CN114886873B - 一种负载sn-38的铁蛋白纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种负载sn-38的铁蛋白纳米粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种负载SN‑38的铁蛋白纳米粒及其制备方法和应用，负载SN‑38的铁蛋白纳米粒包括，负载物，所述负载物为7‑乙基‑10‑羟基喜树碱；以及，载体，所述载体为脯氨酸、丙氨酸、丝氨酸组成的含有10个氨基酸残基的PAS10序列修饰的铁蛋白。本发明提高了SN‑38的水溶性、稳定性，并有效的延长药物在血浆中的半衰期；此外，纳米粒可以通过对肿瘤细胞转铁蛋白受体1的靶向性特异性地递送药物，最大程度的发挥SN‑38的抗癌效果，为后续药物靶向肿瘤细胞治疗提供了非常好的载体模型，具有很好的应用前景。

Description

一种负载SN-38的铁蛋白纳米粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于抗肿瘤技术领域，具体涉及到一种负载SN-38的铁蛋白纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
喜树碱是从喜树皮和果实中提取的抗肿瘤植物药,对胃肠道肿瘤和头颈癌等有良好的疗效，但会引发骨髓抑制、呕吐、腹泻和严重出血等不良反应限制了其在临床的进一步应用。7-乙基-10羟基喜树碱(SN-38)属于喜树碱类药物，是已上市药物伊立替康(CPT-11)的活性代谢产物，能抑制DNA拓扑异构酶，抑制DNA合成，并造成频繁的DNA单链断裂，具有广谱的细胞毒性。与伊立替康相比，SN-38对多种癌细胞的功效高约100～1000倍，并且对包括结直肠癌，肺癌，肝癌、宫颈癌和卵巢癌在内的多种肿瘤具有抑制作用。由于SN-38存在E-内酯环闭环结构而极难溶于水，目前临床使用的SN-38是经过碱化开环后溶于水的羧酸盐注射液，但是其质量不稳定、开环后活性降低、体内半衰期短、代谢较快等缺陷严重影响疗效。目前SN-38的纳米递送系统是研究较为广泛的药物制剂，既能解决SN-38的溶解性问题，又能保护药物的内酯环结构，同时还能减少药物用量，降低毒副作用和增强疗效。主要包括SN-38聚合物纳米粒、SN-38聚合物胶束、SN-38脂质纳米粒等。尽管SN-38纳米药物的研究很多，但与多数难溶性抗肿瘤药物类似，SN-38纳米递送系统仍面临着缺乏靶向性、稳定性差、生物相容性低以及可能存在长期毒性等关键问题和挑战。
蛋白质笼具有良好的稳定性、生物相容性和生物降解性，已广泛应用于药物传递和疫苗开发。其中，铁蛋白是由24个蛋白亚基自组装形成纳米中空笼状结构，该纳米笼水溶性好、生物相容性强，体内稳定性佳，尺寸均一，且该铁蛋白本身具有靶向性，可与肿瘤细胞中过量表达的转铁蛋白受体1(TfR1)特异性结合。然而，野生型的人重链铁蛋白作为纳米载药系统依旧存在血液滞留时间较短和对药物包封率较低两大主要缺点。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中SN-38在临床应用中存在的问题，提出了本发明。
本发明的其中一个目的是提供一种负载SN-38的N端修饰PAS10的铁蛋白纳米粒，有望实现在通过转铁蛋白受体1(TfR1)靶向肿瘤细胞递送药物的同时，有效地延长药物在血浆中的半衰期，为后续选择药物递送载体提供了非常好的模型，具有很好的应用前景。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种负载SN-38的N端修饰PAS10的铁蛋白纳米粒，包括，
负载物，所述负载物为7-乙基-10-羟基喜树碱；以及，
载体，所述载体为脯氨酸、丙氨酸、丝氨酸组成的含有10个氨基酸残基的PAS10序列修饰的铁蛋白；
其中，所述PAS10的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述PAS10序列修饰的铁蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
作为本发明负载SN-38的N端修饰PAS10的铁蛋白纳米粒的一种优选方案，其中：所述铁蛋白为人重链铁蛋白。
作为本发明负载SN-38的N端修饰PAS10的铁蛋白纳米粒的一种优选方案，其中：所述负载物与所述载体的摩尔比为100～200：1。
本发明的另一个目的是提供如上述所述的负载SN-38的铁蛋白纳米粒的制备方法，将含负载物的溶液加入到含载体的溶液中，涡旋后孵育，离心过滤得上清液，并去除游离的负载物。
作为本发明负载SN-38的N端修饰PAS10的铁蛋白纳米粒的制备方法的一种优选方案，其中：所述含负载物的溶液，为7-乙基-10-羟基喜树碱的乙醇溶液。
作为本发明负载SN-38的N端修饰PAS10的铁蛋白纳米粒的制备方法的一种优选方案，其中：所述含载体的溶液，为PAS10序列修饰的铁蛋白的GFC溶液，所述GFC溶液的pH为6.8～7.0，NaCl浓度为50mM，NaH2PO4浓度为25～75mM。
作为本发明负载SN-38的N端修饰PAS10的铁蛋白纳米粒的制备方法的一种优选方案，其中：所述孵育为50～60℃恒温水浴锅中以50～150rpm的转速孵育30～40min。
作为本发明负载SN-38的N端修饰PAS10的铁蛋白纳米粒的制备方法的一种优选方案，其中：所述离心，离心转速8000～12000rpm，离心时间5～10min。
作为本发明负载SN-38的N端修饰PAS10的铁蛋白纳米粒的制备方法的一种优选方案，其中：所述去除游离的负载物，采用透析袋透析，所述透析袋的截留值为6～8kDa，透析时间为24～48h，透析温度为4℃，且每8小时换一次PBS透析液。
本发明的另一个目的是提供如上述所述的负载SN-38的铁蛋白纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过PAS10-HFtn的包封，提高了SN-38的水溶性、稳定性，并有效的延长药物在血浆中的半衰期。此外，纳米粒可以通过对肿瘤细胞转铁蛋白受体1(TfR1)的靶向性特异性地递送药物，最大程度的发挥SN-38的抗癌效果，为后续药物靶向肿瘤细胞治疗提供了非常好的载体模型，具有很好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为实施例2中PAS10-HFtn蛋白的表征图；A为重组蛋白纯化后的SDS-PAGE和Native-PAGE图；B为重组蛋白纯化后的透射电镜图；C为HFtn、PAS10-HFtn蛋白纯化后的体积排阻色谱图；D为HFtn、PAS10-HFtn蛋白纯化后的圆二色谱图。
图2为PAS10修饰的铁蛋白负载SN-38药物的示意图。
图3为实施例3中PAS10-HFtn-SN38和HFtn-SN-38的表征图；A为HFtn-SN38、PAS10-HFtn-SN38的透射电镜图；B为HFtn-SN38、PAS10-HFtn-SN38的体积排阻色谱图；C为HFtn-SN38、PAS10-HFtn-SN38的圆二色谱图。
图4为实施例6中HFtn-SN38、PAS10-HFtn-SN38喜树碱纳米药物中SN-38的释放曲线。
图5为实施例7中A549细胞在不同浓度的SN-38、HFtn-SN38、PAS10-HFtn-SN38喜树碱纳米药物作用下的存活率。
图6为实施例8中激光共聚焦、流式细胞仪检测A549细胞对HFtn、PAS10-HFtn的摄取情况；A为A549细胞与游离FITC、FITC-HFtn和FITC-PAS10-HFtn孵育4h后的荧光图像；B为流式细胞仪定量分析细胞对两种蛋白的摄取情况；C为根据图B分析的平均荧光强度(n＝3)。
图7为实施例9中SN-38、HFtn-SN38和PAS10-HFtn-SN38喜树碱纳米药物的抗细胞迁移能力；A为不同纳米药物培养A549细胞的创面愈合显微镜图像；B为定量分析不同纳米药物对细胞的抗迁移能力图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
如无特别说明，实施例中所采用的原料均为商业购买。
实施例1
HFtn-MMP2-RGE和HFtn-mMMP2-RGE重组铁蛋白的构建：
以人重链铁蛋白(HFtn)编码基因(Gene ID:2495)为基础，在其3'端通过连接序列将PAS10(基因序列如SEQ ID NO.1所示)与人重链铁蛋白N末端连接，PAS10序列修饰的人重链铁蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
将该基因序列亚克隆至pET-20b(+)质粒载体中，得到PAS10-HFtn质粒；再将上述质粒热激至大肠杆菌感受态细胞，并通过氨苄青霉素抗性及基因测序等手段筛选出阳性单克隆。
实施例2
PAS10-HFtn重组铁蛋白的纯化与表征：
将PAS10-HFtn重悬的菌液超声破碎，超声条件为：超声1s，间歇2s，共超声20min，然后8000×g离心10min收集上清，将上清60℃水浴10min，再次8000×g离心30min收集上清，通过镍柱亲和层析和体积排阻色谱(SEC)对目的重组铁蛋白进行纯化，得到所述的目的重组铁蛋白PAS10-HFtn，表征结果如图1所示。
由图1可以看出，PAS10序列修饰的人重链铁蛋白并未有改变铁蛋白的二级结构(α-螺旋)、聚合状态(24聚体)和三维结构(中空笼状结构)。
实施例3
PS10-HFtn-SN38喜树碱纳米药物的制备：
将实施例2得到的目的重组铁蛋白PAS10-HFtn加入GFC缓冲溶液(pH＝6.8，NaCl浓度为50mM，NaH2PO4浓度为50mM)中，得到铁蛋白溶液；
将溶于无水乙醇溶剂的SN-38加入到预热的铁蛋白溶液中，蛋白与SN-38的投入摩尔比分别为1：150。混合溶液涡旋混匀后，放入60℃恒温水浴锅中，以一定转速孵育40min，12000rpm离心10min，分离上清液，在PBS中透析36h。透析结束后，在5000×g条件下离心5min，上清液使用0.45μm的滤膜过滤，即为负载了SN-38药物的PAS10修饰的铁蛋白载药纳米粒。制备过程如图2所示，表征结果如图3所示。
由图3可以看出装载的过程和药物并没有影响载体的二级结构(α-螺旋)、聚合状态(24聚体)和三维结构(笼状结构)。
取部分上清将pH重新调节至2.5使铁蛋白中的SN-38重新释放至溶液中，通过HPLC检测该SN-38纳米药物中SN-38的含量，计算得出每个PAS10修饰后的蛋白笼中约有23个SN-38分子被包封，包封率为10.42％。其中，包封率＝装载药物量/添加药物量*100％。
实施例4
探索不同离子浓度对温度法载药的影响：
配制不同盐离子浓度的GFC缓冲溶液(50mM NaH2PO4,5～200mM NaCl,pH＝6.8)，将蛋白置换至不同盐浓度的缓冲中，之后按照实施例3中的方法进行装载，计算出不同盐离子浓度下的药物包封率，其中，载药量＝装载药物量/载体蛋白量*100％。结果如表1所示。
表1
Figure BDA0003695215920000061
结果显示，不同盐离子浓度的GFC缓冲溶液对药物包封率产生显著影响，随着NaCl浓度的增加，SN-38药物包封率呈现先增加后降低的趋势，其中，NaCl的浓度为50mM时，载药效果最好。
实施例5
探索不同加药比例对温度法载药的影响：
将蛋白置换于GFC缓冲(50mM NaH2PO4，50mM NaCl，pH 6.8)中，按照实施例3中的方法进行装载，计算出不同加药比例下的药物包封率，结果如表2所示。
表2
Figure BDA0003695215920000062
Figure BDA0003695215920000071
结果显示，蛋白与药的摩尔比为1：150时，装载效果最佳。
实施例6
PAS10-HFtn-SN38喜树碱纳米药物的稳定性及体外释放研究：
为研究SN-38纳米药物的稳定性及体外释放特性，将SN-38纳米药物放入透析袋(截留分子量为6-8kDa)中，放入pH 7.4的PBS缓冲液中37℃孵育，在孵育时间0、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48、60小时分别取样并通过HPLC对释放的SN-38进行定量，SN-38释放量＝释放的SN-38/SN-38的总量，结果如图4所示。
可以看出，SN-38纳米药物在pH 7.4下相对稳定，但在pH 5.0下该SN-38纳米药物中SN-38极易释放，该结果表明该SN-38纳米药物释放形式是依赖pH条件。
实施例7
PAS10-HFtn-SN38喜树碱纳米药物的体外细胞毒性研究：
为研究SN-38纳米药物的体外细胞毒性，将A549细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号TCHu150)以每孔5000个细胞的密度种于96孔板中，在37℃下培养24小时后，将紫杉醇含量为0.1～10μg/mL的SN-38、HFtn-SN38、PAS10-HFtn-SN38加入相同的孔中培养24h，使用PBS洗两遍，加入MTT孵育4h后离心小心除去上清后加入二甲基亚砜，在570nm处测紫外吸收，A549细胞在不同浓度的SN-38、HFtn-SN38、PAS10-HFtn-SN38喜树碱纳米药物作用下的存活率如图5所示，结果表明PAS10-HFtn-SN38表现出较强的细胞毒性。
实施例8
PAS10-HFtn-SN38喜树碱纳米颗粒的体外靶向性研究：
为研究细胞对PAS10-HFtn-SN38纳米颗粒的摄取情况，将A549细胞以每孔1×105接种于激光共聚皿中，培养24h后，加入10μg/mL的FITC标记的HFtn-SN38和PAS10-HFtn-SN38纳米颗粒，孵育4h后用PBS洗细胞3遍，并用4％多聚甲醛固定15分钟；然后加入DAPI(10μg/mL)进行细胞核染色，使用激光共聚焦对细胞进行成像，结果如图6所示，FITC标记的PAS10-HFtn-SN38纳米颗粒的荧光强度与FITC标记的HFtn-SN38组相似，均远远高于FITC组。这说明PAS10的修饰并没有影响细胞对纳米粒子的摄取，相同的结果在流式细胞仪定量中也被得到。
实施例9
PAS10-HFtn-SN38喜树碱纳米药物的体外抗细胞迁移能力研究：
为研究SN-38纳米药物的体外抗细胞迁移能力，将A549细胞以每孔5×105个细胞的密度种于6孔板中，在37℃下培养至细胞长至90％以上，用移液枪枪头在各孔板中垂直划出同样宽的划痕，得到两个细胞岛，用磷酸缓冲清洗三遍，除去被划下的细胞，加入SN-38浓度为10μg/mL的SN-38、HFtn-SN38、PAS10-HFtn-SN38纳米药物，培养箱中孵育24h，用显微镜拍摄创面愈合区域，并计算出不同药物下的细胞迁移率，结果如图7所示，SN-38、HFtn-SN38、PAS10-HFtn-SN38纳米药物的抗细胞迁移率分别为70.83％、53.73％和63.55％，PAS10-HFtn-SN38表现出较强的抗细胞迁移力。
本发明提供了一种负载SN-38的PAS10修饰的铁蛋白载药纳米粒的制备方法及应用。N端修饰PAS10的铁蛋白纳米粒子，通过连接序列将PAS10与铁蛋白N末端连接，基于调节温度扩大/缩小蛋白孔道的方法对SN-38进行包封，提高了SN-38的水溶性、稳定性，并有效的延长药物在血浆中的半衰期。此外，纳米粒可以通过对肿瘤细胞转铁蛋白受体1(TfR1)的靶向性特异性地递送药物，最大程度的发挥SN-38的抗癌效果，为后续药物靶向肿瘤细胞治疗提供了非常好的载体模型，具有很好的应用前景。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 南京林业大学
<120> 一种负载SN-38的铁蛋白纳米粒及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcaagcccgg cagcaccggc accggcaagc 30
<210> 2
<211> 585
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcaagcccgg cagcaccggc accggcaagc ggtggtggta tgactaccgc atcgacaagt 60
caggttcgcc agaactacca tcaagatagc gaggccgcca tcaaccgcca gatcaacctg 120
gagttgtatg cttcgtacgt gtatctctct atgagctatt actttgaccg tgatgatgtt 180
gcgctgaaga actttgccaa atatttcctc catcagtcgc atgaggaacg tgaacatgca 240
gaaaaactta tgaagctgca aaaccaacgc ggcggtcgta tctttcttca ggacattaaa 300
aaaccagatt gcgacgactg ggagtcaggt ctcaatgcaa tggagtgtgc gctgcatctg 360
gaaaaaaacg ttaaccagag cctgttagag cttcacaagc ttgcaaccga taaaaatgac 420
ccgcatttgt gcgattttat cgagacgcac tacctgaacg agcaggtcaa agctattaaa 480
gaattgggcg accatgtaac caatcttcgc aaaatgggcg ccccggaaag cggtctggcg 540
gaatatctgt tcgataagca cacactgggt gattctgata atgaa 585

Claims (7)

1.一种负载SN-38的铁蛋白纳米粒，其特征在于：包括，
负载物，所述负载物SN-38为7-乙基-10-羟基喜树碱；以及，
载体，所述载体为脯氨酸、丙氨酸、丝氨酸组成的含有10个氨基酸残基的PAS10序列修饰的铁蛋白；
所述负载物SN-38与所述载体的摩尔比为100~200：1；
其中，所述PAS10的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述PAS10序列修饰的铁蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.如权利要求1所述的负载SN-38的铁蛋白纳米粒，其特征在于：所述铁蛋白为人重链铁蛋白。
3.如权利要求1或2所述的负载SN-38的铁蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于：将含负载物的溶液加入到含载体的溶液中，涡旋后孵育，离心过滤得上清液，并去除游离的负载物；
所述含负载物的溶液，为7-乙基-10-羟基喜树碱的无水乙醇溶液；
所述含载体的溶液，为PAS10序列修饰的铁蛋白的GFC缓冲溶液，所述GFC缓冲溶液的pH为6.8~7.0，NaCl浓度为50 mM，NaH2PO4浓度为25~75 mM。
4.如权利要求3所述的负载SN-38的铁蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于：所述孵育为50~60℃恒温水浴锅中以50~150 rpm的转速孵育30~40 min。
5.如权利要求3或4所述的负载SN-38的铁蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于：所述离心，离心转速8000~12000 rpm，离心时间5~10 min。
6.如权利要求5所述的负载SN-38的铁蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于：所述去除游离的负载物，采用透析袋透析，所述透析袋的截留值为6~8 kDa，透析时间为24~48 h，透析温度为4℃，且每8小时换一次PBS透析液。
7.如权利要求1或2所述的负载SN-38的铁蛋白纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
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