ES2400249T3

ES2400249T3 - Vacunas recombinantes y utilización de las mismas

Info

Publication number: ES2400249T3
Application number: ES04790378T
Authority: ES
Inventors: Özlem TÜRECI; Ugur Sahin; Sebastian Kreiter
Original assignee: Biontech SE
Current assignee: Biontech SE
Priority date: 2003-10-14
Filing date: 2004-10-13
Publication date: 2013-04-08
Anticipated expiration: 2024-10-13
Also published as: CA2542269A1; SI1673460T1; US20140134201A1; EP1673460B1; US20130011426A1; JP4712715B2; US20220257783A1; DK1673460T3; DE10347710A1; PT1673460E; US11298426B2; US20100111993A1; AU2004282332A1; CY1114584T1; JP2008500014A; EP1673460A1; PL1673460T3; US20180177885A1; US8637006B2; US8178653B2

Abstract

Molécula de fusión que comprende un antígeno, una región transmembranaria y la región citoplásmica de unacadena de una molécula de MHC, en la que la molécula de fusión no comprende ninguno de los siguientes: (i)dominios α1, α2 y α3 de la cadena α de una molécula de MHC de clase I, (ii) ß2-microglobulina de una molécula deMHC de clase I, (iii) dominios α1 y α2 de la cadena α de una molécula de MHC de clase II y (iv) dominios ß1 y ß2 dela cadena ß de una molécula de MHC de clase II.

Description

Vacunas recombinantes y utilización de las mismas.

La presente invención se refiere a moléculas de fusión de antígenos, a los ácidos nucleicos que las codifican y a la utilización de dichas moléculas de fusión y ácidos nucleicos.

Las moléculas de fusión según la presente invención se pueden utilizar en un gran número de aplicaciones, entre las que se incluye la inducción de una respuesta inmunitaria en un mamífero.

Las reacciones de linfocitos T específicas de antígeno son desencadenadas por péptidos antigénicos unidos a la hendidura de unión de las glucoproteínas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) como parte del mecanismo del sistema inmunitario, en el que se identifican los antígenos extraños y se induce una respuesta a los mismos. Los péptidos antigénicos enlazados interactúan con los receptores de los linfocitos T y de este modo modulan una respuesta inmunitaria. Los péptidos antigénicos están unidos de forma no covalente a determinados “bolsillos de unión” formados por residuos polimórficos de la hendidura de unión de la proteína MHC.

Las moléculas de MHC de clase II son glucoproteínas heterodiméricas formadas por cadenas a y �. Los dominios a1 y �1 de estas moléculas se pliegan y forman una hendidura de unión al péptido. Los péptidos antigénicos se unen a la molécula de MHC mediante la interacción entre los aminoácidos de anclaje del péptido y los dominios a1 y �1. La estructura cristalina del complejo HLA DR1 humano de clase II con un péptido de virus de la gripe pone de manifiesto que los extremos N y C del péptido unido se prolongan fuera de la hendidura de unión, de modo que el extremo C del péptido se encuentra cerca del extremo N de la cadena �. [Brown, J.H. et al, 1993, Nature 364:33-39; Stern, L. J. et al, 1994, Nature 368:215-221]. Las moléculas de MHC de clase I presentan una organización de los dominios distinta de la de las moléculas de MHC de clase II, pero en general se trata de una estructura parecida con un sitio o hendidura de unión al péptido alejado de los dominios de membrana. [Véase, por ejemplo, Rudensky, A.Y. et al, 1991, Nature 353:622-627].

La etapa inicial en la presentación de un antígeno de una proteína extraña es la unión del antígeno nativo a una célula presentadora de antígeno (APC). Tras unirse a las APC, los antígenos penetran en las células, ya sea por fagocitosis, por endocitosis mediada por receptor o por pinocitosis. Estos antígenos internalizados se encuentran en unas vesículas intracelulares unidas a la membrana llamadas endosomas. Tras la fusión endosoma-lisosoma, los antígenos son procesados por las proteasas celulares presentes en los lisosomas hasta obtenerse péptidos pequeños. Los péptidos se asocian con las cadenas a y � de las moléculas de MHC de clase II dentro de estos lisosomas. Estas moléculas de MHC de clase II, previamente sintetizadas en el retículo endoplasmático rugoso, se transportan sucesivamente a los complejos de Golgi y al compartimento lisosómico. El complejo péptido-MHC se presenta en la superficie de las APC para la activación de los linfocitos T y B. Por consiguiente, la accesibilidad de los sitios de procesamiento proteolítico del antígeno, la estabilidad de los péptidos resultantes en los lisosomas y la afinidad de los péptidos por las moléculas de MHC son factores determinantes para la inmunogenia de un epítopo específico.

Las vacunas recombinantes tienen una importancia particular en la medicina humana y veterinaria como agentes y medicamentos para la profilaxis y el tratamiento de enfermedades infecciosas y cánceres. El objetivo de la vacunación con una vacuna recombinante es inducir una respuesta inmunitaria específica a un antígeno determinado, teniendo dicha respuesta una actividad preventiva o terapéutica contra determinadas enfermedades.

Un factor esencial para la eficacia de una vacuna recombinante es una estimulación óptima de los linfocitos T del organismo inmunizado. Así, una serie de investigaciones experimentales con animales han demostrado que es necesaria una estimulación óptima tanto de los linfocitos CD8+ como de los linfocitos CD4+ para una inmunoterapia efectiva de los tumores. Los principales tipos conocidos de vacunas recombinantes se basan en proteínas recombinantes, fragmentos peptídicos sintéticos, virus recombinantes y vacunas de ácidos nucleicos basadas en ADN o ARN. En años recientes, las vacunas basadas en ácidos nucleicos ADN y ARN han adquirido cada vez más importancia. Sin embargo, se consigue una estimulación muy baja o nula de los linfocitos CD4+ con vacunas recombinantes basadas en ácidos nucleicos para muchos fines, entre otros para antígenos tumorales. Por este motivo, se han desarrollado una serie de modificaciones genéticas con la intención de aumentar la inmunogenia de las vacunas recombinantes. Hasta el momento, se han ensayado diversos métodos en este sentido, entre otros la heterogeneización de inmunógenos mediante la modificación de la secuencia primaria o por fusión a epítopos extraños, por ejemplo, de bacterias o virus [Lowenadler, B. et al, 1990, Eur. J. Immunol. 20: 1541-45; Clarke, B.E. et al, 1987, Nature 330: 381-84] y la preparación de productos quiméricos que consisten en el antígeno real y proteínas inmunomoduladoras, tales como citocinas [Ruckert, R. et al, 1998, Eur. J. Immunol. 28: 3312-20; Harvill, E. T., J. M. Fleming, y S. L. Morrison, 1996, J. Immunol. 157: 3165-70]. Aunque las vacunas basadas en la heterogeneización inducen mejores respuestas inmunitarias, tienen el gran inconveniente de que la inmunoestimulación contra el epítopo extraño predomina y de que, en algunos casos, las respuestas inmunitarias contra el objetivo de la vacuna son sólo moderadas.

Otra posibilidad atractiva es la fusión a secuencias de proteínas destinadas a permitir la translocación de la proteína

en los compartimentos celulares que se degradan. Sin embargo, en la actualidad se sabe que estas modificaciones conducen únicamente a una mejora moderada de la estimulación de los linfocitos CD4+ y apenas ninguna mejora de las respuestas inmunitarias de los linfocitos CD8+ [Wu, T.C. et al, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 1167111675; Bonini, C. et al, 2001, J. Immunol. 166: 5250-57, Su, Z. et al, 2002, Cancer Res. 62: 5041-5048].

Por consiguiente, sería deseable disponer de vacunas que aumentaran significativamente la presentación de antígenos y, por lo tanto, la inmunogenia frente a un antígeno particular. Además, sería deseable que fuera posible modificar sistemáticamente las vacunas de tal modo que se obtuviera la máxima respuesta inmunitaria por parte de los linfocitos CD4+ y CD8+ sin tener que introducir epítopos extraños.

Este objeto se alcanza, según la presente invención, mediante el objeto de las reivindicaciones.

Según la presente invención, se ha podido determinar que las moléculas de fusión que comprenden moléculas de antígeno y partes de antígenos de histocompatibilidad, cuando se utilizan como vacunas, muestran una inmunogenia aumentada en un factor de > 100 en comparación con los antígenos no modificados, y que, sorprendentemente, las respuestas inmunitarias de los linfocitos T CD4+ y CD8+ aumentan de un modo no descrito hasta el momento.

La presente invención se refiere en general a moléculas de fusión de moléculas de antígeno y a la utilización de dichas moléculas de fusión.

En un aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de fusión que comprende un antígeno, una región transmembranaria y la región citoplásmica de una cadena de una molécula de MHC, en la que la molécula de fusión no comprende ninguno de los siguientes fragmentos: (i) dominios a1, a2 y a3 de la cadena a de una molécula de MHC de clase I, (ii) 2-microglobulina de una molécula de MHC de clase I, (iii) dominios a1 y a2 de la cadena a de una molécula de MHC de clase II y (iv) dominios 1 y 2 de la cadena de una molécula de MHC de clase II. Resulta preferido que tanto la región transmembranaria como la región citoplásmica se deriven de una molécula de MHC.

De este modo, se da a conocer, en particular, una molécula de fusión que comprende un antígeno y una parte de una cadena de una molécula de MHC, la cual corresponde esencialmente a la secuencia de la región transmembranaria unida a la región citoplásmica de una molécula de MHC, donde la expresión “región transmembranaria unida a la región citoplásmica” se refiere al segmento de una cadena de una molécula de MHC que comienza con el extremo N de la región transmembranaria y termina con el extremo C de la región citoplásmica, en particular, el extremo C de la cadena completa de la molécula de MHC. En esta forma de realización, la conexión entre la región transmembranaria y la región citoplásmica corresponde a la conexión de origen natural entre dichas regiones.

En particular, la presente invención da a conocer una molécula de fusión que comprende un antígeno y una parte de una cadena de una molécula de MHC, en la que dicha parte carece esencialmente de los dominios extracelulares aminoterminales completos de la molécula de MHC.

En una forma de realización particularmente preferida, las moléculas de fusión según la presente invención consisten en una fusión de un antígeno, en su caso con una secuencia líder en su extremo N, con una región transmembranaria, preferentemente una región transmembranaria de una cadena de una molécula de MHC, en el extremo C del antígeno y de una región citoplásmica de una cadena de una molécula de MHC en el extremo C de la región transmembranaria.

En una forma de realización particularmente preferida, las moléculas de fusión según la presente invención comprenden una secuencia líder, preferentemente una secuencia peptídica que tiene las propiedades de una señal de secreción capaz, en particular, de controlar la translocación de una proteína o péptido a través de una membrana. Es posible utilizar como secuencia líder la señal de secreción de cualquier proteína transmembranaria de tipo I, donde la expresión “proteína transmembranaria de tipo I” se refiere a las proteínas transmembranarias cuyo extremo C se encuentra en el citoplasma. En una forma de realización particular, la secuencia líder se deriva de una cadena de una molécula de MHC. La secuencia líder está situada preferentemente en el extremo N de las moléculas de fusión según la presente invención.

En particular, la presente invención se refiere a una molécula de fusión en la que, esencialmente, los dominios extracelulares aminoterminales completos de una molécula de MHC se sustituyen por un antígeno que tiene una secuencia líder en su extremo N.

En una molécula de fusión según la presente invención, resulta preferente que el antígeno esté unido covalentemente por su extremo N al extremo C de una secuencia líder, y que el extremo C de la molécula de antígeno esté unido al extremo N de la región transmembranaria, que a su vez está unida por su extremo C al extremo N de la región citoplásmica de una molécula de MHC.

Por consiguiente, la molécula de fusión según la presente invención tiene preferentemente la siguiente disposición:

extremo N-secuencia líder/antígeno/región transmembranaria/región citoplásmica-extremo C.

En una forma de realización particularmente preferida, la molécula de fusión según la presente invención está formada esencialmente por la secuencia líder, el antígeno, la región transmembranaria y la región citoplásmica.

En una forma de realización particularmente preferida, el antígeno es un péptido, un polipéptido o una proteína y la molécula de fusión según la presente invención es una proteína o un polipéptido.

En una forma de realización, una serie de antígenos que pueden ser idénticos o distintos están presentes en la molécula de fusión según la presente invención, es decir, por lo menos 2, preferentemente de 2 a 10, más preferentemente de 2 a 5, aún más preferentemente de 2 a 3, en particular 2, antígenos. Estos antígenos múltiplemente acoplados pueden estar presentes separados entre sí o en disposición consecutiva, en su caso separados por un conector, como constructos en tándem. Resulta preferente que se induzca de este modo una respuesta inmunitaria frente a diversos antígenos tras la administración.

El antígeno puede ser completo o truncado, es decir, que contiene sólo una parte de la proteína o polipéptido natural que actúa como antígeno.

Preferentemente, la secuencia líder y/o la región transmembranaria de las moléculas de fusión según la presente invención se derivan de moléculas de MHC, en particular de clase I o II. Resulta más preferente que la secuencia líder y/o la región transmembranaria y/o la región citoplásmica de las moléculas de fusión según la presente invención se deriven de moléculas de MHC, en particular de clase I o II.

También es posible, según la presente invención, que estén presentes en la molécula de fusión una o más secuencias conectoras (secuencias de conexión), preferentemente flexibles, posiblemente situadas entre la secuencia líder y el antígeno, entre el antígeno y la región transmembranaria y/o entre la región transmembranaria y la región citoplásmica. Según la presente invención, resulta preferente que la secuencia conectora comprenda aproximadamente de 7 a 20 aminoácidos, más preferentemente aproximadamente de 8 a 16 aminoácidos, y en particular aproximadamente de 8 a 12 aminoácidos.

Preferentemente, la secuencia conectora de las moléculas de fusión según la presente invención es flexible y, por consiguiente, no mantiene el péptido unido a las mismas en una única conformación no deseada. Preferentemente, el conector comprende en particular aminoácidos con cadenas laterales pequeñas, tales como glicina, alanina o serina, a fin de que se dé cierta flexibilidad. Preferentemente, la secuencia conectora no comprende ningún residuo de prolina, el cual podría inhibir dicha flexibilidad.

En otra forma de realización, la secuencia líder, el antígeno, la región transmembranaria y/o la región citoplásmica están unidos entre sí directamente, sin ningún conector.

Preferentemente, la secuencia líder tiene la secuencia mostrada en SEC ID nº: 2 o una secuencia derivada de la misma, o está codificada por la secuencia mostrada en SEC ID nº: 1 o una secuencia derivada de la misma. Preferentemente, la región transmembranaria-citoplásmica tiene la secuencia mostrada en SEC ID nº: 4 o 6, o una secuencia derivada de la misma, o está codificada por la secuencia mostrada en SEC ID nº: 3 o 5, o una secuencia derivada de la misma.

En otras formas de realización preferidas, la región transmembranaria-citoplásmica o la región exclusivamente citoplásmica se deriva de moléculas de MHC relacionadas en la secuencia (entre otras, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-DRa, HLA-DRb, HLA-DQa, HLA-DQb, HLA-DPa, HLA-DPb, CD1a, CD1b, CD1c). Las regiones transmembranarias-citoplásmicas preferentes tienen una secuencia seleccionada entre el grupo que comprende las secuencias representadas en SEC ID nº: 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, y secuencias derivadas de las mismas. En otras formas de realización, las regiones exclusivamente citoplásmicas tienen una secuencia seleccionada entre el grupo que comprende las secuencias representadas en SEC ID nº: 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, y secuencias derivadas de las mismas. Otras formas de realización también dan a conocer la utilización de diferentes secuencias, por ejemplo, secuencias modificadas u ortólogas de diferentes organismos. Las secuencias particularmente preferentes a este respecto son las que tienen en el extremo C una homología de más del 60% con respecto a las secuencias mostradas en SEC ID nº: 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42.

En una forma de realización particularmente preferida, la molécula de fusión según la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID nº: 12 o 14, o una secuencia derivada de las mismas.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican las moléculas de fusión descritas anteriormente y son preferentemente capaces de expresar dichas moléculas de fusión. En lo sucesivo, el término “ácido nucleico” también incluye derivados de los mismos.

En una forma de realización particularmente preferida, el ácido nucleico que codifica una molécula de fusión según

la presente invención comprende la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEC ID nº: 11 o 13, o una secuencia derivada de las mismas.

La invención también se refiere a células hospedadoras que comprenden un ácido nucleico según la invención.

Además, la célula hospedadora puede comprender un ácido nucleico que codifica una molécula de HLA. En una forma de realización, la célula hospedadora expresa la molécula de HLA de forma endógena. En otra forma de realización, la célula hospedadora expresa la molécula de HLA de forma recombinante. La célula hospedadora es preferentemente no proliferativa. En una forma de realización preferente, la célula hospedadora es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica, un monocito o un macrófago.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica, en particular una vacuna, que comprende una o más de las moléculas de fusión según la presente invención y/o uno o más de los ácidos nucleicos que las codifican y/o uno o más de las células hospedadoras según la presente invención.

En otro aspecto, la presente invención da a conocer un método in vitro para hacer aumentar la cantidad de complejos MHC/péptido en una célula, comprendiendo dicho método la disposición de una molécula de fusión según la presente invención o de un ácido nucleico que la codifica para la célula. La invención también se refiere a la utilización de una molécula de fusión según la presente invención o un ácido nucleico que la codifica para la preparación de una composición farmacéutica con el fin de aumentar la cantidad de complejos MHC/péptido en una célula. En una forma de realización preferente, la célula es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica, un monocito o un macrófago.

En otro aspecto, la presente invención da a conocer un método in vitro para aumentar la presentación de moléculas de superficie celular en células capaces de presentar antígenos (como linfocitos B y macrófagos, generalmente denominadas “APC”). La actividad presentadora de antígeno de dichas células aumenta al proporcionarles una molécula de fusión según la presente invención o un ácido nucleico que la codifica. La invención también se refiere a la utilización de una molécula de fusión según la presente invención o un ácido nucleico que la codifica para la preparación de una composición farmacéutica para aumentar la presentación de moléculas de superficie celular en células capaces de presentar antígenos, en particular, linfocitos B y macrófagos. A su vez, dicho aumento de la actividad de presentación de antígenos potencia preferentemente la activación primaria de los linfocitos T, en particular los linfocitos CD4+ y CD8+, que responden al antígeno.

En otro aspecto, la presente invención da a conocer la utilización de una molécula de fusión según la presente invención y/o un ácido nucleico que la codifica y/o una célula hospedadora según la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica con el fin de inducir una respuesta inmunitaria en un ser vivo.

En otro aspecto, la presente invención da a conocer un método in vitro para estimular o activar los linfocitos T, en particular los linfocitos CD4+ y CD8+, comprendiendo dicho método la disposición para los linfocitos T de una molécula de fusión según la presente invención y/o un ácido nucleico que la codifica y/o una célula hospedadora según la presente invención. La invención también se refiere a la utilización de una molécula de fusión según la presente invención y/o un ácido nucleico que la codifica y/o una célula hospedadora según la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica para estimular o activar los linfocitos T, particularmente los linfocitos CD4+ y CD8+, en un ser vivo, en particular en un paciente. Preferentemente, dicha estimulación o activación se expresa en una expansión, una reactividad citotóxica y/o una liberación de citocinas por parte de los linfocitos T.

Un aspecto adicional da a conocer la utilización de una molécula de fusión según la presente invención y/o un ácido nucleico que la codifica y/o una célula hospedadora según la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento, vacunación o inmunización de un ser vivo. A este respecto, los antígenos utilizados en la molécula de fusión según la presente invención o el ácido nucleico que la codifica son particularmente los que se sabe que son eficaces sin la modificación según la invención para el tratamiento, vacunación o inmunización deseados.

Los enfoques descritos anteriormente son particularmente adecuados para el tratamiento o la profilaxis de enfermedades infecciosas causadas, por ejemplo, por bacterias o virus. En determinadas formas de realización, el antígeno utilizado según la presente invención se deriva de un agente infeccioso, tal como hepatitis A, B, C, VIH, micobacterias, patógenos de la malaria, patógenos del SARS, virus del herpes, virus de la gripe o virus de la polio, o de patógenos bacterianos, tales como clamidias y micobacterias. Una aplicación particularmente beneficiosa de la presente invención se da en la inmunoterapia o vacunación del cáncer, donde se produce particularmente un aumento de la activación de los linfocitos T reactivos a los antígenos tumorales, lo que mejora las perspectivas de la inmunoterapia o vacunación de linfocitos T contra las células tumorales.

En formas de realización específicas, el antígeno utilizado según la presente invención se selecciona entre el grupo formado por los siguientes antígenos: p53, preferentemente codificado por la secuencia mostrada en SEC ID nº: 45, ART-4, BAGS, ss-catenin/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLAUDIN-12, c-MYC, CT,

Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (o hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, preferentemente MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11 o MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/melan-A, MC1R, miosina/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 menor bcrabL Pm1/RARa, PRAME, proteinasa-3, PSA, PSM, RAGE, RU1 o RU2, SAGE, SART-1 o SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE y WT, preferentemente WT-1, particularmente codificado por la secuencia mostrada en SEC ID nº: 44.

Descripción detallada de la invención

Los términos “dominio” o “región” se refieren a una parte determinada de una secuencia de aminoácidos que puede estar preferentemente relacionada con una función o estructura específicas. Por ejemplo, los polipéptidos a y de una molécula de MHC de clase II tienen dos dominios, a1, a2 y 1, 2, respectivamente, una región transmembranaria y una región citoplásmica. Análogamente, la cadena a de las moléculas de MHC de clase I tiene tres dominios, a1, a2 y a3, una región transmembranaria y una región citoplásmica.

En una forma de realización, el dominio o región completos están incluidos en una selección de la secuencia de un dominio o región determinados para su deleción o incorporación en una molécula de fusión según la presente invención. Para garantizar este hecho, la secuencia del dominio o región relevantes se puede extender a fin de comprender partes de un conector o incluso partes del dominio o región adyacentes. El término “esencialmente” en relación con un dominio o región debe entenderse en este sentido.

El término “región transmembranaria” se refiere a la parte de una proteína que consiste esencialmente en el fragmento presente en una membrana celular y preferentemente sirve para anclar la proteína a la misma. Según la presente invención, una región transmembranaria es preferentemente una secuencia de aminoácidos que atraviesa la membrana una vez. Sin embargo, también es posible, en algunas formas de realización, utilizar una región transmembranaria que atraviesa la membrana más de una vez. Habitualmente, la región transmembranaria tiene de 15 a 25 aminoácidos preferentemente hidrófobos y no cargados que adoptan, por ejemplo, una conformación ahelicoidal. Preferentemente, la región transmembranaria se deriva de una proteína seleccionada entre el grupo formado por moléculas de MHC, inmunoglobulinas, CD4, CD8, la cadena � de CD3, la cadena γ de CD3, la cadena 5 de CD3 y la cadena £ de CD3.

Típicamente, la región transmembranaria consiste, en el caso de las cadenas a y de la molécula de MHC de clase II, en aproximadamente 20 aminoácidos hidrófobos unidos al extremo carboxiterminal del antígeno. Estos residuos permiten que la proteína atraviese la membrana. La región transmembranaria termina con aproximadamente de 6 a 32 residuos que comprenden la cola citoplásmica en el extremo carboxiterminal de cada una de estas cadenas. Se ha puesto de manifiesto que estas regiones transmembranaria y citoplásmica se pueden sustituir por secuencias que indican una unión GPI, y que las moléculas quiméricas ancladas a GPI de clase II están unidas a la membrana (Wettstein, D. A., J.J. Boniface, P.A. Reay, H. Schild y M.M. Davis, 1991, J. Exp. Med. 174: 219-228). Estas formas de realización quedan comprendidas en el término “región transmembranaria” según la presente invención. Los dominios de anclaje de la membrana unidos a GPI se han definido para una serie de proteínas, incluidos el factor acelerador de la degradación (DAF), el CD59 y la fosfatasa alcalina placentaria humana (HPAP) (Wettstein, D.A.,

J.J. et al, 1991, J. Exp. Med. 174:219-228). Por ejemplo, los 38 aminoácidos carboxiterminales de la HPAP son suficientes para funcionar como secuencia señal para la unión a GPI. Si la secuencia de ADN que codifica este dominio está unida a una molécula secretada, tal como la parte soluble de la cadena a o del MHC de clase II, se forma una molécula quimérica unida a la membrana (Wettstein, D.A. et al, 1991, J. Exp. Med. 174: 219-228), y se puede utilizar un método de este tipo para anclar moléculas de fusión según la presente invención a una membrana celular.

El término “complejo principal de histocompatibilidad” y la abreviatura “MHC” se refieren a un complejo de genes presente en todos los vertebrados. La función de las proteínas o moléculas de MHC en la señalización entre los linfocitos y las células presentadoras de antígeno en las respuestas inmunitarias normales implica que las mismas se unan a péptidos y los presenten para el posible reconocimiento por parte de receptores de linfocitos T (TCR). Las moléculas de MHC se unen a péptidos en un compartimento de procesamiento intracelular y los presentan a los linfocitos T en la superficie de células presentadoras de antígeno. La región del MHC humano, también denominado HLA, se encuentra en el cromosoma 6 y comprende la región de clase I y la región de clase II.

El término “MHC de clase I” o “clase I” se refiere a proteínas o genes del complejo principal de histocompatibilidad de clase I. Dentro de la región del MHC humano de clase I existen las subregiones HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, CD1a, CD1b y CD1c.

Las cadenas a de clase I son glucoproteínas con un peso molecular de aproximadamente 44 kDa. La cadena polipeptídica tiene una longitud de algo más de 350 residuos de aminoácidos. Se puede dividir en tres regiones funcionales: una región externa, una región transmembranaria y una región citoplásmica. La región externa tiene una longitud de 283 residuos de aminoácidos y se divide en tres dominios, a1, a2 y a3. Habitualmente, los dominios y regiones están codificados por exones separados del gen de clase I. La región transmembranaria se extiende por la

bicapa lipídica de la membrana plasmática. Se compone de 23 residuos de aminoácido, generalmente hidrófobos, dispuestos en una hélice a. Habitualmente, la región citoplásmica, es decir, la parte encarada hacia el citoplasma y que está unida a la región transmembranaria, tiene una longitud de 32 residuos de aminoácidos y es capaz de interactuar con los elementos del citoesqueleto. La cadena a interactúa con la 2-microglobulina, formando dímeros a-2 en la superficie celular.

El término “MHC de clase II” o “clase II” se refiere a proteínas o genes del complejo principal de histocompatibilidad de clase II. Dentro de la región del MHC humano de clase II, existen las subregiones DP, DQ y DR para los genes de la cadena a y los genes de la cadena de clase II (es decir, DPa, DP , DQa, DQ , DRa y DR ).

Las moléculas de clase II son heterodímeros compuestos por una cadena a y una cadena . Ambas cadenas son glucoproteínas con un peso molecular de 31-34 kDa (a) o de 26-29 kDa ( ). La longitud total de las cadenas a varía entre 229 y 233 residuos de aminoácidos, y la de las cadenas entre 225 y 238 residuos. Las dos cadenas a y consisten en una región externa, un péptido de conexión, una región transmembranaria y una cola citoplásmica. La región externa se compone de dos dominios, a1 y a2 o 1 y 2. El péptido de conexión tiene una longitud de 13 y 9 residuos en las cadenas a y respectivamente. Conecta los dos dominios a la región transmembranaria, que consiste en 23 residuos de aminoácidos en las cadenas a y las cadenas . Habitualmente, la región citoplásmica, es decir, la parte encarada hacia el citoplasma y que está unida a la región transmembranaria, tiene una longitud que varía entre 3 y 16 residuos en las cadenas a y de 8 a 20 residuos en las cadenas .

Según la presente invención, el término “cadena de una molécula de MHC” se refiere a la cadena a de una molécula de MHC de clase I o a las cadenas a y de una molécula de MHC de clase II. Las cadenas a de una molécula de MHC de clase I, de las que se pueden derivar las moléculas de fusión según la presente invención, comprenden las cadenas a de HLA-A, -B y -C. Las cadenas a de una molécula de MHC de clase II, de las que se pueden derivar las moléculas de fusión según la presente invención, comprenden las cadenas a de HLA-DR, -DP y -DQ, en particular las cadenas a de HLA-DR1, HLA-DR2, HLA-DR4, HLA-DQ1, HLA-DQ2 y HLA-DQ8 y, en particular, las cadenas a codificadas por los alelos DRA*0101, DRA*0102, DQA1*0301 o DQA1*0501. Las cadenas de una molécula de MHC de clase II, de las que se pueden derivar las moléculas de fusión según la presente invención, comprenden las cadenas de HLA-DR, -DP y -DQ, en particular las cadenas de HLA-DR1, HLA DR2, HLA-DR4, HLA-DQ1, HLA DQ2 y HLA-DQ8 y, en particular, las cadenas codificadas por los alelos DRB1*01, DRB1*15, DRB1*16, DRB5*01, DQB1*03 y DQB1*02.

El término “dominio de unión a MHC” se refiere al “dominio de unión del MHC de clase I” y al “dominio de unión del MHC de clase II”.

El término “dominio de unión del MHC de clase I” se refiere a la región de una molécula de MHC de clase I o de una cadena de MHC de clase I necesaria para la unión a un péptido antigénico. Un dominio de unión del MHC de clase I está formado principalmente por los dominios a1 y a2 de la cadena a del MHC de clase I. Aunque el dominio a3 de la cadena a y la 2-microglobulina no representan partes esenciales del dominio de unión, son presumiblemente importantes para estabilizar la estructura global de la molécula de MHC de clase I y, por consiguiente, el término “dominio de unión del MHC de clase I” incluye preferentemente estas regiones. Un dominio de unión del MHC de clase I también se puede definir esencialmente como el dominio extracelular de una molécula de MHC de clase I, distinguiéndola de la región transmembranaria y la región citoplásmica.

El término “dominio de unión del MHC de clase II” se refiere a la región de una molécula de MHC de clase II o de una cadena de MHC de clase II necesaria para la unión a un péptido antigénico. Un dominio de unión del MHC de clase II está formado principalmente por los dominios a1 y 1 de las cadenas a y del MHC de clase II. Sin embargo, los dominios a2 y 2 de estas proteínas son también presumiblemente importantes para estabilizar la estructura global de la hendidura de unión del MHC, y por lo tanto el término “dominio de unión del MHC de clase II” según la presente invención incluye preferentemente estas regiones. Un dominio de unión de MHC de clase II también se puede definir esencialmente como el dominio extracelular de una molécula de MHC de clase II, distinguiéndola del dominio transmembranario y el dominio citoplásmico.

El número exacto de aminoácidos presentes en los diversos dominios o regiones de la molécula de MHC varía según las especies de mamíferos y entre las clases de genes dentro de una especie. Cuando se selecciona la secuencia de aminoácidos de un determinado dominio o región, el mantenimiento de la función del dominio o región es mucho más importante que la definición estructural exacta, que se basa en el número de aminoácidos. El experto en la materia también será consciente de que la función también se puede mantener utilizando menos que la secuencia de aminoácidos completa del dominio o región seleccionado.

El término “antígeno” se refiere a un agente contra el que se pretende generar una respuesta inmunitaria. El término “antígeno” incluye, en particular, proteínas, péptidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, especialmente ARN y ADN, y nucleótidos. El término “antígeno” también incluye antígenos derivatizados como sustancia secundaria que se convierte en antigénica -y sensibilizante- sólo a través de la transformación (por ejemplo, de forma intermedia en la molécula, por compleción con proteína corporal), y antígenos conjugados que, mediante la incorporación artificial de grupos atómicos (por ejemplo, isocianatos, sales de diazonio), muestran una nueva especificidad constitutiva. En

una forma de realización preferente, el antígeno es un antígeno tumoral, es decir, un constituyente de las células cancerosas que se puede derivar del citoplasma, la superficie celular y el núcleo celular, en particular aquellos antígenos que se producen, preferentemente en grandes cantidades, intracelularmente o como antígenos de superficie sobre las células tumorales. Son ejemplos de los mismos el antígeno carcinoembrionario, la a1fetoproteína, la isoferritina y la sulfoglucoproteína fetal, la a2-H-ferroproteína y la y-fetoproteína y diversos antígenos tumorales víricos. En otra forma de realización, el antígeno es un antígeno vírico, tal como las ribonucleoproteínas víricas o las proteínas de envoltura. En particular, el antígeno o los péptidos del mismo deben ser presentados por moléculas de MHC y, de este modo, ser capaces de modular, y en particular activar, las células del sistema inmunitario, preferentemente los linfocitos CD4+ y CD8+, en particular modulando la actividad de un receptor de linfocitos T, y así inducir preferentemente la proliferación de los linfocitos T.

El término “complejo MHC/péptido” se refiere a un complejo no covalente del dominio de unión de una molécula de MHC de clase I o MHC de clase II y de un péptido de unión al MHC de clase I o MHC de clase II.

El término “péptido de unión al MHC” o “péptido de unión” se refiere a un péptido que se une a una molécula de MHC de clase I y/o de MHC de clase II. En el caso de los complejos de MHC de clase I/péptido, los péptidos de unión tienen típicamente una longitud de entre 8 y 10 aminoácidos, aunque algunos péptidos más largos o más cortos pueden ser activos. En el caso de los complejos de MHC de clase II/péptido, los péptidos de unión tienen típicamente una longitud de entre 10 y 25 aminoácidos, y particularmente de entre 13 y 18 aminoácidos, aunque algunos péptidos más largos o más cortos pueden ser activos.

Generalmente, las moléculas de fusión según la presente invención y los ácidos nucleicos que las codifican se pueden preparar mediante técnicas de ADN recombinante, tales como preparación de ADN plasmídico, escisión de ADN con enzimas de restricción, ligación de ADN, transformación o transfección de un hospedador, cultivo del hospedador y aislamiento y purificación de la molécula de fusión expresada. Estos métodos se conocen y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al, Molecular Cloning (2ª edición, 1989).

El ADN que codifica el antígeno se puede obtener aislando ADN a partir de fuentes naturales o mediante métodos sintéticos conocidos, tales como el método del triéster de fosfato; véase, por ejemplo, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (M.J. Gait, editor, 1984). Los oligonucleótidos sintéticos también se pueden preparar con la ayuda de sintetizadores de oligonucleótidos automáticos disponibles en el mercado.

Las proporciones de moléculas de MHC en las moléculas de fusión según la presente invención corresponden adecuadamente, en relación con la secuencia de aminoácidos, a moléculas de MHC de origen natural de seres humanos, ratones u otros roedores, u otros mamíferos, o derivadas de las mismas.

Se conocen fuentes de ADN que codifican proteínas de MHC, tales como las células linfoblastoides humanas. Después del aislamiento, el gen que codifica la molécula de MHC, o una parte interesante del mismo, se puede amplificar mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros métodos conocidos. Los cebadores de PCR adecuados para amplificar el gen del péptido para el MHC pueden incorporar sitios de restricción al producto de la PCR.

Según la presente invención, resulta preferente preparar constructos de ADN que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican la secuencia líder, la región transmembranaria y la región citoplásmica, y que comprenden un sitio de escisión de restricción entre la secuencia líder y la región transmembranaria, de modo que, esencialmente, cualquier secuencia de nucleótidos que codifique un antígeno interesante se puede incorporar al constructo.

En un método preferente para preparar moléculas de fusión según la presente invención, las secuencias de ADN se disponen de tal manera que el extremo C de la secuencia líder está unido al extremo N del antígeno, el extremo C del antígeno está unido al extremo N de la región transmembranaria y el extremo C de la región transmembranaria está unido al extremo N de la región citoplásmica. Tal como se ha mencionado anteriormente, los sitios de escisión de restricción se incorporan preferentemente entre el extremo de la secuencia líder y el inicio de la región transmembranaria, de modo que, esencialmente, cualquier ácido nucleico que codifique un antígeno interesante se puede unir a la secuencia de ácido nucleico correspondiente a la región transmembranaria.

Una molécula de fusión expresada según la presente invención se puede aislar y purificar de un modo conocido.

Típicamente, el medio de cultivo se centrifuga y a continuación se purifica el sobrenadante mediante métodos de afinidad o inmunoafinidad que comprenden la utilización de anticuerpos monoclonales que se unen a la molécula de fusión expresada. La molécula de fusión también puede comprender una secuencia que facilite la purificación, por ejemplo una etiqueta 6xHis.

La capacidad de una molécula de fusión según la presente invención para modular la actividad de un receptor de linfocitos T (incluyendo las respuestas de inactivación de los linfocitos T) se puede determinar fácilmente mediante un ensayo in vitro. Típicamente, los linfocitos T para los ensayos se obtienen mediante líneas de linfocitos T transformadas, tales como hibridomas de linfocitos T o linfocitos T aislados de un mamífero, tal como un ser humano

o un roedor, por ejemplo un ratón. Los hibridomas de linfocitos T están disponibles o se pueden preparar de un modo conocido. Los linfocitos T se pueden aislar de un modo conocido a partir de un mamífero; véase, por ejemplo, Shimonkevitz, R. et al, 1983, J. Exp. Med. 158: 303.

Se lleva a cabo un ensayo adecuado para determinar si una molécula de fusión según la presente invención es capaz de modular la actividad de los linfocitos T tal como se describe a continuación en las etapas 1-4. Los linfocitos T expresan adecuadamente un marcador que se puede analizar e indica la activación de los linfocitos T o la modulación de su actividad tras su activación. Así, se puede utilizar el hibridoma de linfocitos T de ratón D011.10, que expresa interleucina-2 (IL-2) al activarse. Las concentraciones de IL-2 se pueden medir con el fin de determinar si un péptido específico de presentación es capaz de modular la actividad de este hibridoma de linfocitos T. Un ensayo adecuado de este tipo se lleva a cabo según las etapas siguientes:

1.: Los linfocitos T se obtienen, por ejemplo, a partir de un hibridoma de linfocitos T interesante o mediante su aislamiento a partir de un mamífero.

2.: Los linfocitos T se cultivan en condiciones que permiten su proliferación.

3.: Los linfocitos T en proliferación se ponen en contacto con células presentadoras de antígeno que, a su vez, se han puesto en contacto con una molécula de fusión según la presente invención o con un ácido nucleico que la codifica.

4.: Se determina un marcador de los linfocitos T, por ejemplo, se mide la producción de IL-2.

Los linfocitos T utilizados en los ensayos se incuban en condiciones adecuadas para su proliferación. Por ejemplo, un hibridoma de linfocitos T D011.10 se incuba adecuadamente en medio completo (RPMI 1640, complementado con FBS al 10%, penicilina/estreptomicina, L-glutamina y 5 x 10-5 M de 2-mercaptoetanol) a aproximadamente 37ºC con un 5% de CO2. Se pueden analizar diluciones en serie de la molécula de fusión según la presente invención. Las señales de activación de los linfocitos T las proporcionan las células presentadoras de antígenos que se han cargado con el péptido antigénico adecuado.

Como alternativa a la medición de una proteína expresada, tal como IL-2, es posible determinar adecuadamente la modulación de la activación de los linfocitos T a través de los cambios en la proliferación de los linfocitos T dependientes de antígeno medidos por métodos conocidos de radiomarcación. Por ejemplo, se puede introducir un nucleótido marcado (por ejemplo, tritiado) en el medio de cultivo de ensayo. La introducción de un nucleótido marcado de este tipo en el ADN actúa como mensurando de la proliferación de linfocitos T. Este ensayo no es adecuado para linfocitos T que no requieran presentación de antígeno para su proliferación, tales como los hibridomas de linfocitos T. El ensayo es adecuado para medir la modulación de la activación de los linfocitos T por parte de las moléculas de fusión en el caso de linfocitos T no transformados aislados de mamíferos.

La capacidad de una molécula de fusión según la presente invención para inducir una respuesta inmunitaria, lo que incluye el hacer posible la vacunación contra una enfermedad diana, se puede determinar de forma sencilla mediante un ensayo in vivo. Por ejemplo, se pueden administrar una molécula de fusión según la presente invención

o un ácido nucleico que la codifica a un mamífero, tal como un ratón, y tomar muestras de sangre de dicho mamífero en el momento de la primera administración y varias veces a intervalos periódicos a partir de entonces (por ejemplo, 1, 2, 5 y 8 semanas tras la administración de la molécula de fusión o del ácido nucleico que la codifica). A partir de las muestras de sangre, se obtiene el suero y se analiza en el mismo la aparición de anticuerpos resultantes de la inmunización. Se pueden determinar las concentraciones de anticuerpos. Además, se pueden aislar los linfocitos T de la sangre o de órganos linfáticos y someterse a un ensayo funcional para determinar su reactividad al antígeno o a epítopos derivados del mismo. Todos los sistemas de lectura conocidos por el experto en la materia, entre otros el ensayo de proliferación, la secreción de citocinas, la actividad citotóxica, el análisis de tetrámeros, pueden ser utilizados en este contexto.

Según la presente invención, la inducción de una respuesta inmunitaria, incluida la vacunación de un ser vivo contra una enfermedad diana, puede tener lugar en combinación con medios conocidos para inducir una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, se pueden administrar una molécula de fusión según la presente invención o un ácido nucleico que la codifica a un ser vivo en una disposición o combinación con la administración de una composición de vacuna a fin de potenciar o prolongar el efecto deseado de dicha composición de vacuna.

Según la presente invención, el término “derivado” significa que una determinada entidad, en particular una determinada secuencia, está presente en el objeto del que se deriva, en particular, un organismo o una molécula. En el caso del ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos, particularmente de determinadas regiones de secuencia, “derivado” significa, además, que el correspondiente ácido nucleico o secuencia de aminoácidos se deriva, de acuerdo con las definiciones posteriores, de un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos presente en el objeto. Así, la expresión “secuencia o región derivada de una molécula de MHC” significa que la secuencia o región está presente en una molécula de MHC o se deriva, de acuerdo con las definiciones posteriores, de una secuencia o región presente en una molécula de MHC.

Según la presente invención, el ácido nucleico es preferentemente ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN). Según la presente invención, entre los ácidos nucleicos se incluyen ADN genómico, ADNc, ARNm, moléculas preparadas recombinantemente y por síntesis química. Según la presente invención, el ácido nucleico se puede presentar en forma de molécula monocatenaria o bicatenaria, y lineal o cerrada covalentemente para formar un círculo.

Una secuencia derivada de una secuencia de ácido nucleico o la expresión “secuencia derivada de una secuencia de ácido nucleico” se refiere, según la presente invención, a secuencias homólogas y derivados de la secuencia anterior.

Según la presente invención, las secuencias de ácidos nucleicos homólogas exhiben, por lo menos, un 40%, en particular, por lo menos, un 50%, por lo menos, un 60%, por lo menos, un 70%, por lo menos, un 80%, por lo menos, un 90% y preferentemente, por lo menos, un 95%, por lo menos, un 98% o, por lo menos, un 99% de identidad de los nucleótidos.

Un ácido nucleico es “homólogo” a otro, en particular, cuando las dos secuencias de las cadenas complementarias son capaces de hibridarse entre sí y formar un dúplex estable, la hibridación, teniendo lugar preferentemente dicha hibridación en condiciones que permiten la hibridación específica entre polinucleótidos (condiciones estrictas). Las condiciones estrictas se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al, editors, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 or Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al, editores, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, y se refieren, por ejemplo, a la hibridación a 65ºC en tampón de hibridación (3,5 x SSC, 0,02% de Ficoll, 0,02% de polivinilpirrolidona, 0,02% de seroalbúmina bovina, NaH2PO4 2,5 mM (pH 7), 0,5% de SDS, EDTA 2 mM). SSC es cloruro de sodio 0,15 M/citrato de sodio 0,15 M, pH 7. Tras la hibridación, la membrana sobre la que se ha transferido el ADN se lava, por ejemplo, en 2 x SSC a temperatura ambiente y a continuación en 0,1-0,5 x SSC/0,1 x SDS a temperaturas de hasta 68ºC.

“Derivado” de un ácido nucleico significa, según la invención, que están presentes sustituciones, deleciones y/o adiciones simples o múltiples de nucleótidos en dicho ácido nucleico. El término “derivado” también incluye, además, la derivación química de un ácido nucleico en una base, un sacárido o un fosfato de un nucleótido. El término “derivado” también incluye ácidos nucleicos que comprenden nucleótidos de procedencia no natural y análogos de nucleótidos.

Los ácidos nucleicos descritos por la presente invención son preferentemente aislados. Según la presente invención, el término “ácido nucleico aislado” significa que el ácido nucleico (i) se ha amplificado in vitro, por ejemplo, por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) se ha producido de forma recombinante mediante clonación, (iii) se ha purificado, por ejemplo, por escisión y fraccionamiento mediante electroforesis en gel, o (iv) se ha sintetizado, por ejemplo, mediante síntesis química. Un ácido nucleico aislado es un ácido nucleico que se encuentra disponible para su manipulación mediante técnicas de ADN recombinante.

Según la presente invención, los ácidos nucleicos que codifican las moléculas de fusión pueden presentarse solos o en combinación con otros ácidos nucleicos, particularmente ácidos nucleicos heterólogos. En las formas de realización preferidas, un ácido nucleico está unido funcionalmente a secuencias de control de expresión o secuencias reguladoras que pueden ser homólogas o heterólogas con respecto al ácido nucleico. Una secuencia de codificación y una secuencia reguladora están “funcionalmente” unidas entre sí si están unidas covalentemente, de tal manera que la expresión o transcripción de la secuencia de codificación está bajo el control o la influencia de la secuencia reguladora. Si la secuencia de codificación se debe traducir en una proteína funcional y existe una conexión funcional de una secuencia reguladora con la secuencia de codificación, la inducción de la secuencia reguladora conduce a la transcripción de la secuencia de codificación sin que tenga lugar ningún desplazamiento en el marco de lectura de la secuencia de codificación ni de ninguna incapacidad de la secuencia de codificación para ser traducida en la proteína o péptido deseados.

En el contexto de la presente invención, el término “secuencia de control de expresión” o “secuencia reguladora” incluye potenciadores et al elementos de control que controlan la expresión de un gen. En formas de realización particulares de la presente invención, las secuencias de control de la expresión se pueden regular. La estructura exacta de las secuencias reguladoras puede variar según la especie o el tipo de célula, pero en términos generales incluye secuencias no transcritas en 5’ y secuencias no traducidas en 5’ implicadas en la iniciación de la transcripción y la traducción, respectivamente, tales como una caja TATA, una secuencia de bloqueo, una secuencia CAAT y similares. En particular, las secuencias reguladoras no transcritas en 5’ incluyen una región promotora que incluye una secuencia de promotor para el control transcripcional del gen unido funcionalmente. Las secuencias reguladoras también pueden incluir secuencias potenciadoras o secuencias activadoras situadas secuencia arriba.

Según la presente invención, en una forma de realización preferente, el ácido nucleico es un vector, en su caso con un promotor que controla la expresión de un ácido nucleico, por ejemplo, de un ácido nucleico que codifica una molécula de fusión según la presente invención. En una forma de realización preferente, el promotor es un promotor T7, T3 o SP6.

El término “vector” se utiliza en este contexto en su sentido más general, e incluye cualquiera de los vehículos intermedios para ácidos nucleicos que hacen posible, por ejemplo, que el ácido nucleico se introduzca en células procariotas y/o eucariotas y, en su caso, se integre en un genoma. Preferentemente, dichos vectores se replican y/o se expresan en la célula. Un vehículo intermedio se puede adaptar, por ejemplo, para su utilización en electroporación, bombardeo con microproyectiles, administración liposómica, transferencia con ayuda de agrobacterias o inserción a través de virus ADN o ARN. Los vectores incluyen plásmidos, fagémidos, bacteriófagos o genomas víricos.

Los ácidos nucleicos que codifican una molécula de fusión según la presente invención se pueden utilizar para la transfección de células hospedadoras. En este contexto, la expresión ácidos nucleicos se refiere tanto a ADN como a ARN recombinantes. El ARN recombinante se puede preparar mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN. Además, se puede modificar antes de la aplicación mediante secuencias de estabilización, bloqueo y poliadenilación.

Según la presente invención, el término “célula hospedadora” se refiere a cualquier célula que se puede transformar

o transfectar con un ácido nucleico exógeno. Según la presente invención, el término “células hospedadoras” incluye células procariotas (por ejemplo, E. coli) o eucariotas (por ejemplo, células dendríticas, linfocitos B, células CHO, células COS, células K562, células de levadura y células de insecto). Son particularmente preferentes las células de mamífero, tales como células procedentes de seres humanos, ratones, hámsteres, cerdos, cabras y primates. Las células se pueden derivar de un gran número de tipos de tejido e incluyen células primarias y líneas celulares. Entre los ejemplos específicos se incluyen los queratinocitos, los leucocitos de sangre periférica, células madre de médula ósea y células madre embrionarias. En otras formas de realización, la célula hospedadora es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica, un monocito o un macrófago. En la célula hospedadora puede estar presente un ácido nucleico en una única o en varias copias y, en una forma de realización, el mismo se expresa en dicha célula hospedadora.

Según la presente invención, el término “expresión” se utiliza en su sentido más general e incluye la producción de ARN o de ARN y proteína. También incluye la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión puede ser transitoria o estable. Entre los sistemas de expresión preferentes en células de mamífero se incluyen pcADN3.1 y pRc/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA), que comprenden un marcador seleccionable, tal como un gen que confiere resistencia a G418 (y de este modo hace posible la selección de líneas celulares transfectadas de manera estable), y las secuencias de potenciador-promotor del citomegalovirus (CMV).

Un ácido nucleico que codifica una molécula de fusión según la presente invención también puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de MHC, preferentemente una molécula de HLA. La secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de MHC puede estar presente en el mismo vector de expresión que el ácido nucleico que codifica la molécula de fusión, o los dos ácidos nucleicos pueden estar presentes en vectores de expresión distintos. En este último caso, los dos vectores de expresión se pueden cotransfectar en una célula.

Según la presente invención, una secuencia derivada de una secuencia de aminoácidos o la expresión “secuencia derivada de una secuencia de aminoácidos” se refiere a secuencias homólogas y derivados de la secuencia anterior.

Según la presente invención, las secuencias de aminoácidos homólogas exhiben, por lo menos, un 40%, en particular, por lo menos, un 50%, por lo menos, un 60%, por lo menos, un 70%, por lo menos, un 80%, por lo menos, un 90% y preferentemente, por lo menos, un 95%, por lo menos, un 98% o, por lo menos, un 99% de identidad de los residuos de aminoácidos.

Los “derivados” de una proteína o un polipéptido, o de una secuencia de aminoácidos en el sentido de la presente invención, incluyen variantes de inserción de aminoácidos, variantes de deleción de aminoácidos y/o variantes de sustitución de aminoácidos.

Las variantes de inserción de aminoácidos incluyen fusiones aminoterminales y/o carboxiterminales, e inserciones de uno o varios aminoácidos en una determinada secuencia de aminoácidos. En las variantes de secuencia de aminoácidos con una inserción, se introducen uno o más residuos de aminoácidos en un sitio predeterminado de una secuencia de aminoácidos, aunque también es posible una inserción aleatoria con una selección adecuada del producto resultante. Las variantes de deleción de aminoácidos se caracterizan por la deleción de uno o más aminoácidos de la secuencia. Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracterizan, por lo menos, porque se elimina un residuo de la secuencia y se inserta otro residuo en su lugar. Las modificaciones están presentes preferentemente en posiciones de la secuencia de aminoácidos que no se conservan entre proteínas o polipéptidos homólogos. Preferentemente, los aminoácidos se sustituyen por otros con propiedades parecidas, tales como hidrofobia, hidrofilia, electronegatividad, volumen de la cadena lateral y similares (sustitución conservativa). Las sustituciones conservativas se refieren, por ejemplo, a la sustitución de un aminoácido por otro, estando clasificados ambos aminoácidos en el mismo grupo de entre los siguientes:

1.: residuos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)

2.: residuos cargados negativamente y sus amidas: Asn, Asp, Glu, Gln

3.: residuos cargados positivamente: His, Arg, Lys

4.: residuos alifáticos grandes, no polares: Met, Leu, Ile, Val (Cys)

5.: residuos aromáticos grandes: Phe, Tyr, Trp.

Se han puesto tres residuos entre paréntesis por su particular papel en la arquitectura de proteínas. La Gly es el único residuo sin cadena lateral y, por consiguiente, confiere flexibilidad a la cadena. La Pro tiene una geometría inusual que limita en gran medida la cadena. La Cys puede formar un puente disulfuro.

Las variantes de aminoácidos descritas anteriormente se pueden preparar fácilmente con la ayuda de técnicas de síntesis peptídica conocidas, tales como, por ejemplo, síntesis en fase sólida (Merrifield, 1964) y métodos similares,

o por manipulación de ADN recombinante. Se conocen bien las técnicas para introducir mutaciones de sustitución en sitios predeterminados del ADN con una secuencia total o parcialmente conocida e incluyen, por ejemplo, la mutagénesis con M13. La manipulación de secuencias de ADN para preparar proteínas que tienen sustituciones, inserciones o deleciones y los métodos recombinantes generales para la expresión de proteínas, por ejemplo, en un sistema biológico (por ejemplo, los sistemas de mamífero, insecto, planta y virus) se describen con detalle, por ejemplo, en Sambrook et al (1989).

Según la presente invención, los “derivados” de proteínas o polipéptidos también incluyen una o varias sustituciones, deleciones y/o adiciones de cualquier molécula asociada con la proteína o polipéptido, tales como hidratos de carbono, lípidos y/o proteínas o polipéptidos.

En una forma de realización, los “derivados” de las proteínas o polipéptidos incluyen los análogos modificados resultantes de la glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, palmitoilación, miristoilación, isoprenilación, lipidación, alquilación, derivación, introducción de grupos protectores/de bloqueo, escisión proteolítica o unión a un anticuerpo o a otro ligando celular. Los derivados de proteínas o polipéptidos también se pueden preparar por otros métodos, tales como, por ejemplo, escisión química con bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH2, acetilación, formilación, oxidación, reducción, o por síntesis metabólica en presencia de tunicamicina.

El término “derivado” también se extiende a todos los equivalentes químicos funcionales de proteínas o polipéptidos.

Según la presente invención, los derivados de proteínas y polipéptidos descritos anteriormente están comprendidos por el término “molécula de fusión”, aunque no se haga referencia explícita a los mismos.

Las composiciones farmacéuticas descritas según la presente invención se pueden utilizar terapéuticamente para el tratamiento de una enfermedad preexistente, o profilácticamente como vacunas para inmunización.

Según la presente invención, el término “vacuna” se refiere a una preparación antigénica que comprende, por ejemplo, una proteína, un péptido, un ácido nucleico o un polisacárido, y que se administra a un receptor con el fin de estimular su sistema inmunitario humoral y/o celular contra uno o más antígenos presentes en la preparación de vacuna. Los términos “vacunación” o “inmunización” se refieren al proceso de administración de una vacuna y de estimulación de una respuesta inmunitaria frente a un antígeno. El término “respuesta inmunitaria” se refiere a las actividades del sistema inmunitario, incluidas la activación y proliferación de linfocitos T citotóxicos específicos tras el contacto con un antígeno.

Se pueden utilizar modelos animales para evaluar el efecto inmunizante, por ejemplo, contra el cáncer, utilizando como antígeno un antígeno asociado a tumor. Además, es posible, por ejemplo, introducir células cancerosas humanas en un ratón a fin de crear un tumor y administrar un ácido nucleico según la invención, que codifica una molécula de fusión según la presente invención, que comprende el antígeno asociado al tumor. El efecto sobre las células cancerosas (por ejemplo, la reducción del tamaño del tumor) se puede medir y tomar como criterio para evaluar la eficacia de la inmunización por parte del ácido nucleico.

Como parte de la composición para la inmunización, se administran una o más moléculas de fusión con uno o más adyuvantes a fin de inducir o potenciar la respuesta inmunitaria. Un adyuvante es una sustancia que se incorpora en un antígeno o se administra junto con el mismo y que potencia la respuesta inmunitaria. Los adyuvantes son capaces de potenciar la respuesta inmunitaria proporcionando un depósito de antígeno (extracelularmente o en los macrófagos), activando los macrófagos y estimulando determinados linfocitos. Los adyuvantes son conocidos e incluyen, a modo de enumeración no limitativa, el monofosforil-lípido A (MPL, SmithKline Beecham), saponinas tales como QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 y QS-L1 (So et al, Mol. Cells 7:178-186, 1997), el adyuvante incompleto de Freund, el adyuvante completo de Freund, la vitamina E, Montanide, alumbre, oligonucleótidos CpG (véase Krieg et al, Nature, 374:546-9, 1995) y diversas emulsiones de tipo agua en aceite que se preparan a partir de aceites biodegradables, como escualeno y/o tocoferol. Las moléculas de fusión se administran preferentemente en una mezcla con DQS21/MPL. Habitualmente, la proporción de DQS21 con respecto a MPL es de aproximadamente 1:10 a 10:1, preferentemente de aproximadamente 1:5 a 5:1, y en

particular de aproximadamente 1:1. En una formulación de vacuna para la administración a seres humanos, DQS21 y MPL están presentes habitualmente en un intervalo comprendido entre aproximadamente 1 Ig y aproximadamente 100 Ig.

También se pueden administrar otras sustancias que estimulan una respuesta inmunitaria en el paciente. Por ejemplo, se pueden utilizar citocinas para la vacuna por sus propiedades de regulación de los linfocitos. Entre dichas citocinas se incluyen, por ejemplo, la interleucina-12 (IL-12), de la que se ha demostrado que potencia los efectos protectores de las vacunas (véase Science 268:1432-1434, 1995), GM-CSF y IL-18.

Según la presente invención, la inducción de una respuesta inmunitaria en un mamífero comprende generalmente la administración de una cantidad eficaz de una molécula de fusión según la presente invención y/o de un ácido nucleico que la codifica, en particular en forma de vector. El ADN o ARN que codifica una molécula de fusión según la presente invención se administra preferentemente a un mamífero junto con una secuencia de ADN que codifica un factor coestimulador de linfocitos T, tal como un gen que codifica B7-1 o B7-2.

En la presente memoria, la expresión “factor coestimulador de linfocitos T” se refiere a una molécula, en particular un péptido, capaz de proporcionar una señal coestimuladora y, de este modo, potenciar la respuesta inmunitaria, en particular activando la proliferación de linfocitos T en presencia de una o más moléculas de fusión según la presente invención. Dicha activación de la proliferación de linfocitos T se puede determinar mediante ensayos generalmente conocidos.

Estos factores incluyen moléculas coestimuladoras que se proporcionan en forma de proteínas o ácidos nucleicos.

Entre los ejemplos de dichas moléculas coestimuladoras se incluyen B7-1 y B7-2 (CD80 y CD86, respectivamente), que se expresan en las células dendríticas (DC) e interactúan con la molécula de CD28 expresada en los linfocitos

T. Esta interacción proporciona una coestimulación (señal 2) para un linfocito T estimulado por antígeno/MHC/TCR (señal 1), aumentando de este modo la proliferación de los linfocitos T y la función efectora. B7 también interactúa con CTLA4 (CD152) en los linfocitos T, y las investigaciones que incluyen ligandos de CTLA4 y ligandos de B7 ponen de manifiesto que la interacción B7-CTLA4 puede potenciar la inmunidad antitumoral y la proliferación de CTL (Zheng, P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(11):6284-6289 (1998)).

Normalmente, B7 no se expresa en las células tumorales, por lo que no son células presentadoras de antígeno (APC) eficaces para los linfocitos T. La inducción de la expresión de B7 haría posible que las células tumorales estimulen de forma más eficaz la proliferación de los linfocitos T citotóxicos y una función efectora. La coestimulación mediante una combinación de B7/IL-6/IL-12 puso de manifiesto una inducción de la IFN gamma y del perfil de citocina Th1 en una población de linfocitos T, lo que provoca un aumento adicional de la actividad de los linfocitos T (Gajewski et al, J. Immunol. 154:5637-5648 (1995)).

La activación completa de los linfocitos T citotóxicos y una función efectora completa requieren la cooperación de los linfocitos T cooperadores a través de la interacción entre el ligando de CD40 de los linfocitos T cooperadores y la molécula de CD40 expresada por las células dendríticas (Ridge et al, Nature 393:474 (1998), Bennett et al, Nature

393:478 (1998), Schönberger et al, Nature 393:480 (1998)). Probablemente, el mecanismo de esta señal de coestimulación se relaciona con el aumento de B7 y de la producción asociada de IL-6/IL-12 por parte de las células dendríticas (células presentadoras de antígeno). De este modo, la interacción CD40-CD40L complementa las interacciones de la señal 1 (antígeno/MHC-TCR) y la señal 2 (B7-CD28).

La presente invención da a conocer la administración de ácidos nucleicos, polipéptidos o proteínas y/o células. Resulta preferida la administración de ADN y ARN.

Fue posible demostrar en los experimentos que, en comparación con el antígeno no modificado, según la presente invención, es suficiente una dosis 100 veces más baja de la vacuna para inducir respuestas inmunitarias equivalentes o más fuertes. Un problema de la inyección directa de vacunas de ácido nucleico es que la dosis necesaria para inducir la respuesta inmunitaria es muy alta. En las vacunas de ADN, se supone que la razón reside principalmente en el hecho de que sólo una fracción de las células incorporan en su núcleo el ADN inyectado. En las vacunas de ARN, presumiblemente, el problema es que, en particular, el ARN inyectado es degradado muy rápidamente por las RNAsas.

En la utilización de las vacunas modificadas según la presente invención, es de esperar que se obtendrán respuestas inmunitarias muy aumentadas tras la inyección directa de los ácidos nucleicos, en particular ARN, en comparación con los ácidos nucleicos no modificados.

En una forma de realización preferente, se selecciona un vector viral para la administración de un ácido nucleico que codifica una molécula de fusión según la presente invención entre el grupo formado por adenovirus, virus adenoasociados, poxvirus, incluidos virus de la vaccinia y poxvirus atenuados, virus del bosque de Semliki, retrovirus, virus de Sindbis y partículas de tipo virus Ty. Resultan particularmente preferentes los adenovirus y retrovirus. Normalmente, los retrovirus son de replicación deficiente (es decir, son incapaces de producir partículas

infecciosas).

Se pueden utilizar diversos métodos para introducir ácidos nucleicos en células in vitro o in vivo. Dichos métodos incluyen la transfección de precipitados de ácidos nucleicos-fosfato de calcio, la transfección de ácidos nucleicos asociados con DEAE, la transfección o infección con los virus mencionados anteriormente que portan los ácidos nucleicos de interés, la transfección mediada por liposomas y similares. En determinadas formas de realización, resulta preferente guiar el ácido nucleico hasta determinadas células. En estas formas de realización, un vehículo utilizado para administrar un ácido nucleico a una célula (por ejemplo, un retrovirus o un liposoma) puede tener una molécula de direccionamiento asociada. Por ejemplo, se puede incorporar al vehículo de ácido nucleico o enlazar al mismo una molécula tal como un anticuerpo específico para una proteína de superficie de membrana de la célula diana, o un ligando de un receptor de la misma. Si se escoge la administración de un ácido nucleico mediante liposomas, es posible incorporar proteínas que se unen a una proteína de superficie de membrana asociada con la endocitosis en la formulación de liposomas a fin de posibilitar el direccionamiento y/o la absorción. Entre dichas proteínas se incluyen proteínas de la cápside o fragmentos de las mismas, que son específicos para un determinado tipo celular, anticuerpos contra proteínas internalizadas, proteínas que se dirigen a un sitio intracelular y similares.

Los ácidos nucleicos se administran preferentemente junto con sustancias estabilizantes, tales como sustancias estabilizantes de ARN.

En una forma de realización, los ácidos nucleicos se administran por métodos ex vivo, es decir mediante la extracción de células de un paciente, la modificación genética de las mismas y la reintroducción de las células una vez modificadas en dicho paciente. En general, esto incluye la introducción de una copia funcional de un gen en las células de un paciente in vitro y la devolución de las células modificadas genéticamente a dicho paciente. La copia funcional del gen está bajo el control funcional de elementos reguladores que permiten la expresión del gen en las células genéticamente modificadas. El experto en la materia conoce métodos de transfección y transducción. La presente invención también da a conocer la administración de ácidos nucleicos in vivo mediante la utilización de vectores tales como virus y liposomas dirigidos.

La administración de polipéptidos y péptidos puede tener lugar de un modo conocido.

Según la presente invención, el término “paciente”, “individuo” o “ser vivo” se refiere a un ser humano, un primate no humano u otro animal, en particular un mamífero, por ejemplo la vaca, el caballo, el cerdo, la oveja, la cabra, el perro, el gato, aves como el pollo, o roedores como el ratón y la rata. En una forma de realización particularmente preferida, el paciente, individuo o ser vivo es un ser humano.

Las composiciones terapéuticas según la presente invención se pueden administrar en preparaciones farmacéuticamente aceptables. Dichas preparaciones pueden comprender concentraciones habituales farmacéuticamente aceptables de sales, sustancias tamponantes, conservantes, vehículos, sustancias complementarias potenciadoras de la inmunidad, tales como adyuvantes (por ejemplo, oligonucleótidos CpG) y citocinas, y, en su caso, otros agentes terapéuticos.

Los agentes terapéuticos según la presente invención se pueden administrar por cualquier vía convencional, por ejemplo, por inyección o por infusión. La administración puede tener lugar, por ejemplo, por vía oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intradérmica, transdérmica, intralinfática, preferentemente por inyección en los ganglios linfáticos, particularmente los ganglios linfáticos inguinales, los vasos linfáticos y/o en el bazo.

Las composiciones según la presente invención se administran en cantidades eficaces. La expresión “cantidad eficaz” se refiere a la cantidad que, por sí sola o junto con dosis adicionales, logra una respuesta o un efecto deseados. En el tratamiento de una determinada enfermedad o afección, la respuesta deseada se refiere a la inhibición de la progresión de dicha enfermedad. Esto incluye retrasar la progresión de la enfermedad y, en particular, detener el avance de la misma. La respuesta deseada en el tratamiento de una enfermedad o afección también puede consistir en el retraso o la prevención de la aparición de dicha enfermedad o afección.

La cantidad eficaz de la composición según la presente invención depende de la afección a tratar, de la gravedad de la enfermedad, de los parámetros individuales del paciente, incluidos la edad, el estado fisiológico, la altura y el peso, la duración del tratamiento, el tipo de terapia concomitante (si existe), la vía específica de administración y factores de este tipo.

Las composiciones farmacéuticas según la presente invención son preferentemente estériles y comprenden una cantidad eficaz de la sustancia terapéuticamente activa a fin de generar la respuesta o efecto deseados.

Las dosis de composiciones según la presente invención que se administran pueden depender de diversos parámetros, tales como el modo de administración, el estado del paciente, el período de administración deseado, etc. Si la respuesta del paciente resulta inadecuada con una dosis inicial, es posible administrar dosis más altas (o dosis efectivamente más altas, que se consiguen por una vía de administración diferente y más localizada).

En general, se formulan y administran dosis comprendidas entre 1 ng y 1 mg, preferentemente entre 10 ng y 100 Ig, del antígeno asociado al tumor para un tratamiento o para generar o potenciar una respuesta inmunitaria. Si se desea administrar ácidos nucleicos (ADN y ARN), se formulan y administran dosis comprendidas entre 1 ng y 0,1 mg.

Generalmente, las composiciones farmacéuticas según la presente invención se administran en cantidades farmacéuticamente aceptables y en composiciones farmacéuticamente aceptables. El término “farmacéuticamente aceptable” se refiere a un material no tóxico que no interactúa con el efecto del principio activo de la composición farmacéutica. Habitualmente, estas preparaciones pueden comprender sales, sustancias tamponantes, conservantes, vehículos y, en su caso, otros agentes terapéuticos. Cuando se utilizan para fines médicos, las sales deben ser farmacéuticamente aceptables. Sin embargo, se pueden utilizar sales farmacéuticamente no aceptables para preparar sales farmacéuticamente aceptables de las mismas, y resultan comprendidas en la presente invención. Entre dichas sales farmacológica y farmacéuticamente aceptables se incluyen, sin limitarse a las mismas, las preparadas a partir de los siguientes ácidos: ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables también se pueden preparar como sales de metales alcalinos o de metales alcalinotérreos, tales como sales de sodio, potasio o calcio.

Una composición farmacéutica según la presente invención puede comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable. Según la presente invención, el término “vehículo farmacéuticamente aceptable” se refiere a una o más sustancias de relleno o diluyentes compatibles, sólidos o líquidos, o sustancias de cápsula adecuadas para la administración a seres humanos. El término “vehículo” se refiere a un ingrediente orgánico o inorgánico, de origen natural o sintético, en el que se incorpora el principio activo a fin de facilitar su uso. Normalmente, los ingredientes de la composición farmacéutica según la presente invención son de tal naturaleza que no se produce ninguna interacción que afecte sustancialmente a la actividad farmacéutica deseada.

Preferentemente, los vehículos son líquidos estériles, como agua o aceites, incluidos los derivados de petróleo, animales o plantas, o son de origen sintético, tales como, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, aceite de girasol y similares. También se pueden utilizar soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos acuosos.

Entre los ejemplos de excipientes y vehículos se incluyen derivados acrílicos y metacrílicos, ácido algínico, derivados de ácido sórbico, tales como ácido a-octadecil-w-hidroxipoli(oxietilen)-5-sórbico, aminoácidos y sus derivados, especialmente compuestos amínicos, tales como colina, lecitina y fosfatidilcolina, goma arábiga, aromas, ácido ascórbico, carbonatos, tales como, por ejemplo, carbonatos y bicarbonatos de sodio, potasio, magnesio y calcio, hidrogenofosfatos y fosfatos de sodio, potasio, calcio y magnesio, carmelosa sódica, dimeticona, colorantes, aromatizantes, sustancias tamponantes, conservantes, espesantes, plastificantes, gelatina, jarabes de glucosa, malta, dióxido de silicio coloidal, hidromelosa, benzoatos, especialmente benzoatos de sodio y potasio, macrogol, leche desnatada en polvo, óxido de magnesio, ácidos grasos y sus derivados y sales, tales como ácido esteárico y estearatos, especialmente estearatos de magnesio y calcio, ésteres de ácidos grasos y mono y diglicéridos de ácidos grasos comestibles, ceras naturales y sintéticas, tales como cera de abejas, cera amarilla y cera de montana glicol, cloruros, especialmente cloruro de sodio, polividona, glicoles de polietileno, polivinilpirrolidona, povidona, aceites, tales como aceite de ricino, aceite de soja, aceite de coco, aceite de palmiste, sacáridos y derivados de sacáridos, especialmente mono y disacáridos, tales como glucosa, fructosa, manosa, galactosa, lactosa, maltosa, xilosa, sacarosa, dextrosa, y celulosa y sus derivados, shellac, almidón y derivados de almidón, especialmente almidón de maíz, sebo, talco, dióxido de titanio, ácido tartárico, polialcoholes, tales como glicerol, manitol, sorbitol y xilitol, y sus derivados, glicol, etanol y mezclas de los mismos.

Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender preferentemente agentes humectantes, emulsionantes y/o agentes tamponantes del pH.

En otra forma de realización, las composiciones farmacéuticas pueden comprender un potenciador de la absorción. Estos potenciadores de la absorción pueden sustituir, si se desea, una cantidad equimolar del vehículo en la composición. Entre los ejemplos de dichos potenciadores de la absorción se incluyen, sin limitarse a los mismos, eucaliptol, N,N-dietil-m-toluamida, alcoholes de polioxialquilenos (tales como propilenglicol y polietilenglicol), N-metil2-pirrolidona, miristato de isopropilo, dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilacetamida (DMA), urea, dietanolamina, trietanolamina y similares (véase, por ejemplo, Percutaneous Penetration Enhancers, editado por Smith et al (CRC Press, 1995)). La cantidad de potenciador de la absorción presente en la composición puede depender de los efectos que se desea alcanzar.

Se puede incorporar un inhibidor de la proteasa a la composición según la presente invención a fin de evitar la degradación del agente peptídico o proteínico y, de este modo, aumentar la biodisponibilidad. Entre los ejemplos de inhibidores de la proteasa se incluyen, sin limitarse los mismos, aprotinina, leupepsina, pepstatina, a2macroglobulina e inhibidor de la tripsina. Estos inhibidores se pueden utilizar solos o combinados.

A las composiciones farmacéuticas de la invención se les pueden aplicar uno o más recubrimientos. A las formas de

dosificación orales sólidas se les aplica preferentemente un recubrimiento resistente a los jugos gástricos o se presentan en forma de cápsula de gelatina blanda endurecida resistente a los jugos gástricos.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender sustancias tamponantes adecuadas, tales como ácido acético en una sal, ácido cítrico en una sal, ácido bórico en una sal y ácido fosfórico en una sal.

Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender, donde proceda, conservantes adecuados, tales como cloruro de benzalconio, clorobutanol, parabenos y timerosal.

Las composiciones farmacéuticas se presentan habitualmente en forma de dosis unitaria y se pueden producir de un modo conocido. Las composiciones farmacéuticas según la invención se pueden presentar, por ejemplo, en forma de cápsulas, comprimidos, pastillas, soluciones, suspensiones, jarabes, elixires o como emulsión.

Habitualmente, las composiciones adecuadas para la administración parenteral comprenden una preparación estéril acuosa o no acuosa del agente activo, preferentemente isotónica con respecto a la sangre del receptor. Entre los ejemplos de vehículos y disolventes adecuados se incluyen la solución de Ringer y una solución isotónica de cloruro sódico. Además, habitualmente se utilizan aceites fijos estériles como medio de disolución o suspensión.

La presente invención se describe con detalle mediante los siguientes ejemplos y figuras, que se incluyen a título exclusivamente ilustrativo y no deben entenderse como limitativos. Otras formas de realización que no van más allá de los límites de la invención y del alcance de las reivindicaciones adjuntas son accesibles para el experto en la materia sobre la base de la descripción y los ejemplos.

Breve descripción de los dibujos:

Figura 1: Representación esquemática de una proteína de fusión según la presente invención.

La proteína de fusión se compone de una señal de secreción en posición aminoterminal, un dominio transmembranario y citoplásmico de un antígeno de histocompatibilidad en posición carboxiterminal y una secuencia completa o parcial integrada de un antígeno.

Figura 2: Representación esquemática de los casetes para la expresión de proteínas de fusión.

SP: péptido señal; MCS: sitio de clonación múltiple; TM: dominio transmembranario; cola de MHC: cola citoplásmica de una molécula de MHC; antígeno: secuencia que codifica un antígeno contra el que se pretenden inducir respuestas inmunitarias.

Figura 3: Ensayo del efecto de diversas dosis de ARN en la frecuencia de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno.

Se cocultivaron 1 x 106 linfocitos CD4+ purificados durante 1 semana con 2 x 105 DC que habían sido transfectadas con ARN en las cantidades indicadas (0,1-10 Ig de ARN) por electroporación. El día 7 después de la estimulación, se llevó a cabo un ensayo ELISPOT en condiciones estándar para detectar los linfocitos T secretores de interferón y. Las células presentadoras de antígeno utilizadas fueron DC del mismo donante cargadas con péptidos pp65 solapantes (1,75 Ig/ml) o un péptido de control irrelevante. Para el ensayo, se coincubaron 3 x 104 efectores con 2 x 104 DC durante 16 h. Tras el desarrollo estándar, el número de linfocitos T secretores de IFN gamma se determinó por medio de un análisis por vídeo basado en software. En comparación con el ARN de CMVpp65standard, se observa una expansión masiva de linfocitos CD4+ tanto por el constructo CMVpp65-TM1 como por el constructo CMVpp65-TM2.

Figura 4: Ensayo del efecto de diversas dosis de ARN en la frecuencia de linfocitos T CD8+ secretores de interferón gamma.

Se cocultivaron 1 x 106 linfocitos CD8+ purificados durante 1 semana con 2 x 105 DC que habían sido transfectadas con ARN en las cantidades indicadas (0,1-10 Ig de ARN) por electroporación. El día 7 se llevó a cabo un ensayo ELISPOT para detectar los linfocitos T secretores de IFN gamma contra DC del mismo donante cargadas con péptidos pp65 solapantes (1,75 Ig/ml) o un péptido de control irrelevante. Se coincubaron 3 x 104 efectores con 2 x 104 DC durante 16 h. Tras el desarrollo estándar, el número de linfocitos T secretores de IFN gamma se determinó por medio de un análisis por vídeo basado en software. Se observó una expansión masiva de linfocitos CD8+ por el constructo CMVpp65-TM1 y el constructo CMVpp65-TM2. Incluso al utilizar dosis 100 veces más bajas (0,1 Ig de ARN), la frecuencia de los linfocitos CD8+ específicos de pp65 seguía estando por encima del valor de fondo tras la estimulación por parte de DC transfectadas con NYESO-ARN (datos no representados). La estimulación por el constructo CMVpp65standard mostró una expansión de los linfocitos específicos de pp65 por encima del valor de fondo sólo con 2,5 Ig y más.

Figura 5: Diagrama de dosis/efecto para la capacidad de expansión de diversos inmunógenos sobre linfocitos específicos de antígenos.

Los inmunógenos modificados según la presente invención exhiben una potencia significativamente aumentada (> 100 veces) y un efecto máximo más alto.

Figura 6: Ensayo comparativo del efecto de los inmunógenos modificados según la presente invención y de inmunógenos estándar en la generación de respuestas inmunitarias citotóxicas.

Se cocultivaron 1 x 106 linfocitos CD8+ purificados durante 1 semana con 2 x 105 DC que habían sido transfectadas con 10 Ig de ARN por electroporación. El día 7 se llevó a cabo un ensayo estándar de citotoxicidad-citocromo contra DC del mismo donante cargadas con diversas concentraciones de péptidos pp65 solapantes o un péptido de control irrelevante. Se coincubaron 15 x 104 efectores con 0,5 x 104 DC durante 4 h.

Tras la medición del sobrenadante en un contador, se calculó la lisis específica según la fórmula: Se observó una lisis extensa por parte de linfocitos CD8+ que habían sido estimulados con los constructos CMVpp65-TM1 y CMVpp65-TM2, lo que estaba por encima del valor del péptido de control hasta una concentración 10 nM de la mezcla de péptidos pp65 (datos no representados). Análogamente, los linfocitos CD8+ se expandieron mediante la mezcla de péptidos pp65 y mostraron una marcada lisis específica, pero no alcanzaron el nivel de CMVpp65-TM1 y -TM2. Sólo se pudo alcanzar una estimulación débil de linfocitos T citotóxicos específicos a pp65 mediante el constructo CMVpp65standard.

Figura 7: Secuencias utilizadas en los ejemplos.

I TM-CM de HLA de clase I: región transmembranaria-citoplásmica de una molécula de HLA de clase I; II TM-CM de HLA de clase II: región transmembranaria-citoplásmica de una molécula de HLA de clase II.

Figura 8: Secuencias de regiones transmembranarias-citoplásmicas y regiones citoplásmicas de moléculas de MHC.

Las secuencias muestran la región transmembranaria-citoplásmica o sólo la región citoplásmica de diversas moléculas de HLA. La región transmembranaria está subrayada y en negrita.

Figura 9: Estimulación de linfocitos T CD8+ indiferenciados mediante constructos de fusión según la presente invención.

En placas de microtitulación, se estimularon 1 x 105 linfocitos CD8+ por pocillo contra 2 x 104 DC transfectadas con 20 Ig de CMVpp65-TM1 o ARN de control. El medio se complementó con IL-6 (1.000 U/ml) e IL-12 (10 ng/ml). En los días 7 y 14, se utilizaron DC transfectadas descongeladas (2 x 104/pocillo) para la reestimulación, y el medio contenía IL-2 (10 U/ml) e IL-7 (5 ng/ml). El día 21, todas las poblaciones se sometieron a un ensayo ELISPOT contra péptidos de control (1,75 Ig/ml) y contra péptidos pp65 solapantes (1,75 Ig/ml). Dos de las poblaciones estimuladas contra CMVpp65-TM1 (Pop. 1, Pop. 2) mostraron una marcada reactividad a pp65.

Ejemplos:

Ejemplo 1: Preparación de las vacunas modificadas

Para preparar las vacunas modificadas, se preparó en primer lugar un casete que permite la expresión de genes de fusión en un vector de expresión que permite la transcripción de ARN. Para ello, inicialmente se amplificó el ácido nucleico que codifica un péptido señal de una molécula de HLA a partir de linfocitos humanos y el fragmento se clonó como ADNc en un vector (SEC ID nº: 1 y 2). La clonación se llevó a cabo de tal modo que diversos sitios de escisión de enzimas de restricción se dispusieron detrás del ADNc del péptido señal, y otros fragmentos se pueden clonar en el mismo marco de lectura en el casete de expresión. Los vectores seleccionados eran plásmidos que permitían la expresión in vitro de ARN a través de un promotor de ARN-polimerasa T3, T7 o SP6 situado en 5’. El siguiente fragmento clonado en este vector era un ADNc que codifica un dominio de transmembrana y el dominio citoplásmico de una molécula de HLA de clase I (SEC ID nº: 3 y 4) o de clase II (SEC ID nº: 5 y 6), incluyendo el codón de parada. La clonación se llevó a cabo de tal modo que el plásmido resultante todavía tiene sitios de escisión de enzimas de restricción para la clonación de antígenos entre los dos fragmentos (SEC ID nº: 7 y 8 y figura 1). La secuencia (SEC ID nº: 9 y 10) que codifica la fosfoproteína 65 de citomegalovirus humano (pp65) se clonó en estos casetes de expresión como antígeno modelo de tal modo que se obtuvo un ORF continuo compuesto por la secuencia señal de HLA, pp65 y el dominio transmembranario y citoplásmico de HLA (SEC ID nº: 11 y 12). Para los experimentos de control, se preparó un vector que comprendía la secuencia de pp65 con un codón de parada en el mismo vector inicial sin dichos fragmentos. Se utilizaron los siguientes ácidos nucleicos para experimentos adicionales:

CMVpp65standard: secuencia CMVpp65 sin modificar, inmunógeno estándar

CMVpp65-TM1: ácido nucleico de fusión compuesto por los siguientes fragmentos: señal de secreción de HLA de clase I, pp65 ORF y dominio transmembranario y citoplásmico de HLA de clase I (inmunógeno modificado).

CMVpp65-TM2: ácido nucleico de fusión compuesto por los siguientes fragmentos: señal de secreción de HLA de clase I, pp65 ORF y dominio transmembranario y citoplásmico de HLA de clase II (inmunógeno modificado).

Ejemplo 2: Evaluación de las vacunas modificadas

Los tres ácidos nucleicos (CMVpp65standard, CMVpp65TM1, CMVpp65TM2) se utilizaron como inmunógeno en los ensayos de estimulación con DC autólogas de donantes positivos al antígeno. Con el fin de evaluar las respuestas inmunitarias de CD4 y CD8 por separado, se utilizaron linfocitos CD4+ y CD8+ purificados. La lectura utilizada fue el ensayo de puntos por inmunoabsorción unida a enzimas (ELISPOT), que se reconoce como el ensayo estándar para la cuantificación de linfocitos T secretores de IFN-A. Se utilizó un ensayo estándar de liberación de cromo para evaluar la función efectora de los linfocitos T CD8+. Se transfectaron monocitos autólogos o DC con los inmunógenos ARN pp65, CMVpp65-TM1 y CMVpp65-TM2. Las DC se cargaron con péptidos solapantes para pp65 y con el péptido de control como control de la estimulación máxima. Las DC tratadas de esta manera se coincubaron con linfocitos CD4+ o CD8+ durante la noche o durante 7 días. La lectura se llevó a cabo contra monocitos autólogos

o DC que habían sido cargadas con péptidos pp65 solapantes, o con un lisado de fibroblastos de CMV. La investigación de las respuestas inmunitarias de CD4+ puso de manifiesto, sorprendentemente, que los inmunógenos modificados (CMVpp65-TM1 y CMVpp65-TM2) no sólo indujeron una respuesta inmunitaria aumentada al inmunógeno CMVpp65standard, sino que también indujeron un nivel máximo de secreción de IFN gamma específico al antígeno en los linfocitos CD4+ (figura 3). El porcentaje de células CD4+ específicas al antígeno tras la estimulación por los constructos pp65 modificados fue, además, igual o incluso mayor que tras la estimulación con péptidos pp65 solapantes. Como se esperaba, el inmunógeno CMVpp65standard no mostró ninguna estimulación significativa de los linfocitos CD4+.

Se obtuvo un resultado aún más sorprendente en la investigación de las respuestas inmunitarias de CD8 tras la estimulación con los inmunógenos. Fue posible demostrar que la utilización de los casetes de expresión modificados para estimular los linfocitos CD8+ dio lugar análogamente a una proporción de células específicamente secretoras de IFN-A comparable a la que se produce tras la estimulación con péptidos pp65 solapantes. Sorprendentemente, los constructos de ARN modificados fueron muy superiores a los inmunógenos CMVpp65standard sin modificar también en este caso (figuras 4 y 5). Los resultados del ensayo de citotoxicidad demostraron que ambas modificaciones producían un aumento drástico no descrito hasta el momento de la citotoxicidad en comparación con el ARN de CMVpp65standard (figura 6). También en este caso se observó, sorprendentemente, una superioridad de los inmunógenos modificados con respecto a los péptidos pp65 solapantes.

Ejemplo 3: Estimulación de linfocitos T CD8+ indiferenciados por antígenos de fusión de HLA

A fin de evaluar la posibilidad de cebado y posterior expansión de linfocitos CD8+ indiferenciados por los constructos de fusión según la presente invención, se transfectaron células dendríticas de un donante negativo a CMV con ARN de CMVpp65 sin modificar o con ARN de CMVpp65-TM1 o con un ARN de control (NY-Eso-1). Las células dendríticas transfectadas se utilizaron para estimular linfocitos CD8+ autólogos. Se llevaron a cabo 2 reestimulaciones con células dendríticas transfectadas congeladas en intervalos semanales. Para la lectura, el día 21 después de la primera estimulación, todas las poblaciones de células se sometieron a un ensayo ELISPOT de IFN-y contra células dendríticas autólogas cargadas con péptidos pp65 solapantes o, como control, con péptidos solapantes irrelevantes. En este caso, se puso de manifiesto que se habían generado poblaciones de linfocitos T CD8+ reactivas a pp65 mediante la estimulación con ARN de CMVpp65-TM1 en dos casos (figura 9). Las estimulaciones con las células dendríticas transfectadas con el ARN de CMVpp65 sin modificar o con ARN de control, en cambio, no mostraron ninguna reactividad significativa a pp65.

Ejemplo 4: Utilización de antígenos de fusión de HLA para estimular linfocitos T reactivos a células tumorales

Con el fin de poder expandir los linfocitos T CD8+ y CD4+ contra antígenos tumorales definidos, se clonaron las siguientes secuencias de antígenos como insertos en constructos de fusión según la presente invención: el antígeno tumoral TPTE (Koslowski et al, 2004, PMID 15342378), el antígeno tumoral PRAME (Ikeda et al, 1997, PMID 9047241) en la variante 1 (SEC ID nº: 43), el antígeno tumoral WT1 como variante C (SEC ID nº: 44) y el antígeno tumoral p53 (SEC ID nº: 45). Para la validación funcional, se transfectaron células dendríticas humanas de un donante positivo a HLA* A 0201 con ARN de WT1-HLA-TM1, con ARN de WT1 sin modificar o con un ARN de control irrelevante, y se utilizaron como células diana. Tras la coincubación con clones de linfocitos T CD8+ reactivas a WT1 durante 8 o 16 horas, se cuantificó el IFN-y en el sobrenadante. Se observó que la secreción era mayor en un factor de 6 a 9 después de la coincubación con células dendríticas transfectadas con WT1-HLA-TM1 en comparación con la coincubación después de la transfección con WT1 sin modificar.

En una serie de experimentos, se obtuvieron los siguientes resultados generales, que se confirmaron varias veces:

• Los inmunógenos modificados conducen a una estimulación y expansión significativamente mayores de los linfocitos CD4+ específicos de antígeno (aumento de la proliferación de linfocitos CD4+)

•: Los inmunógenos modificados conducen a una estimulación y expansión significativamente mayores de los linfocitos CD8+ específicos de antígeno (aumento de la proliferación de linfocitos CD8+)

•: Los inmunógenos modificados conducen a una liberación de citocinas significativamente mayor de los linfocitos CD4+ y CD8+ específicos de antígeno (aumento de la liberación de citocinas = mayor activación)

•: Los inmunógenos modificados conducen a una reactividad citotóxica significativamente mayor de los linfocitos CD8+ específicos de antígeno (aumento del efecto citotóxico)

•: Los inmunógenos modificados son 100 veces más potentes en relación con la expansión de los linfocitos CD8+ específicos de antígeno

•: Los inmunógenos modificados tienen un mayor efecto sobre la expansión de los linfocitos CD4+ específicos de antígeno que los inmunógenos estándar, incluso en una dosis 100 veces menor

En resumen, por lo tanto, se puede decir que las modificaciones de un antígeno según la presente invención conducen a una potencia más de 100 veces mayor (desplazamiento hacia la izquierda en la curva de dosis-efecto) y a un aumento drástico de la actividad biológica. En comparación con las secuencias de antígenos sin modificar habituales hasta la fecha, es posible generar un inmunógeno con una eficacia como vacuna cuantitativa y cualitativamente mayor.

Un resultado importante de la presente invención es que los linfocitos CD4+ y CD8+ específicos de antígeno se estimulan de manera óptima y se expanden simultáneamente. La estimulación de los linfocitos CD8+ y CD4+ es crucial para la eficacia, en particular, de las vacunas terapéuticas.

Listado de secuencias

<110> Johannes Gutenberg-Universität Mainz, vertreten durch den Präsidenten

<120> Vacunas recombinantes y utilización de las mismas

<130> 410-1PCT

<150> DE 103 47 710.1

<151> 2003-10-14

<160> 45

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 78

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 168

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210>: 4 10 <211> 55

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210>: 5 20 <211> 129

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 42 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 24

<212> ADN 40 <213> Secuencia artificial

<400> 7

ctgcaggtcg actctagagg atcc 24

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 8

<210> 9

<211> 1683

<212> ADN

<213>: Citomegalovirus 15

<400> 9

<210> 10

<211> 561

<212> PRT

<213> Citomegalovirus

<400> 10

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<210> 12

<211> 653

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 12

<210> 13

<211> 1923

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<400> 13

<210> 14

<211> 640

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400> 14

<210> 15

<211> 66

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 24

<212> PRT

<213>: Homo sapiens 10

<400>: 11 10

<400> 16

15 <210> 17

<211> 63

<212> PRT

<213> Homo sapiens

20 <400> 17

25 <210> 18

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

30 <400> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20

<211> 14

<212> PRT 10 <213> Homo sapiens

<400> 20

<210> 21

<211> 62

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20

<400> 21

25 <210> 22

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

30 <400> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

<210> 24

<211> 27

<212> PRT

<213>: Homo sapiens 10

<400> 24

<210> 25

<211> 37

<212> PRT

<213>: Homo sapiens 20

<400> 25

25 <210> 26

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

30 <400> 26

<210> 27 35 <211> 38

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

<210> 28

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

<210> 29

<211> 37

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 29

<210> 30

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25

<400> 30

30 <210> 31

<211> 31

<212> PRT

<213> Homo sapiens

35 <400> 31

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32 45

<210> 33

<211> 37

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

<210> 34

<211> 12 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

<210> 35

<211> 33

<212> PRT 25 <213> Homo sapiens

<400> 35

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens 35

<400> 36

40 <210> 37

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

45 <400> 37

<210> 38

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

10 <210> 39

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 39

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

<210> 41

<211> 30 30 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 41

<210> 42

<211> 10

<212> PRT 40 <213> Homo sapiens

<400> 42

<210> 43

<211> 1527

<212> ADN

<213> Homo sapiens 50

<400> 43

<210> 44

<211> 1296

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 44

<210> 45

<211> 1179

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 45

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Molécula de fusión que comprende un antígeno, una región transmembranaria y la región citoplásmica de una cadena de una molécula de MHC, en la que la molécula de fusión no comprende ninguno de los siguientes: (i) dominios a1, a2 y a3 de la cadena a de una molécula de MHC de clase I, (ii) 2-microglobulina de una molécula de MHC de clase I, (iii) dominios a1 y a2 de la cadena a de una molécula de MHC de clase II y (iv) dominios 1 y 2 de la cadena de una molécula de MHC de clase II.
2.

Molécula de fusión según la reivindicación 1, en la que la región transmembranaria es una región transmembranaria de una molécula de MHC.
3.

Molécula de fusión según la reivindicación 1 o 2, en la que la región transmembranaria y la región citoplásmica comprenden una secuencia que corresponde a la región transmembranaria unida a la región citoplásmica de una molécula de MHC.
4.

Molécula de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la molécula de fusión comprende además una secuencia líder que puede controlar la translocación de una proteína o péptido a través de una membrana.
5.

Molécula de fusión según la reivindicación 4, en la que la secuencia líder es una secuencia líder de una molécula de MHC.
6.

Molécula de fusión según la reivindicación 4 o 5, en la que la molécula de fusión presenta la disposición siguiente: extremo N - secuencia líder/antígeno/región transmembranaria/región citoplásmica - extremo C, en la que las regiones individuales pueden estar separadas opcionalmente entre sí mediante secuencias conectoras.
7.

Ácido nucleico que codifica una molécula de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8.

Célula hospedadora que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 7.
9.

Composición farmacéutica que comprende una o más moléculas de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o uno o más ácidos nucleicos según la reivindicación 7 y/o una o más células hospedadoras según la reivindicación 8.
10.

Composición farmacéutica según la reivindicación 9 en forma de vacuna.
11.

Método in vitro para aumentar la cantidad de complejos MHC/péptido en una célula, en el que el método comprende la provisión de una o más moléculas de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o de uno

o más ácidos nucleicos según la reivindicación 7 para la célula.
12.

Utilización de una o más moléculas de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o de uno o más ácidos nucleicos según la reivindicación 7 para la preparación de una composición farmacéutica para aumentar la cantidad de complejos MHC/péptido en una célula.
13.

Método in vitro para aumentar la presentación de moléculas de superficie celular sobre las células que pueden presentar antígenos, particularmente linfocitos B y macrófagos, en el que el método comprende la provisión de una o más moléculas de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o de uno o más ácidos nucleicos según la reivindicación 7 para las células.
14.

Utilización de una o más moléculas de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o de uno o más ácidos nucleicos según la reivindicación 7 para la preparación de una composición farmacéutica para aumentar la presentación de moléculas de superficie celular sobre las células que pueden presentar antígenos, particularmente linfocitos B y macrófagos.
15.

Método según la reivindicación 11 o 13, o utilización según la reivindicación 12 o 14, en los que el aumento de la cantidad de complejos MHC/péptido o el aumento de la presentación de moléculas de superficie celular incrementa, a su vez, la activación primaria de los linfocitos T, particularmente de los linfocitos CD4+ y CD8+, que responden al antígeno.
16.

Utilización de una o más moléculas de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o de uno o más ácidos nucleicos según la reivindicación 7 y/o de una o más células hospedadoras según la reivindicación 8 para la preparación de una composición farmacéutica para inducir una respuesta inmunitaria en un ser vivo.
17.

Método in vitro para estimular o activar los linfocitos T, particularmente los linfocitos CD4+ y CD8+, en el que el método comprende la provisión para los linfocitos T de una o más moléculas de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o de uno o más ácidos nucleicos según la reivindicación 7 y/o de una o más células

hospedadoras según la reivindicación 8.
18.

Utilización de una o más moléculas de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o de uno o más ácidos nucleicos según la reivindicación 7 y/o de una o más células hospedadoras según la reivindicación 8 para la

5 preparación de una composición farmacéutica para estimular o activar los linfocitos T, particularmente los linfocitos CD4+ y CD8+, en un ser vivo.
19. Utilización de una o más moléculas de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o de uno o más

ácidos nucleicos según la reivindicación 7 y/o de una o más células hospedadoras según la reivindicación 8 para la 10 preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento, la vacunación o la inmunización de un ser vivo.