JP2022546384A - 免疫耐性エラスチン様組換ペプチドおよび使用方法 - Google Patents
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Abstract
本明細書において、ＩｇＧ結合ドメインと融合されている一つ以上の相同性アミノ酸反復を含む組換ポリペプチドが開示される。組換ポリペプチドは、治療用抗体に結合され、送達ビヒクルを使用して、保持時間を長くし、治療用抗体の全身関連副作用を減少することができる。また、治療用抗体に結合されている組換ポリペプチドを含む医薬組成物および癌の治療のために患者にそれを投与する方法が本明細書に開示される。【選択図】図１Ａ
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月２３日に出願された米国仮出願第６２／８９０，９３６号の出願日の利益を主張する。先に出願されたこの出願の内容は、参照により本明細書にその全体が組み込まれる。
本出願は、２０１９年８月２３日に出願された米国仮出願第６２／８９０，９３６号の出願日の利益を主張する。先に出願されたこの出願の内容は、参照により本明細書にその全体が組み込まれる。
配列表の組み込み
本出願は、出願の出願と同時にＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、ファイル名２１１０１＿０３７８Ｐ１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇを含み、６５，５３６バイトのサイズであり、２０２０年５月２９日に作成され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、出願の出願と同時にＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、ファイル名２１１０１＿０３７８Ｐ１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇを含み、６５，５３６バイトのサイズであり、２０２０年５月２９日に作成され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
免疫チェックポイント抗体は、様々な癌を治療するために使用することができる。今日まで、利用可能な臨床免疫チェックポイント抗体は静脈内投与される。免疫チェックポイント抗体の全身投与は、播種性腫瘍の制御に有効である。しかしながら、腫瘍が局所領域に限定される場合、全身抗体治療は効率的ではなく、副作用に関連していることが多い。このような場合、免疫チェックポイント抗体の局所送達は、治療有効性を増加させ、副作用を低減することによって利益を提供し得る。しかしながら、送達システムがない場合、局所的に投与された抗体は、局所領域において短い保持時間および全身循環への高い曝露の対象となる。これらの課題は、局所免疫チェックポイント抗体治療を期待ほど見込みの低いものにしている。したがって、免疫チェックポイント抗体を局所的に送達する代替方法が必要である。
本明細書において、相同性アミノ酸反復配列を含む組換ポリペプチドが開示され、相同性アミノ酸反復配列と少なくとも７５％のアミノ酸配列を有し、相同性アミノ酸反復配列は以下を有する：Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ（配列番号１）；Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号２）；Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ（配列番号３）；Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ（配列番号４）；Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ（配列番号５）；Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号６）；Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号７）；Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号８）；Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号９）；Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ（配列番号１０）；Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ（配列番号１１）；Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号１２）；Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号１４）；またはＧｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号１５）；およびＩｇＧ結合ドメイン。
本明細書において、対象における治療剤の有効性を増加しまたは治療剤の半減期を増加させる方法が開示され、方法は組換ポリペプチドに抱合されている治療剤を対象に投与することを含み、組換ポリペプチドは、ＩｇＧ結合ドメインに共有結合されている相同性アミノ酸反復配列を含み、治療剤は、ＩｇＧ結合ドメインに非共有結合的に抱合されており、抱合体は直接投与によって投与され、それによって治療剤の有効性または半減期が増加する。
本開示は、本発明の以下の詳細な説明、本明細書に含まれる図面および実施例を参照することによって、より容易に理解することができる。
本発明の方法および組成物が開示および記載される前に、別段の指定がない限り、特定の合成方法に限定されないことが理解され、または別段の指定がない限り、特定の試薬に限定されないことが理解され、当然のことながら変化し得る。本明細書で使用される用語は、特定の態様のみを説明するためにあり、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、例示的な方法および材料はここで説明される。
さらに、別段の明示的な言及がない限り、本明細書に記載のいずれの方法も、その工程が特定の順序で実施されることを要求していると解釈されることは決して意図されていない。従って、方法の請求項が、その工程が従うべき順序を実際に列挙していない場合、または工程が特定の順序に限定されることを特許請求の範囲または説明において別途具体的に記載されていない場合、いかなる点においても、順序が推測されることは決して意図されていない。これは、工程の配設または操作フローに関する論理的な問題、文法的な構成または句読点に由来する平易な意味、明細書に記載の態様の数またはタイプを含む、解釈のためのあらゆる可能性のある不明確な根拠にも当てはまる。
本明細書に言及される全ての刊行物は、その刊行物が引用されることに関連して、方法および／または材料を開示し記述するために、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記述された刊行物は、本出願の出願日に先行してこれらの開示のためにのみ提供される。本明細書のいかなることも、本発明が先行発明によってかかる公表に先行する権利を有しないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、本明細書に提供される公表日は、実際の公表日と異なっている可能性があり、これは独立した確認を必要とする場合がある。
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈によって明確に別の規定が示されない限り、複数の参照を含む。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈によって明確に別の規定が示されない限り、複数の参照を含む。
本明細書で使用される「または」という語は、特定のリストのうちの任意の一つのメンバーを意味し、またそのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。
本明細書において、範囲は「約」または「およそ」一つの特定の値からおよび／または「約」または「およそ」別の特定の値までであるとして表現することができる。こうした範囲が表現される場合、さらなる態様は、ある特定の値からおよび／またはもう一方の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表現される場合、先行する「約」または「およそ」の使用によって、特定の値がさらなる態様を形成することが理解されるであろう。範囲の各々の端点は、他の端点との関連において、および他の端点とは独立して、重要であることがさらに理解されるであろう。また、本明細書に開示されるいくつかの値があり、各値も、値自体に加えて、その特定の値について「約」として本明細書に開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「約１０」も開示されている。当然のことながら、二つの特定の単位間の各単位も開示されている。例えば、１０および１５が開示される場合、１１、１２、１３および１４も開示される。
本明細書で使用される「任意選択的」または「任意選択的に」という用語は、後に説明される事象または状況が生じる場合もあり、または生じない場合もあることを意味し、また、その説明が先述の事象または状況が生じる事例および生じない事例を含むことを意味する。
本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、対象からの組織または臓器、細胞（対象内、対象から直接採取された、または培養もしくは培養細胞株から維持された細胞のいずれか）、細胞可溶化物（または可溶化物分画）または細胞抽出物、または本明細書に記載されるようにアッセイされた細胞もしくは細胞材料（例えばポリペプチドまたは核酸）に由来する一つ以上の分子を含有する溶液を意味する。試料はまた、細胞または細胞成分を含有する任意の体液または排泄物（例えば、限定されないが、血液、尿、便、唾液、涙、胆汁）であってもよい。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、投与の標的、例えば、ヒトを指す。したがって、本開示の方法の対象は、哺乳類、魚、鳥類、虫類または両生類などの脊椎動物であることができる。「対象」という用語はまた、家畜動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）および実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ショウジョウバエなど）も含む。一態様では、対象は哺乳類である。別の態様では、対象はヒトである。この用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。したがって、成人、小児、青年および新生児の対象、ならびに胎児は、雌雄にかかわらず、網羅されることが意図される。
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、疾患または障害に罹患した対象を指す。「患者」という用語は、ヒトおよび獣医学対象を含む。本開示の方法の一部の態様では、「患者」は癌と診断されている。本開示の方法の一部の態様では、「患者」は、例えば、その患者に治療剤を投与する前に、癌の治療を必要とする者として特定されている。
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、「～からなる」および「本質的に～からなる」態様を含み得る。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」および「アミノ酸同一性」という用語は、開示されるバリアント、ペプチドまたは断片のいずれかにありうる、２０個の天然アミノ酸または任意の非天然類似体のうちの一つを指す。したがって、本明細書で使用される場合、「アミノ酸」は、天然アミノ酸および合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明の目的のためにアミノ酸とみなされる。「アミノ酸」はまた、プロリンおよびヒドロキシプロリンなどのアミノ酸残基を含む。側鎖は、（Ｒ）構成または（Ｓ）構成のいずれかであってもよい。非天然側鎖を使用する場合、非アミノ酸置換基を使用して、例えば、インビボでの分解を防止または遅延させることができる。
「断片」という用語は、参照ペプチドと実質的に同一であり、参照の生物学的活性を保持する、ペプチドの一部分（例えば、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０などアミノ酸）を指すことができる。一部の態様では、断片または部分は、本明細書に記載の参照ペプチドの生物活性の少なくとも５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％を保持する。さらに、参照されるペプチドの断片は、参照されるポリペプチドの連続部分または連続部分であってもよい（例えば、１０アミノ酸長のペプチドの断片は、そのペプチド内の任意の２～９個の連続残基であってもよい）。
「バリアント」は、何らかの方法で、Ｎ末端および／またはＣ末端のアミノ酸残基の単なる欠失以外の参照配列における差を意味することができる。バリアントがアミノ酸残基の置換を含む場合、置換は保存的または非保存的とみなすことができる。保存的置換は、以下のグループ内の置換である：Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＣｙｓ；Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＶａｌ；ＧｌｕおよびＡｓｐ；ＬｙｓおよびＡｒｇ；Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ；ならびにＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ＡｓｐおよびＨｉｓ。バリアントは、少なくとも一つの置換および／または少なくとも一つの追加を含んでもよく、また少なくとも一つの欠失であってもよい。バリアントはまた、一つ以上の非天然残基を含み得る。例えば、バリアントは、システインの代わりに任意の位置に、セレノシステイン（例えば、セレノ－Ｌ－システイン）を含んでもよい。他の多くの“非天然”アミノ酸置換物は、当技術分野で公知であり、市販の供給源から入手可能である。非天然由来のアミノ酸の例としては、Ｄ－アミノ酸、システインの硫黄原子に付加されたアセチルアミノメチル基を有するアミノ酸残基、ペグ化アミノ酸および式ＮＨ２（ＣＨ２）nＣＯＯＨのオメガアミノ酸が挙げられるが、式中、ｎは、２～６個の中性、非極性アミノ酸、例えばサルコシン、ｔ－ブチルアラニン、ｔ－ブチルグリシン、Ｎ－メチルイソロイシンおよびノルロイシンなどのアミノ酸である。フェニルグリシンは、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅの代わりになることができ、シトルリンおよびメチオニンスルホキシドは中性非極性であり、システイン酸は酸性であり、オルニチンは塩基性である。プロリンは、ヒドロキシプロリンで置換されてもよく、プロリンの特性を付与する立体構造を保持してもよい。
本明細書で使用される場合、「ｉＴＥＰ」という用語は、免疫寛容、エラスチン様ポリペプチドを指す。ｉＴＥＰは、以前に開示されたエラスチン様ポリペプチドと異なる可能性がある（ＥＬＰと呼称され、ＥＬＰは、Ｄ．Ｍ．Ｆｌｏｓｓら、Ｅｌａｓｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｉｚｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８（１）（２０１０）３７－４５；およびＴ．Ｋｏｗａｌｃｚｙｋら、Ｅｌａｓｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０（８）（２０１４）２１４１－５２）に記載されるＥＬＰとして言及される）。ｉＴＥＰは相転移特性を有し、免疫寛容である。本明細書に開示されるｉＴＥＰ配列は、例えば、２０～１２０回反復することができ、ＩｇＧ結合ドメインに融合されて本明細書に開示される一つ以上の組換ポリペプチドを形成することができる相同性アミノ酸配列と称することができる。一部の態様では、ｉＴＥＰ配列は、リンカーを介してＩｇＧ結合ドメイン（例えば、ＩＢＤ）に融合することができる。一部の態様では、「ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチド」という用語は、ｉＴＥＰ配列とＩＢＤとの間のリンカー配列を包含する。
序文
モノクローナル抗体（例えば、ＩｇＧ）は、医学において広く使用されている。標的組織内の治療用ＩｇＧの分布を制限することがしばしば望まれ、これは、治療用ＩｇＧの他の組織および細胞への曝露を低減する一方で、標的細胞へのＩｇＧのバイオアベイラビリティを増加させるためである。ＩｇＧを他の組織や細胞に曝露すると、副作用が生じることが多い。標的組織内のＩｇＧの分布および蓄積を増加させるために、ＩｇＧは組織に直接注入されている。しかしながら、注入されたＩｇＧは、組織外に急速に拡散する。本明細書では、組織におけるＩｇＧの保持時間および保持量を増加させるための組成物および方法が開示される。本明細書に開示される組換ポリペプチドおよび組成物は、免疫寛容なエラスチン様ペプチド（ｉＴＥＰ）およびＩｇＧ結合ドメインを含み得る。一部の態様では、組換ポリペプチドは、相同性アミノ酸反復（例えば、「Ｐａｃｅｄ ＩｇＧ Ｅｍｉｔｔｅｒ」または「ＰＩＥ」と呼ぶことができるｉＴＥＰおよびＩｇＧ結合ドメイン）を含む。本明細書に記載の組換ポリペプチドおよび組成物は、体内でコアセルベートを形成してもよく、これは生理的温度によって駆動させることができる。コアセルベートは、コアセルベートが形成される組織内にＩｇＧを貯蔵するために使用することができる。本明細書に開示される組換ポリペプチド、組成物および方法は、二つの要素：ｉＴＥＰ（本明細書において相同性アミノ酸反復配列とも呼ばれる）から集められたコアセルベートおよびＩｇＧに結合するように使用することができるポリペプチド、融合ポリペプチドまたは組換ポリペプチドを形成するようにｉＴＥＰに付着することができるＩｇＧ結合ドメインを有することができる。機能的には、本明細書に開示される融合ポリペプチドまたは組換ポリペプチドに結合されたＩｇＧの保持または治療用ＩｇＧの本明細書に開示される融合ポリペプチドもしくは組換ポリペプチドの放出は、以下の要因に限定されないが、少なくとも、ｉＴＥＰ（または相同性アミノ酸反復配列）の配列／疎水性、本開示の組換ポリペプチドにおけるＩｇＧと相同性アミノ酸反復との間の比および相同性アミノ酸反復配列間の架橋の状態によって決定することができる。架橋の状態および疎水性は組換ポリペプチドの安定性を決定することもできる。これらの要因を調節することによって様々な組換ポリペプチドを設計、生成することができ、本明細書に記載される。
モノクローナル抗体（例えば、ＩｇＧ）は、医学において広く使用されている。標的組織内の治療用ＩｇＧの分布を制限することがしばしば望まれ、これは、治療用ＩｇＧの他の組織および細胞への曝露を低減する一方で、標的細胞へのＩｇＧのバイオアベイラビリティを増加させるためである。ＩｇＧを他の組織や細胞に曝露すると、副作用が生じることが多い。標的組織内のＩｇＧの分布および蓄積を増加させるために、ＩｇＧは組織に直接注入されている。しかしながら、注入されたＩｇＧは、組織外に急速に拡散する。本明細書では、組織におけるＩｇＧの保持時間および保持量を増加させるための組成物および方法が開示される。本明細書に開示される組換ポリペプチドおよび組成物は、免疫寛容なエラスチン様ペプチド（ｉＴＥＰ）およびＩｇＧ結合ドメインを含み得る。一部の態様では、組換ポリペプチドは、相同性アミノ酸反復（例えば、「Ｐａｃｅｄ ＩｇＧ Ｅｍｉｔｔｅｒ」または「ＰＩＥ」と呼ぶことができるｉＴＥＰおよびＩｇＧ結合ドメイン）を含む。本明細書に記載の組換ポリペプチドおよび組成物は、体内でコアセルベートを形成してもよく、これは生理的温度によって駆動させることができる。コアセルベートは、コアセルベートが形成される組織内にＩｇＧを貯蔵するために使用することができる。本明細書に開示される組換ポリペプチド、組成物および方法は、二つの要素：ｉＴＥＰ（本明細書において相同性アミノ酸反復配列とも呼ばれる）から集められたコアセルベートおよびＩｇＧに結合するように使用することができるポリペプチド、融合ポリペプチドまたは組換ポリペプチドを形成するようにｉＴＥＰに付着することができるＩｇＧ結合ドメインを有することができる。機能的には、本明細書に開示される融合ポリペプチドまたは組換ポリペプチドに結合されたＩｇＧの保持または治療用ＩｇＧの本明細書に開示される融合ポリペプチドもしくは組換ポリペプチドの放出は、以下の要因に限定されないが、少なくとも、ｉＴＥＰ（または相同性アミノ酸反復配列）の配列／疎水性、本開示の組換ポリペプチドにおけるＩｇＧと相同性アミノ酸反復との間の比および相同性アミノ酸反復配列間の架橋の状態によって決定することができる。架橋の状態および疎水性は組換ポリペプチドの安定性を決定することもできる。これらの要因を調節することによって様々な組換ポリペプチドを設計、生成することができ、本明細書に記載される。
標的組織においてＩｇＧ保持を増加させる他の方法に比べて、治療剤（例えば治療用抗体またはＩｇＧ）を送達するために本明細書に記載の組換ポリペプチドおよび組成物を使用する利点は、以下に限定されないが、第一に、本明細書に記載の組換ポリペプチドを使用するためにＩｇＧ（例えば治療剤または治療用抗体）を改変する必要がないことが挙げられ、他の方法ではＩｇＧの改変を必要とし、調製手順に少なくとも一つ以上の工程を加える。さらに、ＩｇＧの改変は、ＩｇＧの機能を損なうことがある。第二に、ｉＴＥＰまたは相同性アミノ酸反復およびＩｇＧ結合ドメインの融合は、単一の組換えタンパク質として生成することができる。融合タンパク質は、優れた均質性、再現性およびスケーラビリティを有する。第三に、ＩｇＧの保持時間を決定することができるＩｇＧに結合された組換ポリペプチドの安定性を容易に調節することができる。したがって、ＩｇＧに結合された組換ポリペプチドは、ＩｇＧの放出動態を制御または多様化できるように生成することができる。
ＩｇＧに結合された組換ポリペプチドを使用して、長期間にわたって一つ以上の特定の組織に保持されることが所望される任意の治療用または診断用ＩｇＧを送達することができる。ＩｇＧの例として、限定されないが、イピリムマブおよびニボルマブなどの癌免疫チェックポイント阻害剤が挙げられる。薬剤は、例えば、癌治療における適用および有効性を有する。しかしながら、これらの薬剤と、癌治療に無関係な免疫細胞との相互作用によって引き起こされる副作用によって、これらの使用は妨げられている。
免疫チェックポイント抗体は、最も急速に成長している新薬開発の領域の一つである。２０１８年末までに、７種類の免疫チェックポイント抗体が米国食品医薬品局によって承認されており、ペムブロリズマブ、ニボルマブおよびＰＤ－１を標的とするセミプリマブ（（Ｒ．Ｍ．Ｐｏｏｌｅ、Ｄｒｕｇｓ７４（１６）（２０１４）１９７３－８１；Ｅ．Ｄ．Ｄｅｅｋｓ、Ｄｒｕｇｓ７４（１１）（２０１４）１２３３－９；およびＡ．Ｍａｒｋｈａｍ、Ｓ．Ｄｕｇｇａｎ、Ｄｒｕｇｓ７８（１７）（２０１８）１８４１－６）、アテゾリズマブ、 アベルマブおよびＰＤ－Ｌ１を標的とするデュルバルマブ（Ａ．Ｍａｒｋｈａｍ、Ｄｒｕｇｓ７６（１２）（２０１６）１２２７－３２；Ｅ．Ｓ．Ｋｉｍ、Ｄｒｕｇｓ７７（８）（２０１７）９２９－３７；Ｙ．Ｙ．Ｓｙｅｄ、Ｄｒｕｇｓ７７（１２）（２０１７）１３６９－７６）およびＣＴＬＡ－４を標的とするイピリムマブ（Ｆ．Ｃａｍｅｒｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇｓ ７１（８）（２０１１）１０９３－１０４）が挙げられる。これらの抗体の適応症は、黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、尿路上皮がん、リンパ腫などを対象とする（Ｋ．Ｍ．Ｈａｒｇａｄｏｎら、Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐａｒｍａｃｏｌ６２（２０１８）２９－３９）。臨床実践において、免疫チェックポイント抗体は、静脈内注入を介して患者に投与される。静脈内注入後、抗体は全身血液循環に入り、そこを通過して、抗体は疾患部位に作用すると予想される（Ｅ．Ｄ．Ｌｏｂｏら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ９３（１１）（２００４）２６４５－６８）。免疫チェックポイント抗体の静脈内注入などの全身投与は、血液癌などの播種性疾患の治療に適している（Ｅ．Ｊａｂｂｏｕｒら、Ｂｌｏｏｄ１２５（２６）（２０１５）４０１０－６）。しかしながら、腫瘍が特定の領域に限定される場合、免疫チェックポイント抗体の全身投与に関連する課題がある。第一に、血流の悪さ、間隙流体圧の上昇および抗体が血液循環から固形腫瘍に接近することを制限することができる密な細胞外マトリックスなどの生理学的関門があり（Ｇ．Ｍ．Ｔｈｕｒｂｅｒら、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ６０（１２（２００８）１４２１－３４；およびＭ．Ｔａｂｒｉｚｉら、ＡＡＰＳ Ｊ１２（１）（２０１０）３３－４３）、そのため腫瘍部位における抗体の局所的バイオアベイラビリティを制限する（Ｃ．Ｆ．Ｍｏｌｔｈｏｆｆら、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ６５（５）（１９９２）６７７－８３；Ｌ．Ｔ．Ｂａｘｔｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ５４（６）（１９９４）１５１７－２８；およびＣ．Ｍ．Ｌｅｅ、Ｉ．Ｆ．Ｔａｎｎｏｃｋ、ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １０（２０１０）２５５）。静脈内注射された抗体の腫瘍蓄積は、マウスにおける腫瘍のグラム当たりの注射用量の約１％～２５％である（Ｃ．Ｆ．Ｍｏｌｔｈｏｆｆら、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ６５（５）（１９９２）６７７－８３；およびＡ．Ａ．Ｅｐｅｎｅｔｏｓら、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ４６（１）（１９８２）１－８）。ヒト患者における蓄積ははるかに低く、腫瘍のグラム当たり注射用量の約０．００２％～０．０３％である（Ａ．Ａ．Ｅｐｅｎｅｔｏｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ４６（６）（１９８６）３１８３－９１；およびＭ．Ｒ．Ｂｕｉｓｔら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ６４（２）（１９９５）９２－８）。免疫チェックポイント抗体の限られた腫瘍バイオアベイラビリティは、最適以下の治療効果をもたらす。メタアナリシスは、進行固形腫瘍を有する患者における抗ＰＤ－１および抗ＰＤ－Ｌ１の全体的な奏効率が２１％であることを示した（Ａ．Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ－Ｇｏｎｚａｌｅｚら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ９（９）（２０１８）８７０６－１５）。前臨床研究（Ａ．Ｒ．Ｎｉｋｐｏｏｒら、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ１３（８）（２０１７）２６７１－８２；およびＴ．Ｈ．Ｓｈｉｎら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ１３（３）（２０１４）６５１－６１）によって証明されるように、治療用抗体の腫瘍蓄積を増加させることは、抗腫瘍有効性を促進すると思われる。第二に、全身投与される免疫チェックポイント抗体は、血液循環を介して健康な組織に行く可能性があり、これは望ましくない有害作用をもたらす可能性がある（Ｍ．Ａ．Ｐｏｓｔｏｗら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ３７８（２）（２０１８）１５８－６８；およびＪ．Ｍ．Ｍｉｃｈｏｔら、Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ５４（２０１６）１３９－４８）。例えば、黒色腫患者の５５％が抗ＰＤ－１抗体および抗ＣＴＬＡ－４抗体の併用療法を受けていたときに、グレード３～４の副作用を経験した。副作用は非常に重篤であり、患者の３６．４％が治療を中止しなければならなかった（Ｊ．Ｌａｒｋｉｎら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ３７３（１）（２０１５）２３－３４）。抗ＣＴＬＡ－４抗体の副作用は、用量依存性であるように見えた。グレード３以上の副作用は、１０ｍｇ／ｋｇのイピリムマブで治療を受けた患者の３７％、３ｍｇ／ｋｇのイピリムマブで治療を受けた患者の１８％で見られた（Ｊ．Ｄ．Ｗｏｌｃｈｏｋら、Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ１１（２）（２０１０）１５５－６４）。正常な臓器において免疫ホメオスタシスを妨害することによって、免疫チェックポイント抗体は臓器特異的毒性を引き起こす可能性がある。一般的に影響を受ける臓器および組織として、肝臓、肺、皮膚、消化管、内分泌腺および血液系が挙げられる（Ａ．Ｗｉｎｅｒら、Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｄｉｓ１０（Ｓｕｐｐｌ３）（２０１８）Ｓ４８０－９；およびＦ．Ｍａｒｔｉｎｓら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２０１９））。第三に、免疫チェックポイント抗体の全身投与は、治療のコスト高に関連する。例えば、抗体濃度は、静脈内注入を介して血液循環に入った後、かなり希釈される。疾患部位で治療濃度を達成するためには、患者は高用量の抗体を投与されなければならず、これは部分的に抗体治療を高額なものにする（Ａ．Ｆ．Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ、ＢＭＪ３４５（２０１２）ｅ８３４６）。
これらの抗体の全身投与という課題を考えると、免疫チェックポイント抗体の局所投与は、局所的腫瘍を治療するためのいくつかの利点をもたらすことができる（Ｍ．Ｆ．Ｆｒａｎｓｅｎら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ１９（１９）（２０１３）５３８１－９；Ａ．Ｍａｒａｂｅｌｌｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ１２３（６）（２０１３）２４４７－６３；Ｉ．Ｓａｇｉｖ－Ｂａｒｆｉら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ１０（４２６）（２０１８）；Ｖ．Ｈｕｙｎｈら、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ２０（６）（２０１９）７４７－５３；Ｌ．Ｃ．Ｓａｎｄｉｎら、Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３（１）（２０１４）ｅ２７６１４；およびＬ．Ｃ．Ｓａｎｄｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ２（１）（２０１４）８０－９０）。局所的疾患については、疾患部位への抗体の直接注射が局所的バイオアベイラビリティを増加させることができる（Ｒ．Ｇ．Ｊｏｎｅｓ、Ａ．Ｍａｒｔｉｎｏ、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３６（３）（２０１６）５０６－２０）。疾患部位における高濃度の抗体を達成することができ、それゆえ、治療効果を増加させることができる（Ｋ．Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ５２（２２）（１９９２）６３２３－８；およびＡ．Ｄ．Ｓｉｍｍｏｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ５７（８）（２００８）１２６３－７０）。バイオアベイラビリティの増加によって、局所投与は全身投与に比べてはるかに低用量の抗体を使用する。前臨床試験では、マウスにおける原発性腫瘍への免疫チェックポイント抗体の直接注射は、静脈内注射と同じ、またはさらに優れた抗腫瘍効果を達成することができる（Ａ．Ｍａｒａｂｅｌｌｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ１２３（６）（２０１３）２４４７－６３）。局所注射に必要な免疫チェックポイント抗体の用量は、静脈内注射に必要な用量の約１％であった。局所注射に必要な低用量の抗体は、抗体治療のコスト高を減少することができる（Ｄ．Ｗ．Ｇｒａｉｎｇｅｒ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ４（７）（２００４）１０２９－４４）。低用量の抗体が疾患部位に直接注射されるため、健康な組織への抗体の曝露は減少する可能性が高い。したがって、局所抗体注射は、副作用のリスクも低下させることができる（Ａ．Ｄ．Ｓｉｍｍｏｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、５７（８）（２００８）１２６３－７０；Ａ．Ｍａｒａｂｅｌｌｅら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ１９（１９）（２０１３）５２６１－３；Ｂ．Ｋｗｏｎｇら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ３２（２２）（２０１１）５１３４－４７；Ｂ．Ｋｗｏｎｇ，Ｓ．Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ７３（５）（２０１３）１５４７－５８）。
動物実験の結果から、患者における免疫チェックポイント抗体の局所注射の臨床的利益を評価するために、臨床試験が開始された。切除不能な黒色腫を有する患者において、イピリムマブおよびインターロイキン－２の腫瘍内注射を評価した（ＮＣＴ０１６７２４５０）。腫瘍内イピリムマブおよび局所放射線療法は、再発性黒色腫、非ホジキンリンパ腫、結腸癌および直腸癌を有する患者に適用された（ＮＣＴ０１７６９２２２）。第Ｉ／ＩＩ相試験では、Ｂ細胞リンパ腫を有する患者に対する放射線療法と組み合わせた腫瘍内イピリムマブおよびｔｏｌｌ様受容体９作動薬を評価した（ＮＣＴ０２２５４７７２）。理論上、腫瘍内免疫チェックポイント抗体は、腫瘍内注射にアクセス可能な任意の原発腫瘍に適用することができる。しかしながら、転移性腫瘍を治療するために、腫瘍内免疫チェックポイント抗体は、全身抗腫瘍免疫を誘導することができるはずである。動物実験において、腫瘍内免疫チェックポイント抗体は、アブスコパル効果として知られる遠隔の腫瘍に対する抗腫瘍免疫を示した（Ｗ．Ｊ．Ｍ．Ｍｕｌｄｅｒ、Ｓ．Ｇｎｊａｔｉｃ、Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ１２（９）（２０１７）８４０－１；Ｍ．Ｂｉｌｕｓｉｃ，Ｊ．Ｌ．Ｇｕｌｌｅｙ、Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ：Ｌｏｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｗａｙ ｔｏ Ｃｏｎｖｅｒｔ Ｔｕｍｏｒｓ Ｆｒｏｍ“Ｃｏｌｄ”ｔｏ“Ｈｏｔ”、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １０９（１２）（２０１７）；Ｍ．Ａ．Ａｚｎａｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１９８（１）（２０１７）３１－９；Ａ．Ｍａｒａｂｅｌｌｅら、Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ２８（ｓｕｐｐｌ＿１２）（２０１７）ｘｉｉ３３－４３；およびＶ．Ｍｕｒｔｈｙ、Ｊ．Ｍｉｎｅｈａｒｔ、Ｄ．Ｈ．Ｓｔｅｒｍａｎ、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ１０９（１２）（２０１７））。しかし、イピリムマブ、放射線療法およびＤＣベースのワクチン接種における少数の症例を除いて、患者においてアブスコパル免疫はめったに説明されない（Ｍ．Ａ．Ｐｏｓｔｏｗら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ３６６（１０）（２０１２）９２５－３１；Ｅ．Ｆ．Ｓｔａｍｅｌｌら、Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ８５（２）（２０１３）２９３－５；およびＪ．Ｋａｒｂａｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ２（５）（２０１４）４０４－９）．したがって、アブスコパル免疫は、将来の臨床試験で観察される重要なパラメータとみなすことができる。あるいは、腫瘍内免疫チェックポイント抗体と静脈内免疫チェックポイント抗体との組み合わせが、転移性腫瘍の治療に適用される。例えば、第Ｉ／ＩＩ相試験では、現在、転移性黒色腫患者において、イピリムマブの腫瘍内投与とニボルマブの静脈内投与を試験している（ＮＣＴ０２８５７５６９）。
多くの前臨床試験および臨床試験がこの治療を採用しているが、免疫チェックポイント抗体の局所注射のいくつかの課題が残っている。第一に、局所部位における抗体の保持時間が短いことである。例えば、皮下注射後、注射部位におけるＩｇＧの保持時間は約６．８時間であった（Ｆ．Ｗｕら、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ２９（７）（２０１２）１８４３－５３））。短い保持時間は、頻繁な局所注射が必要であり、これは臨床的不便および低い患者のコンプライアンスにつながる可能性がある（Ｄ．Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔｓ、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ ８８（２）（２０１４）２９１－３０９）。第二に、局所的に注射された抗体は最終的に血液循環に入ることである。皮下注射された抗体の全身曝露は、静脈内注入された抗体の約５０～８０％であったと推定される（Ｗ．Ｆ．Ｒｉｃｈｔｅｒ、Ｂ．Ｊａｃｏｂｓｅｎ、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ ４２（１１）（２０１４）１８８１－９）。局所的に注射された抗体の高い全身曝露は、副作用のリスクが高い（Ｊ．Ｉｓｈｉｈａｒａら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９（４１５）（２０１７））。
これらの課題を解決するために、局所抗体注射には制御放出システムが必要である。こうしたシステムは、局所保持時間を増加させ、抗体の全身的曝露を減少させることができる。さらに、システムは局所注射に便利であるべきである。また、システムは、抗体の放出を制御するように調節可能であるべきである。本明細書に記載されるようなシステムを開発するため、免疫寛容なエラスチン様ポリペプチド（ｉＴＥＰ）を、抗体を送達する担体として使用した。ｉＴＥＰは、その転移温度（Ｔｔ）に関連する相転移特性を有する。温度がＴｔを下回る場合、ｉＴＥＰは水溶液に可溶性であり、温度がＴｔを超える場合、ｉＴＥＰは不溶性となり、溶液から沈殿する（Ｐ．Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １８２（２０１８）９２－１０３）。例えば、ｉＴＥＰのＴｔが体温を下回る場合、ｉＴＥＰは、体内に注射された後、沈殿してデポを形成すると思われる。ポリペプチドまたはｉＴＥＰデポは、数週間まで注射部位に存在して、ゆっくりと放出される（Ｍ．Ａｍｉｒａｍら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ１７２（１）（２０１３）１４４－５１；Ｓ．Ｍ．Ｓｉｎｃｌａｉｒら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ１７１（１）（２０１３）３８－４７；Ｍ．Ａｍｉｒａｍら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０（８）（２０１３）２７９２－７；およびＫ．Ｍ．Ｌｕｇｉｎｂｕｈｌら、Ｎａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ １（２０１７））。抗体がこれらのデポに連結されている場合、抗体は注射部位からゆっくりと放出されることが予想される。ｉＴＥＰを抗体（例えば、ＩｇＧ）に連結するために、ＩｇＧ結合ドメイン（ＩＢＤ）をｉＴＥＰに付着させて、組換ポリペプチド（ｉＴＥＰ－ＩＢＤと呼んでもよい）を生成した。「ＩＢＤ」は、タンパク質Ｇに由来するタンパク質ドメインを指す（Ｂ．Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ５（７）（１９８６）１５６７－７５；およびＡ．Ｍ．Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ、Ｇ．Ｍ．Ｃｌｏｒｅ、ＩｍｍｕｎｏＭｅｔｈｏｄｓ ２（１）（１９９３）３－８）。ＩＢＤは、約１０ｎＭの高親和性でＩｇＧに結合することができる（Ｍ．Ｈｕｔｔら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２８７（７）（２０１２）４４６２－９；およびＦ．Ｕｎｖｅｒｄｏｒｂｅｎら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ１０（１０）（２０１５）ｅ０１３９８３８）。本明細書に開示されるように、結果は、本明細書に開示される組換タンパク質（例えば、ｉＴＥＰ－ＩＢＤ）およびＩｇＧの混合物が、デポを形成し、注射部位でＩｇＧを捕捉し、ＩｇＧの放出を遅延させることができることを示す。結果はまた、ＩｇＧの放出速度は、分子量（ＭＷ）および本明細書に開示される組換タンパク質の構造（例えば、ｉＴＥＰ－ＩＢＤ）を制御することによって微調整することができることも示す。さらに、組み換え型タンパク質（例えば、ｉＴＥＰ－ＩＢＤ）は、局所的に注入されたＩｇＧの全身曝露を減少させることが示された。最後に、結果は、組換タンパク質（例えば、ｉＴＥＰ－ＩＢＤ）が腫瘍内で抗体を保持し得ることを実証した。まとめると、本明細書に記載されるこれらの結果は、局所抗体投与のための開示された組換ポリペプチド（例えば、ｉＴＥＰ－ＩＢＤ）の適用を示す。
ｉＴＥＰはタンパク質である。ｉＴＥＰは同様のサイズのナノ粒子（ＮＰ）に自己構築することができる。本明細書では、薬剤送達ビヒクルとしてｉＴＥＰ（本明細書では相同性アミノ酸反復配列とも呼ばれる）ナノ粒子を使用する組成物および方法が開示される。一部の態様では、本明細書に開示されるｉＴＥＰは、ナノ粒子を形成することができる。一部の態様では、本明細書に開示されるｉＴＥＰはナノ粒子を形成しない。本明細書に開示される所与のｉＴＥＰがナノ粒子を形成するかどうかは、限定されるものではないが、ｉＴＥＰ（例えば、相同性アミノ酸反復配列）の長さ、疎水性／親水性、またはジブロックポリマーの組成などの様々な要因に依存し得る。
本明細書に開示されるｉＴＥＰは、所望の移行特性を有し、マウス液性免疫によっても耐容された。また、本明細書に記載されるのは、両親媒性ジブロック共重合体または融合タンパク質を作製するために疎水性が反対であった、二つの対のｉＴＥＰである。融合タンパク質は、二つ以上のタンパク質を一緒に融合することによって生成することができる。ジブロック共重合体を使用して、二つの異なるｉＴＥＰの融合を記述することができる。共重合体（例えば、融合タンパク質）はＮＰに自己組織化される。例えば、配列番号１および配列番号２は、一緒に融合されてジブロックポリマーを形成することができる。一部の態様では、ジブロックポリマーは次に、ＩｇＧ結合ドメインに融合または共有結合され得る。
組成物
組換ポリペプチド。本明細書で使用される場合、「組換ポリペプチド」という用語は、組み換え技術を含む様々な方法によって生成されるポリペプチドを指す。本明細書に開示される組換ポリペプチドは、一つ以上の相同性アミノ酸反復配列（例えばｉＴＥＰ）およびＩｇＧ結合ドメインを含むことができる。本明細書では、組換ポリペプチドが開示される。一部の態様では、組換ポリペプチドは相同性アミノ酸反復配列を含み得る。一部の態様では、相同性アミノ酸反復配列は、相同性アミノ酸反復配列と少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有し得る。一部の態様では、相同性アミノ酸反復配列は以下であってもよい：Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ（配列番号１）；Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号２）；Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ（配列番号３）；Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ（配列番号４）；Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ（配列番号５）；Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号６）；Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号７）；Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号８）；Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号９）；Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ（配列番号１０）；Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ（配列番号１１）；Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号１２）；Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号１４）；またはＧｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号１５）；およびＩｇＧ結合ドメイン。
組換ポリペプチド。本明細書で使用される場合、「組換ポリペプチド」という用語は、組み換え技術を含む様々な方法によって生成されるポリペプチドを指す。本明細書に開示される組換ポリペプチドは、一つ以上の相同性アミノ酸反復配列（例えばｉＴＥＰ）およびＩｇＧ結合ドメインを含むことができる。本明細書では、組換ポリペプチドが開示される。一部の態様では、組換ポリペプチドは相同性アミノ酸反復配列を含み得る。一部の態様では、相同性アミノ酸反復配列は、相同性アミノ酸反復配列と少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有し得る。一部の態様では、相同性アミノ酸反復配列は以下であってもよい：Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ（配列番号１）；Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号２）；Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ（配列番号３）；Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ（配列番号４）；Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ（配列番号５）；Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号６）；Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号７）；Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号８）；Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号９）；Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ（配列番号１０）；Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ（配列番号１１）；Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号１２）；Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号１４）；またはＧｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号１５）；およびＩｇＧ結合ドメイン。
一部の態様では、組換ポリペプチドは、アミノ酸配列Ｇｌｙ－（Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ）28－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号２３）；Ｇｌｙ－（Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）70－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号２４）；Ｇｌｙ－（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ）21－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号２５）；またはＧｌｙ－（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ）96－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号２６）を含む。
一部の態様では、組換ポリペプチドは、同じ二つ以上の相同性アミノ酸反復配列をさらに含むことができる。例えば、相同性アミノ酸配列は、２０～２００回連続して反復されるＧｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ（配列番号１）（例えば、（Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ）28（配列番号１３）；（Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ）56（配列番号１６）；または（Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ）112（配列番号１７））。
一部の態様では、組換ポリペプチドは、異なる二つ以上の相同性アミノ酸反復配列をさらに含むことができる。一部の態様では、相同性アミノ酸配列は、連続して２０～２００回反復される同じ配列であってもよく、２０～２００回反復することができる異なる相同性アミノ酸配列に融合されてもよい。
一部の態様では、組換ポリペプチドはジブロック共重合体または融合タンパク質を含む。ジブロック共重合体または融合タンパク質は、共有結合によって一緒に連結されている２個または３個の相同性アミノ酸反復配列を含む。一部の態様では、ジブロックポリマーは、例えば、Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ（配列番号１）をＧｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号２）に融合することによって形成することができる。一部の態様では、ジブロックポリマーは、（配列番号１）ｘ－（配列番号２）ｙまたは（配列番号２）ｙ－（配列番号１）ｘとすることができ、ｘおよびｙは、２０～１２０の任意の数であってもよく、２０～１２０の任意の数は、それぞれの相同性アミノ酸配列が反復される回数を示す。
一部の態様では、一つ以上のシステインアミノ酸残基は、ジブロック共重合体または融合タンパク質とＩｇＧ結合ドメインとの間に挿入することができる。一部の態様では、システインアミノ酸残基の数は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０以上またはその間の任意の数であってもよい。一部の態様では、システインアミノ酸残基の数は４とすることができる。一部の態様では、システインアミノ酸残基は、一つ以上のグリシンアミノ酸残基によって分離することができる。グリシンアミノ酸残基の数は、ジブロック共重合体とＩｇＧ結合ドメインとの間に挿入されているシステインアミノ酸残基の数によって変化し、依存し得る。一部の態様では、グリシンアミノ酸残基の数は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０以上またはその間の任意の数であってもよい。一部の態様では、グリシンアミノ酸残基の数は、８とすることができる。例えば、四つのシステイン残基がジブロック共重合体とＩｇＧ結合ドメインの間に挿入される場合、８つのグリシンアミノ酸残基を挿入して、隣接するシステインアミノ酸残基を分離することができる。一部の態様では、ジブロック共重合体または融合タンパク質は両親媒性であってもよい。一部の態様では、ジブロック共重合体または融合タンパク質は、ＩｇＧ結合ドメインと融合されてもよい。
また、以下の式に適合するアミノ酸配列を含む組換ポリペプチドが本明細書に記載される：Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｘａａ1－Ｇｌｙ－Ｘａａ2－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ、Ｘａａ1はＬｅｕまたはＰｈｅであり、Ｘａａ2はＡｌａまたはＶａｌ（配列番号１６～１９）であり、式中、アミノ酸配列が反復される。
一部の態様では、本明細書に記載の組換ポリペプチドは、組換ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端またはＮ末端とＣ末端の両方に配置されている一つ以上のアミノ酸残基をさらに含むことができる。一部の態様では、一つ以上のアミノ酸残基は、グリシン、アラニン、またはセリンまたはそれらの組み合わせであってもよい。一部の態様では、組換ポリペプチドは、アミノ酸配列Ｇｌｙ－（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ）21－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号２５）；またはＧｌｙ－（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ）96－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号２６）；またはＸＸ－（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ）X－ＸＸ（配列番号２７）を含むことができる。以下に記載されるように、「ＸＸ」はＣ末端とＮ末端の両方において一つ以上のグリシンアミノ酸残基であってもよく、「ｘ」は、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００またはその間の任意の数とすることができる。配列番号２７は、「ｘ」回数反復され、Ｃ末端とＮ末端の両方において一つ以上のグリシンアミノ酸残基に隣接している相同性アミノ酸反復配列の例として提供される。相同性アミノ酸配列のいずれかは、Ｃ末端、Ｎ末端またはその両方のいずれかで一つ以上のグリシンアミノ酸残基に隣接してもよく、Ｃ末端、Ｎ末端またはその両方のいずれかにおいてグリシンアミノ酸残基の数が、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００またはその間の任意の数であってもよい。
一部の態様では、確認されている組換ポリペプチドの分子量は、１０～１００ｋＤａとすることができる。一部の態様では、確認されている組換ポリペプチドの分子量は、２０～１００ｋＤａとすることができる。
相同性アミノ酸反復。本明細書で使用される場合、「相同性アミノ酸反復」または「相同性アミノ酸反復配列」または「単量体」は、２０個のタンパク質アミノ酸のいずれかを含むアミノ酸配列を指し、直線的に反復または複製される。また、本明細書で使用される場合、「相同性アミノ酸配列反復」という用語は、ｉＴＥＰ配列を指すことができる。一部の態様では、相同性アミノ酸反復配列は反復することができる。相同性アミノ酸反復配列は、２回、３回、４回、５回、１０回、１５回、２０回、３０回、４０回、５０回、１００回、１５０回、２００回、または任意の回数で反復することができる。一部の態様では、相同性アミノ酸反復は１００回以下反復することができる。一部の態様では、相同性アミノ酸反復は２００回以下反復することができる。一部の態様では、相同性アミノ酸反復は少なくとも２０回以下反復することができる。一部の態様では、相同性アミノ酸反復配列は、２０～３０回、３０～４０回、４０～５０回、５０～６０回、６０～７０回、７０～８０回、８０～９０回、９０～１００回、１００～１１０回または１１０～１２０回反復することができる。
いくつかの態様において、相同性アミノ酸反復配列は、配列Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ（配列番号１）；Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号２）；Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ（配列番号３）；Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ（配列番号４）；Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ（配列番号５）；Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号６）；Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号７）；Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号８）；Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号９）；Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ（配列番号１０）；Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ（配列番号１１）；Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号１２）；Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号１４）；またはＧｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号１５）であってもよい。一部の態様では、相同性アミノ酸反復配列は、配列Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ（配列番号１）であってもよい。一部の態様では、相同性アミノ酸反復配列は、配列Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号２）であってもよい。表１は、相同性アミノ酸反復配列の例を列挙する。
いくつかの態様において、相同性アミノ酸反復配列は配列（Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ）28（配列番号１３）；（Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ）56（配列番号１６）；または（Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ）112（配列番号１７）であってもよい。
別の態様では、相同性アミノ酸反復配列は、アミノ酸配列：Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号２８）ではない。
一部の態様では、相同性アミノ酸反復配列は、４個以上のアミノ酸残基を含むことができる。一部の態様では、１個以下のプロリンが、相同性アミノ酸反復配列に存在することができる。相同性アミノ酸反復配列は、エラスチンに天然に存在する配列として存在することができる。相同性アミノ酸反復配列は、Ｎ末端およびＣ末端の両方で、一つ以上のグリシン残基に天然に隣接することもできる。
一部の態様では、相同性アミノ酸反復はエラスチン由来であってもよい。相同性アミノ酸反復配列は、マウスおよび／またはヒトエラスチンに由来してもよい。一部の態様では、相同性アミノ酸反復配列は、Ｃ末端およびＮ末端の両方で一つ以上のグリシン残基によってさらに隣接することができるマウスおよび／またはヒトエラスチンに由来してもよい。
一部の態様では、相同性アミノ酸反復は、相同性アミノ酸反復に対してある程度の同一性または相同性を示すことができ、相同性アミノ酸反復は、配列番号１～１２、１４および１５などのうちの一つ以上であってもよい。同一性の程度は異なり得、当業者に公知の方法によって決定され得る。「相同性」および「同一性」という用語はそれぞれ、二つのポリペプチド配列間の配列類似性を指す。相同性および同一性はそれぞれ、比較の目的で整列することができる各配列内の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列内の位置が、同じアミノ酸残基によって占有される場合、ポリペプチドは、その位置において同一と呼ぶことができ、等価な部位が、同じアミノ酸（例えば、同一）または類似のアミノ酸（例えば、立体および／または電子の性質において類似）によって占有される場合、分子はその位置において相同と呼ぶことができる。配列間の相同性または同一性の割合は、配列によって共有される合致する位置または相同な位置の数の関数である。本明細書に記載の組換ポリペプチドの相同性アミノ酸反復配列は、相同性アミノ酸反復配列に対し、少なくともまたは約２５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性または相同性を有することができ、相同性アミノ酸反復配列は、配列番号１～１２、１４および１５のうちの一つ以上であってもよい（例えば、表１を参照）。
一部の態様では、本明細書に記載の組換ポリペプチドは、組換ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端またはＮ末端とＣ末端の両方に配置されている一つ以上のアミノ酸残基をさらに含むことができる。一つ以上のアミノ酸残基は、グリシン、アラニンまたはセリンまたはこれらの組み合わせであってもよい。一部の態様では、組換ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端またはＮ末端とＣ末端の両方に配置されている一つ以上のアミノ酸残基は、免疫原性を減少させる任意のアミノ酸残基であってもよい
ＩｇＧ結合ドメイン。本明細書において、ＩｇＧ結合ドメインを含む組換ポリペプチドが記載される。一部の態様では、組換ポリペプチドは、ＩｇＧ結合ドメインに共有結合している少なくとも２回反復することができる少なくとも一つの相同性アミノ酸反復配列を含み得る。
一部の態様では、本開示の組換ポリペプチドのＩｇＧ結合ドメインは、タンパク質Ｇに由来してもよい。一部の態様では、ＩｇＧ結合ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に結合することができる配列であってもよい。本明細書で使用される場合、「～に由来する」という用語は、「由来する」または「に基づく」を意味することができる。例えば、ＩｇＧ結合ドメイン配列は、タンパク質Ｇ配列に由来していてもよく、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、またはタンパク質Ｇ塩基もしくはオリジナルのタンパク質Ｇ配列のバリアントもしくは断片であってもよい。
本明細書において、アミノ酸配列ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号１８）を含むＩｇＧ結合ドメインであり、またはこの配列と少なくとも７５％同一である。一部の態様では、ＩｇＧ結合ドメインは、配列ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号１８）またはその断片もしくはバリアントを含んでいてもよい。一部の態様では、バリアントは、ＴＴＹＫＬＩＬＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＥＡＶＤＡＡＴＡＥＫＶＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＥＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号１９）；ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＥＡＶＤＡＡＴＡＥＫＶＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＥＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号２０）；ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＡＡＡＦＡＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号２１）；ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＡＡＡＦＡＱＹＡＲＲＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号２２）；またはＴＴＹＫＬＶＩＡＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＥＡＶＤＡＡＴＡＥＫＶＦＫＱＹＡＮＤＡＧＶＤＧＥＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号２９）またはこれらの断片もしくはバリアントであってもよい。一部の態様では、断片は、ＴＴＥＡＶＤＡＡＴＡＥＫＶＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＥＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号３０）；ＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＥＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号３１）；ＥＫＶＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＥＷＴＹ（配列番号３２）；またはＮＤＮＧＶＤＧＥＷＴＹ（配列番号３３）であってもよい。
リンカー。本明細書に記載の組換ポリペプチドは、一つ以上のリンカーをさらに含むことができる。本明細書に開示される組成物または組換ポリペプチドの所与のリンカーは、切断可能な連結（例えば、チオエステル連結）を提供することができる。連結に利用可能な部位は、本明細書に記載される組換ポリペプチド上で特定することができる。一部の態様では、開示された組換ポリペプチドのリンカーは、ＩｇＧ結合ドメインが（例えば、抱合を介して）結合され得る組換ポリペプチド上の一級アミンと反応する基を含むことができる。有用なリンカーは、市販のソースから入手可能である。一部の態様では、リンカーは、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）ブチリン酸ヒドラジド塩酸塩（ＭＰＢＨ）とすることができる。当業者は、適切なリンカーを選択することができる。
リンカーは、共有結合を介して開示された組換ポリペプチドに結合することができる。共有結合を形成するために、例えば、ヒドロキシル部分が組換ポリペプチドを改変するために必要なレベルで生理学的に許容される、幅広い活性カルボキシル基（例えばエステル）を有する化学反応性基を使用することができる。
一部の態様では、一つ以上のリンカー配列はペプチドであってもよい。一部の態様では、リンカー配列は、直線的かつ連続的に繰り返されてもよい。例えば、リンカー配列は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０回繰り返してもよい。一部の態様では、リンカー配列はＧＧＧＧＳ（配列番号３４）であってもよい。一部の態様では、リンカー配列はＧＧＧＧＣ（配列番号３５）であってもよい。一部の態様では、リンカー配列は、相同性アミノ酸反復配列とＩｇＧ結合ドメインとの間に位置することができる。例えば、Ｎ末端からＣ末端まで、組換ポリペプチドは、ＩｇＧ結合ドメインに共有結合することができるリンカー配列に共有結合された相同性アミノ酸反復配列（例えば配列番号１）、または相同性アミノ酸反復配列（例えば配列番号１）に共有結合することができるリンカー配列に共有結合されているＩｇＧ結合ドメインを含み得る。
一部の態様では、組換ポリペプチドは以下のアミノ酸配列のいずれか一つを含んでいてもよい：（ＧＶＬＰＧＶＧ）28－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号３６）；（ＧＶＬＰＧＶＧ）56－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号３７）；または（ＧＶＬＰＧＶＧ）112－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号３８）。
一部の態様では、本明細書に開示される組換ポリペプチドは、第二のリンカー配列をさらに含むことができる。一部の態様では、第二のリンカー配列は、（ＧＧＧＧＣ）4（配列番号３９）であってもよい。一部の態様では、第二のリンカーはシステインを有していなければならない。第二のリンカーは、１～２０回またはその間の任意の数で反復することができる。一部の態様では、第二のリンカー配列は、相同性アミノ酸反復配列と第一のリンカー配列との間に位置することができる。一部の態様では、（ＧＧＧＧＣ）4（配列番号４０）は、相同性アミノ酸反復配列と第一のリンカー配列との間に位置することができる。一部の態様では、本明細書に記載の組換ポリペプチドは、（ＧＶＬＰＧＶＧ）28－（ＧＧＧＧＣ）4－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号４１）；（ＧＶＬＰＧＶＧ）56－（ＧＧＧＧＣ）4－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号４２）；または（ＧＶＬＰＧＶＧ）112－（ＧＧＧＧＣ）4－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号４３）であってもよい。
a括弧の後の下付き文字は、括弧内の反復配列の数であった。柔軟性を高めるために、ＩＢＤの前、間に「ＧＧＧＧＳ」配列（配列番号３４）を挿入した。
a括弧の後の下付き文字は、括弧内の反復配列の数であった。柔軟性を高めるために、ＩＢＤの前、間に「ＧＧＧＧＳ」配列（配列番号３４）を挿入した。
治療剤。本明細書において、一つ以上の治療剤をさらに含む組換ポリペプチドが開示される。幅広い治療剤を、本明細書に開示される組換ポリペプチドと組み込む、会合させる、または連結させることができる。様々な治療剤が、本明細書に記載される組換ポリペプチド配列に連結され、（例えば、非共有結合的に）結合され、または会合され得る。一部の態様では、治療剤は、本明細書に開示される組換ポリペプチドに間接的にまたは直接的に組み込むことができる。治療剤は、ペプチド、その抗体またはその断片、抗体－薬剤抱合体またはＦｃ－融合タンパク質であってもよい。治療剤はまた、化合物、タンパク質、ペプチド、小分子または細胞であってもよい。治療剤の例としては、ペプチドワクチン、抗体、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）および細胞系剤（例えば、幹細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の態様では、治療剤は、ＩｇＧまたはその断片であってもよい。一部の態様では、治療剤のうちの一つ以上は、抗癌剤とすることができる。抗癌剤は、抗体もしくはその断片または抗体－薬剤抱合体の一部である抗体または抗癌特性を有するＦｃ－融合タンパク質であってもよい。一部の態様では、抗癌剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＣＴＬＡ－４抗体であってもよい。一部の態様では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブまたはセミプリマブであってもよい。一部の態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アベルマブ、デュルバルマブまたはアテゾリズマブであってもよい。一部の態様では、抗ＣＴＬＡ－４抗体はイピリムマブであってもよい。一部の態様では、抗癌剤は、抗癌抗体またはその断片、抗体薬剤抱合体の一部であり得る抗癌Ｆｃ融合抗体または抗癌抗体であってもよい。抗癌抗体またはその断片の例として、限定されないが、オファツムマブ（抗ＣＤ２０）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、ブリナツムマブ（抗ＣＤ３およびＣＤ１９）、ラムシルマブ（抗ＶＥＧＦＲ２）、ダラツムマブ（抗ＣＤ３８）、エロツズマブ（抗ＳＬＡＭＦ７）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、オビヌツズマブ（抗ＣＤ２０）、トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２）、ペルツズマブ（抗ＨＥＲ２）、ネシツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、デノスマブ（抗ＲＡＮＫＬ）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、シルツキシマブ（抗ＩＬ－６）、ジヌツキシマブ（抗ＧＤ２）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）およびモガムリズマブ（抗ＣＣＲ４）が挙げられる。抗癌Ｆｃ－融合タンパク質の例としては、限定されるものではないが、アフリベルセプトが挙げられる。抗体薬剤抱合体の一部であり得る抗癌抗体の例としては、限定されないが、ゲムツズマブオゾガミシン、ブレンツキシマブヴェドチン、アド－トラスツズマブエムタンシン、イノツズマブオゾガミシンおよびポラツズマブベドチンピイクが挙げられる。
本明細書に記載の組換ポリペプチドはまた、例えば、細胞接着および増殖のための足場材料のための担体として使用することができ、したがって、組織修復または細胞に基づく療法に使用することができる。組換ポリペプチドは、例えば、インビトロおよびインビボでの細胞増殖を促進するために、およびアジュバントとして、マトリックスゲルとして使用することができる。
組換ポリペプチドを作製する方法
本明細書に記載される組換ポリペプチドを作製するために使用することができる方法が本明細書に開示されている。
本明細書に記載される組換ポリペプチドを作製するために使用することができる方法が本明細書に開示されている。
設計。一部の態様では、本明細書に記載の相同性アミノ酸反復配列（例えば、ｉＴＥＰ）を含む組換ポリペプチドは、エラスチンに由来するペプチドのポリマーとして設計することができる。相同性アミノ酸反復配列を含む組換ポリペプチドは、マウスおよびヒトにおいて液性に耐性であるべきである。選択された組換ポリペプチドおよび相同性アミノ酸反復配列は、自己免疫応答を本質的に誘導するべきではない（すなわち、配列は、Ｂ細胞またはＴ細胞受容体に本質的に結合するべきではない）。
免疫原性である相同性アミノ酸反復配列を含む組換ポリペプチドを生成する可能性を低減するために、少なくとも二つの戦略を用いることができる。第一に、ヒトおよびマウスのエラスチンに共通した既存のペプチド反復配列を、相同性アミノ酸反復配列の構成要素として使用して、外因性接合部配列の生成を制限することができる。第二に、一つ以上の外因性接合部配列が作製された場合、相同性アミノ酸反復配列は、４残基以上およびエラスチン由来であるべきであり、Ｎ末端およびＣ末端において一つ以上のグリシン残基に隣接しているべきである。より短いというよりより長い相同性アミノ酸反復配列を使用することによって、外因性接合部配列の数を低減することができる。外因性接合部配列を低減または除去することは、組換ポリペプチドまたは相同性アミノ酸反復配列の免疫原性を低減することができる。
一部の態様では、相同性アミノ酸反復配列が相転移特性を有するように、相同性アミノ酸反復配列は一つのプロリンアミノ酸残基および一つ以上のバリンアミノ酸残基を有するように設計することができる。
本明細書に開示される組換ポリペプチドは、核酸からタンパク質を産生する、またはインビトロでポリペプチドを合成するために日常的に使用されている合成方法および組み換え技術によって産生することができる。組換ポリペプチドおよび相同性アミノ酸反復配列および／またはジブロックポリマーは、後の使用まで、未精製または単離もしくは実質的に精製された形態で保存することができる。
一部の態様では、本明細書に開示される組換ポリペプチドは、組換融合タンパク質またはジブロックポリマーであってもよい。一部の態様では、組換ポリペプチドは、様々な発現系（例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞および哺乳類細胞培養物および植物）で発現させることができる。簡潔に述べると、組換ポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡは、上述の発現系のいずれかの細胞にトランスフェクトすることができる。組換ポリペプチド（例えば、配列番号１～配列番号２）がこれらのシステムのいずれか一つで産生された後、その後、精製され、凍結乾燥され、使用時まで保存することもできる。
本明細書に記載される相同性アミノ酸反復配列は、本明細書に記載されるリンカーと化学的に相互作用するように、またはリンカーを含むように改変することができる。これらの組換ポリペプチド、相同性アミノ酸反復配列およびペプチド－リンカー構築物は、本開示の範囲内であり、ＩｇＧ結合ドメインへの付着（例えば、抱合）および／または治療剤との会合のプロセスを完了するための指示を伴うキットの構成要素として包装することができる。相同性アミノ酸反復配列は、Ｎ末端、Ｃ末端または両方にシステイン残基または他のチオ担持部分（例えば、Ｃ－ＳＨ）を含むように改変することができる。
一部の態様では、治療剤（例えば、ＩｇＧまたは抗体）は、当業者に公知の方法を使用して、組換ポリペプチドと混合することができる。例えば、治療剤（例えば、抗体）および組換ポリペプチド（例えば、ｉＴＥＰ－ＩＢＤ）は、ピペット操作、タッピング、振とう、ボルテックス法または他の方法を介してチューブなどの容器内の溶液中に一緒に混合することができる。
構成。相同性アミノ酸反復配列、相同性アミノ酸反復配列が反復される回数、ＩｇＧ結合ドメイン、リンカーおよび治療剤を含む、開示された組換ポリペプチドは、独立して選択することができる。当業者であれば、構成要素の部品は互換性のある様式で会合する必要があると理解する。本明細書に開示されるように、本明細書に開示される組換ポリペプチドを使用して、癌および自己免疫疾患の治療のために患者に治療剤を送達することができる。一部の態様では、治療剤は、組換ポリペプチドに抱合することができる。一部の態様では、組換ポリペプチドは、ＩｇＧ結合ドメインに共有結合した相同性アミノ酸反復配列を含むことができる。一部の態様では、治療剤は、ＩｇＧ結合ドメインに非共有結合的に抱合することができる。組換ポリペプチド当たりの治療剤の数は、追加のＩｇＧ結合ドメインを加えることによって制御することができる。一つのＩｇＧ結合ドメインは、一つの治療剤に（例えば、非共有結合的に）結合することができる。一部の態様では、組換ポリペプチドは、一つ以上または二つ以上のＩｇＧ結合ドメインを含むことができる。このように、組換ポリペプチドは、二つ以上の治療剤を含み得る。例えば、二つのＩｇＧ結合ドメインを含む組換ポリペプチドの線形構成は以下であってもよい：ＩＢＤ－ｉＴＥＰ－ＩＢＤ、ｉＴＥＰ－ＩＢＤ－ｉＴＥＰ－ＩＢＤまたはＩＢＤ－ｉＴＥＰ－ＩＢＥＤ－ｉＴＥＰ。一部の態様では、ｉＴＥＰは、本明細書に開示される相同性アミノ酸反復配列のいずれかであってもよい。一部の態様では、相同性アミノ酸反復配列は、同一であっても異なっていてもよい。一部の態様では、ＩＢＤは、本明細書に開示される配列のいずれかを含むことができる。一部の態様では、ＩＢＤは、同じまたは異なる配列を含むことができる。例えば、一つ以上のシステインアミノ酸残基は、相同性アミノ酸反復配列（例えば、ｉＴＥＰ）の末端の一つに付加されてもよく、一つ以上のＩｇＧ結合ドメインの抱合部位として使用され得る。例えば、８つのシステイン残基を加え、８つのＩｇＧ結合ドメインに対して８つの抱合部位を提供することができる。治療剤は、同じ、異なるまたはそれらの任意の組み合わせであってもよい。本明細書に記載される組換ポリペプチドの末端に二つまたはシステイン残基が加えられる場合、一つ以上のスペーサー（例えば、グリシン残基）を、例えば、二つのシステイン残基の間に挿入することができる。スペーサーの数は、添加されたシステイン残基の数または所望の治療用分子の数に従って調整することができる。スペーサーは、二つ以上のＩｇＧ結合ドメインを収容するための十分なスペースを提供する役割を果たす。スペーサーは、一つ以上のグリシンもしくはセリンまたはこれらの組み合わせであってもよい。あるいは、一つ以上のｉＴＥＰ配列および／または一つ以上のＩＢＤが組換ポリペプチドに存在する場合、追加のリンカー配列を組換ポリペプチドに組み込むことができる。
したがって、一部の態様では、本明細書に開示される組換タンパク質および組成物は、一つ以上の治療剤を含むことができる。一部の態様では、本明細書に記載の組換ポリペプチド（例えば、ｉＴＥＰ）および治療剤は、１：１の比で存在する（組換ポリペプチド：治療剤）。組換ポリペプチド：治療剤の比はまた、２：２、３：３、４：４、５：５、６：６、７：７、８：８、９：９、１０：１０、またはこれらの任意の他の組み合わせであってもよい。本明細書に記載の組換ポリペプチドに抱合することができる治療剤の数は、所与のポリペプチドに添加される抱合部位（例えば、ＩｇＧ結合ドメインまたはシステイン残基）の数によって決定することができる。一部の態様では、組換ポリペプチド：治療剤の比はまた、０．５：１、１：１、２：１、４：１、８：１、１６：１、２４：１、３２：１またはこれらの任意の他の組み合わせであってもよい。一部の態様では、組換ポリペプチド：治療剤の比は、０．５：１（または代替的に１：２）および３２：１とすることができる。
一つ以上のシステイン残基を、本明細書に記載の組換ポリペプチド（例えば、二つのｉＴＥＰ分子または二つの相同性アミノ酸反復配列の間）に追加することができる。システイン残基は、二つ以上のスペーサー（例えば、グリシン残基）を加えることによってさらに分離することができる。例えば、四つのシステイン残基を、ジブロックポリマー（またはコポリマーまたは融合タンパク質）とＩｇＧ結合ドメインとの間に挿入することができる。これらのシステイン残基は、例えば、８つのグリシン残基の添加によってさらに分離することができる。
検出可能なラベル。本明細書に記載の組換ポリペプチドは、一つ以上の標識または検出タグ（例えば、ＦＬＡＧ（商標）タグ、エピトープまたはタンパク質タグ、例えばｍｙｃタグ、６Ｈｉｓおよび蛍光融合タンパク質）をさらに含むことができる。一部の態様では、標識（例えば、ＦＬＡＧ（商標）タグ）は、組換ポリペプチドに融合することができる。一部の態様では、本開示の方法および組成物は、組換ポリペプチドまたは組換ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。様々な態様では、組換ポリペプチドは、少なくとも一つのエピトープ提示アミノ酸配列（例えば、「エピトープタグ」）を含み、エピトープタグは、ｉ）タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に追加されたエピトープタグ（例えば、組換ポリペプチド）、またはｉｉ）タンパク質の領域に挿入されたエピトープタグ（例えば、組換ポリペプチド）およびタンパク質におけるいくつかのアミノ酸を置換するエピトープタグ（例えば、組換ポリペプチド）から選択される。一部の態様では、検出可能な標識は、検出可能な部分と呼んでもよい。一部の態様では、検出可能な標識または検出可能な部分は、ＩｇＧ結合ドメインに共有連結または共有結合することができる。また、検出可能な部分を検出する方法が本明細書に開示されている。方法は、治療有効量の本明細書に開示される組換ポリペプチドを対象に投与することを含むことができ、ＩｇＧ結合ドメインは、検出可能な部分に共有結合または非共有結合され、それによって検出可能な部分を検出する。
エピトープタグは、特定の抗体が産生され得るアミノ酸の短い区間であり、一部の態様では、生体または培養細胞に添加されたタグ付きタンパク質を特異的に識別および追跡することを可能にする。タグ付けされた分子の検出は、いくつかの異なる技術を使用して達成することができる。こうした技術の例として、免疫組織化学法、免疫沈降法、フローサイトメトリー法、免疫蛍光顕微鏡法、ＥＬＩＳＡ法、イムノブロット法（「ウェスタンブロット法」）、およびアフィニティクロマトグラフィーが挙げられる。エピトープタグは、既知のエピトープ（例えば、抗体結合部位）を対象のタンパク質に付加し、既知のしばしば高親和性の抗体の結合を提供し、それによって、生体または培養細胞に添加されているタグ付きタンパク質を特異的に識別および追跡することを可能にする。エピトープタグの例として、以下に限定されないが、ｍｙｃ、Ｔ７、ＧＳＴ、ＧＦＰ、ＨＡ（ヘマグルチニン）、Ｖ５およびＦＬＡＧタグが挙げられる。最初の四つの例は、既存の分子に由来するエピトープである。対照的に、ＦＬＡＧは、高い抗原性のために設計された合成エピトープタグである（例えば、米国特許第４，７０３，００４号および第４，８５１，３４１号を参照されたい）。エピトープタグは、抗体による認識を超えて、一つ以上の追加機能を有することができる。
一部の態様では、本開示の方法、組換ポリペプチドおよび組成物はエピトープタグを含み、エピトープタグは６～１５アミノ酸の長さを有する。代替的な態様では、エピトープタグは、９～１１アミノ酸長を有する。本開示の方法および組成物はまた、離間している、または直接タンデムである、二つ以上のエピトープタグを含む組換ポリペプチドを含み得る。さらに、本開示の方法および組成物は、組換ポリペプチドがその生物活性／活性（例えば、機能性）を維持する限りにおいて、２、３、４、５個またはそれ以上のエピトープタグを含み得る。
いくつかの態様では、エピトープタグは、ＶＳＶ－Ｇタグ、ＣＤタグ、カルモジュリン結合ペプチドタグ、Ｓ－タグ、Ａｖｉｔａｇ、ＳＦ－ＴＡＰ－タグ、ｓｔｒｅｐ－タグ、ｍｙｃ－タグ、ＦＬＡＧ－タグ、Ｔ７－タグ、ＨＡ（ヘマグルチニン）タグ、Ｈｉｓ－タグ、Ｓ－タグ、ＧＳＴ－タグまたはＧＦＰ－タグであってもよい。これらのタグの配列は、文献に記載され、当業者に周知である。
本明細書に記載されるように、「免疫学的結合」という用語は、抗原のエピトープ（例えば、エピトープタグ）と、抗体またはその断片の抗原特異的部分との間の付着の非共有結合形態である。抗体はモノクローナル抗体であることが好ましく、使用されるそれぞれのエピトープタグに特異的でなければならない。抗体は、マウス、ヒトおよびヒト化抗体を含む。抗体断片は、当業者に既知であり、とりわけ、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ断片）およびＦａｂ断片を含む。抗体は、通常のハイブリドーマおよび／または他の組み換え技術によって産生することができる。多くの抗体は市販されている。
既知のタンパク質のドメインから、またはタンパク質全体もしくはタンパク質およびペプチドからの組換ポリペプチドの構築は周知である。概して、所望のタンパク質および／またはペプチド部分をコードする核酸分子は、遺伝子工学技術を使用して結合されて、単一の動作可能に連結された融合オリゴヌクレオチドが作製される。適切な分子生物学的技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（分子クローニング：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ＵＳＡ、１９８９）に見出すことができる。様々なリンカーによって結合されるものおよびペプチドタグを含有するものを含む遺伝子操作されたマルチドメインタンパク質の例は、以下の特許文書に見出すことができる：米国特許第５，９９４，１０４号（「Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ」）、米国特許第５，９８１，１７７号（「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」）、米国特許第５，９１４，２５４号（「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｄ ｏｕｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｗｉｔｈｏｕｔ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」）、米国特許第５，８５６，４５６号（「Ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ ｌｉｎｋｅｄ ｆｕｓｉｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」）、米国特許第５，７６７，２６０号（「Ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」）、米国特許第５，６９６，２３７号（「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｔｏｘｉｎ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ」）、米国特許第第５，５８７，４５５号（「Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔ ａｇａｉｎｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」）、米国特許第４，８５１，３４１号（以下、「Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ」）、米国特許第４，７０３，００４号（「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ」）；およびＷＯ９８／３６０８７（「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｌｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ＨＩＶ ｅｐｉｔｏｐｅｓ」）。
対象の組換ポリペプチド内に官能化ペプチド部分（エピトープタグ）を配置することは、官能化ペプチド部分の活性および融合におけるＴＣＲなどの少なくとも実質的な組換ポリペプチドの生物活性を維持する必要性によって影響され得る。官能化ペプチドの配置のための二つの方法は以下である：Ｎ末端および挿入に対して従順性を示すタンパク質部分内の位置。これらは、官能化ペプチドを挿入することができる唯一の場所ではないが、良い例として役立ち、図として使用される。他の適切な挿入場所は、試験ペプチドコード配列（例えば、ＦＬＡＧペプチドをコードする配列）を異なる位置で構築物に挿入し、次いで、組換ポリペプチドの構築に使用される特定の部分に対して適切なアッセイを使用して、適切な生物活性のための結果としての融合をアッセイし、ペプチド活性を官能化することによって特定することができる。対象の組換ポリペプチドの活性は、本明細書に記載されるものを含む、様々な公知の技術のいずれかを使用して測定することができる。
本明細書に開示される組換ポリペプチドを作製する方法に関連する本明細書に開示の方法を容易に改変して、組換ポリペプチドの薬学的に許容される塩を作製することができる。こうした塩を含む医薬組成物およびその投与方法は、本開示の範囲内である。
医薬組成物
本明細書に開示されるように、組換ポリペプチドを含む医薬組成物が本明細書に開示される。組換ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も本明細書に開示される。一部の態様では、治療剤は、自己免疫疾患を治療するために使用することができる抗癌剤または薬剤であり得る。一部の態様では、治療剤は、抗体またはその断片、抗体－薬剤抱合体の一部である抗体またはＦｃ－融合タンパク質であってもよい。一部の態様では、医薬組成物は、非経口投与、皮下投与または直接注射のために製剤化され得る。一部の態様では、注射による投与は、一つ以上の疾患部位（例えば、腫瘍）に、組換ポリペプチド（治療剤に非共有結合している組換ポリペプチドを含む）のいずれかを含む、本明細書に開示される組成物のいずれかを直接投与することを包含し得る。本開示の組成物はまた、本明細書に記載の治療有効量の組換ポリペプチドを含有する。組成物は、様々な投与経路のいずれかによって投与するために製剤化されてもよく、投与経路に応じて変化し得る、１種類以上の生理学的に許容される賦形剤を含んでいてもよい。本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、任意の化合物または物質を意味し、「担体」または「希釈剤」とも呼ぶことができるものも含まれる。いくつかの態様において、本明細書に開示される組成物および組換ポリペプチドは、天然ポリマー、アジュバント、賦形剤、保存剤、吸収遅延剤、充填剤、結合剤、吸収剤、緩衝剤またはこれらの組み合わせをさらに含むことができる。薬学的および生理学的に許容可能な組成物を調製することは、当技術分野ではルーチンであるとみなされ、したがって当業者は、必要に応じて、ガイダンスを求めて多数の当局に相談することができる。
本明細書に開示されるように、組換ポリペプチドを含む医薬組成物が本明細書に開示される。組換ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も本明細書に開示される。一部の態様では、治療剤は、自己免疫疾患を治療するために使用することができる抗癌剤または薬剤であり得る。一部の態様では、治療剤は、抗体またはその断片、抗体－薬剤抱合体の一部である抗体またはＦｃ－融合タンパク質であってもよい。一部の態様では、医薬組成物は、非経口投与、皮下投与または直接注射のために製剤化され得る。一部の態様では、注射による投与は、一つ以上の疾患部位（例えば、腫瘍）に、組換ポリペプチド（治療剤に非共有結合している組換ポリペプチドを含む）のいずれかを含む、本明細書に開示される組成物のいずれかを直接投与することを包含し得る。本開示の組成物はまた、本明細書に記載の治療有効量の組換ポリペプチドを含有する。組成物は、様々な投与経路のいずれかによって投与するために製剤化されてもよく、投与経路に応じて変化し得る、１種類以上の生理学的に許容される賦形剤を含んでいてもよい。本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、任意の化合物または物質を意味し、「担体」または「希釈剤」とも呼ぶことができるものも含まれる。いくつかの態様において、本明細書に開示される組成物および組換ポリペプチドは、天然ポリマー、アジュバント、賦形剤、保存剤、吸収遅延剤、充填剤、結合剤、吸収剤、緩衝剤またはこれらの組み合わせをさらに含むことができる。薬学的および生理学的に許容可能な組成物を調製することは、当技術分野ではルーチンであるとみなされ、したがって当業者は、必要に応じて、ガイダンスを求めて多数の当局に相談することができる。
本明細書に開示される医薬組成物は、経口投与または非経口投与のために調製することができる。非経口投与のために調製される医薬組成物として、静脈内（または動脈内）、筋肉内、皮下、腹腔内、経粘膜（例えば、鼻腔内、膣内または直腸）または経皮（例えば、局所）投与のために調製される医薬組成物が挙げられる。エアロゾル吸入も、組換ポリペプチドを送達するためにも使用することができる。したがって、水、緩衝水、生理食塩水、緩衝生理食塩水（例えば、ＰＢＳ）などの水性担体を含むがこれに限定されない、許容可能な担体に溶解または懸濁されている組換ポリペプチドを含む組成物を非経口投与のために調製することができる。ｐＨ調整剤および緩衝剤、張性調整剤、湿潤剤、洗剤などの含まれる賦形剤の１種類以上は、生理学的条件に近似することを助けることができる。組成物が固体成分（それらが経口投与のためにもなり得る）を含む場合、賦形剤のうちの１種類以上は、（例えば、錠剤、カプセルなどの製剤について）結合剤または充填剤として作用することができる。組成物が皮膚または粘膜表面への適用のために製剤化される場合、賦形剤のうちの一種類以上は、クリーム、軟膏などの製剤化のための溶媒または乳化剤になることができる。本明細書に開示される組成物のいずれかは、組成物が注射後にデポに変化するように投与することができる。例えば、注射の前に、本明細書に開示される組成物（例えば、治療剤を含む本明細書に開示される組換ポリペプチド）のいずれかは、可溶性溶液中にあってもよい。例えば、組織に注射した後、組成物は変化し、デポを形成することができる。形成することができるデポは、治療剤の単独の投与と比較して、治療剤を組織により長く保持することができる。
医薬組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌および滅菌されてもよく、または滅菌濾過されてもよい。水性溶液は、そのまま使用するために包装されてもよく、または凍結乾燥されて、本開示によって包含される凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わせることができる。医薬組成物のｐＨは、典型的には、３～１１（例えば、約５～９）または６～８（例えば、約７～８）である。固体形態で結果として生じる組成物は、複数の単一用量単位に包装することができ、各々が、錠剤またはカプセルの密封されたパッケージなど、上述の薬剤の固定量を含有する。固体形態の組成物はまた、局所的に適用できるクリームまたは軟膏のために設計された圧縮可能な管など、柔軟な量の容器に包装されてもよい。
治療方法
癌を有する患者を治療する方法が本明細書に開示されており、方法は、本明細書に開示される組換ポリペプチドのいずれかを含む治療有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む。
癌を有する患者を治療する方法が本明細書に開示されており、方法は、本明細書に開示される組換ポリペプチドのいずれかを含む治療有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む。
癌を有する患者を治療する方法が本明細書に開示されており、方法は、（ａ）治療を必要とする患者を特定し、（ｂ）本明細書に開示される組換ポリペプチドのいずれかを含む治療有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む。
自己免疫疾患を有する患者を治療する方法が本明細書に開示されており、方法は、本明細書に開示される組換ポリペプチドのいずれかを含む治療有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む。自己免疫疾患を有する患者を治療する方法が本明細書に開示されており、方法は、（ａ）治療を必要とする患者を特定し、（ｂ）本明細書に開示される組換ポリペプチドのいずれかを含む治療有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む。
癌を有する対象を治療する方法が本明細書に開示されている。自己免疫疾患を有する対象を治療する方法が本明細書に開示されている。疾患または障害を有する対象に投与される治療剤が、抗体またはその断片である、任意の疾患または障害を治療する方法が本明細書に開示されている。一部の態様では、疾患または障害は、以下に限定されないが、炎症、自己免疫疾患、感染症、血液疾患、心血管疾患、代謝疾患、骨疾患、筋肉疾患、疼痛、眼疾患などを含む。
一部の態様では、方法は、治療有効量の本明細書に開示される医薬組成物を対象に投与することを含むことができる。一部の態様では、方法は、投与工程の前に、治療を必要とする対象を特定することをさらに含むことができる。
腫瘍サイズの縮小を必要とする対象において腫瘍サイズを縮小する方法が本明細書に開示されている。一部の態様では、方法は、本明細書に開示される組換ポリペプチドのいずれかを含む有効量の組成物を対象に投与することを含むことができる。一部の態様では、ＩｇＧ結合ドメインは、治療剤に非共有結合されてもよく、それによって腫瘍サイズが減少する。一部の態様では、腫瘍は悪性腫瘍であってもよい。いくつかの態様において、悪性腫瘍は、乳がん、卵巣がん、肺がん、結腸がん、胃がん、頭頸部がん、神経膠芽腫、腎がん、子宮頸がん、腹膜がん、腎臓がん、膵がん、脳がん、脾臓がん、前立腺がん、尿路上皮がん、皮膚がん、骨髄腫、リンパ腫または白血病であってもよい。
また、組換ポリペプチドに抱合されている治療剤を対象に投与する方法が本明細書に開示されている。一部の態様では、組換ポリペプチドは、ＩｇＧ結合ドメインに共有結合された相同性アミノ酸反復配列を含むことができ、治療剤は、ＩｇＧ結合ドメインに非共有結合的に抱合されている。一部の態様では、抱合体は、直接注射によって投与することができる。いくつかの態様において、治療剤が抱合体として抱合された形態で対象に投与される場合、非抱合形態で同様に同量の前記治療剤を対象に投与する場合に比べて、以下の少なくとも一つである：対象において、（ｉ）治療剤のバイオアベイラビリティがより大きい；（ｉｉ）治療剤の半減期がより大きい；（ｉｉｉ）治療剤の全身毒性がより少ない。
また、治療剤の有効性を増加させる方法または対象における治療剤の半減期を増加させる方法が本明細書に開示されている。いくつかの態様において、方法は、組換ポリペプチドに非共有結合的に抱合されている治療剤を対象に投与することを含むことができ、組換ポリペプチドは、ＩｇＧ結合ドメインに共有結合的に連結されている相同性アミノ酸反復配列を含み、治療剤は、ＩｇＧ結合ドメインに非共有結合的に抱合されており、抱合体は直接投与によって投与され、それによって治療剤の有効性または半減期を増加させることができる。一部の態様では、抱合体は、腫瘍または癌または疾患の部位に直接注射され得る。
一部の態様では、抱合体は、治療有効量で対象に投与することができる。一部の態様では、抱合体は、非経口注射によって対象に投与することができる。一部の態様では、抱合体は、対象に皮下投与することができる。非抱合形態で対象に投与される同量の治療剤に比べて、対象における治療剤のインビボ有効性を増加させることができる。
上述の医薬組成物は、本明細書に開示される組換ポリペプチドのいずれかの治療有効量を含むように製剤化することができる。治療的投与は、予防的適用を包含する。遺伝子検査およびその他の予後方法に基づいて、医師は、その患者と相談して、患者が臨床的に決定した素因を有する、または癌または自己免疫疾患のタイプに対する感受性の増加（場合によっては、感受性の大幅な増加）を有する場合、予防的投与を選択することができる。
本明細書に記載される医薬組成物は、臨床疾患の発症を遅らせ、低減し、または好ましくは予防するのに十分な量で、対象（例えば、ヒト患者）に投与することができる。したがって、一部の態様では、患者または対象は、ヒト患者または対象であってもよい。治療用途では、組成物は、兆候または症状を少なくとも部分的に改善する、または状態、その合併症および結果の症状の進行を阻害する（および好ましくは停止する）のに十分な量で、すでに癌（または自己免疫疾患）を有する、または診断された対象（例えば、ヒト患者）に投与することができる。これを達成するのに適切な量は、「治療有効量」として定義される。治療有効量の医薬組成物は、治癒を達成する量であり得るが、その転帰は、達成され得る数種の一つに過ぎない。上述のように、治療効果量は、癌（または自己免疫疾患）の発症または進行が遅延、阻害、または予防される、癌（または自己免疫疾患）または癌（または自己免疫疾患）の症状が改善される治療を提供する量を含む。一つ以上の症状は、重症度が低い場合がある。治療を受けた個体では、回復が加速され得る。本明細書に記載される組成物内に存在し、哺乳動物（例えばヒト）に適用される本明細書に開示される方法において使用される治療剤のうちの１種類以上の治療有効量は、年齢、体重および他の一般状態（上述のように）の個体差を考慮に入れて、当業者によって決定することができる。一部の態様では、癌は、原発性腫瘍または二次腫瘍であってもよい。他の態様では、原発腫瘍または二次腫瘍は、患者の乳房、肺、結腸、卵巣、頭、首、皮膚、消化管、子宮頸部、腎臓、膵臓、脳、脾臓、前立腺、尿路上皮、リンパ節、血液、腹部の上皮細胞、骨髄、免疫細胞（例えば、脾臓、リンパ球、胸腺）内に存在する可能性がある。
癌を有する患者を治療する方法が本明細書に開示されている。癌は、任意の癌であり得る。一部の態様では、癌は固形癌であり得る。一部の態様では、固形癌は肺がん、結腸がん、乳がん、脳がん、肝がん、前立腺がん、脾臓がん、筋がん、卵巣がん、膵がん、皮膚がん、および黒色腫であってもよい。いくつかの態様では、がんは、乳がん、卵巣がん、肺がん、結腸がん、胃がん、頭頸部がん、神経膠芽腫、腎がん、子宮頸がん、腹膜がん、腎臓がん、膵がん、脳がん、脾臓がん、前立腺がん、尿路上皮がん、皮膚がん、骨髄腫、リンパ腫または白血病であってもよい。一態様では、癌は転移性であってもよい。
自己免疫疾患を有する患者を治療する方法が本明細書に開示されている。自己免疫性疾患は、任意の自己免疫性疾患または障害であってもよい。一部の態様では、自己免疫性疾患または障害は、非ホジキンリンパ腫、関節リウマチ、慢性リンパ性白血病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少性紫斑病、エバンス症候群、血管炎、水疱性皮膚障害、１型糖尿病、シェーグレン症候群、デビック病またはグレーブス病の眼障害であってもよい。
この使用に有効な量は、対象の癌（または自己免疫性疾患）の重症度および体重および一般状態および健康状態に依存し得るが、概して、対象に対する１用量当たり、約０．０５ｕｇ～約１０００ｍｇ（例えば、１～１５ｍｇ／ｋｇ）の組換ポリペプチドの等量を範囲とする。初回投与および追加投与のための適切な投与レジメンは、初回投与によって典型化され、その後、１時間以上毎、毎日、毎週または毎月の間隔で、その後の投与によって反復投与される。例えば、対象は、１用量当たり、非結合または遊離治療剤と比較して、１週間に１回以上（例えば、１週間に２回、３回、４回、５回、６回または７回以上）、約０．０５ｕｇ～１，０００ｍｇの等量の範囲内の治療剤を含む組換ポリペプチドを受けることができる。例えば、対象は、１週間当たり０．１ｕｇ～２，５００ｍｇ（例えば、２，０００、１，５００、１，０００、５００、１００、１０、１、０．５、または０．１ｍｇ）の用量を投与することができる。対象はまた、２週間または３週間に１回、１用量当たり０．１ｕｇ～３，０００ｍｇ／用量の範囲で、本明細書に開示される組換ポリペプチドを投与することができる。対象はまた、２ｍｇ／ｋｇを毎週投与することができる（組換ポリペプチドまたは免疫原性バイオコンジュゲートの任意の部分または成分の重量に基づいて計算された重量を伴う）。
本明細書に開示される医薬組成物中の組換ポリペプチドの総有効量は、ボーラス投与または比較的短い期間にわたる注入のいずれかで、単回投与として哺乳動物に投与することができ、または分割された治療プロトコルを使用して投与することができ、このプロトコルでは、複数の用量がより長期間にわたって投与される（４～６、８～１２、１４～１６もしくは１８～２４時間ごとまたは２～４日ごと１～２週間または月に１回）。あるいは、治療有効濃度を血液中に維持するのに十分な連続的な静脈内注入もまた、本開示の範囲内である。
本開示の組換ポリペプチドは、血清および血流において安定であることができ、一部の場合ではより特異的であってもよいため、任意の個々の成分を含む組換ポリペプチドの用量は、結合していないとき、個々の成分のいずれかの有効量または治療有効量よりも低く（またはより高く）てもよい。したがって、一部の態様では、投与される治療剤（例えば、抗癌剤）は、治療剤（例えば、抗癌剤）が単独で投与される場合、または組換ポリペプチドの一部として投与されない（あるいは組換ポリペプチドと結合していない）場合に比べて、組換ポリペプチドの一部として投与される（あるいは組換ポリペプチドに結合している（例えば、非共有結合的に結合している））場合に、有効性の増加または副作用の減少を有することができる。一部の態様では、治療剤は、治療剤が単独で投与される場合または組換ポリペプチドに結合されていない場合に比べて、組換ポリペプチド（例えば、非共有結合）に投与された場合、半減期の増加を有することができる。
一部の態様では、本明細書に開示される医薬組成物は、（同時に、前または後）で投与されてもよく、または第二の異なる医薬組成物もしくは療法の投与と組み合わされてもよい。第二の医薬組成物または療法は、治療レジメン、癌の種類および重症度または自己免疫疾患の種類および重症度に依存し得る。一部の態様では、第二の医薬組成物または療法は、化学療法であってもよい。
実施例１：免疫チェックポイント抗体の持続的な局所送達のための免疫耐性エラスチン様ポリペプチド（ＩＴＥＰ）
要約 免疫チェックポイント抗体の全身投与に関連する課題に対処するために、免疫チェックポイント抗体の局所送達を改善するために、免疫耐性エラスチン様ポリペプチド（ｉＴＥＰ）に基づくシステムが開発された。ｉＴＥＰの相転移特性により、感熱性送達システムは、注射部位において緩徐に放出するデポを形成することができる。抗体をデポに連結するために、ＩｇＧ結合ドメイン（ＩＢＤ）をｉＴＥＰに融合した。本明細書に記載される結果は、ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドが、抗体の放出を延長し、局所注射部位における抗体の保持時間を増加させることができることを示す。ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドの設計を制御することによって、抗体の放出半減期を約１７．２～約７４．９時間以内に微調整することができる。疾患モデルとして黒色腫を使用して、結果は、ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドが、７２時間超にわたって腫瘍内に抗体を保持したことを示す。また、ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドは、他の臓器および血液循環における抗体曝露を減少させ、それによって副作用のリスクを減少させた。これらの結果は、ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドが、癌対象における免疫チェックポイント抗体の局所送達のためのプラットフォームとして使用することができることを示唆している。
要約 免疫チェックポイント抗体の全身投与に関連する課題に対処するために、免疫チェックポイント抗体の局所送達を改善するために、免疫耐性エラスチン様ポリペプチド（ｉＴＥＰ）に基づくシステムが開発された。ｉＴＥＰの相転移特性により、感熱性送達システムは、注射部位において緩徐に放出するデポを形成することができる。抗体をデポに連結するために、ＩｇＧ結合ドメイン（ＩＢＤ）をｉＴＥＰに融合した。本明細書に記載される結果は、ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドが、抗体の放出を延長し、局所注射部位における抗体の保持時間を増加させることができることを示す。ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドの設計を制御することによって、抗体の放出半減期を約１７．２～約７４．９時間以内に微調整することができる。疾患モデルとして黒色腫を使用して、結果は、ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドが、７２時間超にわたって腫瘍内に抗体を保持したことを示す。また、ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドは、他の臓器および血液循環における抗体曝露を減少させ、それによって副作用のリスクを減少させた。これらの結果は、ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドが、癌対象における免疫チェックポイント抗体の局所送達のためのプラットフォームとして使用することができることを示唆している。
ｉＴＥＰ－ＩＢＤはＩｇＧを捕捉し、ＩｇＧの結合機能に影響を与えなかった。第一のＩＢＤを、異なる分子量（ＭＷ）を有する三つの異なるｉＴＥＰ：ｉＴＥＰ28（配列番号１３）、ｉＴＥＰ56（配列番号１６）およびｉＴＥＰ112（配列番号１７）に融合させた（表２）。次に、各タイプのｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドの転移温度（Ｔｔ）を試験した（図１Ａおよび１Ｂ）。同じ濃度では、ｉＴＥＰ56－ＩＢＤ（配列番号３６）のＴｔは、ｉＴＥＰ112－ＩＢＤ（配列番号３７）よりも高い一方、ｉＴＥＰ28－ＩＢＤ（配列番号３８）よりも低く、これは、ｉＴＥＰ－ＩＢＤのＭＷとＴｔとの間の関係を明らかにし、すなわち、ＭＷが高いほど、Ｔｔが低い。結果はまた、各種類のｉＴＥＰ－ＩＢＤ融合ポリペプチドのＴｔが、濃度の関数であり、濃度が高いほど、Ｔｔが低いことを示した。要約すると、ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドのＴｔは、組織への注射後にｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドが不溶性相に形質転換し、デポを形成することができるように、３７℃よりも低くするべきである。次に、ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドがデポにおいてＩｇＧを捕捉することができるかどうかを調べた。この実験では、ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドとＩｇＧの混合物を３７℃でインキュベートして、デポの形成を可能にした。次いで、デポを回収して、含有されるＩｇＧの量を分析した。デポ内のＩｇＧの割合は、二つの因子、すなわちｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドのＭＷおよびＩｇＧに対するｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドのモル比に依存していたことが分かった（図１Ｃ）。ＩｇＧに対するｉＴＥＰ28－ＩＢＤの比が８以上である場合、ＩｇＧの約５５％がデポに存在した。ｉＴＥＰ56－ＩＢＤおよびｉＴＥＰ112－ＩＢＤについては、比が８以上である場合、ＩｇＧの約９０％がデポに存在した。これらの結果は、デポ内のＩｇＧが、ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドの比およびＭＷを制御することによって、微調整することができることを示唆する。ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドはＩｇＧに結合することができるため、ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドが抗体の標的結合能力に干渉し得るかどうかを評価した。この試験では、抗ＰＤ－１（αＰＤ－１）抗体をモデル抗体として使用した。細胞表面にＰＤ－１を発現する細胞株であるＥＬ４細胞も標的細胞として使用した。フローサイトメトリーの結果（図１Ｄおよび１Ｅ）に示されるように、ｉＴＥＰ112－ＩＢＤと結合した後、αＰＤ－１抗体は、遊離αＰＤ－１抗体と同様に、依然として、ＥＬ４細胞上でＰＤ－１に結合することができる。これらの結果は、ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドが抗体の標的結合能力に影響を与えなかったことを示唆する。
ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドはＩｇＧの放出を持続させた。ｉＴＥＰ－ＩＢＤ融合ポリペプチドはデポ内でＩｇＧを捕捉することができるため、デポからのＩｇＧの放出を確認した。ＩｇＧ放出を、２種類の放出緩衝剤を用いて、インビトロで最初に試験した：ＰＢＳおよび１００％マウス血清。最初の１００時間以内にＩｇＧのバースト放出があり、その後、長期間にわたって定常放出があることが分かった（図２Ａ）。バースト放出は、放出緩衝液によって急速に浸漬されたデポの表面において結合されているＩｇＧから生じ得る。放出緩衝剤がデポを貫通するのにより長い時間をかけたため、デポの内部において結合されているＩｇＧから定常放出が生じる場合がある。マウス血清におけるバースト放出は、ＰＢＳ中よりも明らかであり、おそらく、血清中に存在するプロテアーゼがデポの分解を促進するためであった。研究によると、プロテアーゼは、血清およびプロテアーゼ阻害剤においてタンパク質およびペプチドのタンパク質分解性分解を引き起こし、分解を減少させる可能性があることが分かった（Ｊ．Ｙｉら、Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ ６（５）（２００７）１７６８－８１；およびＲ．Ｂｏｔｔｇｅｒら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２（６）（２０１７）ｅ０１７８９４３）。さらに、血清中のマウスＩｇＧは、ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドへの結合について結合されているＩｇＧと競合し、デポにおいて結合されているＩｇＧを置き換えることができる。この置換がＩｇＧ放出を加速し、血清におけるバースト放出の別の理由となり得る。注射部位における次のＩｇＧ放出をインビボで調べた。この実験では、遊離ＩｇＧまたはｉＴＥＰ112－ＩＢＤとＩｇＧの混合物（ｉＴＥＰ112－ＩＢＤ／ＩｇＧ）をマウスに皮下注射し、注射部位に残っているＩｇＧを経時的に観察した。結果は、２４時間後に注射部位から消失した遊離ＩｇＧと比較して、ｉＴＥＰ112－ＩＢＤが９６時間超にわたって注射部位にＩｇＧを維持することを示す（図２Ｂ）。注射部位における残っているＩｇＧの蛍光強度を経時的に定量化し（図２Ｃ）、異なる数学的モデルを使用してＩｇＧの放出動態を分析した（図７）。異なるモデルの決定係数（表３）によって示されるように、一次モデルが、インビボでのＩｇＧおよびｉＴＥＰ112－ＩＢＤ／ＩｇＧの放出特性を最も良く説明することが判明した。したがって、一次モデルを使用して、他の実験におけるＩｇＧ放出を分析した。一次モデルの分析に基づいて、ＩｇＧの放出半減期は７．１±１．０時間であり、ｉＴＥＰ112－ＩＢＤ／ＩｇＧの放出半減期は２０．７±１．１時間であった（図２Ｃ）。注射後のＩｇＧの血漿濃度も比較した。ＩｇＧを単独で皮下注射した場合、ＩｇＧの血漿濃度は、ＩｇＧをｉＴＥＰ112－ＩＢＤと共に注射した場合よりもはるかに高かった（図４．２Ｄ）。ｉＴＥＰ112－ＩＢＤ／ＩｇＧ（１０６．９ｕｇ／ｍＬ／ｈ）の曲線下面積（ＡＵＣ）は、遊離ＩｇＧのＡＵＣ（１４０２．７ｕｇ／ｍＬ／ｈ）の１３倍低かった。このデータは、ｉＴＥＰ112－ＩＢＤが抗体の全身曝露を減少させる可能性を示し、抗体治療の副作用のリスクを減少させる可能性がある。また、インビボでのｉＴＥＰ56－ＩＢＤ／ＩｇＧおよびｉＴＥＰ28－ＩＢＤ／ＩｇＧの放出（図３Ａ）を調査した。放出動態（図２Ｃおよび３Ｂ）に基づいて、ｉＴＥＰ112－ＩＢＤ／ＩｇＧおよびｉＴＥＰ56－ＩＢＤ／ＩｇＧは、類似の放出半減期（それぞれ２０．７±１．１時間および２３．２±２．２時間）を有し、一方、ｉＴＥＰ28－ＩＢＤ／ＩｇＧは、より短い放出半減期（１７．２±２．４時間）を有したが、これは、ｉＴＥＰ28－ＩＢＤがｉＴＥＰ112－ＩＢＤおよびｉＴＥＰ56－ＩＢＤよりも高いＴｔを有したためであった（図１Ｂ）
ｉＴＥＰ－ＩＢＤ融合タンパク質の架橋は、ＩｇＧの放出に影響を与える。以前の研究では、分子間架橋がｉＴＥＰの安定性に影響を及ぼすことが示されていた（Ｓ．Ｄｏｎｇら、Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ ６（５）（２０１６）６６６－７８）。したがって、ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドの架橋がデポの安定性を増大させ、デポからのＩｇＧの放出速度に影響を与え得るかどうかを検証した。ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドを架橋するために、システイン残基をｉＴＥＰとＩＢＤとの間に導入し（表１）、新しいポリペプチドをｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤと命名した。システイン残基は、酸化状態で分子間ジスルフィド結合を形成するように設計され、したがってｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドを架橋した。ｉＴＥＰ28－Ｃ－ＩＢＤ、ｉＴＥＰ56－Ｃ－ＩＢＤおよびｉＴＥＰ112－Ｃ－ＩＢＤを生成した後、それらのＴｔ（図４Ａおよび４Ｂ）を試験した。システイン残基を添加した後のＴｔの降下：ｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドのＴｔは、対応するｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドのＴｔよりも低かったことが観察された（図１Ｂおよび図４Ｂ）。ｉＴＥＰ28－ＩＢＤと比較して、ｉＴＥＰ28－Ｃ－ＩＢＤのＴｔは３～１０℃低下した。ｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤデポにおけるＩｇＧの割合も調べた。ｉＴＥＰ28－ＩＢＤと比較して、ｉＴＥＰ28－Ｃ－ＩＢＤはより高い割合のＩｇＧをデポに捕捉した（図１Ｃおよび４Ｃ）。同時に、ｉＴＥＰ56－Ｃ－ＩＢＤおよびｉＴＥＰ112－Ｃ－ＩＢＤは、それぞれ、ｉＴＥＰ56－ＩＢＤおよびｉＴＥＰ112－ＩＢＤと同様のパーセンテージのＩｇＧをデポに捕捉した（図１Ｃおよび４Ｃ）。次に、インビボで、ｉＴＥＰ28－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧ、ｉＴＥＰ56－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧおよびｉＴＥＰ112－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧの放出を調べた（図４Ｄ）。ｉＴＥＰ56－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧは、ｉＴＥＰ112－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧと同様の放出半減期を有し（それぞれ２７．９±２．１時間および２６．１±２．０時間）、ｉＴＥＰ28－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧよりも長い放出半減期を有した（２３．２±１．７時間）（図４Ｅ）。また、ｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物の放出半減期は、対応するｉＴＥＰ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物の半減期よりも長かった（図２Ｃ、３Ｂおよび４Ｅ）。これらの結果は、ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドの架橋が、ＩｇＧの放出半減期を増加させる可能性があることを示した。
ＩｇＧに対するｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドの比は、ＩｇＧの放出に影響を与えた。本明細書で論じたｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物（およびｉＴＥＰ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物）の放出試験では、混合物中のＩｇＧに対するｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤポリペプチド（およびｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチド）の比は８：１であった。次に、ｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物中のｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤポリケチドの量がＩｇＧ放出に影響を与える可能性があるかどうかを評価した。したがって、混合物中のＩｇＧの量は、以前の試験と同じままにし、ｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドの量を増加して、ＩｇＧに対するｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドの比を３２：１にした。放出はインビボで観察された。結果は、ｉＴＥＰ112－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧが最長の放出半減期（７４．９±１５．２時間）を有し、続いてｉＴＥＰ56－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧ（３８．３±５．８時間）およびｉＴＥＰ28－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧ（２４．０±２．７時間）であった（図５Ａおよび５Ｂ）。ｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物については、放出半減期は、８：１の比での放出半減期と比較して、３２：１の比で増加した（図４Ｅおよび５Ｂ）。さらに、ｉＴＥＰ112－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物の放出半減期は、２６．１±２．０時間から７４．９±１５．２時間へ増加し、比率の変化は８：１から３２：１へ増加した。これらのデータは、放出半減期が、ＩｇＧに対するｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドの比を増加させることによって増加され得ることを示す。比が増加すると、より多くのｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドがデポを形成し、デポに存在するＩｇＧに遮蔽を提供し、ＩｇＧの放出を遅くすることができる。
ｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドは、腫瘍においてＩｇＧを保持し、全身曝露を減少させた。インビボでＩｇＧ放出を研究した後、ｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドが腫瘍モデル、例えば黒色腫におけるＩｇＧ放出を制御することができるかどうかを試験した。過去の研究によると、抗ＰＤ－１抗体および抗ＣＴＬＡ－４抗体などの免疫チェックポイント抗体の腫瘍内注射は、腫瘍の成長の制御に効果的であることが示された（Ａ．Ｍａｒａｂｅｌｌｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ１２３（６）（２０１３）２４４７－６３；Ｉ．Ｓａｇｉｖ－Ｂａｒｆｉら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ１０（４２６）（２０１８）；Ｊ．Ｉｓｈｉｈａｒａら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ９（４１５）（２０１７））。しかし、遊離抗体は腫瘍内に短時間保持され、全身循環に素早く入り、これは副作用の最適以下の効果およびリスクをもたらす可能性がある（Ｆ．Ｗｕら、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ２９（７）（２０１２）１８４３－５３；およびＤ．Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒら、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ８８（２）（２０１４）２９１－３０９）。これらの課題を解決するために、ｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドが腫瘍内に抗体を保持し、それらの全身曝露を低減することができるかどうかを試験した。遊離ＩｇＧおよびｉＴＥＰ112－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物を黒色腫腫瘍に注射し、その後、異なる時点における腫瘍に残っているＩｇＧを観察した。まず、ＩＶＩＳ撮像を使用して、腫瘍に残っているＩｇＧを可視化した。各時点で、ｉＴＥＰ 112－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物群の方が遊離ＩｇＧ群よりもＩｇＧの残存が多いことが分かった（図６Ａ）。腫瘍に残っているＩｇＧ（図６Ｂ）。両方の時点において、ｉＴＥＰ112－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物群における残っているＩｇＧは、組織１グラム当たりの注射量の割合〔（％ＩＤ）／グラム〕で示されるように、遊離ＩｇＧ群よりも約１０倍多かった。免疫チェックポイント抗体は、正常な臓器において過度に活性化された免疫のため、臓器特異的毒性を引き起こす可能性がある（Ｍ．Ａ．Ｐｏｓｔｏｗら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ３７８（２）（２０１８）１５８－６８；およびＪ．Ｍ．Ｍｉｃｈｏｔら、Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ５４（２０１６）１３９－４８）。抗体は、任意の臓器に潜在的に毒性を引き起こす可能性があるが、一般的に影響を受ける臓器として、肝臓、腎臓、肺、皮膚、内分泌腺および血液系が挙げられる。これらの毒性のいくつかは、肺炎、肝炎および心筋炎など、きわめて重大である（Ｆ．Ｍａｒｔｉｎｓら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２０１９））。これらの臓器における免疫チェックポイント抗体の曝露を制限することは、臓器特異的毒性を低減することができる。そのため、脾臓、肝臓、腎臓、肺および血液を含む臓器におけるＩｇＧの蓄積を調べた。結果は、ｉＴＥＰ112－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物の量が、これらの臓器における遊離ＩｇＧの量よりも有意に少ないことを示す（図６Ｃおよび図６Ｄ）。さらに、ｉＴＥＰ112－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物の血清濃度は、注射から２４時間後では２０倍、注射から７２時間後では１３倍、遊離ＩｇＧの血清濃度より低かった（図６Ｅ）。これらのデータは、ｉＴＥＰ112－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドが腫瘍内に抗体を保持し、他の臓器および全身循環への抗体の曝露を制限できることを明らかにした。
考察 免疫チェックポイント阻害剤などの局所抗体治療は、局所的バイオアベイラビリティの増加、副作用の減少、安価なコストなどの利点から注目を集めている（Ｒ．Ｇ．Ｊｏｎｅｓ、Ａ．Ｍａｒｔｉｎｏ、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３６（３）（２０１６）５０６－２０；Ｋ．Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５２（２２）（１９９２）６３２３－８；Ａ．Ｄ．Ｓｉｍｍｏｎｓ、Ｍ．Ｍｏｓｋａｌｅｎｋｏ、Ｊ．Ｃｒｅｓｏｎ、Ｊ．Ｆａｎｇ、Ｓ．Ｙｉ，Ｍ．Ｊ．ＶａｎＲｏｅｙ、Ｊ．Ｐ．Ａｌｌｉｓｏｎ、Ｋ．Ｊｏｏｓｓ、Ｌｏｃａｌ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ５７（８）（２００８）１２６３－７０；Ｄ．Ｗ．Ｇｒａｉｎｇｅｒ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ４（７）（２００４）１０２９－４４；およびＡ．Ｍａｒａｂｅｌｌｅら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ１９（１９）（２０１３）５２６１－３）。しかしながら、局所注射部位における抗体の保持時間は短く（Ｆ．Ｗｕら、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ２９（７）（２０１２）１８４３－５３）、これは治療能力を制限し、頻繁な注射を必要とする（Ｄ．Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒら、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ８８（２）（２０１４）２９１－３０９）。したがって、より長い時間、注射で抗体を保持できる抗体送達システムを開発する必要がある。本明細書に記載されるように、注射後に体温でデポを形成することができるｉＴＥＰ－ＩＢＤに基づくシステムを開発した。開発されたｉＴＥＰ－ＩＢＤに基づくシステムを使用して、抗体をＩＢＤとの結合を介してデポに捕捉した。その後、デポは、抗体放出を長期間にわたって制御することができた。
ｉＴＥＰ－ＩＢＤに基づくシステムの特色は、抗体放出速度を制御できることである。本明細書に記載される結果は、ＩｇＧ放出速度を制御するために三つの方法を使用することができることを示す。第一に、ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドのＭＷは、Ｔｔに影響を与え、それゆえＩｇＧ放出速度を調節することができる。ｉＴＥＰ28－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物、ｉＴＥＰ56－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物およびｉＴＥＰ112－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物を比較し、その結果は、ｉＴＥＰ56－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物およびｉＴＥＰ112－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物は、同様のＩｇＧ放出半減期を有し、これらの両方がｉＴＥＰ28－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物よりも長かったことを示す。ｉＴＥＰ28－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物のＩｇＧ放出半減期がより短いのは、ｉＴＥＰ28－ＩＢＤポリペプチドのＴｔが高いためであった。ｉＴＥＰ112－ＩＢＤポリペプチドは、ｉＴＥＰ56－ＩＢＤポリペプチドよりもわずかに低いＴｔを有したが、それらは同様のＩｇＧ放出半減期を有し、これはおそらく、Ｔｔのわずかな差が放出半減期に有意な差をもたらさなかったためである。第二に、ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドの架橋は、ＩｇＧ放出速度に影響を与える可能性がある。ｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドは、分子間ジスルフィド結合がｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドを架橋できるように、システイン残基を含有するように設計した。結果は、ｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物のＩｇＧ放出半減期が、対応するｉＴＥＰ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物のＩｇＧ放出半減期よりも長かったことを示す。分子間架橋は、インビボでのデポの安定性を改善し、したがって放出半減期を増加させることができる。ＩｇＧ放出を調節する第三の方法は、ＩｇＧに対するｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドの比を制御することであった。３２：１の比におけるｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物のＩｇＧ放出半減期は、８：１の比における半減期よりも長く、これは、ＩｇＧに対するｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドの比を増加させることによってＩｇＧ放出半減期を増強することができることを示した。８：１から３２：１への比の増加は、ｉＴＥＰ28－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物の半減期を有意に増加しなかった（それぞれ２３．２±１．７時間および２４．０±２．７時間）。この結果の理由は、ｉＴＥＰ28－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドのＴｔに起因する可能性がある。ｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドの濃度の増加に伴い、ｉＴＥＰ56－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドとｉＴＥＰ112－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドの両方のＴｔは減少したが、ｉＴＥＰ28－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドのＴｔは変化しなかった（図４Ｂ）。濃度非依存性Ｔｔは、比の増加が、ｉＴＥＰ28－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物の放出半減期に有意な影響を与えなかった理由を説明することができる。同時に、ｉＴＥＰ56－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物およびｉＴＥＰ112－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物の放出半減期は、８：１の比で類似していた（それぞれ２７．９±２．１時間および２６．１±２．０時間）が、３２：１の比では非常に異なっていた（それぞれ３８．３±５．８時間および７４．９±１５．２時間）。この差の根底にある理由はよく理解されていなかった。ｉＴＥＰ112－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドは、より低いＴｔを有し、ｉＴＥＰ56－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドよりも長い長さであった。差の可能な説明は、より低いＴｔおよびより長い長さは、８：１の比よりも、３２：１の比で、半減期をより顕著に増加させたことである。
これら三つの方法を組み合わせることにより、ＩｇＧ放出半減期を約１６～約６４時間制御することができる。調整可能な放出速度を有する抗体送達システムが望ましい。感染などの急性疾患および関節リウマチなどの慢性症状には、抗体の異なる放出速度が必要となる場合がある。同じ種類の疾患であっても、異なるステージの疾患は、特定の抗体放出速度を必要とする場合がある。これらのデータは、ｉＴＥＰ－ＩＢＤに基づくシステムが、異なる疾患および異なる病態の異なるニーズを満たすための調整可能なプラットフォームを表すことを示唆している。
本明細書に記載される結果は、ｉＴＥＰ112－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドが、腫瘍において抗体を７２時間超保持することができることを示す。この実験では、ｉＴＥＰ112－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドが腫瘍内の抗体保持にどのように影響したかを調べることが実験の目的であったため、腫瘍細胞に対する標的結合能力を有しなかったヒトＩｇＧを使用した。抗体が腫瘍細胞上の膜標的に結合することができる場合、腫瘍におけるそれらの保持はより複雑になりうる。第一に、腫瘍標的に対する抗体の結合は、腫瘍における抗体の蓄積および保持を増加させることができる（Ｃ．Ｆ．Ｍｏｌｔｈｏｆｆら、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ６５（５）（１９９２）６７７－８３）。さらに、抗体結合が標的内部移行を駆動することができる場合、結合されている抗体は、細胞内に内部移行され、分解することができる（Ｇ．Ｍ．Ｔｈｕｒｂｅｒら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ ２９（２）（２００８）５７－６１）。腫瘍部位におけるこれらの抗体のクリアランスは、非線形薬物動態特性である、標的介在性薬物配置のパターンに従う（Ｐ．Ｍ．Ｇｌａｓｓｍａｎ、Ｊ．Ｐ．Ｂａｌｔｈａｓａｒ、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ１１（１）（２０１４）２０～３３）。これらのクリアランスは、標的密度、内部移行率、ターンオーバー率および結合親和性を含む、多くの因子に依存する（Ｗ．Ｗａｎｇら、Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ８４（５）（２００８）５４８－５８）。これらの因子は、抗体が腫瘍標的に結合することができる場合、抗体の保持に影響を与える可能性がある。標的結合能力を有しない抗体を使用することで、これらの因子を除外することができ、抗体保持に関するｉＴＥＰ112－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドの因子を評価した。
本明細書に開示されるデータはまた、ｉＴＥＰ112－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドが全身循環および他の臓器における抗体曝露を低減したという証拠も提供した。非標的臓器への抗体の曝露を制限することは、副作用を低減するために重要である。免疫チェックポイント阻害剤などの治療用抗体は、黒色腫の治療に有効である（Ｆ．Ｓ．Ｈｏｄｉら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ３６３（８）（２０１０）７１１－２３；Ｃ．Ｒｏｂｅｒｔら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ３７２（４）（２０１５）３２０－３０；Ｊ．Ｄｉｎｅら、Ａｓｉａ Ｐａｃ Ｊ Ｏｎｃｏｌ Ｎｕｒｓ４（２）（２０１７）１２７－３５）。しかしながら、免疫チェックポイント抗体の潜在能を制限する一つの課題は、免疫関連副作用である（Ｒ．Ｍ．Ｒｕｇｇｅｒｉら、Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｉｎｖｅｓｔ（２０１８）；Ｊ．Ｎａｉｄｏｏら、Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２６（１２）（２０１５）２３７５－９１；およびＩ．Ｐｕｚａｎｏｖら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ５（１）（２０１７）９５）。異なる免疫チェックポイント抗体を治療のために組み合わせた場合、副作用にさらに問題があった。臨床試験は、抗ＰＤ－１抗体と抗ＣＴＬＡ－４抗体の併用療法を受けている黒色腫患者の５５．０％が、グレード３または４の副作用を有し、患者の３６．４％が、副作用のために治療を中止しなければならなかったことを示した（Ｊ．Ｌａｒｋｉｎら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７３（１）（２０１５）２３－３４）。免疫チェックポイント抗体の副作用は、臓器特異的であり、肝臓、肺、消化管、内分泌腺などに毒性を引き起こす。（Ａ．Ｗｉｎｅｒら、Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｄｉｓ１０（Ｓｕｐｐｌ３）（２０１８）Ｓ４８０－９；およびＦ．Ｍａｒｔｉｎｓら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２０１９））。本明細書に記載されるｉＴＥＰ－ＩＢＤに基づくシステムは、これらの臓器における免疫チェックポイント抗体の曝露を低減することによって、臓器特異的な副作用を低減し得る。さらに、副作用を低減した後、より高い用量の抗体を投与することができ、それにより治療有効性が増強される。
ｉＴＥＰ－ＩＢＤに基づくシステムは、ＩＢＤ部分によって広範なＩｇＧサブクラスに結合することができるため、多用途である（Ｌ．Ｂｊｏｒｃｋ、Ｇ．Ｋｒｏｎｖａｌｌ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１３３（２）（１９８４）９６９－７４；およびＢ．Ａｋｅｒｓｔｒｏｍら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１３５（４）（１９８５）２５８９－９２）。ＩＢＤは、タンパク質Ｇに由来する５６個の残基ドメインである（Ｂ．Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ５（７）（１９８６）１５６７－７５；およびＡ．Ｍ．Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ、Ｇ．Ｍ．Ｃｌｏｒｅ、ＩｍｍｕｎｏＭｅｔｈｏｄｓ２（１）（１９９３）３－８）。ＩＢＤは、ＩｇＧの断片結晶化可能（Ｆｃ）領域および断片抗原結合（Ｆａｂ）領域の両方に結合することができる（Ｍ．Ｅｒｎｔｅｌｌら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ２５（２）（１９８８）１２１－６）。ＩＢＤは、ＣＨ２とＣＨ３ドメインとの間のヒンジ領域においてＦｃに結合し（Ａ．Ｅ．Ｓａｕｅｒ－Ｅｒｉｋｓｓｏｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ３（３）（１９９５）２６５－７８；およびＫ．Ｋａｔｏら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ３（１）（１９９５）７９－８５）、ＣＨ１ドメインにおいてＦａｂに結合する（Ｍ．Ｅｒｎｔｅｌｌら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ２５（２）（１９８８）１２１－１２６；Ｊ．Ｐ．Ｄｅｒｒｉｃｋ、Ｄ．Ｂ．Ｗｉｇｌｅｙ、Ｎａｔｕｒｅ３５９（６３９７）（１９９２）７５２－４；およびＪ．Ｐ．Ｄｅｒｒｉｃｋ、Ｄ．Ｂ．Ｗｉｇｌｅｙ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ２４３（５）（１９９４）９０６－１８）。Ｆａｂに対するその結合親和性は、Ｆｃに対するその結合親和性よりもはるかに弱い（Ｆ．Ｕｎｖｅｒｄｏｒｂｅｎら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ１０（１０）（２０１５）ｅ０１３９８３）。抗体の抗原結合部位は可変ドメインにあり、ＩＢＤ結合部位は定常ドメイン内にあり、これは、ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドがその標的に対する抗体の結合能力を損なわないという観察を説明しうる。可変ドメインに加えて、Ｆｃ部分は、補体依存性細胞傷害、抗体依存性細胞傷害および抗体依存性細胞食作用などの抗体のエフェクター機能も媒介する（Ｃ．Ｋｅｌｌｎｅｒら、Ｔｒａｎｓｆｕｓ Ｍｅｄ Ｈｅｍｔｈｅｒ４４（５）（２０１７）３２７－３６；Ｘ．Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ９（１）（２０１８）６３－７３；およびＳ．Ｂｏｕｒｎａｚｏｓ、Ｃｅｌｌ１５８（６）（２０１４）１２４３－５３）。ｉＴＥＰ－ＩＢＤが抗体のＦｃ媒介機能に影響を与え得るかどうかは不明である。αＰＤ－１抗体などのいくつかの抗体について（Ｒ．Ｄａｈａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ２８（３）（２０１５）２８５－９５；およびＴ．Ｚｈａｎｇ、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ６７（７）（２０１８）１０７９－９０）、それらのエフェクター機構はＦｃに依存しない。したがって、ｉＴＥＰ－ＩＢＤに基づくシステムは、少なくとも、それらの機能を損なうことなく、それらの抗体を送達するために適用することができる。
要するに、抗体の局所送達のための多用途なシステムが開発された。このシステムは、治療効果を増加させ、抗体の副作用を減少させるために使用することができる。
材料および方法 動物および細胞株。体重１９．１±１．２ｇの６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスおよび体重１７．５±１．０ｇの６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社から購入した。ＥＬ４細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、１０％のウマ血清を補充したＤＭＥＭ培地で培養した。Ｂ１６－Ｆ１０細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、１０％のウシ胎児血清、１００ｕｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍＬのペニシリンを補充したＤＭＥＭ培地で培養した。細胞を９５％の空気および５％の二酸化炭素で３７℃で培養した。
ｉＴＥＰ系ポリペプチドの発現。ｉＴＥＰおよびＩＢＤをコードするＤＮＡ配列を合成し（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社）、クローニング法を使用してプラスミドに挿入した（Ｐ．Ｗａｎｇら、Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ８（１）（２０１８）２２３－３６；およびＳ．Ｃｈｏら、Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ２４（４）（２０１６）３２８－３９）。次いで、プラスミドを、ポリペプチドの発現のために、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントな大腸菌細胞に移した。ポリペプチドを精製した（Ｓ．Ｄｏｎｇら、Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ３８（６）（２０１７）９１４－２３；およびＳ．Ｄｏｎｇら、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ １４（１０）（２０１７）３３１２－２１）。ポリペプチド中のエンドトキシンレベルは、インビボ試験のために０．２５ＥＵ／ｍｇ未満であった（Ｐ．Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ１８２（２０１８）９２－１０３）。
ポリペプチドのＴｔの特徴付け。異なる濃度の各ポリペプチド溶液の３５０ｎｍ（ＯＤ３５０）における光学密度を、ＵＶ可視分光光度計（Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を使用して、４～５０℃の温度範囲にわたって監視した。ＯＤ３５０と温度との間の曲線を適合させるために、シグモイド型用量反応非線形回帰（ＧｒａｐｈＰａｄ、バージョン６．０１）を使用した。曲線の最大第一階微分値を、Ｔｔとして決定した。
ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドによって捕捉されたＩｇＧの割合の決定。９７％を超える純度を有するヒトＩｇＧを、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から購入した。ヒトＩｇＧはポリクローナルであり、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含有した。ヒトＩｇＧを分画によりヒト血漿または血清から精製した。ヒトＩｇＧをＮＨＳ－フルオレセイン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で標識した。標識されたＩｇＧおよび遊離フルオレセインを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてＰＤ－１０脱塩カラムによって２回分離した。標識されたＩｇＧを、Ｖｉｖａｓｐｉｎスピンカラム（分子質量カットオフ：１０，０００ｋＤａ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた限外濾過遠心分離により濃縮した。蛍光強度とＰＢＳ中のフルオレセイン標識されたＩｇＧ溶液の濃度との間の線形相関を示す標準曲線を確立した（図８Ａ）。標準曲線中の最低ＩｇＧ濃度の蛍光シグナルは、バックグラウンドシグナルの２０倍高かった。ｉＴＥＰ、ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドおよびｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドは、標識されたＩｇＧ（１ｍｇ／ｍＬ）と共に４℃で指定の比で一晩インキュベートされた。次に、混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、次いで２０，０００ｇで１０分間遠心分離した。遠心分離後、ペレットを収集し、ＰＢＳ溶液に溶解した。溶液を９６ウェルプレートに移して、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ｐｒｏマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社）を使用して蛍光強度（励起４９４ｎｍ、放射５１８ｎｍ）を調べた。蛍光強度を標準曲線に基づいてＩｇＧ濃度に変換した。
抗体結合機能アッセイ。ＥＬ４細胞は、細胞表面にＰＤ－１を発現し、αＰＤ－１抗体によって染色することができる。ｉＴＥＰ112－ＩＢＤポリペプチドをＰＥ抗マウスαＰＤ－１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、クローン：ＲＭＰ１－１４）と共に、４℃で一晩、２０００：１の比でインキュベートした。次いで、ｉＴＥＰ112－ＩＢＤ／αＰＤ－１混合物および遊離αＰＤ－１抗体を使用して、ＥＬ４細胞を染色した。以前に、アイソタイプ対照抗体は、染色なし対照と同様に、ＥＬ４細胞を染色しなかったことが示された（Ｐ．Ｚｈａｏら、Ｎａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ３（４）（２０１９）２９２－３０５）。したがって、アイソタイプ対照抗体は、この実験に含まれなかった。次いで細胞を計数し、フローサイトメトリーにより分析した。染色されたＥＬ４細胞の割合は、ｉＴＥＰ112－ＩＢＤ／αＰＤ－１混合物および遊離αＰＤ－１抗体の標的結合能力を示した。
インビトロでのＩｇＧ放出の検討。ｉＴＥＰ112－ＩＢＤポリペプチドおよびフルオレセイン標識されたＩｇＧ（１ｍｇ／ｍＬ）を８：１の比で、１００ｕＬの総体積で４℃で一晩インキュベートした。次いで、ｉＴＥＰ112－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物を３７℃でインキュベートし、遠心分離してペレットを収集した。次に、ペレットを１００ｕＬのＰＢＳまたは１００％マウス血清に添加した。マウス血清を熱不活化することなくマウス血液から調製し、インタクトな補体系および他の血清成分を維持した。ＩｇＧ抗原免疫複合体は、補体系の古典的経路を刺激する可能性がある（Ｍ．Ｎｏｒｉｓ、Ｇ．Ｒｅｍｕｚｚｚｉ、Ｓｅｍｉｎ Ｎｅｐｈｒｏｌ３３（６）（２０１３）４７９－９２）。しかし、この実験で使用したヒトＩｇＧは抗原結合能力がなく、ＩｇＧ－抗原複合体を形成することができなかったため、マウス血清中の補体系は活性化されず、またはＩｇＧ放出に影響を与えなかった。各時点で、ＰＢＳまたはマウス血清を取り出して蛍光強度を測定して、放出されたＩｇＧを定量した。その間、ペレットを１００ｕＬの新しいＰＢＳまたはマウス血清と共に添加した。マウス血清の蛍光バックグラウンドは、蛍光強度を使用して、本明細書に記載される標準曲線を使用してマウス血清中の放出ＩｇＧを定量化する前に減算された。
インビボでのＩｇＧ放出の検討。ヒトＩｇＧを、スルホ－シアニン７ ＮＨＳエステル（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ社）で標識した。遊離染料をＰＤ－１０脱塩カラムによって除去し、標識されたＩｇＧを、本明細書に記載されるＶｉｖａｓｐｉｎスピンカラムで濃縮した。ｉＴＥＰ－ＩＢＤポリペプチドまたはｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤポリペプチドを、スルホ－シアニン７標識されたＩｇＧと共に４℃で一晩インキュベートした。次いで、ｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物を、０．３％のＨ2Ｏ2で一晩酸化した。ＢＡＬＢ／ｃマウスの毛を刈り、１００ｕＬの遊離ＩｇＧ（１ｍｇ／ｍＬ）、ｉＴＥＰ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物（ＩｇＧの等量）またはｉＴＥＰ－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物（ＩｇＧの等量）を脇腹に皮下注射した。この研究で使用したＩｇＧは、組織の背景を減少させるために、最小限の自己蛍光で近赤外色素であるスルホ－シアニン７で標識された（Ｅ．Ａ．Ｏｗｅｎｓら、Ａｃｃ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ４９（９）（２０１６）１７３１－４０；およびＰ．Ｓ．Ｃｈａｎら、ＡＡＰＳ Ｊ ２１（４）（２０１９）５９）。マウスを、ＩＶＩＳスペクトル（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により、注射直後から２４時間ごとに撮像した（励起７４５ｎｍ、放射８００ｎｍ、曝露１ｓ）。注射部位の放射効率は、ＩＶＩＳ分析ソフトウェアによって定量された。蛍光のスケールを調整して、注射部位の放射効率を定量化する前に、組織自己蛍光の影響をなくした。経時的な放射効率を使用して、インビボでのＩｇＧの放出動態を記述した。
注入されたＩｇＧの血漿濃度の検出。蛍光強度とスルホ－シアニン７標識ＩｇＧの濃度との間の標準曲線を作成した（図８Ｂ）。標準曲線中の最低ＩｇＧ濃度の蛍光シグナルは、バックグラウンドシグナルの６倍高かった。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１００ｕＬのスルホ－シアニン７標識されたＩｇＧ（１ｍｇ／ｍＬ）またはｉＴＥＰ112－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物（ＩｇＧの等量）を脇腹に皮下注射した。各時点で、各マウスから３滴の血液を、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で被覆された管に採取した。次いで、管を２０，０００ｇで１０分間遠心分離して、血漿を収集した。結晶をＰＢＳに希釈して、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ｐｒｏマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社）を使用して蛍光強度（励起７５０ｎｍ、放射７７３ｎｍ）を調べた。血漿の蛍光バックグラウンドを減算した後、蛍光強度を標準曲線によってＩｇＧ濃度に変換した。
腫瘍におけるＩｇＧ保持量および他の臓器における蓄積の決定。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５０ｕＬのＰＢＳ中、５×１０5個のＢ１６－Ｆ１０細胞を脇腹に皮内注射した。腫瘍直径が約０．５ｃｍであった場合、５０μＬのスルホ－シアニン７－標識されたＩｇＧ（２ｍｇ／ｍＬ）またはｉＴＥＰ112－Ｃ－ＩＢＤ／ＩｇＧ混合物（ＩｇＧの等価量）を腫瘍に直接注入した。注射の２４時間後および７２時間後に、マウスを安楽死させた。脾臓、肝臓、腎臓および肺を含む腫瘍および他の臓器を収集した。腫瘍をＩＶＩＳスペクトルによって撮像した（励起７４５ｎｍ、放射８００ｎｍ、曝露１ｓ）。収集された腫瘍および臓器を計量し、ＰＢＳ中で均質化した。ホモジネートを遠心分離して上清を収集し、蛍光強度を測定した。臓器の蛍光バックグラウンドを蛍光強度から減算し、上清中のＩｇＧの量を、本明細書に記載される標準曲線を参照することによって定量した。安楽死直前にマウスから血液も採取した。血液を室温で３０分間保持し、次いで遠心分離して血清を得た。血清をＰＢＳに希釈して蛍光強度を調べた。血清の蛍光バックグラウンドを蛍光強度から減算し、注射されたＩｇＧの血清濃度を本明細書に記載される標準曲線を参照することによって定量した。
統計。各実験の詳細な統計は、各図の凡例に記載されている。対応のない両側スチューデントｔ－検定および一方向ＡＮＯＶＡ検定を使用して、データを分析した。Ｐ＜０．０５を有意差として定義した。
Claims (79)
- 相同性アミノ酸反復配列を含む組換ポリペプチドであって、前記相同性アミノ酸反復配列と少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有し、前記相同性アミノ酸反復配列が、
Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ（配列番号１）；
Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号２）；
Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ（配列番号３）；
Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ（配列番号４）；
Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ（配列番号５）；
Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号６）；
Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号７）；
Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号８）；
Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号９）；
Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ（配列番号１０）；
Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ（配列番号１１）；
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号１２）；
Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号１４）；または
Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号１５）；および
ＩｇＧ結合ドメインである、組換ポリペプチド。 - 前記相同性アミノ酸反復配列が、Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ（配列番号１）またはＧｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号２）である、請求項１に記載の組換ポリペプチド。
- 前記相同性アミノ酸反復配列が反復される、請求項１に記載の組換ポリペプチド。
- 前記相同性アミノ酸反復配列が、２０～３０回、３０～４０回、４０～５０回、５０～６０回、６０～７０回、７０～８０回、８０～９０回、９０～１００回、１００～１１０回または１１０～１２０回反復される、請求項３に記載の組換ポリペプチド。
- 前記相同性アミノ酸反復配列が、（Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ）28（配列番号１３）、（Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ）56（配列番号１６）または（Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ）112（配列番号１７）である、請求項１に記載の組換ポリペプチド。
- 前記ＩｇＧ結合ドメインが、タンパク質Ｇに由来する、請求項１に記載の組換ポリペプチド。
- 前記ＩｇＧ結合ドメインが、前記配列を含む、またはアミノ酸配列ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号１８）と少なくとも７５％同一である、請求項１に記載の組換ポリペプチド。
- 一つ以上のリンカー配列をさらに含む、請求項１に記載の組換ポリペプチド。
- 前記リンカー配列が、ＧＧＧＧＳ（配列番号３４）またはＧＧＧＧＣ（配列番号３５）である、請求項８に記載の組換ポリペプチド。
- 前記リンカー配列が、前記相同性アミノ酸反復配列と前記ＩｇＧ結合ドメインとの間にある、請求項８に記載の組換ポリペプチド。
- 前記組換ポリペプチドが、アミノ酸配列（（ＧＶＬＰＧＶＧ）28－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号３６）；（ＧＶＬＰＧＶＧ）56－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号３７）；または（ＧＶＬＰＧＶＧ）112－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号３８）を含む、請求項１０に記載の組換ポリペプチド。
- 第二のリンカー配列をさらに含み、前記第二のリンカー配列が（ＧＧＧＧＣ）4（配列番号４０）である、請求項９に記載の組換ポリペプチド。
- （ＧＧＧＧＣ）4（配列番号４０）が前記相同性アミノ酸反復配列と第一のリンカー配列との間にある、請求項１２に記載の組換ポリペプチド。
- 前記組換ポリペプチドが、アミノ酸配列（ＧＶＬＰＧＶＧ）28－（ＧＧＧＧＣ）4－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号４１）；（ＧＶＬＰＧＶＧ）56－（ＧＧＧＧＣ）4－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号４２）；または（ＧＶＬＰＧＶＧ）112－（ＧＧＧＧＣ）4－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号４３）を含む、請求項１２に記載の組換ポリペプチド。
- 前記組換ポリペプチドがＮ末端、Ｃ末端またはＮ末端とＣ末端の両方に位置する一つ以上のアミノ酸残基をさらに含み、前記一つ以上のアミノ酸残基がグリシン、アラニンもしくはセリンまたはこれらの組み合わせである、請求項１に記載の組換ポリペプチド。
- 前記組換ポリペプチドが２０～１００ｋＤａの確認された分子量を含む、請求項１に記載の組換ポリペプチド。
- 前記相同性アミノ酸反復配列が、アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号２８）を含まない、請求項１に記載の組換ポリペプチド。
- 前記組換ポリペプチドがジブロックポリマーを含み、前記ジブロックポリマーがＧｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ（配列番号１）およびＧｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号２）を含む、請求項１に記載の組換ポリペプチド。
- 一つ以上の治療剤をさらに含む、請求項１に記載の組換ポリペプチド。
- 前記一つ以上の治療剤が、前記ＩｇＧ結合ドメインに非共有結合している、請求項１９に記載の組換ポリペプチド。
- 前記組換ポリペプチドおよび前記治療剤が、０．５：１、１：１、２：１、４：１、８：１、１６：１、２４：１または３２：１（組換ポリペプチド：治療剤）の比で存在する、請求項１９に記載の組換ポリペプチド。
- 前記治療剤が抗癌剤、ペプチドまたは抗体もしくはその断片である、請求項１９に記載の組換ポリペプチド。
- 前記抗癌剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＣＴＬＡ－４抗体である、請求項２２に記載の組換ポリペプチド。
- 前記抗ＰＤ－１抗体が、ニボルマブ、ペムブロリズマブまたはセミプリマブである、請求項２３に記載の組換ポリペプチド。
- 前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、アベルマブ、デュルバルマブ、またはアテゾリズマブである、請求項２３に記載の組換ポリペプチド。
- 前記抗ＣＴＬＡ－４抗体がイピリムマブである、請求項２３に記載の組換ポリペプチド。
- 請求項１または１９に記載の組換ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
- 前記医薬組成物が非経口投与、皮下投与または直接注射のために製剤化される、請求項２７に記載の医薬組成物。
- 癌を有する対象を治療する方法であって、治療有効量の請求項２７に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記対象がヒト患者である、請求項２９に記載の方法。
- 前記対象が前記投与工程の前に、治療を必要としていることを以前に特定されたことがある、または特定されている、請求項２９に記載の方法。
- 前記癌が、原発腫瘍または二次腫瘍である、請求項２９に記載の方法。
- 前記原発腫瘍または二次腫瘍が、乳がん、卵巣がん、肺がん、結腸がん、胃がん、頭頸部がん、神経膠芽腫、腎がん、子宮頸がん、腹膜がん、腎臓がん、膵がん、脳がん、脾臓がん、前立腺がん、尿路上皮がん、骨髄腫、リンパ腫または白血病である、請求項２９に記載の方法。
- 前記癌が転移性である、請求項２９に記載の方法。
- 前記治療剤が単独または前記組換ポリペプチドに結合されずに投与された場合に比べて、前記組換ポリペプチドに結合されて投与された場合、有効性を増加または副作用が減少している、請求項１９に記載の方法。
- 前記治療剤が単独または前記組換ポリペプチドに結合されずに投与された場合に比べて、前記組換ポリペプチドに非共有結合的に結合されて投与された場合、半減期が増加する、請求項１９に記載の方法。
- 請求項１９に記載の医薬組成物の前記投与が、第二の異なる医薬組成物と組み合わされる、請求項３６に記載の方法。
- 腫瘍サイズの減少を必要とする対象において腫瘍サイズを減少する方法であって、前記方法が、有効量の請求項１に記載の組換ポリペプチドを含む組成物を前記対象に投与することを含み、前記ＩｇＧ結合ドメインが治療剤に非共有結合されており、それによって腫瘍サイズを減少することを含む、方法。
- 前記組換ポリペプチドが、天然ポリマー、アジュバント、賦形剤、保存剤、吸収遅延剤、充填剤、結合剤、吸収剤、緩衝剤またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
- 前記腫瘍が悪性腫瘍である、請求項３８に記載の方法。
- 前記悪性腫瘍が、乳がん、卵巣がん、肺がん、結腸がん、胃がん、頭頸部がん、神経膠芽腫、腎がん、子宮頸がん、腹膜がん、腎臓がん、膵がん、脳がん、脾臓がん、前立腺がん、尿路上皮がん、皮膚がん、骨髄腫、リンパ腫または白血病である、請求項４０に記載の方法。
- 前記相同性アミノ酸反復配列が（Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ）28（配列番号１３）、（Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ）56（配列番号１６）または（Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ）112（配列番号１７）である、請求項３８に記載の方法。
- 前記組換ポリペプチドがジブロックポリマーを含み、前記ジブロックポリマーがＧｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ（配列番号１）およびＧｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号２）を含む、請求項３８に記載の方法。
- 前記ＩｇＧ結合ドメインが前記配列を含む、またはＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号１８）と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列である、請求項３８に記載の方法。
- 組換ポリペプチドが第一のリンカー配列をさらに含み、前記第一のリンカー配列がＧＧＧＧＳ（配列番号３４）である、請求項３８に記載の方法。
- 前記第一のリンカー配列が前記相同性アミノ酸反復と前記ＩｇＧ結合ドメインとの間にある、請求項４５に記載の方法。
- 前記組換ポリペプチドが前記アミノ酸配列（ＧＶＬＰＧＶＧ）28－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号３６）；（ＧＶＬＰＧＶＧ）56－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号３７）；または（ＧＶＬＰＧＶＧ）112－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号３８）を含む、請求項３８に記載の方法。
- 前記組換ポリペプチドが第二のリンカー配列をさらに含み、前記第二のリンカー配列が（ＧＧＧＧＣ）4（配列番号４０）であり、前記第二のリンカー配列が前記相同性アミノ酸反復と前記第一のリンカー配列との間にある、請求項３８に記載の方法。
- 前記組換ポリペプチドが、アミノ酸配列（ＧＶＬＰＧＶＧ）28－（ＧＧＧＧＣ）4－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号４１）；（ＧＶＬＰＧＶＧ）56－（ＧＧＧＧＣ）4－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号４２）；または（ＧＶＬＰＧＶＧ）112－（ＧＧＧＧＣ）4－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号４３）を含む、請求項４８に記載の方法。
- 前記組換ポリペプチドおよび前記治療剤が、０．５：１、１：１、２：１、４：１、８：１、１６：１、２４：１または３２：１（組換ポリペプチド：治療剤）の比で存在する、請求項３８に記載の方法。
- 前記治療剤が抗癌剤、ペプチドまたは抗体もしくはその断片である、請求項３８に記載の方法。
- 前記抗癌剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＣＴＬＡ－４抗体である、請求項５１に記載の方法。
- 前記抗ＰＤ－１抗体が、ニボルマブ、ペムブロリズマブまたはセミプリマブである、請求項５２に記載の方法。
- 前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、アベルマブ、デュルバルマブまたはアテゾリズマブである、請求項５１に記載の方法。
- 前記抗ＣＴＬＡ－４抗体がイピリムマブである、請求項５２に記載の方法。
- 組換ポリペプチドに抱合されている治療剤を対象に投与する方法であって、前記組換ポリペプチドが、ＩｇＧ結合ドメインに共有結合している相同性アミノ酸反復配列を含み、前記治療剤が、前記ＩｇＧ結合ドメインに非共有結合的に抱合されており、前記抱合体が直接注射により投与される、方法。
- 前記治療剤が前記抱合体として抱合された形態で前記対象に投与される場合、非抱合形態で同様に同量の前記治療剤を前記対象に投与する場合に比べて、前記対象において以下の少なくとも一つ：（ｉ）前記治療剤のバイオアベイラビリティがより大きい；（ｉｉ）前記治療剤の半減期がより大きい；（ｉｉｉ）前記治療剤の全身毒性がより少ない、である、請求項５６に記載の方法。
- 対象において治療剤の有効性を増加し、または治療剤の半減期を増加させる方法であって、前記方法が組換ポリペプチドに抱合されている治療剤を前記対象に投与することを含み、前記組換ポリペプチドがＩｇＧ結合ドメインに共有結合されている相同性アミノ酸反復配列を含み、前記治療剤が前記ＩｇＧ結合ドメインに非共有結合的に抱合されており、前記抱合体が直接注射によって投与されており、それによって前記治療剤の有効性または半減期が増加する、方法。
- 前記治療剤が抗癌剤である、請求項５７または請求項５８に記載の方法。
- 前記抗癌剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＣＴＬＡ－４抗体である、請求項５９に記載の方法。
- 前記抗ＰＤ－１抗体が、ニボルマブ、ペムブロリズマブまたはセミプリマブである、請求項６０に記載の方法。
- 前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、アベルマブ、デュルバルマブまたはアテゾリズマブである、請求項６０に記載の方法。
- 前記抗ＣＴＬＡ－４抗体がイピリムマブである、請求項６０に記載の方法。
- 前記抱合体が治療有効量で前記対象に投与される、請求項５６または請求項５８に記載の方法。
- 前記抱合体が非経口注射によって前記対象に投与される、請求項５６または請求項５８に記載の方法。
- 前記抱合体が前記対象に皮下投与される、請求項５６または請求項５８に記載の方法。
- 前記対象が癌を有する、請求項５６または請求項５８に記載の方法。
- 前記癌が固形癌である、請求項５６または請求項５８に記載の方法。
- 前記固形癌が、肺がん、結腸がん、乳がん、脳がん、肝がん、前立腺がん、脾臓がん、筋がん、卵巣がん、膵がん、皮膚がんおよび黒色腫である、請求項６８に記載の方法。
- 前記治療剤の前記インビボ有効性が、非抱合形態で前記対象に投与される同量の前記治療剤に比べて、前記対象において増加される、請求項５６または請求項５８に記載の方法。
- 前記相同性アミノ酸反復配列が前記相同性アミノ酸反復と少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を有し、前記相同性アミノ酸反復が、
Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ（配列番号１）；
Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号２）；
Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ（配列番号３）；
Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ（配列番号４）；
Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ（配列番号５）；
Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号６）；
Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号７）；
Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号８）；
Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号９）；
Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ（配列番号１０）；
Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ（配列番号１１）；
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号１２）；
Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号１４）；またはＧｌｙ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（配列番号１５）である、請求項５６または請求項５８に記載の方法。 - 前記相同性アミノ酸反復配列がＧｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ（配列番号１）である、請求項７１に記載の方法。
- 前記相同性アミノ酸反復配列が（Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ）28（配列番号１３）、（Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ）56（配列番号１６）または（Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ）112（配列番号１７）である、請求項５６または請求項５８に記載の方法。
- 前記ＩｇＧ結合ドメインが前記配列を含み、またはＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号１８）と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列である、請求項５６または請求項５８に記載の方法。
- 組換ポリペプチドが第一のリンカー配列をさらに含み、前記第一のリンカー配列がＧＧＧＧＳ（配列番号３４）であり、前記相同性アミノ酸反復と前記ＩｇＧ結合ドメインとの間にある、請求項５６または請求項５８に記載の方法。
- 前記組換ポリペプチドが前記アミノ酸配列（ＧＶＬＰＧＶＧ）28－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号３６）；（ＧＶＬＰＧＶＧ）56－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号３７）；または（ＧＶＬＰＧＶＧ）112－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号３８）を含む、請求項５６または請求項５８に記載の方法。
- 前記組換ポリペプチドが第二のリンカー配列をさらに含み、前記第二のリンカー配列が（ＧＧＧＧＣ）4（配列番号４０）であり、前記第二のリンカー配列が前記相同性アミノ酸反復と前記第一のリンカー配列との間にある、請求項７５に記載の方法。
- 前記組換ポリペプチドが、アミノ酸配列（ＧＶＬＰＧＶＧ）28－（ＧＧＧＧＣ）4－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号４１）；（ＧＶＬＰＧＶＧ）56－（ＧＧＧＧＣ）4－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号４２）；または（ＧＶＬＰＧＶＧ）112－（ＧＧＧＧＣ）4－ＧＧＧＧＳ－ＴＴＹＫＬＶＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ（配列番号４３）を含む、請求項７７に記載の方法。
- 前記組換ポリペプチドおよび前記治療剤が、．５：１、１：１、２：１、４：１、８：１、１６：１、２４：１または３２：１（組換ポリペプチド：治療剤）の比で存在する、請求項５６または請求項５８に記載の方法。
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