ES2309992T3 - Composiciones y procedimientos para incrementar las respuestas inmunes mediadas por celulas presentadoras de antigeno. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN UNOS ADYUVANTES MOLECULARES CONSISTENTES EN UN LIGANDO DIRIGIDO A CELULAS CON ANTIGENOS VINCULADOS FUNCIONALMENTE CON UN INMUNOGEN, P.EJ., ANTIGENOS ASOCIADOS A LOS TUMORES, ANTIGENOS BACTERIANOS O VIRICOS, ETC. SE DESCRIBEN LOS METODOS PARA LA ADMINISTRACION DE ESTOS ADYUVANTES MOLECULARES A PACIENTES, DANDO LUGAR A LA TRANSDUCCION DE SEÑALES ACTIVADORAS PARA LA CELULA DIANA CON ANTIGENOS, AUMENTANDO ASI LA RESPUESTA INMUNE AL INMUNOGEN COADMINISTRADO.

Description

Composiciones y procedimientos para incrementar las respuestas inmunes mediadas por células presentadoras de antígeno.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de las vacunas y la estimulación de una inmunidad adquirida. En particular, la presente invención proporciona nuevas composiciones diseñadas para suministrar antígenos específicos a células presentadoras de antígeno y suministrar simultáneamente señales a las células que producen una respuesta inmune deseada.

Antecedentes de la invención

En esta solicitud se hace referencia a varias publicaciones mediante números entre paréntesis para describir más completamente el estado de la técnica a la que pertenece esta invención. Las citas completas para estas referencias se encuentran al final de la memoria descriptiva.

La base de la inmunidad adquirida específica en un organismo es la capacidad de diferenciar entre sustancias antigénicas propias y no propias. El sistema inmune de mamíferos usa moléculas de la superficie celular conocidas como el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) para diferenciar entre propias y no propias. Existen dos clases de moléculas de MHC: las moléculas de Clase I se encuentran en todos los tipos de células nucleadas del cuerpo; las moléculas de Clase II se encuentran principalmente en células implicadas en la producción de respuestas inmunes. La mayoría de las respuestas inmunes específicas se generan contra péptidos o derivados de péptidos asociados con moléculas de MHC.

La estructura de las moléculas de MHC es tal que de forma natural se unen a pequeños péptidos, glicopéptidos, fosfopéptidos y similares. Una función importante de las moléculas de MHC es unirse a péptidos que proceden de productos procesados de proteínas expresadas en células que expresan las moléculas de MHC y transportarlos a la superficie celular para la presentación al sistema inmune. De este modo, algunas moléculas de MHC funcionan para exponer el sistema inmune a péptidos que son representativos de proteínas celulares normales. Este proceso sucede durante el desarrollo, cuando se aprende qué es lo propio, y continúa durante toda la vida del organismo. Diferentes mecanismos de tolerancia inmune evitan que el organismo reaccione a péptidos "propios" asociados con el
MHC.

La introducción de proteínas no propias en células da como resultado la aparición de péptidos nuevos y diferentes en asociación con las moléculas de MHC; éstos se reconocen como "no propios", dando como resultado una respuesta inmune. Por ejemplo, una infección vírica de una célula dará como resultado la producción de péptidos víricos expresados sobre la superficie de células presentadoras de antígeno en asociación con moléculas de MHC (generalmente, MHC de Clase I). Los péptidos víricos presentados con moléculas de MHC en la superficie de la célula serán reconocidos a menudo como extraños y se generará una respuesta inmune. Puede aparecer una enfermedad autoinmune si se pierde la tolerancia hacia algunos péptidos propios, o si se produce respuesta inmune contra proteínas víricas u otras proteínas extrañas que presentan reacción cruzada con péptidos normales en el organismo hospedador.

En el caso de infecciones bacterianas u otros ataques de origen externo, entran en el organismo nuevas proteínas o compuestos. Algunas células implicadas en la respuesta inmune son capaces de fagocitar organismos o proteínas extrañas. Estas células inmunes degradan (procesan) los productos proteicos y los péptidos obtenidos se expresan en la superficie de la célula en asociación con moléculas de MHC, donde se genera una respuesta inmune adaptativa específica contra nuevos componentes no propios. Esta actividad se denomina procesamiento y presentación de antígeno y las células que median esta actividad se denominan Células Presentadoras de Antígeno (APC). Muchos tipos celulares inmunes diferentes, incluyendo macrófagos, células dendríticas, células B y otros tipos celulares asociados, realizan esta función.

El antígeno solo es a menudo insuficiente para producir una respuesta inmune. En ocasiones, el antígeno debe presentarse con "señales" acompañantes que están mediadas por interacciones de ligando-receptor entre las APC y los linfocitos de respuesta o entre estas células y factores solubles que están presentes en el entorno circundante. Los factores solubles incluyen citoquinas y otros mediadores de la inflamación que están habitualmente presentes en lugares de infecciones o ataques (complemento, quininas, otros factores de crecimiento y de citoquinas). Las señales pueden ser de naturaleza positiva, dando como resultado la proliferación de linfocitos y la generación de una respuesta inmune adaptativa, o de naturaleza negativa, dando como resultado la apoptosis de los linfocitos de respuesta y posiblemente la tolerancia inmune a ese antígeno. La presentación de antígeno sucede a menudo en presencia de células T auxiliares u otros tipos celulares que secretan series de citoquinas, las cuales influyen en o determinan el tipo de respuesta inmune que se induce. A un nivel celular, se generan respuestas inmunes específicas en un entorno celular mixto que incluye diferentes tipos de células presentadoras de antígeno, linfocitos T auxiliares, otros tipos de células reguladoras y los linfocitos de respuesta (células B para respuestas de anticuerpos y células T para respuestas celulares). También puede producirse el reconocimiento directo de péptidos por células T con algunos tipos celulares, tales como aloinjertos, donde el MHC alogénico es reconocido directamente como extraño.

Procesamiento de antígenos y su impacto sobre tipos de respuestas inmunes contra antígenos específicos. Actualmente no se entiende bien el mecanismo por el que se procesa y se presenta un antígeno y los parámetros que determinan los tipos de respuestas inmunes que se generan (de anticuerpos frente a celular) para muchos antígenos. Se cree que hay diferentes clases de APC que pueden producir diferentes tipos de respuestas inmunes. En general, se piensa que las respuestas inducidas por APC contra antígenos exógenos que son captados por endocitosis se presentan al sistema inmune en el contexto de MHC de Clase II y conducen al reclutamiento de células T auxiliares que interaccionan con células B y, finalmente, producen una respuesta de anticuerpos. Por el contrario, los péptidos endógenos de las células se asocian con moléculas de MHC de Clase I y producen actividades celulares que incluyen linfocitos T citotóxicos (CTL) y células T de Hipersensibilidad de Tipo Retardado (DTH). Existen importantes excepciones a estos mecanismos. Por ejemplo, se han descrito muchos CTL reactivos con péptidos exógenos y es posible generar CTL contra péptidos específicos que se han añadido a cultivos in vitro de células inmunes.

Otros factores pueden determinar los tipos de respuestas inmunes que se generan. Por ejemplo, la naturaleza de la asociación de péptidos con MHC (de Clase I o de Clase II) es un factor importante que influye en los tipos de respuestas inmunes. En el caso de las moléculas de MHC de Clase I, existen motivos de unión específicos para la asociación con péptidos (Rammensee et al, Ann. Rev. Imm. 11: 213, 1993). Se han establecido motivos de unión para H-2 K^{d}, K^{k}, D^{d} y otros MHC murinos y humanos. También existen parámetros de la secuencia peptídica que determinan la afinidad por MHC de Clase II. De esta manera, los tipos de péptidos contra los que un individuo puede generar una respuesta del sistema inmune están determinados, en parte, por el fenotipo y el genotipo inmunogenético, que establece la forma y la estructura de las moléculas de MHC expresadas por ese individuo.

En resumen, los tipos de respuesta inmune que se generan en un organismo en respuesta a una exposición antigénica es el resultado de una miríada de factores contribuyentes, incluyendo: el fondo inmunogenético del individuo, sensibilización previa a antígenos, la ruta y la forma de exposición al antígeno, la edad y el género del organismo y otros factores. Prácticamente todas las respuestas inmunes adquiridas que implican el reconocimiento de células T específicas se dirigen contra péptidos pequeños unidos al surco de unión del péptido de moléculas de MHC, siendo la excepción obvia la respuesta a superantígenos. La reacción inmune celular (reacción de T auxiliares, CTL, DTH) contra péptidos unidos a MHC se genera habitualmente por presentación del antígeno a células T mediante células presentadoras de antígeno (APC).

Vacunas tumorales. Las células cancerosas expresan moléculas aberrantes conocidas como antígenos asociados a tumores. El sistema inmune tiene el potencial de reconocer tales estructuras como "extrañas" y generar respuestas inmunes específicas contra las mismas para rechazar las células tumorales de un modo muy similar a como se rechaza un aloinjerto. Esto proporciona la base para el interés en el desarrollo de agentes inmunoterápicos específicos activos (ASI) ("vacunas" contra el cáncer) basadas en antígenos asociados a cáncer.

Los primeros estudios sobre tumores de roedores inducidos por carcinógenos químicos, radiación ultravioleta o virus demostraron la inducción de un rechazo inmunológico de la exposición a un tumor secundario. Estudios posteriores sobre tumores espontáneos mostraron que estos animales eran incapaces de inducir el rechazo inmunomediado del tumor. Aunque se han caracterizado un gran número de antígenos asociados a tumores humanos, la mayoría de éstos son expresados también por algunas células normales. Por lo tanto, la tolerancia inmunológica a tales moléculas hace difícil estimular respuestas contra tales antígenos. Además, existe la preocupación de que la inducción de fuertes respuestas inmunes contra moléculas propias pueda dar como resultado el desarrollo de trastornos autoinmunes. Ya que rara vez se detectan antígenos específicos de tumor en cánceres espontáneos, se han visto con pesimismo las estrategias para desarrollar una inmunoterapia específica activa para cánceres comunes basadas en antígenos asociados a tumores.

Sin embargo, ha persistido el interés en la inmunología tumoral y el desarrollo de ASI en particular. Existen al menos cuatro razones para el interés actual en las estrategias de ASI. En primer lugar, se han reconocido respuestas inmunes mediadas por células como el factor clave en el rechazo inmunológico del cáncer. Las células T reconocen péptidos procesados en asociación con moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), de tal forma que las proteínas intracelulares pueden dar origen a dianas peptídicas para respuestas mediadas por células. Además, ya que el procesamiento y la presentación de antígenos son etapas críticas en el reconocimiento de células T, las alteraciones asociadas a cáncer de una proteína propia (en su procesamiento postraduccional o en sus niveles de expresión) pueden dar como resultado la presentación de nuevos fragmentos peptídicos en células cancerosas. En segundo lugar, se han caracterizado mutaciones puntuales específicas de tumor en determinados genes en varios cánceres de animales y seres humanos. Algunas de estas mutaciones generan nuevos fragmentos peptídicos que se unen a moléculas de MHC, dando como resultado la producción de nuevos epítopos para el reconocimiento por células T. Este proceso permite la inducción de respuestas inmunes específicas contra células cancerosas que llevan tales mutaciones. En tercer lugar, la manipulación de respuestas inmunes usando citoquinas, antígenos mutados y otros medios ha dado como resultado en algunas ocasiones el rechazo del tumor incluso en casos de tumores que expresan débilmente antígenos inmunogénicos. En cuarto lugar, algunos individuos con inmunodeficiencias graves tienen una mayor incidencia de tumores que la población normal, sugiriendo que el sistema inmune juega un papel importante en la eliminación de algunos tumores.

Se han utilizado diversos métodos para estimular respuestas inmunes generales, especialmente para sustancias de interés no antigénicas o débilmente antigénicas. Por ejemplo, se han usado durante mucho tiempo adyuvantes, tales como el completo de Freund y de Ribi, con este propósito. Estos adyuvantes comprenden soluciones oleosas que contienen componentes, tales como lipopolisacáridos, que estimulan respuestas inmunes generalizadas. Se cree que los aceites rodean a un antígeno soluble en agua, tal como un péptido, protegiéndolo por lo tanto de la degradación en el cuerpo y facilitando la fagocitosis y el paso a través de membranas celulares de células presentadoras de
antígeno.

Otra estrategia para estimular la inmunogenicidad de un péptido o proteína débilmente antigénica ha sido acoplar el antígeno débil a una proteína transportadora que se sabe que es un buen inmunógeno. Las proteínas transportadoras comunes incluyen hemocianina de lapa californiana, gamma-globulina aviar y albúmina sérica bovina. Como alternativa, la inmunogenicidad de un antígeno débil puede potenciarse polimerizándolo en grandes agregados por medio de agentes reticulantes, tales como glutaraldehído. Estos dos métodos se basan en la idea de que un antígeno débil acoplado a un antígeno fuerte potenciará la respuesta inmune generalizada. En un método similar, se pueden emplear resinas en fase sólida y métodos de péptidos sintéticos para sintetizar un péptido de manera repetida, para formar un complejo altamente ramificado. De nuevo, la base para esta estrategia es presentar el antígeno en un contexto muy poco habitual (y muy "no propio") al sistema inmune para estimular la producción de
anticuerpos.

En otra estrategia más, una proteína o péptido débilmente antigénico se une a una partícula sólida, tal como una perla de látex o resina. El propósito de esta estrategia es potenciar la fagocitosis del antígeno por los macrófagos. Adicionalmente, se han encapsulado péptidos y proteínas en liposomas para potenciar el paso a través de las membranas de células presentadoras de antígenos, potenciar la fagocitosis y estimular respuestas inmunes generalizadas debido a las características de "no propio" del vehículo de liposoma.

Las estrategias descritas anteriormente se han encontrado con grados variables de éxito en la estimulación de la inmunogenicidad de sustancias débilmente antigénicas o no antigénicas. Sin embargo, solamente proporcionan una estimulación generalizada de la inmunidad y no están diseñadas para dirigirse a poblaciones específicas de células del sistema inmune (tales como células presentadoras de antígeno). Un objetivo deseado al efectuar una intervención terapéutica en diversas patologías es proporcionar un medio para dirigir específicamente una proteína o péptido hacia una población de células presentadoras de antígenos y estimular de este modo esas células para internalizar el antígeno de interés y presentarlo al mismo sistema inmune en un contexto específico eficaz. En la medida en que se conoce, actualmente no está disponible un sistema de este tipo.

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Descripción resumida de la invención

La presente invención proporciona un adyuvante molecular para potenciar una respuesta inmune contra un inmunógeno y usos del mismo para suministrar antígenos específicos a células presentadoras de antígeno, y suministrar simultáneamente señales a esas células que producen una respuesta inmune deseada. En ocasiones, las composiciones se denominan en la presente memoria como "antígenos de activación dirigidos a APC".

De acuerdo con un aspecto de la invención, estos antígenos de activación dirigidos a APC, que provocan una respuesta inmune mediada por una célula presentadora de antígeno, comprenden al menos una porción antigénica unida funcionalmente a al menos una porción de dirección que se une específicamente a un determinante característico sobre la célula presentadora de antígeno, en el que dicho determinante característico es un receptor de C5a, receptor de IFN\gamma, CD21 (receptor de C3d) o CD23 (receptor de FCER11). Para los propósitos de la presente invención, la expresión "unido funcionalmente" se define generalmente como la unión de las porciones de manera que cada porción conserva su función deseada. Esto es particularmente importante con respecto a la porción de dirección, que está diseñada para unirse a un determinante característico sobre la célula presentadora de antígeno.

Las células presentadoras de antígeno que se contemplan para la dirección de acuerdo con la presente invención incluyen, pero se limitación a, monocitos, células dendríticas, macrófagos, células B y algunas células T. En realizaciones preferidas de la invención, el determinante característico en la APC seleccionada es un receptor de superficie celular y la porción de dirección del antígeno dirigido a APC es un ligando que se une al receptor. Se prefiere particularmente que el receptor de superficie celular sea un receptor inmunomodulador. Los receptores de superficie celular adecuados incluyen, pero se limitan a, receptor de C5a, receptor de IFN\gamma, receptor CD21 (C3d) y receptor CD23 (Fc\varepsilonRII).

Un antígeno dirigido a APC ilustrativo de la invención está diseñado para unirse al receptor de C5a y la porción de dirección es un ligando del receptor de C5a, que preferiblemente es un análogo peptídico de C5a que se corresponde con los 10 residuos C-terminales de C5a. Otra composición ilustrativa de la presente invención está diseñada para unirse al receptor de IFN\gamma y comprende una porción de dirección que es un ligando del receptor de IFN\gamma, preferiblemente un análogo peptídico de IFN\gamma que se corresponde con los 39 residuos N-terminales
de IFN\gamma.

La porción antigénica de los antígenos dirigidos a APC de la invención puede comprender esencialmente cualquier sustancia antigénica, incluyendo, pero no se limitan a, péptidos y proteínas, glicopéptidos y glicoproteínas, fosfopéptidos y fosfoproteínas, lipopéptidos y lipoproteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos y lípidos. Los antígenos dirigidos a APC pueden comprender más de una porción antigénica y, así mismo, pueden comprender más de una porción de dirección. Además, estas porciones pueden unirse funcionalmente de varias maneras. Por ejemplo, si "T" representa una porción de dirección y "Ag" representa una porción antigénica, los antígenos dirigidos a APC de la presente invención se pueden orientar del siguiente modo:

\quad

Ag - T;

\quad

T - Ag;

\quad

T_{1} - Ag - T_{2};

\quad

T_{1} - [Ag]_{n} - T_{2} (donde [Ag]_{n} representa una multiplicidad de antígenos)

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Los ejemplos de las fórmulas generales indicadas anteriormente incluyen:

\quad

Ag - péptido agonista de C5a;

\quad

péptido IFN\gamma - Ag;

\quad

péptido IFN\gamma - [Ag]_{n} - péptido agonista de C5a;

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De acuerdo con otros aspectos de la presente invención, los antígenos dirigidos a APC de la invención se usan en la fabricación de medicamentos para potenciar una respuesta inmune que incluye activar una célula presentadora de antígeno con un ligando de dirección y métodos para provocar una respuesta inmune mediada por células presentadoras de antígeno en un sujeto en el que se desea una respuesta de este tipo. Los medicamentos también pueden usarse en métodos generales de inmunización o vacunación de un paciente que requiere dicho tratamiento, métodos de tratamiento de un tumor y métodos para producir anticuerpos específicos para un antígeno predeterminado para el uso como herramientas de investigación o con propósitos de diagnóstico.

Las numerosas características y ventajas de las composiciones y usos de las mismas de la presente invención se describen más completamente en la descripción detallada que se expone a continuación.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un gráfico que ilustra la titulación de anticuerpos producidos en ratones inmunizados con las construcciones peptídicas indicadas, como se determina mediante radioinmunoensayo, y muestra la relación entre la cantidad de anticuerpo antirratón de cabra-I^{125} unido frente al factor de dilución de sueros de ratón que se han incubado en pocillos de microtitulación recubiertos con el péptido del epítopo de MUC1.

La figura 2 es un gráfico que ilustra el aumento de la titulación de anticuerpo en los sueros de ratones recogidos antes (pre) o después de la inmunización con los péptidos 3 (YKQGGFLGLYSFKPMPLaR) (SEC ID Nº: 2) y 4 (YSFKPMPLaRKQGGFLGL) (SEC ID Nº: 5), como se determina mediante radioinmunoensayo, y muestra la relación entre la cantidad de anticuerpo antirratón de cabra-I^{125} unido y el factor de dilución de sueros de ratón que se han incubado en pocillos de microtitulación recubiertos con péptido del epítopo de MUC1. Obsérvese que los péptidos 3 y 4 comprenden dos porciones, un ligando de dirección y un antígeno contra el que se desea una respuesta
inmune.

La figura 3 es un gráfico que ilustra las titulaciones de las clases y subclases de anticuerpos producidos en ratones después de la inmunización con el péptido 3 (YKQGGFLGLYSFKPMPLaR) (SEC ID Nº: 2), como se determina mediante ELISA usando IgA, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgM antirratón de conejo, seguido de anticonejo de cabra conjugado con peroxidasa y detectado usando la escisión del fosfato de p-nitrofenilo controlada a 405 nm.

La figura 4 es un gráfico que ilustra la especificidad de unión de las subclases de anticuerpos en sueros de ratones inmunizados con el péptido 3 (YKQGGFLGLYSFKPMPLaR) (SEC ID Nº: 2), como se determina mediante ELISA usando la unión a pocillos de microtitulación recubiertos con el epítopo del péptido MUC1 y la detección con IgG2a, IgG2b o IgM antirratón de conejo seguido de incubación con anticonejo de cabra conjugado con peroxidasa y detectado usando la escisión del fosfato de p-nitrofenilo controlada a 405 nm.

Descripción detallada de la invención

Un obstáculo principal en el desarrollo de vacunas y otros agentes inmunoestimulantes es la incapacidad de algunos antígenos para ser captados y procesados fácilmente por las células presentadoras de antígeno. La captación de antígenos por APC es una etapa esencial para estimular una respuesta inmune eficaz, ya que el sistema inmune sólo reconoce el antígeno después de que haya sido procesado por la APC y presentado en la superficie de la APC junto con el complejo principal de histocompatibilidad (MHC).

Se conoce que las APC, incluyendo células dendríticas, monocitos, macrófagos y células B, poseen receptores funcionales para numerosas moléculas que modulan la respuesta inmune. Ahora se ha descubierto, de acuerdo con la presente invención, que los ligandos que se unen a estos receptores pueden conjugarse con antígenos débilmente inmunogénicos, por ejemplo, como un modo de suministrar antígenos a la ruta de presentación de antígeno de la APC y activar simultáneamente la capacidad presentadora de antígeno de la APC. Por lo tanto, estos conjugados se unen a un receptor en la superficie de la APC, transducen una señal biológica y son internalizados por la APC. De este modo, la porción antigénica del conjugado se suministra a la ruta de presentación de antígeno de la APC junto con la activación simultánea de la APC.

Los conjugados descritos anteriormente se denominan en ocasiones en la presente memoria como "adyuvantes moleculares" o "antígenos de activación dirigidos a APC". Los antígenos de activación dirigidos a APC de la invención están diseñados para provocar respuestas inmunes mediadas por uno o más tipos de células presentadoras de antígenos. Por consiguiente, un antígeno de activación dirigido a APC comprende al menos una porción antigénica unida a una porción de dirección y activación, que se une específicamente a al menos un determinante característico en el tipo de célula presentadora de antígeno seleccionado. Esta unión es seguida por la internalización del antígeno dirigido a APC y da como resultado la presentación de la porción antigénica en la superficie de la APC. Para los propósitos de la presente invención, la expresión "porción antigénica" puede referirse a cualquier sustancia contra la que se desea producir una respuesta inmune. La porción antigénica seleccionada puede ser o no capaz de provocar una respuesta inmune mediante medios convencionales.

El término "determinante" se usa en la presente memoria en su sentido más amplio para indicar un elemento que identifica o determina la naturaleza de algo. Cuando se usa en referencia a una célula presentadora de antígeno, el "determinante" se refiere a ese sitio en la célula presentadora de antígeno que está implicado en la unión específica por la porción de ligando de dirección del adyuvante molecular de la invención.

La expresión "determinante característico", como se usa en la presente memoria, significa un epítopo (o grupos de epítopos) que sirve para identificar una población particular de células presentadoras de antígeno y diferenciarla de otras poblaciones de células presentadoras de antígeno. Los determinantes asociados a células incluyen, por ejemplo, componentes de la membrana celular, tales como proteínas unidas a membrana o glicoproteínas, incluyendo antígenos de superficie celular, antígenos de histocompatibilidad o receptores de membrana.

La expresión "unión específica", como se usa en la presente memoria, se refiere a la interacción entre la porción de ligando de dirección y un determinante característico sobre la población de células presentadoras de antígeno que se busca activar de acuerdo con esta invención, con la exclusión importante de determinantes presentes en otras células.

Se han sintetizado determinadas composiciones ilustrativas de la invención y se ha demostrado que provocan respuestas inmunes mediadas por APC, de acuerdo con los mecanismos descritos anteriormente. Por ejemplo, se han conjugado epítopos antigénicos con el extremo amino terminal de un agonista decapeptídico de C5a capaz de unirse a receptores de C5a presentes en la superficie de muchas APC. Los ratones a los que se inoculó un epítopo de la MUC1 humana (una mucina asociada a la superficie celular) conjugado con dicho agonista de C5a mostraron titulaciones de anticuerpos pronunciados contra el epítopo de MUC1, incluyendo titulaciones elevadas de anticuerpos específicos con los isotipos IgG2a e IgG2b. Los ratones a los que se inoculó (1) epítopo de MUC1 solo, (2) agonista de C5a solo, (3) epítopo de MUC1 sin conjugar junto con agonista de C5a o (4) agonista de C5a conjugado con epítopo de MUC1 de una manera en la que se bloqueaba la actividad biológica de la porción C5a, no expresaron una respuesta inmune específica significativa. Estos resultados se describen con más detalle en el Ejemplo 1. Se observaron resultados similares con conjugados de agonista de C5a con un polipéptido de 12 kDa, amiloide sérico A (SAA), como se describe con más detalle en el Ejemplo 2. Estos datos tienden a demostrar la viabilidad de la invención, que es usar ligandos de unión a receptor como un modo de suministrar antígenos a APC, con la activación simultánea de APC mediante la porción del ligando.

Como se describe con más detalle a continuación, el receptor de C5a sólo es uno de los muchos receptores expresados en APC. Esta invención incluye el uso de diversos ligandos con selectividad para otros receptores que median en acontecimientos de transducción de señal en las APC, para usarlos solos o junto con agonistas de C5a para influir en la naturaleza de la respuesta inmune generada, es decir, humoral, celular, Th1, Th2 y similares. Se pueden preparar vacunas y otros agentes inmunoterápicos con una serie de tales porciones de dirección, que sirven para dirigir la porción del antígeno hacia una población específica de APC y activar simultáneamente a estas y otras células implicadas en diversas vías inmunomoduladoras.

La descripción detallada a continuación expone realizaciones preferidas para producir y usar los antígenos dirigidos de la presente invención. Hasta el punto en que se mencionan compuestos y reactivos específicos, son con el propósito de ilustrar y no tienen por objeto limitar la invención. Cualquier técnica bioquímica, molecular o de ADN recombinante no descrita específicamente es realizada mediante métodos convencionales, como se explica de forma general, por ejemplo, en Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Inc., 1995.

I. Preparación de Antígenos de Activación Dirigidos a APC A. Selección de Componentes

Las células presentadoras de antígenos tienen diversos receptores en sus superficies para ligandos conocidos. La unión de ligandos a estos receptores da como resultado acontecimientos de transducción de señal que estimulan respuestas inmunes o de tolerancia. Se sabe que muchos de estos receptores se internalizan y reciclan en la célula. Se sospecha que otros hacen lo mismo. Como tales, estos receptores son dianas ideales para suministrar antígenos y señales de activación simultáneamente a APC.

Como se ha discutido anteriormente, las APC incluyen varios tipos celulares incluyendo macrófagos, monocitos, células dendríticas, células B, algunas células T y otros tipos celulares poco caracterizados. Se cree que estas clases diferentes de APC pueden producir diferentes tipos de respuestas inmunes. Por consiguiente, mediante la dirección de un receptor prevalente en una población específica de APC, puede favorecerse una respuesta inmune particular deseada. A continuación se expone una lista ilustrativa de receptores que se contemplan para la dirección en la presente invención, y la razón de su selección. Estos receptores de APC son particularmente apropiados para el uso en la presente invención en base a los siguientes criterios: son receptores expresados en APC; los receptores se internalizan después de la unión del ligando; los receptores pueden transmitir señales en las células que influyen en el procesamiento y la presentación de antígeno por estas células; se piensa que algunos de los receptores están implicados en la señalización de respuestas celulares de tipo Th1, mientras que se predice que otros generan respuestas humorales de tipo Th2. El receptor u otro determinante característico no necesita estar implicado directamente en la respuesta inmune.

Receptor de C5a. Se prefiere este receptor para el uso de acuerdo con la presente invención. Está presente en PMN, macrófagos, células dendríticas, células del músculo liso y algunos mastocitos. Se han atribuido varias actividades biológicas a C5a, la mayoría asociadas con respuestas inflamatorias e inmunes. De acuerdo con una realización preferida, esta invención se basa en la capacidad de C5a, como un ligando de dirección, para unirse específicamente a su receptor afín, de tal modo que se activen células presentadoras de antígeno, incluyendo macrófagos, monocitos y células dendríticas, a través de una vía de transducción de señales mediada por proteína G. Posteriormente a la transducción de señal, el complejo ligando/receptor se internaliza. En el caso de células dendríticas, se ha demostrado que C5a induce una respuesta de tipo Th1.

Receptor de IFN\gamma. El receptor de interferón \gamma se expresa en macrófagos, monocitos, células dendríticas, otras APC, algunas células B, fibroblastos, células epiteliales, endotelio y células de carcinoma de colon. La unión de IFN\gamma a su receptor induce la activación de macrófagos y células dendríticas, la diferenciación de células B y la expresión de moléculas de MHC de clase I y de clase II en muchos tipos celulares. El receptor está implicado en vías de transducción de señales. El IFN\gamma es producido en el cuerpo principalmente por células T activadas, particularmente durante la generación de la respuesta de tipo Th1. También es producido por linfocitos T citotóxicos CD8+ después del reconocimiento de antígeno asociado a MHC de clase I y por células asesinas naturales estimuladas con TNF\alpha y productos microbianos (Barclay et al., 1993).

CD 21 (receptor de C3d). El CD 21 es el receptor para el fragmento del complemento C3d. Es un receptor para el virus de Epstein-Barr y puede ser un receptor de interferón importante (Barclay et al., anteriormente). El CD 21 se expresa en células B, células dendríticas foliculares, otras APC, células epiteliales faríngeas y cervicales y algunos timocitos. Está implicado en la activación y proliferación de células B a través de un mecanismo de transducción de señales y se ha asociado con aumentos en las actividades de presentación de antígenos por esas células.

CD 23 (receptor de Fc\varepsilonRII). El CD 23 es un receptor de baja afinidad por IgE (no relacionado con el receptor de IgE de alta afinidad que se encuentra en basófilos y mastocitos). Se encuentra en algunas poblaciones de células B, macrófagos, eosinófilos, plaquetas y células dendríticas (Barclay et al., anteriormente). El CD 23 media en la citotoxicidad mediada por células dependiente de IgE y la fagocitosis por macrófagos y eosinófilos, y la unión de inmunocomplejos de IgE aumenta la eficacia del procesamiento y de la presentación de antígenos por algunas APC a través de un mecanismo de transducción de señal que incluye la tirosina quinasa p59 fyn. El ligando para CD 23 es el dominio C\varepsilon3 de IgE.

Como se ha mencionado anteriormente, los antígenos dirigidos a APC de la presente invención comprenden al menos una porción antigénica y al menos una porción de dirección. La porción de dirección puede proceder de ligandos de origen natural para un receptor seleccionado en una APC o de análogos y derivados de tales ligandos. Por ejemplo, el receptor de C5a es un receptor preferido para el uso en la práctica de la presente invención. El C5a de origen natural puede utilizarse como la porción de dirección en los antígenos de activación dirigidos a APC de la invención. Sin embargo, no se prefiere el C5a nativo para el uso como la porción de dirección ya que induce una miríada de respuestas proinflamatorias que pueden tener efectos secundarios indeseables. En realizaciones particularmente preferidas de la invención, se utilizan análogos de agonistas del C-terminal de C5a capaces de unirse al receptor de C5a y transducir la señal de una manera selectiva de respuesta. Tales análogos se describen con detalle en la patente US 5.696.230 del mismo solicitante.

Un agonista decapeptídico C-terminal de C5a ilustrativo, preferido para el uso en la presente invención es:

YSFKPMPLaR

(SEC ID Nº: 1)

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Este decapéptido es un potente agonista del C5a de origen natural y se prefiere frente al C5a de origen natural ya que su pequeño tamaño contribuye a facilitar la síntesis y la solubilidad. Además, estos péptidos conformacionalmente parciales son estables con respecto a la digestión por carboxipeptidasa del suero, expresan un nivel de selectividad biológica y se ha demostrado que no son tóxicos a concentraciones elevadas en ratones atímicos.

También se contemplan para el uso en la presente invención análogos peptídicos del interferón \gamma de origen natural. Se ha demostrado que los péptidos que se corresponden con los 39 aminoácidos amino terminales del IFN\gamma compiten por la unión con el IFN\gamma nativo. Los anticuerpos contra este dominio bloquean la actividad biológica y la eliminación de los primeros 10 residuos amino terminales suprime la actividad biológica. Esto sugiere que la unión del IFN\gamma a su receptor afín está mediada por esta porción de la molécula. Por consiguiente, los péptidos basados en este dominio se contemplan como útiles para suministrar antígenos a APC que expresen receptores de IFN\gamma. A este respecto, debe señalarse que los IFN\gamma humano y de ratón son absolutamente específicos de especie en la unión y en la actividad. Por consiguiente, para estimular respuestas inmunes mediadas por APC en ratones se utilizarán los péptidos de ratón y, así mismo, se utilizará el péptido humano para estimular respuestas inmunes mediadas por APC en seres humanos. El análogo peptídico de 39 aminoácidos del IFN\gamma de ratón está compuesto por la siguiente secuencia:

HGTVIESLESLNNYFNFFGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDG

(SEC ID Nº: 3)

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El análogo peptídico de 39 aminoácidos del IFN\gamma humano está compuesto por la siguiente secuencia:

QDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEE

(SEC ID Nº: 4)

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Otro ligando que se contempla para el uso en la presente invención es el componente C3dG del complemento. Este componente es un fragmento de 348 residuos procedente de la escisión proteolítica del precursor C3b (residuos 955-1303 de C3; entrada p01024 de Swissprot). El C3dG puede convertirse en C3d (residuos 1002-1303) y C3g (residuos 955-1001). El C3dG y el C3d permanecen asociados a superficies no activadoras y sirven como opsoninas para la fagocitosis por macrófagos y otras células presentadoras de antígeno. El Cd 21 es el receptor de C3dG y C3d.

Los ligandos enumerados anteriormente ilustran el tipo de ligando preferido para la práctica de la presente invención. Sin embargo, será entendido por los expertos en la materia que pueden utilizarse otros ligandos como la porción de dirección de los antígenos dirigidos a APC de la invención. Éstos incluyen ligandos que ya se conocen en el estado de la técnica, así como ligandos que pueden descubrirse y desarrollarse a partir de ahora. También pueden usarse anticuerpos o fragmentos de anticuerpos para dirigir antígenos de superficie celular específicos de APC.

El tipo de antígeno que puede seleccionarse como porción antigénica en la presente invención puede ser cualquier péptido, polipéptido o derivado de los mismos para el que se desee una respuesta inmune o producción de anticuerpos. Éstos incluyen, pero no se limitan a, péptidos, polipéptidos (es decir, proteínas) y derivados de los mismos, tales como glicopéptidos, fosfopéptidos y similares. En la presente invención pueden usarse péptidos sintéticos y derivados polipeptídicos o análogos, o cualquier otro compuesto similar que pueda conjugarse con una porción de dirección a receptor. Además, estos péptidos, proteínas y derivados pueden comprender epítopos únicos o múltiples epítopos para generar diferentes tipos de respuestas inmunes. De hecho, si se conjuga una proteína entera con una porción de dirección, es probable que esta proteína comprenda numerosos epítopos, que pueden variar dependiendo de las condiciones del disolvente y su efecto sobre la estructura secundaria y terciaria de la proteína. También pueden usarse carbohidratos, ácidos nucleicos y otras sustancias no proteicas como porción antigénica. Existen métodos disponibles en la técnica para conjugar estas sustancias con la porción de dirección a péptido o proteína.

En realizaciones preferidas de la invención, la porción antigénica comprende agentes que son débilmente antigénicos o no antigénicos en las condiciones de inmunización disponibles actualmente. Muchos antígenos asociados a tumor entran dentro de esta categoría, ya que los antígenos también son expresados por células normales. Por lo tanto, la tolerancia inmunológica a tales moléculas hace difícil estimular respuestas contra tales antígenos. Otras proteínas que entran dentro de esta categoría incluyen proteínas de origen natural de una especie (por ejemplo, humana) para las que sería deseable producir anticuerpos en otras especies pero que son recalcitrantes a la generación de anticuerpos en otras especies.

Un antígeno tumoral bien caracterizado es una mucina asociada a la superficie celular que se sobreexpresa mucho y se glicosila de forma diferencial por diferentes adenocarcinomas, incluyendo carcinomas de mama, páncreas, pulmón y próstata. La glicosilación aberrante de MUC1 por adenocarcinomas da como resultado la adición de algunos antígenos carbohidratos de grupo sanguíneo a esta proteína núcleo y la exposición de epítopos que han sido detectados mediante anticuerpos monoclonales sobre la proteína núcleo, que no están expuestos en formas de esta proteína producidas por células epiteliales normales. Una secuencia de ADNc de longitud completa de la mucina 1 (MUC1) humana mostró una proteína codificada con una longitud media de aproximadamente 1200 aminoácidos (dependiendo de la longitud de los alelos repetidos en tándem) con varios dominios obvios: un péptido señal amino terminal; un gran dominio compuesto por múltiples repeticiones en tándem idénticas de 20 aminoácidos flanqueadas por varias repeticiones que contienen secuencias degeneradas; un dominio de empalme hidrófobo de 31 aminoácidos; y un dominio citoplasmático de 69 aminoácidos en el extremo carboxilo terminal. Los epítopos asociados a tumor mejor caracterizados descritos hasta la fecha para MUC1 se encuentran en el dominio de repeticiones en tándem. Éstos incluyen estructuras de carbohidratos y estructuras proteicas. Los epítopos de MUC1 asociados a tumor están bien caracterizados y, por lo tanto, se han propuesto para usarse en la producción de vacunas tumorales usando métodos convencionales. Las composiciones ilustrativas de la presente invención comprenden epítopos de MUC1, tales como los que se indican a continuación, como la porción antigénica de los antígenos dirigidos a APC-1 de la invención, para demostrar el potencial de la presente invención como potentes vacunas tumorales.

El epítopo de MUC1 que se ha predicho que se une a moléculas de clase I del tipo H-2k^{b} presenta homología de secuencia con la región yuxtamembrana de MUC1;

YKQGGFLGL

(SEC ID Nº: 6)

\vskip1.000000\baselineskip

La repetición en tándem de MUC1 tiene la secuencia:

GVTSAPDTRRAPGSTAPPAH

(SEC ID Nº: 7)

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Los componentes que comprenden los antígenos dirigidos a APC de la invención se pueden generar por separado y conjugarse después. Por ejemplo, se puede producir un pequeño análogo peptídico, tal como los agonistas de C5a descritos anteriormente, por métodos de péptidos sintéticos y conjugarse con una proteína que se ha purificado de fuentes biológicas de origen natural. Como alternativa, pueden usarse proteínas modificadas por ingeniería genética para la expresión mediante métodos recombinantes. Adicionalmente, se pueden sintetizar en tándem antígenos dirigidos que comprenden componentes peptídicos (es decir, un epítopo antigénico peptídico conjugado con un ligando de receptor peptídico) mediante química sintética de péptidos, de acuerdo con métodos conocidos y como se describe con más detalle a continuación. Finalmente, los antígenos dirigidos de la invención, que comprenden dos porciones polipeptídicas más grandes (es decir, un gran antígeno polipeptídico unido a un gran ligando), se pueden generar mediante técnicas recombinantes. Por ejemplo, se pueden ligar entre sí moléculas de ADN que codifican ambos componentes por medios recombinantes, y después expresarse como la proteína de fusión conjugada. Se explican con más detalle a continuación métodos para generar estos tipos diferentes de composiciones.

B. Péptidos

Los oligopéptidos que se requieren para la presente invención pueden prepararse mediante diversos métodos sintéticos de síntesis de péptidos por condensación de uno o más residuos aminoacídicos, de acuerdo con los métodos convencionales de síntesis de péptidos. Preferiblemente, los péptidos se sintetizan de acuerdo con metodologías en fase sólida convencionales, tales como las que pueden realizarse en un sintetizador de péptidos Modelo 430 A de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Son bien conocidos por los expertos en la materia otros métodos para sintetizar péptidos o peptidomiméticos, ya sea mediante metodologías en fase sólida o en fase líquida. Cuando se utiliza la síntesis en fase sólida, el aminoácido C-terminal se une a un soporte de resina insoluble que puede producir un enlace escindible por reacción con un grupo carboxilo en un aminoácido C-terminal. Un soporte de resina insoluble preferido es resina de p-hidroximetilfenoximetil poliestireno (HMP). Otras resinas útiles incluyen, pero no se limitan a: resinas de fenilacetamidometilo (PAM) para la síntesis de algunos péptidos que contienen N-metilo (esta resina se usa con el método Boc de síntesis en fase sólida; y resinas de MBHA (p-metilbencidrilamina) para producir péptidos que tienen grupos amida C-terminales.

Durante el transcurso de la síntesis de péptidos, se pueden proteger o desproteger grupos amino y carboxilo de cadena ramificada según sea necesario, usando grupos protectores conocidos habitualmente. En una realización preferida, se protegen grupos N^{\alpha}-amino con el grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) inestable en medio básico o t-butiloxicarbonilo (grupos Boc). Los grupos funcionales de cadena lateral que concuerdan con la síntesis Fmoc pueden protegerse con los grupos protectores indicados del siguiente modo: arginina (2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo); asparagina (éster O-t-butílico); cisteína, glutamina e histidina (tritilo); lisina (t-butiloxicarbonilo); serina y tirosina (t-butilo). Será evidente para los expertos en la materia la modificación que utiliza grupos protectores alternativos para péptidos y derivados de péptidos.

C. Proteínas

Se pueden preparar proteínas de longitud completa para el uso en la presente invención de una diversidad de formas, de acuerdo con métodos conocidos. Las proteínas pueden purificarse a partir de fuentes apropiadas, por ejemplo, células o tejidos cultivados humanos o animales, mediante diversos métodos tales como filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, HPLC de fase inversa y purificación por inmunoafinidad, entre otros. Sin embargo, debido a la cantidad, a menudo limitada, de una proteína presente en una muestra en cualquier momento dado, no se prefieren técnicas de purificación convencionales en la presente invención.

La disponibilidad de moléculas de ácidos nucleicos que codifican una proteína permite la producción de la proteína usando métodos de expresión in vitro conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ADNc o gen puede clonarse en un vector de transcripción in vitro apropiado, tal como un pSP64 o pSP65 para la transcripción in vitro, seguido de una traducción libre de células en un sistema de traducción adecuado libre de células, tal como germen de trigo o reticulocitos de conejo. Los sistemas de transcripción y traducción in vitro están disponibles en el mercado, por ejemplo, en Promega Biotech, Madison, Wisconsin o BRL, Rockville, Maryland.

Como alternativa, de acuerdo con una realización preferida, un péptido o proteína seleccionada puede producirse por expresión en un sistema procariota o eucariota adecuado. Por ejemplo, puede insertarse una molécula de ADN, que codifica un componente peptídico o proteico de la invención, o un antígeno dirigido compuesto completo de la invención, en un vector plasmídico adaptado para la expresión en una célula bacteriana, tal como E. coli, o en un vector de baculovirus para la expresión en una célula de insecto. Tales vectores comprenden los elementos reguladores necesarios para la expresión del ADN en la célula hospedadora, colocados de tal modo que permiten la expresión del ADN en la célula hospedadora. Tales elementos reguladores necesarios para la expresión incluyen secuencias promotoras, secuencias de inicio de la transcripción y, opcionalmente, secuencias potenciadoras.

Un péptido o proteína producidos por expresión génica en un sistema procariota o eucariota recombinante puede purificarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. En una realización preferida, se puede usar un sistema de expresión/secreción disponible comercialmente, por el que la proteína recombinante se expresa y después se secreta desde la célula hospedadora, para purificarse fácilmente a partir del medio circundante. Si no se usan vectores de expresión/secreción, una estrategia alternativa implica purificar la proteína recombinante mediante separación por afinidad, tal como por interacción inmunológica con anticuerpos que se unen específicamente a la proteína recombinante. Tales métodos se usan comúnmente para aislar péptidos y proteínas.

D. Unión de Proteínas y/o Péptidos Generados de Forma Separada

En una realización alternativa, los componentes proteicos y/o peptídicos de la invención se sintetizan por separado, y después se conjugan usando métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, un péptido sintético puede acoplarse químicamente a una proteína usando un éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBF). Este reactivo reticula grupos tiol amino y carboxi terminales en el péptido con cadenas laterales de lisina presentes en la proteína. Como alternativa, un péptido sintético puede acoplarse a una proteína usando glutaraldehído, un agente reticulante común. Otro método para acoplar químicamente un péptido a una proteína es mediante el uso de carbodiimida y 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida metiodida (EDC). Como se describe con más detalle en el Ejemplo 2, este método se usó para conjugar un análogo decapeptídico C-terminal de C5a con amiloide sérico A (SAA). También están disponibles métodos para unir dos proteínas entre sí.

Los péptidos o proteínas de la invención, preparados mediante los métodos que se han mencionado anteriormente, pueden analizarse de acuerdo con procedimientos convencionales. Por ejemplo, pueden someterse a un análisis de la secuencia de aminoácidos, análisis de espectro de masas o análisis composicional de aminoácidos, de acuerdo con métodos conocidos.

E. Fórmulas Generales e Ilustrativas Composiciones de la Invención

Los antígenos dirigidos a APC de la invención pueden comprender uno o más porciones antigénicas y, así mismo, pueden comprender una o más porciones de dirección. Además, estas porciones se pueden unir funcionalmente de diversas maneras. Por ejemplo, si "T" representa una porción de dirección y "Ag" representa una porción antigénica, los antígenos dirigidos a APC de la presente invención se pueden organizar del siguiente modo:

\quad

Ag - T;

\quad

T - Ag;

\quad

T_{1} - Ag - T_{2};

\quad

T_{1} - [Ag]_{n} - T_{2} (donde [Ag]_{n} representa una multiplicidad de antígenos)

\vskip1.000000\baselineskip

Los ejemplos de las fórmulas generales expuestas anteriormente incluyen:

\quad

Ag - péptido agonista de C5a;

\quad

péptido IFN\gamma - Ag;

\quad

péptido IFN\gamma - [Ag]_{n} - péptido agonista de C5a;

\vskip1.000000\baselineskip

Otras composiciones representativas de la invención incluyen:

\quad

Epítopo de unión de MUC1 a Clase I - péptido C-terminal agonista de C5a

\quad

Péptido IFN\gamma murino o humano - epítopo de unión de MUC1 a Clase I

\quad

Péptido IFN\gamma murino o humano - repetición en tándem de MUC1

\quad

Epítopo de MUC1 de Clase I - péptido C3dG

\quad

SAA-K-Ahx - péptido C-terminal de C5a (Ahx = ácido \varepsilon amino hexanoico)

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Será entendido por los expertos en la materia que los antígenos de activación dirigidos a APC de la invención pueden adaptarse para la inclusión de antígenos grandes o complejos. Esto puede conseguirse, por ejemplo, por inclusión de un "espaciador" (tal como la porción espaciadora K-Ahx en el compuesto ilustrativo anterior) entre el antígeno y la porción de dirección. Tales modificaciones químicas son familiares para los bioquímicos.

II. Usos de Antígenos de Activación Dirigidos a APC

Los antígenos de activación dirigidos a APC de la presente invención tienen un amplio potencial para aplicaciones clínicas en seres humanos y animales. Como se ha discutido anteriormente, un impedimento significativo para el desarrollo de vacunas y otros agente inmunoterápicos es la aparente incapacidad de antígenos particulares de ser captados y procesados fácilmente por células presentadoras de antígeno. Las composiciones de la invención facilitan el suministro específico de un antígeno a una población de células presentadoras de antígenos, después de lo cual el mecanismo de suministro (por ejemplo, usando como porción de dirección un ligando de receptor capaz de transducir una señal biológica) activa simultáneamente la vía de presentación de antígeno de la APC. Por lo tanto, la presente invención permite el desarrollo de vacunas y otros inmunoterapéuticos que pueden dirigirse específicamente a cualquier antígeno peptídico u otra estructura antigénica unida covalentemente a un ligando para un receptor presente en una célula presentadora de antígeno. Se cree que los antígenos unidos a ligandos que se unen selectivamente a y activan una población particular de APC no sólo pueden generar una respuesta inmune, sino que pueden influir en la naturaleza de la respuesta inmune que se genera. Por lo tanto, pueden generarse selectivamente respuestas inmunes que favorezcan respuestas de anticuerpos, celulares, Th1 o Th2, respectivamente. También pueden desarrollarse vacunas con una serie de dichas porciones de dirección, sirviendo de este modo para dirigir un antígeno o antígenos seleccionados hacia varias poblaciones de APC y activar simultáneamente a estas y otras células implicadas en diversas vías inmunomoduladoras.

La capacidad para generar respuestas inmunes de anticuerpos o mediadas por células contra diferentes antígenos específicos tiene una amplia aplicabilidad general y se prevé que los antígenos dirigidos a APC de la invención serán extremadamente útiles para estos propósitos. Por ejemplo, se ha demostrado que las respuestas de anticuerpo son capaces de proteger contra diferentes infecciones víricas o bacterianas y se sabe que los anticuerpos inactivan diferentes toxinas o compuestos tóxicos que pueden afectar al bienestar de seres humanos o animales. Diferentes respuestas inmunes mediadas por células pueden proporcionar protección contra patógenos víricos u otros patógenos intracelulares y pueden jugar un papel en algunas respuestas antitumorales. Se cree que diferentes células presentadoras de antígenos y el contexto en el que se estimulan estas células para presentar antígenos (coestimulación mediada por diferentes interacciones ligando-receptor) son factores importantes que determinan la naturaleza de las respuestas anteriores.

Los antígenos dirigidos deberían encontrar una utilidad particular en el desarrollo de agentes inmunoterápicos específicos activos (es decir, "vacunas" contra el cáncer) basados en antígenos asociados a cáncer. Por ejemplo, se ha establecido la hipótesis de que la inducción de fuertes respuestas inmunes mediadas por células (que implican células Th1 y/o linfocitos T citotóxicos) proporcionaría la protección más eficaz contra diversas formas de cáncer. Puede diseñarse una estrategia de vacunación que utiliza los antígenos dirigidos a APC de la invención para inducir este tipo de respuesta. A este respecto, se sabe que la estimulación con algunas citoquinas (IL-12, IFN\gamma) puede inducir predominantemente respuestas de tipo Th1 frente a respuestas de tipo Th2 para determinados antígenos.

Como una etapa para el desarrollo de vacunas anticáncer para el uso clínico, las composiciones de la invención pueden aprovecharse como herramientas de investigación para explorar adicionalmente el efecto de la estimulación de una determinada población de APC con un antígeno tumoral y determinar el efecto sobre una respuesta inmune antitumoral. Con este propósito, debe señalarse que la presente solicitud ilustra antígenos dirigidos que comprenden un epítopo de un antígeno específico de tumor particular, Mucina-1.

Las formulaciones de vacunas tumorales previas que pretenden inmunizar a pacientes con compuestos que son idénticos a compuestos ya producidos por tumores han demostrado tener un valor limitado, probablemente debido a que los tumores que progresan se han seleccionado por su carencia de inmunogenicidad en su respectivo hospedador (por ejemplo, el hospedador es tolerante a antígenos tumorales existentes). Por lo tanto, un desafío importante de producir vacunas tumorales eficaces es generar reactivos que contrarresten la tolerancia inmunológica a antígenos asociados a tumores. Un propósito de los antígenos dirigidos a APC que se ha descrito anteriormente es inducir en el individuo inmunizado una respuesta contra su tumor que sea similar a la observada en individuos que experimentan el rechazo de un aloinjerto. En otras palabras, el objetivo es inducir una reacción autoinmune contra el tumor que sea capaz de destruir el tumor. No se comprenden bien los parámetros inmunológicos que regulan la tolerancia a antígenos tumorales; sin embargo, las composiciones que se describen en la presente memoria tienen el potencial de contrarrestar esta tolerancia y, por lo tanto, de inducir respuestas inmunes específicas que medien en el rechazo del tumor.

Los antígenos dirigidos también encontrarán una amplia utilidad en la producción de anticuerpos para el uso como agentes de inmunodiagnóstico e inmunoterapéuticos. Para propósitos de inmunodiagnóstico, se usan ampliamente anticuerpos en diversos ensayos cuantitativos y cualitativos para la detección y medición de moléculas biológicas asociadas a enfermedades u otros estados patológicos. Por razones que a menudo no se entienden bien, a veces es difícil generar anticuerpos contra determinadas moléculas biológicas usando medios convencionales. Las composiciones de la presente invención proporcionan un medio alternativo para inducir que un animal produzca anticuerpos contra sustancias débilmente antigénicas o no antigénicas. La utilidad de las composiciones de la invención a este respecto se muestra claramente en el Ejemplo 2, a continuación, junto con el amiloide sérico A. El aspecto y la abundancia de esta proteína en el cuerpo están fuertemente correlacionados con estrés inflamatorio sistémico, que es una afección que es muy difícil de cuantificar. Se cree que los ensayos cuantitativos para niveles de SAA serían un indicador excelente de inflamación sistémica generalizada; por lo tanto sería beneficioso generar anticuerpos contra la proteína en una especie no humana. Esta proteína ha demostrado ser particularmente reacia a la generación de anticuerpos usando medios convencionales. Como se describe en el Ejemplo 2, un antígeno dirigido que comprende SAA conjugado con un ligando de péptido C5a produjo una respuesta de anticuerpos significativa en ratones a los que se había inyectado la molécula conjugada. De un modo similar, los antígenos dirigidos que comprenden cualquier componente débilmente antigénico o no antigénico de interés podrían producirse y usarse para producir anticuerpos específicos en animales de laboratorio, para el uso como reactivos inmunodiagnóstico.

También pueden generarse anticuerpos para el uso como agentes inmunoterapéuticos usando las composiciones de la invención. Como ejemplo, recientemente ha habido mucho interés en el desarrollo de reactivos capaces de regular negativamente o inhibir la cascada del complemento para modular respuestas inflamatorias locales y sistémicas. Con este propósito, la convertasa de C3a, que se activa tempranamente en la cascada, podría proporcionar una diana ideal para la inhibición del complemento. La convertasa de C3a escinde el péptido C3 en dos componentes, C3a y C3b, y por lo tanto debe ser capaz de acceder al sitio de escisión en C3 para lograr el resultado. Se espera que los anticuerpos dirigidos hacia el sitio de escisión de C3a-C3b sean eficaces en el bloqueo del acceso de la convertasa de C3a al sito de escisión, inhibiendo de este modo esta etapa temprana en la cascada del complemento. Tales anticuerpos pueden generarse usando un antígeno dirigido de la invención que comprende, como porción antigénica, la secuencia peptídica corta que comprende el sitio de escisión C3a/C3b. Después, la secuencia podría conjugarse con una porción de dirección apropiada, tal como los agonistas decapeptídicos C-terminales de C5a ilustrados en la presente memoria. Por lo tanto, las composiciones serían útiles para generar un agente inmunoterapéutico (por ejemplo, un anticuerpo que bloquee la actividad de la convertasa de C3a) para tratar una afección inflamatoria adversa.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir la invención con más detalle. Estos ejemplos tienen por objeto ilustrar la invención con más detalle. No tienen por objeto limitar de ningún modo la invención.

Ejemplo 1 Evaluación de un Conjugado de Epítopo de Mucina (MUC1/agonista de CSa) para el Reclutamiento y la Activación de Células Presentadoras de Antígeno (APC) y la Estimulación de una Respuesta Inmune en Ratones

El receptor de C5a está presente en numerosas células presentadoras de antígeno, incluyendo monocitos, macrófagos, células dendríticas y otros tipos celulares. En este ejemplo, se evaluó un péptido compuesto que comprende un epítopo de mucina (MUC1) unido funcionalmente a un análogo agonista decapeptídico de C5a que se corresponde con la región efectora C-terminal del factor natural para determinar su capacidad para activar las APC estimulando de este modo una respuesta inmune en ratones. Esta evaluación se basa en la propiedad conocida de los receptores de C5a de internalizarse y reciclarse en la célula presentadora de antígeno, actuando de este modo como candidatos ideales para suministrar antígenos y activar simultáneamente señales en las APC. Ya que los receptores de C5a son particularmente comunes en macrófagos, monocitos y células dendríticas, se cree que el uso de un análogo agonista de C5a para unirse a receptores de C5a dará como resultado la activación preferente de estas APC.

i. Abreviaturas

Excepto cuando se señale, se usa la denominación de una sola letra para los residuos aminoacídicos: alanina es A; arginina es R; asparagina es N; ácido aspártico es D; cisteína es C; glutamina es Q; ácido glutámico es E; glicina es G; histidina es H; isoleucina es I; leucina es L; lisina es K; metionina es M; fenilalanina es F; prolina es P; serina es S; treonina es T; triptófano es W; tirosina es Y; y valina es V. Las letras mayúsculas representan el isómero L del aminoácido y las minúsculas el isómero D.

ii. Síntesis, Purificación y Caracterización de Péptidos

Se sintetizaron los siguientes péptidos de acuerdo con metodologías en fase sólida convencionales en un sintetizador de péptidos modelo 430 A de Applied Biosystems (Foster City, CA) y se caracterizaron como se ha descrito previamente (7):

(1)

El epítopo antigénico "yuxtamembrana" (JM) de la mucina 1 humana (MUC1), YKQGGFLGL (SEC ID Nº: 6);

(2)

El análogo agonista decapeptídico del extremo C-terminal de C5a, YSFKPMPLaR (SEC ID Nº: 1);

(3)

El péptido compuesto YKQGGFLGLYSFKPMPLaR (SEC ID Nº: 2); en el que el epítopo JM se coloca hacia el extremo amino terminal y el péptido C5a se coloca hacia el extremo carboxilo terminal; y

(4)

El péptido compuesto YSFKPMPLaRKQGGFLGL (SEC ID Nº: 5); en el que el epítopo JM de MUC1 se coloca hacia el extremo carboxilo terminal y el análogo de C5a se coloca hacia el extremo amino terminal.

\newpage

El péptido 3 conserva la actividad biológica de C5a, mientras que el péptido 4 no lo hace porque el extremo carboxilo terminal biológicamente importante del análogo de C5a está bloqueado por la presencia del epítopo de mucina. Como tal, el péptido 4 sirve como un control para determinar la importancia de la actividad biológica de C5a para la eficacia de estos péptidos para propósitos de inmunización.

Se realizaron síntesis en una escala de 0,25 mmol sobre resinas de O-hidroximetilfenoximetil poliestireno (HMP) (0,88 meq/g de sustitución). Se protegieron los grupos N^{\alpha}-amino con el grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) que es lábil en medio básico. Los grupos funcionales de la cadena lateral se protegieron del siguiente modo: Arg (Pmc o 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo); Asp (éster Ot-butílico); Cys, Gln e His (Trt o tritilo); Lys (Boc o t-butiloxicarbonilo); Ser y Tyr (t-butilo). La síntesis se inició mediante el acoplamiento in situ del residuo C-terminal (N^{\alpha}-Fmoc-L-Arg(Pmc)) a la resina de HMP en presencia de un exceso de N-N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 1-hidroxibenzotriazol (HOBT) con 4-dimetilaminopiridina (DMAP) como un catalizador del acoplamiento. La elongación de la cadena peptídica se consiguió por desprotección repetitiva de Fmoc en piperidina al 50% en NMP, seguida de acoplamiento del residuo en presencia de hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU).

La desprotección de la cadena lateral y la escisión de la resina se lograron en una reacción de acetolisis en una sola etapa, agitando la resina con péptido en una solución de ácido trifluoroacético al 84% (TFA), fenol al 6%, etanoditiol al 2%, tioanisol al 4% y agua al 4% durante 1,5 h a temperatura ambiente. Se precipitó el péptido libre a partir de esta solución por adición de éter dietílico frío. La mezcla se filtró a través de un embudo Buchner de vidrio sinterizado (porosidad media) y el péptido/resina se lavó dos veces con éter frío para eliminar el aceptor de tioles. El péptido se extrajo haciendo girar el péptido/resina en el embudo con alícuotas de 20-30 ml de ácido acético al 10%, seguido de filtración. Las alícuotas de extracción se combinaron, se congelaron y se liofilizaron para obtener la forma en polvo del péptido no procesado.

Los péptidos se purificaron por HPLC preparativa y analítica en fase inversa en columnas rellenas con sílice C_{18}. Los detalles de este procedimiento han sido descrito por (4). Todos los péptidos se caracterizaron por análisis composicional de aminoácidos y espectrometría de masas por bombardeo de átomos rápidos (FAB-MS).

iii. Modelos Animales

Las cepas de ratones usadas para este ejemplo eran hembras endogámicas de 6 a 12 semanas de edad C57B16 (H-2^{b}) y Balb/c (H-2^{d}) que se obtuvieron de Jackson labs (Bar Harbor, Maine). Estas dos razas, que difieren en los haplotipos H-2, se usaron en este ejemplo para demostrar que las respuestas de anticuerpos observadas no eran resultado de la selección o generación de un único epítopo inmunogénico característico de la secuencia de las proteínas de las moléculas de MHC de clase I y clase II, importantes para el procesamiento de antígenos en una raza u otra de ratón. El péptido MUC1 seleccionado para estos estudios contenía un motivo que se puede unir a la molécula H-2K^{b} del ratón C57B16; por lo tanto, también se estudió una raza de ratón que carecía de este motivo de unión a una molécula de clase I (Balb/c) para determinar la contribución relativa del motivo de unión a la clase I a las propiedades de presentación de antígenos de estos péptidos.

iv. Protocolo de inmunización

Se obtuvieron sueros preinmunes de ratones, que posteriormente se inmunizaron por vía intraperitoneal con 100 \mug del péptido indicado con adyuvante de RIBI (MPL+TDM+CWS) (Sigma Inmunochemicals). Los animales se estimularon dos veces a intervalos de dos semanas usando el mismo procedimiento de inyección. Los sueros se obtuvieron después de tres inmunizaciones (a las 6 semanas).

v. Análisis de las respuestas de anticuerpos séricos

Para el radioinmunoensayo (RIA), se determinaron los anticuerpos antipéptido antes y en diferentes momentos después de la inmunización, en placas de microtitulación de 96 pocillos (Dynatech Laboratories, Inc.). Las placas se recubrieron con 50 \mul de un péptido apropiado a 100 \mug/ml en solución fosfato salino (PBS) a pH 7,4 durante una noche a 4ºC. Los pocillos se bloquearon por incubación con leche en polvo al 5% en PBS a pH 7,4 durante al menos dos horas. Se determinaron las titulaciones de anticuerpos antipéptido usando diluciones seriadas de sueros. Los sueros se diluyeron con PBS pH 7,4 que contenía Tween-20 al 0,05% a (tampón de lavado) y se incubaron 50 \mul de cada dilución a 37ºC durante 1 hora. A continuación, se vaciaron los pocillos, se lavaron 4 veces con PBS-Tween y se añadieron 50 \mul de Ab antirratón de cabra-I^{125} (1-2 x 10^{4} cpm/pocillo) y se incubaron durante 1 h a 25ºC. Después del lavado, se registró la radiactividad específica en un contador gamma (1272 CliniGamma, LKB).

Se determinaron las titulciones de isotipos de anticuerpos antipéptido por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) realizado en placas de microtitulación de 96 pocillos. Las placas se recubrieron con 100 \mug/ml de péptido apropiado en PBS, pH 7,4, y se incubaron durante una noche. Los pocillos se bloquearon con leche en polvo al 5% en PBS a pH 7,4 durante al menos dos horas. Se determinaron las titulaciones de anticuerpos antipéptido usando diluciones seriadas de sueros como se ha descrito anteriormente. Después de que las placas se lavaran 4 veces, se añadieron 50 \mul de una dilución 1:100 de IgA, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgM antirratón de conejo (Zymed) a cada pocillo y se incubaron a 25ºC durante 1 hora. Las placas se lavaron 4 veces con tampón de lavado y se incubaron 50 \mul de anticonejo de cabra conjugado con peroxidasa (Zymed) 1:500 a 37ºC durante 1 hora. De nuevo, las placas se lavaron 4 veces con tampón de lavado y se detectó la enzima unida mediante la adición de 50 \mul de fosfato de p-nitrofenilo (Sigma) a 1 mg/ml en dietanolamina al 10% (Sigma) a pH 9,4. La reacción se detuvo mediante la adición de 50 \mul de hidróxido de sodio 0,5 M y se determinaron los valores de absorbancia (A_{405}) en un Titertek Multiskan (Flox Laboratories, Irvine, Escocia).

vi. Grupos Experimentales

Los grupos experimentales fueron los siguientes:

Grupo A, ratones inmunizados con péptido (1)

Grupo B, ratones inmunizados con péptido (2)

Grupo C, ratones inmunizados con péptido (1) más péptido (2)

Grupo D, ratones inmunizados con péptido (3)

Grupo E, ratones inmunizados con péptido (4).

Los resultados de los protocolos experimentales se exponen en las Figuras 1 y 2. Como puede observarse en las Figuras, los ratones de los Grupos A, B, C y E no produjeron un aumento apreciable en la respuesta de anticuerpos a la inoculación con epítopo de MUC1 (Grupo A), péptido agonista de C5a (Grupo B), epítopo MUC1 combinado con, pero no conjugado con, el péptido agonista de C5a (grupo C) o epítopo MUC1 conjugado con el péptido agonista de C5a en su extremo C-terminal, en vez de en su extremo N-terminal (bloqueando de este modo la actividad biológica de C5a) (Grupo E). Sólo los ratones a los que se había inoculado con el conjugado de epítopo de MUC1/péptido agonista de C5a de la presente invención (Grupo D) generaron una respuesta de anticuerpos apreciable. Además, esta estimulación fue significativa. Es evidente a partir de estos resultados que la inoculación con el conjugado de epítopo de MUC1/péptido agonista de C5a era mucho más eficaz en la estimulación de una respuesta inmune general (es decir, producción de anticuerpos) que la inoculación con péptido solo, o ambos péptidos juntos, pero no conjugados, o péptidos conjugados en la orientación opuesta.

Hay varias conclusiones significativas que pueden extraerse basándose en estos resultados. El hecho de que tanto los ratones Balb/c como C57B16 mostraran respuestas de anticuerpos contra el péptido 3 sugiere que el efecto de presentación de antígenos no está restringido por el haplotipo de MHC. El hecho de que no se produjeran respuestas inmunes contra el péptido 4, o contra mezclas de péptido 1 y 2, pero se produjeran respuestas sustanciales contra el péptido 3, sugiere que el efecto está mediado por la porción C5a del péptido y que la respuesta inmune es el resultado del suministro simultáneo de péptido antigénico y de señales de activación mediadas por C5a para células presentadoras de antígenos.

Se determinaron los isotipos de los anticuerpos antipéptido producidos en los ratones inmunizados (Figura\cdot3) y se observó que consistían en IgM, IgG2a e IgG2b. Esto sugiere que el péptido inmunogénico está produciendo respuestas dependientes de células T, que generalmente requieren el procesamiento y la presentación del antígeno. Los datos que se presentan en la Figura 4 muestran que la respuesta de anticuerpos contra el péptido 3 incluye un alto porcentaje de anticuerpos que son específicos para el epítopo de MUC1, que era la porción antigénica de estos estudios.

Ejemplo 2 Evaluación de Conjugados Amiloide Sérico A/Péptido C5a para el Reclutamiento y la Activación de APC y la Estimulación de la Respuesta Inmune en Ratas

El amiloide sérico A es una proteína de respuesta al estrés de fase aguda generada por el hígado. Junto con otras proteínas de fase aguda, el SAA se secreta en respuesta a un estrés inflamatorio sistémico como una medida protectora. El SAA es de interés ya que parece ser un excelente indicador de una inflamación sistémica generalizada, que es un fenómeno muy difícil de cuantificar. Ya que se ha observado que los niveles séricos de SAA son paralelos al aumento y descenso de la respuesta inflamatoria sistémica, la cuantificación de los niveles séricos de este péptido proporcionaría un medio eficaz de evaluar la inflamación. Un modo para conseguir esto es desarrollar anticuerpos contra SAA que se podrían usar para la cuantificación, tal como en un ensayo de ELISA. Sin embargo, el SAA ha sido particularmente reacio a la generación de anticuerpos contra el mismo. En este ejemplo, se realizó una evaluación de la capacidad de SAA conjugado con un análogo C-terminal de C5a (como se describe en el Ejemplo 1) para activar células productoras de antígenos y producir una respuesta de anticuerpos en ratas.

i. Producción y preparación de proteínas y péptidos

El análogo C-terminal de C5a K-Ahx-YSFKPMPLaR (SEC ID Nº: 8) (AhX es ácido aminohexanoico, que es una porción espaciadora alifático lineal) se produjo como se ha descrito en el Ejemplo 1. La porción espaciadora alifática se incluyó para separar el análogo de C5a de unión a receptor crítico de la proteína voluminosa que se iba a añadir en el extremo amino terminal.

Se conjugó amiloide sérico A con los análogos peptídicos de C5a de acuerdo con el siguiente método. Se hizo reaccionar SAA (100 \mug) con un exceso molar de 50 veces de una carbodiimida soluble en agua, 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida metiodiida (EDC), en 200 \mul de tampón fosfato salino, pH 7,5, a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadieron a esta solución un exceso molar de 50 veces del péptido (K-Ahx-YSFKPMPLaR) (SEC ID Nº: 8) y un exceso molar de 100 veces de una diisopropiletilamina básica (DIEA). Se añadió agua a la solución para llevar la mezcla de reacción a un volumen de 400 \mul. Esta solución se agitó durante una noche a temperatura ambiente y después se liofilizó hasta un polvo seco. El polvo se diluyó hasta el volumen apropiado con agua para generar la mezcla madre usada para inocular a los animales.

ii. Protocolos experimentales

Se inyectó por vía intraperitoneal a las ratas un inóculo que comprende los conjugados SAA/péptido C5a en solución salina tamponada con fosfato con o sin adyuvante de RIBI. Se administraron inyecciones de refuerzo dos y cinco semanas después de las inyecciones iniciales. Las ratas se sacrificaron siete semanas después de la inyección inicial y se evaluó la producción de anticuerpo antimucina a partir de las titulaciones séricas, como se describe en el Ejemplo 1.

Se produjo anticuerpo anti-SAA significativo por ambos grupos de ratas, se hubiera incluido o no adyuvante de RIBI en la inoculación. Como se visualiza por electroforesis en gel y autorradiografía del anticuerpo anti-SAA eluido a partir de los ensayos en placa, parece que las titulaciones de anticuerpos anti-SAA eran esencialmente equivalentes, o ligeramente mayores, en ratas a las que se había inoculado conjugado de SAA/péptido C5a en ausencia de adyuvante de RIBI, en comparación con la misma inoculación sin el adyuvante. Por lo tanto, los conjugados antigénicos que comprenden el análogo peptídico de C5a son útiles para generar anticuerpos contra proteínas grandes, así como contra fragmentos peptídicos más pequeños, tales como los descritos en el Ejemplo 1. Además, la generación con éxito de anticuerpos anti-SAA utilizando este método es particularmente prometedora para los propósitos de producción de anticuerpos contra péptidos o proteínas débilmente antigénicos o no antigénicos.

Ejemplo 3 Producción y caracterización de anticuerpos neutralizantes dirigidos específicos contra un péptido \kappaR(33-52) de la región amino terminal prevista para el receptor kappa humano

Se han descrito receptores para hormonas peptídicas opioides humanas en numerosos tipos celulares. Los receptores para ligandos \mu, \kappa y \delta se han clonado recientemente a partir de bibliotecas genómicas y de ADNc obtenidas de tejidos normales y líneas celulares. Existe una homología considerable entre los receptores \mu, \kappa y \delta, excepto para las regiones N-terminales de los receptores. La región N-terminal del receptor kappa humano (residuos aminoacídicos 1-100) es relativamente hidrófila y se predice que estaría expuesta en la superficie de la membrana celular. Se seleccionó un péptido de 20 residuos [\kappaR(33-52)] y se usó para generar un anticuerpo policlonal específico dirigido contra el péptido (5).

A continuación se expone el método de producción de un antisuero policlonal en conejos usando el adyuvante molecular, péptido agonista de C5a conjugado con el epítopo de \kappaR. También se describe a continuación la especificidad de unión y las actividades biológicas del antisuero policlonal resultante generado contra la región extracelular prevista para el receptor humano kappa (\kappaR).

i. Construcción de un inmunógeno dirigido

Se sintetizó una construcción peptídica que consiste en el \kappaR(33-52) (FPGWAEPDSNGSAGSEDAQL) (SEC ID Nº: 9) unido covalentemente al extremo N-terminal de un péptido análogo agonista del fragmento del complemento C5a conformacionalmente parcial (YSFKPMPLaR) (SEC ID Nº: 1), de acuerdo con los métodos en el Ejemplo 1 y como se ha descrito anteriormente (7).

ii. Preparación de antisuero anti-\kappaR(33-52) y ELISA específico de péptido

Se inmunizaron conejos por vía subcutánea con 500 \mug de la construcción FPGWAEPDSNGSAGSEDAQLYSFKP
MLaR (SEC ID Nº: 10) en adyuvante completo de Freund (GIBCO, Grand Island, NY) el día 0, seguido de inyecciones de refuerzo los días 30 y 60 en adyuvante incompleto de Freund. Se recogió el suero comenzando 75 días después de la inmunización inicial.

La presencia de anticuerpo antipéptido se determinó usando un ELISA específico de péptido, utilizando el péptido \kappaR(33-52) libre, como se ha descrito previamente (8). Se purificaron anti-\kappaR(33-52) y \gamma-globulina de conejo normal (RGG) mediante cromatografía en proteína A-Sepharose (Sigma) (8) antes del uso.

iii. Células y condiciones de cultivo

Se cultivaron células de neuroblastoma SK-N-SH (HTB 11), células ductales de carcinoma de mama T47D (HTB 133), células T de Jurkat de leucemia (TIB 152), linfoma histolítico U937 (CRL 1593), monocitos humanos THP 1 (TIB 202), células B transformadas con EBV SKW 6.4 (TIB 215) y CESS (TIB 190) (Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, MD) en DMEM o RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino al 10%, HEPES 25 mM, L-glutamina 1 mM, piruvato de Na 2 mM, penicilina 50 U y estreptomicina 50 \mug/ml. Las células precursoras neuronales humanas NT2 (Stratagene, La Jolla, CA) se cultivaron en Opti-MEM (Gibco) suplementado como anteriormente. Todos los cultivos se incubaron a 37ºC en una cámara humidificada con CO_{2} al 7,5%.

Se obtuvieron células mononucleares derivadas de sangre periférica de voluntarios sanos masculinos y femeninos, se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad en Ficoll-Hypaque(tm) y se enriquecieron para macrófagos por adherencia al plástico.

iv. Citometría de flujo

Se preincubaron análisis por citometría de flujo de un solo color de células (1 X 10^{6}) en PBS que contenían suero fetal bovino al 1% y azida sódica al 0,1% (tampón de tinción) 30 minutos a 4ºC en presencia de suero humano normal al 20%. Las células se lavaron y se incubaron con anti-\kappaR(33-52) o RGG durante 30 minutos a 4ºC, se lavaron y se marcaron con fragmentos (Fab')2 de IgG anticonejo de burro conjugados con PI (Zymed, S. San Francisco, CA) durante 30 minutos a 4ºC (8). Para el análisis de doble color también se incluyeron anti-CD3 o anti-CD14 conjugados con FITC (Pharmingen, San Diego, CA) en la segunda etapa. Las células (1 X 10^{4}) se analizaron en un FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA) y los datos se analizaron con el programa informático Cell Quest, como se ha descrito previamente (8).

v. Medición de la proliferación celular

El día 2 de cultivo las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se sometieron a un pulso con timidina- H^{3} y 18 horas después las células se recogieron sobre filtros de fibra de vidrio y se procesaron para el recuento por centelleo. Los experimentos se realizaron tres veces y cada muestra se preparó por triplicado.

vi. Medición de la secreción de IgG

Se determinaron los niveles relativos de IgG en sobrenadantes de cultivo mediante ELISA indirecto, como se ha descrito previamente (9). Los sobrenadantes de los cultivos de PBMC se recogieron después de 10 días y se analizaron para determinar la presencia de IgG. Los números representan el CPM medio +/- SD de muestras por triplicado. Los experimentos se realizaron al menos tres veces.

vii. Caracterización de antisuero antipéptido \kappaR

Se ensayaron sueros de conejos inmunizados con la construcción \kappaR(33-52) YSFPMPLaR (SEC ID Nº: 10) y suero normal de conejo para determinar la capacidad de reconocer el \kappaR(33-52) unido a la placa (SEC ID Nº: 9) en ELISA. Los resultados muestran que el suero de conejos inmunizados con la construcción \kappaR(33-52) YSFPMPLaR (SEC ID Nº: 10) se unía al péptido \kappaR(33-52) libre (SEC ID Nº: 9) de manera dependiente de la dosis. La titulación fue de aproximadamente 10^{5}. Por el contrario, el suero de conejos no inmunizados no se uniría a este péptido. Las muestras de suero de conejos inmunizados y no inmunizados se sometieron a una cromatografía de proteína A-Sepharose y los eluidos de la columna se evaluaron para determinar la presencia del anticuerpo específico contra \kappaR(33-52) (SEC ID Nº: 9). Los resultados indican que el anticuerpo purificado por proteína A obtenido de conejos inmunizados con la construcción \kappaR(33-52)YSFPMPLaR (SEC ID Nº: 10) que se une a \kappaR(33-52) libre (SEC ID Nº: 9) era detectable a concentraciones de anticuerpo inferiores a 0,1 ng/ml. Por el contrario, la RGG no se unió al péptido libre. Los resultados de múltiples extracciones de sangre indicaron que la titulación de ED_{50} variaba entre 1-10 ng/ml. Estos resultados indican que los conejos inmunizados con \kappaR(33-52)YSFPMPLaR (SEC ID Nº: 10) contenían una titulación elevada de anticuerpo específico contra el péptido \kappaR(33-52).

viii. Unión de anticuerpo anti-R (33-52) a células que expresan \kappaR humano

Para determinar si los anticuerpos policlonales anti-\kappaR(33-52) se unían a células que expresaban el \kappaR, se ensayaron en primer lugar una diversidad de líneas celulares mononucleares y células mononucleares humanas normales para determinar la presencia del ARNm específico del receptor \kappa por RT-PCR. Las muestras de ARN aisladas a partir de líneas celulares neuronales NT2, U937, Jurkat, T47D, PBMC humanas normales y macrófagos humanos enriquecidos se sometieron a un análisis de RT-PCR con cebadores directo 5' y antisentido 3' específicos para la región 3' del \kappaR clonado y de B-actina. Todas las líneas celulares o fracciones celulares, excepto la línea celular T47D, fueron positivos para el producto de PCR específico del receptor \kappa, como se esperaba en base a las secuencias de cebadores usadas (5).

Se realizaron experimentos para determinar si el anti-\kappaR(33-52) se unía a células que expresan ARNm específico de \kappaR. Los resultados del análisis de citometría de flujo de un solo color para varias líneas celulares se muestran en la Tabla 2. Se realizaron mediciones citométricas de flujo con líneas celulares humanas representativas de macrófagos (U937), linfocitos T (Jurkat) y linfocitos B (SKW 6.4 y CESS). Los resultados indican que el anti-\kappaR(33-52) se unía a los tres tipos celulares. El anti-\kappaR(33-52) se unía a las células U937 en mayor medida (MFI = 231) en comparación con la RGG normal (MFI=38). Como se usa en la presente memoria, MFI se refiere a intensidad de fluorescencia media. La comparación de la unión de anti-\kappaR(33-52) y RGG a la línea Jurkat indicó un cambio de aproximadamente 3 veces en la MFI (MFI = 18 frente a MFI = 6). Se obtuvieron resultados similares con las dos líneas celulares similares a linfocitos B (SKW 6.4 y CESS). La comparación de la unión de anti-\kappaR(33-52) y RGG a la línea SKW 6.4 indicó un cambio de aproximadamente 3 veces en la MFI (MFI = 19 frente a MFI = 6). La línea celular neuronal también se unió específicamente al anti-\kappaR(33-52), como se indica por un cambio de aproximadamente 3 veces en la MFI con respecto a la RGG. Finalmente, basándose en la ausencia de expresión de ARNm específico de \kappaR de la línea celular de carcinoma de mama humano (T47D), esta línea celular se evaluó para determinar su capacidad para unirse a anti-\kappaR(33-52) mediante análisis citométrico de flujo. La ausencia de una expresión de \kappaR en células T47D se confirmó por el hecho de que el anti-\kappaR(33-52) y la RGG se unían a estas células de una manera prácticamente idéntica. Como un control positivo, se evaluó el anti-\kappaR(33-52) y la RGG para determinar su capacidad para unirse a una línea celular similar a macrófagos humanos adicional (THP 1). La comparación de la unión de anti-\kappaR(33-52) y RGG a esta línea celular dio como resultado un cambio significativo en la MFI (MFI = 190 frente a MFI = 8). Estos resultados confirman la especificidad del anti-\kappaR(33-52) para el \kappaR humano.

TABLA 1 Unión al tipo celular seleccionado de los anticuerpos anti-\kappaR(33-52) producidos en conejos inmunizados con péptido agonista de C5a conjugado con la secuencia de \kappaR(33-52), cuando se evaluó mediante análisis de citometría de flujo de color de un solo canal

1

El análisis de PBMC humanos intactas indicó que estas células expresan ARNm para un R "similar a \kappa" (5). Se utilizó el análisis citométrico de flujo de doble color para evaluar la unión de anti-\kappaR(33-52) a macrófagos humanos normales (CD14+) y linfocitos T (CD3+). Se observó que tanto los macrófagos como los linfocitos T se unían al anticuerpo anti-\kappaR(33-52). El anti-\kappaR(33-52) y la RGG se evaluaron para determinar su unión a PBMC CD14+. Los resultados indican que el anti-\kappaR(33-52) se unía a células CD14+ con un aumento de 15 veces en comparación con la RGG normal (MFI = 320 frente a MFI = 21). También se observó que el anti-\kappaR(33-52) se unía a células CD3+ (MFI = 19 frente a RGG MFI = 3) aunque menos que a las células CD14+. Esos resultados indican que el anti-\kappaR(33-52) se une a células mononucleares obtenidas de PBMC normales, así como a líneas celulares mononucleares que expresan ARNm específico de \kappaR.

ix. Neutralización de la supresión mediada por U50,488H de la proliferación de linfocitos por el anticuerpo anti-\kappaR(33-52) in vitro

Los resultados de estudios publicados han demostrado que la regulación inducida por péptido opioide de respuestas inmunes in vitro puede producirse mediante interacciones receptor-ligando específicas. Más específicamente, se ha demostrado que el agonista selectivo de \kappaR U50,488H es capaz de suprimir la proliferación de linfocitos inducida por SAC mediante cultivos de PBMC humanos (6). También se ha demostrado que la inhibición de la activación de linfocitos por U50,488H se revierte por el antagonista selectivo de \kappaR nor-BNI. Para determinar si anti-\kappaR(33-52) era capaz de actuar como un antagonista selectivo de \kappaR y neutralizar la supresión mediada por U50,488H, se preincubaron cultivos de PBMC con diversas concentraciones de anti-\kappaR(32-52) purificado por proteína A antes de la adición de SAC y U50,488H. U50,488H suprime la proliferación de linfocitos inducida por SAC de una manera dependiente de la dosis (5). Se obtuvo una supresión máxima cuando se usó U50,488H a una concentración de 10^{-6}M. Se preincubaron cultivos de PBMC con diversas concentraciones de anti-\kappaR(33-52) (1-50 \mug/ml) seguido de la adición de U50,488H más SAC y se midió la proliferación el día 3 de cultivo. Se observó que el anti-\kappaR(33-52) neutralizaba la supresión mediada por U50,488H de la proliferación de linfocitos inducida por SAC de una manera dependiente de la dosis. Por el contrario, concentraciones idénticas de RGG normal no inhibieron la inmunosupresión mediada por agonista selectivo de \kappaR.

Ya que se ha demostrado que SAC induce la proliferación de linfocitos tanto T como B, se realizaron experimentos similares con el mitógeno de células T PHA. El anti-\kappaR(33-52) también era capaz de neutralizar la capacidad de U50,488H para suprimir la proliferación de células T inducida por mitógeno. El U50,488H (10^{-6} M) suprimió la proliferación de células T inducida por PHA en el 85%. Esta supresión se revirtió preincubando las células con anti-\kappaR(33-52). La preincubación de PBMC con RGG normal no bloqueó la supresión mediada por U50,488H de la proliferación de células T.

El anti-\kappaR(33-52) no parece modular directamente la proliferación de linfocitos. El cocultivo de PBMC con anti-\kappaR(33-52) en ausencia de mitógeno no estimuló las células por encima de los medios control. Además, la combinación de anti-\kappaR(33-52) y PHA o SAC no dio como resultado un incremento en la proliferación celular en comparación con cultivos de PBMC que recibieron sólo mitógeno.

x. Neutralización de la supresión mediada por U50,488N de la síntesis de IgG por anticuerpo anti-\kappaR(33-52) in vitro

Además de la proliferación de linfocitos, el U50,488H es un potente inhibidor de la síntesis de IgG inducida por SAC en cultivos de PBMC humanos (6). Para determinar si el anti-\kappaR(33-52) era capaz de neutralizar la supresión de la síntesis de IgG, se preincubaron PBMC con anti-\kappaR(33-52) seguido de la adición de U50,488H y SAC y los niveles de IgG se midieron el día 10. Los resultados indican que U50,488H a 10^{-8} M y 10^{-7} M inhibió la síntesis de IgG en el 67% y 85%, respectivamente (5). Se observó que la inclusión de anti-\kappaR(33-52) en cultivo neutralizaba la supresión de la síntesis de IgG inducida por SAC de una forma dependiente de la dosis. Por el contrario, concentraciones similares de RGG normal no neutralizaron la supresión observada.

Para evaluar la especificidad de anticuerpo anti-\kappaR(33-52) se incubaron PBMC con anticuerpo específico o RGG seguido de cocultivo con U50,488H o el agonista selectivo de receptor \mu (DAGO) y la producción de IgG se midió por ELISA. Los resultados indican que, mientras que el anti-\kappaR(33-52) neutralizó la inhibición mediada por U50,488H de la síntesis de IgG inducida por SAC, el anti-\kappaR(33-52) fue incapaz de neutralizar la supresión mediada por DAGO de la síntesis de IgG.

Estos resultados indican que además de unirse a linfocitos y macrófagos, el anti-\kappaR(33-52) es capaz de neutralizar la capacidad de un agonista selectivo de \kappaR (U50,488H), pero no un agonista selectivo de \muR (DAGO). Adicionalmente, el anticuerpo demostró una inhibición significativa tanto de la proliferación como de la diferenciación de linfocitos para la síntesis de anticuerpos. Estos resultados demuestran además la especificidad de anti-\kappaR(33-52) por el receptor kappa humano.

Como se puede observar a partir de los datos de unión a anticuerpo que se han presentado anteriormente, los anticuerpos policlonales dirigidos a sitio generados en conejos usando la forma agonista de C5a del adyuvante molecular conjugada con la secuencia del receptor \kappa fueron capaces de unirse a células humanas normales y líneas celulares que expresaban ARNm específico para el receptor \kappa humano. El análisis por citometría de flujo de una línea celular neuronal (NT2), monocitos CD14+ obtenidos de sangre normal, líneas celulares similares a monocitos (U937 y THP1), células T CD3+ obtenidas de sangre normal y una línea de células T (Jurkat) y líneas de células B humanas (SKW 6.4 y CESS) mostraron que todas las células se unían al anti-\kappaR(33-52) de una manera específica. El anti-\kappaR(33-52) no se unía a una línea celular que se haya determinado que no expresa ARNm para el receptor \kappa humano.

Se observó que el anti-\kappaR(33-52) neutraliza específicamente la inhibición de la activación de linfocitos mediada por el agonista selectivo de \kappaR (U50, 488H). Se observó que el antisuero neutraliza, de una forma dependiente de la dosis, la inhibición mediada por U50,488H de: 1) la proliferación de linfocitos inducida por SAC; 2) la proliferación de linfocitos inducida por PHA y; 3) la síntesis de IgG inducida por SAC. Por el contrario, la supresión mediada por DAGO de la producción de IgG inducida por SAC no se vio afectada por anti-\kappaR(33-52). Estos resultados sugieren que este antisuero policlonal dirigido a sitio interacciona específicamente con el \kappaR humano en PBMC. Los resultados presentados indican que los anticuerpos anti-\kappaR(33-52) policlonales interaccionan con la región N-terminal expuesta del \kappaR. Mientras que este antisuero bloqueó eficazmente la activación de linfocitos mediada por U50,488H, no activó a macrófagos ni linfocitos.

Aunque se han ilustrado anteriormente anticuerpos antirreceptor opioide \kappa, la conjugación de péptido agonista de C5a con péptidos correspondientes a péptidos específicos de \mu y \Delta ha dado como resultado la generación con éxito de anticuerpos específicos para los epítopos \mu y \Delta.

Ejemplo 4 Comparación de la inmunogenicidad de construcciones de epítopo-agonista de C5a con conjugados de epítopo-KLH

Se realizó el siguiente experimento para comparar la potencia del adyuvante molecular de la presente invención con un método ampliamente usado para potenciar la respuesta inmune contra epítopos peptídicos. El objetivo era una comparación directa de la respuesta contra una construcción de epítopo de MUC1-agonista de C5a y el mismo epítopo conjugado con hemocianina de lapa californiana (KLH) en ratones. Los resultados se resumen en la Tabla 2.

TABLA 2 Títulaciones de isotipo de Ab específico para MUC1 producidos con diferentes inmunógenos. Isotipos de Ab y titulaciones^{a}

2

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Se realizó un experimento similar en conejos. Los inmunógenos usados en conejos fueron los epítopos de los receptores opioides \kappa y \mu, FPGWAEPDSNGSAGSEDAQL (SEC ID Nº: 9) y GDLSDPCGNRTNLGGRDSL (SEC ID Nº: 11), respectivamente. Se comparó la titulación de anticuerpos séricos y los subtipos de anticuerpos producidos en conejos a los que se inyectaron las dos composiciones que contienen los diferentes inmunógenos.

i. Conjugados de péptidos

En un caso, los epítopos se conjugaron con KLH por un residuo de lisina añadido sintéticamente al extremo N-terminal del epítopo junto con un residuo de alanina que actuaba como un espaciador. En este experimento se usó glutaraldehído para realizar la conjugación. En el otro caso, los epítopos se unieron al extremo N-terminal del agonista de C5a YSFKPMPLaR (SEC ID Nº:1) usando las metodologías de síntesis de péptidos en fase sólida que se han descrito anteriormente en el ejemplo 1.

ii. Protocolo de inmunización para conejos

Se inmunizaron conejos por vía subcutánea con 500 \mug de las construcciones de epítopo-KLH o de epítopo-YSFKPMPLaR (epítopo-SEC ID Nº:1) en adyuvante completo de Freund (GIBCO, Grand Island, NY). Se administraron inyecciones de refuerzo los días 30 y 60 en adyuvante incompleto de Freund. Se recogió el suero comenzando el día 60 después de la inmunización.

iii. Determinación de anticuerpos

Se determinó la presencia de IgG de conejo específica contra los epítopos peptídicos por ELISA, como se ha descrito anteriormente (8).

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Los conejos inmunizados con el epítopo-agonista de C5a generaron elevadas titulaciones de Ab de IgG específicos contra los epítopos peptídicos del receptor opioide. Los conejos inmunizados con los epítopos de receptor opioide conjugados con la proteína transportadora KLH también produjeron elevadas titulaciones de anticuerpos específicos contra los epítopos que se les inyectaron. Estos resultados demuestran que el decapéptido agonista de C5a era tan eficaz como la proteína de elevado peso molecular, KLH, conjugado con el epítopo en la inducción de anticuerpos antipéptido específicos en especies de no roedores.

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Bibliografía

1. Rammensee et al. (1993) "Peptides Naturally Presented by MHC Class I Molecules", Ann. Rev. Imm. 11: 213-244.

2. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Inc., 1995.

3. Barclay, et al., (1993) The Leucocyte Antigen Facts Book. Academic Press, Harcourt Brace and Co., London.

4. Ember, J. A., Sanderson, S. D., Taylor, S. M., Sawahara, M., and Hugli, T.I. (1992) "Biological activity of synthetic analogues of C5a anaphylatoxin". J. Immunol. 148: 3165-3173.

5. Robert R Buchner, Shawn M. Vogen, Wolfgang Fischer., Marylin L. Thoman, Sam D. Sanderson, and Edward L. Morgan. (1996) "Anti-Human kappa opioid receptor antibodies characterization of site-directed neutralizing antibodies specific for a peptide \kappaR(33-52) derived from the predicted amino-terminal region of the human dappa receptor", J. Immunol. (In press).

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8. Morgan, E. L., J. A. Ember, S. D. Sanderson, W. Scholz, R. Buchner, R. D. Ye, T. E. Hugli. (1993) "Anti-C5a receptor antibodies. I. Characterization of neutralizing antibodies specific for the human C5a receptor". J. Immunol. 151: 377.

9. Hobbs, M. V., R. A. Houghten, J. A. Janda, W. O. Weigle, and E. L. Morgan, E. L. (1989) "Induction of human B cell differentiation by Fc region activators. I. Identification of an active tetrapeptide", Clinical Immunol. Immunopathol. 50: 251.

Aunque anteriormente se han descrito e ilustrado específicamente determinadas realizaciones preferidas de la presente invención, no se pretende limitar la invención a tales realizaciones.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patentes citados en la descripción

\bullet US 5696230 A [0042]

Bibliografía no relativa a patentes citada en la descripción

\bulletRAMMENSEE et al. Ann. Rev. Imm., 1993, vol. 11, 213 [0009]

\bulletAUSUBEL et al. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc, 1995 [0035] [0088]

\bulletRAMMENSEE et al. Peptides Naturally Presented by MHC Class I Molecules. Ann. Rev. Imm., 1993, vol. 11, 213-244 [0088]

\bulletBARCLAY et al. The Leucocyte Anten Facts Book. Academic Press, Harcourt Brace and Co, 1993 [0088]

\bulletEMBER,. J. A.; SANDERSON, S .D.; TAYLOR, S. M.; SAWAHARA, M.; HUGLI, T. I. Biological activity of synthetic analogues of C5a anaphylatoxin. J. Immunol., 1992, vol. 148, 3165-3173 [0088]

\bullet ROBERT R BUCHNER; SHAWN M. VOGEN; WOLFGANG FISCHER.; MARILYN L. THOMAN; SAM D. SANDERSON; EDWARD L. MORGAN. Anti-Human kappa opioid receptor antibodies characterization of site-directed neutralizing antibodies specific for a peptide \kappaR(33-52) derived from the predicted amino-terminal region of the human kappa receptor. J. Immunol., 1996 [0088]

\bulletMORGAN, E. L. Regulation of human B lymphocyte activation by opioid peptide hormones. Inhibition of IgG production by opioid receptor class (\mu, \kappa and \delta) selective agonists. J. Neuroimmunol., 1996, vol. 65, 21 [0088]

\bulletSANDERSON, S. D.; L KIRNARSKY; S. A. SHERMAN; J. A. EMBER; A. M. FINCH; S. M. TAYLOR. Decapeptide agonists of human C5a: the relationship between conformation and spasmogenic and platelet aggregatory responses. J. Med. Chem., 1994. vol. 38, 3171-3180 [0088]

\bulletMORGAN, E. L.; J. A. EMBER; S. D. SANDERSON; W. SCHOLZ; R. BUCHNER; RD. YE; T. E. HUGLI. Anti-C5a receptor antibodies. I. Characterization of neutralizing antibodies specific for the human C5a receptor. J. Immunol., 1993, vol. 151, 377 [0088]

\bulletHOBBS, M. V.; R. A. HOUGHTEN; J. A. JANDA; W. O. WEIGLE; E. L. MORGAN. Induction of human B cell differentiation by Fc region activators. I. Identification of an active tetrapeptide. Clinical Immunol. Immunopathol., 1989, vol. 50, 251 [0088]

Claims (19)

1. Adyuvante molecular para potenciar una respuesta inmune contra un inmunógeno que comprende un ligando de dirección que tiene afinidad de unión por un determinante característico de una célula presentadora de antígeno, estando dicho ligando de dirección unido covalentemente a dicho inmunógeno, por lo que la unión de dicho adyuvante molecular a dicho determinante de célula presentadora de antígeno activa a dicha célula presentadora de antígeno, realizando el suministro de dicho inmunógeno a una vía de presentación de antígeno de dicha célula presentadora de antígeno, donde dicho determinante característico es un receptor de C5a y donde dicho ligando de dirección se selecciona del grupo que consiste en C5a y un análogo agonista peptídico de C5a que comprende los diez residuos C-terminales de C5a.

2. Adyuvante molecular de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho ligando de dirección es un péptido que comprende la secuencia YSFKPMPLaR, (SEC ID Nº:1).

3. Adyuvante molecular de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la secuencia YKQGGFLGLYSFKPMPLaR (SEC ID Nº:2).

4. Adyuvante molecular de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha porción de dirección y dicho inmunógeno se unen por una porción espaciadora.

5. Adyuvante molecular de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho inmunógeno comprende al menos una sustancia seleccionada del grupo que consiste en péptidos, glicopéptidos, fosfopéptidos, lipopéptidos, proteínas, glicoproteínas, fosfoproteínas, lipoproteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos y lípidos.

6. Adyuvante molecular de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho inmunógeno comprende un péptido.

7. Adyuvante molecular de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho péptido comprende un epítopo de mucina-1 humana.

8. Adyuvante molecular de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho inmunógeno comprende una proteína.

9. Adyuvante molecular de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicha proteína comprende un amiloide sérico A (SAA).

10. Adyuvante molecular de acuerdo con la reivindicación 9, que tiene la fórmula SAA-K-Ahx-YSFKPMPLaR, que es la SEC ID Nº: 8 conjugada a SAA.

11. Adyuvante molecular de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho inmunógeno comprende un antígeno específico de tumor.

12. Composición para aumentar una respuesta inmune contra un inmunógeno en un sujeto en el que se desea dicho aumento de la respuesta inmune, comprendiendo dicha composición el adyuvante molecular de la reivindicación 1 en un medio biológicamente compatible.

13. Uso de un adyuvante molecular de acuerdo con la reivindicación 1, para la fabricación de un medicamento para activar una célula presentadora de antígeno, para inducir una respuesta inmune potenciada contra un inmunógeno, suministrándose dicho inmunógeno a la vía de presentación de antígeno de dicha célula presentadora de antígeno, uniéndose dicho adyuvante molecular a un determinante de superficie característico de dicha célula presentadora de antígeno.

14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la unión de dicho adyuvante molecular a dicha célula presentadora de antígeno induce una respuesta inmune humoral.

15. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la unión de dicho adyuvante molecular a dicha célula presentadora de antígeno induce una respuesta inmune celular.

16. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que dicha célula presentadora de antígeno se selecciona del grupo que consiste en monocitos, células dendríticas, macrófagos y células B.

17. Uso de un adyuvante molecular de acuerdo con la reivindicación 1, para la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmune mediada por células presentadoras de antígeno en un hospedador susceptible a una infección por un antígeno que contiene un agente causante de enfermedad, donde dicho inmunógeno de dicho adyuvante molecular comprende el antígeno de dicho agente causante de la enfermedad en una cantidad eficaz para provocar dicha respuesta inmune.

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18. Uso de un adyuvante molecular de acuerdo con la reivindicación 1, para la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmune a un antígeno asociado a tumor, donde dicho inmunógeno de dicho adyuvante molecular comprende dicho antígeno asociado a tumor en una cantidad eficaz para provocar dicha respuesta inmune.

19. Uso de un adyuvante molecular de acuerdo con la reivindicación 1, para la fabricación de un medicamento para la producción de anticuerpos contra un inmunógeno, mediante la inmunización de un animal con una cantidad inmunogénica eficaz de dicho adyuvante molecular, y el aislamiento y la recuperación de dichos anticuerpos.