CN114533698B - 一种修饰了d型肿瘤穿透肽的铁蛋白载药纳米粒的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种修饰了D型肿瘤穿透肽的铁蛋白载药纳米粒的制备方法，包括如下步骤：1)利用化学偶联法制备修饰了D型肿瘤穿透肽的铁蛋白；2)在特定离子强度条件下，利用温度法在步骤1)所得的铁蛋白内负载药物，制得铁蛋白载药纳米粒。本发明制得的修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白载药纳米粒，具有较强的肿瘤穿透能力以及肿瘤细胞生长抑制作用，且D型RGERPPR肽修饰的铁蛋白‑紫杉醇载药纳米粒的效果最好，为后续药物靶向穿透至肿瘤细胞的治疗提供了良好的载药模型，具有很好的应用前景。

Description

一种修饰了D型肿瘤穿透肽的铁蛋白载药纳米粒的制备方法

技术领域

本发明涉及抗肿瘤技术领域，涉及一种修饰了D型肿瘤穿透肽的铁蛋白载药纳米粒的制备方法。

背景技术

癌症严重威胁着人类的健康，是重要的致死原因之一。虽然化疗是临床上治疗癌症最有效的方法之一，但肿瘤组织具有致密的细胞外基质和较高的间质压力，会使得抗肿瘤药物无法深入肿瘤实质部位，导致药物滞留在肿瘤血管周围，影响化疗效果。因此，为了克服传统化疗的缺点，聚合物胶束、脂质体、脂基纳米载体、无机纳米载体等纳米药物递送系统已被开发。此外，蛋白质纳米颗粒具有许多优良的性质，使它们成为构建药物递送系统中十分有潜力的候选者。

人体重链铁蛋白(HFtn)是一种外径为12nm，内径为8nm的球型笼状蛋白纳米材料。铁蛋白作为纳米载体具有低的免疫原性、可生物降解性、特异性靶向TfR1等特点。因此，铁蛋白在癌症治疗领域中发挥着重要作用。由于TfR1在许多癌细胞中过表达，铁蛋白基的药物递送系统主要依赖单一的靶向递送。为了提高靶向及穿透作用，利用肿瘤靶向或肿瘤穿透肽来功能化修饰铁蛋白是一种常用的手段。但目前研究中对于肿瘤靶向肽修饰主要集中于L型多肽的修饰，然而，这类多肽会被血浆或细胞中的蛋白酶降解，从而影响其靶向和渗透作用。

发明内容

为解决现有的纳米载体对肿瘤细胞靶向单一且穿透效果弱的缺陷，本发明提供一种修饰了D型肿瘤穿透肽的铁蛋白载药纳米粒的制备方法，实现对肿瘤细胞转铁蛋白受体1(TfR1)和神经纤毛蛋白-1(Neuropilin-1，NRP-1)的双重靶向效果，有效地增强载药纳米粒对肿瘤细胞的穿透作用，并实现有效地递送药物、抑制肿瘤细胞的生长，为后续高效率的肿瘤治疗提供了非常好的模型，具有很好的应用前景。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种修饰了D型肿瘤穿透肽的铁蛋白载药纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

1)利用化学偶联法制备修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白，肿瘤穿透肽的氨基酸序列为D型RPPREGR或D型RGERPPR中的至少一种；

2)在0-200mM NaCl的离子强度条件下，利用温度法在步骤1)所得的铁蛋白内负载药物，制得铁蛋白载药纳米粒。

步骤1)中，肿瘤穿透肽是通过化学偶联的方法修饰于铁蛋白外表面；修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白为基于人体重链铁蛋白改造的功能化蛋白。步骤2)中，铁蛋白负载药物的方法是特定离子强度条件下的温度法。

现有的肿瘤穿透肽靶向递送药物主要集中于L型肽的修饰，但细胞中的蛋白酶会识别由L型氨基酸组成的特定氨基酸序列，从而影响L型肽的功能；而由D型氨基酸组成的肽不能被蛋白酶识别，具有更强更持久的作用效果，但并不是所有的D肽都能增强载药纳米粒对肿瘤细胞的穿透作用，且具有相同氨基酸序列的D型肽和L型肽由于不同的手性结构，可能会导致生物活性的丧失，发明人经长期的研发试验发现，D型RPPREGR或D型RGERPPR对铁蛋白的修饰可显著增强载药纳米粒对肿瘤细胞的穿透作用，且D型RGERPPR的效果尤为突出。

Neuropilin-1(NRP-1)是一种跨膜糖蛋白，研究表明，D型RPPREGR或D型RGERPPR肽可特异性靶向结合NRP-1，并能增强药物的组织穿透能力。

上述步骤1)中，铁蛋白为人体重链铁蛋白。

上述步骤1)包括以下步骤：

1.1)将含有肿瘤穿透肽的溶液加入到铁蛋白溶液中，调节溶液pH为6.5-7.5，在室温条件下于100-200rpm转速缓慢搅拌1.5～2h，其中，肿瘤穿透肽与铁蛋白的摩尔比(25±1):1；

1.2)将步骤1.1)所得溶液置于透析袋中透析除去游离的多肽，透析18-24h后取出、离心，上清即为修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白溶液。

上述步骤1.1)中，的转速不能过快，否则会影响多肽的偶联效果。

上述步骤2)中，特定离子强度条件为含有5～200mM的NaCl磷酸缓冲液，优选为，含有25mM的NaCl磷酸缓冲液。

上述步骤2)中，温度法的处理温度为60±5℃。

上述步骤2)中，利用温度法在步骤1)所得的铁蛋白内负载抗肿瘤药物。

上述步骤2)中，利用温度法在步骤1)所得的铁蛋白内负载疏水性药物紫杉醇，制得修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白-紫杉醇纳米粒。

紫杉醇水溶性极差，市售紫杉醇注剂主要采用聚氧乙烯蓖麻油与乙醇等体积比制成，此注剂会引起严重的过敏和神经毒性等不良反应，其应用受到限制，因此提高其作用功效十分必要。

上述修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白-紫杉醇纳米粒的制备方法包括如下步骤：

2.1)将紫杉醇药物加入乙醇溶液中，然后涡旋至药物完全溶解；

2.2)将铁蛋白溶液置换于磷酸缓冲液中，并于60±5℃水浴中保温10-30min，加入步骤2.1)得到的药物溶液，涡旋混匀后，迅速放入60±5℃水浴保温10-30min，其中，铁蛋白与紫杉醇的摩尔比为1:(300±50)；

2.3)将步骤2.2)所得溶液于室温下静置，至溶液为常温，之后置于透析袋中透析除去游离的紫杉醇，透析18-24h后取出，离心，上清即为修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白-紫杉醇纳米粒。

本申请可通过4-20％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对目的蛋白进行表征。

本发明未提及的技术均参照现有技术。

本发明修饰了D型肿瘤穿透肽的铁蛋白载药纳米粒，实现了双靶向至肿瘤细胞，有效地增强了纳米载体对肿瘤细胞的穿透作用，实现了对肿瘤细胞转铁蛋白受体1(TfR1)和神经纤毛蛋白-1(NRP-1)的双重靶向效果，并有效实现了药物递送、抑制了肿瘤细胞的生长，为后续药物靶向穿透肿瘤细胞的治疗提供了非常好的载体模型，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白的表征图；A为验证肿瘤穿透肽修饰的SDS-PAGE图；B为修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白纯化后的体积排阻色谱图；C为修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白纯化后的圆二色谱图；D为修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白的透射电镜图；

图2为实施例2中修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白-紫杉醇载药纳米粒的表征图；A为检测装载的紫杉醇的高效液相色谱图；B为修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白-紫杉醇载药纳米粒的体积排阻色谱图；C为修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白-紫杉醇载药纳米粒的圆二色谱图；D为修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白-紫杉醇载药纳米粒的透射电镜图；

图3为实施例2中不同离子强度条件下温度法载药的沉淀现象图；A、B、C为不同浓度下的上清浑浊程度与沉淀的对比图；D为铁蛋白负载紫杉醇的效率对比图；

图4为实施例3中的细胞存活率考察图；A和B分别为A549细胞和MCF-7细胞在不同浓度的铁蛋白作用下的存活率；C和D为A549细胞和MCF-7细胞在不同浓度的铁蛋白-紫杉醇载药纳米粒作用下的存活率；

图5为实施例4中激光共聚焦、流式细胞仪检测A549细胞和MCF-7细胞对修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白的摄取情况考察图；A和B分别为A549细胞和MCF-7细胞对修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白摄取的激光共聚焦图；C和D为A549细胞对修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白摄取的流式定量分析图；E和F为MCF-7细胞对修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白摄取的流式定量分析图；

图6为实施例5中修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白对A549三维肿瘤球的穿透作用考察图；

图7为实施例6中修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白载药纳米粒对A549三维肿瘤球的生长抑制考察图；

图8为实施例7中修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白载药纳米粒对A549肺癌小鼠的体内抗肿瘤作用考察图；

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例中的室温指20～25℃。

实施例1

修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白的制备：

将25μL浓度为1μmol/mL的肿瘤穿透肽L型RGERPPR、D型RPPREGR或D型RGERPPR(南京肽谷生物科技有限公司)的PBS缓冲(0.01M，pH 7.0-7.2)溶液按照比例加入到1mL浓度为1μM铁蛋白(南京思普金生物)溶液(GFC缓冲液，50mM NaH₂PO₄，150mM NaCl，pH 7.0)中，其中铁蛋白与肿瘤穿透肽的摩尔比例为1:25(下述各例中均采用此比例)，调节溶液pH为6.5-7.5，于室温条件下缓慢(150rpm)搅拌2h(或在4℃条件下过夜缓慢(150rpm)搅拌)。

将上述所得溶液置于截留分子量为6-8kDa的透析袋中透析除去游离的多肽，透析18h后取出，离心5min，上清即为修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白溶液，表征结果如图1所示，修饰后的铁蛋白呈现两个条带，而未修饰的铁蛋白仅显示单一条带，由此可看出多肽成功修饰于铁蛋白上，由表1可知，多肽偶联效率一致；且多肽的修饰对铁蛋白的结构未造成影响。其中，HFtn为未修饰的铁蛋白，H_L(RGE)为修饰了L型RGERPPR的铁蛋白，H_D(RPPR)为修饰了D型RPPREGR的铁蛋白，H_D(RGE)为修饰了D型RGERPPR的铁蛋白。

表1为实施例1中肿瘤穿透肽修饰铁蛋白的偶联效率表

实施例2

修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白-紫杉醇载药纳米粒的制备方法：

将10mg紫杉醇药物用1mL乙醇溶液溶解。

将1mL浓度为1μM的修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白溶液(实施例1制得)置换至1mL磷酸缓冲液中(50mM NaH₂PO₄磷酸缓冲液，并含有不同浓度为5、10、20、25、30、40、50、75、100、150、200mM氯化钠，pH 7.2-7.4)并于60℃水浴中保温15min，按照摩尔比铁蛋白与紫杉醇的摩尔比为1:300(下述各例均按照此比例制备，且是用最优条件25mM NaCl制备)加入相同量约26μL的紫杉醇药物乙醇溶液，将所得混合溶液涡旋混匀后，迅速放入60℃水浴中，保温15min；

将上述所得溶液于室温下静置，至溶液为室温，之后置于截留分子量为6-8kDa的透析袋中透析除去游离的紫杉醇，透析20h后取出，5000×g转速离心5min，上清液使用0.45μm的滤膜过滤，即为修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白-紫杉醇载药纳米粒，表征结果如图2所示，由图2可看出紫杉醇分子被成功负载，且并未影响铁蛋白结构。其中，HFtn-PTX为未修饰的铁蛋白负载的紫杉醇药物，H_L(RGE)-PTX为修饰了L型RGERPPR的铁蛋白负载的紫杉醇药物，H_D(RPPR)-PTX为修饰了D型RPPREGR的铁蛋白负载的紫杉醇药物，H_D(RGE)-PTX为修饰了D型RGERPPR的铁蛋白负载的紫杉醇药物。取部分上清将pH重新调节至2.0使铁蛋白中的紫杉醇重新释放至溶液中，通过高效液相色谱验证该紫杉醇被成功装载；如图3和表2所示，在离子浓度为25mM的NaCl条件下(下述各例均在此条件下制备)，紫杉醇分子的包封率(包封的紫杉醇的量和使用的紫杉醇的量的比值)更高，且D型肽修饰的铁蛋白对紫杉醇的包封率能达到16.64％。

实施例3

修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白载药纳米粒的体外细胞毒性研究：

为研究修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白-紫杉醇载药纳米粒的体外细胞毒性，将A549细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)和MCF-7细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)以每孔5000个细胞的密度种于96孔板中，在37℃下培养24小时后，将紫杉醇含量为0.05-10μg/mL的PTX、HFtn-PTX、H_L(RGE)-PTX、H_D(RPPR)-PTX和H_D(RGE)-PTX加入孔板中并培养24h，之后弃去药液，加入200μL PBS缓冲液(0.01M，pH 7.0-7.2)清洗两遍后加入MTT孵育4h后离心，小心除去上清后加入200μL二甲基亚砜，在490nm处测紫外吸收，A549细胞和MCF-7细胞在不同浓度的紫杉醇纳米药物作用下的存活率如图4所示，结果表明修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白-紫杉醇载药纳米粒表现出较更强的细胞毒性，且D型肽的修饰能够增强铁蛋白对药物的递送，达到更高的治疗效果，其中修饰了D型RGERPPR的铁蛋白载药纳米粒效果最好。

实施例4

修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白的体外靶向性研究：

为研究肿瘤细胞对修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白的摄取情况，将A549细胞和MCF-7细胞以每孔3×10⁴个细胞接种于激光共聚皿中，培养24h后，加入FITC浓度为10μg/mL的FITC标记的HFtn(荧光标记铁蛋白，便于显微镜观察)，H_L(RGE)，H_D(RPPR)和H_D(RGE)纳米颗粒，孵育4h后用PBS清洗3遍细胞，并用4％多聚甲醛固定15min；然后加入DAPI进行细胞核染色，使用激光共聚焦显微镜对细胞进行成像，结果如图5所示，FITC标记的修饰肿瘤穿透肽的铁蛋白的细胞摄取明显增强。且在竞争性实验中，在TfR1受体被屏蔽的情况下，未修饰的铁蛋白荧光消失，TfR1介导的靶向摄取被抑制，而修饰肿瘤穿透肽的铁蛋白纳米粒子仍然显示出强烈的荧光，说明肿瘤穿透肽的修饰能够通过增强肿瘤细胞对铁蛋白的摄取；流式细胞仪定量分析细胞的荧光强度可知(图5D和5F)，与L型肽修饰的铁蛋白纳米粒子相比，D型肽修饰的铁蛋白具有更高的荧光强度，其平均荧光强度高达250，表明有更多的纳米颗粒被细胞摄取。因此，修饰了D型RGERPPR的铁蛋白效果最好、作用效果最为明显。

实施例5

修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白对三维肿瘤球的穿透作用：

三维肿瘤球可用于模拟实体瘤的体内状态，因此可以更好地用来评估铁蛋白纳米粒子的穿透能力。将A549细胞以每孔5000个细胞的密度接种于含有2％琼脂糖的96孔板中，离心10min，放于37℃细胞培养箱培养4-5天，每天半量换液。之后，加入10μg/mL的FITC标记的HFtn，H_L(RGE)，H_D(RPPR)和H_D(RGE)纳米颗粒，孵育4h后用PBS洗细胞3遍，直接使用激光共聚焦显微镜对细胞进行成像观察。实验结果如图6所示，对照组和FITC-HFtn组的荧光强度相对较低，且在肿瘤球内的穿透深度有限；而修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白能表现出更强烈的荧光和更深的穿透深度，且H_D(RGE)的穿透效果最为明显。这些结果表明，细胞穿透肽的修饰能够增强肿瘤细胞A549对铁蛋白纳米粒子的穿透作用，并且D型的RGERPPR的修饰对铁蛋白增强的靶向穿透效果最好。

实施例6

修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白载药纳米粒对三维肿瘤球的生长抑制作用：

以5000个细胞每孔的密度将A549细胞接种于含有2％琼脂的96孔板中，离心10min，放于37℃细胞培养箱培养4-5天至生长成致密的肿瘤球，每天半量换液。之后，加入紫杉醇含量为10μg/mL的PTX、HFtn-PTX、H_L(RGE)-PTX、H_D(RPPR)-PTX和H_D(RGE)-PTX的铁蛋白-紫杉醇载药纳米粒，每天半量换液；给药后，每天同一时间通过倒置显微镜观察并测量肿瘤球的形态、大小，并计算体积变化，持续6天，结果如图7所示，PTX和HFtn-PTX组对A549三维肿瘤球的生长有一定的抑制作用，但修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白-紫杉醇载药纳米粒能显示出更强的抑制作用，且H_D(RGE)-PTX表现出最强的抑制效果。表明D型的RGERPPR的修饰可以增强肿瘤细胞对铁蛋白载药纳米粒的细胞摄取，使得更多药物进入肿瘤细胞内部，达到更强的治疗效果。

实施例7

修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白载药纳米粒的体内抗肿瘤作用：

于4-5周龄BALB/c雌性小鼠右侧腋窝接种A549细胞以构建A549肺癌小鼠模型。待肿瘤长至100mm³时，开始静脉注射给药，共给药20天。给药共分为六组：PBS缓冲液组、PTX组、HFtn-PTX组、H_L(RGE)-PTX组、H_D(RPPR)-PTX组和H_D(RGE)-PTX组铁蛋白-紫杉醇载药纳米粒。其中，给药剂量为1mg PTX/kg，每两天给药一次，并测量肿瘤长短径，记录肿瘤体积大小。肿瘤体积V＝0.5×长径×短径²。于最后一次给药的后两天处死小鼠，完整剥取实体瘤并称重。结果如图8所示，由图8可看出，D型肽修饰的铁蛋白载药纳米粒能显示出比L型肽修饰的铁蛋白载药纳米粒更高的肿瘤抑制作用，且H_D(RGE)-PTX的作用效果最佳，肿瘤体积几乎没有增加。

Claims (2)

1.一种修饰了D型肿瘤穿透肽的铁蛋白载药纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）利用化学偶联法制备修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白，肿瘤穿透肽的氨基酸序列为D型RPPREGR或D型RGERPPR中的至少一种；铁蛋白为人体重链铁蛋白；

步骤1）包括以下步骤：

1.1）将含有肿瘤穿透肽的溶液加入到铁蛋白溶液中，调节溶液pH为6.5-7.5，在室温条件下于100-200 rpm转速缓慢搅拌1.5~2 h，其中，肿瘤穿透肽与铁蛋白的摩尔比（25±1）:1；

1.2）将步骤1.1）所得溶液置于透析袋中透析除去游离的多肽，透析18-24 h后取出、离心，上清即为修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白溶液；

2）在含有5~200 mM NaCl的磷酸缓冲液中，利用温度法在步骤1）所得的铁蛋白内负载紫杉醇，制得修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白-紫杉醇纳米粒；

修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白-紫杉醇纳米粒的制备方法包括如下步骤：

2.1）将紫杉醇药物加入乙醇溶液中，然后涡旋至药物完全溶解；

2.2）将铁蛋白溶液置换于磷酸缓冲液中，并于60±5℃水浴中保温10-30 min，加入步骤2.1）得到的药物溶液，涡旋混匀后，迅速放入60±5℃水浴保温10-30 min，其中，铁蛋白与紫杉醇的摩尔比为1:（300±50）；

2.3）将步骤2.2）所得溶液于室温下静置，至溶液为常温，之后置于透析袋中透析除去游离的紫杉醇，透析18-24 h后取出，离心，上清即为修饰了肿瘤穿透肽的铁蛋白-紫杉醇纳米粒。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中，肿瘤穿透肽的氨基酸序列为D型RGERPPR。

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