维生素、Snap-8八肽、二肽、阿基瑞林六肽,尿囊素、烟酰胺、芦荟、花青素、甘草酸二钾、熊果苷、氨基丁酸、烟酰胺单核苷酸、氨糖、N-乙酰肌肽、L-肌肽、辅酶、合欢花提取物、小米草提取物、甜菜碱、海藻糖、赤藓醇、甘露醇、卡波姆、维生素C、羟乙基纤维素、铜三肽、乙酰壳糖胺、天麻素、乙酰基六肽-8、乙酰基六肽-1、L-色氨酸、5-羟基色氨酸、柠檬酸、脂肪酶、芦芭胶、神经酰胺3、牛奶提取物、库拉索芦荟叶水、人参根水、水解胶原、九肽-1、六肽-1、β-葡聚糖、丙二醇、丙三醇、乙二醇、丁二醇、烟酸、传明酸、葛根素、光果甘草、积雪草提取物、人参皂苷、白藜芦醇、棕榈酰五肽-4、棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、棕榈酰寡肽、适体、si-RNA、干细胞和治疗剂。
9.根据权利要求7所述的多层多相纳米细胞粒,其特征在于:
所述疏水性分子包括以下物质中的至少一种:欧洲越桔籽油、印加果籽油、刺阿甘树仁油、大裂叶五桤木籽油、巴西果籽油、牛油果树果脂油、香叶天竺葵油、椰子油、小麦胚芽油、橄榄油、乳木果油、月见草油、羊毛脂、蜂蜡、卵磷脂、霍霍巴蜡、薄荷醇、水杨酸甲酯、维生素E、叶黄素、玉米黄质、肉桂油、姜根油、香草醇丁醚、羊毛甾醇、维生素A、大豆异黄酮、植物甾醇、植物甾醇酯、豆油、茶籽油、沙棘油、葡萄籽油、杏仁油、冬青油、霍霍巴油。
10.根据权利要求8或9所述的多层多相纳米细胞粒,其特征在于:
所述治疗剂包括以下物质中的一种或多种:胰岛素、塞来昔布、罗非考昔、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪、布洛芬、四环素、氧四环素、雌三醇、黄体酮、多西环素、米诺环素、雌二醇、AgNO3、ZnO、抗生素、激素、费洛蒙、原料药分子和植物提取物。
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