CN107530279A - 含聚(l‑精氨酸)链段的嵌段共聚物与聚阴离子性聚合物的聚离子复合物 - Google Patents

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Abstract

课题在于提供可成为对肿瘤内诱导型NO合酶(iNOS)有效的精氨酸底物的组合物。解决方案是PEG‑b‑聚(L‑Arg)或聚(L‑Arg)‑b‑PEG‑b‑聚(L‑Arg)与聚阴离子性聚合物的聚离子复合物(PIC)及其使用。

Description

含聚(L-精氨酸)链段的嵌段共聚物与聚阴离子性聚合物的聚 离子复合物
技术领域
本发明涉及含有聚乙二醇-b-聚(L-精氨酸)或聚(L-精氨酸)-b-聚乙二醇-b-聚(L-精氨酸)和聚阴离子性聚合物而成的聚离子复合物(PIC)；这样的PIC的用途(例如其对肿瘤组织内巨噬细胞的激活方面的应用)；以及上述嵌段共聚物及其制备方法。
背景技术
肿瘤组织中不仅存在癌细胞，也存在多种免疫细胞。在肿瘤组织形成初期阶段，由于免疫细胞的抗癌活性，肿瘤组织的生长受到阻碍，癌细胞被从体内除去。但是，这样的免疫细胞带来的抗癌活性减弱时，肿瘤组织可能继续生长，直至发生肿瘤组织的转移。将为了杀死癌细胞而使存在于该肿瘤组织的免疫细胞激活的疗法称作癌症免疫疗法，近年来备受关注。在以往的癌症免疫疗法中，白细胞介素-2(IL-2)的过量给予导致细胞毒性T细胞或自然杀伤细胞被激活，但IL-2不具有被特异性摄入到肿瘤组织的机制，现状是由于过量全身给予，因此确认了严重的毒性。另外在癌细胞开始分泌被称为肿瘤生长因子或转化生长因子(TGF-β)的细胞因子的肿瘤环境中，免疫细胞的激活受到限制，这也是必须解决的课题。
发明内容
本发明人为解决上述课题，将巨噬细胞作为要激活的免疫细胞而关注。巨噬细胞非常多地浸润于肿瘤组织内，通过产生一氧化氮(NO)来诱导癌细胞的凋亡(程序性死亡)。激活的巨噬细胞在细胞内表达诱导型NO合酶(iNOS)，以L-精氨酸为底物产生NO。该酶促反应以L-精氨酸浓度作为决定反应速度的步骤，肿瘤内精氨酸浓度越增加则NO产生速度越增加，因此通过将L-精氨酸高效地递送至肿瘤组织，有望提高巨噬细胞的抗癌活性。
在这样的背景下，为了将L-精氨酸高效地传递至肿瘤组织，人们研究了使用药物递送系统(DDS)的技术来递送L-精氨酸的方法。
结果，新合成了生物降解性聚乙二醇-b-聚(L-精氨酸)[有时简称为PEG-b-P(L-Arg)或PEG-PArg]，发现通过其与聚阴离子性聚合物的静电相互作用而制作的芯鞘型聚离子复合物胶束(PIC/m)的纳米颗粒高效地聚集在肿瘤组织中，同时该共聚物具有L-精氨酸作为聚(L-Arg)链段的聚合单元，且该共聚物不仅与聚阴离子性聚合物形成PIC胶束，还与游离L-精氨酸同样，可成为iNOS的底物，并且可显著降低荷瘤的实验哺乳动物的肿瘤体积。还发现：聚(L-精氨酸)-b-聚乙二醇-b-聚(L-精氨酸)[有时简称为P(L-Arg)-b-PEG-b-P(L-Arg)或PArg-PEG-PArg]的三嵌段共聚物也与上述二嵌段共聚物同样起作用。
另一方面，以往的技术文献WO2008/104694中概括性地记载了可包含PEG-b-P(L-Arg)的接枝化氨基酸聚合物，日本特开2006-56864或许也可以说概括性地记载了可包含PEG-b-P(L-Arg)的共聚物。但是并未具体记载(或由特定的化学结构式特别规定)PEG-b-P(L-Arg)，另外不仅对于如何可高效制备这样的聚合物，对于含有这样的聚合物和聚阴离子性聚合物而成的组合物、此外对于这样的聚合物与聚阴离子性聚合物的聚离子复合物(PIC)可在水性介质中形成稳定的胶束或高分子胶束也未有任何记载或提示，也未提示可提供可作为在巨噬细胞的存在下产生的iNOS的底物的L-Arg。另一方面还已知，与构成本发明的体系不同的、聚阴离子性氨基酸(PEG-b-PAsp)与聚阳离子性氨基酸(PEG-b-PLys)的PIC形成胶束(例如参照Harada等人, Macromolecules, 28, 5294-99(1995))。
另外，关于聚精氨酸，以往合成的含有聚精氨酸链段的嵌段共聚物含有二胍等的副产物，无法进行定量的胍基取代(参照Michael S. Bernatowicz等人, Journal ofOrganic Chemistry, 57, 2497-2502, (1992))。还有人报道了聚精氨酸侧链具有Z保护基的嵌段共聚物，但除去Z保护基的条件严苛，虽然可以以毫克级进行，但如果以克级进行脱保护，则肽主链开裂(ERIC P.HOLOWKA等人, Nature materials, 6, 52-57, 2007))。并且这些制备方法含有侧链不是完整的胍基的基团，且分子量分布过宽，无法控制，因此可能肽键分解后的L-精氨酸单体无法起到iNOS底物的作用，或者无法形成稳定的PIC胶束。并且可以举出以下情况：以往的PIC胶束在生理条件下稳定性低，颗粒因血液中的盐浓度、聚阴离子、胎牛血清(FBS)而崩解。此外，由于以往的PIC胶束是为了将蛋白或核酸递送至肿瘤组织而设计的，纳米颗粒本身的抗癌活性等并未得到确认。
针对这样的伴随现有技术而出现的问题，根据本发明，发现以特定的制备方法制备的PEG-b-P(L-Arg)或P(L-Arg)-b-PEG-b-P(L-Arg)的分子量分布狭窄，且在水性介质中由该嵌段共聚物和聚阴离子性聚合物形成的PIC胶束的纳米颗粒的平均直径为例如适合摄入到肿瘤组织的稳定的纳米(nm)尺寸。
因此，解决所述课题的手段不受限定，可提供以下的本发明的各种实施方式。
(1) 聚离子复合物，它是含有聚阳离子性聚合物和聚阴离子性聚合物而成的聚离子复合物(PIC)，其中，聚阳离子性聚合物为式(I)所示的共聚物：
[化1]
式中，A如下：
(i)表示氢、未取代或取代C1-C12烷基，被取代时的取代基表示甲酰基、式R1R2CH-(这里，R1和R2独立地表示C1-C4烷氧基、或者R1和R2一起表示-OCH2CH2O-、-O(CH2)3O-或-O(CH2)4O-)的基团，或者
(ii)表示式
[化2]
，
L和L’独立地表示连接基团，
Y和Y’独立地表示H、C1-21烷基羰基、取代C1-4烷基羰基、未取代或取代C3-7环烷基羰基、未取代或取代芳基羰基、或者未取代或取代五或六元杂芳基羰基，这里，取代C1-4烷基羰基的取代基选自卤素原子、羟基、羧基、未取代或取代C3-7环烷基、未取代或取代芳基和未取代或取代五或六元杂芳基、未取代或取代金刚烷基、未取代或取代胆甾醇残基，这些取代基被取代时的取代基可以是C1-4烷基、C1-4烷基氧基、羟基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、或者单-或二C1-4烷基氨基，
m和m’独立地为5～300的整数，
n为5～1,000的整数，
式中的m或m’个脒基(C(=NH)NH2)的最大80%可以是H；
聚阴离子性聚合物选自聚阴离子性多糖、聚阴离子性多肽、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸；且
所述PIC在溶解或分散于水中时是平均粒径为纳米(nm)级的PIC胶束的形态。
(2)实施方式(1)所述的聚离子复合物，其中，A由(i)定义。
(3)实施方式(1)所述的聚离子复合物，其中，A由(ii)定义。
(4)组合物，该组合物含有实施方式(1)～(3)中任意一项所述的聚离子复合物作为有效成分，用于提供诱导型NO合酶的底物L-Arg，所述诱导型NO合酶来自哺乳动物组织中被激活的细胞。
(5)实施方式(4)所述的组合物，其中，哺乳动物组织中被激活的细胞是肿瘤组织内或附近的巨噬细胞。
(6)实施方式(4)所述的组合物，其中，哺乳动物组织中被激活的细胞是伴随心肌内的炎症而被激活的巨噬细胞。
(7)组合物，该组合物含有实施方式(1)～(3)中任意一项所述的聚离子复合物作为有效成分，用于预防或治疗哺乳动物组织中的肿瘤。
(7’)哺乳动物的肿瘤的预防或治疗方法，该方法包括对需要给予的哺乳动物给予抗肿瘤有效量的实施方式(1)～(3)中任意一项、优选(2)所述的聚离子复合物。
(8)嵌段共聚物的制备方法，该嵌段共聚物由式(I)表示：
[化3]
式中，A如下：
(i)表示氢、未取代或取代C1-C12烷基，被取代时的取代基表示甲酰基、式R1R2CH-(这里，R1和R2独立地表示C1-C4烷氧基、或者R1和R2一起表示-OCH2CH2O-、-O(CH2)3O-或-O(CH2)4O-)的基团，或者
(ii)表示式
[化4]
，
L和L’独立地表示连接基团，
Y和Y’独立地表示H、C1-21烷基羰基、取代C1-4烷基羰基、未取代或取代C3-7环烷基羰基、未取代或取代芳基羰基、或者未取代或取代五或六元杂芳基羰基，这里，取代C1-4烷基羰基的取代基选自卤素原子、羟基、羧基、未取代或取代C3-7环烷基、未取代或取代芳基和未取代或取代五或六元杂芳基、未取代或取代金刚烷基、未取代或取代胆甾醇残基，这些取代基被取代时的取代基可以是C1-4烷基、C1-4烷基氧基、羟基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、或者单-或二C1-4烷基氨基，
m和m’独立地为5～300的整数，
n为5～1,000的整数，
式中的m或m’个脒基(C(=NH)NH2)的最大80%可以是H；
所述制备方法包括以下步骤：根据需要在反应惰性溶剂中，使N,N’-双(叔丁氧基羰基)-1H-吡唑-1-甲脒与式(II)所示的嵌段共聚物反应，使来自鸟氨酸的链段中的δ-氨基进行胍基化
[化5]
式中，A如下：
(i)’与对于上式(I)的(i)定义的一样，或者
(ii)’表示式
[化6]
，
L、L’、Y、Y’、n、m、m’与对于上式(I)定义的一样。
(9)实施方式(8)所述的嵌段共聚物的制备方法，其中，式(II)的A由(i)’定义。
(10)实施方式(8)所述的嵌段共聚物的制备方法，其中，式(II)的A由(ii)定义。
(11) 嵌段共聚物，该嵌段共聚物由式(III)表示：
[化7]
式中，
L和L’独立地表示连接基团，
Y和Y’独立地表示H、C1-21烷基羰基、取代C1-4烷基羰基、未取代或取代C3-7环烷基羰基、未取代或取代芳基羰基、或者未取代或取代五或六元杂芳基羰基，这里，取代C1-4烷基羰基的取代基选自卤素原子、羟基、羧基、未取代或取代C3-7环烷基、未取代或取代芳基和未取代或取代五或六元杂芳基、未取代或取代金刚烷基、未取代或取代胆甾醇残基，这些取代基被取代时的取代基可以是C1-4烷基、C1-4烷基氧基、羟基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、或者单-或二C1-4烷基氨基，
m和m’独立地为5～300的整数，
n为5～1,000的整数，
式中的m或m’个脒基(C(=NH)NH2)的最大80%可以是H。
发明的效果
按照本发明的PIC胶束，特别是式(I)所示的A由(i)定义的二嵌段共聚物与优选聚阴离子性多糖、更优选硫酸软骨素、透明质酸、最优选硫酸软骨素的PIC胶束，可以在血液中以单分散且稳定的PIC胶束的形式存在。这样的PIC胶束通过被摄入肿瘤内巨噬细胞中，显著产生NO，由此，即使未负载抗癌药或具有抗癌作用的蛋白、核酸等，纳米颗粒本身也显示抗癌或抗肿瘤活性，因此是有望可单独地、或与其它抗癌药组合地用于癌症疗法中的一种候选物质。
附图说明
图1是L-Orn(Z)-NCA的1H-NMR谱图。
图2是PEG-b-P(L-Orn(Z))的尺寸排阻色谱(SEC)。
图3是PEG-b-P(L-Orn(Z))的1H-NMR谱图。
图4是PEG-b-P(L-Orn)的1H-NMR谱图。
图5是PEG-b-P(L-Orn)的13C-NMR谱图。
图6是PEG-b-P(L-Arg(Boc2))的1H-NMR谱图。
图7是PEG-b-P(L-Arg)的尺寸排阻色谱(SEC)。
图8是PEG-b-P(L-Arg)(聚合度m=30)的1H-NMR谱图。
图9是PEG-b-P(L-Arg)的13C-NMR谱图。
图10是表示胍基化的反应时间导致的取代率的变化的曲线图。
图11是PEG-b-P(L-Arg)(聚合度m=62)的1H-NMR谱图。
图12是PEG-b-P(D-Arg)的1H-NMR谱图。
图13是PEG-b-P(L-Lys-Gua)的1H-NMR谱图。
图14是表示包含PEG-b-P(L-Arg)和硫酸软骨素C的PIC胶束的DLS评价结果的曲线图。
图15是表示基于缓冲液中的聚精氨酸和iNOS酶的反应产生NO的评价结果的曲线图。
图16是表示来自RAW264.7巨噬细胞的NO产生量的评价结果的曲线图(＊p＜0.05,n=3)。
图17是表示对于静脉给予L-PArg-CS/m，荷癌小鼠的体重相对变化的曲线图(n=4)。
图18是表示对于静脉给予L-PArg-CS/m，荷癌小鼠的肿瘤体积变化的曲线图(＊p＜0.05, ＊＊p＜0.01, n=4)。
图19是POrn(Z)-b-PEG-b-POrn(Z)和POrn-b-PEG-b-POrn的1H-NMR谱图。
图20是PArg(Boc2)-b-PEG-b-PArg(Boc2)和PArg-b-PEG-b-PArg的1H-NMR谱图。
图21是表示PIC(PMNT-b-PEG-b-PMNT+PAAc或PMNT-b-PEG-b-PMNT/PArg-b-PEG-b-PArg+PAAc)的凝胶化行为的代替图的照片。
图22是表示PEG-b-PArg/CS和PArg-b-PEG-b-PArg/CS在HUVEC中的管形成行为的代替图的照片。
图23是表示心肌梗塞(MI)后第4周的心脏超声图和左心室射血分数(LVEF)测定结果的曲线图。
图24是表示MI后第4周通过Masson三色(torichrome)染色得到的心脏组织的组织学评价结果的代替图的照片。
发明详述
本说明书中使用的技术术语如未特别定义，则以表示该技术领域中常用的含义内容的方式使用。
<PIC>
本发明的PIC含有作为聚阳离子性聚合物的式(I)的嵌段共聚物(PEG-b-P(L-Arg)或P(L-Arg)-b-PEG-b-P(L-Arg))和聚阴离子性聚合物而成，优选实质上由该共聚物和该聚阴离子性聚合物构成(consisting essentially of)或由该共聚物和该聚阴离子性聚合物构成(consisting of)。
<PIC胶束>
进而，可理解，式(I)的嵌段共聚物(PEG-b-P(L-Arg)或P(L-Arg)-b-PEG-b-P(L-Arg))-和聚阴离子性聚合物的PIC在水性介质中形成，经由该共聚物中的聚(L-精氨酸)(也记为P(L-Arg))链段与聚阴离子性聚合物之间的静电相互作用形成PIC部，由此形成以该PIC部为芯、而以该共聚物的聚乙二醇部为鞘的纳米尺寸的聚合物胶束(例如参照实施例9的“聚离子复合物胶束的制备”中对PIC胶束水溶液进行DLS测定的结果)。这里，水性介质可以是纯水或离子交换水、或它们的缓冲化溶液、含水溶性有机溶剂(例如N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等)的水溶液等。
式(I)、(II)、(III)中的连接基团L和/或L’只要不对所述聚离子复合物胶束的形成产生不良影响即可，可以是不受限定的有机二价基团，但通常表示-O-(CH2)a-NH-、-O-(CH2)a-O-、-(CH2)a-NH-或-(CH2)a-O-，优选表示-O-(CH2)aNH-、-(CH2)a-NH-(这里，a为1～6、优选1～3的整数)，关于这些连接基团的键合的方向性，L是在各式的结构式中具有各部分的顺方向性。例如举-O-(CH2)aNH-为例，-O-(CH2)部分一侧的连接键与式(I)的亚甲基共价键合，NH-部分与羰基共价键合。与此相对，L’的方向性是具有与L相反的方向性。
Y表示H、C1-21烷基羰基、取代C1-4烷基羰基、未取代或取代C3-7环烷基羰基、未取代或取代芳基羰基、或者未取代或取代五或六元杂芳基羰基。
作为上述各基团或各基团的部分的烷基可以是直链或支链，并没有限定，可举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、壬基、十一烷基、十三烷基、十七烷基、十九烷基等中适合的基团。优选选自C1-6烷基。C3-7环烷基可以是环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基。芳基可以是苯基、萘基。五或六元杂芳基是含有1或2个选自氧、氮和硫原子的相同或不同的杂原子的不饱和杂环式基团，可以是噻吩基、呋喃基、吡喃基、吡咯基、异噁唑基、吡唑基、咪唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基，另外这些杂环式环也可以苯并缩合。所述缩合环例如可举出异吲哚基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、菲啶基。
取代C1-4烷基羰基的取代基选自卤素原子(Cl、F、Br、I)、羟基、羧基、未取代或取代C3-7环烷基、未取代或取代芳基和未取代或取代五或六元杂芳基、未取代或取代金刚烷基、未取代或取代胆甾醇残基，这些取代基被取代时的取代基可以是C1-4烷基、C1-4烷基氧基、羟基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、或者单-或二C1-4烷基氨基。最后的取代基也适用于取代C3-7环烷基羰基、取代芳基羰基、或者取代五或六元杂芳基羰基。
以上的定义中，胆甾醇残基可以是胆甾醇分子中22～27位碳上的任一H离去、或含有22～27位碳中任一的烃链离去而得的残基。所述残基取代的烷基羰基例如可举出胆酸、鹅去氧胆酸。Y优选为C1-6烷基羰基。
从该共聚物和阴离子性聚合物所形成的PIC胶束在水性介质中的稳定性考虑，m和m’独立地可优选为10～200、更优选15～150、最优选15～100的整数。
同样地，n可优选为20～800、更优选30～500、最优选40～400的整数。
式(I)中的m和m’个脒基(C(=NH)NH2)独立，通常可以最大80%、优选最大60%、更优选最大30%、最优选最大10%为H，特别最优选m和m’个全部为脒基。
该聚阴离子性聚合物是可在水性介质中与所述式(I)所示的共聚物形成稳定的PIC，且该PIC形成稳定的聚合物胶束的物质，具体物质并没有限定，但可为选自聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚磺酸、聚阴离子性多糖类、阴离子性蛋白质等的1种或多种，优选的可举出：硫酸软骨素、鹿角菜胶、肝素、羧甲基葡聚糖、黄原胶、透明质酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸，从稳定性考虑，可特别举出硫酸软骨素作为优选的物质。这些聚阴离子性聚合物的分子量根据聚合物的种类，最佳值不同，没有限定。但为聚丙烯酸时，Mn为200～1000000，优选500～100000，更优选1000～10000；为聚阴离子性多糖类例如硫酸软骨素时，Mn或Mw为500～1000000，优选1000～100000；为阴离子性多肽例如聚天冬氨酸时，Mn或Mw为500～1000000，优选1000～100000。它们可以将市售的产品根据需要进行纯化使用。
<嵌段共聚物的制备>
用于形成PIC的式(I)所示的嵌段共聚物可含有：只要满足本发明的目的则可通过任何方法制备的适当的PEG链段和P(L-Arg)链段。但该嵌段共聚物优选分子量分布狭窄，且以在水性介质中由该嵌段共聚物和聚阴离子性聚合物形成的PIC胶束的纳米颗粒平均粒径适合摄入到肿瘤组织的尺寸获得的该嵌段共聚物。所述共聚物可按照上述本发明的实施方式(8)制备。
可以通过如下来提供：预先准备为式(II)的前体的共聚物
[化8]
式中，A、L、Y、m和n与上式(II)中的定义含义相同，
接着，使用胍基化试剂(用于将来自该式中的L-鸟氨酸的链段中的δ-氨基进行胍基化反应)、N,N’-双(叔丁氧基羰基)-1H-吡唑-1-甲脒进行所述胍基化，由此来制备。对于所述制备，典型的是按照下述的合成方案，形成式(II)所示的共聚物与三氟乙酸(TFA)的盐，在适当的碱存在下的惰性溶剂、或者具备碱和溶剂的性质的溶剂(例如N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜等的溶剂)中进行胍基化反应，
[化9]
这里，上述反应方案中，最初的式中的A对应于由上式(II)的(ii)’定义的基团时，其中记载的与来自式中m’个重复单元对应的鸟氨酸的链段中的δ-氨基，与上述m个重复单元的δ-氨基同样，为三氟乙酸的盐型；胍基化后，上述反应方案中最后的式的A中，与来自 m’个重复单元对应的鸟氨酸的链段中的δ-氨基为二Boc保护脒基。
接着，使存在于来自胍基化试剂的部分的保护基团叔丁氧基羰基(Boc)离去，由此制备目标式(I)的嵌段共聚物。关于消除反应(离去反应)，只要在不对该共聚物的肽键等产生不良影响的条件下，则可在任何条件下进行，优选在使用TFA的条件下进行。
[化10]
进而，为了提供分子量分布狭窄的本发明的共聚物，优选式(II)所示的前体共聚物(以式(II)的A由(i)’表示的情形为例时)按照下述的合成方案制备。
[化11]
这里，化合物1使用市售的产品，或通过按照其提供方法的方法准备的、分子量分布尽可能狭窄的化合物，对该化合物，通过进行使氨基得到保护的鸟氨酸的氨基酸酐进行活性开环聚合、接着使用乙酸酐等的活性末端改性剂终止反应这样的本身公知的方法，制备化合物2，进而使聚(L-鸟氨酸)链段的氨基保护基团离去。
根据所述的以化合物1为原料的反应处理，聚(L-鸟氨酸)链段也可以以分子量分布极为狭窄的前体共聚物的形式提供。
因此，最终得到的按照本发明的式(I)所示的嵌段共聚物可提供分子量分布为1.01～1.20、优选1.01～1.06的产品。
与此相对，式(II)的A由(II)’定义时，作为上述反应方案中的起始原料即化合物1，可使用NH2CH2CH2-(OCH2CH2)nNH2，以下，化合物2～4的A部分可分别为与m个重复单元对应的重复单元。
这样得到的、式(II)的A由(ii)’定义的三嵌段共聚物由下式(III)表示：
[化12]
式中，L、L’、Y、Y’、m、m’、n与对于上式(III)的定义一样，
就本发明人所知，是以往技术文献未记载的化合物。
<PIC胶束的制备>
根据本发明得到的PIC胶束可通过如下制备：将上述式(I)所示的嵌段共聚物和上述聚阴离子性聚合物调节为前者的氨基或胍基的数目(称为C)/后者的羧基和/或磺基的数目(A)之比为0.5～2.50，在经缓冲化的水性溶液(pH=7.2～7.5)中溶解并混合，静置规定时间(通常在室温下为30分钟以上)。在该制备时，若对使用所述式(I)的A由(i)定义的嵌段共聚物得到的胶束水溶液进行动态光散射(DLS)的测定，则通常可得到平均粒径为约20nm～约50nm的胶束颗粒，另一方面，若对式(I)的A由(ii)定义的三嵌段共聚物或式(III)所示的三嵌段共聚物和聚阴离子性聚合物的PIC胶束水溶液进行DLS测定，则通常可得到平均粒径为约40～70的胶束颗粒。
这样得到的PIC胶束可通过离心等的分离手段分离，还可通过冷冻干燥，以冷冻组合物的形式保存，可根据需要在水性介质中重构。这样的干燥组合物可根据需要、以含有生理学可接受的稀释剂或赋形剂的PIC胶束的水溶液的形式提供。这样的稀释剂可以是无菌水、生理盐水、含有生理学可接受的缓冲剂的溶液等，赋形剂例如可以是山梨醇、糊精、葡萄糖、甘露醇、氨基酸(例如甘氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸等)等。
这样的水性溶液可以对需要其给予的哺乳动物特别是人经由静脉或动脉给予，该水溶液或干燥组合物还可直接给予肿瘤局部。这样，PIC胶束可在肿瘤组织聚集，在该位置产生NO，发挥抗肿瘤作用。所述给予量可参照后述试验例或与其类似的试验结果，由专门医师适当确定。
另一方面，单独的式(III)的三嵌段共聚物或者该共聚物与下述通式所示的三嵌段共聚物(如实施例11记载，WO2015/118993A中记载的，典型的为PMNT-PEG-PMNT或包含该化合物)的混合物(前者的L-Arg单元与后者的TEMPO单元之比可以是5～1:1～5)，和特定的阴离子性聚合物的PIC胶束水性溶液在生物体条件下的pH以及温度37℃以上发生凝胶化。因此，可以直接给予到希望该PIC滞留的生物体部位(例如心肌、关节等)，对与炎症相关的疾病或障碍进行处置。关于给予方式，可参照基于本发明人的专利申请的WO2013/111801A、WO2013/111801A、WO2014/199982A。这些专利文献通过引用，其全部内容被结合到本说明书。
摘记主要事项，则PMNT-PEG-PMNT可按照以下的合成方案合成。
[化13]
包含这样的PMNT-PEG-PMNT的三嵌段共聚物在技术概念上可通过以下通式表示。
[化14]
式中，
L1表示相同或不同的连接基团，
L2独立地为-C1-6亚烷基-NH-(C1-6亚烷基)ｑ-，这里，ｑ为0或1的整数，
关于R，独立地， R的总数n的至少20%表示选自2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基-4-基、2,2,5,5-四甲基吡咯烷-1-氧基-3-基、2,2,5,5-四甲基吡咯啉-1-氧基-3-基和2,4,4-三甲基-1,3-噁唑烷-3-氧基-2-基、2,4,4-三甲基-1,3-噻唑烷-3-氧基-2-基和2,4,4-三甲基-咪唑烷-3-氧基-2-基的环状硝基氧自由基化合物的残基而存在时，剩余的R为氢原子、卤素原子或羟基，
Y独立地选自H、可被C1-6烷基取代的苯基硫代羰基硫、C1-6烷基硫代羰基硫、C1-6烷基氧基硫代羰基硫或SH，
m独立地为3～1,000的整数，
n为5～5,000的整数。
上述的通式中，优选的方案中，各L1独立地选自单键、-S-(CH2)c-、-S-(CH2)cCO-、-(CH2)cS-、-CO(CH2)cS-、
[化15]
，
这里，c为1-5的整数，条件是，连接基团具有方向性时、例如为-S-(CH2)c-时，上式中左侧的L1以所记载的顺方向键合，即S原子一侧与CH2键合，CH2一侧与O原子键合，而右侧的L1以其逆方向键合。
Y优选为H，或选自-SH、
[化16]
，
关于R，独立地， R的总数n的优选80%、更优选至少90%、最优选约100%表示选自2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基-4-基、2,2,5,5-四甲基吡咯烷-1-氧基-3-基、2,2,5,5-四甲基吡咯啉-1-氧基-3-基和2,4,4-三甲基-1,3-噁唑烷-3-氧基-2-基、2,4,4-三甲基-1,3-噻唑烷-3-氧基-2-基和2,4,4-三甲基-咪唑烷-3-氧基-2-基的环状硝基氧自由基化合物的残基而存在时，剩余的R为氢原子、卤素原子或羟基，
m独立地优选为3～100、更优选3～50的整数，
n优选为5～1000、更优选10～200的整数，由此表示。
PEG-b-P(L-Arg)或P(L-Arg)-PEG-P(L-Arg)嵌段共聚物其本身除上述目的之外，还可用作1)基因递送用的聚阳离子、2)二氧化硅纳米颗粒等无机物纳米颗粒、以及金纳米颗粒等的金属纳米颗粒、以及磁性纳米颗粒的表面涂布剂、3)生物医疗器械的表面涂布剂、4)药物等的细胞导入剂，另外，所述PIC胶束除上述的目的之外，还可用作1)药物递送用的DDS载体、2)基因递送用的DDS载体。
实施例
以下举出具体例，更详细地说明本发明，但并不意味着将本发明限定于它们。
实施例1
为Nδ-苄氧基羰基-L-鸟氨酸(L-Orn(Z))的氨基酸酐(N-羧基酸酐，NCA)的L-Orn(Z)-NCA的合成
L-Orn(Z)-NCA按照以下合成方案1合成：
[化17]
将L-Orn(Z)(15.0g，56.3mmol)加入到500mL茄形烧瓶反应容器中。接着将反应容器中抽真空，然后用氮气置换，将该操作重复3次，由此使反应容器内处于氮气氛下。在反应容器中加入150mL四氢呋喃(THF)，使L-Orn(Z)分散，开始搅拌。在反应容器中加入溶解于25mLTHF的三光气(6.13g，20.7mmol)。在反应容器中加入(+)-α-蒎烯(17.5mL，112.7mmol)，加热至50℃，搅拌1小时。将反应溶液用蒸发器蒸发，新加入200mL THF，再次用蒸发器蒸发，由此除去反应溶液中的质子。将所得的灰白色的固体用THF:己烷=1:3的混合溶剂重结晶，由此得到针状晶体。产量为10.5g，产率为64%。所得L-Orn(Z)-NCA的1H-NMR谱如图1所示。
实施例2
PEG-b-P(L-Orn(Z))嵌段共聚物的合成
PEG-b-P(L-Orn(Z))按照以下合成方案2合成：
[化18]
在500mL烧瓶反应容器中加入α末端具有甲氧基且ω末端具有氨基的聚乙二醇(PEG-NH2，分子量12,000，日油株式会社)(5.0g，0.42mmol)、30mL苯，冷冻干燥一夜，由此除去反应容器内的水分。接着将容器内置换为氮，制成氮气氛下，加入70mL二甲基甲酰胺(DMF)作为反应溶剂，开始搅拌。将按照实施例1得到的L-Orn(Z)-NCA(3.9g，13mmol)溶解于30mLDMF，加入到反应容器，在25℃的温度下搅拌48小时。然后加入4mL乙酸酐，搅拌2小时，由此使活性末端乙酰基化。将该反应溶液在冰上沉淀于1.5L二乙醚。重复2次用氯仿和二乙醚进行的再沉淀操作，从而进行纯化，然后通过苯冷冻干燥得到白色粉末。产量为8.1g，产率为98%。所得PEG-b-P(L-Orn(Z)嵌段共聚物的尺寸排阻色谱和1H-NMR谱分别如图2、3所示。将PEG用作标准品时的分子量分布为1.07，P(L-Orn(Z))链段的聚合度m=30。
实施例3
PEG-b-P(L-Orn)嵌段共聚物的合成
PEG-b-P(L-Orn)按照以下合成方案3合成：
[化19]
将按照实施例2得到的PEG-b-P(L-Orn(Z))(3.0g，0.154mmol)加入到100mL茄形烧瓶反应容器中，继续加入30mL三氟乙酸(TFA)并搅拌。加入TFA起15分钟后加入9mL溴化氢/乙酸溶液，在冰上搅拌4小时。在反应后的溶液中加入40mL蒸馏水，用1L二乙醚进行萃取。只回收水相，再次用1L二乙醚进行萃取。将该醚萃取操作进行至醚相为中性。将醚萃取后的水相注入截留分子量12-14,000的透析膜，相对于0.05%TFA水溶液进行24小时透析，继续相对于蒸馏水进行48小时透析。将透析后的膜内水溶液冷冻干燥，由此得到白色粉末。产量为2.75g，产率为95%。此时，PEG-b-P(L-Orn)嵌段共聚物以TFA盐的形式回收。将该TFA盐的PEG-b-P(L-Orn)相对于0.01N HCl透析，由此可转换为HCl盐。TFA盐的嵌段共聚物用于胍基化反应，HCl盐的嵌段共聚物用于物性评价。所得PEG-b-P(L-Orn)嵌段共聚物的1H-NMR和13C-NMR谱如图4、5所示。P(L-Orn)链段的聚合度m=30。
实施例4
PEG-b-P(L-Arg(Boc2))嵌段共聚物的合成
PEG-b-PL-ArgBoc2))按照以下合成方案4合成：
[化20]
在100mL茄形烧瓶反应容器中加入按照实施例3得到的PEG-b-P(L-Orn)嵌段共聚物的TFA盐(2.5g，0.13mmol)、50mL N-甲基吡咯烷酮。接着加入作为胍基化试剂的N,N’-双(叔丁氧基羰基)-1H-吡唑-1-甲脒(PCX(boc2)) (2.46g，7.9mmol)、二异丙基乙基胺(1.3mL，7.9mmol)，在25℃下搅拌24小时。将反应溶液加入到截留分子量6-8,000的透析膜，相对于DMF透析24小时，继续相对于甲醇透析24小时。将透析后的溶液用蒸发器蒸发，将粗品进行苯冷冻干燥，由此得到白色粉末。产量为2.65g，产率为88%。所得的PEG-b-P(L-Arg(Boc2))嵌段共聚物的1H-NMR如图6所示。P(L-Arg(Boc2))链段的聚合度m=30，取代度为99%。
实施例5
PEG-b-P(L-Arg)嵌段共聚物的合成
PEG-b-P(L-Arg)按照以下合成方案5合成：
[化21]
将按照实施例4得到的PEG-b-P(L-Arg(Boc2))(2.5g，0.109mmol)加入到100mL茄形烧瓶反应容器中，继续加入50mL三氟乙酸(TFA)，在室温下搅拌24小时。在反应后的溶液中加入50mL蒸馏水，用1L二乙醚进行萃取。只回收水相，再次用1L二乙醚进行萃取。将该醚萃取操作进行至醚相为中性。将醚萃取后的水相注入截留分子量12-14,000的透析膜，相对于0.01N HCl水溶液进行24小时透析，继续相对于蒸馏水进行48小时透析。将透析后的膜内水溶液冷冻干燥，因此得到白色粉末。产量为1.88g，产率为96%。此时，PEG-b-P(L-Arg)嵌段共聚物以HCl盐的形式回收。所得的PEG-b-P(L-Arg)嵌段共聚物的尺寸排阻色谱、1H-NMR和13C-NMR谱分别如图7、8、9所示。分子量分布为1.03，P(L-Arg)链段的聚合度m=30，取代度为99%。
胍基取代率的反应时间追踪如图10所示。使用PCX(Boc2)作为胍基化试剂时，仅仅1小时的反应时间内，约80%的氨基被胍基取代，24小时后导入了99%胍基。而在相同反应条件下使用以往的胍基化试剂PCX・HCl时，24小时后只被取代约40%左右。另外胍基化试剂使用N-(叔丁氧基羰基)-1H-吡唑-1-甲脒[PCX(boc)]时，即使在相同条件下反应24小时，胍基也只有5%左右得到取代。
实施例6
PEG-b-P(L-Arg)嵌段共聚物的合成
将按照实施例2得到的L-Orn(Z)-NCA的量由3.9g改为7.8g，除此之外按照与实施例2至5的方案同样的方法进行PEG-b-P(L-Arg)的合成。此时，所得嵌段共聚物的P(L-Arg)链段的聚合度m=62，胍基的取代度为99%。1H-NMR如图11所示。
实施例7
PEG-b-P(D-Arg)嵌段共聚物的合成
使用D-Orn(Z)代替L-Orn(Z)，除此之外按照与实施例1至6的方案同样的方法进行PEG-b-P(D-Arg)的合成。这样得到的嵌段共聚物的P(D-Arg)链段的聚合度m=58，胍基的取代度为99%。1H-NMR如图12所示。
实施例8
PEG-b-P(L-Lys-Gua)或PEG-b-P(L-homoArg)嵌段共聚物的合成
使用Nδ-苄氧基羰基-L-赖氨酸[L-Lys(Z)]代替L-Orn(Z)，除此之外按照与实施例1至6的方案同样的方法进行PEG-b-P(L-Lys-Gua)的合成。该嵌段共聚物是将PEG-b-聚(L-赖氨酸)嵌段共聚物的聚赖氨酸链段中的ε-氨基取代为胍基的胍基取代的聚赖氨酸或聚(L-高精氨酸)。这样得到的嵌段共聚物的P(L-Lys-Gua)链段的聚合度m=56，胍基的取代度为99%。1H-NMR如图13所示。
实施例9
聚离子复合物胶束的制备
将PEG-b-P(L-Arg)嵌段共聚物和硫酸软骨素C钠(CS：分子量50,000)分别溶解于Tris-HCl缓冲液(10mM，pH7.4)，制备浓度为2mg/mL的PEG-b-P(L-Arg)聚阳离子水溶液和CS聚阴离子水溶液。将PEG-b-P(L-Arg)聚阳离子水溶液和CS聚阴离子水溶液以任意的阳离子/阴离子比(C/A比)混合，涡旋后静置30分钟，由此制备PIC胶束水溶液。这里，C/A是[聚阳离子中的氨基或胍基数]/[聚阴离子中的羧基或磺基]。对所得的PIC胶束水溶液进行动态光散射(DLS)测定，结果C/A=1时，得到散射强度最大、多分散度(PdI)最小的纳米颗粒。此时的平均粒径为约35nm左右(图14)。
<试验1>
iNOS酶与聚精氨酸的反应性
将实施例6至9中合成的嵌段共聚物的粉末分别溶解于HEPES-NaOH缓冲液(10mM，pH7.4)，制备2mg/mL的聚合物水溶液。将所制备的聚合物水溶液与1mg/mL胰蛋白酶水溶液混合，在37℃下温育24小时。另外作为对照，将不含有胰蛋白酶的单一缓冲液与聚合物水溶液同样地混合，在37℃下温育24小时。将温育后的混合溶液在98℃下温育5分钟，使胰蛋白酶失活。将该混合溶液与含有iNOS酶(Sigma-Aldrich)的缓冲液混合，在37℃下温育24小时，然后通过Griess法(Dojindo，产品编码NK05)定量亚硝酸离子(NO2 -)。结果可确认，只有实施例6中合成的PEG-b-P(L-Arg)嵌段共聚物在胰蛋白酶处理后显著产生NO (图15)。可知该NO产生量与同浓度含有PEG均聚物(分子量12,000)和L-精氨酸的体系为相同程度。
<试验2>
由巨噬细胞产生NO的评价
使用RAW264.7巨噬细胞(美国典型培养物保藏中心，ATCC(U.S.A.))。培养基使用加入了10%胎牛血清(FBS)和抗生素(氨苄青霉素、链霉素、新霉素)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)。在24孔板上以5,000细胞/孔的细胞密度接种RAW264.7巨噬细胞，在37℃、5%CO2浓度下温育一夜。然后将按照实施例9的方法制备的PIC胶束水溶液给予孔，使胶束中的精氨酸浓度为1mM的浓度，温育72小时。然后加入10ng/mL浓度的脂多糖(LPS)，温育6小时，激活巨噬细胞。温育后回收孔中的上清培养基，按照与试验1同样的程序定量亚硝酸离子。结果确认，只有在包含实施例6中合成的PEG-b-P(L-Arg)嵌段共聚物和硫酸软骨素的PIC胶束(L-PArg-CS/m，C/A=1)下，由被LPS激活的巨噬细胞显著产生NO(图16)。即使给予包含实施例7、8中合成的其它PEG-b-P(D-Arg)嵌段共聚物和PEG-b-P(L-Lys-Gua)嵌段共聚物以及硫酸软骨素的PIC胶束(D-PArg-CS/m和L-PLys-Gua/m)，也未观察到由被LPS激活的巨噬细胞显著产生NO。根据以上，发现只有PEG-b-P(L-Arg)嵌段共聚物显著地与巨噬细胞中的iNOS酶反应，产生NO。
<试验3>
对荷癌小鼠的抗肿瘤活性评价
通过包含实施例6中合成的PEG-b-P(L-Arg)嵌段共聚物和硫酸软骨素C的PIC胶束(L-PArg-CS/m，C/A=1)的静脉给予，评价对荷癌小鼠的抗肿瘤活性。L-PArg-CS/m水溶液如实施例9地制备。将5周龄的Balb/c小鼠(♂)分成1组4只，在从入手至本实验结束的期间，在室温25℃(±1℃))、湿度50%、12小时明暗周期的条件下进行饲养，饵料和水自由摄取。在该小鼠的右后肢大腿部接种1×105细胞/mL细胞密度的Colon-26癌细胞100μL。肿瘤组织的大小用游标卡尺测定，以肿瘤体积(mm3)=[短轴(mm)]2×[長轴(mm)]×0.52表示。肿瘤体积平均超过100mm3时，如下所述给予L-PArg-CS/m水溶液。
组1：给予1次100μL生理盐水(PBS)
组2：给予1次100μL L-PArg-CS/m(精氨酸浓度16mg/kg)
组3：自最初给予100μL L-PArg-CS/m之日起隔日给予，共给予2次(精氨酸浓度16mg/kg)
组4：自最初给予100μL L-PArg-CS/m之日起隔日给予，共给予3次(精氨酸浓度16mg/kg)
组5：自最初给予100μL L-PArg-CS/m之日起隔日给予，共给予4次(精氨酸浓度16mg/kg)
给予后，每隔3天测定肿瘤体积和小鼠的体重。图17表示小鼠的相对体重变化。如图所示，本发明中制备的L-PArg-CS/m(组2至5)与对照(组1)相比，未见体重显著减少，因此可知，没有来自PIC胶束的毒性。另外肿瘤体积变化如图18所示。组2和3中，肿瘤生长速度比对照显著增加。这可认为原因在于，如试验3中所见的NO产生的增加导致肿瘤内NO浓度增加，但并不是显示抗肿瘤活性的程度，相反促进了血管新生。组4与对照相比未有显著差异。组5与对照相比，肿瘤生长速度显著延迟。这可认为是，通过如试验3中所见的NO产生量的增加，诱导癌细胞凋亡，结果抑制了肿瘤的生长。
1.聚(L-Arg)-聚乙二醇-聚(L-Arg)(PArg-PEG-PArg)的合成
PArg-PEG-PArg通过聚(L-鸟氨酸)-聚乙二醇-聚(L-鸟氨酸)(POrn-PEG-POrn)的胍基化制备。
该POrn-PEG-POrn经由N-δ-苄氧羰基-L-鸟氨酸的N-羧酸酐(L-Orn(Z)-NCA)向PEG(NH2-PEG-NH2；Mn=10,000) 的α,ω-NH2基开环聚合、接着使保护基团离去而合成。
实施例10
聚(L-Arg)-b-聚乙二醇-b-聚(L-Arg)(PArg-b-PEG-b-PArg)的合成
PArg-b-PEG-b-PArg通过聚(L-鸟氨酸)-聚乙二醇-聚(L-鸟氨酸)(POrn-b-PEG-b-POrn)的胍基化制备。需说明的是，表示嵌段共聚物的“-b-”以下简写为“-”。
该POrn-PEG-POrn经由N-δ-苄氧羰基-L-鸟氨酸的N-羧酸酐(L-Orn(Z)-NCA)向PEG(NH2-PEG-NH2；Mn=10,000)的α,ω-NH2基开环聚合、接着使保护基团离去而合成。
(1)POrn-PEG-POrn的合成
在氮气氛下、在具备三通止栓的300mL圆底烧瓶中搅拌，由此将NH2-PEG-NH2(2g，0.2mmol)溶解于二甲基甲酰胺(DMF，20mL)中。在另一100mL烧瓶中，使用N2吹扫的针筒将溶解于20mL DMF的Nδ-苄氧基羰基-L-鸟氨酸酐(L-Orn(Z)-NCA；2g，6.85mmol)加入到NH2-PEG-NH2溶液中。将干燥氮气氛下的反应混合物在30℃油浴中搅拌48小时。反应后在冰浴中使用15倍过量的二乙醚(600mL)使反应混合物沉淀，接着过滤。将回收的聚合物用二乙醚再次沉淀，除去杂质。以白色固体的形式得到POrn(Z)-PEG-POrn(Z)(2.6g)。该固体的1H-NMR分析结果如图19所示。
将所得POrn(Z)-PEG-POrn(Z)(2.6g)溶解于三氟乙酸(TFA，15mL)，加入氢溴酸(HBr，4.5mL)，在冰浴中搅拌4小时。接着滴加三乙胺(TEA，15mL)，除去过量的酸。接着，悬浮物用蒸馏水(100mL)稀释，接着使用预先溶胀的半透膜管(MWCO=3500)相对于水透析3天。进一步连续地相对于0.01HCl、蒸馏水继续透析，将TFA型POrn-PEG-POrn转换为HCl型，然后冷冻干燥。以白色粉末的形式得到POrn-PEG-POrn(2.2g)。该粉末的1H-NMR分析结果如图19所示。
(2)PArg-PEG-PArg的合成
PArg-PEG-PArg通过使用N,N’-双(叔丁氧基羰基)-1H-吡唑-1-甲脒(PCX(Boc2))对POrn-PEG-POrn中POrn链段的侧链δ-氨基进行胍基化、接着进行Boc基的脱保护来获得。
简单地说，将POrn-PEG-POrn(1g，0.7mmol)和PCX(Boc2)(1g、3.2mmol)溶解于含N,N-二异丙基乙基胺(0.5mL，3mmol)的N-甲基吡咯烷酮(20mL)，在室温下搅拌24小时。反应后使混合物在冰浴中用15倍过量的二乙醚(300mL)沉淀，接着过滤。将回收的聚合物(PArg(Boc2)-PEG-PArg(Boc2))用二乙醚二次再沉淀，除去杂质。得到聚合物(1.1 g)，其1H-NMR分析结果如图20所示。将这样得到的PArg(Boc2)-PEG-PArg(Boc2)溶解于TFA(10mL)，在室温下搅拌8小时。接着滴加TEA(15mL)，除去过量的酸。接着将悬浮物用蒸馏水(100mL)稀释，相对于0.01HCl、接着相对于蒸馏水进行透析，然后冷冻干燥。以白色粉末的形式得到0.9gPArg-PEG-PArg。该粉末的1H-NMR分析结果如图20所示。
参考例
反应性氧物类(ROS)捕获性聚合物(PMNT-PEG-PMNT)的合成
通过使用硫烷基(sulphanyl)-聚乙二醇-硫烷基(HS-PEG-SH；Mn=10,000)作为调聚剂的氯甲基苯乙烯的自由基调聚反应来合成聚(氯甲基苯乙烯)-聚乙二醇-聚(氯甲基苯乙烯)(PCMS-PEG-PCMS)。接着经由4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶1氧基(4-氨基-TEMPO)的氨基与PCMS-PEG-PCMS嵌段共聚物中的氯化苄基团之间的相互作用，将氯甲基转换为TEMPO。具体请参照WO2015/118993A。
实施例11
聚离子复合物(PIC)的制备和凝胶化
将聚阳离子性聚合物PArg-PEG-PArg和PMNT-PEG-PMNT溶解于磷酸缓冲液(pH6.2，100mM)。将聚阴离子性聚合物聚丙烯酸(PAAc)或硫酸软骨素(CS)也溶解于磷酸缓冲液(pH6.2，100mM)。在聚阳离子性聚合物溶液中加入聚阴离子性聚合物，制备聚离子复合物(阴离子:阳离子比为1:1)。将混合物在室温下搅拌30分钟，进行这样形成的PIC胶束颗粒的动态光散射(DLS)测定。结果表示在下述表1中。
[表1]
接着将10mg/mL PIC溶液通过离心旋转蒸发器浓缩至所需浓度(45～60mg/mL)，这样浓缩的PIC在生理学条件下(37℃)发生凝胶化的结果如图21所示。由该结果可知，上述PIC胶束在体温下有效地凝胶化。
<试验4>
体外血管新生的评价
通过使用低生长因子型基质胶(growth-factor-reduced-Matrigel)(BDBiosciences)的人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)管检测来评价Arg-PEG-PArg/CS复合物的血管新生促进性。
简单来讲，按照制备厂商的规程，在冷室温(4℃)下将基质胶解冻过夜。将基质胶液(10μL)加入到腔室载玻片(μ-slide)(同上)上，在37℃的温育器中保持30分钟，使其聚合。接着在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中，将HUVEC悬浮液(5×103细胞/孔)缓慢加入到Arg-PEG-PArg/CS复合物存在或不存在下的基质胶层上。使用血管内皮细胞生长因子(VEGF)作为阳性血管新生促进剂。在5%CO2下、在37℃下温育4小时，然后小心地除去DMEM，然后将含有钙黄绿素(calcein)AM(10μg/mL)的新鲜的DMEM加入到基质胶层上。温育15分钟后在荧光显微镜下观察管的形成，通过ImageJ软件的血管新生分析装置插件进行分析。所得结果是，PEG-PArg/CS和PArg-PEG-PArg/CS显示在HUVEC中形成管。结果如图22所示。需说明的是，图中，PIC(di)是指来自按照上述实施例9制备的PEG-PArg二嵌段共聚物的PIC，PIC(tri)是指来自PArg-PEG-PArg三嵌段共聚物的PIC。
如图22所示，可知PEG-PArg、PArg-PEG-PArg均诱发HUVEC的管形成。
试验5
心肌梗塞小鼠中以PMNT-PEG-PMNT/PArg-PEG-PArg为基质的可注射水凝胶的评价
将心脏左前降支(LAD)结扎诱发心肌梗塞(MI)小鼠。自Charles River Japan购入雄性7～8周龄ICR小鼠(体重32～35g)。将这些小鼠在温度(23±1℃)、湿度(50±5%)和明暗(12小时明暗周期)控制下的筑波大学实验动物设施中饲养。使这些动物可自由摄取饲料和水。全部实验均按照筑波大学的动物实验用规则实施。将LAD用8-0丝缝合线结扎，然后将浓缩PIC溶液(40μL，PMNT-PEG-PMNT/PArg-PEG-PArg+PAAc)在缝合线部位注入心脏内。MI后第1周和第4周进行心脏超声检查。心脏功能通过左心室射血分数的测定来评价，梗塞的尺寸由组织学评价来确定。如图23和24所示，以PMNT-PEG-PMNT/PArg-PEG-PArg为基质的可注射凝胶处置小鼠与未处置小鼠相比，显著改善了心脏功能。需说明的是，图中，凝胶1是PMNT-PEG-PMNT/PArg-PEG-PArg+PAAC(30mg/mL)的数据，凝胶2是PMNT-PEG-PMNT/PArg-PEG-PArg+PAAC(60mg/mL)的数据。
关于图24，通过1天4%(v/v)缓冲甲醛和2天70%(v/v)醇将心脏组织固定后进行石蜡包埋，接着制备这些组织的5μm厚度薄片，进行Masson三色染色。这是在光学显微镜下对这样的生物试样的组织学特征进行试验的结果。
产业实用性
根据本发明，PIC胶束并没有限定，例如可作为用于处置肿瘤的药剂使用，至少可在制药产业应用。

Claims (11)

1.聚离子复合物，它是含有聚阳离子性聚合物和聚阴离子性聚合物而成的聚离子复合物(PIC)，其中，聚阳离子性聚合物为式(I)所示的共聚物：
式中，A如下：
(i)表示氢、未取代或取代C1-C12烷基，被取代时的取代基表示甲酰基、式R1R2CH-的基团，这里，R1和R2独立地表示C1-C4烷氧基，或者R1与R2一起表示-OCH2CH2O-、-O(CH2)3O-或-O(CH2)4O-，或者
(ii)表示式
，
L和L’独立地表示连接基团，
Y和Y’独立地表示H、C1-21烷基羰基、取代C1-4烷基羰基、未取代或取代C3-7环烷基羰基、未取代或取代芳基羰基、或者未取代或取代五或六元杂芳基羰基，这里，取代C1-4烷基羰基的取代基选自卤素原子、羟基、羧基、未取代或取代C3-7环烷基、未取代或取代芳基和未取代或取代五或六元杂芳基、未取代或取代金刚烷基、未取代或取代胆甾醇残基，这些取代基被取代时的取代基可以是C1-4烷基、C1-4烷基氧基、羟基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、或者单C1-4烷基氨基或二C1-4烷基氨基，
m和m’独立地为5～300的整数，
n为5～1,000的整数，
式中的m或m’个脒基(C(=NH)NH2)的最大80%可以是H；
聚阴离子性聚合物选自聚阴离子性多糖、聚阴离子性多肽、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸；且
所述PIC溶解或分散于水时是平均粒径为纳米(nm)级的PIC胶束的形态。
2.权利要求1所述的聚离子复合物，其中，A由(i)定义。
3.权利要求1所述的聚离子复合物，其中，A由(ii)定义。
4.组合物，其含有权利要求1～3中任意一项所述的聚离子复合物作为有效成分，用于提供诱导型NO合酶的底物L-Arg，所述诱导型NO合酶来自哺乳动物组织中被激活的细胞。
5.权利要求4所述的组合物，其中，哺乳动物组织中被激活的细胞是肿瘤组织内或附近的巨噬细胞。
6.权利要求4所述的组合物，其中，哺乳动物组织中被激活的细胞是伴随心肌内的炎症而被激活的巨噬细胞。
7.组合物，其含有权利要求1～3中任意一项所述的聚离子复合物作为有效成分，用于预防或治疗哺乳动物组织中的肿瘤。
8.嵌段共聚物的制备方法，所述嵌段共聚物由式(I)表示：
式中，A如下：
(i)表示氢、未取代或取代C1-C12烷基，被取代时的取代基表示甲酰基、式R1R2CH-的基团，这里，R1和R2独立地表示C1-C4烷氧基，或者R1和R2一起表示-OCH2CH2O-、-O(CH2)3O-或-O(CH2)4O-，或者
(ii)表示式
，
L和L’独立地表示连接基团，
Y和Y’独立地表示H、C1-21烷基羰基、取代C1-4烷基羰基、未取代或取代C3-7环烷基羰基、未取代或取代芳基羰基、或者未取代或取代五或六元杂芳基羰基，这里，取代C1-4烷基羰基的取代基选自卤素原子、羟基、羧基、未取代或取代C3-7环烷基、未取代或取代芳基和未取代或取代五或六元杂芳基、未取代或取代金刚烷基、未取代或取代胆甾醇残基，这些取代基被取代时的取代基可以是C1-4烷基、C1-4烷基氧基、羟基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、或者单C1-4烷基氨基或二C1-4烷基氨基，
m和m’独立地为5～300的整数，
n为5～1,000的整数，
式中的m或m’个脒基(C(=NH)NH2)的最大80%可以是H；
所述制备方法包括以下步骤：根据需要在反应惰性溶剂中，使N,N’-双(叔丁氧基羰基)-1H-吡唑-1-甲脒与式(II)所示的嵌段共聚物反应，将来自鸟氨酸的链段中的δ-氨基进行胍基化
式中，A如下：
(i)’与对于上式(I)的(i)定义的一样，或者
(ii)’表示式
，
L、L’、Y、Y’、n、m、m’与对于上式(I)定义的一样。
9.权利要求8所述的嵌段共聚物的制备方法，其中，式(II)的A由(i)’定义。
10.权利要求8所述的嵌段共聚物的制备方法，其中，式(II)的A由(ii)定义。
11.共聚物，该共聚物由式(III)
表示，式中，
L和L’独立地表示连接基团，
Y和Y’独立地表示H、C1-21烷基羰基、取代C1-4烷基羰基、未取代或取代C3-7环烷基羰基、未取代或取代芳基羰基、或者未取代或取代五或六元杂芳基羰基，这里，取代C1-4烷基羰基的取代基选自卤素原子、羟基、羧基、未取代或取代C3-7环烷基、未取代或取代芳基和未取代或取代五或六元杂芳基、未取代或取代金刚烷基、未取代或取代胆甾醇残基，这些取代基被取代时的取代基可以是C1-4烷基、C1-4烷基氧基、羟基、羧基、氰基、硝基、卤素原子、或者单C1-4烷基氨基或二C1-4烷基氨基，
m和m’独立地为5～300的整数，
n为5～1,000的整数，
式中的m或m’个脒基(C(=NH)NH2)的最大80%可以是H。
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