CN109956995B - 一种负载紫杉醇的苦杏仁蛋白纳米载体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种负载紫杉醇的苦杏仁蛋白纳米载体及其制备方法，该载体由苦杏仁蛋白单体通过热诱导形成。经过磷酸盐缓冲液抽提、离子交换色谱、凝胶过滤色谱分离，获得苦杏仁蛋白，序列为ARQSQLSPQNAYQLVQQQAR。该苦杏仁蛋白在Gly‑NaOH缓冲体系中，蛋白浓度为1 mg/mL，pH 9.0条件下，经过95℃加热10 min后形成蛋白质纳米载体，该载体稳定性好，体外实验显示载体对人正常肝细胞与犬肾细胞均无明显毒性。载体成功装载抗癌药物紫杉醇，获得92.18%的装载效率，且具备良好的缓释效果。本发明涉及的苦杏仁蛋白来源于食品，其载体的制备方法不涉及任何交联剂，安全性高。

Description

一种负载紫杉醇的苦杏仁蛋白纳米载体及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域中的纳米载体制备，具体涉及一种用于负载紫杉醇的苦杏仁蛋白纳米载体及其制备方法。

背景技术

目前，许多药物的摄取途径依然是口服递送，特别是用于慢性疾病治疗的药物，然而，由于溶解性低、肠道吸收率低，以及药物在肠道中的不稳定性，导致很多药物呈现出利用率低的弊端，虽然，国内外研究已经设计了各类纳米载体实现药物的靶向递送，但其中大部分为合成型聚合物，如金属聚集体、无机颗粒、聚合物胶束等，此类载体在展现靶向性与穿透性优点的同时，也暴露出其在细胞毒性和可降解性方面的缺点，这给纳米载体的发展带来潜在的风险。

紫杉醇是一类具有抗肿瘤性的药物，1992年经美国FDA批准作为抗癌症药物上市，用于治疗非小细胞肿瘤的临床治疗。然而，紫杉醇的溶解度低，且对人体正常器官有严重的毒副作用，这些不利因素限制了紫杉醇的应用。

中药、食品热处理过程大分子物质形成纳米颗粒的体系提供了新的研究模型，包括“麻杏石甘汤”、“葛根芩连汤”、“茶汤”、“ 猪骨汤”在内的热提取液体系均存在纳米尺度的颗粒结构，该颗粒结构与蛋白质的自组装行为密切相关，“汤”在人类历史上饮用时间长、受众广，属于安全食品级材料（Generally Regarded as Safe，GRAS），由食品来源的蛋白质自组装形成的纳米颗粒可以解决现阶段对纳米载体安全性方面的担忧。

苦杏仁为家喻户晓的食物，有平喘镇咳、润肠通便、抗炎止痛、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老等功效，苦杏仁所含活性物质苦杏仁甙具有很强的抑菌作用。苦杏仁作为单方或复方的药材炮制成汤剂服用，炮制过程发生了蛋白质自组装、纳米颗粒形成的化学变化，而蛋白质纳米颗粒具有装载难溶性药物的优势，经纳米载体装载的非水溶性抗癌药物，可以降低抗癌药物的毒副作用，提高生物利用率。目前，对苦杏仁蛋白及其纳米载体应用的研究国内外尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于苦杏仁蛋白纳米结构装载紫杉醇或类似非水溶性药物的天然载体及其制备方法。该载体安全性高、装载效率高、缓释效果明显。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种苦杏仁蛋白，氨基酸序列为ARQSQLSPQNAYQLVQQQAR。

所述蛋白的制备方法为经过磷酸盐缓冲液水相抽提，离子交换色谱Macro-PrepHigh-Q，凝胶过滤色谱TSK-GEL G6000 PW，从苦杏仁饮片中分离得到一个电泳纯的蛋白。

苦杏仁蛋白粗提液制备：苦杏仁饮片经高速粉碎机粉碎，经丙酮（1:10 w/v）脱脂后，以质量比1:20将脱脂粉末与去离子水混合，置于室温搅拌1 h，混合液经6000 g离心10min后，收集上清液，沉淀重悬后再次重复提取步骤。将两次上清液混合，经0.45 μm水系滤膜抽滤，滤过液即为苦杏仁蛋白粗提液。

苦杏仁蛋白的离子交换色谱分离：将1 mL苦杏仁蛋白粗提液流加至以Tris-盐酸缓冲液（0.02 mol/L、pH8.1）平衡Macro-Prep® High-Q色谱柱（Bio-RAD公司，柱体积：10*150 mm），以同样浓度Tris-盐酸缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～0.3 mol/L NaCl的Tris-盐酸缓冲液（0.02 mol/L、pH8.1）线性梯度洗脱130 mL，最后用含0.3 mol/L NaCl的Tris-盐酸缓冲液（0.02 mol/L、pH8.1）洗脱1个柱体积。流速1.0 mL/min，紫外分光光度计测量波长为280 nm，收集色谱分离的SP1洗脱峰，即为苦杏仁蛋白初步分离液。

苦杏仁蛋白的凝胶过滤色谱分离：将50 μL苦杏仁蛋白初步分离液流加至以磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L、pH7.4）平衡TSK-GEL G6000 PW凝胶色谱柱（日本TOSOH公司，柱体积：7.8 *300 mm），以同样浓度磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L、pH7.4）等度洗脱30 mL。流速0.5mL/min，紫外分光光度计测量波长为280 nm，收集洗脱峰SP2组分后以SDS-PAGE进行蛋白成分鉴定。

苦杏仁蛋白的基础性质表征：以计算迁移率方式获得苦杏仁蛋白分子量大小，以Edman 降解法测定该黄连蛋白的N末端一级结构序列。

一种苦杏仁蛋白在制备蛋白纳米载体上的应用。

所述纳米载体的制备方法为将该苦杏仁蛋白配制为1 mg/mL的Gly-NaOH（0.02mol/L、pH 9.0），经过95℃加热10 min，经过5000 g超滤30 min，即获得苦杏仁蛋白纳米载体；并应用动态光散射技术动态光散射、多角度激光光散射对该载体进行性质研究。

本发明制备得到的苦杏仁蛋白纳米颗粒平均粒径为91.41±1.17 nm，表面电荷呈负性，Zeta电位值为-24.83±0.34 mV。

以该苦杏仁蛋白为载体制备紫杉醇-苦杏仁蛋白纳米颗粒溶液，对紫杉醇的最大装载效率为82.70%，平均粒径为203.23±1.00 nm，对紫杉醇的释放呈现对数增长趋势，达到50 h内缓慢释放的效果。

本发明的优点在于：

本发明涉及的苦杏仁蛋白来源于食品，安全性高。其纳米载体的制备方法不涉及任何交联剂，该载体成功装载疏水性抗癌药物紫杉醇，装载效率达到 92.18%，高于壳聚糖对紫杉醇的装载效率79.24%。本发明涉及的苦杏仁蛋白纳米载体有望通过对非水溶性抗癌药物的负载，降低抗癌药物对人体的毒副作用，提高药物的生物利用率。

附图说明

图1苦杏仁蛋白阴离子交换色谱图。其中OD280为在280nm下的OD值，Elutionvolume为洗脱体积，SP1为洗脱峰，M为Maker。

图2苦杏仁蛋白凝胶过滤色谱图。其中OD280为在280nm下的OD值，Elution volume为洗脱体积，SP2为洗脱峰，M为Maker。

图3苦杏仁蛋白纳米颗粒粒径分布图。其中Intensity为光散射强度，Size为粒径。

图4苦杏仁蛋白纳米颗粒的释放曲线图。

图5苦杏仁蛋白与颗粒的细胞毒性。

具体实施方式

实施例1 ：苦杏仁蛋白的提取

苦杏仁饮片经高速粉碎机粉碎，经丙酮（1:10 w/v）脱脂后，以质量比1:20将脱脂粉末与去离子水混合，置于室温搅拌1 h，混合液经6000 g离心10 min后，收集上清液，沉淀用去离子水重悬后再次重复提取步骤。将两次上清液混合，经0.45 μm水系滤膜抽滤，滤过液即为苦杏仁蛋白粗提液。

将1 mL苦杏仁蛋白粗提液流加至以Tris-盐酸缓冲液（0.02 mol/L、pH8.1）平衡Macro-Prep® High-Q色谱柱（Bio-RAD公司，柱体积：10*150 mm），以同样浓度Tris-盐酸缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0～0.3 mol/L NaCl的Tris-盐酸缓冲液（0.02 mol/L、pH8.1）线性梯度洗脱130 mL，最后用含0.3 mol/L NaCl 的Tris-盐酸缓冲液（0.02 mol/L、pH8.1）洗脱1个柱体积。流速1.0 mL/min，紫外分光光度计测量波长为280 nm，收集色谱分离的SP1洗脱峰，即为苦杏仁蛋白初步分离液。苦杏仁蛋白阴离子交换色谱图及各组分SDS-PAGE电泳图见附图1。

将50 μL苦杏仁蛋白初步分离液流加至以磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L、pH7.4）平衡TSK-GEL G6000 PW凝胶色谱柱（日本TOSOH公司，柱体积：7.8 *300 mm），以同样浓度磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L、pH7.4）等度洗脱30 mL。流速0.5 mL/min，紫外分光光度计测量波长为280 nm，收集洗脱峰SP2为苦杏仁蛋白组分。苦杏仁蛋白凝胶过滤色谱图及各组分SDS-PAGE电泳图见附图2。

苦杏仁蛋白基本生化性质，表征为分子量为 62.5 kDa，N-端一级结构序列为ARQSQLSPQN AYQLVQQQAR。

实施例2 ：苦杏仁蛋白纳米颗粒的制备

将苦杏仁蛋白配制为1 mg/mL的Gly-NaOH（0.02 mol/L、pH 9.0）盐溶液，经过95℃加热10 min，经5000 g超滤30 min，即可获得苦杏仁蛋白颗粒溶液。

用动态光散射技术动态光散射对该颗粒进行性质研究，测得其纳米颗粒平均粒径为91.41±1.17 nm，表面电荷Zeta电位值为-24.83±0.34 mV。苦杏仁蛋白纳米颗粒粒度分布图见附图3。

实施例3 ：苦杏仁蛋白纳米载体装载与释放紫杉醇能力测定

将苦杏仁蛋白与紫杉醇按摩尔浓度4:1比例混合，经过95℃加热10 min后实现载体对紫杉醇的包埋效果。经5000 g超滤30 min，取50 μL滤过液，经C₁₈反相色谱柱测定游离紫杉醇含量，色谱条件：流动相为高纯水（A）、乙腈（B），A:B=55: 45，检测波长227 nm，流速0.5 mL/min，洗脱时间30 min，柱温25℃。根据以下公式计算装载效率：

装载效率（%）=（紫杉醇总含量-游离紫杉醇含量）/ 紫杉醇总含量×100%

紫杉醇释放试验在37℃，pH 7.4 缓冲体系中进行，制备紫杉醇-苦杏仁蛋白纳米颗粒溶液，将该溶液置于纤维素膜透析袋（12,000-14,000 kDa）中，透析介质为磷酸盐缓冲液，将释放体系于37°C恒温加热器保温，搅拌转速250 rpm，全过程持续50 h，依据以上色谱条件测定释放的紫杉醇含量。

苦杏仁蛋白载体对紫杉醇的最大装载效率为 92.18%；最大释放量为51.29%，释放过程呈现对数增长趋势，具备良好缓释效果。苦杏仁蛋白载体对紫杉醇释放曲线图见附图4。

实施例4 ：苦杏仁蛋白载体的体外细胞毒性测定

正常肝细胞（L-02）与犬肾细胞（MDCK）经常规消化、离心、重悬、计数细胞。用MEM培养基制成浓度为4×10⁵ cell/mL的细胞悬液，并将重悬液接种于96（100 µL/well），置于37°C、5% CO₂和95%湿度的培养条件下培养24 h。样品稀释后，每孔细胞加入100 μL并设对照组。样品干预24 h后以MTT法测定细胞存活率，检测波长570 nm，计算公式如下：

存活率（%）=（OD加样组-OD空白组）/ OD590空白组×100%

细胞毒性试验表明，苦杏仁蛋白及其形成的纳米粒在10-500 μg/mL范围内，对人正常肝细胞L-02、犬肾细胞MDCK均无明显细胞毒性，甚至，苦杏仁蛋白形成纳米粒的行为提高了蛋白的安全性。苦杏仁蛋白与其纳米颗粒的体外细胞毒性见附图5。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工商大学

<120> 一种负载紫杉醇的苦杏仁蛋白纳米载体及其制备方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Arg Gln Ser Gln Leu Ser Pro Gln Asn Ala Tyr Gln Leu Val Gln

1 5 10 15

Gln Gln Ala Arg

20

Claims (4)

1.一种苦杏仁蛋白，其特征在于：所述苦杏仁蛋白的N-端一级结构序列为ARQSQLSPQNAYQLVQQQAR；所述苦杏仁蛋白的制备方法如下：

1）苦杏仁饮片经高速粉碎机粉碎，经丙酮按料液比1：10 脱脂后，以质量比1：20将脱脂粉末与去离子水混合，室温搅拌1h，再6000g离心10min，收集上清液，沉淀用去离子水重悬后再次重复提取步骤，将两次上清液混合后经0.45μm水系滤膜抽滤，滤过液即为苦杏仁蛋白粗提液；

2）将1mL苦杏仁蛋白粗提液流加至以Tris-盐酸缓冲液平衡Macro-Prep^® High-Q色谱柱，以Tris-盐酸缓冲液继续平衡3倍柱体积后，再以含0~0.3mol/L NaCl的Tris-盐酸缓冲液线性梯度洗脱130mL，最后用含0.3mol/L NaCl的Tris-盐酸缓冲液洗脱1个柱体积，流速1.0mL/min，紫外分光光度计测量波长为280nm，收集洗脱峰SP1，即为苦杏仁蛋白初步分离液；

3）将50μL苦杏仁蛋白初步分离液流加至以磷酸盐缓冲液平衡TSK-GEL G6000 PW凝胶色谱柱，以磷酸盐缓冲液等度洗脱30mL，流速0.5mL/min，紫外分光光度计测量波长为280nm，收集洗脱峰SP2，即为苦杏仁蛋白组分；

其中，所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.02mol/L、pH为8.1，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.05mol/L、pH为7.4。

2.一种如权利要求1所述的苦杏仁蛋白在制备蛋白纳米载体上的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述蛋白纳米载体的制备方法为：将苦杏仁蛋白配制为1mg/mL的0.02mol/L、pH9.0 Gly-NaOH盐溶液，经过95℃加热10min，经5000g超滤30min，即获得苦杏仁蛋白纳米载体。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述蛋白纳米载体用于装载紫杉醇。