CN102016058A - 与具有c端元件的肽和蛋白相关的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

公开了用于将分子靶向和内化至目的细胞以及用于分子穿透目的组织的组合物和方法。所述组合物和方法是基于可被细胞选择性地内化以及/或者可穿透组织的肽序列。所公开的内化和组织穿透可用于将治疗试剂和可检测试剂递送至目的细胞和组织。

Description

与具有C端元件的肽和蛋白相关的方法和组合物
本申请要求享有2008年2月21日提交的美国临时申请No.61/030,409的权益。2008年2月21日提交的申请No.61/030,409通过引证的方式全部纳入本文。
有关联邦资助研究的声明
本发明的完成受到来自美国NIH国立癌症研究所(National Cancer Institute)的基金CA104898、CA 119414、CA 119335、CA124427、CA115410和30199以及来自美国国防部(Department of Defense)的基金BC 076050的政府资助。政府享有本发明的某些权利。
技术领域
本发明在广义上涉及分子医学领域，更具体而言，涉及细胞和组织穿透肽。
背景技术
可内化至细胞中的肽主要是指细胞穿透肽。主要有两类这种肽：疏水型和阳离子型(Zorko and Langel，2005)。阳离子型肽通常用于将核酸、蛋白导入细胞中，其包括原型的细胞穿透肽Tat和penetratin(Meade and Dowdy，2007；Derossi et al.，1998)。疱疹病毒蛋白VP22能够进入细胞及离开细胞，并且能够随其携带负载(Elliott and O’Hare，1997；Brewis et al.，2003)。这些肽作为递送载体的主要局限是它们是非选择性的；它们可进入所有细胞。可以使用对一种细胞类型或组织特异性更高的可活化递送体系。
细胞穿透递送载体在许多方面都很重要。首先，内化可以改善靶向作用，这是因为肽及其负载内化至细胞可使得归巢更有效(Christian et al.，2003；Laakkonen et al.，2004；Weissleder at al.，1995)。第二，细胞穿透靶向元件可将负载带进细胞质中，这在例如基于核酸递送的疗法中是至关重要的。第三，细胞穿透性质与离开能力可以增加外渗和组织扩散。
对于将组合物递送至细胞而言，组织穿透是严重限制因素。荧光素标记肽的分布与以相同肽涂覆的氧化铁颗粒的分布的比较结果显示，所述颗粒保持在肿瘤血管近处，而荧光肽则到达肿瘤的所有区域。经常引述的肿瘤血管“渗漏”似乎不能在本质上缓解该问题。而且，抗血管生成治疗可造成肿瘤血管的“正常化”(Jain，2005)，由此需要靶向血管未渗漏的肿瘤。因此，重要的是寻求能改善不同组合物到达血管外空间的通道的新方法。已知大量蛋白可透过血管内皮，包括血脑屏障。一个主要实例为运铁蛋白，它被运铁蛋白受体携带通过血脑屏障。该体系已被用于将其他负载带入脑中(Li et al.，2002；Fenart and Cecchelli，2003)。可介导组合物从循环系统转位至组织中的用于内皮转胞吞的肽信号物是有用的。
因此，需要新的治疗策略，用于选择性靶向不同细胞类型，用于将蛋白和肽内化至这些细胞中以及用于蛋白和肽的组织穿透。本发明通过提供可以被不同细胞类型选择性靶向及选择性内化并且/或者可穿透组织的肽而满足该要求。本发明还提供了相关的优点。
发明内容
公开了CendR元件以及包含CendR元件的蛋白和肽。还公开了如下CendR缀合物：其包含共价偶联于或非共价缔合于包含一个CendR元件的蛋白或肽的运载组合物。还公开了如下CendR缀合物：其包含共价偶联于或非共价缔合于一种包含所选择的氨基酸序列的蛋白或肽的运载组合物，其中所述氨基酸序列包含一个CendR元件。所述运载组合物可以偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。
还公开了可活化的CendR元件和包含可活化的CendR元件的蛋白和肽。还公开了如下可活化的CendR缀合物：其包含共价偶联于或非共价缔合于包含可活化的CendR元件的蛋白或肽的运载组合物。还公开了如下可活化的CendR缀合物：其包含共价偶联于或非共价缔合于一种包含所选择的氨基酸序列的蛋白或肽的运载组合物，其中所述氨基酸序列包含可活化的CendR元件。所述运载组合物可以偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述可活化CendR元件的N端侧。
还公开了通过这样的方法制备的CendR缀合物，即该方法包括使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于一种包含CendR元件的蛋白或肽，其中所述运载组合物偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。还公开了通过这样的方法制备的CendR缀合物，即该方法包括使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于一种包含所选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述氨基酸序列包含C端元件，其中所述运载组合物偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。还公开了通过这样的方法制备的CendR缀合物，即该方法包括(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或穿透组织，其中所述氨基酸序列包含C端元件，以及(b)使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于包含所述选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述运载组合物偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。所述CendR缀合物可以包含所述蛋白或肽以及所述偶联或缔合的运载组合物。
还公开了通过这样的方法制备的可活化的CendR元件，即该方法包括使一个封闭基团共价偶联于一个CendR元件，其中偶联所述封闭基团和所述CendR元件的键是可切割的。还公开了通过这样的方法制备的可活化的CendR元件，即该方法包括使一个封闭基团共价偶联于一条氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含一个CendR元件，其中偶联所述封闭基团和所述CendR元件的键是可切割的。还公开了通过这样的方法制备的可活化的CendR元件，即该方法包括(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或穿透组织，其中所述氨基酸序列包含CendR元件，以及(b)使一个封闭基团共价偶联于所述CendR元件，其中偶联所述封闭基团和所述CendR元件的键是可切割的。共价偶联于所述CendR元件的所述封闭基团可减少或阻止细胞内化和/或组织穿透。与无封闭基团的相同CendR元件相比，共价偶联于所述CendR元件的所述封闭基团可减少或阻止细胞内化和/或组织穿透。所述可活化的CendR元件可以包含所述选择的氨基酸序列和所述封闭基团。
在所述蛋白或肽中存在所述CendR元件时，所述蛋白或肽可以内化至细胞中/或穿透组织，但在所述蛋白或肽中不存在所述CendR元件时，所述蛋白或肽不内化至细胞中及/或穿透组织。在所述蛋白或肽中存在所述选择的氨基酸序列时，所述蛋白或肽可以内化至细胞中及/或穿透组织，但在所述蛋白或肽中不存在所述选择的氨基酸时，所述蛋白或肽不内化至细胞中及/或穿透组织。所述CendR元件可以不与所述运载组合物缔合而内化至细胞中并/或可以穿透组织。所述选择的氨基酸序列可以不与所述运载组合物缔合而内化至细胞中并/或可以穿透组织。所述CendR元件可以是所述蛋白或肽中仅有的功能性内化元件，所述CendR元件可以是所述蛋白或肽中仅有的功能性组织穿透元件，或者所述CendR元件可以是所述蛋白或肽中仅有的功能性内化元件和功能性组织穿透元件。所述选择的氨基酸序列可以是所述蛋白或肽中仅有的功能性内化元件，所述选择的氨基酸序列可以是所述蛋白或肽中仅有的功能性组织穿透元件，或者所述选择的氨基酸序列可以是所述蛋白或肽中仅有的功能性内化元件和功能性组织穿透元件。所述CendR元件可以是所述CendR缀合物中仅有的功能性内化元件，所述CendR元件可以是所述CendR缀合物中仅有的功能性组织穿透元件，或者所述CendR元件可以是所述CendR缀合物中仅有的功能性内化元件和功能性组织穿透元件。所述选择的氨基酸序列可以是所述CendR缀合物中仅有的功能性内化元件，所述选择的氨基酸序列可以是所述CendR缀合物中仅有的功能性组织穿透元件，或者所述选择的氨基酸序列可以是所述CendR缀合物中仅有的功能性内化元件和功能性组织穿透元件。
所述CendR元件可以是可活化的CendR元件。所述CendR元件可以是蛋白酶可活化的CendR元件。所述蛋白或肽可以为环形(圆形)或者可以含有环。所述CendR元件可位于所述蛋白或肽的C末端。所述CendR元件可以包含末端羧基。可以将一个封闭基团偶联于所述末端羧基。选择偶联所述封闭基团和所述末端羧基的键以便可被存在于目的细胞附近的蛋白酶切割。所述封闭基团可以偶联于所述CendR元件的C端氨基酸。所述封闭基团可以偶联于所述CendR元件C端氨基酸之外的所述CendR元件的氨基酸。
运载组合物可以共价偶联于或非共价缔合于一种包含所选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述氨基酸序列可以包含CendR元件。所述运载组合物可以偶联或缔合于所述蛋白或肽，例如位于所述CendR元件的N端侧。所述运载组合物可以为例如应用于治疗或诊断的纳米颗粒、分子或分子复合物。可以通过CendR元件靶向的治疗性运载组合物包括但不限于纳米颗粒、分子、分子复合物、抗血管生成剂、促血管生成剂、癌症化学治疗剂、细胞毒剂、促细胞存活剂、细胞分化剂、神经保护剂、免疫调节剂、抗炎剂、抗关节炎剂、抗病毒剂或它们的结合。可以通过CendR元件靶向的诊断性运载组合物包括但不限于纳米颗粒、分子、分子复合物、MRI显象剂、放射显象剂、光学显象剂、分子标签(例如生物素)、荧光团、表位标签(例如，它可以用特异性分子测定来检测)或它们的结合。所述运载组合物可以包含归巢序列。所述运载组合物可以选择性地归巢于肿瘤或其他靶组织。所述运载组合物可以选择性地归巢于肿瘤或其他靶组织的血管。
还公开了形成CendR缀合物的方法，所述方法包括使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于包含CendR元件的蛋白或肽，其中所述运载组合物偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。还公开了形成CendR缀合物的方法，所述方法包括使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于一种包含所选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述氨基酸序列包含CendR元件，其中所述运载组合物偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。还公开了形成CendR缀合物的方法，所述方法包括(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或穿透组织，其中所述氨基酸序列包含CendR元件，以及(b)使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于一种包含所述选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述运载组合物偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。所述CendR缀合物可以包含所述蛋白或肽以及所述偶联或缔合的运载组合物。
还公开了将运载组合物递送至细胞的方法，所述方法包括将所述细胞暴露于一种CendR缀合物，其中所述CendR元件包含共价偶联于或非共价缔合于一个CendR元件的运载组合物，其中所述CendR缀合物然后可以进入所述细胞，从而将所述运载组合物递送至所述细胞。还公开了将运载组合物递送至细胞的方法，所述方法包括将所述细胞暴露于一种CendR缀合物，其中所述CendR元件包含一种共价偶联于或非共价缔合于一种包含CendR元件的蛋白或肽的运载组合物，其中所述CendR缀合物然后可以进入所述细胞，从而将所述运载组合物递送至所述细胞。还公开了将运载组合物递送至细胞的方法，所述方法包括(a)将一个CendR元件偶联于所述运载组合物，从而形成一种CendR缀合物；以及(b)将所述细胞暴露于所述CendR缀合物，其中所述CendR缀合物然后可以进入所述细胞，从而将所述运载组合物递送至所述细胞。
还公开了鉴定能内化CendR元件的细胞的方法，所述方法包括(a)将一种细胞暴露于一个CendR元件，以及(b)确定所述CendR元件是否被内化。还公开了鉴定一种癌细胞作为基于CendR的疗法的候选物的方法，所述方法包括(a)将所述癌细胞暴露于一个CendR元件，以及(b)确定所述CendR元件是否被所述癌细胞内化，其中内化的CendR元件将所述癌细胞鉴定为基于CendR的疗法的候选物。所述细胞可以在一个测定中。所述CendR元件可以偶联于一种蛋白或肽。所述CendR元件可以是可活化的CendR元件。所述可活化的CendR元件可以在暴露于所述细胞之前活化。所述可活化的CendR元件可以是蛋白酶可活化的CendR元件。所述蛋白或肽可以是环形的。所述CendR元件可以位于所述蛋白或肽的C末端。
还公开了鉴定可以被CendR元件穿透的组织的方法，所述方法包括(a)将一种组织暴露于一个CendR元件，以及(b)确定所述CendR元件是否穿透所述组织。还公开了鉴定一种肿瘤作为基于CendR的疗法的候选物的方法，所述方法包括(a)将来自所述肿瘤的细胞暴露于一个CendR元件，以及(b)确定所述CendR元件是否被所述细胞内化，其中内化的CendR元件将所述肿瘤鉴定为基于CendR的疗法的候选物。还公开了鉴定一种肿瘤作为基于CendR的疗法的候选物的方法，所述方法包括(a)将所述肿瘤暴露于一个CendR元件，以及(b)确定所述CendR元件是否穿透所述肿瘤，其中穿透的CendR元件将所述肿瘤鉴定为基于CendR的疗法的候选物。所述肿瘤可以在一个测定中。所述CendR元件可以偶联于蛋白或肽。所述CendR元件可以是可活化CendR元件。所述可活化的CendR元件可以在暴露于所述肿瘤之前活化。所述可活化的CendR元件可以是蛋白酶可活化的CendR元件。所述蛋白或肽可以是环形的。所述CendR元件可以位于所述蛋白或肽的C末端。
还公开了产生可以在目的细胞附近被活化的可活化CendR元件的方法，所述方法包括形成一个可活化的CendR元件，其中将一个封闭基团经可切割键偶联于一个CendR元件，其中所述可切割键可被存在于目的细胞附近的酶切割。所述细胞可以在受试者中。可以鉴定存在于目的细胞附近的酶。可以在形成所述可活化的CendR元件之前，鉴定存在于目的细胞附近的酶。可以基于存在于目的细胞附近的酶选择所述可切割键。可以在形成所述可活化放入CendR元件之前选择所述可切割键。所述CendR元件可以包含末端羧基，其中所述封闭基团偶联于所述末端羧基。
还公开了形成可活化的CendR元件的方法，所述方法包括使一个封闭基团共价偶联于一个CendR元件，其中偶联所述封闭基团和所述CendR元件的键是可切割的。还公开了形成可活化的CendR元件的方法，所述方法包括使一个封闭基团共价偶联于一条氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含一个CendR元件，其中偶联所述封闭基团和所述CendR元件的键是可切割的。还公开了形成可活化的CendR元件的方法，所述方法包括(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或穿透组织，其中所述氨基酸序列包含一个CendR元件，以及(b)使一个封闭基团共价偶联于所述CendR元件，其中偶联所述封闭基团和所述CendR元件的键是可切割的。共价偶联于所述CendR元件的所述封闭基团可减少或阻止细胞内化和/或组织穿透。与无封闭基团的相同CendR元件相比，共价偶联于所述CendR元件的所述封闭基团可以减少或阻止细胞内化和/或组织穿透。所述可活化的CendR元件可以包含所述选择的氨基酸序列和所述封闭基团。所述细胞可以在受试者中。可以鉴定存在于目的细胞附近的酶。可以在形成所述可活化CendR元件之前鉴定存在于目的细胞附近的酶。可以基于存在于目的细胞附近的酶选择所述可切割键。可以在形成所述可活化CendR元件之前选择所述可切割键。所述CendR元件可以包含末端羧基，其中所述封闭基团偶联于所述末端羧基。运载组合物可以共价偶联于或非共价缔合于一种包含所述选择的氨基酸序列的蛋白或肽。所述运载组合物可以偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。
本文公开了一种形成CendR缀合物的方法，所述方法包括选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中，其中所述氨基酸序列包含C端元件；以及使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于一种包含所述选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述选择的氨基酸序列位于所述蛋白或肽的C末端，其中所述CendR缀合物包含所述蛋白或肽以及所述偶联或缔合的运载组合物。
公开了一种制备CendR缀合物的方法，包括：(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中，其中所述氨基酸序列包含一个C端元件，(b)使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于一种包含所述选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述选择的氨基酸序列位于所述蛋白或肽的C末端，其中所述CendR缀合物包含所述蛋白或肽以及所述偶联或缔合的运载组合物。
还公开了一种将运载组合物递送至细胞的方法，所述方法包括：(a)将一个CendR元件偶联于所述运载组合物，从而形成一种CendR缀合物；以及(b)将所述细胞暴露于所述CendR缀合物，其中所述CendR缀合物然后可以进入所述细胞，从而将所述运载组合物递送至所述细胞。
还公开了一种使运载组合物穿透组织的方法，所述方法包括：(a)将一个CendR元件偶联于所述运载组合物，从而形成一种CendR缀合物；以及(b)将所述组织暴露于所述CendR缀合物，其中所述CendR缀合物然后可以进入并离开所述组织中的细胞，从而使所述运载组合物穿透所述组织。
又公开了一种将运载组合物递送至细胞的方法，所述方法包括：(a)将一个可活化的CendR元件偶联于所述运载组合物，从而形成一种CendR缀合物；以及(b)将所述细胞暴露于所述CendR缀合物，于是切割剂可活化所述CendR缀合物的可活化CendR元件，其中所述CendR缀合物然后可以进入所述细胞，从而将所述运载组合物递送至所述细胞。
再公开了一种使运载组合物穿透组织的方法，所述方法包括：(a)将一个可活化的CendR元件偶联于所述运载组合物，从而形成一种CendR缀合物；以及(b)将所述组织暴露于所述CendR缀合物，于是切割剂可活化所述CendR缀合物的可活化CendR元件，其中所述CendR缀合物然后可以进入和离开所述组织中的细胞，从而使所述运载组合物穿透所述组织。
还公开了一种鉴定可以内化CendR元件的细胞的方法，所述方法包括：(a)将一种细胞暴露于一个CendR元件；以及(b)确定所述CendR元件是否被内化。例如，所述细胞可以在一个测定中。所述CendR元件可以偶联于一种运载组合物，例如蛋白或肽，从而形成CendR缀合物。
还公开了一种鉴定可以内化可活化的CendR元件的细胞的方法，所述方法包括：(a)将一种细胞暴露于一个可活化的CendR元件；(b)确定所述可活化的CendR元件是否被内化。所述可活化的CendR元件可以在暴露于所述细胞之前脱封闭，但不需要如此。例如，这可以用于测试所述封闭剂的封闭能力。所述可活化的CendR元件还可以为蛋白酶活化的CendR元件。
还公开了一种鉴定癌细胞作为基于CendR的疗法的候选物的方法，所述方法包括：(a)将所述癌细胞暴露于一个CendR元件；以及(b)确定所述CendR元件是否被所述癌细胞内化，其中内化的CendR元件将所述癌细胞鉴定为基于CendR的疗法的候选物。例如，所述细胞可以在一个测定中，或者可以在受试者中。所述CendR元件可以偶联于一种运载组合物例如蛋白或肽，从而形成CendR缀合物。
还公开了一种鉴定肿瘤作为基于CendR的疗法的候选物的方法，所述方法包括：(a)将来自所述肿瘤的组织暴露于一个CendR元件；以及(b)确定所述CendR元件是否通过所述组织或者被所述组织中的细胞内化，其中通过的CendR元件或被内化的CendR元件将所述肿瘤鉴定为基于CendR的疗法的候选物。
还公开了一种产生可以在目的细胞附近活化的可活化CendR元件的方法，所述方法包括形成一个可活化CendR元件，其中将一个封闭基团经可切割键偶联于一个CendR元件，其中所述可切割键可被存在于目的细胞附近的酶切割。该方法还可以包括在形成所述可活化CendR元件之前鉴定存在于目的细胞附近的酶。该方法还可以包括在形成所述可活化CendR元件之前基于存在于目的细胞附近的酶选择所述可切割键。
还公开了一种形成可活化的CendR元件的方法，所述方法包括：(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中，其中所述氨基酸序列包含一个C端元件，其中所述C端元件包含末端羧基，以及(b)使一个封闭基团共价偶联于所述选择的氨基酸序列的末端羧基，其中偶联所述封闭基团和所述末端羧基的键是可切割的，其中所述可活化的CendR元件包含所述选择的氨基酸序列和所述封闭基团。该方法还可包括，在步骤(b)之前选择可被存在于目的细胞附近的蛋白酶切割的、偶联所述封闭基团和所述末端羧基的键。
再公开了一种由这样的方法制备的可活化的CendR元件，即该方法包括(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中，其中所述氨基酸序列包含一个C端元件，其中所述C端元件包含末端羧基，以及(b)使一个封闭基团共价偶联于所述选择的氨基酸序列的末端羧基，其中偶联所述封闭基团和所述末端羧基的键是可切割的，其中所述可活化的CendR元件包含所述选择的氨基酸序列和所述封闭基团。该方法还可包括，在步骤(b)之前选择可被存在于目的细胞附近的蛋白酶切割的、偶联所述封闭基团和所述末端羧基的键。
所公开的方法和组合物的其他优点一部分将在下文的描述中阐明，一部分可以从说明书中获知，或者可通过实施所公开的方法和组合物而得知。所公开的方法和组合物的优点将通过所附权利要求书中具体指明的要素和组合实现和获得。应当理解的是，上文的一般性描述和下文的具体描述都仅仅是示例性和解释性的，并不是对本发明要求保护范围的限制。
附图说明
附图包含于本说明书中并构成本说明书的一部分，附图阐述了所公开方法和组合物的一些实施方案，它与文字描述一起用于解释所公开方法和组合物的原理。
图1A、1B和1C示出了对内化肽进行鉴定。图1A：对于T7噬菌体展示，肽的表达形式为主衣壳蛋白GP10的C末端融合物。图1B：在PPC1细胞上进行了4个不同文库(CX7C、X7、RXXRXXX(SEQ ID NO：19)和RXXR(A/P)PRXXX(SEQ ID NO：20))的3轮离体筛选，产生归巢比展示7个连续甘氨酸残基(G7)的对照噬菌体高500-2,500倍的噬菌体库。图1C：对每个文库随机20个噬菌体克隆的测序表明主要存在以C端精氨酸残基结尾的肽，不管初始的文库构型和噬菌体与细胞相互作用中使用的温度如何。对于4℃相应部分，这些序列从表的左上至右下对应于：SEQ ID NO：52-61、132、72-75、133、76、134、77-78、135-144和62-71。对于37℃+酸洗相应部分，这些序列从表的左上至右下对应于：SEQ ID No：82-91、102-111、145-154和92-101。
图2A和2B示出了展示C端精氨酸的T7噬菌体结合于PPC1细胞并被PPC1细胞内化。图2A：T7噬菌体与前列腺癌细胞的结合依赖于C端精氨酸在所述噬菌体颗粒上的展示。在4℃下将PPC1细胞与展示G7肽衍生物(上图)或RPARPAR肽衍生物(SEQ ID NO：2)(下图)的T7细菌噬菌体一起孵育，并通过噬菌斑检测法定量测定结合的噬菌体。结合表示为高于未结合的G7对照噬菌体的倍数。图2B：展示C端精氨酸的噬菌体被内化至培养的PPC1细胞中(箭号：核内化；箭头：细胞质内化)。在37℃下将一组T7噬菌体克隆与培养于胶原涂布的盖玻片上的PPC1细胞一起孵育，以抗T7抗体染色并通过共聚焦显微术成像。
图3显示了RPARPAR(SEQ ID NO：2)-量子点(quantum dot，Q-dot)被PPC1细胞内化。将培养于胶原涂布的盖玻片上的PPC1前列腺癌细胞与以生物素标记的肽涂布的链霉亲和素量子点孵育，然后进行固定，用DAPI对细胞核复染并进行共聚焦成像。以具有游离C端的RPARPAR肽(SEQ ID NO：2)涂布的Q-dot被强内化(浅颜色点)(a)，而以酰胺封闭的C端涂布的Q-dot不结合所述细胞或内化(b)。插图：Q-dot的示意图：用于该研究的量子点具有约20nm的直径，并且可以以每颗粒5-10个肽涂布。
图4显示了胰蛋白酶可活化RPARPARA(SEQ ID NO：3)噬菌体与PPC1细胞的结合。在37℃下将5×108个噬菌体颗粒与标明体积的2.5％胰蛋白酶一起孵育20分钟，随后在4℃下将所述噬菌体与1×106个PPC1细胞一起孵育3小时。结合表示为高于未结合的G7对照噬菌体(其内化不受胰蛋白酶处理的影响)的倍数。
图5显示了iRGD噬菌体和iRGD肽的肿瘤归巢和内化。a.iRGD肽归巢于胰肿瘤。将大约200μg荧胺标记的iRGD肽通过尾静脉注入胰腺导管腺癌(PDAC)小鼠，并使之循环4.5小时。收集器官并在UV光下观察(上图)。下图显示出了相应的亮视野图像。b.iRGD噬菌体广泛地内化至人肿瘤细胞中。在37℃下将展示iRGD肽(主图)或CG7C对照肽(右上窗口)的T7噬菌体与培养于I型胶原涂布的盖玻片上的PPC1细胞一起孵育2小时，以抗T7抗体和质膜标记物染色，并通过共聚焦显微镜成像。观察到iRGD噬菌体(浅颜色点)广泛地内化至所述肿瘤细胞中，而所述对照噬菌体不是这样。
图6显示了具体的细胞内递送中的CendR。将包含潜在CendR基序的归巢肽通过结合于特定受体(例如整联蛋白)带至靶细胞表面，所述肽随后被特定的细胞表面或细胞周蛋白酶切割以暴露所述CendR基序(C端精氨酸)，被递送至广泛存在(ubiquitous)的CendR受体，并被胞吞。具有暴露的CendR基序的肽直接与所述CendR受体相互作用，并被内化。所述CendR通路可以使得所有类型的诊断剂和治疗剂(包括纳米颗粒)高度特异地进行细胞内递送。
图7显示了针对蛋白酶活化的进入信号和离去信号的CendR筛选的示意图。(A)为进行蛋白酶解性进入筛选，CendR元件(RPARPAR，SEQID NO：2)被随机六肽和C端丙氨酸残基掩盖。细胞内存在的噬菌体已被蛋白酶解处理，以暴露CendR元件。(B)为了鉴定离去信号，构建具有暴露的CendR元件的噬菌体文库，所述暴露的CendR元件之前连有随机肽。噬菌体的默认通路是内化，且仅其中随机肽编码离去信号的噬菌体在细胞外。
图8A和8B显示了iRGD具有这样的CendR元件，即它有C端K(赖氨酸)而非C端R(精氨酸)，并且该CendR元件像其他有C端精氨酸的CendR一样发挥作用。iRGD包含CendR元件。图8A：制备了截短形式的iRGD噬菌体并对其内化至PPC1人前列腺癌细胞的作用进行了测试。与天然iRGD噬菌体相比，携带CRGDKG(SEQ ID NO：21)、CRGDK(SEQ ID NO：22)、CR(SEQ ID NO：163)的噬菌体具有更高的内化至PPC1细胞的能力。从左至右，序列为SEQ ID NO：155、SEQID NO：4、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ IDNO：160、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163。图8B：将PPC1细胞与或不与多种浓度的携带iRGD、CRGDK(SEQ ID NO：22)、CR(SEQ ID NO：163)或RPAR(SEQ ID NO：164)的UV失活噬菌体一起预孵育，随后与活CRGDK噬菌体或对照噬菌体(NC5)一起进一步孵育。观察到CRGDK(SEQ IDNO：22)噬菌体的内化被RPAR噬菌体以剂量依赖的方式抑制，表明CRGDK(SEQ ID NO：22)发挥CendR的作用。
图9显示了iRGD能够扩散至肿瘤组织中。将iRGD噬菌体(a)及其对照KGD噬菌体(b)注入至携带自发胰腺导管腺癌的转基因小鼠，并使之循环15分钟。然后将小鼠以含1％BSA的PBS灌注并收集肿瘤。将所述肿瘤的冰冻切片以抗T7噬菌体抗体、抗CD31抗体和DAPI染色。观察到iRGD噬菌体被形成胰肿瘤导管的肿瘤细胞广泛地吸收，而KGD噬菌体保持在一些血管内部且在肿瘤导管中几乎未观察到信号，表明iRGD噬菌体能够外渗并扩散至肿瘤组织中。在图9的2幅图中都以亮色表示着染。
图10A和10B显示了使用噬菌体展示鉴定CendR肽。将一组肽文库(CX7C、X7和RXXRXXX(SEQ ID NO：19))用于在源自PPC-1同位异种移植肿瘤的细胞悬液上进行离体筛选。(图10A)在3轮筛选后，噬菌体库对悬液中肿瘤细胞的结合比对照多甘氨酸七肽(G7)噬菌体高500-1,300倍。(图10B)在3轮噬菌体筛选后回收代表性肽序列。以C端精氨酸结尾的肽占所有测序的噬菌体插入物的97％。对于4℃相应部分，这些序列从表的左上至右下对应于：SEQ ID NO：52-81。对于37℃+酸洗相应部分，这些序列从表的左上至右下对应于：SEQ ID NO：82-111。
图11A-11C显示了CendR内化的结构特征。图11A：G6R和RPARPAR(SEQ ID NO：2)噬菌体与PPC-1细胞的相互作用。在4℃下将细胞与噬菌体一起孵育以评估表面结合(“被结合”)，或者在37℃下孵育后以低pH洗涤以评估噬菌体摄取(“被内化”)。RPARPAR(SEQ IDNO：2)-功能化的q-dot同时抑制了RPARPAR噬菌体的结合和内化，而G7 q-dot无作用。G6R噬菌体未被内化；它与PPC-1细胞的结合被过量RPARPAR(SEQ ID NO：2)q-dot阻断。结合表示为展示多甘氨酸七肽(G7)的对照噬菌体的倍数。图11B：在4℃下RPARPAR(SEQ ID NO：2)衍生噬菌体与PPC-1细胞的结合。数据是4次独立结合实验的代表。除了第一序列和第九序列分别为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3外，所述序列从左至右对应于SEQ ID NO：112-125。统计分析通过学生t检验(Student’s t-test)进行(图11A)。n＝3；误差棒表示标准差(s.d.)；1个星号，p＜0.05；2个星号，p＜0.01。比例尺：20μm。图11C(图c-g)在37℃下与展示肽的噬菌体(亮色点，c-e)或肽涂覆的q-dot(亮色点，f，g)一起孵育2小时的PPC-1细胞的共聚焦显微术：RPARPAR(SEQ IDNO：2)T7(c)、G6R T7(d)、RPARPARA(SEQ ID NO：2)T7(e)、RPARPAR(SEQ ID NO：2)q-dot(f)和RPARPAR-NH2(SEQ ID NO：2)q-dot(g)。在显微照片中，箭头指向表面结合的噬菌体和q-dot；箭号指向内化的颗粒。
图12A和12A显示了RPARPAR(SEQ ID NO：2)、RGERPPR(SEQID NO：27)和RVTRPPR(SEQ ID NO：28)肽的细胞结合和摄取。图12A：共享的通路。在4℃下，展示所有3个串联RXXR(SEQ ID NO：25)肽的噬菌体都以类似的程度与所述PPC-1细胞结合。所述结合被细胞与RPARPAR(SEQ ID NO：2)-功能化的q-dot的预孵育抑制。以七甘氨酸对照肽(G7)涂覆的Q-dot对所述噬菌体结合无作用。统计分析通过学生t检验进行(c)。n＝3；误差棒表示标准差(s.d.)；1个星号，p＜0.05；2个星号，p＜0.01。图12B(图b-i)：在存在109 pfu的以下噬菌体的条件下，培养1小时的PPC-1细胞中噬菌体免疫反应性的共聚焦免疫荧光评估(亮色点)：(b)RPARPAR(SEQ ID NO：2)、(c)RGERPPR(SEQID NO：27)、(d)RVTRPPR(SEQ ID NO：28)、(e)对照G7、(f)存在20μM游离RPARPAR(SEQ ID NO：2)肽情况下的RPARPAR(SEQ IDNO：2)噬菌体、(g)存在200μM游离RPARPAR(SEQ ID NO：2)肽情况下的RPARPAR(SEQ ID NO：2)噬菌体、(h)存在2mM游离RPARPAR(SEQ ID NO：2)肽情况下的RPARPAR(SEQ ID NO：2)噬菌体、(i)存在200μM游离RPARPAR(SEQ ID NO：2)肽情况下的RGERRPR(SEQ ID NO：27)噬菌体。卵形椭圆表示以DAPI复染的核。比例尺：20μm。
图13显示了PPC-1细胞对RPARPAR(SEQ ID NO：2)q-dot的内化(浅色点)：肽修饰的效应。将PPC-1细胞与以如下肽功能化的q-dot一起孵育2小时：(a)RPARPAR(SEQ ID NO：2)、(b)RPARPARA(SEQID NO：3)、(c)RPARPAR-NH2(SEQ ID NO：2)、(d)D-rparpar、(e)D-rparpara和(f)G7。将细胞以核染色剂DAPI染色并使用共聚焦显微镜成像。比例尺：50μm。
图14显示了胰蛋白酶切割可增加RPARPARA(SEQ ID NO：3)噬菌体与PPC-1细胞的结合。在37℃下将109pfu的RPARPARA(SEQ IDNO：3)噬菌体以指定量的胰蛋白酶处理，随后在4℃下进行噬菌体结合测定。数据是4次独立结合实验的代表。
图15A-15D显示了CendR噬菌体可结合于许多类型的细胞。图15A：在4℃下RPARPAR(SEQ ID NO：2)噬菌体与培养细胞的体外结合。图15B：在4℃下RPARPAR(SEQ ID NO：2)噬菌体与小鼠器官原代细胞悬液的离体结合。图15C和15D：静脉注射的RPARPAR(SEQ ID NO：2)噬菌体在20分钟的循环时间后的组织分布。图15C：噬菌体通过滴定定量，组织结合表示为G7噬菌体的倍数。统计分析通过学生t检验进行(c)。n＝3；误差棒表示标准差(s.d.)；2个星号，p＜0.01；3个星号，p＜0.001。图15D(图d和e)：以RPARPAR(SEQ ID NO：2)(d)或G7(e)噬菌体静脉注射的小鼠的肺切片中T7噬菌体的免疫荧光定位(浅着色)。广泛分布的免疫反应性存在于以RPARPAR(SEQ ID NO：2)注射的小鼠的肺中(d中的箭头)，但不存在于以G7注射的小鼠的肺中(血管中偶尔出现标记，e中的箭头)。比例尺：50μm。
图16A和16B显示了RPARPAR(SEQ ID NO：2)噬菌体与PPC-1细胞结合以及向PPC-1细胞内化的动力学。图16A：在4℃下，噬菌体与培养的PPC-1细胞悬液的结合在20分钟时达到平台。对于时程研究，将培养PPC-1细胞的细胞悬液与109pfu噬菌体一起孵育，随后在硅油垫(1.03g/ml)上通过离心将未结合的噬菌体与细胞一步分离，并进行滴定。图16B(图b、c)：在37℃下肝PPC-1细胞对RPARPAR(SEQ IDNO：2)功能化的q-dot的内化。(b)在加入q-dot 15分钟后，沿质膜出现标记(浅色斑点)。(c)在1小时时，大多数的q-dot被内化。以活体细胞核染色剂Hoechst 342进行细胞核染色。n＝3；误差棒表示标准差(s.d.)。比例尺：20μm。
图17A、17B和17C显示了RPARPAR(SEQ ID NO：2)噬菌体被PPC-1细胞经非常规的通路内化。图17A：胞吞抑制剂对RPARPAR(SEQID NO：2)噬菌体内化的影响。在37℃下将噬菌体与PPC-1细胞一起在存在所示抑制剂的情况下孵育90分钟，随后进行酸洗和滴定以定量测定内化的噬菌体。通过ANOVA进行的统计分析显示所述抑制剂没有一种显著抑制内化。n＝3；误差棒表示标准差(s.d.)。图17B：在存在109pfu的RPARPAR(SEQ ID NO：2)噬菌体的情况下孵育60分钟并针对T7噬菌体和亚细胞区室标记物(LAMP-1、小窝蛋白-1(caveolin-1)、钙联接蛋白(calnexin)、EEA-1)双染的PPC-1细胞的共聚焦成像。以DAPI进行细胞核染色。图17C：在存在109pfu的RPARPAR(SEQ ID NO：2)噬菌体和10μg/ml霍乱毒素B亚基的情况下孵育180分钟的PPC-1细胞的共聚焦成像。噬菌体通过Alexa-546标记的二抗进行检测，霍乱毒素亚基B以Alexa-488染料标记。共定位通过紧靠细胞核外侧的亮点(箭号)表示。以DAPI进行细胞核染色。比例尺：10μm。
图18A-18C显示了NRP-1作为CendR受体的鉴定和确认。图18A：蛋白与RPARPAR(SEQ ID NO：2)肽相互作用的亲和色谱。以200mM吡喃葡萄糖苷缓冲物提取PPC-1肿瘤组织并将所述提取物与RPARPAR(SEQ ID NO：2)涂覆的小珠孵育，然后进行大量洗涤，并以2mM游离RPARPAR(SEQ ID NO：2)肽洗脱。注意到被质谱鉴定为NRP-1的130kDa带出现，其起始于洗脱物的第3级分。上图-银染凝胶，下图-抗NRP-1抗体的免疫印迹。图18B：RPARPAR(SEQ ID NO：2)噬菌体与以野生型NRP-1(NRP-1)、三重突变体NS346A-E348A-T349ANRP-1(突变体NRP-1)或亲本pcDNA3.1质粒(载体)瞬时转染的M21黑色素瘤细胞的结合，以及与非转染的M21细胞的结合。图18C：(c、d)，在37℃下与噬菌体一起孵育40分钟(c)和3小时(d)的PPC-1细胞中NRP-1和RPARPAR(SEQ ID NO：2)T7噬菌体的共聚焦免疫荧光图像。所述噬菌体和NRP-1大量地共定位，但似乎重叠不断减少(c和d中的箭头)并出现仅对噬菌体阳性的结构(箭号，d)。(e)以NRP-1瞬时转染的M21细胞中RPARPAR(SEQ ID NO：2)噬菌体和NRP-1的免疫染色和共聚焦成像。在37℃下将RPARPAR(SEQ ID NO：2)噬菌体与在纤连蛋白涂布的盖玻片上培养的细胞一起孵育3小时。仅表达NRP-1的细胞结合并内化所述噬菌体(箭号)，而阴性细胞(不可视)不结合和内化所述噬菌体。(f)RPARPARA(SEQ ID NO：3)噬菌体不内化至NRP-1阳性M21细胞中。统计分析以ANOVA进行(b)；n＝3；误差棒表示标准差(s.d.)。比例尺：10μm。
图19A和19B显示了展示RPARPAR(SEQ ID NO：2)和已知NRP-1配体肽的噬菌体与PPC-1细胞的结合。图19A：已知NRP-1配体可使得噬菌体结合于PPC-1细胞。展示已知与NRP-1的b1亚基相互作用的肽配体(a中的表)的噬菌体以与RPARPAR(SEQ ID NO：2)类似的程度结合所述细胞，而具有添加的C端丙氨酸(VEGF-C7-A)的VEGF-C7是失活的。在该表中，序列从上至下对应于SEQ ID NO：126-130。图19B(图b-g)：对在存在109pfu的所示噬菌体的情况下培养1小时的PPC-1细胞中的噬菌体免疫反应性进行共聚焦免疫荧光评估。箭号，内化的噬菌体；箭头，质膜关联的噬菌体。以DAPI进行细胞核染色。插图：0.5mM游离RPARPAR(SEQ ID NO：2)肽(在加入噬菌体前10分钟加到细胞中)对所述噬菌体结合的竞争。比例尺：20μm。
图20A-20C显示了尿激酶依赖的CendR肽。图20A：uPA-可活化的CendR肽(uCendR)的设计。uPA的共有切割位点SGRSA(SEQ IDNO：34的第5-9位氨基酸)(Ke，S.H.et al.(1997))与重叠CendR元件相组合。在完整的肽中，所述CendR元件由于未在C端处暴露而无活性。uPA的切割导致所述CendR元件的C端暴露(uCendR-X)、细胞结合和内化。图20B：展示uCendR肽和对应于切割后产物(uCendR-X)的噬菌体与PPC-1细胞的结合。在将所述噬菌体加入细胞之前，将噬菌体以50iu的uPA、25μg结晶胰蛋白酶、50iu凝血酶或25μg的I型胶原酶处理。图20C(图c-e)：与uPA-CendR-q-dot一起孵育的PPC-1细胞的荧光显微术。未处理的uCendR q-dot未内化(c)，而uPA处理可触发q-dot的内化(d，箭头)。阿米洛利(Amiloride)抑制了摄取(e)。统计分析以ANOVA进行(b)；n＝3；误差棒表示(s.d.)；3个星号，p＜0.001。比例尺：10μm。
图21显示了CendR的内化通路。所鉴定的内化基序(CendR基序)在位于蛋白C端时有活性。在C端之外的位置包含CendR基序的肽(隐性CendR肽)未内化；然而，它们对神经毡蛋白-1的结合和它们的内化可以通过蛋白酶解切割触发。所述CendR通路可导致生物纳米颗粒和合成纳米颗粒(细菌噬菌体和q-dot)的摄取。CendR通路还可以涉及到细胞与其他生物剂(例如病毒和其他细胞)的相互作用。
具体实施方式
通过参考对下文中包括的具体实施方案和实施例的具体描述，以及参考附图及其上下文的描述，可以更容易地理解所公开的方法和组合物。
在公开并描述本发明的化合物、组合物、物品、装置和/或方法之前，应当理解，除非另外指出，否则它们不局限于具体的合成方法或具体的重组生物技术方法，或者除非另外指出，否则它们不局限于具体的试剂，因为这些理所当然可以有变化。还应当理解，本文中使用的术语仅是为了描述具体实施方案的目的，不是意欲进行限制。
A.定义
除非上下文中另外明确指出，在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代对象。因此，例如，提及“一种药物载体”包括两种或多种该载体的混合物，等等。
本文中范围可以表示为从“约”一个具体的数值，和/或至“约”另一个具体的数值。当表示为该范围时，另一实施方案可包含从一个具体数值和/或至另一个具体数值。类似地，当通过在前面使用“约”将数值表示为近似值时，应当理解，该具体的数值形成另一实施方案。还应当进一步理解，每个范围的端点在与另一个端点相关和独立于另一个端点时都是有意义的。还应当理解，本文中公开了许多值，并且每个值除该值本身外在本文中还被公开为“约”该具体值。例如，如果公开了值“10”，那么“约10”也被公开。还应理解，如本领域技术人员适当理解的，如果一个值被公开，那么“小于或等于”该值、“大于或等于该值”以及这些值之间可能的范围也被公开。例如，如果公开了值“10”，那么“小于或等于10”以及“大于或等于10”也被公开。还应理解，在本申请通篇中，数据以多种不同形式提供，并且该数据表示终点和起点以及这些数据点的任意组合的范围。例如，如果公开了具体数据点“10”和具体数据点15，那么应理解，除10和15之间以外，还认为大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15都被公开。还应理解，两个具体单元之间任一单元也被公开。例如，如果10和15被公开，那么11、12、13和14也被公开。
在本说明书和随附的权利要求书中，将会提到多个术语，这些术语将被定义具有如下含义：
“任选的”或“任选地”是指后面描述的事件或情况可能发生，也可能不发生，且该描述包括所述事件或情况发生以及不发生的情形。
本申请全文中，参引了多份出版物。这些出版物的公开内容通过引证的方式全文纳入本申请，以更全面地描述本发明所属技术领域的状态。基于倚赖参考文献的句子中所论述的包含在所述参考文献中的素材，所公开的参考文献还单独地并具体地通过引用的方式纳入本文。
应理解，除非另外指出，所公开的方法和组合物不限于具体合成方法、具体分析技术或具体试剂，因此它们可以有变化。还应理解，用于本文中的术语仅是为了描述具体实施方案，而不是意欲进行限制。
B.综述
本文公开了一种新的技术平台，该平台使得可以进行组合物的细胞内递送、离开和组织穿透。所述递送可以是全面递送，也可以靶向目的细胞或组织，例如肿瘤。组合物(包括纳米颗粒、药物、可检测标记物和其他化合物)及它们的负载在靶细胞中的内化以及靶组织穿透可以提高靶向的效率，但之前还未实现细胞类型特异性内化和组织类型特异性穿透。另外，组合物穿透至血管外空间的能力是限制组合物的体内靶向效率的主要因素。已经鉴定了一个简单的肽基序，其C端元件为一个限定特征，该基序可示意噬菌体和游离肽的高效细胞内化(图9是一个实例)。该内化现象被命名为“C端规则”或“CendR”。使C端元件暴露的蛋白酶解可作为触发内化信号的开关。多种组合物可以通过该机制内化。例如，归巢肽介导的积聚可以通过暴露这样的C端元件的细胞类型特异性蛋白酶解而出现在靶位点，即该C端元件使得形成具有靶触发内化的高特异性归巢体系。所述CendR通路还可以用于使目的组合物离开细胞并分散至组织中。该C端元件可以实现穿透血管壁(并且例如可以从静脉注射分散至肿瘤组织中)的转位，并且还可以扩展至其他屏障，例如粘膜和血脑屏障。本文使用的“组织穿透”和“组织的穿透”是指越过或穿过外层或第一层细胞或者穿过组织膜进入或穿过组织。这类的组织进入或穿透(这还可以称为外渗和组织穿透)可以具有细胞内化和离开双功能。在本申请全文中，如果使用术语“组织穿透”，应理解为这类穿透还可以扩展至全身存在的其他屏障和膜，例如血脑屏障。
与已知的细胞穿透肽不同，本申请公开的内化元件是位置依赖的--它存在于肽C端之外的其他位置时是无活性的。该潜伏肽可以通过例如合适的蛋白水解酶切割以暴露例如C端精氨酸、赖氨酸或赖氨酸-甘氨酸而活化。在本申请全文中，使用术语“CendR元件”或“C端元件”时，它是用于描述C端精氨酸、C端赖氨酸或C端赖氨酸-甘氨酸对，在最后一种情况下甘氨酸位于C端最末位置。换句话说，在赖氨酸在C末端的情况下，所述CendR元件以甘氨酸位于赖氨酸的C端侧可以保持功能。然而，为使赖氨酸残基作为C端元件起作用，甘氨酸位于末端不是必需的，因此赖氨酸可以在无甘氨酸下存在并仍有功能。然而，反之则不然，因为甘氨酸在不存在邻接的赖氨酸的情况下不能发挥C端元件的功能。精氨酸不需要赖氨酸或甘氨酸就可发挥C端元件的功能，条件是它保持在C端最末位置。这类CendR元件可以被称为1类CendR元件。
术语“CendR元件”或“C端元件”还可以用于描述C端组氨酸和具有序列X1X2X3X4的氨基酸序列，其中X1可以为R、K或H，其中X4可以为R、K、H或KG，其中X2和X3可以彼此独立地为任意氨基酸。这类CendR元件可以被称为2类CendR元件。可以基于具体目的选择X2和X3氨基酸。例如，可以选择X2和/或X3以形成蛋白酶识别序列的全序列或其一部分。例如，这可用于具体表示对含有作为一种潜伏或隐性CendR元件的CendR元件的肽的切割或使所述切割进行，所述潜伏或隐性CendR元件被X4氨基酸之后的切割作用所活化。这类氨基酸选择的实例显示于表1和4中。例如，还可以选择X1、X2和X3氨基酸以将其他分子募集至细胞表面处的NRP-1分子。例如，这可以应用于调节CendR元件(及包含CendR元件的缀合物、蛋白和肽)的选择性和内化以及/或者组织穿透能力。任选地，还可以将一些氨基酸从X2和/或X3的使用中排除。例如，根据需要，可以排除G和D同时分别用作X2和X3。一些2类CendR元件还可以描述为R/K/HXXR/K/H(SEQ IDNO：50)和R/K/HXXKG(SEQ ID NO：51)。
CendR元件的实例包括XXR/K/H、XXR/K、XXR/H、XXK/H、XXR、XXK、XXH、XXKG、RXXR/K/H、RXXR/K、RXXR/H、RXXK/H、RXXR、RXXK、RXXH、RXXKG、KXXR/K/H、KXXR/K、KXXR/H、KXXK/H、KXXR、KXXK、KXXH、KXXKG、HXXR/K/H、HXXR/K、HXXR/H、HXXK/H、HXXR、HXXK、HXXH、HXXKG、R/K/HXXR、R/KXXR、R/HXXR、K/HXXR、RXXR、KXXR、HXXR、R/K/HXXK、R/KXXK、R/HXXK、K/HXXK、RXXK、KXXK、HXXK、R/K/HXXH、R/KXXH、R/HXXH、K/HXXH、RXXH、KXXH、HXXH、R/K/HXXKG、R/KXXKG、R/HXXKG、K/HXXKG、RXXKG、KXXKG和HXXKG。
该可由蛋白酶控制的内化体系可用于设计这样的组合物，即这些组合物具有诸如细胞类型特异性和/或组织类型特异性摄取的功能以及将所述组合物扩散至组织中的能力。另外，该规则可涉及多种生物过程，包括病毒感染和吞噬。由于病毒天然地可以利用所述CendR通路感染细胞，因而所述CendR肽和/或缀合物可以用于干扰病毒感染的过程。
在一个实例中，所述CendR肽可以用于纳米医学中。纳米医学的主要目标之一是设计通过在诊断、监测和治疗疾病中发挥多种功能而超越简单药物的装置。可以将新技术应用于解决多功能纳米颗粒的医学应用中的一些主要问题。医学纳米技术的一个主要目标是开发能够监测组织(包括细胞内部)中疾病的纳米装置。这类装置可以包括这样的纳米颗粒，即该纳米颗粒对细胞内部进行取样后返回以对结果进行报告。这需要离开细胞的能力。但是，许多缺乏分泌信号序列的细胞质蛋白也从细胞中分泌。以该方式发挥功能的细胞蛋白的一个主要实例为碱性FGF(Backhaus et al.，2004)。VP22蛋白也以非常规的方式从细胞离开。赋予纳米颗粒针对非靶向细胞的离开信号可减少所述颗粒的非特异性毒性。组织穿透噬菌体文库可用于鉴定促进纳米颗粒离开细胞的分子信号。
1.CendR元件及其用途
本文公开了一种形成CendR缀合物的方法，所述方法包括选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或穿透组织，其中所述氨基酸序列包含一个C端元件；以及使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于包含所述选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述选择的氨基酸序列位于所述蛋白或肽的C末端，其中所述CendR缀合物包含所述蛋白或肽以及所述偶联或缔合的运载组合物
本文定义的C端元件为精氨酸、赖氨酸或赖氨酸-甘氨酸(对于1类CendR元件)，或者组氨酸或具有序列X1X2X3X4的氨基酸序列，其中X1可以为R、K或H，其中X4可以为R、K、H或KG，其中X2和X3可以彼此独立地为任意氨基酸(对于2类CendR元件)。
本文使用的“选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中”是指选择、鉴定、设计或分类具有如下具体目的的氨基酸序列：使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入细胞。因此，例如，“选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中”不包括如下情况：为了除使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入细胞之外的某个目的或能力，以及在不存在使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入细胞的意图的情形下，选择一种氨基酸序列。“选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中”包括如下情况：除了为了使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入细胞之外还为了获得某个目的或能力而选择一种氨基酸序列。因此，“选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中”包括这样的情况，即其他目标或目的的存在不改变至少具有如下具体目的的氨基酸序列选择：使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入细胞。
本文使用的“选择一种氨基酸序列用于穿透组织”是指选择、鉴定、设计或分类具有如下具体目的的氨基酸序列：使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入组织(即组织穿透)。因此，例如，“选择一种氨基酸序列用于穿透组织”不包括如下情况：为了除使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入组织之外的某个目的或能力，以及在不存在使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入组织的意图的情形下，选择一种氨基酸序列。“选择一种氨基酸序列用于穿透组织”包括如下情况：除了为了使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入组织之外还为了获得某个目的或能力而选择一种氨基酸序列。因此，“选择一种氨基酸序列用于穿透组织”包括这样的情况，即其他目标或目的的存在不改变至少具有如下具体目的的氨基酸序列选择：使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入组织。
本文使用的“选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或穿透组织”是指选择、鉴定、设计或分类具有如下具体目的的氨基酸序列：使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入细胞和/或组织。因此，例如，“选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或穿透组织”不包括如下情况：为了除使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入细胞和/或组织之外的某个目的或能力，以及在不存在使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入细胞和/或组织的意图的情形下，选择一种氨基酸序列。“选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或穿透组织”包括如下情况：除了为了时包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入细胞和/或组织之外还为了获得某个目的或能力而选择一种氨基酸序列。因此，“选择一种氨基酸序列用于内化至细胞和/或穿透组织”包括这样的情况，即其他目标或目的的存在不改变至少具有如下具体目的的氨基酸序列选择：使包含所述氨基酸序列的蛋白或肽进入细胞和/或组织。
本文使用的“使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于”其他某物是指任何这样的作用，即该作用导致不共价偶联于或非共价缔合于所述其他某物的运载组合物变成或获得共价偶联于或非共价缔合于所述其他某物的状态。例如，“使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于”另一运载组合物包括，将运载组合物共价偶联于所述另一运载组合物。再例如，“使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于”某物包括这样的运载组合物，即该运载组合物开始不存在，然后作为一种组合物的一部份被合成，所述组合物包含所述运载组合物将偶联或缔合的所述某物。例如，使运载组合物(目的氨基酸序列)共价偶联于或非共价缔合于所述包含C端元件的氨基酸序列包括，合成同时包含目的氨基酸序列和含C端元件的氨基酸序列的肽。然而，一般而言，“使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于”所述包含C端元件的氨基酸序列可以排除这样的过程，即天然地同时包含目的氨基酸序列和含C端元件的氨基酸序列的蛋白或肽的合成。
本文使用的“CendR元件”是指具有C端精氨酸、赖氨酸或赖氨酸-甘氨酸序列的氨基酸序列(对于1类CendR元件)，或者C端组氨酸或具有序列X1X2X3X4的C端氨基酸序列，其中X1可以为R、K或H，其中X4可以为R、K、H或KG，其中X2和X3可以彼此独立地为任意氨基酸(对于2类CendR元件)。一些2类CendR元件还可以描述为R/K/HXXR/K/H(SEQ ID NO：50)和R/K/HXXKG(SEQ ID NO：51)。还可以选择X1、X2和X3氨基酸以将其他蛋白募集至细胞表面处的NRP-1分子。例如，这可以应用于调节CendR元件(及包含CendR元件的缀合物、蛋白和肽)的选择性和内化以及/或者组织穿透能力。例如，CendR元件可以包含这样的氨基酸序列的蛋白或肽，所述氨基酸序列具有C端元件；包含由具有C端元件的氨基酸序列组成的蛋白或肽；或者由具有C端元件的氨基酸序列组成。任选地，还可以排除一些氨基酸在X1X2X3X4形式的CendR元件中用作X2和/或X3。例如，根据需要，可以排除G和D同时分别用作X2和X3。
CendR元件的实例包括XXR/K/H、XXR/K、XXR/H、XXK/H、XXR、XXK、XXH、XXKG、RXXR/K/H、RXXR/K、RXXR/H、RXXK/H、RXXR、RXXK、RXXH、RXXKG、KXXR/K/H、KXXR/K、KXXR/H、KXXK/H、KXXR、KXXK、KXXH、KXXKG、HXXR/K/H、HXXR/K、HXXR/H、HXXK/H、HXXR、HXXK、HXXH、HXXKG、R/K/HXXR、R/KXXR、R/HXXR、K/HXXR、RXXR、KXXR、HXXR、R/K/HXXK、R/KXXK、R/HXXK、K/HXXK、RXXK、KXXK、HXXK、R/K/HXXH、R/KXXH、R/HXXH、K/HXXH、RXXH、KXXH、HXXH、R/K/HXXKG、R/KXXKG、R/HXXKG、K/HXXKG、RXXKG、KXXKG和HXXKG。
可以内化至细胞中的CendR元件可以称为内化CendR元件。可穿透组织的CendR元件可以称为穿透CendR元件。可内化至细胞中并且可穿透组织的CendR元件可以称为内化和穿透CendR元件。除非上下文明确另外指出，提及“CendR元件”时是指这些情况的各单独情况、它们的总合或任意组合。
本文使用的“CendR缀合物”是指与包含含有CendR元件的氨基酸序列的蛋白或肽缔合的运载组合物，其中所述氨基酸序列位于所述蛋白或肽的C末端。
本文使用的“可活化的CendR元件”是指分子、部分、纳米颗粒、化合物或其他组合物共价偶联于一个CendR元件(例如共价偶联于C端元件的末端羧基)的CendR元件，其中所述分子、部分、纳米颗粒、化合物或其他组合物可阻断所述CendR缀合物的内化和/或组织穿透，并且其中所述分子、部分、纳米颗粒、化合物或其他组合物可被除去(例如以暴露所述末端羧基)。例如，所述可活化的CendR元件可以位于所述肽的C末端，并且可以阻止所述CendR元件内化和/或穿透组织。共价偶联于所述CendR元件的所述分子、纳米颗粒、部分、化合物或其他组合物可以称为“封闭基团”。例如，所述封闭基团可以偶联于所述CendR元件的C端精氨酸或赖氨酸或者其他C端氨基酸的末端羧基；偶联于所述CendR元件的C端氨基酸；或者偶联于除所述C端氨基酸之外的CendR元件的氨基酸。所述封闭基团还可以偶联或缔合于CendR缀合物中除所述CendR元件之外的部分，条件是它可以阻断所述CendR元件内化和/或穿透组织。
可活化的CendR元件的细胞内化以及/或者组织穿透可被阻断。一般而言，将同时阻断可活化的CendR元件的细胞内化和组织穿透。这类可活化的CendR元件可以称为可活化的内化和穿透CendR元件。然而，一些可活化的CendR元件仅被阻断组织穿透，或者仅被阻断细胞内化。这类可活化的CendR元件可以称为可活化的内化CendR元件(对于仅被阻断细胞内化的CendR元件)，或者称为可活化的内化和穿透CendR元件(对于仅被阻断组织穿透的CendR元件)。一般而言，可活化的内化CendR元件应为可活化的内化CendR元件。与之类似，可活化的穿透CendR元件一般应为可活化的穿透CendR元件。可活化的内化和穿透CendR元件应为可活化的内化和穿透CendR元件。除去所述封闭基团后将使得所述CendR元件可内化至细胞中和/或穿透组织。
“蛋白酶可活化的CendR元件”(或“蛋白酶活化的CendR元件”)是指这样的可活化CendR元件，即其中所述封闭基团经肽键偶联于所述CendR元件，并且其中所述肽键可被蛋白酶切割。蛋白酶可活化的CendR元件中该肽键的切割使得所述CendR元件能够内化至细胞中和/或穿透组织。在一个实例中，所述封闭基团可以经可切割键或不稳定键偶联于所述CendR元件。例如，所述可切割键可以被酶或化合物切割。可活化CendR元件中的切割或“不稳定”键可使得所述CendR元件能够内化至细胞中和/或穿透组织。这类切割或“不稳定”可称为所述CendR元件的活化。蛋白酶可活化的CendR元件为一种形式的可活化CendR元件。根据具体目的可以选择X1X2X3X4形式的CendR元件的X2和X3氨基酸。例如，可以选择X2和/或X3以形成蛋白酶识别序列的全序列或部分序列。例如，这可用于具体表示含有作为一种潜伏或隐性CendR元件的CendR元件的肽的切割或使所述切割进行，所述潜伏或隐含CendR元件被X4氨基酸之后的切割作用所活化。这类氨基酸选择的实例显示于表1和4中。一类可用的CendR元件可以由未封闭的CendR元件和可活化的CendR元件组成，该类CendR元件排除不可活化的封闭CendR元件。
可用的蛋白酶包括在碱性残基(CendR元件的C端残基可以是碱性残基)的C端侧切割的酶以及识别它们的切割位点的C端侧序列的酶(因此使得可自由选择切割产物的C端序列)。可用的蛋白酶的实例包括例如，丝氨酸蛋白酶(包括例如纤溶酶和纤溶酶原激活剂)、前蛋白转化酶(参见例如Duckert et al.，Prediction of proprotein convertase cleavage sites Protein engineering Design and Selection 17(1)：107-112(2004))、弗林蛋白酶(furin)和羧肽酶。丝氨酸蛋白酶可特别用于靶向癌细胞和肿瘤的CendR元件和CendR缀合物。在碱性残基的C端侧切割的酶的实例包括Arg-C蛋白酶(它在精氨酸残基的C端侧切割；Keil，Specificityof Proteolysis(Springer-Verlag，Berlin-Heidelberg-New York)(1992))、梭菌蛋白酶(它在精氨酸残基的C端侧切割；Keil，1992)、肠激酶(它在序列-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-(SEQ ID NO：131)后切割)、Xa因子(它在序列-Gly-Arg-后切割；Fujikawa et al.，Activation of bovine factor X(Stuart factor)：conversion of factor Xa alpha to factor Xa beta，Proc.Natl.Acad.Sci.72：3359-3363(1975))、Lys-C(它在赖氨酸残基的C端侧切割；Keil，1992)、凝血酶(它在精氨酸残基的C端侧切割；Keil，1992)、胰蛋白酶(它在精氨酸和赖氨酸残基的C端侧切割；Keil，1992)、丝氨酸蛋白酶、前蛋白转化酶(例如PC1、PC2、PC3、PC4、PC5、PC6、PC7、PC8、弗林蛋白酶、Pace、PACE4、位点1蛋白酶、S1P、SKI、NARC-1、PCSK1、PCSK2、PCSK3、PCSK4、PCSK5、PCSK6、PCSK7、PCSK8和PCSK9)、纤溶酶和纤溶酶原激活剂。可识别其切割位点C端侧序列的酶的实例包括Asp-N内肽酶(它切割天冬氨酸的N端侧；Keil，1992)和羧肽酶如羧肽酶A(它切割除脯氨酸、赖氨酸和精氨酸之外的C端残基)。
蛋白酶的实例还记载于Hook，proteolytic and cellular mechanisms in prohormone and proprotein processing，RG Landes Company，Austin，Texas，USA(1998)；Hooper et al.，Biochem.J.321：265-279(1997)；Werb，Cell 91：439-442(1997)；Wolfsberg et al.，J.Cell Biol.131：275-278(1995)；Murakami and Etlinger，Biochem.Biophys.Res.Comm.146：1249-1259(1987)；Berg et al.，Biochem.J.307：313-326(1995)；Smyth and Trapani，Immunology Today 16：202-206(1995)；Talanian et al.，J.Biol.Chem.272：9677-9682(1997)；以及Thornberry et al.，J.Biol.Chem.272：17907-17911(1997)。
表4.切割规则
底物            切割
                 ↓
----P4-P3-P2-P1-P1’-P2’-P3’-P4’-----
如下的酶在出现各自切割位点的组合时可切割。
Figure BPA00001248881800261
例外规则：如下切割位点的组合时上述切割规则不适用，即不出现切割：
Figure BPA00001248881800272
可活化CendR元件的一些可用形式可以为环状蛋白或肽或者可以在环状蛋白或肽中。所述CendR元件将潜伏于这类环状结构中，原因是所述CendR元件不会位于游离C末端。环状蛋白和肽可以以本领域中已知的多种方式形成，例如通过半胱氨酸键、通过共价键、通过活性基团的反应以及经由接头。对环化蛋白和肽来说，半胱氨酸键是有用的方式。应理解的是，环化连接不需要在所述CendR元件的C末端。通过将所述环化连接置于远离所述CendR元件的C末端处，环化键的选择和潜伏CendR元件的可切割键选择可以各自独立。例如，所述环化连接可以是半胱氨酸键，而所述潜伏CendR元件的可切割键可以为肽键(例如，其中所述肽键可以位于蛋白酶靶的切割位点)。
公开的蛋白、肽、氨基酸序列或CendR缀合物中的CendR元件通常应位于游离C末端，或者在可活化的CendR元件中位于切割位点的N端侧。
在一些形式中，所述CendR缀合物的肽或蛋白在所述选择的氨基酸序列(CendR元件)存在于所述肽或蛋白中时可以内化至细胞中，但在所选择氨基酸不存在于所述肽或蛋白中时不内化至细胞中。例如，这可用于检测蛋白或肽是否包含CendR元件。例如，所述CendR元件在不缔合除其自身序列之外的任何物质的情况下可以内化至细胞中。所述CendR元件可以是所述蛋白或肽或者所述CendR缀合物中仅有的功能性内化元件，或者可以有一种或多种其他功能性内化元件。在一些形式中，在所述选择的氨基酸序列(CendR元件)存在于所述CendR缀合物中时，所述CendR缀合物可以内化至细胞中，但在所述选择的氨基酸不存在于所述CendR缀合物中时不内化至细胞中。
类似地，在一些形式中，所述CendR缀合物的肽或蛋白在所述选择的氨基酸序列(CendR元件)存在于所述肽或蛋白中时可以穿透组织，但在所述选择的氨基酸不存在于所述肽或蛋白中时不穿透组织。例如，这可用于检测蛋白或肽是否包含CendR元件。例如，所述CendR元件在不缔合除其自身序列之外的任何物质的情况下可以穿透组织。所述CendR元件可以是所述蛋白或肽或者所述CendR缀合物中仅有的功能性组织穿透元件，或者可以有一种或多种其他功能性组织穿透元件。在一些形式中，在所述选择的氨基酸序列(CendR元件)存在于所述CendR缀合物中时，所述CendR缀合物可以穿透组织，但在所述选择的氨基酸不存在于所述CendR缀合物中时不穿透组织。
类似地，在一些形式中，所述CendR缀合物的肽或蛋白在所述选择的氨基酸序列(CendR元件)存在于所述肽或蛋白中时可以内化至细胞中并可穿透组织，但在所述选择的氨基酸不存在于所述肽或蛋白中时不内化至细胞中也不穿透组织。例如，这可用于检测蛋白或肽是否包含CendR元件。例如，所述CendR元件在不缔合除其自身序列之外的任何物质的情况下可以内化至细胞中和穿透组织。所述CendR元件可以是所述蛋白或肽或者所述CendR缀合物中仅有的功能性内化和组织穿透元件，或者可以有一种或多种其他功能性内化和/或组织穿透元件。在一些形式中，在所述选择的氨基酸序列(CendR元件)存在于所述CendR缀合物中时，所述CendR缀合物可以内化至细胞中并可穿透组织，但在所述选择的氨基酸不存在于所述CendR缀合物中时不内化至细胞中也不穿透组织。
“内化”是指穿过质膜或其他生物屏障。“穿透”是指进入且穿过细胞、组织或其他生物屏障。穿透通常涉及并包括内化。所公开的CendR元件通常可促进内化(例如内化至细胞中)和穿透(例如组织穿透)并且允许其发生。除非上下文中另外指出(例如分别对细胞内化和组织穿透地单独地或区分地讨论和描述--本段是这种情况的一个实例)，否则提及内化或提及穿透时应理解为其同时指内化和穿透。
“内化至细胞中”是指CendR元件能够穿透质膜，从而内化至细胞中。对于给定的CendR元件和给定的细胞，该内化可以以例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的效率发生。
例如，可以通过这样的方法制备CendR缀合物，即所述方法包括：(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或组织穿透，其中所述氨基酸序列包含C端精氨酸或赖氨酸(或者另一种CendR元件序列)，(b)使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于一种包含所述选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述选择的氨基酸序列位于所述蛋白或肽的C末端，其中所述CendR缀合物包含所述蛋白或肽以及所述偶联或缔合的运载组合物。
还公开了一种将运载组合物递送至细胞的方法，所述方法包括：(a)将一个CendR元件偶联于所述运载组合物，从而形成一种CendR缀合物；以及(b)将所述细胞暴露于所述CendR缀合物，其中所述CendR缀合物然后可以进入所述细胞，从而将所述运载组合物递送至所述细胞。
还公开了一种使运载组合物穿透的方法，所述方法包括：(a)将一个CendR元件偶联于所述运载组合物，从而形成一种CendR缀合物；以及(b)将所述组织暴露于所述CendR缀合物，其中所述CendR缀合物然后可以进入和离开所述组织中的细胞，从而使所述运载组合物穿透所述组织。穿过或穿透组织(这也可以称为外渗和组织穿透)可以是一种同时包括细胞内化和细胞脱离的功能。所公开的CendR元件和CendR缀合物能够穿透组织，这是因为它们既能内化至细胞中又能从细胞离开。
又公开了一种将运载组合物递送至细胞的方法，所述方法包括：(a)将一个可活化的CendR元件偶联于所述运载组合物，从而形成一种CendR缀合物；以及(b)将所述细胞暴露于所述CendR缀合物，于是切割剂可活化所述CendR缀合物的可活化CendR元件，其中所述CendR缀合物然后可以进入所述细胞，从而将所述运载组合物递送至所述细胞。
又公开了一种使运载组合物穿透的方法，所述方法包括：(a)将一个可活化CendR元件偶联于所述运载组合物，从而形成一种CendR缀合物；以及(b)将所述组织暴露于所述CendR缀合物，于是切割剂可活化所述CendR缀合物的可活化CendR元件，其中所述CendR缀合物然后可以进入和离开所述组织中的细胞，从而使所述运载组合物穿透所述组织。
还公开了一种鉴定可以内化CendR元件的细胞的方法，所述方法包括：(a)将一种细胞暴露于一个CendR元件；以及(b)确定所述CendR元件是否被内化。例如，所述细胞可以在一个测定中。所述CendR元件可以偶联于蛋白或肽，从而形成CendR缀合物。
还公开了一种鉴定可以内化可活化CendR元件的细胞的方法，所述方法包括：(a)将一种细胞暴露于一个可活化的CendR元件；(b)确定所述可活化的CendR元件是否被内化。所述可活化的CendR元件可以在暴露于所述细胞前脱封闭，但不需要如此。例如，这可以用于测试所述可活化的元件的封闭能力。所述可活化CendR元件还可以为蛋白酶可活化的CendR元件，所述蛋白酶可活化的CendR元件在存在可切割所述可活化元件的蛋白酶时被活化。
还公开了一种鉴定癌细胞作为基于CendR的疗法的候选物的方法，所述方法包括：(a)将所述癌细胞暴露于一个CendR元件；以及(b)确定所述CendR元件是否被所述癌细胞内化，其中内化的CendR元件将所述癌细胞鉴定为基于CendR的疗法的候选物。例如，所述细胞可以在一个测定中，或者可以在受试者中。所述CendR元件可以偶联于运载组合物，例如蛋白或肽或纳米颗粒，从而形成CendR缀合物。本文使用的基于CendR的疗法是指涉及CendR元件或CendR缀合物的受试者治疗。
还公开了一种鉴定肿瘤作为基于CendR的疗法的候选物的方法，所述方法包括：(a)将来自所述肿瘤的组织暴露于一个CendR元件；以及(b)确定所述CendR元件是否穿过所述组织或者被所述组织中的细胞内化，其中穿过或内化的CendR元件将所述肿瘤鉴定为基于CendR的疗法的候选物。
还公开了一种产生可以在目的细胞附近被活化的可活化CendR元件的方法，所述方法包括形成一个可活化的CendR元件，其中一个封闭基团经可切割键偶联于一个CendR元件，其中所述可切割键可被存在于目的细胞附近的酶切割。该方法还可以包括，在形成所述可活化的CendR元件之前鉴定存在于目的细胞附近的酶。该方法还可以包括，在形成所述可活化CendR元件之前，基于存在于目的细胞附近的酶选择所述可切割键。
还公开了一种形成可活化的CendR元件的方法，所述方法包括：(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中，其中所述氨基酸序列包含CendR元件，其中所述CendR元件(例如C端精氨酸、赖氨酸或赖氨酸-甘氨酸或者另一种CendR元件序列)包含末端羧基，以及(b)使一个封闭基团共价偶联于所述选择的氨基酸序列的末端羧基，其中偶联所述封闭基团和所述末端羧基的键是可切割的，其中所述可活化的CendR元件包含所述选择的氨基酸序列和所述封闭基团。该方法还可包括，在步骤(b)之前选择可被存在于目的细胞附近的蛋白酶切割的、偶联所述封闭基团和所述末端羧基的键。
又公开了一种由这样的方法制备的可活化CendR元件，即该方法包括(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中，其中所述氨基酸序列包含CendR元件，其中所述CendR元件包含末端羧基，以及(b)使一个封闭基团共价偶联于所述选择的氨基酸序列的末端羧基，其中偶联所述封闭基团和所述末端羧基的键是可切割的，其中所述可活化的CendR元件包含所述选择的氨基酸序列和所述封闭基团。该方法还可包括，在步骤(b)之前选择可被存在于目的细胞/细胞类型/细胞/组织附近的蛋白酶切割的、偶联所述封闭基团和所述末端羧基的键。
公开了CendR元件以及包含CendR元件的蛋白和肽。还公开了如下的CendR缀合物：其包含一种共价偶联于或非共价缔合于包含CendR元件的蛋白或肽的运载组合物。还公开了如下的CendR缀合物：其包含一种共价偶联于或非共价缔合于包含所选择的氨基酸序列的蛋白或肽的运载组合物，其中所述氨基酸序列包含CendR元件。所述运载组合物可偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。
还公开了可活化的CendR元件和包含可活化CendR元件的蛋白和肽。还公开了如下的可活化的CendR缀合物：其包含一种共价偶联于或非共价缔合于包含可活化CendR元件的蛋白或肽的运载组合物。还公开了如下的可活化CendR缀合物：其包含共价偶联于或非共价缔合于包含所选择的氨基酸序列的蛋白或肽的运载组合物，其中所述氨基酸序列包含可活化的CendR元件。所述运载组合物可偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述可活化CendR元件的N端侧。
还公开了通过这样的方法制备的CendR缀合物，即该方法包括使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于包含CendR元件的蛋白或肽，其中所述运载组合物偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。还公开了通过这样的方法制备的CendR缀合物，即该方法包括使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于包含所选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述氨基酸序列包含C端元件，其中所述运载组合物偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。还公开了通过这样的方法制备的CendR缀合物，即该方法包括(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或组织穿透，其中所述氨基酸序列包含C端元件，以及(b)使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于包含所述选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述运载组合物偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。所述CendR缀合物可以包含所述蛋白或肽以及所述偶联或缔合的运载组合物。
还公开了通过这样的方法制备的可活化CendR元件，即该方法包括使一个封闭基团共价偶联于一个CendR元件，其中偶联所述封闭基团和所述CendR元件的键是可切割的。还公开了通过这样的方法制备的可活化CendR元件，即该方法包括使一个封闭基团共价偶联于一条氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含CendR元件，其中偶联所述封闭基团和所述CendR元件的键是可切割的。还公开了通过这样的方法制备的可活化CendR元件，即该方法包括(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或组织穿透，其中所述氨基酸序列包含CendR元件，以及(b)使一个封闭基团共价偶联于所述CendR元件，其中偶联所述封闭基团和所述CendR元件键是可切割的。共价偶联于所述CendR元件的所述封闭基团可减少或阻止细胞内化和/或组织穿透。与无封闭基团的相同CendR元件相比，共价偶联于所述CendR元件的所述封闭基团可减少或阻止细胞内化和/或组织穿透。所述可活化的CendR元件可以包含所述选择的氨基酸序列和所述封闭基团。
在所述蛋白或肽中存在所述CendR元件时，所述蛋白或肽可以内化至细胞中及/或穿透组织，但在所述蛋白或肽中不存在所述CendR元件时，所述蛋白或肽不能内化至细胞中及/或穿透组织。在所述蛋白或肽中存在所述选择的氨基酸序列时，所述蛋白或肽可以内化至细胞中及/或穿透组织，但在所述蛋白或肽中不存在所述选择的氨基酸时，所述蛋白或肽不能内化至细胞中及/或穿透组织。所述CendR元件可以不与所述运载组合物缔合而内化至细胞中及/或穿透组织。所述选择的氨基酸序列可以不与所述运载组合物缔合而内化至细胞中及/或穿透组织。所述CendR元件可以是所述蛋白或肽中仅有的功能性内化元件，所述CendR元件可以是所述蛋白或肽中仅有的功能性组织穿透元件，或者所述CendR元件可以是所述蛋白或肽中仅有的功能性内化元件和功能性组织穿透元件。所述选择的氨基酸序列可以是所述蛋白或肽中仅有的功能性内化元件，所述选择的氨基酸序列可以是所述蛋白或肽中仅有的功能性组织穿透元件，或者所述选择的氨基酸序列可以是所述蛋白或肽中仅有的功能性内化元件和功能性组织穿透元件。所述CendR元件可以是所述CendR缀合物中仅有的功能性内化元件，所述CendR元件可以是所述CendR缀合物中仅有的功能性组织穿透元件，或者所述CendR元件可以是所述CendR缀合物中仅有的功能性内化元件和功能性组织穿透元件。所述选择的氨基酸序列可以是所述CendR缀合物中仅有的功能性内化元件，所述选择的氨基酸序列可以是所述CendR缀合物中仅有的功能性组织穿透元件，或者所述选择的氨基酸序列可以是所述CendR缀合物中仅有的功能性内化元件和功能性组织穿透元件。
所述CendR元件可以是可活化的CendR元件。所述CendR元件可以是蛋白酶可活化的CendR元件。所述蛋白或肽可以为环形或者可以含有环。所述CendR元件可位于所述蛋白或肽的C末端。所述CendR元件可以包含末端羧基。一个封闭基团可以偶联于所述末端羧基。可以选择偶联所述封闭基团和所述末端羧基的键为可被存在于目的细胞附近的蛋白酶切割的。所述封闭基团可以偶联于所述CendR元件的C端氨基酸。所述封闭基团可以偶联于所述CendR元件C端氨基酸之外的所述CendR元件的氨基酸。
运载组合物可以共价偶联于或非共价缔合于一种包含所选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述氨基酸序列可以包含CendR元件。所述运载组合物可以偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。所述运载组合物可以为例如应用于治疗或诊断的纳米颗粒、分子或分子复合物。可以以CendR元件靶向的治疗性运载组合物包括但不限于：纳米颗粒、分子、分子复合物、抗血管生成剂、促血管生成剂、癌症化学治疗剂、细胞毒剂、促细胞存活剂、细胞分化剂、神经保护剂、免疫调节剂、抗炎剂、抗关节炎剂、抗病毒剂或它们的结合。可以以CendR元件靶向的诊断性运载组合物包括但不限于：纳米颗粒、分子、分子复合物、MRI显象剂、放射显象剂、光学显象剂、分子标签(例如生物素)、荧光团、表位标签(例如，它可以通过特异性分子测定法来检测)或它们的结合。
还公开了形成CendR缀合物的方法，所述方法包括使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于一种包含CendR元件的蛋白或肽，其中所述运载组合物偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。还公开了形成CendR缀合物的方法，所述方法包括使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于包含所选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述氨基酸序列包含CendR元件，其中所述运载组合物偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。还公开了形成CendR缀合物的方法，所述方法包括(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或组织穿透，其中所述氨基酸序列包含CendR元件，以及(b)使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于一种包含所述选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述运载组合物偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。所述CendR缀合物可以包含所述蛋白或肽以及所述偶联或缔合的运载组合物。
还公开了将运载组合物递送至细胞的方法，所述方法包括将所述细胞暴露于一种CendR缀合物，其中所述CendR元件包含共价偶联于或非共价缔合于一个CendR元件的运载组合物，其中所述CendR缀合物然后可以进入所述细胞，从而将所述运载组合物递送至所述细胞。还公开了将运载组合物递送至细胞的方法，所述方法包括将所述细胞暴露于一种CendR缀合物，其中所述CendR元件包含共价偶联于或非共价缔合于一种包含CendR元件的蛋白或肽的运载组合物，其中所述CendR缀合物然后可以进入所述细胞，从而将所述运载组合物递送至所述细胞。还公开了将运载组合物递送至细胞的方法，所述方法包括(a)将一个CendR元件偶联于所述运载组合物，从而形成一种CendR缀合物；以及(b)将所述细胞暴露于所述CendR缀合物，其中所述CendR缀合物然后可以进入所述细胞，从而将所述运载组合物递送至所述细胞。
还公开了鉴定能内化CendR元件的细胞的方法，所述方法包括(a)将一种细胞暴露于一个CendR元件，以及(b)确定所述CendR元件是否被内化。还公开了鉴定一种癌细胞作为基于CendR的疗法的候选物的方法，所述方法包括(a)将所述癌细胞暴露于一个CendR元件，以及(b)确定所述CendR元件是否被所述癌细胞内化，其中内化的CendR元件将所述癌细胞鉴定为基于CendR的疗法的候选物。所述细胞可以在一个测定中。所述CendR元件可以偶联于蛋白或肽。所述CendR元件可以是可活化的CendR元件。所述可活化的CendR元件可以在暴露于所述细胞之前活化。所述可活化CendR元件可以是蛋白酶可活化的CendR元件。所述蛋白或肽可以是环形的。所述CendR元件可以位于所述蛋白或肽的C末端。
还公开了鉴定可以被CendR元件穿透的组织的方法，所述方法包括(a)将一种组织暴露于一个CendR元件，以及(b)确定所述CendR元件是否穿透所述组织。还公开了鉴定一种肿瘤作为基于CendR的疗法的候选物的方法，所述方法包括(a)将来自所述肿瘤的细胞暴露于一个CendR元件，以及(b)确定所述CendR元件是否被所述细胞内化，其中内化的CendR元件将所述肿瘤鉴定为基于CendR的疗法的候选物。还公开了鉴定一种肿瘤作为基于CendR的疗法的候选物的方法，所述方法包括(a)将所述肿瘤暴露于一个CendR元件，以及(b)确定所述CendR元件是否穿透所述肿瘤，其中穿透的CendR元件将所述肿瘤鉴定为基于CendR的疗法的候选物。所述肿瘤可以在一个测定中。所述CendR元件可以偶联于蛋白或肽。所述CendR元件可以是可活化的CendR元件。所述可活化的CendR元件可以在暴露于所述肿瘤之前活化。所述可活化的CendR元件可以是蛋白酶可活化的CendR元件。所述蛋白或肽可以是环形的。所述CendR元件可以位于所述蛋白或肽的C末端。
还公开了产生可以在目的细胞附近活化的可活化CendR元件的方法，所述方法包括形成一个可活化的CendR元件，其中封闭基团经可切割键偶联于一个CendR元件，其中所述可切割键可被存在于目的细胞附近的酶切割。所述细胞可以在受试者中。可以鉴定存在于目的细胞附近的酶。可以在形成所述可活化的CendR元件之前鉴定存在于目的细胞附近的酶。可以基于存在于目的细胞附近的酶选择所述可切割键。可以在形成所述可活化CendR元件之前选择所述可切割键。所述CendR元件可以包含末端羧基，其中所述封闭基团偶联于所述末端羧基。
还公开了形成可活化的CendR元件的方法，所述方法包括使一个封闭基团共价偶联于一个CendR元件，其中偶联所述封闭基团和所述CendR元件的键是可切割的。还公开了形成可活化的CendR元件的方法，所述方法包括使一个封闭基团共价偶联于一条氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含CendR元件，其中偶联所述封闭基团和所述CendR元件的键是可切割的。还公开了形成可活化的CendR元件的方法，所述方法包括(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或组织穿透，其中所述氨基酸序列包含CendR元件，以及(b)使一个封闭基团共价偶联于所述CendR元件，其中偶联所述封闭基团和所述CendR元件的键是可切割的。共价偶联于所述CendR元件的所述封闭基团可减少或阻止细胞内化和/或组织穿透。与无封闭基团的相同CendR元件相比，共价偶联于所述CendR元件的所述封闭基团可以减少或阻止细胞内化和/或组织穿透。所述可活化的CendR元件可以包含所述选择的氨基酸序列和所述封闭基团。所述细胞可以在受试者中。可以鉴定存在于目的细胞附近的酶。可以在形成所述可活化CendR元件之前鉴定存在于目的细胞附近的酶。可以基于存在于目的细胞附近的酶选择所述可切割键。可以在形成所述可活化CendR元件之前选择所述可切割键。所述CendR元件可以包含末端羧基，其中所述封闭基团偶联于所述末端羧基。运载组合物可以共价偶联于或非共价缔合于一种包含所述选择的氨基酸序列的蛋白或肽。所述运载组合物可以偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。
所述CendR元件可以具有最多10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、400、500、1000或2000个残基的长度。在具体的实施方案中，CendR元件可以具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或200个残基的长度。在又一些实施方案中，CendR元件可以具有2-200个残基、2-100个残基、2-90个残基、2-80个残基、2-70个残基、2-60个残基、2-50个残基、2-40个残基、2-30个残基、2-20个残基、2-15个残基、2-10个残基、3-200个残基、3-100个残基、3-90个残基、3-80个残基、3-70个残基、3-60个残基、3-50个残基、3-40个残基、3-30个残基、3-20个残基、3-15个残基、3-10个残基、4-200个残基、4-100个残基、4-90个残基、4-80个残基、4-70个残基、4-60个残基、4-50个残基、4-40个残基、4-30个残基、4-20个残基、4-15个残基、4-10个残基、5-200个残基、5-100个残基、5-90个残基、5-80个残基、5-70个残基、5-60个残基、5-50个残基、5-40个残基、5-30个残基、5-20个残基、5-15个残基、5-10个残基、10-200个残基、10-100个残基、10-90个残基、10-80个残基、10-70个残基、10-60个残基、10-50个残基、10-40个残基、10-30个残基、10-20个残基、20-200个残基、20-100个残基、20-90个残基、20-80个残基、20-70个残基、20-60个残基、20-50个残基、20-40个残基或者20-30个残基的长度。本文使用的术语“残基”是指氨基酸或氨基酸类似物。
CendR缀合物的蛋白或肽部分可以具有最多50、100、150、200、250、300、400、500、1000或2000个残基的长度。在具体的实施方案中，CendR缀合物的蛋白或肽部分可以具有至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或200个残基的长度。在又一些实施方案中，CendR缀合物的蛋白或肽部分可以具有2-200个残基、2-100个残基、2-90个残基、2-80个残基、2-70个残基、2-60个残基、2-50个残基、2-40个残基、2-30个残基、2-20个残基、2-15个残基、2-10个残基、3-200个残基、3-100个残基、3-90个残基、3-80个残基、3-70个残基、3-60个残基、3-50个残基、3-40个残基、3-30个残基、3-20个残基、3-15个残基、3-10个残基、4-200个残基、4-100个残基、4-90个残基、4-80个残基、4-70个残基、4-60个残基、4-50个残基、4-40个残基、4-30个残基、4-20个残基、4-15个残基、4-10个残基、5-200个残基、5-100个残基、5-90个残基、5-80个残基、5-70个残基、5-60个残基、5-50个残基、5-40个残基、5-30个残基、5-20个残基、5-15个残基、5-10个残基、10-200个残基、10-100个残基、10-90个残基、10-80个残基、10-70个残基、10-60个残基、10-50个残基、10-40个残基、10-30个残基、10-20个残基、20-200个残基、20-100个残基、20-90个残基、20-80个残基、20-70个残基、20-60个残基、20-50个残基、20-40个残基或者20-30个残基的长度。
所述CendR缀合物可以具有最多50、100、150、200、250、300、400、500、1000或2000个残基的长度。在具体的实施方案中，CendR缀合物可以具有至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或200个残基的长度。在又一些实施方案中，CendR缀合物可以具有5-200个残基、5-100个残基、5-90个残基、5-80个残基、5-70个残基、5-60个残基、5-50个残基、5-40个残基、5-30个残基、5-20个残基、5-15个残基、5-10个残基、10-200个残基、10-100个残基、10-90个残基、10-80个残基、10-70个残基、10-60个残基、10-50个残基、10-40个残基、10-30个残基、10-20个残基、20-200个残基、20-100个残基、20-90个残基、20-80个残基、20-70个残基、20-60个残基、20-50个残基、20-40个残基或者20-30个残基的长度。
应理解，有多种氨基酸和肽类似物可引入至所公开的组合物中。例如，有多种D氨基酸或者可使用的氨基酸。公开了天然存在的肽的相反立体异构体，以及肽类似物的立体异构体。通过以下方式可容易地将这些氨基酸引入多肽链中：使tRNA分子负载选定的氨基酸，构建使用例如琥珀密码子的遗传构建体，以将氨基酸类似物以位点特异性的方式插入至肽链中(Thorson et al.，Methods in Molec.Biol.77：43-73(1991)，Zoller，Current Opinion in Biotechnology，3：348-354(1992)；Ibba，Biotechnology & Genetic Enginerring Reviews 13：197-216(1995)，Cahill et al.，TIBS，14(10)：400-403(1989)；Benner，TIB Tech，12：158-163(1994)；Ibba and Hennecke，Bio/technology，12：678-682(1994)，至少就与氨基酸类似物有关的内容，将所有这些参考文献通过引用的方式纳入本文)。
可以产生与肽类似、但非经天然肽键连接的分子。例如，氨基酸或氨基酸类似物的连接可包括CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、--CH＝CH--(顺式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2-和--CHH2SO-(这些及其他连接可以参见Spatola，A.F.in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides，and Proteins，B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)；Spatola，A.F.，Vega Data(March 1983)，Vol.1，Issue 3，Peptide Backbone Modifications(general review)；Morley，Trends Pharm Sci(1980)pp.463-468；Hudson，D.et al.，Int J Pept Prot Res14：177-185(1979)(--CH2NH--，CH2CH2--)；Spatola et al.Life Sci38：1243-1249(1986)(--CH H2--S)；Hann J.Chem.Soc Perkin Trans.I307-314(1982)(--CH--CH--，顺式和反式)；Almquist et al.J.Med.Chem.23：1392-1398(1980)(--COCH2--)；Jennings-White et al.Tetrahedron Lett23：2533(1982)(--COCH2--)；Szelke et al.European Appln，EP 45665 CA(1982)：97：39405(1982)(--CH(OH)CH2--)；Holladay et al.Tetrahedron.Lett 24：4401-4404(1983)(--C(OH)CH2--)；以及Hruby Life Sci 31：189-199(1982)(--CH2--S--)；这些文献的每一篇通过引用的方式纳入本文)。特别优选的非肽键为--CH2NH--。应理解，肽类似物可以有多于一个原子位于键合原子之间，例如b-丙氨酸、g-氨基丁酸等。
氨基酸类似物和肽类似物经常具有增强的性质或所需的性质，例如生产更经济、化学稳定性更高、药理学性质更强(半衰期、吸收、能力、效力等)、特异性改变(例如广谱的生物活性)、抗原性减少等。
D氨基酸可以用于生成更稳定的肽，这是因为D氨基酸不被肽酶等识别。以同类型的D氨基酸全面地置换共有序列的一种或多种氨基酸(例如以D赖氨酸代替L-赖氨酸)可以用于生成更稳定的肽。半胱氨酸残基可以用于环化两条或更多条肽或者将两条或更多条肽连接在一块。这可有利于将肽限制在具体的构象中(Rizo and Gierasch Ann.Rev.Biochem.61：387(1992)，通过引用的方式纳入本文)。
公开了如下多功能CendR缀合物：其除了包含所述CendR元件之外，还包含例如融合于具有不同功能的第二肽的归巢肽。这类多功能缀合物具有由全长分子不同部分贡献的至少两种功能，并且除了选择性归巢活性外，还可以展示例如抗血管生成活性或促凋亡活性。
本文使用的术语“肽”广义上用于指肽、蛋白、蛋白片段等。本文使用的术语“拟肽”是指具有其结构所来源的肽的活性的肽样分子。这类拟肽包括化学修饰的肽、包含非天然存在的氨基酸的肽样分子，以及类肽，并且具有例如所述拟肽所源自的肽的活性(参见例如Goodman and Ro，Peptidomimetics for Drug Design，in″Burger′s Medicinal Chemistry and Drug Discovery″Vol.1(ed.M.E.Wolff；John Wiley & Sons 1995)，pages 803-861)。
本文公开的术语“运载组合物”是指可以用于与所述CendR元件缀合的物质的任意组合物。例如，运载组合物可以是分子、缀合物、分子缔合物、组合物、混合物。本领域技术人员可以确定什么载物可以偶联于CendR缀合物。本文公开的CendR缀合物可以包含偶联于或缔合于所述运载组合物的CendR元件。运载组合物的实例包括但不限于抗血管生成剂、促血管生成剂、癌症化学治疗剂、细胞毒剂、抗炎剂、抗关节炎剂、多肽、核酸分子、小分子、纳米颗粒、微粒、荧光团、荧光素、罗丹明、放射性核素、铟-111、锝-99、碳-11、碳-13或它们的结合。在CendR缀合物中与CendR元件连接的这些运载组合物可以是部分(moiety)。本文使用的术语“部分”广义上是指通常将生物学上有用的功能赋予连接的运载组合物的物理材料、化学材料或生物材料。部分可以是任何天然的或非天然的材料，包括但不限于：生物材料，例如细胞、噬菌体或其他病毒；有机化学物，例如小分子；纳米颗粒、放射性核素；核酸分子或寡核苷酸；多肽；或者肽。例如，作用于靶标的部分，例如具有治疗效应的部分；或者有利于靶标的检测、可视化或成像的部分，例如荧光分子或放射性核素。
所公开的CendR缀合物的组分可以以任何合适的方式结合、连接和/或偶联。例如，所述部分和归巢分子可以共价地或非共价地，直接地或间接地，或者有或无接头部分的情况下连接。
在一些实施方案中，CendR缀合物可以包含癌症化学治疗剂。例如，CendR缀合物的运载组合物可以是癌症化学治疗剂。本文使用的“癌症化学治疗剂”为抑制癌细胞的增殖、生长、生存期或转移活性的化学剂。这类癌症化学治疗剂可为如下物质但不限于此：紫杉烷如多西他赛(docetaxel)；蒽环类药物如多柔比星；烷化剂；长春花生物碱；抗代谢药；铂剂如顺铂或卡铂；类固醇如甲氨蝶呤；抗生素如阿霉素；异环磷酰胺；或者，选择性雌激素受体调节剂；抗体如曲妥珠单抗。
CendR缀合物可以包含治疗剂。例如，所述CendR缀合物的运载组合物可以为一种治疗剂。有用的治疗剂可为例如细胞毒剂，本文中使用的细胞毒剂可以为任何直接或间接促进细胞死亡的分子。有用的细胞毒剂包括但不限于小分子、多肽、肽、拟肽、核酸分子、细胞和病毒。作为非限制的实例，有用的细胞毒剂包括细胞毒小分子如多柔比星、多西他赛或曲妥珠单抗；抗微生物肽，例如下文进一步描述的那些；促凋亡多肽例如半胱天冬蛋白酶类(caspase)和毒素，例如半胱天冬蛋白酶-8(caspase-8)；白喉毒素A链、假单胞菌外毒素A、霍乱毒素、配体融合毒素例如DAB389EGF、蓖麻毒素(蓖麻毒蛋白)；以及，细胞毒细胞例如细胞毒T细胞。参见，例如Martin et al.，Cancer Res.60：3218-3224(2000)；Kreitman and Pastan，Blood 90：252-259(1997)；Allam et al.，Cancer Res.57：2615-2618(1997)；和Osborne and Coronado-Heinsohn，Cancer J.Sci.Am.2：175(1996)。本领域技术人员可理解，本文描述的或本领域中已知的这些或其他细胞毒剂可用于所公开的缀合物和方法中。
在某些形式中，治疗剂可以为治疗性多肽。本文使用的治疗性多肽可以是任何具有生物有用功能的多肽。可用的治疗性多肽包括但不限于：细胞因子、抗体、细胞毒多肽；促凋亡多肽；以及，抗血管生成多肽。作为非限制性实例，可用的治疗性多肽可以为细胞因子例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素-α(IFN-α)；干扰素γ(IFN-γ)、白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、白介素-7(IL-7)、白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)、淋巴细胞趋化因子(LTN)或树突细胞趋化因子1(DC-CK1)；抗HER2抗体或其片段；细胞毒性多肽，包括毒素或半胱天冬蛋白酶，例如白喉毒素A链、假单胞菌外毒素A、霍乱毒素、配体融合毒素例如DAB389EGF或蓖麻毒蛋白；或者抗血管生成多肽，例如血管抑制素、血管内皮抑制素、血小板反应素、血小板因子4；anastellin；或者本文进一步描述的或本领域中已知的那些中的一种。应理解的是，具有生物活性的这些多肽和其他多肽可以为“治疗性多肽”。
用于所公开的CendR缀合物中的治疗剂可以是抗血管生成剂。本文使用的术语“抗血管生成剂”是指减少或阻止血管发生的分子，血管发生是指血管的生长发育。所述缀合物可用于治疗或诊断任何与血管发生相关的疾病、病症或障碍。例如，可诊断和/或治疗黄斑变性和糖尿病血管并发症。多种抗血管生成剂可通过常规方法制备。这类抗血管生成剂包括但不限于：小分子；蛋白，例如负显性形式的血管发生因子、转录因子和抗体；肽；以及核酸分子，包括核酶、反义寡核苷酸和编码例如负显性形式的血管发生因子和受体、转录因子和抗体及其抗原结合片段的核酸分子。参见，例如Hagedorn and Bikfalvi，Crit.Rev.Oncol.Hematol.34：89-110(2000)和Kirsch et al.，J.Neurooncol.50：149-163(2000)。
可用的治疗剂的一些其他实例包括氮芥、亚硝基脲(nitrosoruea)、乙撑亚胺、烷基磺酸盐、四嗪、铂化合物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗代谢物、叶酸类似物、蒽环类、紫杉烷类、长春碱类、拓扑异构酶抑制剂和激素制剂。示例性化学治疗药物有放线菌素-D、爱克兰(Alkeran)、阿糖胞苷(Ara-C)、阿那曲唑(Anastrozole)、天冬酰胺酶、卡氮芥(BiCNU)、比卡鲁胺(Bicalutamide)、博莱霉素、白消安(Busulfan)、卡培他滨、卡铂、碳铂、卡莫司汀、罗氮芥(CCNU)、苯丁酸氮芥、Chlomaphazine、Cholophosphamide、顺铂、克拉屈滨、CPT-11、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、阿糖胞苷(Cytarabine)、阿糖胞苷(Cytosine arabinoside)、环磷酰胺(Cytoxan)、达卡巴嗪(Dacarbazine)、更生霉素、柔红霉素、右雷佐生(Dexrazoxane)、多西他赛、多柔比星、DTIC、表柔比星、雌莫司汀(Estramustine)、乙撑亚胺、依托泊苷、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟他胺、福莫司汀、吉西他滨、赫赛汀、六甲胺、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺(Ifosfamide)、伊立替康、洛莫司汀、氮芥(Mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、Novembiehin、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸(Pamidronate)、喷司他丁、苯芥胆甾醇(Phenesterine)、普卡霉素、泼尼莫司汀、丙卡巴肼、利妥昔单抗(Rituximab)、类固醇、链佐星、STI-571、链佐星、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、四嗪、硫鸟嘌呤、塞替哌(Thiotepa)、雷替曲塞、托泊替康、曲奥舒凡、三甲曲沙、曲磷胺、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、VP-16和希罗达。烷基化剂如塞替派；烷基磺酸盐如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶如Benzodopa、卡波醌、麦吞多派(Meturedopa)和尤里多派(Uredopa)；乙撑亚胺和甲基氨基吖啶，包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫化磷酰胺和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；硝基脲，例如卡莫司汀(Cannustine)、氯脲菌素(Chlorozotocin)、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，例如阿柔比星(Aclacinomysin)、放线菌素、Authramycin、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡奇霉素(Calicheamicin)、卡柔比星(Carabicin)、洋红霉素(Caminomycin)、嗜癌素(Carzinophilin)、色霉素(Chromoinycin)、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星(Idambicin)、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(Potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(Quelamycin)、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素(Tubercidin)、乌苯美司(Ubenimex)、净司他丁(Zinostatin)和佐柔比星；抗代谢物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如氨基二甲叶酸(Denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟(Carmofur)、阿糖胞苷(Cytarabine)、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷和5-FU；雄激素，例如卡普睾酮、屈他雄酮、环硫雄醇、Rnepitiostane和睾内酪；抑肾上腺药，例如氨鲁米特、米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；Bestrabucil；比生群；依达曲沙(Edatraxate)；地磷酰胺(Defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(Elfornithine)；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶(Nitracrine)；喷司他丁；蛋氨氮芥(Phenamet)；吡柔比星；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼；PSK.RTM.；雷佐生；Sizofrran；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；Gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉醇类(taxoids)，例如紫杉醇(Paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多烯紫杉醇(Doxetaxel)(
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Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(Navelbine)；能灭瘤(Novantrone)；替尼泊苷；柔红霉素；氨基喋呤；希罗达(Xeloda)；伊班膦酸盐(Ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯培拉霉素(Esperamicin)；卡培他滨；以及上述任一物质的可药用盐、酸或衍生物。还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用效果的抗激素剂，例如抗雌激素类，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳化酶抑制剂4(5)-咪唑、4羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬(keoxifene)、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通(Fareston))；抗雄激素类，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、醋酸亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任一物质的可药用盐、酸或衍生物。
所述CendR缀合物还可以包含可检测试剂。这类可检测试剂可以是所述CendR缀合物的运载组合物，可以包含所述CendR缀合物的运载组合物的一部分，或者可以是与所述分子或部分分开的所述CendR缀合物的组分。多种可检测试剂可用于所公开的方法中。本文中使用的术语“可检测试剂”是指任何可被检测的分子。可用的可检测试剂包括可体内给予并且随后被检测的部分。用于所公开的缀合物和成像方法中的可检测试剂包括但不限于放射标记物和荧光分子。例如，所述可检测试剂可以为任何有利于直接或间接检测的部分，所述检测优选通过非侵入和/或体内可视化技术。例如，可检测试剂可通过任何已知的成像技术(包括例如放射学技术)检测。可检测试剂可以包括例如造影剂，例如离子型造影剂或非离子型造影剂。例如，在一些实施方案中，所述可检测试剂包含钽化合物和/或钡化合物，例如硫酸钡。在一些实施方案中，所述可检测试剂包含碘，例如放射性碘。例如，在一些实施方案中，所述可检测试剂包含有机碘酸，例如碘羧酸、三碘酚、碘仿和/或四碘乙烯。在一些实施方案中，所述可检测试剂包含非放射性可检测试剂，例如非放射性同位素。例如，在一些实施方案中Gd可以被用作非放射性可检测试剂。可检测试剂还可以包括放射性同位素、酶、荧光团和量子点
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例如，所述检测部分可以是酶、生物素、金属或表位标签。其他已知的或新发现的可检测标记物被考虑用于所提供的缀合物中。
所公开的CendR缀合物可以在可药用的载体中进行体内给药。“可药用的”是指一种不是生物学上或其他方面不利的材料，即所述材料可以与核酸或载体一起给予受试者，而不引起任何不利的生物作用，或者不会与包含它的药物组合物中的任何其他成分以有害的方式相互作用。如本领域技术人员熟知的，载体的选择应理所当然地使所述活性成分的任何降解最小并且使所述受试者中的任何副作用最小。所述材料可以在溶液、悬液中(例如，引入至微粒、脂质体或细胞中)。
所述CendR缀合物可与可药用载体联合用于治疗中。合适的载体及其制剂描述于Remington：The Science and Practice of Pharmacy(19th ed.)ed.A.R.Gennaro，Mack Publishing Company，Easton，PA 1995。一般而言，合适量的可药用盐用于制剂中使该制剂等渗。可药用载体的实例包括但不限于生理盐水、林格氏液和葡萄糖溶液。溶液的pH值优选为约5到约8，更优选为约7至约7.5。其他载体包括缓释制剂如含有抗体的固体疏水性聚合物的半透基质，该基质是特型制品形式，例如薄膜、脂质体或微粒。对于本领域技术人员而言显而易见的是，某些载体可能更优选，这取决于例如待给药组合物的给药途径和浓度。
药物制剂可以包括一种作为活性成分的组合物，所述组合物包含靶蛋白或多肽的至少一个表位，所述至少一个表位能够诱导可结合于血凝素茎区的至抗体。或者，药物组合物可包括一种作为活性成分的组合物，所述组合物包含用于结合血凝素茎区的至少一个表位的抗体的至少免疫部分。
所述制剂可以以其自身形式或者以药物组合物形式给予至受试者或生物体，在所述药物组合物中它与合适的载体或赋形剂混合。
本文使用的“药物组合物”是指本文描述的一种或多种活性成分与其他化学组分例如生理上适合的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是为了有利于将一种化合物给予受试者或生物体。
本文的术语“活性成分”是指赋以生物效应的制剂。
本文使用的短语“生理上可接受的载体”和“可药用的载体”可互换使用，其是指，不会导致对受试者或生物体的明显刺激并且不会消除给药的化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。这些短语涵盖辅料。
本文中的术语“赋形剂”是指添加至药物组合物中以进一步有利于活性成分给药的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各类淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
用于药物配制和给药的技术可以见Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，(最新版)，其通过引用的方式纳入本文。
合适的给药途径可以包括例如口服、直肠给药、经粘膜给药(特别是经鼻)，经肠给药或非肠胃给药(除鞘内注射、直接心室内注射、静脉注射、腹膜内注射、鼻内注射或眼内注射外，还包括肌内注射、皮下注射和髓内注射)。或者，可以以局部而非全身的方式给予制剂。
药物组合物可以通过本领域中公知的方法制备，例如借助常规的混合、溶解、制粒、制糖衣片、水飞法、乳化、囊化、包封或冻干的方法。
用于所公开方法中的药物组合物则可以以常规的方式使用一种或多种生理上可接受的载体配制，所述载体包括赋形剂和助剂，这些载体有利于将所述活性成分加工至可药用的制剂中。合适的配方依赖于选择的给药途径。
对于注射，可以将活性成分配制于水性溶液中，优选配至生理上相容的缓冲液中，例如Hank溶液、林格溶液或生理盐缓冲液。对于经粘膜给药，在配方中使用适合透过所述屏障的渗透剂。这类渗透剂在本领域中是公知的。
对于口服给药，所述化合物可以通过将活性化合物与本领域公知的可药用载体混合而容易地配制。这类载体能够使化合物配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体、凝胶剂、糖浆、浆体、悬浮剂等，用于患者口服。口服使用的药物制剂可以使用固体赋形剂制备，任选研磨形成的混合物，以及在根据需要加入合适的助剂后加工所述颗粒混合物，以得到片剂或糖衣片片心。具体而言，合适的赋形剂有填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素制品，例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素纳；以及/或者生理上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。根据需要，可以加入崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或者海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。
对糖衣片片心提供有合适的包衣。对于该目的，可以使用浓缩糖溶液，其任选包含阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或色素加入片剂或糖衣片包衣中用于识别，或者以表征不同的活性化合物剂量的组合。
可以口服使用的药物组合物包括明胶制成的推入密封式胶囊剂(push-fit capsule)，以及明胶和增塑剂(例如甘油或山梨糖醇)制成的封闭软胶囊剂。推入密封式胶囊剂可以包含活性成分与以下物质的混合：填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉、润滑剂如滑石或硬脂酸镁以及任选的稳定剂。在软胶囊中，活性成分可溶解或悬浮于合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以加入稳定剂。所有用于口服的配方成分应为适合于所选给药途径的剂量。
对于含服给药，所述组合物可以取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于鼻吸给药，用于所公开方法中的活性成分可以方便地以气雾喷雾的形式递送，所述气雾喷雾由压缩包或者使用合适推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳的雾化器呈递。在压缩气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供递送计定量的阀确定。用于分配器中的例如明胶的胶囊剂和药筒可配制为包含所述化合物和合适的粉基例如乳糖或淀粉的混合粉末的形式。
本文描述的制剂可以配制用于肠胃外给药，例如通过推注或连续输注。用于注射的制剂可以以单剂型形式存在(例如在安瓿瓶中)，或者与任选加入的防腐剂一块存在于多剂量容器中。所述组合物可以为油性或水性载体中的悬液、溶液或乳剂，并且可以包含配制试剂例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外给药的药物组合物包括水溶形式的活性制剂的水溶液。另外，活性成分的悬液可以制备为合适的油基或水基注射悬液。合适的亲脂溶剂或载体包括脂肪油如麻油或者合成脂肪酸酯如油酸乙酯、三酸甘油酯或脂质体。水性注射悬液可包含增加所述悬液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，所述悬液还可以含有合适的稳定剂，或者增加活性成分溶解度以使得可配制更高浓度的溶液的试剂。
或者，所述活性成分可以为粉剂形式，用于在使用之前与合适的载体例如基于无菌、无热源的水溶液组合。
所述制剂还以配制为直肠组合物如栓剂或保留灌肠剂，例如使用常规的栓剂基质如可可脂或其他甘油酯。
用于本申请公开的方法中的药物组合物包括这样的组合物，即其包含含量可有效实现预期目的的活性成分。更具体而言，治疗有效量是指活性成分的量可有效阻止、减轻或改善疾病症状，或者延长进行治疗的受试者的存活时间。
对治疗有效量的确定是本领域技术人员能力所能及的，尤其在依照本文提供的详细公开内容的情况下。
对于本申请公开的方法中使用的任意制剂，治疗有效量或剂量最初可以通过体外和细胞培养测定来估计。例如，可以在动物模型中配制一个剂量以达到所需的循环系统抗体浓度或效价。这类信息可用于更准确地确定人体的可用剂量。
本文描述的活性成分的毒性和治疗有效性可以通过标准的药学方法在体外、在细胞培养物或实验动物中确定。从这些体外和细胞培养测定和动物研究中获得的数据可以用于制定人体使用的一系列剂量。该剂量可以变化，这取决于采用的剂型以及使用的给药途径。确切的配方、给药途径和剂量可由各医师视患者情况选择。(参见例如Fingl et al in The Pharmacological Basis of Therapeutics，Ch.1 p.1.(1975))。
剂量的量和间隔时间可个别地调整以提供足以阻止或减少病毒进入的血浆抗体(最低有效浓度，MEC)。每种制剂的MEC会不同，但可以从体外数据估测。达到MEC所需的剂量将取决于个体特征和给药途径。结合测定可用于确定血浆浓度。
剂量间隔还可以使用MEC值确定。应使用这样的方案给予制剂，即该方案可保持血浆水平高于MEC达10-90％的时间，优选30-90％，最优选50-90％。
根据待治疗的病症的严重度和反应性，给药方案可以确定为单次给药或多次给药，治疗过程持续数日至数周，或者直至完成治愈或达到疾病状态减轻。
待给药的组合物的量当然应取决于治疗的受试者、病痛的严重度、给药方式、处方医生的判断等。
可以缀合于所公开的缀合物的脂肪酸(即脂质)包括使所述肽有效掺入脂质体中的脂肪酸。通常，所述脂肪酸是极性脂质。因此，所述脂肪酸可以是磷脂。所提供的缀合物可以包含天然磷脂或合成磷脂。所述磷脂可以选自包含饱和或不饱和单取代或二取代脂肪酸的磷脂及其结合物。例如，这些磷脂可以为二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰丝氨酸、二油酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、棕榈酰油酰磷脂酰丝氨酸、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺、棕榈酰油酰磷脂酰甘油、棕榈酰油酰磷脂酸、棕榈反油酰油酰磷脂酰胆碱(palmitelaidoyloleoylphosphatidylcholine)、棕榈反油酰油酰磷脂酰丝氨酸、棕榈反油酰油酰磷脂酰乙醇胺、棕榈反油酰油酰磷脂酰甘油、棕榈反油酰油酰磷脂酸、肉豆蔻油酰油酰磷脂酰胆碱、肉豆蔻油酰油酰磷脂酰丝氨酸、肉豆蔻油酰油酰磷脂酰乙醇胺、肉豆蔻油酰油酰磷脂酰甘油、肉豆蔻油酰油酰磷脂酸、二亚油酰磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰丝氨酸、二亚油酰磷脂酰乙醇胺、二亚油酰磷脂酰甘油、二亚油酰磷脂酸、棕榈酸亚油酰磷脂酰胆碱、棕榈酸亚油酰磷脂酰丝氨酸、棕榈酸亚油酰磷脂酰乙醇胺、棕榈酸亚油酰磷脂酰甘油、棕榈酸亚油酰磷脂酸。这些磷脂还可以为磷脂酰胆碱(溶血磷脂酰胆碱)、磷脂酰丝氨酸(溶血磷脂酰丝氨酸)、磷脂酰乙醇胺(溶血磷脂酰乙醇胺)、磷脂酰甘油(溶血磷脂酰甘油)和磷脂酸(溶血磷脂酸)的单酰化衍生物。这些溶血磷脂酰衍生物中的单酰基链可以是棕榈酰基、油酰基、棕榈油酰基、亚油酰肉豆蔻酰基或肉豆蔻油酰基。所述磷脂还可以是合成的。合成磷脂可容易从多种来源通过商业途径获得，例如AVANTI Polar Lipids(Albaster，Ala.)；Sigma Chemical Company(St.Louis，Mo.)。这些合成化合物可以不同，并且可以具有在天然磷脂中没有的其脂肪酸侧链的变化。所述脂肪酸可以在PS和/或PC中具有链长为C14、C16、C18或C20的不饱和脂肪酸侧链。合成磷脂可以具有作为组分的二油酰(18:1)-PS；棕榈酰(16:0)-油酰(18:1)-PS、二肉豆蔻酰(14:0)-PS；二棕榈油酰(16:1)-PC、二棕榈酰(16:0)-PC、二油酰(18:1)-PC、棕榈酰(16:0)-油酰(18:1)-PC和肉豆蔻酰(14:0)-油酰(18:1)-PC。因此，例如，所提供的缀合物可以包含棕榈酰16:0。
所述运载组合物可以是微粒或纳米颗粒，例如纳米球、纳米壳、纳米虫(nanoworm)、产热纳米壳等。本文使用的“纳米壳”是这样的纳米颗粒，即其具有被一个或多个导电壳层包围的不连续电介质或半导电核心部分。据此就制备和使用金属纳米壳的方法的教导，将美国专利6,530,944通过引用的方式全文纳入本文。纳米壳可以以例如电介质或惰性材料如硅的核心形成，涂覆有可以通过辐照如近红外线(大约800-1300nm)激发的材料(例如高导电金属)。激发后，纳米壳会发热。形成的高热作用可杀灭周围的细胞或组织。所述纳米壳的壳和核心的联合直径为数十至数百纳米。近红外线由于具有穿透组织的能力而是有利的。还可以使用其他类型的辐射，这取决于所选的纳米颗粒涂料和靶向的细胞。实例包括x射线、磁场、电场和超声。所述颗粒还可以用于促进成像，特别是对于使用红外散射光子成像(infrared diffuse photon imaging)的方法。靶向分子可以是抗体或其片段、具体受体的配体或者其他特异性结合靶向细胞表面的蛋白。
所述运载组合物可以共价连接于或非共价缔合于例如所公开的蛋白、肽、氨基酸序列或CendR元件。所述运载组合物可以例如连接于所公开的蛋白、肽、氨基酸序列或CendR元件的氨基末端；连接于所公开的蛋白、肽、氨基酸序列或CendR元件的内部氨基酸；连接于所公开的蛋白、肽、氨基酸序列或CendR元件的羧基末端；连接于所述蛋白、肽、氨基酸序列的所述CendR元件的N端侧；经接头连接于所公开的蛋白、肽、氨基酸序列或CendR元件；或者上述的组合。所公开的CendR缀合物还可包含将所述运载组合物连接至公开的蛋白、肽、氨基酸序列或CendR元件的接头。所公开蛋白、肽、氨基酸序列或CendR元件还可以缀合于涂覆分子例如牛血清白蛋白(BSA)(参见Tkachenko et al.，(2003)J Am Chem Soc，125，4700-4701)，这可用于以所述蛋白、肽、氨基酸序列或CendR元件涂覆所述纳米颗粒、纳米虫、纳米壳等。
可以用于将所述运载组合物交联于所公开肽的蛋白交联剂是本领域中已知的，其是基于用途和结构进行定义的，它们包括DSS(双琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、DSP(二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯))、DTSSP(3，3′-二硫代双(硫代琥珀酰亚胺基丙酸酯))、SULFOBSOCOES(双[2-(硫代琥珀酰亚胺氧代羰基氧)乙基]砜)、BSOCOES(双[2-(琥珀酰亚胺氧代羰基氧)乙基]砜)、SULFO DST(二硫代琥珀酰亚胺基酒石酸酯)、DST(二琥珀酰亚胺基酒石酸酯)、SULFO EGS(乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯))、EGS(乙二醇双(硫代琥珀酰亚胺基琥珀酸酯))、DPDPB(1，2-二[3′-(2′-吡啶二硫代)丙酰胺]丁烷)、BSSS(双(硫代琥珀酰亚胺基)辛二酸酯)、SMPB(琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯)、SULFO SMPB(硫代琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯)、MBS(3-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、SULFO MBS(3-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯)、SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯)、SULFO SIAB(N-硫代琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯)、SMCC(琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯)、SULFO SMCC(硫代琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯)、NHS LC SPDP(琥珀酰亚胺基-6-[3-(2-吡啶二硫代)丙酰氨)己酸酯)、SULFO NHS LC SPDP(硫代琥珀酰亚胺基-6-[3-(2-吡啶二硫代)丙酰氨)己酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯)、NHS BROMOACETATE(N-羟基琥珀酰亚胺基溴乙酸酯)、NHS IODOACETATE(N-羟基琥珀酰亚胺基碘乙酸酯)、MPBH(4-(N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼盐酸盐)、MCCH(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酰肼盐酸盐)、MBH(间马来酰亚胺苯甲酸酰肼盐酸盐)、SULFO EMCS(N-(ε-马来酰亚胺己酰基氧)硫代琥珀酰亚胺)、EMCS(N-(ε-马来酰亚胺己酰基氧)琥珀酰亚胺)、PMPI(N-(对马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯)、KMUH(N-(κ-马来酰亚胺十一酸)酰肼)、LC SMCC(琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧基(6-氨基己酸酯))、SULFO GMBS(N-(γ-马来酰亚胺丁氧基)硫代琥珀酰亚胺酯)、SMPH(琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺丙酰胺己酸酯))、SULFO KMUS(N-(κ-马来酰亚胺十一酰基氧)硫代琥珀酰亚胺酯)、GMBS(N-(γ-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺)、DMP(盐酸二甲基庚二酰亚胺)、DMS(盐酸二甲基辛二酰亚胺)、MHBH(Wood试剂)(盐酸甲基对羟基苯甲酰亚胺，98％)、DMA(盐酸二甲基己二酰亚胺)。
公开了偶联于CendR元件归巢分子，该归巢分子是为了将所述CendR元件选择性递送至指定细胞，从而形成归巢CendR缀合物。多种归巢分子可用于所公开的组合物、缀合物和方法中。这类归巢分子非限制性地包括本文公开的肽。所公开的化合物、组合物、缀合物和方法可以包括或使用多种形式的所公开归巢分子，包括所公开的肽和拟肽。为了方便表述，在本文许多地方将描述为使用或包括肽。应理解的是，在这类情况下应认为，还可以以如术语肽中描述的相同或相似方式使用或包括多种形式的归巢分子，并从而具体地考虑及公开这类使用和包括。
本文使用的术语“归巢分子”是指体内优先于正常组织地选择性归巢于肿瘤或其他特定组织。类似地，术语“归巢肽”或“归巢拟肽”是指体内优先于正常组织地选择性归巢于再生组织、伤口或肿瘤的肽。应理解，体内选择性归巢于再生组织、伤口或肿瘤的归巢分子可表现出优先归巢于再生组织、伤口或肿瘤。
“选择性归巢”是指，与非靶相比，所述归巢分子在体内优先结合于所述靶。例如，与非肿瘤相比，归巢分子优先归巢于肿瘤。选择性归巢于例如肿瘤细胞的特征一般在于，与非肿瘤细胞的多种组织类型相比，在肿瘤细胞中的定位高出至少2倍。归巢分子的分子的特征可在于，与大多数或所有非癌症细胞相比，在癌细胞中的定位优先5倍、10倍、20倍或更高。因此，应理解的是，在一些情况下，除了归巢于肿瘤，归巢分子会部分地归巢于一种或多种正常器官。选择性归巢还可称作靶向。
在归巢分子识别和/或结合其靶的情形下，结合可以指共价和非共价结合，例如其中归巢分子可通过共价和/或非共价结合作用而结合、附着或偶联于其靶。结合可以是高亲和性或低亲和性的，优选高亲和性。可能有用的结合力的实例包括但不限于：共价键、偶极作用、静电力、氢键、疏水作用、离子键和/或范德华力。该结合作用可以与所述CendR元件的结合作用同时存在。
“治疗”是指意在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状态或病症而对患者进行的医学处理。该术语包括积极治疗，即治疗特别旨在改善疾病、病理状态或病症，并且还包括病因治疗，即治疗旨在除去相关疾病、病理状态或病症的病因。另外，该术语包括姑息治疗，即为减轻症状而非治愈疾病、病理状态或病症而设计的治疗；预防性治疗，即旨在尽可能阻止或者部分或完全抑制相关疾病、病理症状或病症发展的治疗；以及支持性治疗，即用于补充另一种旨在改善相关疾病、病理症状或病症的特定疗法的治疗。
本文使用的“受试者”包括，但不限于动物、植物、细菌、病毒、寄生物以及任何其他具有核酸的生物或实体。所述受试者可以是脊椎动物，更具体而言是哺乳动物(例如人、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、非人类灵长动物、牛、猫、豚鼠或啮齿动物)、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物。所述受试者可以是无脊椎动物，更具体而言是节肢动物(例如昆虫和甲壳动物)。该术语不表示具体的年龄或性别。因此，意欲涵盖雄性或雌性的成年受试者和新生受试者，以及胎儿。患者是指受疾病或病症之痛的受试者。术语“患者”包括人和兽医受试者。在子宫内膜异位症和子宫内膜异位症细胞的情形中，应理解受试者为具有或可能具有子宫内膜异位症和/或子宫内膜异位症细胞的受试者。
实施例
下面给出的实施例为本领域普通技术人员提供了关于如何制得和评估本申请所要求保护的化合物、组合物、物品、装置和/或方法的完整公开内容和描述，并且这些实施例仅仅意在示例说明而不意在限制所公开的内容。已努力确保数字(如数量和温度等)的准确性，但是应允许有某些误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，温度以℃计或者为环境温度，压力为大气压或者接近大气压。
A.实施例1：进入并离开细胞的纳米颗粒、药物和其他物质的递送
噬菌体展示已被用于分离多种用于体内血管靶向的高度选择性肽。针对细胞的大分子和胶状纳米颗粒递送通常通过受体靶向和/或使用细胞穿透肽实现。
1.结果
将一组T7噬菌体展示肽文库用于识别可导致所述噬菌体颗粒被PPC1前列腺癌细胞进行细胞摄取的序列基序。T7噬菌体颗粒由二十面体的核壳和尾丝组成；展示肽的表达形式为主衣壳蛋白GP10的C端融合物，一般密度为200-415肽/噬菌体(图1A)。将常规T7肽文库(随机环状CX7C和线性X7；X为随机残基)用于筛选。还可以设计新文库以包括RXXR基序，RXXR基序已被发现出现在其他分子中，例如iRGD肽(RXXRXXX和RXXR(A/P)PRXXX文库)。在3轮后展示，选定的文库与细胞悬液的结合比展示7-甘氨酸(G7)对照肽的噬菌体高500-2,500倍(图1B)。对3轮选择后的随机噬菌体克隆的测序表明，不依赖于初始文库构型，所有文库都集中展示C端精氨酸残基(图1C)。在37℃下孵育并酸洗后在细胞中检测到了展示C端精氨酸的噬菌体，表明有噬菌体内化至细胞中。与个体噬菌体克隆一起孵育的细胞的免疫染色和共聚焦成像确认了所述噬菌体颗粒的细胞内定位(图2B)。
为了了解C端精氨酸在噬菌体内化中的功能，制备了展示(1)GGGGGGR(SEQ ID NO：1)和所述G7对照肽的其他变体，以及(2)强内化肽之一的变体RPARPAR(SEQ ID NO：2)的两组噬菌体。研究了这些噬菌体对体外PPC1细胞(图2A)和数种其他人肿瘤细胞系的结合，以及对从正常小鼠器官制备的离体细胞悬浮物的结合。这些实验证明，C端精氨酸足以触发噬菌体与多种细胞的结合。RPARPAR(SEQ ID NO：2)噬菌体显示出了比GGGGGGR(SEQ IDNO：1)噬菌体更强的结合。与一般的细胞结合一致，静脉注射的展示C端精氨酸的噬菌体克隆呈现出在初次遇到的血管床、心脏和肺中的富集。
i.C端精氨酸的展示导致合成纳米颗粒的内化
接下来研究了C端规则对于合成纳米颗粒的适用性。将RPARPAR(SEQ ID NO：2)肽涂覆于量子点(Q-dotsTM，Invitrogen)触发了培养的PPC1细胞对Q-dot的强结合和内化(图3，a图)。以酰胺封闭RPARPAR(SEQ ID NO：2)肽的C端消除了所述Q-dot的结合和内化(图3，b图)。这与这样的观念一致，即颗粒内化同时使用了末端精氨酸的胍基和末端羧基。RPARPAR-Q-dot(SEQ IDNO：2)的内化还受到所述细胞与过量的展示RPARPAR的噬菌体(SEQ ID NO：2)的预孵育作用的抑制，这表明是一个可饱和的、受体介导的过程。
本文描述的实验证明了，C端展示的精氨酸残基代表了触发噬菌体(以及更通常的纳米颗粒)被细胞强摄取的简单信号(CendR信号)。
ii.蛋白酶切割对潜伏内化组合物的活化
这些数据显示，所述CendR定义了用于多种组合物摄取的简单位置依赖性元件。该规则一个值得关注的意义是，它可以用于设计潜伏组合物，例如潜伏纳米颗粒，所述潜伏组合物可以通过蛋白酶解切割而被活化成内化纳米颗粒。许多丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶可暴露C端元件(例如赖氨酸、精氨酸或赖氨酸-甘氨酸)，并且可能适合于这类切割活化。再者，细胞外蛋白酶经常以这样的高度受调控的方式表达，所述受调控方式可以是细胞类型、组织或疾病特异的。这使得可以进行纳米颗粒摄取的靶向蛋白酶解活化。将胰蛋白酶用于对蛋白酶开关观点的概念验证实验，胰蛋白酶是一种专门切割精氨酸和赖氨酸残基C端侧的广谱丝氨酸蛋白酶。展示RPARPARA(SEQ IDNO：3)肽的噬菌体在未经胰蛋白酶处理的情况下与PPC1细胞一起孵育时显示出极少的细胞结合(比展示G7的噬菌体高2.8倍)，但将所述噬菌体与胰蛋白酶一起孵育则将所述结合提高超过100倍(图4)。
iii.组合物的组织选择性归巢和C端规则
以前鉴定的许多内化归巢肽包含内部精氨酸或C端精氨酸(Laakkonen et al.，2002a；Hoffman et al.，2003；Zhang et al.，2005；Jarvinen and Ruoslahti，2007)。CendR可以有助于这些归巢肽的细胞内化。最近，鉴定了对许多肿瘤模型有强的体内选择性的一个归巢肽家族。这些肽的一种CRGDKGPDC(iRGD)(SEQ ID NO：4)包含结合整联蛋白的RGD基序，但该肽在RGD肽中不寻常，原因是它可以比任何其他RGD肽(包括以前用于肿瘤靶向的RGD-4C肽)更强地内化至细胞中(Arap et al，1998)。图5显示了iRGD肽的强肿瘤归巢作用的一个实例。
强内化的关键似乎是RGDK序列(K可以被R替换，如图8中所示)，该序列使得肽对肿瘤中表达的蛋白酶敏感。iRGD肽和携带iRGD的颗粒的选择性和强细胞内化可能是如下几点共同作用的结果：(1)与血管生成内皮和肿瘤细胞上的αv整联蛋白相互作用，从而在肿瘤中形成高浓度的肽；(2)通过一种或多种待确定的源自肿瘤的细胞外蛋白酶进行切割以暴露C端精氨酸或赖氨酸(所述RGD序列中的那一个)；(3)随后所述CendR通路的活化可导致所述颗粒的内化，这比整联蛋白使用的内化通路更有效。支持这一点的结果表明，展示iRGD肽的噬菌体的细胞对iRGD噬菌体的内化作用可通过与UV失活的RPARPAR(SEQ ID NO：2)噬菌体的预孵育过程而降低(并且不受对照G7噬菌体影响)。图6举例说明了该概念。
2.设计和方法
i.鉴定细胞表面受体和细胞内蛋白和非蛋白，并阐明以具有C端精氨酸的肽涂覆的纳米颗粒的内化通路。
C端规则适用于多种组合物结合于和内化至多种细胞类型的情形。这些过程可以通过将细胞与展示CendR元件的非标记颗粒的预孵育来抑制，这与摄取对特定细胞表面受体以及细胞内蛋白和非蛋白(例如核酸、脂质和糖胺聚糖)的依赖性是一致的。鉴定并详细理解CendR受体的调控是将该通路合理地应用于递送的重要先决条件。可以鉴定并表征CendR肽的内化受体。通过沉降(pull down)与所述CendR肽相互作用的分子可富集所述受体/细胞内蛋白/非蛋白。将与CendR肽共纯化的蛋白分级分离并进行质谱分析以鉴定推定的受体和其他分子。
进行了一系列实验来验证所述候选物是否作为真正的受体蛋白。通过测试所纯化的推定受体结合CendR噬菌体的作用以及CendR噬菌体与所述受体在培养细胞中的共定位来确认所述相互作用。对于功能分析，调节候选CendR受体的表达水平并将其与噬菌体和以CendR肽涂覆的量子点的摄取相关联。
采用了一组针对细胞内区室标记物的抗体的共定位研究可用于确定内化通路，然后可以测试CendR纳米颗粒摄取对多个通路的抑制剂的敏感性。
受体鉴定和确认。为了鉴定CendR受体，以制备自PPC1前列腺癌细胞系的提取物进行了肽沉降测定。以含吡喃葡萄糖苷(Sigma)、Ca2+、Mg2+和一种哺乳动物细胞用蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液(Roche Biochemicals)提取10×106个PPC1细胞。将提取物与已偶联RPARPAR(SEQ ID NO：2)和对照肽(C端封闭的RPARPAR和G7)的琼脂糖珠(Roche Biochemicals)进行孵育。所有肽均由本发明人实验室相关的肽化学人员合成。通过HPLC纯化所述肽至纯度超过95％，并且通过质谱法确认其结构。在孵育过夜后，彻底洗涤所述珠子并在4-20％聚丙烯酰胺凝胶上分离。在电泳后，将凝胶银染，切下特异地存在于RPARPAR沉降样品中的蛋白条带并用于进行MALDI-TOF分析。
还可以使用一种沉降测定的变化方案，其包括使用二硫-双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP，Lomant试剂)将所述肽可逆交联于所述受体的另外步骤。二硫-双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)是一种透细胞的、同基双功能的、可切割硫醇的分子，其被设计用于在pH 6.5-8.5的水性缓冲液中将伯胺基基团相互连接。在凝胶上样缓冲物中以β-巯基乙醇切割所形成的-S-S-桥。制备一组具有其他氨基末端半胱氨酸的专门肽用于通过DSP进行交联稳定化沉降。
可以修改所述步骤，以利用所述受体在所述细胞表面的表达。在一个变化方案中，将完整活细胞与肽-琼脂糖珠一起预孵育，洗去过量的珠子，并将细胞溶解并再次洗所述珠子。这就限制了细胞表面蛋白的结合。或者，可以将所述细胞进行表面生物素标记(Altin and Pagler，1995)，并以肽-琼脂糖进行初始分离，然后可以在链霉亲和素-琼脂糖上进一步分离含生物素的蛋白，随后进行凝胶电泳。
还可以使用用于CendR分离的克隆策略。常规培养的细胞系(估计大约30种不同细胞系)可以用于测试CendR肽内化。如果发现非内化细胞系，那么将这些细胞用于转染PPC1细胞的cDNA文库，以及筛选已获得内化以CendR肽涂覆的量子点的能力的转染子。通过FACS鉴定并分离内化阳性细胞。如果未发现CendR阴性细胞系，那么通过以细胞内作用的促凋亡肽处理所述PCC1细胞来生成这样的细胞系。第一选择为源自BH3结构域的促凋亡肽，已知它可以抑制促存活分子Bcl-2、Bcl-x(L)、Bcl-w、Mcl-1和A1的活性(Dharap and Minko，2003)。选择存活细胞，直至得到耐受所述处理的细胞系。然后测试该细胞系的CendR-量子点内化的缺乏情况。如果所述CendR步骤中无缺陷，那么将处理改变为使用两种独立作用的促凋亡化合物。将以前用于肿瘤靶向的抗细菌肽D(KLAKLAK)2(SEQID NO：5)(例如Arap et al.，2002)作为替代筛选中的第二化合物。
将通过上述方法鉴定的候选受体用生物化学测定法或基于细胞的测定法确认。以免疫测定方式分析结合于塑料孔的经纯化推定受体蛋白，以及展示CendR(RPARPAR，SEQ ID NO：2)和对照肽(RPARPARA(SEQ ID NO：3)和G7)噬菌体的结合。如果所述相互作用被确认，那么对受体调节对所述CendR噬菌体摄取的影响进行确定。通过使用以驱动siRNA(PPC1/R-)组成性表达的pSilencer2.0-U6载体(Ambion)进行稳定转染，形成前列腺癌细胞系PPC1的具有下调受体表达的亚系。如果真正的CendR受体被下调，那么可以观察到CendR噬菌体内化被抑制。作为所述siRNA效应的特异性的对照，生成了具有备用密码子选择的siRNA不敏感表达构建体。通过将这些表达载体转染而拯救结合于PPC1/R-细胞的CendR噬菌体可以确认，siRNA敲低的效应是受体特异的，并且不是由于其他基因参与的结果。还测试了所鉴定的CendR受体参与一些公知细胞穿透肽(Tat、penetratin、pVec)内化的情况，以确定所述CendR体系的一般性。
对内化通路的说明。将共聚焦显微术用于研究内化CendR纳米颗粒和一组亚细胞区室标记物的定位。将PPC1细胞与呈现RPARPAR(SEQ ID NO：2)肽的噬菌体和量子点(QdotTM 605 ITK-SA，Invitrogen)孵育不同时长(10分钟-3小时)，并以抗内体标记物(抗EEA1 pAb和抗M6PR pAb；Abcam)、溶酶体(抗LAMP-1 pAb)、小窝蛋白(抗小窝蛋白1 pAb；Abcam)和网格蛋白(抗网格蛋白mAb；Abcam)的抗体对所述细胞染色。对所述细胞进行多种内化通路的标记物和T7噬菌体的双染。将非免疫IgG用作对照。对于功能分析，测试了特定内化通路抑制剂对所述CendR和对照颗粒摄取的影响。通过荧光显微法检测量子点。应用的抑制剂有：内体途径的一般抑制因素低温(4℃)；用于小窝蛋白介导的摄取的非律平(filipin)、细胞松弛素D和制霉菌素(Sigma-Aldrich)；用于网格蛋白依赖的胞吞作用的氯丙嗪(Sigma-Aldrich)；用于大胞饮作用的阿米洛利(Sigma-Aldrich)；以及用于溶酶体逃逸的氯喹(Sigma-Aldrich)。
siRNA活性是细胞质递送可靠的且相适应的量度。为EGFP合成siRNA，将其偶联于所述CendR肽RPARPAR(SEQ ID NO：2)，并测试其对表达EGFP和DsRed的PPC1细胞的效应。对照为纯siRNA。通过荧光和免疫印迹测试了所处理细胞的EGFP和DsRed表达。将所述siRNA附着于纳米颗粒表面，按如下所述进行构建。
因此鉴定了介导所述CendR肽的细胞摄取的一种或多种受体。还鉴定了这些肽使用的具体胞吞通路，并且观察了是否可获得细胞质递送。
ii.应用C端精氨酸的蛋白酶解暴露来触发潜伏组合物的体内结合/内化
所述CendR元件需要暴露C端使得其有可能构建可被蛋白酶解切割活化的潜伏(非内化)纳米颗粒。体外胰蛋白酶处理可将潜伏CendR肽(RPARPARA，SEQ ID NO：3)转化成强内化触发肽。这里，探究了组合物的蛋白酶解活化内化在肿瘤递送中效用。
细胞外蛋白酶解机制是一种蛋白酶复合物体系，其具有多种表达模式、特异性和活性，并且每种酶受受体、共受体和抑制剂调节。在健康成年中，细胞外蛋白酶解被抑制。在伴随有组织重塑和血管发生的病理状态(例如肿瘤侵入和生长疾病、神经变性疾病、血管疾病和炎症性疾病)中，发生向蛋白酶解增加的转变。许多研究已经建立肿瘤发生与纤溶酶和纤溶酶原激活剂的细胞外丝氨酸蛋白酶体系的活化之间的联系。对于两种主要的纤溶酶原激活剂尿激酶型活化剂(uPA)和组织型纤溶酶原激活剂(tPA)，其中uPA被认为对于细胞外周蛋白酶解和肿瘤细胞侵入更重要。uPA作为可蛋白酶解失活的单链uPA原从细胞分泌，所述uPA原在细胞外周空间中被转换成活性的双链uPA。在肿瘤中，活性uPA存在于侵入性肿瘤细胞、巨噬细胞和血管原性内皮细胞的表面。uPA活性被一组功能相关的分子精确调节：高亲和性GPI锚定的细胞表面受体--uPAR(Blasi and Carmeliet，2002)、共受体LDL受体相关蛋白/α2-巨球蛋白受体(Conese et al.，1995)、丝氨酸蛋白酶抑制剂--1-3型纤溶酶原激活剂抑制剂(Rijken，1995)。该体系起到将uPA活性限制在紧邻细胞外周空间的作用。uPA活性与肿瘤发生和血管新生的关联以及其强底物选择性使得它成为受关注的体内蛋白酶活化的靶向的候选物。实际上，uPA介导的细菌毒素的活化已被成功地应用于实验性肿瘤疗法中(Liu et al.，2001，Abi-Habib et al.，2004)。uPA倾向于精氨酸作为P1残基，并且它可能是催化掩藏的CendR元件显示C端的合适蛋白酶。形成了展示CendR元件的T7噬菌体，在该元件后接有一致性的uPA切割位点，通过表达uPA的细胞以及内化对uPA活性药理学抑制的敏感性来研究该噬菌体的内化。所述对照包括展示具有另一uPA底物基序的肽的噬菌体，所述另一uPA底物基序预计在切割时会导致C端赖氨酸暴露；该噬菌体不应内化。类似地对可能暴露C端精氨酸残基的另外两种蛋白酶弗林蛋白酶和凝血酶(它们都在碱性残基的C端侧切割蛋白和肽)测试它们诱导内化的能力。一旦已证明uPA-CendR噬菌体的内化依赖于uPA活性，就在携带表达uPA的异种移植瘤的小鼠中和孕鼠的胎盘组织中体内研究归巢作用(胎盘形态发生是公知的生理uPA诱导的模型过程)。弗林蛋白酶或凝血酶还可以用于体内研究。
iii.uPA敏感性CendR噬菌体的构建和体内靶向研究。
预计可被尿激酶、弗林蛋白酶或凝血酶切割暴露的一组展示C端掩藏的潜伏CendR肽的噬菌体(表1)。所使用的uPA敏感性基序已经被成功地用于构建uPA敏感的炭疽毒素变体(Liu et al.，2001)。对于表1中的基序1-4，预计所示蛋白酶对底物噬菌体的切割可暴露CendR元件，导致噬菌体结合和内化。相反，uPA对基序5的切割可以暴露C端赖氨酸，而不会触发内化。除了底物噬菌体之外，还构建了模拟切割后状态的对照噬菌体(表1，右列)。弗林蛋白酶在哺乳动物细胞中是普遍存在的，并亚细胞定位于反面高尔基网、内体和质膜；在这些实验中，预计弗林蛋白酶敏感性噬菌体(表1中噬菌体1)的CendR通路被普遍活化，并且所述噬菌体被用作阳性对照。凝血酶不存在于培养细胞中，并且通过加入外源凝血酶在细胞培养物中触发包含凝血酶可切割的肽的噬菌体的内化(表1中噬菌体2)。在肿瘤组织中，癌细胞一般表达uPAR，而基质细胞产生pro-uPA。已知仅少数细胞系可同时产生pro-uPA和uPAR。一个实例是Lewis肺癌细胞系LL3，它同时产生这两种蛋白。研究了底物噬菌体组在LL3细胞中的体外内化。在37℃下，将约106LL3细胞与5×108噬菌体颗粒共孵育2小时；在以含1％BSA的DMEM充分洗涤后，将所结合的噬菌体拯救并定量。作为对照，通过以特异性肽抑制剂upain-1(CSWRGLENHRMC(SEQ ID NO：6)；100μM；Hansen et al.，2005)或者以1mM阿米洛利盐酸盐(一种较低特异性的uPA竞争性抑制剂)孵育所述细胞来抑制uPA活性。这些体外实验可证明uPA介导的CendR纳米颗粒活化的可行性。
iv.蛋白酶敏感性CendR噬菌体的体内归巢。
使用两种靶标研究了uPA敏感性CendR噬菌体的体内归巢：(1)植入的肿瘤(皮下LL3模型和PC3前列腺癌正位异种移植模型)，以及(2)小鼠妊娠中期后胎盘(交配后10-14天)。已知LL3和PC3肿瘤具有高度活化的uPA体系。在胎盘中，uPA在滋养层细胞和蜕膜内皮细胞中都表达。胎盘具有可以有助于靶向的数个特征：血管正常，不存在肿瘤中常见的高组织间隙压和EPR效应。纳米颗粒(包括噬菌体)被网状内皮系统(肝脏)从血液快速清除。如果需要较长的噬菌体半衰期来观察蛋白酶解效应，则使用避免肝作用的突变体T7噬菌体。所述突变存在于尾丝蛋白中，它们使得所述噬菌体不被肝识别，结果是延长了血液半衰期。已经构建并测试了这类噬菌体(Sokoloff et al.，2003)。将uPA敏感性CendR和对照(G7)噬菌体(109-1011pfu)静脉注射至小鼠，并且在多个循环时长后(10分钟-2小时)，以磷酸盐缓冲盐水(PBS)灌注所述动物并收集组织样品。将所述组织匀浆，以包含1％BSA的DMEM洗涤，并通过滴定肝噬菌体以及通过噬菌体DNA拷贝数的q-PCR评估对靶标和对照器官(一般是脑、肺、心、肝、脾、肾和骨骼肌)中的噬菌体量进行评估。另外，将以兔多克隆抗T7抗体进行的免疫过氧化物酶染色用于确定噬菌体的组织分布。以前已经表征了体内归巢于肿瘤细胞胞外基质组分、血液管、淋巴管和肿瘤细胞的几种肽(Laakkonen et al.，2002a；Hoffmann et al.，2003；Brown and Ruoslahti，2004；Pilch et al.2006)。将uPA敏感性CendR噬菌体的归巢与展示这些以前鉴定的归巢肽的噬菌体定性地和定量地进行比较。
已知肿瘤具有增加血液凝结的倾向。以归巢肽CREKA(SEQ IDNO：7)涂敷的纳米颗粒已经被证明可结合于肿瘤血管并造成它们中的血液凝结(Simberg et al.，2007)。将携带MDA-MB-435肿瘤的小鼠(用于最初的CREKA(SEQ ID NO：7)研究中)以CendR凝血酶底物噬菌体(噬菌体2，表1)或对照(G7)噬菌体(109-1011pfu)静脉注射，并如上文对于uPA敏感性噬菌体所述，研究噬菌体归巢。使用以过氧化物酶和碱性磷酸酶作为报告酶的双免疫组织化学法来研究噬菌体和凝血酶的免疫反应性。对于增加的凝结，将凝血酶敏感性CendR噬菌体和CREKA噬菌体共注射，然后进行归巢的定量和免疫定位。
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表1.用于体外和体内靶向研究的蛋白酶可切割噬菌体和对照噬菌体。底物噬菌体中的切割位点以箭号指出。蛋白酶解暴露的C端残基为黑体。
v.对于经CendR通路内化的新型的蛋白酶可切割的细胞类型和组织特异性肽的筛选。
人蛋白酶总体或降解组(degradome)由超过460种蛋白酶组成(Puente et al.，2003)。蛋白酶解活性谱是组织类型和疾病特异性的。使用现有技术进行不能对可全身可使用的内源性蛋白酶的体内作谱。所述CendR元件可以用于这类筛选。丝氨酸蛋白酶包括大约1/3的已知蛋白酶，并且在一些情况下它们的切割可暴露C端精氨酸残基。许多半胱氨酸蛋白酶还倾向于以精氨酸作为P1残基，并且可为CendR筛选的合适的靶标。有几种能在切割后够暴露C端精氨酸的组织细胞类型特异性蛋白酶是已知的。尿激酶/纤溶酶体系在发育的迁移细胞(例如滋养层巨细胞、神经嵴细胞)中以及在肿瘤侵入中被活化(Blasi and Carmeliet，2002)。组织激肽释放酶(15种紧密相关的胰凝乳蛋白酶样蛋白酶的家族)以器官和细胞类型特异性模式表达；最熟知的是hK3/前列腺特异性抗原的前列腺特异性表达。底物作谱表明激肽释放酶hK4、hK5、hK6、hK10倾向于以精氨酸作为P1残基，其他重要激肽释放酶如hK3也容许精氨酸在该位置(Debele et al.，2006)。胰蛋白酶原由外分泌胰生理性表达，但它们也在许多肿瘤中异位表达，并在基质金属蛋白酶的活化中起到重要作用(Nyberg et al.，2006)。值得注意的是，一种或多种宿主蛋白酶对病毒外壳蛋白的蛋白酶解切割对于许多病毒是有用的活化步骤；事实上，活化蛋白酶的表达模式经常可决定病毒组织的向性(Klenk and Garten 1994)。病毒外壳蛋白通常在碱性残基处切割；这可代表细胞内递送病毒颗粒适用所述CendR原理的天然途径。除了直接暴露C端精氨酸残基的内蛋白酶切割之外，还可以通过羧肽酶加工或者内蛋白酶和羧肽酶联合加工的多步骤修整来观察CendR活化。当需要在细胞表面处或附近同时表达多于一种蛋白酶时，可产生大量的组织特异性变异和选择性靶向的可能。
新型体内噬菌体筛选可用于探索靶向作用中组织特异性蛋白酶表达的可能性。随机文库序列中包含合适蛋白酶识别元件的肽通蛋白酶解性暴露可以导致所述噬菌体颗粒的细胞内化(图7)。所述内化将所述噬菌体集中于所述靶标，这为选择在所述靶标处特异性切割的肽提供基础。以此方式进行体外筛选和体内筛选，以发现新的肿瘤特异性CendR肽。
这类肽可用于构建对多种肿瘤类型中的蛋白酶和蛋白酶组合特异的内化组合物。而且，所述基于蛋白酶的靶向可以与接合型(synaphic)(对接型(docking-based))靶向相结合，以增加特异性和效果；将在所述靶组织处结合于受体的归巢肽用于将嵌合肽或以两种肽修饰的组合物(例如纳米颗粒)集中于所述靶标处，在此基于CendR的蛋白酶解然后可切割所述肽并引起内化。该结合效应可以获得空前的靶向选择性。以上所述的iRGD肽可以为具有该结合特异性的肽的实例。
vi.文库构建
构建了两种类型的T7噬菌体文库：(1)在一组文库中，单个精氨酸残基后是随机肽饵序列(如果意欲使所述随机序列形成环状肽，将半胱氨酸残基插入至所述精氨酸的N端侧，随机部分具有XnC结构)。(2)在第二组文库中，已知的归巢基序之后是精氨酸残基和随机序列。将精氨酸暴露为C端残基的蛋白酶解加工可导致所述噬菌体的内化和在所述靶标处积聚。在设计#2中，已知的归巢基序旨在将所述噬菌体集中于肿瘤组织。归巢基序的一个选择是RGD-4C肽。该肽在9个残基中含4个半胱氨酸残基，并形成高度缠绕的结构(Assa-Munt et al.，2001)。已经证明，RGD-4C归巢于肿瘤血管(Pasqualini et al.，1997；Arap et al.，1998)，并且由于其结构，它相对地耐受蛋白酶切割。这样使得添加的随机序列提供蛋白酶底物和内化功能。另一选择是CLT1肽；该肿瘤归巢肽可识别肿瘤间质中凝结的血浆蛋白(Pilch et al.，2006)。该肽无精氨酸残基(序列为CGLIIQKNEC(SEQ ID NO：18))，因此任何内化也应该由所述随机序列提供。对96个噬菌体克隆的随机组进行DNA测序以用于评估文库质量。
vii.文库筛选
在培养的前列腺癌(PPC1，PC3)和乳腺癌(MDA-MB-435)细胞上进行体外噬菌体展示筛选。在37℃下，将所述肿瘤细胞(106个细胞)与1010pfu噬菌体文库一起孵育2小时，然后以含1％BSA的DMEM充分洗涤，以除去未结合的噬菌体。将噬菌体在大肠杆菌BLT5403细胞中扩增，并通过PEG-8000沉淀纯化。进行4轮选择。为了处理内化噬菌体的可能失活，另外通过PCR拯救噬菌体，并将编码肽的插入物克隆回T7载体臂中。该选择方案导致这样的噬菌体的富集，所述噬菌体展示对能够活化CendR摄取的细胞外蛋白酶敏感的肽。通过以下方式进行体内筛选：将1010噬菌体静脉注射至携带异种移植瘤(来自上文列出的细胞系)的小鼠，并且在10分钟至2小时后(以使不同有效时间的蛋白酶作用于所述肽)收集组织。如上文对体外筛选的描述，拯救并分析所述噬菌体。还使用了体外筛选和体内筛选的组合。
在最后一轮选择后，将来自库中的96个随机噬菌体克隆测序，并鉴定任何显性肽基序。将显示C端精氨酸(由于在精氨酸残基后存在终止密码子)的序列丢弃，原因是在所述筛选中选择它们可能是由已暴露的C端精氨酸引起。根据图1C中所示的结果，这些噬菌体占来自体外筛选的所有选定库的二分之一至三分之二(one half-to two thirds)。这比体内筛选可能会低得多，原因是具有C端精氨酸的噬菌体可在到达肿瘤之前结合于其他组织。在剩下的噬菌体克隆中，分别地分析了均代表各个显性基序的3个克隆。体外测试可测量细胞结合，以及所述结合对于低温的敏感性和对于以下物质的敏感性：α2-巨球蛋白(一般的蛋白酶抑制剂)、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟(AEBSF，丝氨酸蛋白酶抑制剂，Roche Biochemicals)、胃蛋白酶抑制剂A(天冬氨酸蛋白酶抑制剂，Sigma)、Z-Phe-Ala-FMK(半胱氨酸蛋白酶抑制剂，Enzyme Systems Products)、抑氨肽酶素(amastatin)(氨肽酶抑制剂，Sigma)。这些测试可以证明噬菌体内化的蛋白酶依赖性活化，并定义出负责所述活化的蛋白酶类型。另外，鉴定了所述CendR通路参与所选肽的结合和内化的情况。使用两种方法进行鉴定：(1)通过UV失活的CendR噬菌体竞争噬菌体结合和内化，以及(2)使用其中上文鉴定的CendR受体已使用siRNA技术敲低的PPC1细胞。
除了所述噬菌体研究之外，制备荧光标记的底物肽以用于共振能量转移(RET)研究。当紧密接近的两种荧光团的吸收和发射光谱有重叠时会出现RET猝灭。猝灭量除了依赖于光谱重叠的程度外，还依赖于所述分子之间的距离。为了评估肽切割，将肽在不同末端以已知荧光团/猝灭剂对(例如DABCYL/EDANS或Abz/3-硝基-Tyr)进行标记，将肽与细胞一起孵育，并测量荧光强度的偏移。将上文针对噬菌体研究列出的一组蛋白酶抑制剂用于鉴定负责切割的蛋白酶家族。
还测试了噬菌体克隆的体内肿瘤归巢。归巢效率通过滴定肿瘤和正常组织中的噬菌体进行度量。使用抗T7抗体分析组织中噬菌体的存在情况；该分析给出以下信息：噬菌体在组织中关联的细胞类型以及噬菌体是否被内化至细胞。
这些筛选可得到新的、肿瘤特异性CendR序列。还可以出现混合序列，其中归巢肽嵌入CendR序列中，或者在嵌合肽中与一种肽配合。通过这类联合机制结合于靶组织的肽可以是特别好的的载体，用于组合物的选择性细胞内递送。蛋白酶可切割的底物的鉴定还可以用于鉴定负责切割的蛋白酶。这些蛋白酶可以证明对于疾病进展功能上的重要性，并且其本身可以是重要的药物靶标。
viii.分离可促进组合物离开细胞的肽以及可导致纳米颗粒外渗的肽。
多种组合物的有效外渗和组织穿透都同时利用了细胞内化和离开细胞两种功能。组合物从细胞离开可依赖于对细胞分泌通路的挟持。似乎有多种通路可应用于离开；这些通路中有一些可以是细胞和组织类型特异性的，并且有可能为药物递送提供另一层选择性。C端规则可以应用于筛选可介导从细胞离开的肽序列。为此目的，制备了展示后接具有C端精氨酸的CendR元件的随机肽的T7文库(XCendR文库)。所述C端精氨酸可导致所述噬菌体的无差别细胞内化。由于仅那些展示具有离开功能的肽的噬菌体能够离开细胞，进行了对离开功能的筛选。有几种可能的途径来选择能够离开细胞的噬菌体。最直接的方法是鉴定在初始的文库结合和内化并洗去未结合的噬菌体后出现于细胞培养基中的噬菌体。该系统还使得可以选择能够进行多于一个进入/离开细胞循环的噬菌体。在该筛选中，使所述噬菌体结合于一个细胞库的细胞，随后将这些细胞与另一个携带分类标签的相同细胞的细胞库形成混合培养物。从所述第二细胞库回收噬菌体。该方案对能够重复进入-离开循环的肽有选择性，因此可充当组织穿透元件。
还探索了细胞类型特异性离开信号的可能存在情况。，使用了上文对一般促离开肽描述的筛选的变化方案，不同的是使用两种不同细胞系进行选择。在筛选细胞系A特异的离开元件中，将其与XCendR文库孵育，随后与细胞系B共培养，扩大培养并从细胞系B回收细 胞内噬菌体。以该方式选出的肽广泛内化，然而它们仅能够离开细胞系A，但不能离开细胞系B。细胞类型特异性离开肽可以提供对负载递送的额外选择性。例如，将触发载物离开非癌细胞的肽用于实现外渗、组织穿透和肿瘤细胞的选择性靶向。
外渗是纳米颗粒穿透组织的第一步骤。它不仅包括内皮细胞和周细胞的穿透，而且包括致密细胞外基质结构(基膜和富含胶原的基质)的穿透。将携带促外渗肽基序的噬菌体通过显微切割从以XCendR文库注射的小鼠的靶组织分离。
构建T7噬菌体文库(XCendR文库)，用于鉴定触发离开细胞过程的肽。C端CendR肽(RPARPAR，SEQ ID NO：2)在N端侧的侧翼是随机七体文库；展示该文库的噬菌体经所述CendR通路内化。另一方面，展示具有离开功能的肽的噬菌体能够离开细胞。除非所述进入/离开过程涉及不可逆加工(例如蛋白酶解)，所述进入/离开循环可重复数次。
鉴定一般促出离开肽序列的实验策略的概要列于图7的图B。首先在4℃下将所述文库与5×106个PPC1前列腺癌细胞一起孵育，以使所述噬菌体结合于细胞表面(在4℃下使用孵育来避免噬菌体重复内化/离开循环，可能风险是噬菌体失活)。在第一轮选择中，使用大约20倍于所述文库多样性(一般1010噬斑形成单位)的输入噬菌体数目。在以含1％BSA的DMEM充分洗涤以除去未结合的噬菌体后，在37℃下孵育所述细胞持续不同的时长(为了防止细胞死亡成为因素之一，保持该时间尽可能短)，并通过感染大肠杆菌BLT5403细胞从培养物上清液中拯救噬菌体。该噬菌体库可以包含展示离开信号的噬菌体，重复筛选可以富集这些噬菌体。
为了分离在从一个细胞离开后能够再次进入的噬菌体，如上述进行了该筛选的初始部分，但在结合步骤后和洗涤后，加入10×过量的以GFP稳定转染的PPC1细胞，随后在37℃下孵育1小时。在充分洗涤后，通过FACS分离GFP+细胞，将这些细胞中的噬菌体通过以下方式拯救：感染大肠杆菌BLT5403细胞以及/或者基于PCR克隆回T7噬菌体。在每一轮选择中，通过滴定感染的噬菌体并通过噬菌体DNA的qPCR评估回收的噬菌体的数目。使用如所述文库选择中的相同的策略逐个地评估携带候选离开基序的噬菌体。该方法可选择能够进行多于一次进入/离开循环的噬菌体，并且可以用于鉴定使纳米颗粒可以离开细胞的肽元件。
进行上文描述的筛选策略的变化方案，以探索可能的细胞类型特异性离开信号(图7的B图)。探索了从如下来源制备的细胞悬液的离开信号：正常小鼠器官(肝、肾、前列腺)、从脐带分离的正常人血管内皮细胞(HUVEC；BD Bioscience)、前列腺癌细胞系(PC3、Du145；都来自ATCC)和乳腺癌细胞系(MDA-MB-435，ATCC)。为了鉴定细胞类型特异性离开肽，在4℃下将5×106靶细胞与20×多样性的XCendR文库(一般1010个噬斑形成单位)一起孵育，随后以含1％BSA的DMEM充分(4×)洗涤以除去未结合的噬菌体。然后在37℃下将所述靶细胞与10×过量的表达GFP的PPC1细胞共培养1小时，所述表达GFP的PPC1细胞已知具有高CendR通路活性。在该步骤中，PPC1细胞可内化从初始靶细胞离开的噬菌体。在孵育后，对PPC1细胞分类，酸洗(以除去表面结合的噬菌体)，并且通过感染以及/或者通过基于PCR克隆回T7噬菌体来拯救细胞内噬菌体。所得到的噬菌体应展示这样的肽，即该肽可进入/离开靶细胞，但仅能够进入而不能离开PPC1细胞。以相同的方式测试不同细胞类型的其他组合。内皮细胞和肿瘤细胞的组合被特别关注，这是因为能够进入且离开内皮细胞，同时仅可以进入而不能离开肿瘤细胞的肽作为靶向肿瘤的肽特别值得注意。
最后，在体内筛选XCendR文库以鉴定驱使血管外渗的肽。具有HUVEC离开/CendR肽的单个噬菌体的外渗能力。由于具有暴露的CendR肽的文库预计可在体内结合所有血管，使用尾静脉注射后噬菌体最先遇到的靶器官(心和肺)进行初始筛选以及技术优化。然后将噬菌体注入左心室(Brown and Ruoslahti，2004)以避免心和肺的优先摄取。对于体内外渗筛选，使用了已经使用氯化铯超速离心纯化的高浓缩文库(已经发现高度纯化的噬菌体可给出比未纯化的或PEG8000沉淀的噬菌体制剂更好的筛选结果)。将所述文库以1011pfu/小鼠注射，总体积不超过200μl(以避免压力诱导的血管紧张和损伤)。在将噬菌体循环3小时以使得可外渗和穿透组织后，将组织急速冷冻并以30μm切片。将组织切片以-20℃的甲醇固定1分钟，并进行复染。使用PALM显微解剖系统(Carl Zeiss GmbH，Germany)除去血管结构。已经确定，这类处理不影响噬菌体存活。将去除血管的组织切片溶解于非离子型洗涤剂(LB细菌生长培养基中1％NP40)中，并拯救噬菌体。在几轮选择后，选择候选噬菌体用于单个评估。单个噬菌体的外渗通过多路qPCR并使用Taqman探针和引物组(BioRad IQ5 instrument)评估，以定量测定两噬菌体克隆的DNA拷贝数。作为qPCR的内部对照，将G7噬菌体与所核查的噬菌体共注射。还通过以抗T7抗体的免疫染色研究了候选外渗噬菌体在靶组织噬菌体中的分布。
在文库筛选阶段以及鉴定/确认展示可能的外渗肽的噬菌体后，制备了生物素标记的合成肽并将其缀合于量子点(QdotTM 605ITK-SA，Invitrogen)。使用转盘式共聚焦显微镜实时评估活细胞中量子点的内化/离开。使用相同的成像系统分析携带细胞类型特异性离开(和CendR)元件的量子点；将携带不同荧光标记物的细胞的混合培养物用于研究细胞类型选择性离开过程。将慢病毒表达系统用于表达一组能够快速导入细胞以生成荧光亚系的荧光蛋白(GFP、YFP、DsRed、Venus)。对于体内评估，静脉注射涂覆肽的量子点，在循环3小时后将器官收集、快速冷冻并处理，用于免疫荧光染色。使用TRITC滤光装置观察量子点，还将相同切片以一组细胞类型特异性标记物(内皮细胞为CD31，肿瘤细胞为上皮膜抗原/EMA，巨噬细胞为CD11b，淋巴内皮细胞为podoplanin和LYVE-1)和缀合于Alexa488染料的二抗(Invitrogen)染色。
设计该策略以揭示已知存在的非常规离开信号。所述肽展示筛选可以揭示能够利用这些通路介导从细胞离开的肽。这是全新的方法，并且它可揭示在导致外渗和多种组合物从一个细胞转移至另一个细胞中特别有用的信号。
ix.通过设计癌症的实验疗法证明蛋白酶触发的C端规则方法的有效性。
上文详述的结果表明，通过使用基于C端规则的肽递送，可以将两种类型的纳米颗粒--噬菌体和量子点--特异地递送至细胞内部。将葡聚糖涂覆和聚乙二醇化的50nm氧化铁纳米颗粒用作支架来构建多功能递送载体。其他人已将类似的支架用于siRNA递送(Medarova et al.，2007)。归巢肽可提供靶向和内化功能。iRGD肽被用作纳米颗粒上的靶向元件，这是因为该肽将向肿瘤血管和肿瘤细胞的特异性靶向与载物的靶细胞内化相结合。还可以使用其他单个的或嵌合的归巢加CendR元件肽。类似地，可以将任何促进外渗和向组织中扩散的肽整合至所述纳米颗粒中。
所述靶向肽另外携带近红外荧光体用于成像。在小鼠中的光学成像是优选的，原因是在小动物中它比其他成像方法更容易且更便宜。然而，氧化铁核心可选择使用MRI，这是在人类患者中选择的方法。载物被连接于所述颗粒表面。可以使用siRNA，siRNA在包括癌症在内的多种疾病的治疗中有巨大潜能，原因是有可能调节所谓的“非药物作用”靶标(Uprichard，S.L.，2005；Dykxhoorn et al.，2006)。还可以使用所述颗粒的内体逃逸功能。已经发现了来自已经以荧光素标记的iRGD处理的细胞的细胞核信号。
已经在量子点支架上构建了类似的siRNA递送载体(Derfus et al.，2007)。基于iRGD肽在将噬菌体和荧光肽递送至肿瘤中特别有效的事实以及对iRGD和F3噬菌体的直接比较，所述iRGD纳米颗粒可以显示出显著改善的归巢和内化活性。
另一选择是脂质体，脂质体也被其他人用于siRNA递送(例如Pirollo et al.，2007)。文献中记载了对于siRNA递送的大量其他支架设计(例如Li and Huang，2006；Bartlett et al.，2007)。颗粒支架不是特别重要的；该体系建立在归巢/内化/外渗元件的有效性和特异性之上。
在体内开发了多种给药方案，并表征了随时间变化的肿瘤负荷。通过光学成像以及通过测量组织磁化研究了所述颗粒随时间的体内分布。siRNA抑制的靶标为被称为p32、gC1qR或HABP的蛋白(Grebrehiwet et al.，2002；Rubinstein et al.，2004)。该蛋白主要是线粒体蛋白，但在一些情况下它还可以在细胞表面处表达。p32是一种肿瘤归巢肽的靶标。归巢肽LyP-1在一些但非全部肿瘤中识别淋巴和肿瘤细胞(Laakkonen et al.，2002a；2004)。已经表明，肿瘤巨噬细胞的亚群还以高水平表达p32。而且，已经证明，以siRNA抑制p32表达可将肿瘤细胞代谢转向糖酵解，减少细胞生长并破坏体内肿瘤发生。通过使用该靶标，显示了所述颗粒在抑制肿瘤中p32表达的有效性。由于p32在肾和胰中相对高水平的表达(其肿瘤特异性部分地源自在所述细胞表面的表达，根据以前的结果，这种情况局限于肿瘤)，还可以通过测量这些器官中的p32水平监测所述靶向的选择性。所述处理研究可以揭示p32是否有可能用于肿瘤的siRNA疗法中。
纳米颗粒支架。使用了涂敷氨基功能化葡聚糖的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(50nm nanomag-D-SPIO；Micromod Partikeltechnologie GmbH，Rostock，Germany)。可以使用伸长的氧化铁颗粒“纳米虫”，而不是纳米球。纳米虫可以携带更多的载物至靶标(Park et al.，2008)。纳米虫的合成类似于一般的磁性纳米球(NS)的制备，涉及Fe(II)和Fe(III)盐在存在葡聚糖情况下的反应(Palmacci and Josephson，1993)。为了实现虫样形态，与制备球状颗粒相比，所制备的铁盐浓度更高，使用的葡聚糖的分子量也更高(20kDa)。纳米虫为伸长的涂覆葡聚糖的颗粒，它由5～10IO核心(50～80nm)的线性聚集物组成。还可以制备这样的纳米球，即其是包含1～2IO核心(25～35nm)的涂覆有葡聚糖的球状颗粒。可以使用脂质体，例如靶向脂质体(Simberg et al.，2007)。还可以使用自组装微团。
将PEG、肽和siRNA偶联于纳米颗粒。已经发现，循环半衰期高度依赖于表面胺基(用于肽缀合的官能团)的数目，以及NW和NS两者的表面荷电(Park et al.，2007)。随着表面胺基团数目及因此的颗粒净电荷的增加，循环时间会减短，这一点已经在文献中有报道(Weissleder et al.，1995；Moghimi et al.，2001)。游离表面胺可以吸引一些与调理作用相关的血浆蛋白；保持接近于中性的表面电荷(ζ电势)似乎对于获得长的血液半衰期是重要的。PEG附着于胺化的纳米颗粒可以增加循环时间，推测是通过降低参与调理作用的血浆蛋白的结合实现(Moghimi et al.，2001)。可以为以下功能对颗粒进行表面修饰：避开网状内皮系统(PEG)、归巢和内化(iRGD肽)、内体逃逸(pH敏感性肽；例如Pirello et al.，2007)、荧光团如Cy7和siRNA载物，以及可能的促外渗肽。为了在一个颗粒上提供所有这些功能，进行优化研究以确定为了得到靶向/内化和载物递送的最佳结合，这些元件中的任一种应所述颗粒表面上的可用连接位点占据的多大比例。还可以研究串联而非单个地偶联这些化合物的可能的优点。一个极端情况是，归巢/内化肽、内体离开肽、外渗肽和荧光团都可以作为一个复合物合成并通过PEG部分来偶联于所述颗粒。另一个极端情况是，逐一偶联它们全部。构建包含不规则肽和对照siRNA的颗粒，并将其用作对照。
iRGD肽和最近的其他高效归巢肽是具有对肽活性至关重要的二硫键的环状肽。已经开发化学法来解决该问题；将选择性侧基团保护用于合成具有额外半胱氨酸的环状肽，所述额外半胱氨酸存在游离巯基。这些肽变得稳定，无可检测的不规则二硫键。马来酰亚胺功能团也可以用于偶联基团。这些化学法用于将iRGD偶联于所述颗粒。siRNA载物通过使用二硫键偶联于所述颗粒。在早期研究中已表明，通过二硫化物交联接头附着于纳米颗粒的siRNA显示出比通过非还原性硫醚键附着时更高的沉默效率(Derfus et al.，2007)。推测这是因为siRNA在还原性细胞内环境中会从颗粒中释放出来。
x.纳米颗粒在体外和体内的摄取和活性。
通过荧光显微术研究所培养细胞的结合和摄取，使用共聚焦显微术确定内化和亚细胞定位。通过测量在不同时间采集的血样中的荧光以及通过SQUID(超导量子干涉仪，Superconducting Quantum Interference Device)磁力法测定确定静脉注射的纳米颗粒的循环时间。SQUID提供了对样品中磁性IO纳米颗粒的总数目(而非总铁含量)的直接测量，并且该测量涉及MRI成像应用。SQUID还被用于确定肿瘤和其他组织样品中的纳米颗粒浓度。通过靶蛋白以及数种非靶蛋白的免疫印迹，监测siRNA的效应，以确认任何抑制的特异性。
xi.肿瘤模型和对靶向的分析。
主要肿瘤模型是通过将MDA-MB-435人癌细胞移植至雌性裸鼠的乳腺脂肪垫生成的正位乳癌异种移植模型。选择该模型是因为iRGD肽和几种其他可作为备选靶向元件的归巢肽可有效地归巢于该肿瘤(CREKA，LyP-1)。再者，该模型还已被广泛地应用于肽归巢和肿瘤治疗研究(例如Laakkonen et al.，2004)。
以临床相关浓度(0.7mg-2.6mg Fe/Kg体重)开始，将携带siRNA的纳米颗粒经尾静脉静脉注射至小鼠，之后在1、8和24小时拍摄麻醉的活动物的光学图像。将在注入纳米颗粒后合适时间收集的器官进行成像并进行SQUID分析以定量测定归巢。siRNA的效应通过上文所述的免疫印迹确定。多功能的纳米颗粒被证明选择性地靶向肿瘤并且将活性siRNA递送至所述肿瘤。
肿瘤治疗研究。将携带MDA-MB-435肿瘤的小鼠(16-20周龄)以纳米颗粒或本文公开依照上文详述的标准选择的其他合适的组合物处理。所述小鼠(每组10只小鼠)每周接受静脉注射。确定具有特定siRNA和对照siRNA的颗粒的剂量，其中siRNA对肿瘤和毒性的效应被监测。测定毒性相关剂量。在给药频率从每周一次增加至每周2-3次的方案中，研究所述靶向纳米颗粒的效力和毒性。增加频率和减少每次注入剂量时，效力和毒性的阈值随可能是更有利的(Kerbel and Kamen，2004)。
MDA-MB-435肿瘤大小可以在实验结束时通过测量直径以及通过对肿瘤块称重容易地监测。当小鼠肿瘤达到可造成其显著不适的大小时将小鼠安乐处死。动物房的人员独立于参与该研究的研究人员作出是否安乐死的决定(Arap et al.，2002)。这种安排使得可收集用于不同组比较的存活数据。上文详述的光学(和可能的MRI)成像方法提供了测量肿瘤大小或使用存活情况作为终点之外的备选方法。成像的可用性增加并加速了检验所述设计中变化的能力。
定性测定淋巴管和巨噬细胞(除肿瘤细胞之外的p32阳性靶细胞)以作为效果的又一种量度。以抗LYVE-1抗体染色研究了淋巴管，以CD11b染色研究了巨噬细胞。已经证明，p32阳性细胞可表达这些谱系标记物(Laakkonen et al.，2004；Fogal，Zhang，and Ruoslahti，Mitochondrial/Cell surface protein p32/gC1qR as a molecular target in tumor cells and tumor stroma.Cancer Res.68：7210-7218(2008))。肿瘤细胞在淋巴系统中的存在情况也被评定，对肿瘤沿淋巴系统扩散进行宏观评价以及组织学评价。可检测到淋巴管数目的大量减少(Laakkonen et al.，2004)。镜检可能评估肿瘤坏死，这是因为大量的坏死可使肿瘤大小测量值产生偏差。
本文中产生的信息可以促进所述靶向纳米颗粒技术发展到可开发出用于临床研究的化合物。获得诊断试剂或治疗试剂的步骤包括如下：(1)确定所述归巢肽结合于人受体的能力，就与人受体分子的结合以及药代动力学性质优化所述肽。(2)开发用于治疗的靶向组合物；本文中作为模型化合物提出的p32 siRNA可以用于人的治疗用途，并且还可以被调整以携带其他载物。
B.实施例2-C端规则：暴露C端精氨酸的肽及肽涂覆纳米颗粒的神经毡蛋白-1依赖性内化
载物的细胞类型选择性内化对于许多生物过程以及对于药物和显象剂的靶向递送是重要的。已确定的是，纳米颗粒的细胞内化和组织穿透可以通过C端暴露的R/KXXR/K(SEQ ID NO：23)肽基序实现。该现象被称为C端规则(CendR)。在C端之外位置含R/KXXR/K(SEQ ID NO：23)基序的肽不被内化；然而，这类潜伏CendR肽的摄取可以通过蛋白酶解切割触发。CendR肽通过一种涉及被称为神经毡蛋白-1的关键组分的机制进入细胞，神经毡蛋白-1是一种以其在血管和神经系统模式化中的作用为人所知的多配体受体。所述CendR技术可以应用于开发对单个细胞类型或组织特异性的蛋白酶活化的递送系统。它还可以干扰涉及所述CendR机制的病理过程，例如病毒和其他微生物以及它们的产物进入细胞的过程。
诊断剂和治疗剂选择性靶向至患病组织，尤其是肿瘤，仍是一项重要的挑战。阳离子氨基酸的伸展可驱使内源性蛋白的转导，并且对于病毒感染和扩散是重要的。这类蛋白的实例包括同源异型结构域转录因子，例如Antennapedia(Joliot，A.，et al.1991)、单纯疱疹病毒-1蛋白VP22(Elliott，G.et al.1997)和人免疫缺陷病毒-1转录激活因子TAT蛋白(Green，M.et al.1988，Frankel，A.et al.1988)。衍生自这些蛋白的短阳离子细胞穿透肽(CPP)保持其内化许多种载物的能力：异源肽和蛋白、核酸和纳米颗粒(Langel，
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2007)。然而，CPP是非选择性的；它们几乎被所有类型的细胞吸收。缺乏选择性严重地限制了CPP在临床上的应用。能够接合型(对接型)递送的组织特异性内化肽是已知的(Laakkonen，P.et al.2002b，Porkka，K.et al.2002，Hoffman，J.A.et al.2003，Jarvinen，T.A.et al.2007)。对于所有CPP，细胞吸收的机制都了解很少。
蛋白酶解开关常在生物过程中调节蛋白的活性(Esmon，C.T.1993，Barrettw et al.1998，Sternlicht，M.D.et al.2001)。实例包括血液凝固和血纤蛋白溶解、生长因子和肽激素的活化、细胞死亡-存活决定作出以及细胞迁移和粘附。值得注意的是，病毒进入细胞的过程以及许多细菌毒素的内化受蛋白酶解活化的调节(Klenk，H.D.et al.1994，Gordon，V.M.et al.，1995)；活化蛋白酶的表达模式经常是进入所述靶细胞的决定因子。
本文描述了可以被蛋白酶解开关活化的内化体系。该体系是基于内化肽基序R/K/XXR/K(SEQ ID NO：24)。该基序必须存在于待活化的多肽链的C端(从而称之为C端规则或CendR)。内化受体被鉴定为神经毡蛋白-1(NRP-1)。还表明，当隐性R/K/XXR/K(SEQID NO：24)基序嵌入蛋白或肽序列中时，该基序可以通过蛋白酶暴露，触发细胞摄取。这些结果突出显示了这样的细胞穿透开关，即该细胞穿透开关可用于靶向药物递送，并且可以在大量生物过程例如病毒感染中起作用。Sugahara，K.N.et al.(2008)描述了同时包含组织特异性靶向元件和隐性CendR元件的复合肽。所述靶向元件将所述肽集中在所述靶标，此时组织蛋白酶在此暴露该肽的CendR元件，促进内化和组织穿透。
1.结果
i.C端内化元件的鉴定
将肽文库的C端展示用于所述T7噬菌体的表面上(Hoffman，J.A.et al.，2004)，以鉴定触发纳米颗粒细胞内化至源自PPC-1人前列腺癌异种移植瘤的细胞中的肽。用于选择的肽文库是线性X7文库、环状CX7C，以及被设计以包含RXXR(SEQ ID NO：25)基序的限制性RXXRXXX(SEQ ID NO：19)文库，所述RXXR(SEQ ID NO：25)基序还存在于一些内化归巢肽中(X，随机氨基酸；C，半胱氨酸；R，精氨酸，图10)。在3轮选择后，所选的噬菌体库对PPC-1细胞的结合比展示7-甘氨酸(G7)对照肽的对照噬菌体高500-1,300倍(图10A)。对随机噬菌体分离物的测序表明，在大多数情况下对于(R/K)XXR(SEQ ID NO：26)而言，不依赖于初始文库构型，所有文库都集中展示C端精氨酸(图10B)。T7噬菌体对酸性条件以及对在甘氨酸缓冲液(pH 2.5)中对细胞的酸洗是敏感的，后者会导致细胞外噬菌体的释放和失活。在所述细胞在37℃下孵育并且以酸性缓冲液洗涤后，回收了展示(R/K)XXR(SEQ ID NO：26)基序的噬菌体，表明有内化。一个肽表明了C端的赖氨酸残基也能够产生活性肽。
使用来自所选库的单个噬菌体的结合研究表明，虽然仅C端精氨酸(如G6R中)的存在就足以弱化噬菌体与PPC-1细胞的结合(图11A和11C，d图)，但存在RXXR(SEQ ID NO：25)基序时可以观察的到强的结合和内化，如在RPARPAR(SEQ ID NO：2)(图11A、11B和11C的c图)、RGERPPR(SEQ ID NO：27)和RVTRPPR(SEQID NO：28)(图12A和12B的c、d图)中。内化RXXR(SEQ ID NO：25)肽的类似结构以及它们相互竞争的能力(图12A和12B的i图)表明了共享的结合机制。在后续的研究中将RPARPAR(SEQ ID NO：2)肽用作原型CendR肽。
评估所述内化肽的结构特征，以确定单个精氨酸残基对RPARPAR(SEQ ID NO：2)噬菌体结合的贡献。这表明C端精氨酸(或赖氨酸)对噬菌体结合是至关重要的，并且另外两种碱性氨基酸可以以剂量和位置依赖性方式增加所述相互作用(图11A和11B)。与细胞的相互作用不涉及其他噬菌体元件，原因是RPARPAR(SEQID NO：2)-功能化量子点(qdot)结合和内化方式与噬菌体颗粒并无差别(图11C嵌图f、g和图13嵌图a、f)。值得关注的是，包含D氨基酸(D-rparpar)的肽具有显著降低的触发量子点摄取的能力(图13嵌图d)，表明手性结合位点的参与。以另外的C端氨基酸掩藏C端RXXR(SEQ ID NO：25)元件(如在RPARPARA(SEQ ID NO：3)中)消除了噬菌体与PPC-1细胞的结合(图11B)；RPARPARA(SEQID NO：3)噬菌体的结合通过以胰蛋白酶(其在碱性残基后切割并推测可暴露C端精氨酸；图14)处理所述肽来恢复。qdot的内化类似地可通过将丙氨酸添加至RPARPAR(SEQ ID NO：2)肽的C端而受到抑制(图13嵌图b)。所述C端羧基的酰胺化也阻断qdot内化(图11C的c图)。这些发现表明内化在具有游离羧基的末端碱性氨基酸的情况下出现。总之，所述文库筛选以及结构-功能研究可将所述CendR基序(R/K)XX(R/K)(SEQ ID NO：29)确定为肽和纳米颗粒被PPC-1细胞所摄取的触发物。
ii.CendR内化的表征
为了评估CendR内化机制的保守性，对不同靶细胞--一组培养的人细胞系和源自几种正常小鼠器官的原代细胞--研究了RPARPAR(SEQ ID NO：2)及其衍生物的结合(图15)。不同来源的肿瘤细胞结合所述RPARPAR-噬菌体，包括PPC-1之外的前列腺癌细胞(PC-3、Du-145)、乳腺癌细胞(4T1)、胰腺癌细胞(MIAPaCa-2、PDAC1.3)、黑色素瘤细胞(B16F10)和MDA-MB-435人癌细胞。CendR噬菌体还与鼠类血管内皮细胞(F2)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)发生结合。M21黑色素瘤细胞是一个例外，它对RPARPAR(SEQ ID NO：2)噬菌体的结合并不比对照噬菌体的结合强。源自一组正常小鼠器官的原代细胞也结合RPARPAR(SEQ IDNO：2)噬菌体(图15B)。与一般性的结合一致，静脉注射的RPARPAR噬菌体主要聚集于初始遇到的血管床：在肺中以及较低程度地在心脏中(图15C)。在肺中，对于RPARPAR(SEQ ID NO：2)，噬菌体免疫反应性出现于整个组织中(图15D嵌图d)，而对照噬菌体则并非如此(图15D嵌图e)，这表明所述CendR噬菌体不仅结合血管衬里细胞并被所述细胞内化，而且能够穿透至组织实质中。因此，RPARPAR(SEQ ID NO：2)肽是能够进入多种细胞类型并且还能促进组织穿透的内化肽。
在4℃下RPARPAR(SEQ ID NO：2)噬菌体对细胞的结合很快，在20分钟内达到平台(图16A)。在37℃下，RPARPAR(SEQ ID NO：2)噬菌体和qdot在15分钟内出现质膜缔合，在加入细胞后1小时出现细胞核周积聚(图16B，图b，c)。以活的非固定细胞观察到这种qdot内化，排除了所述细胞内积聚是由加工假象造成的(图16B，图b，c)。
还研究了一组多种胞吞通路的抑制剂：网格蛋白依赖性摄取(氯丙嗪)、胞膜窖内吞(caveolar endocytosis)(金雀异黄素、制霉菌素)和大胞饮作用[5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利和渥曼青霉素(wortmannin)]。这些抑制剂没有一种影响所述CendR肽的摄取(图17A)。类似地，内化的RPARPAR(SEQ ID NO：2)噬菌体与一组亚细胞区室标记物的共染色未显示任何明显的染色图案的重叠(图17B)。值得注意的是，RPARPAR(SEQ ID NO：2)噬菌体免疫反应性和标记的霍乱毒素B亚基的分布中有显著的重叠(图17C)。虽然霍乱毒素B亚基的胞吞通路有待确定，但它表明了不依赖于发动蛋白(dynamin)并且同时涉及网格蛋白依赖性和非依赖性机制(Torgersen，M.et al.2001)。
iii.CendR内化依赖于NRP-1
在结合之前用胰蛋白酶处理PPC-1细胞造成RPARPAR(SEQ IDNO：2)噬菌体颗粒的结合降低(数据未显示)，表明细胞表面蛋白参与了RPARPAR(SEQ ID NO：2)结合和内化。阳离子CPP的内化涉及与细胞表面糖胺聚糖的相互作用(Tyagi，M.，et al.2001，Sandgren，S.et al.2002)。然而，酶消化(肝素酶III和硫酸软骨素酶ABC)以及以肝素和硫酸软骨素竞争对于RPARPAR(SEQ IDNO：2)噬菌体与所述PPC-1细胞的结合无影响(数据未显示)。为了鉴定其他可能的RPARPAR(SEQ ID NO：2)相互作用蛋白，将通过RPARPAR(SEQ ID NO：2)肽的亲和色谱法提取的分级PPC-1肿瘤异种移植提取物固定于琼脂糖珠上。以含游离RPARPAR(SEQ IDNO：2)肽的缓冲液洗脱释放出130kDa蛋白，通过MALDI-TOF质谱法鉴定为NRP-1(图18A)。
NRP-1作为CendR受体的功能得到了几个证据链支持：M21黑色素瘤细胞，该细胞不结合也不内化RPARPAR(SEQ ID NO：2)，表达痕量的NRP-1。强行表达NRP-1使得这些细胞能够结合并内化RPARPAR(SEQ ID NO：2)(而非RPARPARA(SEQ ID NO：3))噬菌体(图18C，图e、f)，而以NPR-1结合袋突变体转染的细胞(Vander Kooi，C.W.et al.，2007)未赋予RPARPAR(SEQ ID NO：2)结合特性(图18B)。最后，免疫荧光共染色表明，RPARPAR(SEQID NO：2)噬菌体和qdot与NRP-1共定位于细胞表面和细胞内部(图18C，图c-e)。
VEGF-165使用由外显子8(CRCDKPRR(SEQ ID NO：30))编码的其C端CendR样序列结合于NRP-1(Jia，H.et al.2006，Soker，S.et al.1998)。几种其他肽，如A7R(ATWLPPR(SEQ ID NO：31))(Starzec，A.et al.2006)、免疫调节肽--促吞噬肽(tuftsin)(TKPR(SEQ ID NO：32))及其变体增强的促吞噬肽(TKPPR(SEQ IDNO：33))(von Wronski，M.A.et al.2006)可结合于NRP-1上的相同位点(Geretti，E et al.2008)。展示VEGF-165的七个C端氨基酸、增强的促吞噬肽或A7R的T7噬菌体结合PPC-1细胞并被所述细胞吸收，并且当结合缓冲液中包含未标记的RPARPAR(SEQ ID NO：2)肽时或者在将丙氨酸残基加至VEGF-C7的C端时，所述结合和内化降低(图19)。这些研究表明CendR肽经包括NRP-1作为关键组分的通路内化。
iv.隐性CendR基序通过蛋白酶解而活化
C端规则的一个激动人心的应用是有可能合理地设计蛋白酶解活化的内化肽(CendR前体)。如上文所示，以胰蛋白酶处理RPARPARA(SEQ ID NO：3)噬菌体可增加所述噬菌体与细胞的结合超过100倍(图14)，表明蛋白酶解可以用于暴露潜伏CendR元件。人降解组(degradome)包含超过550种蛋白酶(Puente，X.S.etal.2003)，它们中的许多暴露有C端精氨酸和赖氨酸残基，并且在存在十分确定的靶序列的情况下也是如此。这类蛋白酶可以用于获得靶细胞选择性的前CendR活化。尿激酶型激活剂(uPA)在细胞外周蛋白酶解级联中起到核心作用，细胞外周蛋白酶解级联在发育过程中的组织重建中以及在病理状态(例如肿瘤侵入和转移、新生血管形成和炎症)中是重要的(Andreasen，P.A et al.2000，Waisman，2003)。uPA活性与肿瘤的关联、其强底物选择性以及其对精氨酸作为P1残基的偏好使得uPA成为前CendR活化的一个吸引人的候选。
设计了包含uPA识别位点(Ke，S.H.et al.1997)和潜伏CendR元件(RPARSGRSAGGSVA(SEQ ID NO：34)，CendR序列下划线，图20A)的肽。展示uPA可切割的CendR(uPA-CendR)肽的噬菌体对PPC-1细胞的结合不超过对照G7噬菌体，但通过在细胞结合之前以uPA预处理则将该结合提高了超过100倍(图20B)。以RPARSGRSAGGSVA(SEQ ID NO：34)涂敷的Q-dot还以uPA敏感的方式内化(图20C，图c-e)。uPA-CendR噬菌体暴露于胰蛋白酶大大增加了所述结合，但以胶原酶-I或凝血酶处理噬菌体无影响。虽然凝血酶在碱性残基后切割，但它明显不识别所述肽中的uPA底物序列，而胰蛋白酶明显不加区分地形成切割。这些研究表明，隐性CendR肽可以通过蛋白酶暴露并转变成内化肽。而且，具有限制性表达模式的蛋白酶可用于CendR肽的内化功能的靶标特异性活化。阿米洛利抑制了摄取(图20C，图e)。
2.讨论
这些研究揭示了以前未被认识的细胞内化通路，称为CendR(图21)。CendR的突出特征有：(i)R/KXXR/K(SEQ ID NO：23)识别基序，(ii)所述基序为了结合和内化活性所需的C端暴露，(iii)NRP-1参与所述结合和内化，以及(iv)隐性CendR基序通过蛋白酶解处理转变成活性CendR基序。
一组心脏归巢肽包含暴露的CendR基序(Zhang，L.et al.2005)，但所述CendR基序也可以是隐含的。几种具有细胞穿透特性的肿瘤归巢肽包含隐性CendR基序(Laakkonen，P.，et al.2002b；Porkka，K.et al.，2002；Jarvinen，T.A.et al.2007；Zhang，L.et al.2006)。除了所述CendR基序之外，这些肽还具有结合特定受体的序列。Sugahara，K.N.et al.，2008中描述的结合整联蛋白的iRGD肽提供了这类肽如果起作用的解释；特异性归巢元件将所述肽集中于所述靶标(肿瘤)处，蛋白酶暴露所述CendR基序，随后NRP-1结合引起所述肽(如果有的话，以及任何其载物)的细胞摄取。
许多阳离子CPP包含活性或隐性CendR元件(Langel，2007)。具有CendR基序的HIV-1 TAT蛋白的碱性结构域可抑制VEGFA-165与NRP-1的结合(Jia，H.et al.2001)，但阳离子CPP的结合和摄取的机制仍不清楚。阳离子CPP和CendR肽之间的最重要的差异是由D氨基酸组成的CCP是有活性的(Polyakov，V.et al.2000，Gammon，S.T.et al.2003)，而本文的结果表明CendR摄取仅依赖于L肽的特异性识别。同时，许多CPP可以内化C端锚定的载物，明显与CendR核心观念相矛盾。可能的情况是，CendR是可能参与阳离子CPP摄取的几个平行通路之一。
所述CendR介导的内化体系的生理重要性未被完全理解，但CendR元件存在于整个蛋白组中，并且许多丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶能够活化它们(Barrett，Alan et al.1998)。前蛋白转化酶和膜蛋白酶如蛋白裂解酶(matriptase)可能是特别相关的，因为这些酶的切割可暴露多种内源性蛋白(肽类激素、生长因子、粘附分子、蛋白酶)C端的RXXR(SEQ ID NO：23)序列(Thomas，G.，2002，Uhland，K.2006)。生理CendR序列的可能的功能是使得NRP-1共受体起作用、受体活化以及活性蛋白的细胞摄取。
病毒和其他微生物似乎可挟持所述CendR机制作为感染促进因素。伴随有CendR元件暴露的病毒外壳蛋白的蛋白酶解切割似乎是许多病毒病原体的感染性中的反复出现的现象(表2)。
表2.具有表面CendR元件的人病原性病毒的实例
Figure BPA00001248881800811
Figure BPA00001248881800821
被普遍表达的蛋白酶--弗林蛋白酶--切割的病毒表面蛋白是数种病毒全身扩散的重要促成因素，而对具有限制性表达模式的蛋白酶敏感的病毒的感染性可以将感染限制于表达所述合适蛋白酶的组织。该概念以流感病毒来举例说明(Steinhauer，D.A.et al.1999)。局部感染哺乳动物的血凝素和无毒力的禽流感病毒在单个精氨酸残基处被切割；这类切割局限于有限的细胞类型，例如呼吸道和消化道的细胞。相反，可造成全身感染的高致病性禽流感病毒可被弗林蛋白酶活化，以暴露多碱性CendR元件。本文中表明，抑制病原体及其产物的CendR介导的内化和组织穿透可以提供对抗感染性疾病的新途径。
所述CendR技术可能具有许多其他生物技术应用，例如提高细胞类型特异性纳米颗粒的递送。以预暴露的CendR肽涂覆的纳米颗粒将被所述颗粒首先遇到的血管床(心脏和肺，在静脉注射RPARPAR(SEQ ID NO：2)噬菌体后)吸收。如Sugahara et al.2008所示，隐性CendR序列可用于将载物递送至外周组织。血浆包含高浓度的普通蛋白酶抑制剂(例如α-2-巨球蛋白)和酶特异性蛋白酶抑制剂(例如α-2抗纤溶酶、抗凝血酶)。这可能提供防止血液中的成熟前CendR活化的保护作用。活性蛋白酶一般局限于紧邻细胞外周区域。这些蛋白酶可活化已通过被动积聚或者通过归巢肽介导的递送到达靶组织的纳米颗粒上的隐性CendR肽。能够暴露隐性CendR序列的组织特异性蛋白酶还可增加体内的靶标选择性。由活化的CendR元件介导的细胞摄取为将所处理的肽及其载物聚集于所述靶组织或细胞提供了一种机制。来自这些研究的另一个重要结论是，CendR元件能够促进纳米颗粒在组织中的扩散，以及可以通过将基于对接的CendR靶向元件和蛋白酶敏感性CendR靶向元件相结合实现选择性CendR介导的内化和组织穿透。随附报道(Sugahara et al.2008)中描述的iRGD肽以及其中详述的含隐性CendR元件的其他可能的内化血管归巢肽即为示例说明。还表明，与所研究的噬菌体和其他纳米颗粒类似，多种感染剂可能使用所述CendR体系，来协助它们在组织中扩散。
3.方法
动物规程。所有动物实验依照加利福利亚大学圣塔芭芭拉分校的动物研究委员会批准的规程，使用BALB/c裸鼠(Harlan Sprague Dawley，Inc.，Indianapolis，IN)进行。
噬菌体展示。对于体内噬菌体展示，以1010噬斑形成单位(pfu)的T7噬菌体静脉注射小鼠，然后进行循环系统灌注，并通过滴定确定靶器官中结合的噬菌体。对于在培养细胞上(体外展示)和源自器官的细胞悬液(离体展示)的细胞结合研究，将所述细胞在4℃下与109pfu的噬菌体孵育、洗涤、裂解并通过滴定定量。在37℃下孵育，然后低pH洗涤(甘氨酸-HCl，pH 2.5)来评估内化噬菌体的量。
qdot的标记。依照制造商的说明书，将生物素标记的肽用于将所述605ITK链霉亲和素qdot(Invitrogen，Carlsbad，CA)功能化。
免疫荧光法。将培养的细胞和组织切片以4％缓冲的低聚甲醛或冷(-20℃)甲醇固定，然后与合适的一抗和Alexa标记的二抗一起孵育，并以DAPI或Hoechst 342 DNA染料进行细胞核染色。
亲和色谱法。将PPC-1肿瘤在含200mM正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷的PBS中裂解，然后与RPARPAR(SEQ ID NO：2)涂覆的Sulfolink-小珠(Pierce，Rockford，IL)一起孵育，并用含2mM游离RPARPAR(SEQ ID NO：2)肽的裂解缓冲液洗脱。将从洗脱级分的银染色凝胶切下凝胶片段在医学研究蛋白质组资源伯恩汉姆研究所(Burnham Institute for Medical Research Proteomics Resource)进行MALDI-TOF质谱测定。
小鼠和组织。所有动物实验依照加利福利亚大学圣塔芭芭拉分校的动物研究委员会批准的规程进行。对于肿瘤注射以及在处死之前，对小鼠腹腔注射赛拉嗪(10mg/kg)和氯胺酮(50mg/kg)麻醉。将BALB/c无胸腺裸鼠(Harlan Sprague Dawley，Inc.，Indianapolis，IN)用于肿瘤异种移植，以及体外和离体噬菌体展示实验。通过将106PPC-1细胞(Zhang，L.et al.2006)注入前列腺腹侧叶形成正位前列腺肿瘤异种移植物。对于组织学分析，将组织以4％低聚甲醛固定，在含30％蔗糖的磷酸盐缓冲的盐水溶液中低温保护，并且以10μm切片。
细胞系。将PPC-1、PC-3、Du-145、4T1、MIA PaCa-2、PDAC1.3、B16F10、M21和MDA-MB-435细胞系维持在补充有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的达尔伯克氏改良的伊格尔培养基(DMEM)中。依照制造商的说明书，培养人脐静脉内皮细胞。
噬菌体展示。依照制造商的说明书(EMD Biosciences，Gibbstown，NJ)，将T7-select噬菌体展示体系用于噬菌体文库构建(文库多样性-108)和单个噬菌体克隆。通过以下方式纯化噬菌体：以PEG-8000(Sigma，St.Louis，MO)沉淀，然后进行CsCl2梯度超速离心和透析。展示肽的序列通过编码位于T7主外壳蛋白gp10的C端包含插入物的区域的DNA确定。
为进行生物淘选(biopanning)和噬菌体结合研究(Hoffman，J.A.et al.，2004)，将培养细胞培养至汇合并以胰蛋白酶收集，使用Medimachine(BD Biosciences，San Jose，CA)将小鼠器官分割。为了测量噬菌体结合，在4℃下将结合缓冲液(含1％BSA的DMEM)中106个细胞与109pfu/ml的T7噬菌体孵育1小时。将所述细胞以所述结合缓冲液洗涤4次，在含1％NP-40的LB细菌生长培养基中裂解，并滴定。噬菌体内化分析使用了相同方法，除了将细胞与噬菌体在37℃下孵育以及在第二次洗涤时以酸性缓冲液(500mM氯化钠、0.1M甘氨酸、1％BSA，pH 2.5)代替结合缓冲液之外。
使用在硅油垫(1.03g/ml)上离心以在时程实验过程中从细胞中分离未结合的噬菌体。在与噬菌体孵育之前20分钟，将噬菌体结合和内化抑制剂(肝素、软骨素、糖萼去除酶、胞吞抑制剂、游离肽、量子点和UV失活的噬菌体)加入所述细胞中。用于该研究中的胞吞抑制剂如下：制霉菌素(50μg/ml)、金雀异黄素(100μg/ml)、氯丙嗪(5μg/ml)、5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利(100μM)、渥曼青霉素(10μM)。
小鼠中的体内噬菌体归巢研究通过以下方式进行：将1010pfu的T7噬菌体注入尾静脉，在10分钟-1小时后，将小鼠以DMEM灌注流过心脏的左心室。收集目的器官、在1％NP40中均浆，并通过滴定定量测定噬菌体。
肽合成和qdot标记。所述肽在微波辅助的自动肽合成仪(Liberty，CEM Corporation)上使用Fmoc/t-Bu化学法合成。通过HPLC使用含0.1％TFA的乙腈-水混合物将肽纯化至纯度90％-95％，并通过Q-TOF质谱分析确认。
将链霉亲和素ITK-605量子点(Invitrogen，Carlsbad，CA)以生物素标记的肽通过以下方式功能化：与100倍摩尔过量的肽一起孵育，然后通过透析除去游离肽。
亲和色谱法。将正位PPC-1肿瘤在含400mM正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、1mM MgSO4、1mM MnCl2、1mM CaCl2和1片/5ml无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，St.Louis，MO)的PBS中均浆。在4℃下在旋转平台上提取6小时后，将裂解物通过离心(在冷冻离心机中以14,000rpm离心20分钟)澄清，并加载于通过以下方式制备的亲和柱：依照制造商的说明书(Pierce，Rockford，IL)，将半胱氨酸标记的RPARPAR(SEQ ID NO：2)肽偶联于Sulfolink偶联凝胶。在结合过夜后，将所述柱以包含200mM正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷且其他组分与裂解缓冲液相同的柱洗涤缓冲液洗涤，然后以含2mM游离RPARPAR肽的相同缓冲液洗脱。
将洗涤和洗脱级分的样品使用Novex 4-20％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)分离，使用Silver Snap试剂盒(Pierce，Rockford，IL)银染，并在医学研究蛋白质组资源伯恩汉姆研究所进行MALDI-TOF质谱测定。将亲和色谱法样品以抗体免疫印迹并探测，然后进行结合的化学发光检测。
免疫荧光染色。将培养细胞(2×105个细胞)在37℃下和5％CO2中过夜培养于6孔组织培养板中I型胶原涂覆的盖玻片(BDBiosciences，San Jose，CA)上，并与108pfu的T7噬菌体一起孵育。将所述细胞在4％低聚甲醛或冷(-20℃)甲醇中固定，并以抗体染色。细胞核以DAPI或Hoechst 542染色。如以前的描述(Laakkonen，P.et al.2002b)在机构内部产生多克隆兔抗T7抗体，不同的是还包括使用CsCl2离心的噬菌体纯化步骤。使用的其他一抗有大鼠抗小鼠CD31单克隆抗体(BD Biosciences)、兔抗NRP-1抗体、小鼠抗人Lamp-1抗体、小鼠抗人小窝蛋白抗体(Millipore，Temecula，CA)、小鼠抗NRP-1抗体(Miltenyi Biotec Inc.，Auburn，CA)、小鼠抗人EEA-1抗体(BD Biosciences，San Jose，CA)。二抗--抗小鼠、大鼠和兔免疫球蛋白的Alexa594山羊抗体以及Alexa488驴抗兔抗体来自Invitrogen(Carlsbad，CA)。细胞和组织切片通过共聚焦显微镜(Fluoview 500，Olympus America Inc.，Center Valley，PA)检查。
DNA构建体和转染。包含野生型NRP-1 cDNA的pcDNA3.1(+)的表达构建体获赠自Michael Klagsbrun博士。通过将TCAAAAGAAACC(SEQ ID NO：48)(编码氨基酸SKET)替换为GCTAAAGCTGCT(SEQ ID NO：49)(编码AKAA)，将定向诱变用于在NRP-1(S346A-E348A-349A)的b1结构域中产生VEGF-165结合位点的三个突变。
依照制造商的说明书(Invitrogen，Carlsbad，CA)，使用lipofectamine以这些构建体瞬时转染M21黑色素瘤细胞。
噬菌体和qdot的蛋白酶处理。将109噬菌体颗粒或50μl的肽涂覆的qdot噬菌体以50iu的uPA、25μg的结晶胰蛋白酶、50iu的凝血酶或25μg的I型胶原酶(都购自Sigma，St.Louis，Mo)处理。
统计分析。通过学生t检验和单因素方差分析(ANOVA)以及合适的事后检验来分析数据(表3)。
表3|统计显著性
Figure BPA00001248881800871
Figure BPA00001248881800872
Figure BPA00001248881800873
图12A。
§在每幅图中，p值对应于从左至右的星号。1个星号，p＜0.05；2个星号，p＜0.01；3个星号p＜0.001。
Figure BPA00001248881800874
所有统计分析n＝3。
本申请通篇参引了多份参考文献。这些出版物的公开文本通过引证的方式全文纳入本申请，以更全面地描述本发明所属技术领域的状态。
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应说明的是，除非上下文中另外明确指出，在本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式的“一”、“一种”和“该”包括复数指代对象。因此，例如，提及“一种肽”时包括多个这样的肽，提及“该肽”时，是指本领域技术人员已知的一个或多个肽及其等同物；等等。
“任选的”或“任选地”是指后面描述的事件、情况或材料可能发生或存在，也可能不发生或不存在，且该描述包括所述事件、情况或材料发生或存在以及不发生或不存在的情形。
本文中范围可以表示为从“约”一个具体的数值，和/或至“约”另一个具体的数值。当表示为这种范围时，除非上下文中特别指明，还特别考虑和认为公开了从一个具体数值和/或至另一个具体数值的范围。类似地，当通过在前面使用“约”将数值表示为近似值时，除非上下文中特别指明，应当理解的是，该具体的数值构成另一个被特别考虑和认为被公开的实施方案。应当进一步理解的是，除非上下文中特别指明，每个范围的端点在与另一个端点相关和独立于另一个端点时都是有意义的。最后，应当理解的是，除非上下文中特别指明，在明确公开的范围中所包括的所有单个的数值和子范围也被特别考虑并应认为被公开。不论在具体的情况下这些实施方案的全部或部分是否被明确地公开，上述的原则都适用。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义都与所公开的方法和组合物所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。虽然在实施或检测本发明方法和组合物时可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料，但是特别有用的方法、装置和材料仍然如本文所述。本文引用的出版物和旨在引用的素材在此特别地以引证的方式纳入本文。但是本文不应被解释为承认本发明不能在先前的发明之前做出。并未承认任何参考文献构成了现有技术。参考文献的讨论说明了它们的作者的论断，但是本申请人保留怀疑所引用文献的准确性和相关性的权利。可以清楚地理解，虽然本文中参引了许多出版物，但是并未承认这些参考文献构成本领域的公知常识的一部分。
在本申请的说明书和权利要求的通篇中，词语“包括”及其同义词“包含”和“含有”的含义为“包括但不限于”，并不意在排除例如其他的添加物、组分、整数或步骤。
应理解，所公开的方法和组合物不限于具体的手段、方案或试剂，因此这些可以有变化。还应理解，用于本文中的术语仅是为了描述具体实施方案的目的，不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书限定。
本领域技术人员仅利用常规试验就可以认识到或确认本文所述方法和组合物的具体实施方案的许多等价物。下述的权利要求书意在涵盖这些等价物。
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Claims (82)

1.一种形成CendR缀合物的方法，所述方法包括
(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或穿透组织，其中所述氨基酸序列包含一个CendR元件，
(b)使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于一种包含所述选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述运载组合物偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧，
其中所述CendR缀合物包含所述蛋白或肽以及所述偶联或缔合的运载组合物。
2.权利要求1的方法，其中步骤(b)的蛋白或肽在步骤(a)所选择的氨基酸序列存在于所述蛋白或肽中时可以被内化至细胞中，但当所选择的氨基酸不存在于所述蛋白或肽中时不能被内化至细胞中。
3.权利要求1的方法，其中步骤(b)的蛋白或肽在步骤(a)所选择的氨基酸序列存在于所述蛋白或肽中时可以穿透组织，但当所选择的氨基酸不存在于所述蛋白或肽中时不能穿透组织。
4.权利要求1的方法，其中步骤(b)的蛋白或肽在步骤(a)所选择的氨基酸序列存在于所述蛋白或肽中时可以被内化至细胞中并可穿透组织，但当所选择的氨基酸不存在于所述蛋白或肽中时不能被内化至细胞中也不能穿透组织。
5.权利要求1的方法，其中步骤(a)所选择的氨基酸序列在不与步骤(b)的组合物缔合情况下可以被内化至细胞中。
6.权利要求1的方法，其中步骤(a)所选择的氨基酸序列在不与步骤(b)的组合物缔合情况下可以穿透细胞。
7.权利要求1的方法，其中步骤(a)所选择的氨基酸序列在不与步骤(b)的组合物缔合情况下可以被内化至细胞中并可穿透组织。
8.权利要求1的方法，其中步骤(a)所选择的氨基酸序列是步骤(b)的蛋白或肽中仅有的功能性内化元件。
9.权利要求1的方法，其中步骤(a)所选择的氨基酸序列是所述CendR缀合物中仅有的功能性内化元件。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述CendR元件为可活化的CendR元件。
11.权利要求6的方法，其中所述可活化CendR元件为蛋白酶可活化的CendR元件。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述蛋白或肽是环状的。
13.权利要求1-9任一项的方法，其中所述CendR元件位于所述蛋白或肽的C末端。
14.权利要求1-12任一项的方法，其中步骤(b)的运载组合物是抗血管生成剂、促血管生成剂、纳米颗粒、癌症化学治疗剂、细胞毒剂、抗炎剂或抗关节炎剂。
15.权利要求1-14任一项的方法，其中步骤(b)的运载组合物包含归巢序列。
16.权利要求15的方法，其中所述运载组合物选择性地归巢于肿瘤。
17.权利要求16的方法，其中所述运载组合物选择性地归巢于肿瘤血管。
18.权利要求1-17任一项的方法，其中所述氨基酸序列被选择以用于内化至细胞中。
19.权利要求1-17任一项的方法，其中所述氨基酸序列被选择以用于组织穿透。
20.权利要求1-17任一项的方法，其中所述氨基酸序列被选择以用于内化至细胞中和组织穿透。
21.一种由包括如下步骤的方法制备的CendR缀合物：
(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或穿透组织，其中所述氨基酸序列包含一个CendR元件，
(b)使一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于一种包含所述选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述运载组合物偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧，
其中所述CendR缀合物包含所述蛋白或肽以及所述偶联或缔合的运载组合物。
22.权利要求21的CendR缀合物，其中所述CendR元件为可活化的CendR元件。
23.权利要求22的CendR缀合物，其中所述可活化的CendR元件为蛋白酶可活化的CendR元件。
24.权利要求21-23任一项的CendR缀合物，其中所述蛋白或肽是环状的。
25.权利要求21的CendR缀合物，其中所述CendR元件位于所述蛋白或肽的C末端。
26.权利要求21-25任一项的CendR缀合物，其中所述氨基酸序列被选择以用于内化至细胞中。
27.权利要求21-25任一项的CendR缀合物，其中所述氨基酸序列被选择以用于组织穿透。
28.权利要求21-25任一项的CendR缀合物，其中所述氨基酸序列被选择以用于内化至细胞中和组织穿透。
29.一种将运载组合物递送至细胞中的方法，所述方法包括：
(a)将一个CendR元件偶联于所述运载组合物，从而形成一种CendR缀合物；并且
(b)将所述细胞暴露于所述CendR缀合物，其中所述CendR缀合物然后可以进入所述细胞，从而将所述运载组合物递送至所述细胞中。
30.权利要求29的方法，其中所述CendR元件为可活化的CendR元件。
31.权利要求30的方法，其中所述可活化的CendR元件为蛋白酶可活化的CendR元件。
32.权利要求29-31任一项的方法，其中所述蛋白或肽是环状的。
33.权利要求30-32任一项的方法，其中在所述细胞暴露于所述CendR元件时，一种切割剂活化所述CendR缀合物的可活化CendR元件。
34.权利要求29的方法，其中所述CendR元件位于所述蛋白或肽的C末端。
35.一种鉴定可以内化CendR元件的细胞的方法，所述方法包括：
(a)将一种细胞暴露于一个CendR元件；
(b)确定所述CendR元件是否被内化。
36.权利要求35的方法，其中所述细胞在一个测定中。
37.权利要求35或36的方法，其中所述CendR元件偶联于一种蛋白或肽。
38.权利要求35-37任一项的方法，其中所述CendR元件为可活化的CendR元件。
39.权利要求38的方法，其中所述可活化的CendR元件为蛋白酶可活化的CendR元件。
40.权利要求35-39任一项的方法，其中所述蛋白或肽是环状的。
41.权利要求35-40任一项的方法，其中所述可活化的CendR元件在暴露于所述细胞之前被活化。
42.权利要求35-37任一项的方法，其中所述CendR元件位于所述蛋白或肽的C末端。
43.权利要求38-41任一项的方法，其中所述可活化的CendR元件为蛋白酶可活化的CendR元件。
44.一种鉴定癌细胞作为基于CendR的疗法的候选物的方法，所述方法包括：
(a)将所述癌细胞暴露于一个CendR元件；
(b)确定所述CendR元件是否被所述癌细胞内化，其中内化的CendR元件将所述癌细胞鉴定为基于CendR的疗法的候选物。
45.权利要求44的方法，其中所述细胞在一个测定中。
46.权利要求44的方法，其中所述细胞在受试者中。
47.权利要求44-46任一项的方法，其中所述CendR元件偶联于一种蛋白或肽。
48.权利要求44-47任一项的方法，其中所述CendR元件为可活化的CendR元件。
49.权利要求48的方法，其中所述可活化的CendR元件为蛋白酶可活化的CendR元件。
50.权利要求48-49任一项的方法，其中所述蛋白或肽是环状的。
51.权利要求48-47任一项的方法，其中所述CendR元件位于所述蛋白或肽的C末端。
52.一种产生可活化的CendR元件的方法，所述可活化的CendR元件在接近目的细胞时可以被活化，所述方法包括形成一个可活化的CendR元件，其中一个封闭基团经可切割键偶联于一个CendR元件，其中所述可切割键可被存在于目的细胞附近的酶切割。
53.权利要求52的方法，其中所述细胞在受试者中。
54.权利要求52或53的方法，还包括在形成所述可活化的CendR元件之前鉴定存在于目的细胞附近的酶。
55.权利要求52-54任一项的方法，还包括在形成所述可活化的CendR元件之前，基于存在于目的细胞附近的酶选择所述可切割键。
56.一种形成可活化的CendR元件的方法，所述方法包括：
(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或穿透组织，其中所述氨基酸序列包含一个CendR元件，
(b)使一个封闭基团共价偶联于所述CendR元件，其中偶联所述封闭基团和所述CendR元件的键是可切割的，其中共价偶联于所述CendR元件的所述封闭基团可减少或阻止细胞内化和/或组织穿透，
其中所述可活化的CendR元件包含所述选择的氨基酸序列和所述封闭基团。
57.权利要求56的方法，其中所述CendR元件包含末端羧基，其中所述封闭基团偶联于所述末端羧基。
58.权利要求57的方法，所述方法还包括，在步骤(b)之前选择可被存在于目的细胞附近的蛋白酶切割的、偶联所述封闭基团和所述末端羧基的键。
59.权利要求56的方法，其中所述封闭基团偶联于所述CendR元件的C端氨基酸。
60.权利要求56的方法，其中所述封闭基团偶联于所述CendR元件的C端氨基酸之外的所述CendR元件的氨基酸。
61.权利要求56-60任一项的方法，其中一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于一种包含所述选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述运载组合物偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。
62.权利要求56-61任一项的方法，其中所述氨基酸序列被选择以用于内化至细胞中。
63.权利要求56-61任一项的方法，其中所述氨基酸序列被选择用于组织穿透。
64.权利要求56-61任一项的方法，其中所述氨基酸序列被选择以用于内化至细胞中和组织穿透。
65.权利要求56-62任一项的方法，其中共价偶联于所述CendR元件的所述封闭基团可减少或阻止细胞内化。
66.权利要求56-61或63任一项的方法，其中共价偶联于所述CendR元件的所述封闭基团可减少或阻止组织穿透。
67.权利要求56-61或64任一项的方法，其中共价偶联于所述CendR元件的所述封闭基团可减少或阻止细胞内化和组织穿透。
68.一种由包括如下步骤的方法制备的可活化的CendR元件：
(a)选择一种氨基酸序列用于内化至细胞中和/或穿透组织，其中所述氨基酸序列包含一个CendR元件，
(b)使一个封闭基团共价偶联于所述CendR元件，其中偶联所述封闭基团和所述CendR元件的键是可切割的，其中共价偶联于所述CendR元件的所述封闭基团可减少或阻止细胞内化和/或组织穿透，
其中所述可活化的CendR元件包含所述选择的氨基酸序列和所述封闭基团。
69.权利要求68的CendR元件，其中所述CendR元件包含末端羧基，其中所述封闭基团偶联于所述末端羧基。
70.权利要求69的CendR元件，其中所述方法还包括，在步骤(b)之前选择可被存在于目的细胞附近的蛋白酶切割的、偶联所述封闭基团和所述末端羧基的键。
71.权利要求68的CendR元件，其中所述封闭基团偶联于所述CendR元件的C端氨基酸。
72.权利要求68的CendR元件，其中所述封闭基团偶联于所述CendR元件的C端氨基酸之外的所述CendR元件的氨基酸。
73.权利要求68-72任一项的CendR元件，其中一种运载组合物共价偶联于或非共价缔合于一种包含所述选择的氨基酸序列的蛋白或肽，其中所述运载组合物偶联或缔合于所述蛋白或肽的所述CendR元件的N端侧。
74.权利要求68-73任一项的CendR元件，其中所述氨基酸序列被选择以用于内化至细胞中。
75.权利要求68-73任一项的CendR元件，其中所述氨基酸序列被选择以用于组织穿透。
76.权利要求68-73任一项的CendR元件，其中所述氨基酸序列被选择以用于内化至细胞中和组织穿透。
77.权利要求68-74任一项的CendR元件，其中共价偶联于所述CendR元件的所述封闭基团可减少或阻止细胞内化。
78.权利要求68-73或75任一项的CendR元件，其中共价偶联于所述CendR元件的所述封闭基团可减少或阻止组织穿透。
79.权利要求任一项68-73或76的CendR元件，其中共价偶联于所述CendR元件的所述封闭基团可减少或阻止细胞内化和组织穿透。
80.一种鉴定可以被CendR元件穿透的组织的方法，所述方法包括
(a)将一种组织暴露于一个CendR元件，并且
(b)确定所述CendR元件是否穿透所述组织。
81.一种鉴定肿瘤作为基于CendR的疗法的候选物的方法，所述方法包括：
(a)将所述肿瘤暴露于一个CendR元件，并且
(b)确定所述CendR元件是否穿透所述肿瘤，其中穿透的CendR元件将所述肿瘤鉴定为基于CendR的疗法的候选物。
82.一种鉴定肿瘤作为基于CendR的疗法的候选物的方法，所述方法包括：
(a)将来自所述肿瘤的细胞暴露于一个CendR元件，并且
(b)确定所述CendR元件是否被所述细胞内化，其中内化的CendR元件将所述肿瘤鉴定为基于CendR的疗法的候选物。
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