KR20220103916A - 면역 내성 엘라스틴-유사 재조합 펩티드 및 사용 방법 - Google Patents

면역 내성 엘라스틴-유사 재조합 펩티드 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본원에 개시된 것은, IgG 결합 도메인과 융합된 하나 이상의 상동성 아미노산 반복을 포함하는 재조합 폴리펩티드이다. 재조합 폴리펩티드는 치료 항체에 결합될 수 있고, 전달 비히클을 사용하여 치료 항체의 보유 시간을 증가시키고 전신 관련 부작용을 감소시킬 수 있다. 또한, 본원에 개시된 것은 치료 항체에 결합된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물; 및 암의 치료를 위해 환자에게 이를 투여하는 방법이다.

Description

면역 내성 엘라스틴-유사 재조합 펩티드 및 사용 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2019년 8월 23일에 출원된 미국 가출원 62/890,936의 출원일의 이익을 주장한다. 이전에 출원된 본 출원의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
서열 목록의 통합
본 출원은, 2020년 5월 29일에 생성되고, 크기가 65,536 바이트인 파일명 21101_0378P1_Sequence_Listing을 담고 있는, EFS-Web을 통해 본 출원과 동시에 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 포함하고 있으며, 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
면역 관문 항체는 다양한 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 현재까지는, 이용 가능한 임상 면역 관문 항체를 정맥내 투여한다. 면역 관문 항체의 전신 투여는 파종성 종양을 제어하는 데 효과적이다. 그러나, 종양이 국소 영역에 국한되는 경우에는, 전신 항체 치료는 효율적이지 않으며 종종 부작용과 연관된다. 이러한 경우에는, 면역 관문 항체의 국소 전달이 치료 효능을 증가시키고 부작용을 감소시킴으로써 이점을 제공할 수 있다. 그러나, 전달 시스템이 없으면, 국소 투여되는 항체는 국소 영역에서 짧은 보유 시간 및 전신 순환에 대한 높은 노출에 처하게 된다. 이러한 어려움은 국소 면역 관문 항체 치료가 예상대로 덜 유망하게 만든다. 따라서, 면역 관문 항체를 국소적으로 전달하기 위한 대안적인 방법이 필요하다.
상동성 아미노산 반복 서열과 적어도 75%의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 상동성 아미노산 반복 서열을 포함하는 재조합 폴리펩티드가 본원에 개시되며, 여기서 상동성 아미노산 반복 서열은 다음과 같다: Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly (서열번호 1); Gly-Ala-Gly-Val-Pro-Gly (서열번호 2); Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly (서열번호 3); Val-Pro-Gly-Leu-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly (서열번호 4); Val-Pro-Gly-Leu-Gly-Val-Gly-Ala-Gly (서열번호 5); Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly-Gly (서열번호 6); Gly-Val-Leu-Pro-Gly (서열번호 7); Gly-Leu-Val-Pro-Gly-Gly (서열번호 8); Gly-Leu-Val-Pro-Gly (서열번호 9); Gly-Val-Pro-Leu-Gly (서열번호 10); Gly-Ile-Pro-Gly-Val-Gly (서열번호 11); Gly-Gly-Val-Leu-Pro-Gly (서열번호 12); Gly-Val-Gly-Val-Leu-Pro-Gly (서열번호 14); 또는 Gly-Val-Pro-Gly (서열번호 15); 및 IgG 결합 도메인.
대상체에서 치료제의 효능을 증가시키거나 치료제의 반을 증가시키는 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 재조합 폴리펩티드에 접합된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 재조합 폴리펩티드는 IgG 결합 도메인에 공유 결합된 상동성 아미노산 반복 서열을 포함하고, 상기 치료제는 상기 IgG 결합 도메인에 비공유 접합되고, 상기 접합체는 직접 주사에 의해 투여되고, 이에 의해 상기 치료제의 효능 또는 반감기가 증가된다.
도 1a-e는 iTEP-IBD 폴리펩티드의 Tt의 특성 분석 및 iTEP-IBD 폴리펩티드와 항체 사이의 결합을 보여준다. 도 1a는 온도 변화에 따른 iTEP-IBD 폴리펩티드 용액의 탁도를 나타낸 대표도이다. 용액의 탁도는 350 nm에서의 흡광도로 특성화되었다. 도 1b는 각각의 iTEP-IBD 폴리펩티드의 Tt가 그 농도에 의존적임을 보여준다 (n = 3 생물학적으로 독립적인 시료, Tukey 사후 검정을 이용한 단방향 ANOVA). 도 1c는 IgG에 결합된 iTEP-IBD 폴리펩티드 및 데포에 포획된 IgG를 보여준다. 데포 내의 IgG 백분율은 iTEP-IBD 폴리펩티드 대 IgG의 비율에 의존적이었다 (n = 5 생물학적으로 독립적인 시료, Tukey 사후 검정을 이용한 단방향 ANOVA). 도 1d는 iTEP-IBD 폴리펩티드가 αPD-1 항체의 표적 결합 능력에 영향을 미치지 않았음을 보여준다. 유리 αPD-1 항체 및 iTEP112-IBD/αPD-1 폴리펩티드는 유사하게 표적 세포를 염색하였다 (n = 6 생물학적으로 독립적인 시료, 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정). 도 1e는 αPD-1 항체 및 iTEP112-IBD/αPD-1 폴리펩티드의 유사한 표적 결합 능력을 보여준 대표적인 유세포 계측 플롯이다. 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로서 표시하였다. ****P < 0.0001, NS = 유의하지 않음.
도 2a-d는 iTEP112-IBD/IgG의 방출 프로파일 및 낮은 혈장 농도를 보여준다. 도 2a는 PBS 또는 마우스 혈청 중 iTEP112-IBD/IgG 데포로부터의 IgG의 시험관 내 방출 곡선을 보여준다 (n = 3 생물학적으로 독립적인 시료, 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정). 도 2b는 IgG 또는 iTEP112-IBD/IgG를 피하 주사한 마우스 (n = 5 마우스)의 형광 IVIS 이미징을 보여준다. iTEP112-IBD 폴리펩티드 대 IgG의 비율은 8:1이었다. 표지된 IgG의 존재를 이미지 상에서 황색/적색으로 표시하였다. 도 2c는 도 2b에 도시된 바와 같이 마우스에서 남은 IgG의 복사 효율의 정량화를 보여준다 (n = 5 마우스, 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정). 각 시점에서의 복사 효율을 초기 복사 효율로 정규화하였다. 방출 반감기(t 1/2)는 시간 및 정규화된 복사 효율을 일차 방출 모델에 피팅하여 계산하였다. 도 2d는 IgG가 단독으로 또는 iTEP112-IBD와 함께 주사되었을 때 시간 경과에 따른 설포-시아닌7-표지된 IgG의 마우스 혈장 농도를 보여준다 (n = 5 마우스, 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정). iTEP112-IBD 폴리펩티드 대 IgG의 비율은 8:1이었다. 데이터는 평균 ± SD로 나타냈다. *P < 0.5, ****P < 0.0001.
도 3a-b는 iTEP28-IBD/IgG 및 iTEP56-IBD/IgG의 생체 내 방출 프로파일을 보여준다. 도 3a는 iTEP28-IBD/IgG 또는 iTEP56-IBD/IgG가 주사된 마우스 (n = 5 마우스)의 형광 IVIS 이미징을 보여준다. iTEP28-IBD 폴리펩티드 및 iTEP56-IBD 폴리펩티드 대 IgG의 비율은 8:1이었다. 도 3b는 도 3a에 도시된 바와 같이 주사 부위에서 남은 IgG의 복사 효율의 정량화를 보여준다 (n = 5 마우스, 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정). 데이터는 평균 ± SD로 나타냈다. **P < 0.01.
도 4a-d는 iTEP-C-IBD 폴리펩티드의 특성 분석 및 iTEP-C-IBD/IgG의 생체 내 방출 프로파일을 보여준다. 도 4a는 온도에 대한 iTEP-C-IBD 폴리펩티드 용액의 탁도를 나타낸 대표도이다. 도 4b는 iTEP-C-IBD 폴리펩티드의 Tt의 농도 의존성을 보여주는 플롯이다 (n = 3 생물학적으로 독립적인 시료, Tukey 사후 검정을 이용한 단방향 ANOVA). 도 4c는 iTEP-C-IBD 폴리펩티드 데포 내 포획된 IgG를 보여준다 (n = 5 생물학적으로 독립적인 시료, Tukey 사후 검정을 이용한 단방향 ANOVA). 도 4d는 iTEP28-C-IBD/IgG, iTEP56-C-IBD/IgG, 또는 iTEP112-C-IBD/IgG가 주사된 마우스(n = 5 마우스)의 형광 IVIS 이미징을 보여준다. iTEP-C-IBD 폴리펩티드 대 IgG의 비율은 8:1이었다. 도 4e는 도 4d에 도시된 바와 같이 시간 경과에 따른 남은 IgG의 복사 효율의 정량화를 보여준다 (n = 5 마우스, Tukey 사후 검정을 이용한 단방향 ANOVA). 데이터는 평균 ± SD로 나타냈다. **P < 0.01, ****P < 0.0001, NS = 유의하지 않음.
도 5a-b는 32:1의 비율에서 iTEP-C-IBD/IgG의 생체 내 방출 프로파일을 보여준다. 도 5a는 iTEP28-C-IBD/IgG, iTEP56-C-IBD/IgG, 또는 iTEP112-C-IBD/IgG가 주사된 마우스(n = 5 마우스)의 형광 IVIS 이미징을 보여준다. iTEP-C-IBD 폴리펩티드 대 IgG의 비율은 32:1이었다. 도 5b는 도 5a에 도시된 바와 같이 주사 부위에서의 남은 IgG의 복사 효율의 정량화를 보여준다 (n = 5 마우스, Tukey 사후 검정을 이용한 단방향 ANOVA). 데이터는 평균 ± SD로 나타냈다. ***P < 0.001, NS = 유의하지 않음.
도 6a-e는 혈액, 종양 및 기타 기관에서 iTEP112-C-IBD/IgG의 분포를 보여준다. 도 6a는, 주사 후 24시간 및 72시간 시점에 유리 IgG 또는 iTEP112-C-IBD/IgG를 주사한 종양의 형광 IVIS 이미징을 보여준다 (n = 5 마우스). iTEP112-C-IBD 폴리펩티드 대 IgG의 비율은 8:1이었다. 도 6b는 유리 IgG 또는 iTEP112-C-IBD/IgG를 직접 주사한 종양에서 IgG의 축적을 보여준다 (n = 5 마우스, 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정). 데이터는 조직 그램 당 주사된 투여량의 백분율, (ID%)/그램으로서 표현하였다. 주사 후 24시간(도 6c) 및 72시간(도 6e) 시점에 비장, 간, 신장 및 폐에서 IgG의 축적을 보여준다 (n = 5 마우스, 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정). 도 6e는 주사 후 24시간 및 72시간 시점에 주사된 IgG의 마우스 혈청 농도를 보여준다 (n = 5 마우스, 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정). 데이터는 평균 ± SD로 나타냈다. *P < 0.5, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
도 7a-e는 상이한 수학 모델을 사용하는 IgG 및 iTEP112-IBD/IgG의 생체 내 방출 동역학을 보여준다. 각 시점에서 수집된 데이터는 0시간으로 간주될 때 주사 직후에 수집된 데이터로 정규화되었다. 영차 모델(도 7a), 일차 모델(도 7b), Higuchi 모델(도 7c), Hixson-Crowell 모델(도 7d), 및 Korsmeyer-Peppas 모델(도 7e)를 사용해 방출 동역학을 분석하였다. 각 적합선의 방정식 및 결정 계수(R2)를 각 플롯에 표시하였다.
도 8a-b는 표지된 IgG의 표준 곡선을 보여준다. 곡선들은 PBS 용액 중의 플루오레세인-표지된 IgG(도 8a) 및 설포-시아닌7-표지된 IgG(도 8b)의 형광 강도와 농도 사이의 선형 상관 관계를 보여주었다. 각 선의 방정식 및 결정 계수(R2)를 플롯에 표시하였다. 저에서 고까지의 두 표준 곡선에서 IgG의 농도는 0.0003, 0.0009, 0.0027, 0.0081, 및 0.0243 mg/mL이었다. 표준 곡선에서 최저 IgG 농도의 형광 신호는 배경 신호보다 20배(도 8a) 및 6배(도 8b) 높았다. 표준 곡선을 사용하여 이들 생물학적 성분 중의 IgG 농도를 계산하기 전에, 혈장, 혈청 및 다른 조직의 형광 배경을 차감하였다.
본 개시는 다음의 상세한 설명, 본원에 포함된 도면 및 예를 참조하여 보다 쉽게 이해될 수 있다.
본 방법 및 조성물이 개시되고 기술되기 전에, 이들은 달리 명시되지 않는 한 특정 합성 방법에 한정되지 않거나, 달리 명시되지 않는 한 특정 시약에 한정되지 않는 것으로 이해해야 하며, 이는 물론 달라질 수 있다. 또한, 본원에 사용되는 용어가 단지 특정 측면을 설명하기 위한 것이며 제한하려고 의도되지 않은 것을 이해해야 한다. 본원에 설명된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 재료를 이제 설명하기로 한다.
또한, 달리 명백하게 언급되지 않는 한, 본원에 설명된 임의의 방법이 그 단계가 특정 순서로 수행될 것을 요구하는 것으로 해석되는 것은 결코 의도되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 방법 청구항이 실제로 그 단계를 뒤따르는 순서를 언급하지 않거나, 그 단계가 특정 순서로 제한되어야 한다는 것이 청구범위 또는 설명에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 경우, 어떠한 측면에서도, 순서가 암시되는 것은 결코 의도되지 않는다. 이것은 단계 또는 작동 흐름의 배열에 대한 논리의 문제, 문법적 구조 또는 구두점으로부터 파생된 단순 의미, 본 명세서에 설명된 측면의 수 또는 유형을 포함하여, 해석에 대한 임의의 가능한 비-명시적 근거를 유지한다.
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정의
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 “a”, “an”, 및 “the”는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다.
본원에서 사용된 “또는”이라는 단어는 특정 목록 중의 어느 한 구성원을 의미하며, 또한 그 목록 중의 임의의 구성원의 조합을 포함한다.
범위는 본원에서 “약” 또는 “대략” 하나의 특정 값, 및/또는 “약” 또는 “대략” 다른 특정 값으로 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 때, 추가 측면은 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 값이 선행하는 “약”, 또는 “대략”의 사용에 의해, 근사치로 표현될 때, 특정 값이 추가 측면을 형성하는 것이 이해될 것이다. 범위 각각의 종료점이 다른 종료점과 관련하여, 그리고 다른 종료점과 무관하게 둘 모두에서 중요하다는 것이 추가로 이해될 것이다. 또한, 본원에 개시된 다수의 값이 있으며 각각의 값은 그 값 자체에 더하여 “약” 그 특정 값으로서도 본원에 개시된다는 것이 이해된다. 예를 들어, 값 “10”이 개시되면, “약 10”도 개시된다. 또한, 2개의 특정 유닛 사이의 각각의 유닛이 또한 개시되는 것으로 이해된다. 예를 들어, 10 및 15가 개시되면, 11, 12, 13 및 14도 개시된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 “선택적” 또는 “선택적으로”는, 후속적으로 설명되는 사건 또는 상황이 발생할 수도 있거나 발생하지 않을 수도 있고, 상기 설명이 상기 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 그렇지 않은 경우를 포함하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “시료”는 대상체로부터의 조직 또는 기관; 세포 (대상체로부터 직접 취해져서, 대상체 내에 있거나, 배양에서 또는 배양된 세포주에서 유지된 세포); 세포 용해물 (또는 용해물 분획) 또는 세포 추출물; 또는 본원에 설명된 바와 같이 검정된 세포 또는 세포성 물질 (예를 들어, 폴리펩티드 또는 핵산)로부터 유래된 하나 이상의 분자를 함유하는 용액을 의미한다. 시료는 또한 세포 또는 세포 성분을 함유하는 임의의 체액 또는 분비물(예를 들어, 혈액, 소변, 대변, 침, 눈물, 담즙을 포함하지만 이에 한정되지 않음)일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “대상체”는 투여 표적, 예를 들어, 인간을 지칭한다. 따라서, 개시된 방법의 대상체는 포유류, 어류, 조류, 파충류, 또는 양서류와 같은 척추동물일 수 있다. 용어 “대상체”는 가축(예를 들어, 고양이, 개 등), 가축(예를 들어, 소, 말, 돼지, 양, 염소 등), 및 실험실 동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 랫트, 기니피그, 초파리 등)을 또한 포함한다. 일 측면에서, 대상체는 포유동물이다. 또 다른 측면에서, 대상체는 인간이다. 상기 용어는 특정 연령 또는 성별을 나타내지 않는다. 따라서, 성인, 아동, 청소년 및 신생아 대상체 뿐만 아니라, 태아는, 남성이든 여성이든, 포함되도록 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “환자”는 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체를 지칭한다. 용어 “환자”는 인간 및 수의학 대상체를 포함한다. 개시된 방법의 일부 측면에서, “환자”는 암으로 진단되었다. 개시된 방법의 일부 측면에서, “환자”는, 예를 들어, 환자에게 치료제를 투여하기 전과 같이, 암 치료를 필요로 하는 것으로 식별되었다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “포함하는”은 “이루어지는” 및 “필수적으로 이루어지는” 측면들을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “아미노산” 및 “아미노산 동일성”은 개시된 변이체, 펩티드 또는 이의 단편 중 어느 하나에 있을 수 있는 20개의 자연 발생 아미노산 중 하나 또는 임의의 비-자연 유사체를 지칭한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이 “아미노산”은 자연 발생 아미노산 및 합성 아미노산 둘 다를 의미한다. 예를 들어, 호모페닐알라닌, 시트룰린 및 노르류신은 본 발명의 목적을 위해 아미노산으로 간주된다. “아미노산”은 또한 프롤린 및 하이드록시프롤린과 같은 아미노산 잔기를 포함한다. 측쇄는 (R) 또는 (S) 구성일 수 있다. 비-자연 발생 측쇄가 사용되는 경우, 예를 들어 생체 내 분해를 방지하거나 지연시키기 위해, 비-아미노산 치환체가 사용될 수 있다.
용어 “단편”은 참조 펩티드와 실질적으로 동일하고 참조 펩티드의 생물학적 활성을 보유하는 펩티드의 부분(예를 들어, 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 등 아미노산)을 지칭할 수 있다. 일부 측면에서, 단편 또는 부분은 본원에 설명된 참조 펩티드의 생물학적 활성의 적어도 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%를 보유한다. 또한, 참조된 펩티드의 단편은 참조된 폴리펩티드의 연속 또는 인접 부분일 수 있다(예를 들어, 10개의 아미노산 길이인 펩티드의 단편은 해당 펩티드 내의 임의의 2-9개의 인접 잔기일 수 있다).
“변이체”는 N- 및/또는 C-말단 아미노산 잔기 또는 잔기들의 단지 단순한 결실 이외의 참조 서열과 몇몇 방식으로 차이를 의미할 수 있다. 변이체가 아미노산 잔기의 치환을 포함하는 경우, 치환은 보존적 또는 비보존적인 것으로 간주될 수 있다. 보존적 치환은 다음 그룹 내의 치환이다: Ser, Thr, 및 Cys; Leu, Ile, 및 Val; Glu 및 Asp; Lys 및 Arg; Phe, Tyr 및 Trp; 및 Gln, Asn, Glu, Asp 및 His. 변이체는 적어도 하나의 치환 및/또는 적어도 하나의 첨가를 포함할 수 있고, 또한 적어도 하나의 결실이 있을 수 있다. 변이체는 또한 하나 이상의 비-자연 발생 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 변이체는 시스테인을 대신하는 것을 비롯하여, 임의의 위치에 셀레노시스테인(예: 셀레노-L-시스테인)을 포함할 수 있다. 많은 다른 “비천연” 아미노산 치환체는 당 기술분야에 공지되어 있고 상업적 공급원으로부터 이용 가능하다. 비-자연 발생 아미노산의 예는 D-아미노산, 시스테인의 황 원자에 부착된 아세틸아미노메틸기를 갖는 아미노산 잔기, 페길화 아미노산, 및 식 NH2(CH2)nCOOH의 오메가 아미노산을 포함하며, 여기서 n은 2-6 중성, 무극성 아미노산, 예컨대 사르코신, t-부틸 알라닌, t-부틸 글리신, N-메틸 이소류신 및 노르류신이다. 페닐글리신은 Trp, Tyr, 또는 Phe를 치환할 수 있고; 시트룰린 및 메티오닌 설폭시드는 중성 무극성이고, 시스테산은 산성이고, 오르니틴은 염기성이다. 프롤린은 히드록시프롤린으로 치환될 수 있고, 프롤린의 특성을 부여하는 입체구조를 보유할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “iTEP”는 면역-내성, 엘라스틴-유사 폴리펩티드를 의미한다. iTEP는 이전에 개시된 엘라스틴-유사 폴리펩티드(ELP로 지칭함; ELP는 D.M. Floss, 등, Elastin-like polypeptides revolutionize recombinant protein expression and their biomedical application, Trends Biotechnol. 28(1) (2010) 37-45; 및 T. Kowalczyk, 등, Elastin-like polypeptides as a promising family of genetically-engineered protein based polymers, World J. Microbiol. Biotechnol. 30(8) (2014) 2141-52.)와 상이할 수 있다. iTEP는 상 전이 특성을 가지며 면역-내성을 갖는다. 본원에 개시된 iTEP 서열은, 예를 들어, 20 내지 120회 반복되고, IgG 결합 도메인에 융합되어 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드 중 하나 이상을 형성할 수 있는 상동성 아미노산 서열로서 지칭될 수 있다. 일부 측면에서, iTEP 서열은 링커를 통해 IgG 결합 도메인(예: IBD)에 융합될 수 있다. 일부 측면에서, 용어 “iTEP-IBD 폴리펩티드”는 iTEP 서열과 IBD 사이의 링커 서열을 포함한다.
도입부
단클론 항체(예를 들어, IgG)는 의학에 널리 사용된다. 이는 치료용 IgG가 다른 조직 및 세포에 노출되는 것을 감소시키면서 표적 세포에 대한 IgG의 생체이용률을 증가시키기 때문에, 표적 조직 내부의 치료용 IgG의 분포를 제한하는 것이 종종 요망된다. 다른 조직 및 세포에 IgG가 노출되는 것은 종종 부작용을 초래한다. 표적 조직 내부의 IgG의 분포 및 축적을 증가시키기 위해, IgG를 조직에 직접 주사하고 있다. 하지만, 주사된 IgG이 신속하게 조직 외부로 확산된다. 조직 내 IgG의 보유 시간 및 보유량을 증가시키기 위한 조성물 및 방법이 본원에 개시된다. 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드 및 조성물은 면역-내성 엘라스틴-유사 펩티드(iTEP, immune-tolerant elastin-like peptide) 및 IgG 결합 도메인을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 상동성 아미노산 반복을 포함하는 재조합 폴리펩티드(예: “페이싱된 IgG 방출자” 또는 “PIE”로서 지칭될 수 있는 iTEP 및 IgG 결합 도메인). 본원에 설명된 재조합 폴리펩티드 및 조성물은 신체 내부에 코아세르베이트(coacervate)를 형성할 수 있으며, 이는 생리학적 온도에 의해 유발될 수 있다. 코아세르베이트는, 코아세르베이트가 형성하는 조직 내부에 IgG를 저장하는 데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드, 조성물 및 방법은 2개의 요소를 가질 수 있다: iTEP(본원에서 상동성 아미노산 반복 서열로도 지칭됨)로부터 조립된 코아세르베이트 및 iTEP와 결합된 다음 IgG에 결합하는 데 사용할 수 있는 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드를 형성할 수 있는 IgG 결합 도메인. 기능적으로, 본원에 개시된 융합 또는 재조합 폴리펩티드에 결합된 상태로 IgG의 보유 또는 본원에 개시된 융합 또는 재조합 폴리펩티드로부터의 치료 IgG의 방출은 적어도 다음의 인자에 의해 결정될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다, iTEP(또는 상동성 아미노산 반복 서열)의 서열/소수성, 개시된 재조합 폴리펩티드에서 IgG와 상동성 아미노산 반복 간의 비율, 및 상동성 아미노산 반복 서열 간의 가교 결합 상태. 가교 결합 상태 및 소수성은 또한 재조합 폴리펩티드의 안정성을 결정할 수 있다. 다양한 재조합 폴리펩티드는 이들 인자를 조절함으로써 설계되고 생성될 수 있으며, 본원에 기술된다.
표적 조직에서 IgG 보유를 증가시키는 다른 방법과 비교하여 치료제(예를 들어, 치료 항체 또는 IgG)를 전달하기 위해 본원에 기재된 재조합 폴리펩티드 및 조성물을 사용하는 것의 이점은 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 첫째, 본원에 설명된 재조합 폴리펩티드를 활용하기 위해 IgG(예: 치료제 또는 항체)를 변형할 필요가 없으며; 다른 방법은 제조 절차에 적어도 하나 이상의 단계를 추가하는 IgG의 변형을 필요로 한다. 또한, IgG의 변형은 IgG의 기능을 손상시킬 수 있다. 둘째, iTEP 또는 상동성 아미노산 반복 및 IgG 결합 도메인의 융합은 단일 재조합 단백질로서 생성될 수 있다. 융합 단백질은 우수한 균질성, 재현성 및 확장성을 갖는다. 셋째, IgG의 보유 시간을 결정할 수 있는 IgG에 결합된 재조합 폴리펩티드의 안정성을 쉽게 조절할 수 있다. 따라서, IgG에 결합된 재조합 폴리펩티드는 IgG의 방출 동역학이 제어되거나 다양화될 수 있도록 생성될 수 있다.
IgG에 결합된 재조합 폴리펩티드는 연장된 기간 동안 하나 이상의 특이적 조직에 보유되는 것이 요망되는 임의의 치료 또는 진단 IgG를 전달하는 데 사용될 수 있다. IgG의 예는 이필리무맙 및 니볼루맙과 같은 암 면역 관문 억제제를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 약물은, 예를 들어, 암 치료에서 적용 및 효능을 갖는다. 그러나, 암 치료와 무관한 면역 세포와의 이들 약물의 상호작용에 의해 야기되는 부작용으로 인해 이들의 사용이 방해를 받았다.
면역 관문 항체는 신약 개발에서 가장 빠르게 성장하는 영역 중 하나를 나타낸다. 2018년 말까지, 미국 식품의약국의 승인을 받은 7개의 면역 관문 항체가 있었으며, 예로써 PD-1을 표적으로 하는 펨브로리주맙, 니볼루맙, 및 세미플리맙(R.M. Poole, Drugs 74(16) (2014) 1973-81; E.D. Deeks, Drugs 74(11) (2014) 1233-9; 및 A. Markham, S. Duggan, Drugs 78(17) (2018) 1841-6), PD-L1을 표적으로 하는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 및 더발루맙(A. Markham, Drugs 76(12) (2016) 1227-32; E.S. Kim, Drugs 77(8) (2017) 929-37; Y.Y. Syed, Drugs 77(12) (2017) 1369-76), 및 CTLA-4을 표적으로 하는 이필리무맙(F. Cameron, 등, Drugs 71(8) (2011) 1093-104)이 있다. 이들 항체의 적응증은 흑색종, 비소세포 폐암(NSCLC), 요로상피 암종, 림프종 등을 커버한다(K.M. Hargadon 등의 Int Immunopharmacol 62 (2018) 29-39). 임상 진료에서, 면역 관문 항체는 정맥내 주입을 통해 환자에게 투여된다. 정맥내 주입 후, 항체는 전신 혈액 순환으로 들어가며, 이를 통해 항체는 질환 부위로 이동하여 효력을 발휘할 것으로 예상된다(E.D. Lobo 등의 J Pharm Sci 93(11) (2004) 2645-68). 면역 관문 항체의 정맥내 주입과 같은, 전신 투여는 혈액암과 같은, 파종성 질환을 치료하는 데 적합하다(E. Jabbour 등의 Blood 125(26) (2015) 4010-6). 그러나, 종양이 특이적 구역에 제한되는 경우, 면역 관문 항체의 전신 투여와 관련된 어려움이 있다. 첫째, 생리학적 장벽, 예컨대 약한 혈액 흐름, 간질 유체 압력 상승, 혈액 순환으로부터 고형 종양으로의 항체의 접근을 제한할 수 있는 치밀한 세포외 기질이 있으며(G.M. Thurber, 등, Adv Drug Deliv Rev 60(12) (2008) 1421-34; 및 M. Tabrizi, 등, AAPS J 12(1) (2010) 33-43), 이에 따라, 종양 부위에서 항체의 국소 생체이용률을 제한하게 된다(C.F. Molthoff, 등, Br J Cancer 65(5) (1992) 677-83; L.T. Baxter, 등, Cancer Res 54(6) (1994) 1517-28; 및 C.M. Lee, I.F. Tannock, BMC Cancer 10 (2010) 255). 정맥내 주입된 항체의 종양 축적은 마우스에서 종양의 그램당 주입된 투여량의 약 1% 내지 25%이다(C.F. Molthoff 등, Br J Cancer 65(5) (1992) 677-83; 및 A.A. Epenetos 등, Br J Cancer 46(1) (1982) 1-8). 인간 환자에서의 축적은 훨씬 더 낮으며, 종양의 그램당 주입된 투여량의 약 0.002% 내지 0.03%이다(A.A. Epenetos 등, Cancer Res 46(6), (1986) 3183-91; 및 M.R. Buist 등, Int J Cancer 64(2) (1995) 92-8). 면역 관문 항체의 제한된 종양 생체이용률은 차선의 치료 효과를 초래한다. 메타 분석에 의하면 진행성 고형 종양 환자에서 항-PD-1 및 항-PD-L1의 전체 반응률이 21%임을 보여주었다(A. Carretero-Gonzalez 등, Oncotarget 9(9) (2018) 8706-15). 전임상 연구에 의해 입증된 바와 같이, 치료 항체의 종양 축적을 증가시키는 것이 항종양 효능을 촉진할 것이다(A.R. Nikpoor 등, Nanomedicine 13(8) (2017) 2671-82; 및 T.H. Shin 등, Mol Cancer Ther 13(3) (2014) 651-61). 둘째, 전신으로 투여되는 면역 관문 항체는 혈액 순환을 통해 건강한 조직으로 이동할 수 있으며, 이는 원하지 않는 부작용으로 이어질 수 있다(M.A. Postow 등, N Engl J Med 378(2)(2018) 158-68; 및 J.M. Michot 등, Eur J Cancer 54 (2016) 139-48). 예를 들어, 흑색종 환자의 55%는 항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체의 병용 요법을 받을 때 3-4 등급의 부작용을 경험하였다. 부작용은 매우 심각해서 36.4%의 환자가 치료를 중단해야 했다(J. Larkin 등, N Engl J Med 373(1) (2015) 23-34). 항-CTLA-4 항체의 부작용은 투여량 의존적인 것으로 나타났다. ≥3 등급 부작용은 10 mg/kg 이필리무맙으로 치료한 환자의 37%와 3 mg/kg 이필리무맙으로 치료한 환자의 18%에서 관찰되었다(J.D. Wolchok 등, Lancet Oncol 11(2) (2010) 155-64). 정상 기관에서 면역 항상성을 방해함으로써, 면역 관문 항체는 기관 특이적 독성을 유발할 수 있다. 흔히 영향을 받는 기관 및 조직은 간, 폐, 피부, 위장관, 내분비샘 및 혈액계를 포함한다(A. Winer 등, J Thorac Disc 10(Suppl 3) (2018) S480-9; 및 F. Martins 등, Nat Rev Clin Oncol (2019)). 셋째, 면역 관문 항체의 전신 투여는 치료의 고비용과 연관된다. 예를 들어, 정맥내 주입을 통해 혈액 순환에 들어간 후에 항체 농도가 고도로 희석된다. 질환 부위에서 치료 농도를 달성하기 위해, 환자들은 고 투여량의 항체를 투여받아야 하며, 이는 부분적으로 항체 치료를 고가로 만든다(A.F. Shughnessy, BMJ 345 (2012) e8346).
항체의 전신 투여의 어려움을 감안할 때, 면역 관문 항체의 국소 투여가 국소화된 종양 치료에 몇 가지 이점을 가져올 수도 있다(M.F. Fransen, 등, Clin Cancer Res 19(19) (2013) 5381-9; A. Marabelle, 등, J Clin Invest 123(6) (2013) 2447-63; I. Sagiv-Barfi, 등, Sci Transl Med 10(426) (2018); V. Huynh, 등, Chembiochem 20(6) (2019) 747-53; L.C. Sandin, 등, Oncoimmunology 3(1) (2014) e27614; 및 L.C. Sandin, 등, Cancer Immunol Res 2(1) (2014) 80-90). 국소화된 질환의 경우, 질환 부위로의 항체의 직접 주사가 국소 생체이용률을 증가시킬 수 있다(R.G. Jones, A. Martino, Crit Rev Biotechnol 36(3) (2016) 506-20). 따라서, 질환 부위에서 고 농도의 항체를 달성할 수 있으며, 치료 효과를 증가시킬 수 있다(K. Kitamura 등, Cancer Res 52(22) (1992) 6323-8; 및 A.D. Simmons 등, Cancer Immunother 57(8) (2008) 1263-70). 증가된 생체이용률로 인해, 국소 투여는 전신 투여와 비교하여 훨씬 더 낮은 투여량의 항체를 사용한다. 전임상 연구에서, 마우스에서 원발성 종양으로의 면역 관문 항체의 직접 주사는 정맥내 주사와 동일하거나 훨씬 더 양호한 항종양 효과를 달성할 수 있다(A. Marabelle 등, J Clin Invest 123(6) (2013) 2447-63). 국소 주사에 필요한 면역 관문 항체의 투여량은 정맥내 주사에 필요한 투여량의 약 1%였다. 국소 주사에 필요한 항체의 낮은 투여량은 항체 치료의 고 비용을 감소시킬 수 있다(D.W. Grainger, Expert Opin Biol Ther 4(7) (2004) 1029-44). 낮은 투여량의 항체가 질환 부위에 직접 주사되기 때문에, 건강한 조직에 대한 항체의 노출은 감소할 가능성이 있다. 따라서, 국소 항체 주사는 부작용의 위험을 또한 감소시킬 수 있다(A.D. Simmons 등, Cancer Immunol Immunother, 57(8) (2008) 1263-70; A. Marabelle 등, Clin Cancer Res 19(19) (2013) 5261-3; B. Kwong 등, Biomaters 32(22) (2011) 5134-47; B. Kwong, S.A. 등, Cancer Res 73(5) (2013) 1547-58).
동물 연구의 결과를 고려하여, 환자에서 면역 관문 항체의 국소 주사의 임상적 이점을 평가하기 위해 임상시험이 개시되었다. 절제 불가능한 흑색종 환자에서 이필리무맙과 인터루킨-2의 종양내 주사를 평가하였다(NCT01672450). 재발성 흑색종, 비호지킨 림프종, 결장 직장암 환자에서 종양내 이필리무맙 및 국소 방사선 요법을 적용하였다(NCT01769222). 제I/II상 연구는 B-세포 림프종 환자에 대한 방사선 요법과 병용하여 종양내 이필리무맙 및 톨-유사 수용체 9 작용제를 평가하였다(NCT02254772). 이론적으로, 종양내 면역 관문 항체는 종양내 주사에 대해 접근 가능한 어떠한 원발성 종양에도 적용될 수 있다. 그러나, 전이성 종양을 치료하기 위해서는, 종양내 면역 관문 항체가 전신 항종양 면역성을 유도할 수 있어야 한다. 동물 연구에서, 종양내 면역 관문 항체는 원위 종양에 대한 항종양 면역성을 나타냈으며, 이는 압스코팔 효과로 알려져 있다(W.J.M. Mulder, S. Gnjatic, Nat Nanotechnol 12(9) (2017) 840-1; M. Bilusic, J.L. Gulley, Editorial: Local Immunotherapy: A Way to Convert Tumors From "Cold" to "Hot", J Natl Cancer Inst 109(12) (2017); M.A. Aznar, 등, J Immunol 198(1) (2017) 31-9; A. Marabelle, 등, Ann Oncol 28(suppl_12) (2017) xii33-43; 및 V. Murthy, J. Minehart, D.H. Sterman, J Natl Cancer Inst 109(12) (2017)). 그러나, 이필리무맙, 방사선요법, 및 DC-기반 백신접종의 맥락에서의 단지 몇 가지 경우를 제외하고, 압스코팔 면역은 환자에서 거의 설명되지 않는다(M.A. Postow 등, N Engl J Med 366(10) (2012) 925-31; E.F. Stamell, 등, Int J Radiat Oncol Biol Phys 85(2) (2013) 293-5; 및 J. Karbach, 등, Cancer Immunol Res 2(5) (2014) 404-9). 따라서, 압스코팔 면역은 향후 임상 시험에서 관찰될 중요한 파라미터로서 간주될 수 있다. 대안적으로, 종양내 및 정맥내 면역 관문 항체의 조합이 전이성 종양을 치료하기 위해 적용된다. 예를 들어, 제I/II상 임상시험은 전이성 흑색종 환자에서 종양내 이필리무맙 + 정맥내 니볼루맙을 현재 시험하고 있다(NCT02857569).
많은 전임상 및 임상 연구들이 이 치료를 채택하고 있지만, 면역 관문 항체의 국소 주사에 대한 몇몇 어려움이 남아 있다. 먼저, 국소 부위에서 항체의 보유 시간이 짧다. 예를 들어, 피하 주사 후, 주사 부위에서 IgG의 보유 시간은 약 6.8시간이었다(F. Wu 등, Pharm Res 29(7) (2012) 1843-53)). 짧은 보유 시간은 빈번한 국소 주사를 필요로 하며, 이는 임상적 불편 및 낮은 환자 순응도로 이어질 수 있다(D. Schweizer 등, Controlled release of therapeutic antibody formats, Eur J Pharm Biopharm 88(2) (2014) 291-309). 둘째, 국소적으로 주사된 항체는 결국 혈액 순환으로 진입하게 된다. 피하 주사된 항체의 전신 노출은 정맥내 주입된 항체의 경우의 약 50-80%인 것으로 추정된다(W.F. Richter, B. Jacobsen, Drug Metab Dispos 42(11) (2014) 1881-9). 국소 주사된 항체의 높은 전신 노출은 부작용의 높은 위험을 초래한다(J. Ishihara 등, Sci Transl Med 9(415) (2017)).
이러한 문제를 해결하기 위해서는 국소 항체 주사에 대해 제어 방출(controlled release) 시스템이 필요하다. 이러한 시스템은 국소 보유 시간을 증가시키고 항체의 전신 노출을 감소시킬 수 있다. 또한, 시스템은 국소 주사하기에 편리해야 한다. 또한, 시스템은 항체의 방출을 제어하도록 조정 가능해야 한다. 본원에 설명된 바와 같은 이러한 시스템을 개발하기 위해, 면역 내성 엘라스틴-유사 폴리펩티드(iTEP)를 담체로서 사용하여 항체를 전달하였다. iTEP는 이의 전이 온도(Tt)와 관련된 상 전이 특성을 갖는다. iTEP는 온도가 Tt 아래일 때 수용액에 가용성이고, 온도가 Tt 위일 때 불용성으로 되고 용액으로부터 침전된다(P. Wang, 등, Biomaterials 182 (2018) 92-103). 예를 들어, iTEP의 Tt가 체온 아래이면, iTEP는 신체에 주사된 후 침전되어 데포(depot)를 형성할 것이다. 폴리펩티드 또는 iTEP 데포는 최대 수주 동안 주사 부위에 체류하면서, 서서히 방출된다(M. Amiram 등, J Control Release 172(1) (2013) 144-51; S.M. Sinclair, 등, J Control Release 171(1) (2013) 38-47; M. Amiram, 등, Proc Natl Acad Sci U S A 110(8) (2013) 2792-7; 및 K.M. Luginbuhl, 등, Nat Biomed Eng 1 (2017)). 항체가 이들 데포에 연결된 경우, 항체는 주사 부위로부터 서서히 방출될 것으로 예상된다. iTEP(들)를 항체(예: IgG)에 연결하기 위해, IgG 결합 도메인(IBD)을 iTEP에 부착하여 재조합 폴리펩티드(iTEP-IBD로서 지칭될 수 있음)를 생성하였다. “IBD”는 단백질 G로부터 유래된 단백질 도메인을 지칭한다(B. Guss 등, EMBO J 5(7)(1986) 1567-75; 및 A.M. Gronenborn, G.M. Clore, ImmunoMethods 2(1) (1993) 3-8). IBD는 약 10 nM의 높은 친화도로 IgG에 결합할 수 있다(M. Hutt 등, J Biol Chem 287(7) (2012) 4462-9; 및 F. Unverdorben 등, PLoS One 10(10) (2015) e0139838). 본원에 개시된 바와 같이, 결과에 의하면 본원에 개시된 재조합 단백질(예: iTEP-IBD) 및 IgG의 혼합물이 주사 부위에서 데포를 형성하고 IgG를 포획하여, IgG의 방출을 늦출 수 있음을 보여준다. 결과는 또한 IgG의 방출 속도가 분자량(MW) 및 본원에 개시된 재조합 단백질(예: iTEP-IBD)의 구조를 제어함으로써 미세 조정될 수 있음을 보여준다. 또한, 재조합 단백질(예: iTEP-IBD)은 국소 주사된 IgG의 전신 노출을 감소시키는 것으로 나타났다. 마지막으로, 결과는 재조합 단백질(예: iTEP-IBD)이 종양에서 항체를 보유할 수 있음을 입증하였다. 종합하면, 본원에 설명된 이들 결과는 국소 항체 투여를 위한 개시된 재조합 폴리펩티드(예: iTEP-IBD)의 적용을 입증한다.
iTEP는 단백질이다. iTEP는 유사한 크기의 나노입자(NP)로 자체 조립될 수 있다. iTEP(본원에서 상동성 아미노산 반복 서열로도 지칭됨) 나노입자를 약물 전달 비히클로서 사용하는 조성물 및 방법이 본원에 개시된다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 iTEP는 나노입자를 형성할 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 iTEP는 나노입자를 형성하지 않을 것이다. 본원에 개시된 바와 같은 주어진 iTEP가 나노입자를 형성할 것인지의 여부는 iTEP(예를 들어, 상동성 아미노산 반복 서열)의 길이, 소수성/친수성, 또는 이중 블록 중합체의 조성 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 인자에 의존할 수 있다.
본원에 개시된 iTEP는 원하는 전이 특성을 가지며, 마우스 체액성 면역에 의해서도 내성이 있었다. 또한, 본원에서는, 양친매성 이중 블록 공중합체 또는 융합 단백질을 제조하기 위해 소수성에서 상반되는 2개의 쌍을 이룬 iTEP가 기술된다. 융합 단백질은 2개 이상의 단백질을 함께 융합함으로써 생성될 수 있다. 이중 블록 공중합체는 2개의 상이한 iTEP의 융합을 설명하는 데 사용될 수 있다. 공중합체(예를 들어, 융합 단백질)는 NP로 자체 조립된다. 예를 들어, 서열번호 1 및 서열번호 2가 함께 융합되어 이중 블록 중합체를 형성할 수 있다. 일부 측면에서, 이중 블록 중합체는 이어서 IgG 결합 도메인에 융합되거나 공유 결합될 수 있다.
조성물
재조합 폴리펩티드. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “재조합 폴리펩티드”는 재조합 기술을 포함하는 다양한 방법에 의해 생성된 폴리펩티드를 지칭한다. 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드는 하나 이상의 상동성 아미노산 반복 서열(예: iTEP) 및 IgG 결합 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 폴리펩티드가 본원에 개시된다. 일부 측면에서, 재조합 폴리펩티드는 상동성 아미노산 반복 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 상동성 아미노산 반복 서열은 상동성 아미노산 반복 서열과 적어도 75%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 측면에서, 상동성 아미노산 반복 서열은 다음과 같을 수 있다: Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly (서열번호 1); Gly-Ala-Gly-Val-Pro-Gly (서열번호 2); Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly (서열번호 3); Val-Pro-Gly-Leu-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly (서열번호 4); Val-Pro-Gly-Leu-Gly-Val-Gly-Ala-Gly (서열번호 5); Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly-Gly (서열번호 6); Gly-Val-Leu-Pro-Gly (서열번호 7); Gly-Leu-Val-Pro-Gly-Gly (서열번호 8); Gly-Leu-Val-Pro-Gly (서열번호 9); Gly-Val-Pro-Leu-Gly (서열번호 10); Gly-Ile-Pro-Gly-Val-Gly (서열번호 11); Gly-Gly-Val-Leu-Pro-Gly (서열번호 12); Gly-Val-Gly-Val-Leu-Pro-Gly (서열번호 14); 또는 Gly-Val-Pro-Gly (서열번호 15); 및 IgG 결합 도메인.
일부 측면에서, 재조합 폴리펩티드는 아미노산 서열 Gly-(Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Gly-Gly)28-Gly-Gly (서열번호 23); Gly-(Gly-Ala-Gly-Val-Pro-Gly)70-Gly-Gly (서열번호 24); Gly-(Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly)21-Gly-Gly (서열번호 25); 또는 Gly-(Val-Pro-Gly-Leu-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly)96-Gly-Gly (서열번호 26)를 포함한다.
일부 측면에서, 재조합 폴리펩티드는 동일한 둘 이상의 상동성 아미노산 반복 서열을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상동 아미노산 서열은 20 내지 200회 연속하여 반복된 Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly (서열번호 1) (예를 들어, (Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly)28 (서열번호 13); (Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly)56 (서열번호 16); 또는 (Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly)112 (서열번호 17)일 수 있다.
일부 측면에서, 재조합 폴리펩티드는 상이한 둘 이상의 상동성 아미노산 반복 서열을 더 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 상동성 아미노산 서열은 20 내지 200회 반복될 수 있는 상이한 상동성 아미노산 서열에 연속하여 20 내지 200회 반복되고 융합된 동일한 서열일 수 있다.
일부 측면에서, 재조합 폴리펩티드는 이중 블록 공중합체 또는 융합 단백질을 포함한다. 이중 블록 공중합체 또는 융합 단백질은 공유 결합에 의해 함께 연결된 2개 또는 3개의 상동성 아미노산 반복 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 이중 블록 중합체는, 예를 들어, Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly (서열번호 1)를 Gly-Ala-Gly-Val-Pro-Gly (서열번호 2)에 융합함으로써 형성될 수 있다. 일부 측면에서, 이중 블록 중합체는 (서열번호 1)x-(서열번호 2)y 또는 (서열번호 2)y-(서열번호 1)x일 수 있으며, 여기서 x 및 y는 20과 120 사이의 임의의 수일 수 있으며, 여기서 20과 120 사이의 임의의 수는 각각의 상동성 아미노산 서열이 반복되는 횟수를 나타낸다.
일부 측면에서, 하나 이상의 시스테인 아미노산 잔기가 이중 블록 공중합체 또는 융합 단백질과 IgG 결합 도메인 사이에 삽입될 수 있다. 일부 측면에서, 시스테인 아미노산 잔기의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 이상 또는 그 사이의 임의의 수일 수 있다. 일부 측면에서, 시스테인 아미노산 잔기의 수는 4일 수 있다. 일부 측면에서, 시스테인 아미노산 잔기는 하나 이상의 글리신 아미노산 잔기에 의해 분리될 수 있다. 글리신 아미노산 잔기의 수는 다양할 수 있고 이중 블록 공중합체와 IgG 결합 도메인 사이에 삽입된 시스테인 아미노산 잔기의 수에 따라 달라질 수 있다. 일부 측면에서, 글리신 아미노산 잔기의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 이상 또는 그 사이의 임의의 수일 수 있다. 일부 측면에서, 글리신 아미노산 잔기의 수는 8일 수 있다. 예를 들어, 4개의 시스테인 잔기가 이중 블록 공중합체와 IgG 결합 도메인 사이에 삽입될 때, 8개의 글리신 아미노산 잔기가 인접하는 시스테인 아미노산 잔기를 분리하기 위해 삽입될 수 있다. 일부 측면에서, 이중 블록 공중합체 또는 융합 단백질은 양친매성일 수 있다. 일부 측면에서, 이중 블록 공중합체 또는 융합 단백질은 IgG 결합 도메인과 융합될 수 있다.
또한, 본원에 설명된 바와 같이, 다음의 식에 부합하는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 폴리펩티드가 본원에 기술된다: Val-Pro-Gly-Xaa1-Gly-Xaa2-Gly-Ala-Gly 여기서 Xaa1은 Leu 또는 Phe이고 Xaa2는 Ala 또는 Val(서열번호 16-19)이고, 여기서 아미노산 서열은 반복된다.
일부 측면에서, 본원에 설명된 재조합 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 모두에 위치한 하나 이상의 아미노산 잔기를 더 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 글리신, 알라닌 또는 세린 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 측면에서, 재조합 폴리펩티드는 아미노산 서열 Gly-(Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly)21-Gly-Gly (서열번호 25); 또는 Gly-(Val-Pro-Gly-Leu-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly)96- Gly-Gly (서열번호 26); 또는 XX-(Val-Pro-Gly-Leu-Gly-Val-Gly-Ala-Gly)X-XX (서열번호 27)를 포함할 수 있다. 후술하는 바와 같이, “XX”는 C-말단 및 N-말단 말단 모두에서 하나 이상의 글리신 아미노산 잔기일 수 있고; “x”는 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200 또는 그 사이의 임의의 수일 수 있다. 서열번호 27은 “x”회 반복되고, C-말단 및 N-말단 말단 모두에서 하나 이상의 글리신 아미노산 잔기가 측부에 위치하는 상동성 아미노산 반복 서열의 예로서 기능한다. 상동성 아미노산 서열 중 어느 하나는 C-말단, N-말단, 또는 둘 다에서 하나 이상의 글리신 아미노산 잔기가 측부에 위치할 수 있고, C-말단, N-말단, 또는 둘 다에서 글리신 아미노산 잔기의 수는 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200 또는 그 사이의 임의의 수일 수 있다.
일부 측면에서, 재조합 폴리펩티드의 식별된 분자량은 10 내지 100 kDa일 수 있다. 일부 측면에서, 재조합 폴리펩티드의 식별된 분자량은 20 내지 100 kDa일 수 있다.
상동성 아미노산 반복. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “상동성 아미노산 반복” 또는 “상동성 아미노산 반복 서열” 또는 “단량체”는 20개의 단백질 아미노산 중 어느 하나를 포함하는 아미노산 서열을 지칭하며, 선형으로 반복되거나 중복된다. 또한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “상동성 아미노산 서열 반복”은 iTEP 서열을 지칭할 수 있다. 일부 측면에서, 상동성 아미노산 반복 서열은 반복될 수 있다. 상동성 아미노산 반복 서열은 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200회 이상 또는 그 사이의 임의의 횟수로 반복될 수 있다. 일부 측면에서, 상동성 아미노산 반복은 100회 이하로 반복될 수 있다. 일부 측면에서, 상동성 아미노산 반복은 200회 이하로 반복될 수 있다. 또 다른 측면에서, 상동성 아미노산 반복은 적어도 20회 반복될 수 있다. 일부 측면에서, 상동성 아미노산 반복 서열은 20 내지 30회, 30 내지 40회, 40 내지 50회, 50 내지 60회, 60 내지 70회, 70 내지 80회, 80 내지 90회, 90 내지 100회, 100 내지 110회, 또는 110 내지 120회 반복될 수 있다.
일부 측면에서, 상동성 아미노산 반복 서열은 서열 Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly (서열번호 1); Gly-Ala-Gly-Val-Pro-Gly (서열번호 2); Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly (서열번호 3); Val-Pro-Gly-Leu-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly (서열번호 4); Val-Pro-Gly-Leu-Gly-Val-Gly-Ala-Gly (서열번호 5); Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly-Gly (서열번호 6); Gly-Val-Leu-Pro-Gly (서열번호 7); Gly-Leu-Val-Pro-Gly-Gly (서열번호 8); Gly-Leu-Val-Pro-Gly (서열번호 9); Gly-Val-Pro-Leu-Gly (서열번호 10); Gly-Ile-Pro-Gly-Val-Gly (서열번호 11); Gly-Gly-Val-Leu-Pro-Gly (서열번호 12); Gly-Val-Gly-Val-Leu-Pro-Gly (서열번호 14); 또는 Gly-Val-Pro-Gly (서열번호 15)일 수 있다. 일부 측면에서, 상동성 아미노산 반복 서열은 서열 Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly (서열번호 1)일 수 있다. 일부 측면에서, 상동성 아미노산 반복 서열은 서열 Gly-Ala-Gly-Val-Pro-Gly (서열번호 2)일 수 있다. 표 1은 상동성 아미노산 반복 서열의 예를 열거한다.
표 1
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일부 측면에서, 상동성 아미노산 반복 서열은 서열(Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly)28 (서열번호 13); (Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly)56 (서열번호 16); 또는 (Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly)112 (서열번호 17)일 수 있다.
또 다른 측면에서, 상동성 아미노산 반복 서열은 다음 아미노산 서열이 아니다: Gly-Gly-Val-Pro-Gly (서열번호 28).
일부 측면에서, 상동성 아미노산 반복 서열은 4개 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 1개 이하의 프롤린이 상동성 아미노산 반복 서열에 존재할 수 있다. 상동성 아미노산 반복 서열은 엘라스틴에서 자연적으로 발생하는 서열로서 존재할 수 있다. 상동성 아미노산 반복 서열은 또한 N-말단 및 C-말단 말단 모두에서 하나 이상의 글리신 잔기가 자연적으로 측부에 위치할 수 있다.
일부 측면에서, 상동성 아미노산 반복은 엘라스틴-유래일 수 있다. 상동성 아미노산 반복 서열은 마우스 및/또는 인간 엘라스틴으로부터 유래될 수 있다. 일부 측면에서, 상동성 아미노산 반복 서열은 C-말단 및 N-말단 말단 모두에서 하나 이상의 글리신 잔기가 추가로 측부에 위치할 수 있는 마우스 및/또는 인간 엘라스틴으로부터 유래될 수 있다.
일부 측면에서, 상동성 아미노산 반복은 상동성 아미노산 반복에 대해 일정 정도의 동일성 또는 상동성을 나타낼 수 있으며, 여기서 상동성 아미노산 반복은 서열번호 1-12, 14 및 15 중 하나 이상일 수 있다. 동일성의 정도는 달라질 수 있고 당 분야의 숙련자에게 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 용어 “상동성” 및 “동일성”은 각각 2개의 폴리펩티드 서열 간의 서열 유사성을 지칭한다. 상동성 및 동일성은 비교를 위해 정렬될 수 있는 각각의 서열에서의 위치를 비교함으로써 각각 결정될 수 있다. 비교된 서열에서의 위치가 동일한 아미노산 잔기에 의해 점유되는 경우에는, 폴리펩티드는 그 위치에서 동일한 것으로 지칭될 수 있고; 동등한 부위가 동일한 아미노산(예를 들어, 동일함) 또는 유사한 아미노산(예를 들어,입체 및/또는 전자 성질이유사함)에 의해 점유되는 경우에는, 분자는 그 위치에서 상동성으로 지칭될 수 있다. 서열들 간의 상동성 또는 동일성의 백분율은 서열에 의해 공유된 일치하거나 상동성인 위치의 수의 함수이다. 본원에 설명된 재조합 폴리펩티드의 상동성 아미노산 반복 서열은 상동성 아미노산 반복 서열에 대해 적어도 또는 약 25%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성 또는 상동성을 가질 수 있으며, 여기서 상동성 아미노산 반복 서열은 서열번호 1-12, 14 및 15 중 하나 이상일 수 있다(예를 들어, 표 1 참조).
일부 측면에서, 본원에 설명된 재조합 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 모두에 위치한 하나 이상의 아미노산 잔기를 더 포함할 수 있다. 하나 이상의 아미노산 잔기는 글리신, 알라닌 또는 세린 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 측면에서, 재조합 폴리펩티드의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 모두에 위치한 하나 이상의 아미노산 잔기는 면역원성을 감소시키는 임의의 아미노산 잔기일 수 있다.
IgG 결합 도메인. IgG 결합 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩티드가 본원에 개시된다. 일부 측면에서, 재조합 폴리펩티드는 IgG 결합 도메인에 적어도 2회 공유 결합될 수 있는 적어도 하나의 상동성 아미노산 반복 서열을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 개시된 재조합 폴리펩티드의 IgG 결합 도메인은 단백질 G로부터 유래될 수 있다. 일부 측면에서, IgG 결합 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4에 결합할 수 있는 서열일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “~에서 유래된”은 “~에서 오는” 또는 “~에 기초하는”을 의미할 수 있다. 예를 들어, IgG 결합 도메인 서열은 단백질 G 서열로부터 유래될 수 있고, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 단백질 G 염기 또는 원래 단백질 G 서열의 변이체 또는 단편일 수 있다.
서열을 포함하거나 아미노산 서열 TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 18)와 적어도 75% 동일한 IgG 결합 도메인이 본원에 개시된다. 일부 측면에서, IgG 결합 도메인은 서열 TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 18), 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 변이체는 다음과 같을 수 있다: TTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE (서열번호 19); TTYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE (서열번호 20); TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAAAAFAQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 21); TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAAAAFAQYARRNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 22); 또는 TTYKLVIAGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDAGVDGEWTYDDATKTFTVTE (서열번호 29), 또는 이의 단편 또는 변이체. 일부 측면에서, 단편은 다음과 같을 수 있다: TTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE (서열번호 30); QYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE (서열번호 31); EKVFKQYANDNGVDGEWTY (서열번호 32); 또는 NDNGVDGEWTY (서열번호 33).
링커. 본원에 설명된 재조합 폴리펩티드는 하나 이상의 링커를 더 포함할 수 있다. 본원에 개시된 조성물 또는 재조합 폴리펩티드 내의 주어진 링커는 절단 가능한(cleavable) 결합(예: 티오에스테르 결합)을 제공할 수 있다. 연결에 이용 가능한 부위는 본원에 설명된 재조합 폴리펩티드 상에서 식별될 수 있다. 일부 측면에서, 개시된 재조합 폴리펩티드 내의 링커는 IgG 결합 도메인이 (예를 들어, 접합을 통해) 부착될 수 있는 재조합 폴리펩티드 상의 일차 아민과 반응성인 기를 포함할 수 있다. 유용한 링커는 상업적 공급원으로부터 이용 가능하다. 일부 측면에서, 링커는 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 히드라지드 하이드로클로라이드(MPBH)일 수 있다. 당 분야의 숙련자는 적절한 링커를 선택할 수 있다.
링커는 공유 결합을 통해 개시된 재조합 폴리펩티드에 부착될 수 있다. 공유 결합을 형성하기 위해, 예를 들어, 광범위한 활성 카르복실기(예를 들어, 에스테르)를 갖는, 화학적 반응성 기가 사용될 수 있으며, 여기에서 재조합 폴리펩티드를 변형시키는 데 필요한 수준에서 히드록실 모이어티가 생리학적으로 허용 가능하다.
일부 측면에서, 하나 이상의 링커 서열은 펩티드일 수 있다. 일부 측면에서, 링커 서열은 선형으로 그리고 인접하여 반복될 수 있다. 예를 들어, 링커 서열은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20회 반복될 수 있다. 일부 측면에서, 링커 서열은 GGGGS(서열번호 34)일 수 있다. 일부 측면에서, 링커 서열은 GGGGC(서열번호 35)일 수 있다. 일부 측면에서, 링커 서열은 상동성 아미노산 반복 서열과 IgG 결합 도메인 사이에 위치할 수 있다. 예를 들어, N-말단에서 C-말단까지, 재조합 폴리펩티드는 다음을 포함할 수 있다: IgG 결합 도메인에 공유 결합될 수 있는 링커 서열에 공유 결합된 상동성 아미노산 반복 서열(예: 서열번호 1); 또는 상동성 아미노산 반복 서열(예: 서열번호 1)에 공유 결합될 수 있는 링커 서열에 공유 결합된 IgG 결합 도메인.
일부 측면에서, 재조합 폴리펩티드는 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다: (GVLPGVG)28-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 36); (GVLPGVG)56-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 37); 또는 (GVLPGVG)112-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 38).
일부 측면에서, 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드는 제2 링커 서열을 더 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 제2 링커 서열은 (GGGGC)4(서열번호 39)일 수 있다. 일부 측면에서, 제2 링커는 시스테인을 가져야 한다. 제2 링커는 1 내지 20회 또는 그 사이의 임의의 수로 반복될 수 있다. 일부 측면에서, 제2 링커 서열은 상동성 아미노산 반복 서열과 제1 링커 서열 사이에 위치할 수 있다. 일부 측면에서, (GGGGC)4(서열번호 40)는 상동성 아미노산 반복 서열과 제1 링커 서열 사이에 위치할 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 설명된 재조합 폴리펩티드는 (GVLPGVG)28-(GGGGC)4-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 41); (GVLPGVG)56-(GGGGC)4-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 42); 또는 (GVLPGVG)112-(GGGGC)4-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 43)일 수 있다.
표 2
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a 괄호 뒤의 아래첨자는 괄호 안의 반복 서열의 수였다. 유연성을 증가시키기 위해 “GGGGS” 서열(서열번호 34)을 IBD 전에 삽입하였다.
치료제. 하나 이상의 치료제를 추가로 포함하는 재조합 폴리펩티드가 본원에 개시된다. 광범위한 치료제가 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드와 통합되거나, 이와 연관되거나, 이에 연결될 수 있다. 다양한 치료제가 본원에 설명된 재조합 폴리펩티드 서열에 연결되거나, 결합되거나(예를 들어, 비공유 결합으로) 연관될 수 있다. 일부 측면에서, 치료제는 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드에 간접적으로 또는 직접적으로 혼입될 수 있다. 치료제는 펩티드, 항체 또는 이의 단편, 항체-약물 접합체 또는 Fc-융합 단백질일 수 있다. 치료제는 또한 화학 화합물, 단백질, 펩티드, 소분자 또는 세포일 수 있다. 치료제의 예는 펩티드 백신, 항체, 핵산(예: siRNA) 및 세포 기반 제제(예: 줄기 세포, CAR-T 세포)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 측면에서, 치료제는 IgG 또는 이의 단편일 수 있다. 일부 측면에서, 치료제 중 하나 이상은 항암제일 수 있다. 항암제는 항체 또는 이의 단편, 또는 항체-약물 접합체의 일부인 항체, 또는 항암 특성을 갖는 Fc-융합 단백질일 수 있다. 일부 측면에서, 항암제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 또는 항-CTLA-4 항체일 수 있다. 일부 측면에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙 또는 세미플리맙일 수 있다. 일부 측면에서, 항-PD-L1 항체는 아벨루맙, 더발루맙 또는 아테졸리주맙일 수 있다. 일부 측면에서, 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙일 수 있다. 일부 측면에서, 항암제는 항암제 항체 또는 이의 단편, 항체 약물 접합체의 일부일 수 있는 항암 Fc-융합 또는 항암 항체일 수 있다. 항암 항체 또는 이의 단편의 예는, 오파투무맙(항-CD20), 베바시주맙(항-VEGF), 블리나투무맙(항-CD3 및 CD19), 라무시루맙(항-VEGFR2), 다라투무맙(항-CD38), 엘로투주맙(항-SLAMF7), 세툭시맙(항-EGFR), 오비누투주맙(항-CD20), 트라스투주맙(항-HER2), 퍼투주맙(항-HER2), 네시투무맙(항-EGFR), 데노수맙(항-RANKL), 리툭시맙(항-CD20), 실툭시맙(항-IL-6), 디누툭시맙(항-GD2), 파니투무맙(항-EGFR), 및 모가물리주맙(항-CCR4)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 항암 Fc-융합 단백질의 예는 또한 아플리버셉트를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 항체 약물-접합체의 일부일 수 있는 항암 항체의 예는 겜투주맙 오조가마이신, 브렌툭시맙 베도틴, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 이노투주맙 오조가마이신, 및 폴라투주맙 베도틴-피이크를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에 설명된 바와 같은 재조합 폴리펩티드는 또한, 예를 들어, 세포 접착 및 성장을 위한, 스캐폴드 재료용 담체로서 사용될 수 있으며, 따라서, 조직 수복 또는 세포 기반 요법에 사용될 수 있다. 재조합 폴리펩티드는 또한, 예를 들어 시험관 내 및 생체 내 세포 성장을 용이하게 하기 위한 매트릭스 겔로서 사용될 수 있고; 보강제로서 사용될 수 있다.
재조합 폴리펩티드 제조 방법
본원에 설명된 재조합 폴리펩티드를 생산하는 데 사용될 수 있는 방법이 본원에 개시된다.
설계. 일부 측면에서, 본원에 설명된 상동성 아미노산 반복 서열(예: iTEP)을 포함하는 재조합 폴리펩티드는 엘라스틴으로부터 유래된 펩티드의 중합체로서 설계될 수 있다. 상동성 아미노산 반복 서열을 포함하는 재조합 폴리펩티드는 마우스 및 인간에서 체액 내성이 있어야 한다. 선택된 재조합 폴리펩티드 및 상동성 아미노산 반복 서열은 자가면역 반응을 내재성으로 유도하지 않아야 한다(즉, 서열은 B 세포 또는 T 세포 수용체에 내재성으로 결합하지 않아야 함).
면역원성인 상동성 아미노산 반복 서열을 포함하는 재조합 폴리펩티드를 생성할 가능성을 감소시키기 위해, 적어도 2개의 전략이 사용될 수 있다. 첫째, 인간 및 마우스 엘라스틴 내의 통상적인 기존의 펩티드 반복 서열을 외인성 접합 서열의 생성을 제한하기 위한 상동성 아미노산 반복 서열의 성분으로서 사용할 수 있다. 둘째, 하나 이상의 외인성 접합 서열이 생성될 때, 상동성 아미노산 반복 서열은 4개의 잔기 이상이고, 엘라스틴으로부터 유래되어야 하며; N-말단 및 C-말단에서 하나 이상의 글리신 잔기가 측부에 위치해야 한다. 더 짧은 것보다 더 긴 상동성 아미노산 반복 서열을 사용함으로써, 외인성 접합 서열의 수가 감소될 수 있다. 외인성 접합 서열을 감소시키거나 제거하는 것은 재조합 폴리펩티드 또는 상동성 아미노산 반복 서열의 면역원성을 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, 상동성 아미노산 반복 서열이 상 전이 특성을 갖도록, 이들은 하나의 프롤린 아미노산 잔기 및 하나 이상의 발린 아미노산 잔기를 갖도록 설계될 수 있다.
본원에 개시된 재조합 폴리펩티드는 핵산으로부터 단백질을 생산하거나 시험관 내에서 폴리펩티드를 합성하기 위해 일상적으로 사용되는 합성 방법 및 재조합 기술에 의해 생산될 수 있다. 재조합 폴리펩티드 및 상동성 아미노산 반복 서열 및/또는 이중 블록 중합체는 나중에 사용할 때까지 미정제 형태 또는 단리된 형태 또는 실질적으로 정제된 형태로 보관될 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드는 재조합 융합 단백질 또는 이중 블록 중합체일 수 있다. 일부 측면에서, 재조합 폴리펩티드는 다양한 발현 시스템(예: E.coli, 효모, 곤충 세포, 및 포유류 세포 배양물; 및 식물)에서 발현될 수 있다. 간략하게, 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 플라스미드 DNA는 전술한 발현 시스템 중 어느 하나의 세포 내로 형질감염될 수 있다. 재조합 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 1-서열번호 2)가 이들 시스템 중 어느 하나에서 생산된 후, 이들은 또한 정제되고, 동결건조되고, 사용 시까지 보관될 수 있다.
본원에 설명된 상동성 아미노산 반복 서열은 본원에 설명된 바와 같은 링커와 화학적으로 상호작용하거나 이를 포함하도록 변형될 수 있다. 이들 재조합 폴리펩티드, 상동성 아미노산 반복 서열 및 펩티드-링커 작제물은 본 개시의 범위 내에 있고, IgG 결합 도메인에 부착(예를 들어, 접합)하는 과정 및/또는 치료제와의 연관을 완료하기 위한 지침과 함께 키트의 구성요소로서 포장될 수 있다. 상동성 아미노산 반복 서열은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두에서 시스테인 잔기 또는 다른 티오-함유 모이어티(예: C-SH)를 포함하도록 변형될 수 있다.
일부 측면에서, 치료제(예: IgG 또는 항체)는 당 분야의 숙련자에게 공지된 방법을 사용하여 재조합 폴리펩티드와 혼합될 수 있다. 예를 들어, 치료제(예를 들어, 항체) 및 재조합 폴리펩티드(예를 들어, iTEP-IBD)는 피펫팅, 태핑, 진탕, 와류화 또는 다른 방법을 통해 튜브와 같은 용기 내의 용액에서 함께 혼합될 수 있다.
구성. 상동성 아미노산 반복 서열을 포함하는 개시된 재조합 폴리펩티드, 상동성 아미노산 반복 서열이 반복되는 횟수, IgG 결합 도메인, 링커(들), 및 치료제는 독립적으로 선택될 수 있다. 당 분야의 숙련자라면 성분 부분들이 호환 가능한 방식으로 연관될 필요가 있음을 이해할 것이다. 본원에 개시된 바와 같이, 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드는 암 및 자가면역 질환의 치료를 위해 환자에게 치료제를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 치료제는 재조합 폴리펩티드에 접합될 수 있다. 일부 측면에서, 재조합 폴리펩티드는 IgG 결합 도메인에 공유 결합된 상동성 아미노산 반복 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 치료제는 IgG 결합 도메인에 비공유 접합될 수 있다. 재조합 폴리펩티드당 치료제의 수는 추가적인 IgG 결합 도메인을 첨가함으로써 제어될 수 있다. 하나의 IgG 결합 도메인은 하나의 치료제에 (예를 들어, 비공유적으로) 결합될 수 있다. 일부 측면에서, 재조합 폴리펩티드는 하나 이상 또는 둘 이상의 IgG 결합 도메인을 포함할 수 있다. 이와 같이, 재조합 폴리펩티드는 둘 이상의 치료제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 2개의 IgG 결합 도메인을 포함하는 재조합 폴리펩티드의 선형 구성은 다음과 같을 수 있다: IBD-iTEP-IBD, iTEP-IBD-iTEP-IBD 또는 IBD-iTEP-IBED-iTEP. 일부 측면에서, iTEP는 본원에 개시된 상동성 아미노산 반복 서열 중 어느 하나일 수 있다. 일부 측면에서, 상동성 아미노산 반복 서열은 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 측면에서, IBD는 본원에 개시된 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, IBD는 동일하거나 상이한 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 시스테인 아미노산 잔기는 상동성 아미노산 반복 서열(예: iTEP)의 말단 중 하나에 첨가될 수 있고, 하나 이상의 IgG 결합 도메인에 대한 접합 부위로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 8개의 시스테인 잔기가 추가될 수 있고, 8개의 IgG 결합 도메인에 대해 8개의 접합 부위를 제공할 수 있다. 치료제는 동일하거나, 상이하거나, 이들의 임의의 조합일 수 있다. 2개 또는 시스테인 잔기가 본원에 설명된 바와 같은 재조합 폴리펩티드의 말단에 첨가될 때, 하나 이상의 스페이서(예를 들어, 글리신 잔기)가, 예를 들어 2개의 시스테인 잔기 사이에 삽입될 수 있다. 스페이서의 수는 첨가된 시스테인 잔기의 수 또는 원하는 치료 분자의 수에 따라 조정될 수 있다. 스페이서는 2개 이상의 IgG 결합 도메인을 수용하기에 충분한 공간을 제공하는 역할을 한다. 스페이서는 하나 이상의 글리신 또는 세린 또는 이들의 조합일 수 있다. 대안적으로, 하나 초과의 iTEP 서열 및/또는 하나 초과의 IBD가 재조합 폴리펩티드에 존재할 때 추가 링커 서열이 재조합 폴리펩티드에 혼입될 수 있다.
따라서, 일부 측면에서, 본원에 개시된 재조합 단백질 및 조성물은 하나 이상의 치료제를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 설명된 바와 같은 재조합 폴리펩티드(예: iTEP) 및 치료제는 1:1(재조합 폴리펩티드:치료제)의 비율로 존재한다. 재조합 폴리펩티드:치료제 비율은 또한 2:2, 3:3, 4:4, 5:5, 6:6, 7:7, 8:8, 9:9, 10:10 또는 이들의 임의의 다른 조합일 수 있다. 본원에 설명된 재조합 폴리펩티드에 접합될 수 있는 치료제의 수는 주어진 폴리펩티드에 첨가되는 접합 부위(예: IgG 결합 도메인 또는 시스테인 잔기)의 수에 의해 결정될 수 있다. 일부 측면에서, 재조합 폴리펩티드:치료제 비율은 또한 0.5:1, 1:1, 2:1, 4:1, 8:1, 16:1, 24:1, 32:1 또는 이들의 임의의 다른 조합일 수 있다. 일부 측면에서, 재조합 폴리펩티드:치료제 비율은 0.5:1(또는 대안적으로, 1:2) 내지 32:1일 수 있다.
하나 이상의 시스테인 잔기는 본원에 설명된 재조합 폴리펩티드 사이에 (예를 들어, 2개의 iTEP 분자 또는 2개의 상동성 아미노산 반복 서열 사이에) 첨가될 수 있다. 시스테인 잔기는 2개 이상의 스페이서(예: 글리신 잔기)를 첨가함으로써 추가로 분리될 수 있다. 예를 들어, 4개의 시스테인 잔기가 이중 블록 중합체(또는 공중합체 또는 융합 단백질)와 IgG 결합 도메인 사이에 삽입될 수 있다. 이들 시스테인 잔기는, 예를 들어, 8개의 글리신 잔기의 첨가에 의해 추가로 분리될 수 있다.
검출 가능한 표지. 본원에 설명된 재조합 폴리펩티드는 하나 이상의 표지 또는 검출 태그(예를 들어, FLAG™ 태그, 에피토프 또는 단백질 태그, 예컨대 myc 태그, 6 His, 및 형광 융합 단백질)를 추가로 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 표지(예: FLAG™ 태그)는 재조합 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 일부 측면에서, 개시된 방법 및 조성물은 재조합 폴리펩티드, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 다양한 측면에서, 재조합 폴리펩티드는 적어도 하나의 에피토프-제공 아미노산 서열(예: “에피토프-태그”)을 포함하고, 상기 에피토프-태그는 i) 단백질(예: 재조합 폴리펩티드)의 N-말단 및/또는 C-말단에 추가된 에피토프-태그; 또는 ii) 단백질(예: 재조합 폴리펩티드)의 영역 내에 삽입된 에피토프-태그, 및 단백질(예: 재조합 폴리펩티드) 내의 여러 아미노산을 대체하는 에피토프-태그로부터 선택된다. 일부 측면에서, 검출 가능한 표지는 검출 가능한 모이어티로서 지칭될 수 있다. 일부 측면에서, 검출 가능한 표지 또는 검출 가능한 모이어티는 IgG 결합 도메인에 공유 연결되거나 공유 결합될 수 있다. 검출 가능한 모이어티를 검출하는 방법이 본원에 또한 개시된다. 상기 방법은 본원에 개시된 바와 같은 재조합 폴리펩티드의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 IgG 결합 도메인은 검출 가능한 모이어티에 공유 또는 비공유 연결되어, 검출 가능한 모이어티를 검출한다.
에피토프 태그는 특이적 항체가 상승될 수 있는 아미노산의 짧은 스트레치며, 일부 측면에서, 이는 살아있는 유기체 또는 배양된 세포에 첨가된 태그된 단백질을 특이적으로 식별하고 추적할 수 있게 한다. 태그된 분자의 검출은 다수의 상이한 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 기술의 예는: 면역조직화학, 면역침전, 유세포 계측법, 면역형광 현미경, ELISA, 면역블롯팅(“웨스턴 블롯팅”), 및 친화도 크로마토그래피를 포함한다. 에피토프 태그는 대상체 단백질 상에 공지된 에피토프(예를 들어, 항체 결합 부위)를 첨가하여, 공지되고 종종 고친화도 항체의 결합을 제공하고, 이에 의해 살아있는 유기체 또는 배양된 세포에 첨가된 태그된 단백질을 특이적으로 식별하고 추적할 수 있게 한다. 에피토프 태그의 예는 myc, T7, GST, GFP, HA(헤마글루티닌), V5 및 FLAG 태그를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 처음 4개의 예는 기존 분자로부터 유래된 에피토프이다. 대조적으로, FLAG는 높은 항원성을 위해 설계된 합성 에피토프 태그다(예를 들어, 미국 특허 제4,703,004호 및 제4,851,341호 참조). 에피토프 태그는 항체에 의한 인식을 넘어, 하나 이상의 추가 기능을 가질 수 있다.
일부 측면에서, 개시된 방법, 재조합 폴리펩티드 및 조성물은 에피토프-태그를 포함하고, 여기서 에피토프-태그는 6 내지 15개 아미노산의 길이를 갖는다. 대안적인 측면에서, 에피토프-태그는 9 내지 11개의 아미노산의 길이를 갖는다. 개시된 방법 및 조성물은 또한 2개 이상의 에피토프-태그를 포함하는 재조합 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 이 둘은 이격되거나 직접적으로 일렬로 존재한다. 또한, 개시된 방법 및 조성물은 재조합 폴리펩티드가 그의 생물학적 활성/활성들(예: “기능성”)을 유지하는 한, 2, 3, 4, 5개 또는 훨씬 더 많은 에피토프-태그를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 에피토프-태그는 VSV-G 태그, CD 태그, 칼모둘린-결합 펩티드 태그, S-태그, Avitag, SF-TAP-태그, 스트렙-태그, myc-태그, FLAG-태그, T7-tag, HA(헤마글루티닌)-태그, His-태그, S-태그, GST-태그, 또는 GFP-태그일 수 있다. 이들 태그의 서열은 문헌에 기술되어 있고 당 분야의 숙련자에게 주지되어 있다.
본원에 설명된 바와 같이, 용어 “면역학적 결합”은 항원의 에피토프(예: 에피토프-태그)와 항체 또는 이의 단편의 항원-특이적 부분 사이의 비공유 부착 형태다. 항체는 바람직하게는 단클론이며, 사용되는 각각의 에피토프 태그(들)에 특이적이어야 한다. 항체는 쥣과 동물, 인간 및 인간화 항체를 포함한다. 항체 단편은 당 분야의 숙련자에게 공지되어 있으며, 무엇보다도 단쇄 Fv 항체 단편(scFv 단편) 및 Fab 단편을 포함한다. 항체는 규칙적인 하이브리도마 및/또는 다른 재조합 기술에 의해 생산될 수 있다. 많은 항체가 상업적으로 이용 가능하다.
공지된 단백질의 도메인, 또는 전체 단백질 또는 단백질 및 펩티드로부터 재조합 폴리펩티드를 구성하는 것은 주지되어 있다. 일반적으로, 원하는 단백질 및/또는 펩티드 부분을 암호화하는 핵산 분자는 유전자 조작 기술을 사용하여 결합되어 단일의 작동가능하게 연결된 융합 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 적절한 분자 생물학 기술은 Sambrook 등의 (Molecular Cloning: A laboratory manual Second Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold spring harbor, NY, USA, 1989)에서 발견 가능하다. 다양한 링커에 의해 결합된 단백질, 및 펩티드 태그를 함유하는 단백질을 포함하여, 유전자 조작된 다중 도메인 단백질의 예는 다음의 특허 문헌에서 확인할 수 있다: 미국 특허 제5,994,104호(“인터루킨-12 융합 단백질”); 미국 특허 제5,981,177호(“단백질 융합 방법 및 구성”); 미국 특허 제5,914,254호(“리더 서열 없이 세포질 밖으로 수송된 융합 폴리펩티드의 발현”); 미국 특허 제5,856,456호(“결합된 융합 폴리펩티드용 링커”); 미국 특허 제5,767,260호(“항원 결합 융합 단백질”); 미국 특허 제5,696,237호(“재조합 항체-독소 융합 단백질”); 미국 특허 제5,587,455호(“특이적 바이러스 감염에 대한 세포독성 제제”); 미국 특허 제4,851,341호(“면역친화도 정제 시스템”); 미국 특허 제4,703,004호(“식별 펩티드를 갖는 단백질의 합성”); 및 WO 98/36087(“HIV 에피토프에 대한 면역학적 내성”).
대상체 재조합 폴리펩티드 내에 기능화 펩티드 부분(에피토프-태그)을 배치하는 것은 관능화 펩티드 부분의 활성 및 융합 시 TCR과 같은 적어도 실질적인 재조합 폴리펩티드의 생물학적 활성을 유지할 필요성에 의해 영향을 받을 수 있다. 관능화 펩티드의 배치 방법은 2가지다: N-말단, 및 삽입에 대한 순응성을 나타내는 단백질 부분 내의 위치에서다. 이들은 관능화 펩티드가 삽입될 수 있는 유일한 위치는 아니지만, 이들은 좋은 예로서 기능하며, 예시로서 사용될 것이다. 다른 적정한 삽입 위치는, 시험 펩티드 암호화 서열(예: FLAG 펩티드를 암호화하는 서열)을 상이한 위치에서 작제물에 삽입한 다음, 재조합 폴리펩티드를 작제하는 데 사용되는 특이적 부분에 적정한 검정을 사용하여, 적정한 생물학적 활성에 대한 결과적인 융합을 분석하고 펩티드 활성을 관능화함으로써 식별될 수 있다. 대상체 재조합 폴리펩티드의 활성은 본원에 설명된 것들을 포함하여, 임의의 다양한 공지된 기술을 사용하여 측정될 수 있다.
본원에 개시된 방법은, 재조합 폴리펩티드의 약제학적으로 허용 가능한 염을 생산하기 위해 쉽게 변형될 수 있는 본원에 개시된 바와 같은 재조합 폴리펩티드를 생산하는 공정에 관한 것이다. 이러한 염을 포함하는 약제학적 조성물 및 이를 투여하는 방법이 본 개시의 범위 내에 있다.
약제학적 조성물
본원에 개시된 바와 같이, 재조합 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 개시된다. 또한, 재조합 폴리펩티드(들) 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물이 본원에 개시된다. 일부 측면에서, 치료제는 항암제 또는 자가면역 질환을 치료하는 데 사용될 수 있는 제제일 수 있다. 일부 측면에서, 치료제는 항체 또는 이의 단편, 항체-약물 접합체의 일부인 항체 또는 Fc-융합 단백질일 수 있다. 일부 측면에서, 약제학적 조성물은 비경구 투여, 피하 투여 또는 직접 주사를 위해 제형화될 수 있다. 일부 측면에서, 주사에 의한 투여는 (치료제에 비공유 결합된 재조합 폴리펩티드를 포함하는) 재조합 폴리펩티드 중 어느 하나를 포함하는 본원에 개시된 조성물 중 어느 하나를 하나 이상의 질환 부위(예: 종양)에 직접 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 개시의 조성물은 또한 본원에 설명된 바와 같은 재조합 폴리펩티드의 치료적 유효량을 함유한다. 조성물은 임의의 다양한 투여 경로에 의해 투여되도록 제형화될 수 있고, 투여 경로에 따라 달라질 수 있는, 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “부형제”는 “담체” 또는 “희석제”로도 지칭될 수 있는 것들을 포함하는, 임의의 화합물 또는 물질을 의미한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 조성물 및 재조합 폴리펩티드는 천연 고분자, 보강제, 부형제, 보존제, 흡수를 지연시키기 위한 제제, 필러, 결합제, 흡수제, 완충제, 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 약제학적 조성물 및 생리학적으로 허용 가능한 조성물을 제조하는 것은 당 기술분야에서 일상적인 것으로 간주되며, 따라서 당 분야의 숙련자는 필요한 경우 가이드에 대해 수많은 당국에 자문을 구할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여용으로 제조될 수 있다. 비경구 투여를 위해 제조된 약제학적 조성물은 정맥내(또는 동맥내), 근육내, 피하, 복강내, 점막내(예를 들어, 비강내, 질내 또는 직장) 투여, 또는 경피(예를 들어, 국소) 투여를 위해 제조된 것들을 포함한다. 에어로졸 흡입 또한 재조합 폴리펩티드를 전달하는 데 사용될 수도 있다. 따라서, 조성물은, 물, 완충수, 식염수, 완충 식염수(예를 들어, PBS) 등과 같은, 수성 담체를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 허용 가능한 담체에 용해되거나 현탁된 재조합 폴리펩티드를 포함하는 비경구 투여를 위해 제조될 수 있다. 포함된 부형제 중 하나 이상은 pH 조정제 및 완충제, 등장성 조정제, 습윤제, 세제 등과 같은, 생리학적 상태를 근사화하는 데 도움을 줄 수 있다. 조성물이 (경구 투여용일 수 있는) 고형 성분을 포함하는 경우, 부형제 중 하나 이상은 (예를 들어, 정제, 캡슐 등의 제형을 위한) 결합제 또는 필러로서 작용할 수 있다. 조성물이 피부 또는 점막 표면에 적용되도록 제형화되는 경우, 부형제 중 하나 이상은 크림, 연고 등의 제형을 위한 용매 또는 유화제일 수 있다. 본원에 개시된 조성물 중 어느 하나는 조성물이 주사 후 데포로 변하도록 투여될 수 있다. 예를 들어, 주사 전에, 본원에 개시된 임의의 조성물(예: 치료제를 포함하는 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드)은 가용성 용액 내에 있을 수 있다. 예를 들어, 조직 내로 주사한 후, 조성물은 변화하여 데포를 형성할 수 있다. 형성될 수 있는 데포는 치료제 단독 투여와 비교하여 조직에서 더 오래 치료제를 보유할 수 있다.
약제학적 조성물은 멸균성이 있거나 종래의 멸균 기술에 의해 멸균되거나 멸균 여과될 수 있다. 수용액은 그대로 사용하기 위해 포장되거나, 동결건조된 상태로 포장될 수 있고, 동결건조된 제제는 본 개시에 의해 포함되며, 투여 전에 멸균 수성 담체와 조합될 수 있다. 약제학적 조성물의 pH는 통상적으로 3 내지 11(예를 들어, 약 5 내지 9) 또는 6 내지 8(예를 들어, 약 7 내지 8)일 것이다. 고형분 형태의 생성된 조성물은, 각각이 고정된 양의 전술한 제제 또는 제제들을 함유하는, 다수의 단일 투여량 단위로, 예컨대, 정제 또는 캡슐의 밀봉된 패키지 내에 포장될 수 있다. 고형분 형태의 조성물은 또한 유연성 양을 위한 용기 내에, 예컨대 국소 적용 가능한 크림 또는 연고용으로 설계된 압착 가능한 튜브 내에 포장될 수 있다.
치료 방법
암을 가진 환자를 치료하는 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드 중 어느 하나를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
암을 가진 환자를 치료하는 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 (a) 치료를 필요로 하는 환자를 식별하는 단계; 및 (b) 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드 중 어느 하나를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
자가면역 질환을 가진 환자를 치료하는 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드 중 어느 하나를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 자가면역 질환을 가진 환자를 치료하는 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 (a) 치료를 필요로 하는 환자를 식별하는 단계; 및 (b) 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드 중 어느 하나를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
암을 가진 대상체를 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 자가면역 질환을 가진 대상체를 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 질환 또는 장애를 가진 대상체에게 투여될 치료제가 항체 또는 이의 단편인 임의의 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 측면에서, 질환 또는 장애는 염증, 자가면역 질환, 감염성 질환, 혈액 질환, 심혈관 질환, 대사 질환, 골 질환, 근육 질환, 통증, 안과 질환 등을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
일부 측면에서, 상기 방법은 본원에 개시된 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 방법은 투여 단계 전에 치료를 필요로 하는 대상체를 식별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이를 필요로 하는 대상체에서 종양 크기를 감소시키는 방법이 본원에 개시된다. 일부 측면에서, 상기 방법은 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드 중 어느 하나를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, IgG 결합 도메인은 치료제에 비공유 결합됨으로써 종양 크기를 감소시킬 수 있다. 일부 측면에서, 종양은 악성 종양일 수 있다. 일부 측면에서, 악성 종양은 유방암, 난소암, 폐암, 대장암, 위암, 두경부암, 교모세포종, 신장암, 자궁경부암, 복막암, 신장암, 췌장암, 뇌암, 비장암, 전립선암, 요로상피세포암종, 피부암, 골수종, 림프종, 또는 백혈병일 수 있다.
재조합 폴리펩티드에 접합된 치료제를 대상체에게 투여하는 방법이 본원에 또한 개시된다. 일부 측면에서, 재조합 폴리펩티드는 IgG 결합 도메인에 공유 결합된 상동성 아미노산 반복 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 치료제는 IgG 결합 도메인에 비공유 접합된다. 일부 측면에서, 접합체는 직접 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 비접합 형태로 동일한 방식으로 대상체에게 투여된 동일한 양의 치료제와 비교하여 치료제가 접합체로서 접합된 형태로 대상체에게 투여되는 경우 대상체에서 (i) 치료제의 생체이용률이 더 크고; (ii) 치료제의 반감기가 더 크고, (iii) 치료제의 전신 독성이 더 적은 경우 중 적어도 하나다.
또한, 대상체에서 치료제의 효능을 증가시키거나 치료제의 반감기를 증가시키는 방법이 본원에 개시된다. 일부 측면에서, 상기 방법은 재조합 폴리펩티드에 비공유 접합된 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있고, 상기 재조합 폴리펩티드는 IgG 결합 도메인에 공유 결합된 상동성 아미노산 반복 서열을 포함하고, 상기 치료제는 상기 IgG 결합 도메인에 비공유 접합되고, 상기 접합체는 직접 주사에 의해 투여되고, 이에 의해 치료제의 효능 또는 반감기가 증가될 수 있다. 일부 측면에서, 접합체는 종양 또는 암 또는 질환의 부위(들) 내로 직접 주입될 수 있다.
일부 측면에서, 접합체는 치료 유효량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 접합체는 비경구 주사에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 접합체는 대상체에게 피하 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 치료제의 생체 내 효능은, 미접합 형태로 대상체에게 투여된 치료제의 동일한 양과 비교하여, 대상체에서 향상될 수 있다.
전술한 약제학적 조성물은 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드 중 어느 하나의 치료적 유효량을 포함하도록 제형화될 수 있다. 치료적 투여는 예방적 응용예를 포함한다. 유전자 검사 및 다른 예후 방법에 기초하여, 환자와 상담한 의사는 환자가 암 또는 자가면역 질환의 유형에 대해 임상적으로 결정된 소인 또는 증가된 감수성(일부 경우에는, 상당히 증가된 감수성)을 갖는 경우에 예방적 투여를 선택할 수 있다.
본원에 설명된 약제학적 조성물은 임상 질환의 발병을 지연, 감소 또는 바람직하게는 예방하기에 충분한 양으로 대상체(예: 인간 환자)에게 투여될 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 환자 또는 대상체는 인간 환자 또는 대상체일 수 있다. 치료적 응용예에서, 조성물은 암(또는 자가면역 질환)을 이미 앓고 있거나 진단받은 대상체(예를 들어, 인간 환자)에게 징후 또는 증상을 적어도 부분적으로 개선하거나 병태의 증상, 합병증 및 결과의 진행을 억제(바람직하게는 정지)하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 이를 달성하기에 적절한 양은 “치료적 유효량”으로서 정의된다. 약제학적 조성물의 치료적 유효량은 치유를 달성하는 양일 수 있지만, 그 결과는 달성될 수 있는 여러 것 중 하나일 수 있다. 언급된 바와 같이, 치료적 유효량은 암(또는 자가면역 질환)의 발병 또는 진행이 지연되거나, 방해되거나, 예방되거나, 암(또는 자가면역 질환) 또는 암(또는 자가면역 질환)의 증상이 완화되는 치료를 제공하는 양을 포함한다. 증상 중 하나 이상은 중증이 덜할 수 있다. 수복은 치료된 개체에서 가속될 수 있다. 본원에 설명된 조성물 내에 존재하고 포유동물(예를 들어, 인간)에 적용된 방법에 사용되는 치료제 중 하나 이상의 치료적 유효량은 연령, 체중 및 (전술한 바와 같은) 다른 일반 조건의 개별적인 차이를 고려하여 당 분야의 숙련자에 의해 결정될 수 있다. 일부 측면에서, 암은 원발성 또는 이차 종양일 수 있다. 다른 측면에서, 원발성 또는 이차 종양은 환자의 유방, 폐, 결장, 난소, 머리, 목, 피부, 위장관, 자궁경부, 신장, 췌장, 뇌, 비장, 전립선, 요로상피, 림프절, 혈액, 복부의 상피세포, 골수, 면역 세포(예를 들어, 비장, 림프구, 흉선) 내에 있을 수 있다.
암 환자를 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 암은 임의의 암일 수 있다. 일부 측면에서, 암은 고형 암일 수 있다. 일부 측면에서, 고형 암은 폐암, 대장암, 유방암, 뇌암, 간암, 전립선암, 비장암, 근육암, 난소암, 췌장암, 피부암, 및 흑색종일 수 있다 일부 측면에서, 암은 유방암, 난소암, 폐암, 대장암, 위암, 두경부암, 교모세포종, 신암, 자궁경부암, 복막암, 신장암, 췌장암, 뇌암, 비장암, 전립선암, 요로상피암종, 피부암, 골수종, 림프종, 또는 백혈병일 수 있다. 일 측면에서, 암은 전이성일 수 있다.
자가면역 질환을 가진 환자를 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 자가면역 질환은 임의의 자가면역 질환 또는 장애일 수 있다. 일부 측면에서, 자가면역 질환 또는 장애는 비호지킨 림프종, 류머티스 관절염, 만성 림프구성 백혈병, 다발성 경화증, 전신성 홍반루푸스, 자가면역 용혈성 빈혈, 순수 적혈구 무형성증, 특발성 혈소판감소성 자반증, 에반스 증후군, 혈관염, 수포성 피부 장애, 1형 당뇨병, 쇼그렌 증후군, 데빅병, 또는 그레이브스병 안염증일 수 있다.
이 사용에 효과적인 양은 암(또는 자가면역 질환)의 중증도 및 대상체의 체중 및 전반적 상태 및 건강에 따라 달라질 수 있지만, 일반적으로 대상체당 투여량 당 재조합 폴리펩티드의 동등한 양의 약 0.05 μg 내지 약 1000 mg(예: 1 내지 15 mg/kg) 범위이다. 초기 투여 및 부스터 투여에 적합한 체제는 초기 투여에 이어서 후속 투여에 의해 1 이상의 매시간, 매일, 매주 또는 매월 간격으로 반복 투여량이 따라는 것으로 규정된다. 예를 들어, 대상체는 주당 1회 이상(예를 들어, 주당 2, 3, 4, 5, 6 또는 7회 이상) 투여량 당 비결합 또는 유리 치료제(들)와 비교하여 약 0.05 μg 내지 1,000 mg 등가 투여량 범위의 치료제를 포함하는 재조합 폴리펩티드를 투여받을 수 있다. 예를 들어, 대상체는 주당 0.1 μg 내지 2,500 mg(예를 들어, 2,000, 1,500, 1,000, 500, 100, 10, 1, 0.5, 또는 0.1 mg) 투여량을 투여받을 수 있다. 대상체는 또한 2주 또는 3주마다 1회 투여량 당 0.1 μg 내지 3,000 mg 범위의 본원에 개시된 재조합 폴리펩티드를 투여받을 수 있다. 대상체는 또한 매주 2 mg/kg을 투여받을 수 있다(재조합 폴리펩티드 또는 면역원성 바이오컨쥬게이트의 임의의 부분 또는 성분의 중량에 기초하여 계산된 중량).
본원에 개시된 약제학적 조성물 중의 재조합 폴리펩티드의 총 유효량은, 볼루스로서 또는 비교적 짧은 시간 동안 주입에 의해, 포유동물에게 단일 투여량으로 투여될 수 있거나, 다중 투여량이 보다 장기간에 걸쳐(예를 들어, 4-6, 8-12, 14-16, 또는 18-24시간마다, 2-4일마다, 1-2주마다, 또는 1개월에 1회 투여량) 투여되는 분할된 치료 프로토콜을 사용하여 투여될 수 있다. 대안적으로, 혈액 내 치료적 유효 농도를 유지하기에 충분한 연속 정맥내 주입도 본 개시의 범위 내에 포함된다.
본 개시의 재조합 폴리펩티드는 혈청 및 혈류에서 안정적일 수 있고, 일부 경우에 보다 특이적일 수 있기 때문에, 임의의 개별 성분을 포함하는 재조합 폴리펩티드의 용량은, 미결합될 때 개별 성분 중 어느 하나의 유효 투여량 또는 치료적 유효량보다 더 낮을(또는 더 높을) 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 투여되는 치료제(예: 항암제)는, 치료제(예: 항암제)가 단독으로 투여되거나 재조합 폴리펩티드의 일부로서 투여되지 않을 때(또는 재조합 폴리펩티드에 결합되지 않을 때)와 비교하여, 재조합 폴리펩티드의 일부로서 투여될 때(또는 재조합 폴리펩티드에 결합(예; 비공유 결합)될 때 증가된 효능 또는 감소된 부작용을 가질 수 있다. 일부 측면에서, 치료제는, 치료제가 단독으로 투여되거나 재조합 폴리펩티드에 결합되지 않을 때와 비교하여 재조합 폴리펩티드에 투여될 때(예를 들어, 비공유 결합됨) 증가된 반감기를 가질 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 상이한 제2 약제학적 조성물 또는 요법의 투여와 (동시에, 전에 또는 후에) 투여되거나 병용 투여될 수 있다. 제2 약제학적 조성물 또는 요법은 치료 체제 및 암의 유형 및 중증도 또는 자가면역 질환의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있다. 일부 측면에서, 제2 약제학적 조성물 또는 요법은 화학요법일 수 있다.
예
예 1: 면역 관문 항체의 지속적인 국소 전달을 위한 면역 내성 엘라스틴-유사 폴리펩티드(ITEP)
요약. 면역 관문 항체의 전신 투여와 관련된 문제를 해결하기 위해, 면역 내성 엘라스틴-유사 폴리펩티드(iTEP)-기반 시스템을 개발하여 면역 관문 항체의 국소 전달을 개선하였다. iTEP의 상 전이 특성으로 인해, 열민감성 전달 시스템이 주사 부위에서 서방형 데포를 형성할 수 있다. 항체를 데포에 연결시키기 위해, IgG 결합 도메인(IBD)을 iTEP에 융합시켰다. 본원에 설명된 결과는 iTEP-IBD 폴리펩티드가 항체의 방출을 연장시키고 국소 주사 부위에서 항체의 보유 시간을 증가시킬 수 있음을 입증한다. iTEP-IBD 폴리펩티드의 설계를 제어함으로써, 항체의 방출 반감기가 약 17.2 내지 약 74.9시간 이내에 미세 조정될 수 있다. 흑색종을 질환 모델로서 사용하는 경우, 결과는 iTEP-IBD 폴리펩티드가 72시간 넘는 시간 동안 종양에서 항체를 보유시켰다는 것을 보여준다. 또한, iTEP-IBD 폴리펩티드는 다른 기관 및 혈액 순환에서의 항체 노출을 감소시켰으며, 이에 의해 부작용 위험을 감소시켰다. 이 결과는 iTEP-IBD 폴리펩티드가 암 대상체에서 면역 관문 항체의 국소 전달을 위한 플랫폼으로서 사용될 수 있음을 시사한다.
iTEP-IBD는 IgG를 포획하고 IgG의 결합 기능에 영향을 미치지 않았다. 첫번째 IBD를 상이한 분자량(MW)을 갖는 3개의 상이한 iTEP에 융합하였다: iTEP28 (서열번호 13), iTEP56(서열번호 16), 및 iTEP112 (서열번호 17) (표 2). 다음으로, 각 유형의 iTEP-IBD 폴리펩티드의 전이 온도(Tt)를 시험하였다(도 1a 및 1b). 동일한 농도에서, iTEP56-IBD(서열번호 36)의 Tt는 iTEP112-IBD(서열번호 37)보다 높았지만 iTEP28-IBD(서열번호 38)보다 낮았으며, 이는 iTEP-IBD의 MW와 Tt 간의 관계를 밝혀냈는데: MW가 높을수록 Tt가 낮다. 결과는 또한 각 유형의 iTEP-IBD 융합 폴리펩티드의 Tt가 농도의 함수임을 보여주었다: 농도가 높을수록 Tt가 낮다. 요약하면, iTEP-IBD 폴리펩티드의 Tt는 37℃ 보다 낮아서 iTEP-IBD 폴리펩티드가 조직에 주사된 후 불용성 상으로 변환되고 데포를 형성할 수 있어야 한다. 다음으로, iTEP-IBD 폴리펩티드가 데포에서 IgG를 포획할 수 있는지 여부를 조사하였다. 이 실험에서, iTEP-IBD 폴리펩티드 및 IgG의 혼합물을 37℃에서 인큐베이션하여 데포를 형성하게 하였다. 그런 다음, 데포를 수집하여 함유된 IgG의 양을 분석하였다. 데포 내의 IgG의 분획은 두 가지 인자에 의존적인 것으로 밝혀졌다: iTEP-IBD 폴리펩티드의 MW 및 iTEP-IBD 폴리펩티드 대 IgG의 몰비(도 1c). iTEP28-IBD 대 IgG의 비가 8 이상일 때, IgG의 약 55%가 데포 내에 있었다. iTEP56-IBD 및 iTEP112-IBD의 경우, 비율이 8 이상일 때, IgG의 약 90%가 데포 내에 있었다. 이들 결과는 데포 내의 IgG가 iTEP-IBD 폴리펩티드의 비율 및 MW를 제어함으로써 미세 조정될 수 있음을 시사한다. iTEP-IBD 폴리펩티드가 IgG에 결합할 수 있기 때문에, iTEP-IBD 폴리펩티드가 항체의 표적-결합 능력을 방해할 수 있는지 여부를 평가하였다. 이 연구를 위해, 항-PD-1(αPD-1) 항체를 모델 항체로서 사용하였다. 세포 표면 상에서 PD-1을 발현하는 세포주인, EL4 세포를 표적 세포로서 또한 사용하였다. 유세포 계측법 결과(도 1d 및 1e)에 의해 도시된 바와 같이, iTEP112-IBD와의 결합 후, αPD-1 항체는 유리 αPD-1 항체와 유사하게, 여전히 EL4 세포 상의 PD-1PD-1에 결합할 수 있다. 이들 결과는 iTEP-IBD 폴리펩티드가 항체의 표적 결합 능력에 영향을 미치지 않았음을 시사한다.
iTEP-IBD 폴리펩티드는 IgG의 방출을 지속하였다. iTEP-IBD 융합 폴리펩티드가 데포 내에 IgG를 포획할 수 있기 때문에, 이어서 데포로부터 IgG의 방출을 확인하였다. IgG 방출을 먼저 2가지 종류의 방출 완충액을 사용해 시험관 내에서 시험하였다: PBS 및 100% 마우스 혈청. 처음 100시간 이내에 IgG의 파열 방출이 있었으며, 이후에 장기간에 걸쳐 일정한 방출이 있음을 발견하였다(도 2a). 파열 방출은 방출 완충액에 의해 신속하게 침지된 데포의 표면에 있는 결합된 IgG로부터 유래될 수 있다. 방출 완충액이 데포를 침투하는 데 더 오랜 시간이 걸리기 때문에, 데포의 내부에서의 결합된 IgG로 인해 꾸준한 방출이 발생할 수 있다. 마우스 혈청에서의 파열 방출이 PBS에서보다 더 명백하였는데, 이는 혈청에 존재하는 프로테아제가 데포의 분해를 촉진했기 때문일 것이다. 연구는 프로테아제가 혈청 속 단백질 및 펩티드의 단백질 분해를 유발하였고, 프로테아제의 억제제가 분해를 감소시킬 수 있음을 발견하였다(J. Yi 등, J Proteome Res 6(5) (2007) 1768-81; 및 R. Bottger 등, PLoS One 12(6) (2017) e0178943). 또한, 혈청 속 마우스 IgG는 iTEP-IBD 폴리펩티드에 대한 결합을 위해 결합된 IgG와 경쟁할 수 있고, 데포에서 결합된 IgG를 교체할 수 있다. 이러한 교체는 IgG 방출을 가속화할 수 있고 혈청에서 파열 방출의 또 다른 이유일 수 있다. 다음으로 주사 부위에서의 IgG 방출을 생체 내 조사하였다. 이 실험에서, 유리 IgG 또는 iTEP112-IBD와 IgG의 혼합물(iTEP112-IBD/IgG)을 마우스에 피하 주사하고, 시간이 지남에 따라 주사 부위에서 잔여 IgG를 관찰하였다. 결과는 iTEP112-IBD가 24시간 후에 주사 부위에서 사라진 유리 IgG와 비교하여, 96시간을 넘는 시간 동안 주사 부위에서 IgG를 유지시킨다는 것을 보여준다(도 2b). 주사 부위에서 잔여 IgG의 형광 강도를 시간 경과에 따라 정량화하고(도 2c), 상이한 수학 모델을 사용하여 IgG의 방출 동역학을 분석하였다(도 7). 상이한 모델의 판정 계수에 의해 나타낸 바와 같이(표 3), 일차 모델은 생체 내에서 IgG 및 iTEP112-IBD/IgG의 방출 프로파일을 가장 잘 기술하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 다른 실험에서 IgG 방출을 분석하기 위해 일차 모델을 사용하였다. 일차 모델의 분석에 기초하여, IgG 및 iTEP112-IBD/IgG의 방출 반감기는 각각 7.1±1.0시간 및 20.7±1.1시간이었다 (도 2c). 주사 후 IgG의 혈장 농도도 비교하였다. IgG를 단독으로 피하 주사했을 때, IgG의 혈장 농도는 IgG를 iTEP112-IBD와 함께 주사했을 때보다 훨씬 더 높았다 (도 4.2d). iTEP112-IBD/IgG의 곡선하 면적(AUC)(106.9 μg/mL/h)은 유리 IgG의 AUC(1402.7 μg/mL/h) 보다 13배 더 낮았다. 이 데이터는 iTEP112-IBD가 항체의 전신 노출을 감소시킬 수 있으며, 이는 항체 치료의 부작용의 위험을 감소시킬 수 있음을 나타냈다. 또한, 생체 내 iTEP56-IBD/IgG 및 iTEP28-IBD/IgG의 방출을 조사하였다 (도 3a). 방출 동역학에 기초하여(도 2c 및 도 3b), iTEP112-IBD/IgG 및 iTEP56-IBD/IgG는 유사한 방출 반감기를 갖는 반면(각각 20.7±1.1시간 및 23.2±2.2시간), iTEP28-IBD/IgG는 더 짧은 방출 반감기(17.2±2.4시간)를 가졌으며, 이는 iTEP28-IBD가 iTEP112-IBD 및 iTEP56-IBD 보다 높은 Tt를 가졌기 때문이었다 (도 1b).
표 3
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iTEP-IBD 융합 단백질의 가교 결합은 IgG의 방출에 영향을 미쳤다. 이전의 연구는 분자간 가교 결합이 iTEP의 안정성에 영향을 미쳤음을 보여주었다(S. Dong 등, Theranostic 6(5) (2016) 666-78). 따라서, iTEP-IBD 폴리펩티드의 가교 결합이 데포의 안정성을 증가시킬 수 있는지 여부와, 이에 따라 데포로부터의 IgG의 방출 속도에 영향을 주는지 시험하였다. iTEP-IBD 폴리펩티드를 가교 결합시키기 위해, 시스테인 잔기를 iTEP와 IBD 사이에 도입하고(표 1), 새로운 폴리펩티드를 iTEP-C-IBD로 명명하였다. 시스테인 잔기는 산화 상태에서 분자간 이황화 결합을 형성하고, 이에 따라 iTEP-C-IBD 폴리펩티드를 가교 결합시키도록 설계되었다. iTEP28-C-IBD, iTEP56-C-IBD, 및 iTEP112-C-IBD를 생성한 후, 이들의 Tt(도 4a 및 4b)를 시험하였다. 시스테인 잔기를 첨가한 후 Tt의 강하를 관찰했으며: iTEP-C-IBD 폴리펩티드의 Tt는 상응하는 iTEP-IBD 폴리펩티드의 Tt보다 낮았다(도 1b 및 도 4b). iTEP28-IBD와 비교하여 iTEP28-C-IBD의 경우 3-10℃의 Tt 강하가 있었다. iTEP-C-IBD 데포 내의 IgG의 백분율도 조사하였다. iTEP28-IBD와 비교했을 때, iTEP28-C-IBD는 데포 내에 더 높은 백분율의 IgG를 포획하였다(도 1c 및 도 4c). 동시에, iTEP56-C-IBD 및 iTEP112-C-IBD는 각각 iTEP56-IBD 및 iTEP112-IBD와 유사한 백분율의 IgG를 데포 내에 포획하였다(도 1c 및 도 4c). 그런 다음, iTEP28-C-IBD/IgG, iTEP56-C-IBD/IgG, 및 iTEP112-C-IBD/IgG의 방출을 생체 내 조사하였다(도 4d). iTEP56-C-IBD/IgG는 iTEP112-C-IBD/IgG와 유사한 방출 반감기를 가졌으며 (각각, 27.9±2.1 h 및 26.1±2.0 h) iTEP28-C-IBD/IgG (23.2±1.7 h) 보다 긴 방출 반감기를 가졌다 (도 4e). 또한, iTEP-C-IBD/IgG 혼합물의 방출 반감기는 상응하는 iTEP-IBD/IgG 혼합물의 반감기보다 더 길었다(도 2c, 3b 및 4e). 이 결과는 iTEP-IBD 폴리펩티드의 가교 결합이 IgG의 방출 반감기를 증가시킬 수 있음을 입증하였다.
iTEP-C-IBD 폴리펩티드 대 IgG의 비율은 IgG의 방출에 영향을 미쳤다. 본원에서 논의된 iTEP-C-IBD/IgG 혼합물(및 iTEP-IBD/IgG 혼합물)의 방출 연구에서, 혼합물 중의 iTEP-C-IBD 폴리펩티드(및 iTEP-IBD 폴리펩티드) 대 IgG의 비율은 8:1이었다. 그런 다음, iTEP-C-IBD/IgG 혼합물 중 iTEP-C-IBD 폴리펩티드의 양이 IgG 방출에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 평가하였다. 따라서, iTEP-C-IBD 폴리펩티드의 양을 증가시켜 iTEP-C-IBD 폴리펩티드 대 IgG의 비율을 32:1로 만들면서 혼합물 중의 IgG의 양은 이전 연구와 동일하게 유지하였다. 방출을 생체 내 관찰하였다. 결과는 iTEP112-C-IBD/IgG가 가장 긴 방출 반감기(74.9±15.2시간)를 가졌고, 이어서 iTEP56-C-IBD/IgG(38.3±5.8시간) 및 iTEP28-C-IBD/IgG(24.0±2.7시간)임을 보여준다 (도 5a 및 5b). iTEP-C-IBD/IgG 혼합물의 경우, 방출 반감기는 8:1의 비율에서의 방출 반감기와 비교하여 32:1의 비율에서 증가하였다 (도 4e 및 도 5b). 또한, iTEP112-C-IBD/IgG 혼합물의 방출 반감기는 26.1±2.0시간에서 74.9±15.2시간으로 증가하였고, 비율의 변화는 8:1에서 32:1로였다. 이들 데이터는 iTEP-C-IBD 폴리펩티드 대 IgG의 비율을 증가시킴으로써 방출 반감기가 증가될 수 있음을 입증한다. 비율이 증가함에 따라, 더 많은 iTEP-C-IBD 폴리펩티드가 데포를 형성하는데, 이는 데포에 존재하는 IgG에 차폐를 제공하고 IgG의 방출을 느리게 할 수 있다.
iTEP-C-IBD 폴리펩티드는 종양에 IgG를 보유하였고 전신 노출을 감소시켰다. 생체 내 IgG 방출을 연구한 후, iTEP-C-IBD 폴리펩티드가 종양 모델, 예를 들어 흑색종에서 IgG 방출을 제어할 수 있는지 여부를 시험하였다. 이전 연구에 따르면, 항-PD-1 항체 및 항-CTLA-4 항체와 같은 면역 관문 항체의 종양내 주사가, 종양 성장을 제어하는 데 효과적임을 보여주었다(A. Marabelle 등, J Clin Invest 123(6) (2013) 2447-63; I. Sagiv-Barfi 등, Sci Transl Med 10(426) (2018); 및 J. Ishihara 등, Sci Transl Med 9(415) (2017)). 그러나, 유리 항체는 짧은 시간 동안 종양에 보유되고 전신 순환에 빠르게 진입하였는데, 이는 부최적 효과 및 부작용 위험을 초래할 수 있다(F. Wu 등, Pharm Res 29(7) (2012) 1843-53; 및 D. Schweizer 등, Eur J Pharm Biopharm 88(2) (2014) 291-309). 이 문제를 해결하기 위해, iTEP-C-IBD 폴리펩티드가 항체를 종양 내에 유지하고 이들의 전신 노출을 감소시킬 수 있는지 여부를 시험하였다. 유리 IgG 및 iTEP112-C-IBD/IgG 혼합물을 흑색종 종양 내로 주사한 다음, 상이한 시점에 종양 내의 나머지 IgG를 관찰하였다. 먼저, IVIS 이미징을 사용하여 종양에 남은 IgG를 시각화하였다. 각각의 시점에서 유리 IgG 그룹에서보다 iTEP112-C-IBD/IgG 혼합물 그룹에 더 많은 IgG가 남아있는 것으로 밝혀졌다 (도 6a). 종양 내의 나머지 IgG (도 6b). 두 시점 모두에서, iTEP112-C-IBD/IgG 혼합물 그룹의 나머지 IgG는 그램 조직당 주사된 투여량의 백분율[(%ID)/그램]로 표시된 바와 같이, 유리 IgG 그룹에서 보다 약 10배 더 많았다. 면역 관문 항체는 정상 장기에서 과도하게 활성화된 면역으로 인해 기관 특이적 독성을 유발할 수 있다(M.A. Postow 등, N Engl J Med 378(2) (2018) 158-68; 및 J.M. Michot 등, Eur J Cancer 54 (2016) 139-48). 항체는 임의의 기관에서 독성을 유발할 가능성이 있지만, 일반적으로 영향을 받는 기관은 간, 신장, 폐, 피부, 내분비선 및 혈액계를 포함한다. 이러한 독성 중 일부는 간질폐렴, 간염 및 심근염과 같은 태아이다(F. Martins 등, Nat Rev Clin Oncol (2019) 참조). 이들 기관에서 면역 관문 항체의 노출을 제한하면 기관 특이적 독성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 비장, 간, 신장 및 폐를 포함하는 기관 및 혈액에서 IgG의 축적을 조사하였다. 결과는 iTEP112-C-IBD/IgG 혼합물의 양이 이들 기관에서 유리 IgG의 양보다 상당히 적었음을 보여준다 (도 6c 및 6d). 또한, iTEP112-C-IBD/IgG 혼합물의 혈청 농도는 주사 후 24시간 및 72시간 시점 각각에 유리 IgG의 혈청 농도보다 각각 20배 및 13배 더 낮았다 (도 6e). 이들 데이터는 iTEP112-C-IBD 폴리펩티드가 항체를 종양 내에 유지시키고 다른 기관 및 전신 순환에 대한 항체 노출을 제한할 수 있음을 밝혀냈다.
논의. 국소 항체 치료제, 예컨대 면역 관문 억제제가, 국소 생체이용률 증가, 부작용 감소, 저렴한 비용 등의 장점으로 인해 주목받고 있다 (R.G. Jones, A. Martino, Crit Rev Biotechnol 36(3) (2016) 506-20; K. Kitamura, 등, Cancer Res 52(22) (1992) 6323-8; A.D. Simmons, M. Moskalenko, J. Creson, J. Fang, S. Yi, M.J. VanRoey, J.P. Allison, K. Jooss, Local secretion of anti-CTLA-4 enhances the therapeutic efficacy of a cancer immunotherapy with reduced evidence of systemic autoimmunity, Cancer Immunol Immunother 57(8) (2008) 1263-70; D.W. Grainger, Expert Opin Biol Ther 4(7) (2004) 1029-44; 및 A. Marabelle, 등, Clin Cancer Res 19(19) (2013) 5261-3). 그러나, 국소 주사 부위에서 항체의 보유 시간은 짧으며(F. Wu 등, Pharm Res 29(7) (2012) 1843-53), 이는 치료 잠재력을 제한하고 빈번한 주사를 필요로 한다(D. Schweizer 등, Eur J Pharm Biopharm 88(2) (2014) 291-309). 따라서, 주사 시 항체를 더 오랜 시간 동안 보유할 수 있는 항체 전달 시스템을 개발할 필요가 있다. 본원에 설명된 바와 같이, 주사 후 체온에서 데포를 형성할 수 있는 iTEP-IBD 기반 시스템이 개발되었다. 개발된 iTEP-IBD 기반 시스템을 사용하여, 항체를 IBD와의 결합을 통해 데포에 포획하였다. 이어서, 데포는 긴 시간에 걸쳐 항체 방출을 제어할 수 있었다.
iTEP-IBD 기반 시스템의 특별한 특징은 항체 방출 속도가 제어될 수 있다는 것이다. 본원에 설명된 결과는 IgG 방출 속도를 제어하기 위해 3가지 방법이 사용될 수 있음을 보여준다. 첫째, iTEP-IBD 폴리펩티드의 MW가 Tt에 영향을 미칠 수 있어서, IgG 방출 속도를 조절할 수 있다. iTEP28-IBD/IgG 혼합물, iTEP56-IBD/IgG 혼합물, 및 iTEP112-IBD/IgG 혼합물을 비교하였고, 그 결과는 iTEP56-IBD/IgG 혼합물 및 iTEP112-IBD/IgG 혼합물이 유사한 IgG 방출 반감기를 가졌고, 이들 모두 iTEP28-IBD/IgG 혼합물보다 더 길었음을 보여준다. iTEP28-IBD/IgG 혼합물의 IgG 방출 반감기가 더 짧았던 이유는 iTEP28-IBD 폴리펩티드의 Tt가 더 높기 때문이다. iTEP112-IBD 폴리펩티드는 iTEP56-IBD 폴리펩티드보다 약간 더 낮은 Tt를 갖지만, 이들은 유사한 IgG 방출 반감기를 가졌는데, 이는 아마도 Tt에서의 작은 차이가 방출 반감기에 유의한 차이를 초래하지 않았기 때문이다. 둘째, iTEP-IBD 폴리펩티드의 가교 결합이 IgG 방출 속도에 영향을 미칠 수 있다. iTEP-C-IBD 폴리펩티드는 시스테인 잔기를 함유하도록 설계되어서, 분자간 이황화 결합이 iTEP-C-IBD 폴리펩티드를 가교 결합할 수 있도록 하였다. 결과는 iTEP-C-IBD/IgG 혼합물의 IgG 방출 반감기가 상대 iTEP-IBD/IgG 혼합물의 반감기보다 길었음을 보여준다. 분자간 가교 결합은 생체 내 데포의 안정성을 개선시켜, 방출 반감기를 증가시킬 수 있다. IgG 방출을 조절하는 세 번째 방법은 iTEP-C-IBD 폴리펩티드 대 IgG의 비율을 제어하는 것이었다. 32:1의 비율에서의 iTEP-C-IBD/IgG 혼합물의 IgG 방출 반감기는 8:1의 비율에서의 반감기보다 더 길었으며, 이는 iTEP-C-IBD 폴리펩티드 대 IgG의 비율을 증가시킴으로써 IgG 방출 반감기가 향상될 수 있음을 나타냈다. 8:1에서 32:1로의 비율 증가는 iTEP28-C-IBD/IgG 혼합물의 반감기를 유의하게 증가시키지 않았다 (각각 23.2±1.7시간 및 24.0±2.7시간). 이 결과에 대한 원인은 iTEP28-C-IBD 폴리펩티드의 Tt에 기인할 수 있다. iTEP-C-IBD 폴리펩티드의 농도가 증가함에 따라, iTEP56-C-IBD 폴리펩티드 및 iTEP112-C-IBD 폴리펩티드 모두의 Tt는 감소하였지만, iTEP28-C-IBD 폴리펩티드의 Tt는 변하지 않았다 (도 4b). 농도 비의존적 Tt는 비율의 증가가 iTEP28-C-IBD/IgG 혼합물의 방출 반감기에 유의하게 영향을 미치지 않는 이유를 설명할 수 있다. 동시에, iTEP56-C-IBD/IgG 혼합물 및 iTEP112-C-IBD/IgG 혼합물의 방출 반감기는 8:1의 비율에서 유사하였지만(각각 27.9±2.1시간 및 26.1±2.0시간), 32:1의 비율에서는 매우 상이하였다(각각 38.3±5.8시간 및 74.9±15.2시간). 이러한 차이의 근본 원인은 잘 이해되지 않았다. iTEP112-C-IBD 폴리펩티드는 iTEP56-C-IBD 폴리펩티드보다 더 낮은 Tt를 가졌으며 더 긴 길이였다. 차이에 대한 가능한 설명은, 더 낮은 Tt 및 더 긴 길이가 8:1의 비율에서보다 32:1의 비율에서 더 유의하게 반감기를 향상시켰다는 것일 수 있다.
이 3가지 방법을 조합함으로써, IgG 방출 반감기는 약 16시간 내지 약 64시간으로 제어될 수 있다. 조정 가능한 방출 속도를 갖는 항체 전달 시스템이 바람직하다. 감염과 같은, 급성 질환, 및 류마티스 관절염과 같은, 만성 증상은 항체의 상이한 방출 속도가 필요할 수 있다. 심지어 동일한 유형의 질환에 대해서도, 질환의 상이한 단계는 특이적 항체 방출 속도가 필요할 수 있다. 이 데이터는 iTEP-IBD 기반 시스템이 상이한 질환 및 상이한 질환 상태의 상이한 요구를 충족하기 위한 조정 가능한 플랫폼을 나타낸다는 것을 시사한다.
본원에 설명된 결과는 iTEP112-C-IBD 폴리펩티드가 72시간 넘는 시간 동안 종양에서 항체를 보유할 수 있음을 입증한다. 본 실험에서, 종양 세포에 대한 표적 결합 능력을 갖지 않은 인간 IgG를 사용하였는데, 이는 실험의 목표가 iTEP112-C-IBD 폴리펩티드가 종양 내의 항체 보유에 어떻게 영향을 미쳤는지 조사하는 것이기 때문이다. 항체가 종양 세포 상의 막 표적에 결합할 수 있는 경우, 종양에서의 이들의 보유는 더 복잡할 수 있다. 첫째, 종양 표적에 대한 항체의 결합은 종양에서 항체의 축적 및 보유를 증가시킬 수 있다(C.F. Molthoff 등, Br J Cancer 65(5) (1992) 677-83). 또한, 항체 결합이 표적 내재화를 촉발할 수 있는 경우, 결합된 항체는 세포 내에서 내재화되고 분해될 수 있다(G.M. Thurber 등, Trends Pharmacol Sci 29(2) (2008) 57-61). 종양 부위에서 이들 항체의 제거는 비선형 약동학 프로파일인, 표적 매개 약물 배치 패턴을 따른다(P.M. Glassman, J.P. Balthasar, Cancer Biol Med 11(1) (2014) 20-33). 이들의 제거는 표적 밀도, 내재화 속도, 전환 속도, 및 결합 친화도(W. Wang 등, Clin Pharmacol Ther 84(5) (2008) 548-58)를 포함하는, 많은 인자에 의존한다. 이들 인자는 항체가 종양 표적에 결합할 수 있는 경우 항체 보유에 영향을 미칠 수 있다. 표적 결합 능력이 없는 항체를 사용함으로써, 이들 인자를 배제할 수 있고, 항체 보유에 대한 iTEP112-C-IBD 폴리펩티드의 인자를 평가하였다.
본원에 개시된 데이터는 또한 iTEP112-C-IBD 폴리펩티드가 전신 순환 및 다른 기관에서의 항체 노출을 감소시켰다는 증거를 제공하였다. 비-표적 기관에 대한 항체 노출을 제한하는 것은 부작용을 감소시키는 데 중요하다. 면역 관문 억제제와 같은, 치료용 항체는 흑색종 치료에 효과적이다(F.S. Hodi 등, N Engl J Med 363(8) (2010) 711-23; C. Robert, 등, N Engl J Med 372(4) (2015) 320-30; 및 J. Dine 등, Asia Pac J Oncol Nurs 4(2) (2017) 127-35). 그러나, 면역 관문 항체의 잠재성을 제한하는 하나의 과제는 면역 관련 부작용이다(R.M. Ruggeri 등, J Endocrinol Invest (2018); J. Naidoo, 등, Ann Oncol 26(12) (2015) 2375-91; 및 I. Puzanov 등, J Immunother Cancer 5(1) (2017) 95). 다른 면역 관문 항체를 치료용으로 조합했을 때 부작용은 훨씬 더 문제가 되었다. 임상 연구에 의하면, 항-PD-1 항체 및 항-CTLA-4 항체의 병용 요법을 받는 흑색종 환자의 55.0%가 3등급 또는 4등급의 부작용을 경험하였고, 36.4%의 환자가 부작용으로 인해 치료를 중단해야 하는 것으로 나타났다(J. Larkin 등, N Engl J Med 373(1) (2015) 23-34). 면역 관문 항체의 부작용은 기관 특이적이며 간, 폐, 위장관, 내분비선 등에 독성을 유발한다. (A. Winer 등, J Thorac Disc 10(Suppl 3) (2018) S480-9; 및 F. Martins 등, Nat Rev Clin Oncol (2019)). 본원에 설명된 iTEP-IBD 기반 시스템은 이들 기관에서 면역 관문 항체의 노출을 감소시킴으로써 기관 특이적 부작용을 감소시킬 수 있다. 또한, 부작용을 감소시킨 후, 항체의 더 높은 투여량이 투여될 수 있으며, 이는 결국, 치료 효능을 향상시킬 것이다.
iTEP-IBD 기반 시스템은 IBD 모이어티를 통해 광범위한 IgG 서브클래스에 결합할 수 있기 때문에 다목적이다(L. Bjorck, G. Kronvall, J Immunol 133(2) (1984) 969-74; 및 B. Akerstrom 등, J Immunol 135(4) (1985) 2589-92). IBD는 단백질 G로부터 유래된 56 잔기 도메인이다(B. Guss 등, EMBO J 5(7)(1986) 1567-75; 및 A.M. Gronenborn, G.M. Clore, ImmunoMethods 2(1) (1993) 3-8). IBD는 IgG의 단편 결정화 가능(Fc) 영역 및 단편 항원 결합(Fab) 영역 둘 모두에 결합할 수 있다(M. Erntel 등, Mol Immunol 25(2) (1988) 121-6). IBD는 CH2 및 CH3 도메인 사이의 힌지 영역에서 Fc에 결합하고(A.E. Sauer-Eriksson 등, Structure 3(3) (1995) 265-78; 및 K. Kato 등, Structure 3(1) (1995) 79-85), CH1 도메인에서 Fab에 결합한다(M. Erntell, 등, Mol Immunol 25(2) (1988) 121-126; J.P. Derrick, D.B. Wigley, Nature 359(6397) (1992) 752-4; 및 J.P. Derrick, D.B. Wigley, J Mol Biol 243(5) (1994) 906-18). Fab에 대한 결합 친화도는 Fc에 대한 결합 친화도보다 훨씬 약하다(F. Unverdorben 등, PLoS One 10(10) (2015) e013983). 항체의 항원 결합 부위는 가변 도메인에 있는 반면, IBD 결합 부위는 불변 도메인에 있는데, 이는 iTEP-IBD 폴리펩티드가 그 표적에 대한 항체의 결합 능력을 손상시키지 않았다는 관찰을 설명할 수 있다. 가변 도메인 이외에, Fc 부분은 또한 보체 의존성 세포독성, 항체 의존성 세포독성, 및 항체 의존성 세포 식균작용과 같은, 항체의 효과기 기능을 매개한다(C. Kellner 등, Transfus Med Hemother 44(5) (2017) 327-36; X. Wang, 등, Protein Cell 9(1) (2018) 63-73; 및 S. Bournazos, Cell 158(6) (2014) 1243-53). iTEP-IBD가 항체의 Fc-매개 기능에 영향을 미칠 수 있는지 여부는 알려져 있지 않다. αPD-1 항체(R. Dahan 등, Cancer Cell 28(3) (2015) 285-95; 및 T. Zhang 등, Cancer Immunol Immunother 67(7) (2018) 1079-90)와 같은 일부 항체의 경우, 이들의 효과기 메커니즘은 Fc에 의존하지 않는다. 따라서, iTEP-IBD 기반 시스템은 적어도 이들의 기능을 약화시키지 않고 이들 항체를 전달하기 위해 적용될 수 있다.
요약하면, 항체의 국소 전달을 위한 다목적 시스템이 개발되었다. 이 시스템은 치료 효과를 증가시키고 항체의 부작용을 감소시키는 데 사용될 수 있다.
재료 및 방법. 동물 및 세포주. 19.1±1.2 g의 체중인 6주령 암컷 BALB/c 마우스 및 17.5±1.0 g의 체중인 6주령 암컷 C57BL/6 마우스를 Jackson Laboratory로부터 구입하였다. EL4 세포(ATCC)를 10% 말 혈청이 보충된 DMEM 배지와 함께 배양하였다. B16-F10 세포(ATCC)를 10% 소 태아 혈청이 보충된 DMEM 배지, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 100 U/mL 페니실린에서 배양하였다. 세포를 37℃에서 95% 공기 및 5% 이산화탄소와 함께 배양하였다.
iTEP-기반 폴리펩티드 발현. iTEP 및 IBD를 코딩하는 DNA 서열을 합성하고(Eurofins Genomics), 클로닝 방법을 사용하여 플라스미드에 삽입하였다(P. Wang 등, Theranostics 8(1)(2018) 223-36; 및 S. Cho 등, J Drug Target 24(4) (2016) 328-39). 그런 다음, 폴리펩티드의 발현을 위해 플라스미드를 BL21(DE3) 경쟁 E. coli 세포로 옮겼다. 폴리펩티드를 정제하였다(S. Dong 등, Acta Pharmacol Sin 38(6) (2017) 914-23; 및 S. Dong 등, Mol Pharm 14(10) (2017) 3312-21). 폴리펩티드에서의 엔도톡신 수준은 생체 내 연구를 위해 0.25 EU/mg 미만이었다(P. Wang 등, Biomaterials 182(2018) 92-103).
폴리펩티드의 Tt 특성 분석. 상이한 농도에서 각 폴리펩티드 용액의 350 nm에서의 광학 밀도(OD350)를 UV-가시광 분광광도계(Varian Instruments)를 사용하여 4-50℃ 온도 범위에 걸쳐 모니터링하였다. ODOD350과 온도 사이의 곡선에 맞추기 위해 S자형 투여량-반응 비선형 회귀(GraphPad, 버전 6.01)를 사용하였다. 곡선의 최대 1차 도함수를 Tt로서 결정하였다.
iTEP-IBD 폴리펩티드에 의해 포획된 IgG 백분율 결정. 순도가 97%를 초과하는 인간 IgG를 Innovative Research로부터 구입하였다. 인간 IgG는 다클론성이었고 하위 계열 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 함유하였다. 인간 IgG를 분획에 의해 인간 혈장 또는 혈청으로부터 정제하였다. 인간 IgG를 NHS-플루오레세인(Thermo Fisher Scientific)으로 표지하였다. 표지된 IgG 및 유리 플루오레세인을 Sephadex G-25 수지(GE Healthcare)를 사용해 PD-10 탈염 컬럼에 의해 2회 분리하였다. 표지된 IgG를 Vivaspin 스핀 컬럼(분자량 컷오프: 10,000 kDa, GE Healthcare)으로 한외여과 원심분리를 통해 농축시켰다. PBS에서 형광 강도와 플루오레세인-표지된 IgG 용액의 농도 간의 선형 상관 관계를 묘사하는 표준 곡선을 성립시켰다(도 8a). 표준 곡선에서 최저 IgG 농도의 형광 신호는 배경 신호보다 20배 더 높았다. iTEP, iTEP-IBD 폴리펩티드, 및 iTEP-C-IBD 폴리펩티드를 표지된 IgG(1 mg/mL)와 함께 지정된 비율로 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음으로, 혼합물을 37℃에서 10분 동안 인큐베이션한 다음 20,000 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 펠릿을 수집하고 PBS 용액에 용해시켰다. Infinite M1000 프로 마이크로플레이트 판독기(Tecan)를 사용하여 형광 강도(여기 494 nm, 방출 518 nm)를 조사하기 위해 용액을 96-웰 플레이트로 옮겼다. 형광 강도를 표준 곡선에 기초하여 IgG 농도로 변환하였다.
항체 결합 기능 검정. EL4 세포는 세포 표면에서 PD-1을 발현하고 αPD-1 항체에 의해 염색될 수 있다. iTEP112-IBD 폴리펩티드를 밤새 4℃에서 2000:1의 비율로 PE 항-마우스 αPD-1 항체(BioLegend, 클론: RMP1-14)와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음, iTEP112-IBD/αPD-1 혼합물 및 유리 αPD-1 항체를 사용하여 EL4 세포를 염색하였다. 이전에는 이소형 대조군 항체가 무염색 대조군과 유사하게, EL4 세포를 염색하지 않은 것으로 나타났다(P. Zhao 등, Nat Biomed Eng 3(4) (2019) 292-305). 따라서, 이소형 대조군 항체는 본 실험에 포함되지 않았다. 그런 다음, 세포를 계수하고 유세포 계측법으로 분석하였다. 염색된 EL4 세포의 백분율은 iTEP112-IBD/αPD-1 혼합물 및 유리 αPD-1 항체의 표적 결합 능력을 나타냈다.
시험관 내IgG 방출 검사. 8:1의 비율 및 100 μL의 총 부피의 iTEP112-IBD 폴리펩티드 및 플루오레세인-표지된 IgG(1 mg/mL)를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그런 다음, iTEP112-IBD/IgG 혼합물을 37℃에서 인큐베이션하고 원심분리하여 펠릿을 수집하였다. 다음으로, 펠릿을 100 μL PBS 또는 100% 마우스 혈청에 첨가하였다. 마우스 혈청을 열 불활성화 없이 마우스 혈액으로부터 준비하여, 온전한 보체 시스템 및 다른 혈청 성분을 유지하였다. IgG-항원 면역 복합체는 보체 시스템의 고전적인 경로를 자극할 수도 있다(M. Noris, G. Remuzzi, Semin Nephrol 33(6) (2013) 479-92). 그러나, 본 실험에 사용된 인간 IgG는 항원 결합 능력이 없었고 IgG-항원 복합체를 형성할 수 없었기 때문에, 마우스 혈청에서의 보체 시스템은 활성화되지 않거나 IgG 방출에 영향을 미치지 않을 것이다. 각각의 시점에서, PBS 또는 마우스 혈청을 취해 형광 강도를 측정하여 방출된 IgG를 정량화하였다. 한편, 펠릿에 100 μL의 새로운 PBS 또는 마우스 혈청을 첨가하였다. 마우스 혈청의 형광 배경을 차감한 후, 형광 강도를 사용하여 본원에 설명된 바와 같은 표준 곡선을 사용하여 마우스 혈청에서 방출된 IgG를 정량화하였다.
생체 내IgG 방출 검사. 인간 IgG를 설포-시아닌7 NHS 에스테르(Lumiprobe)로 표지하였다. PD-10 탈염 컬럼에 의해 유리 염료를 제거하고, 표지된 IgG를 본원에 설명된 바와 같이 Vivaspin 스핀 컬럼으로 농축시켰다. iTEP-IBD 폴리펩티드 또는 iTEP-C-IBD 폴리펩티드를 설포-시아닌7-표지된 IgG와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그런 다음, iTEP-C-IBD/IgG 혼합물을 0.3% H2O2로 밤새 산화시켰다. BALB/c 마우스를 면도하고, 옆구리에 100 μL 유리 IgG(1 mg/mL), iTEP-IBD/IgG 혼합물(동등량의 IgG), 또는 iTEP-C-IBD/IgG 혼합물(동등량의 IgG)을 피하 주사하였다. 본 연구에 사용된 IgG를, 조직 배경을 감소시키기 위해, 최소의 자가형광을 갖는 근적외선 염료인 설포-시아닌7로 표지하였다(E.A. Owens 등, Acc Chem Res 49(9) (2016) 1731-40; 및 P.S. Chan 등, AAPS J 21(4) (2019) 59). 주사 직후부터 시작하여 24시간마다 IVIS Spectrum(Caliper Life Sciences)에 의해 마우스를 이미지화하였다(여기 745 nm, 방출 800 nm, 노출 1초). 주사 부위의 복사 효율을 IVIS 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였다. 형광의 스케일을 조정하여 주사 부위의 복사 효율을 정량화하기 전에 조직 자가형광의 영향을 생략하였다. 시간 경과에 따른 복사 효율을 사용하여 생체 내 IgG 방출 동역학을 설명하였다.
주사된 IgG의 혈장 농도 검출. 설포-시아닌7-표지된 IgG의 형광 강도와 농도 사이의 표준 곡선을 만들었다 (도 8b). 표준 곡선에서 최저 IgG 농도의 형광 신호는 배경 신호보다 6배 더 높았다. C57BL/6 마우스에게 100 μL 설포-시아닌7-표지된 IgG(1 mg/mL) 또는 iTEP112-IBD/IgG 혼합물(동등량의 IgG)을 옆구리에 피하 주사하였다. 각 시점에서, 각각의 마우스로부터 3 방울의 혈액을 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 코팅된 튜브에 수집하였다. 그런 다음, 튜브를 20,000 g에서 10분 동안 원심분리하여 혈장을 수집하였다. Infinite M1000 pro 마이크로플레이트 판독기(Tecan)를 사용하여 형광 강도(여기 750 nm, 방출 773 nm)를 검사하기 위해 혈장을 PBS에 희석하였다. 표준 곡선을 통해 형광 강도를 IgG 농도로 변환하기 전에 혈장의 형광 배경을 차감하였다.
종양 내 IgG 보유량 및 다른 기관 내 축적 판정. C57BL/6 마우스에게 50 μL PBS 중 5×105 B16-F10 세포를 옆구리에 피내 주사하였다. 종양 직경이 약 0.5 cm인 경우, 50 μL 설포-시아닌7-표지된 IgG(2 mg/mL), 또는 iTEP112-C-IBD/IgG 혼합물(동등량의 IgG)을 종양 내로 직접 주사하였다. 주사 후 24시간 및 72시간 시점에, 마우스를 안락사시켰다. 종양 및 비장, 간, 신장 및 폐를 포함하는 다른 기관을 수집하였다. 종양을 (여기 745 nm, 방출 800 nm, 노출 1초) IVIS Spectrum에 의해 이미지화하였다. 수집된 종양 및 기관을 칭량하고 PBS 중에 균질화시켰다. 균질물을 원심분리하여 상청액을 수집하고 형광 강도를 측정하였다. 기관의 형광 배경을 형광 강도로부터 차감하고, 상청액 내 IgG의 양을 본원에 설명된 바와 같은 표준 곡선을 참조하여 정량화하였다. 안락사 직전에 마우스로부터 혈액을 채취하였다. 혈액을 30분 동안 실온에서 유지시킨 다음 원심분리하여 혈청을 수득하였다. 혈청을 PBS에 희석하여 형광 강도를 검사하였다. 형광 강도에서 혈청의 형광 배경을 차감한 다음, 본원에 설명된 표준 곡선을 참조하여 주사된 IgG의 혈청 농도를 정량화하였다.
통계. 각 실험의 상세한 통계가 각각의 도면 범례에 기술되어 있다. 데이터를 분석하기 위해 쌍을 이루지 않은 양측 스튜던트 t-검정 및 단방향 ANOVA 검정을 사용하였다. P < 0.05가 유의한 차이로 정의되었다.
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SEQUENCE LISTING <110> University of Utah Research Foundation <120> Immune Tolerant Elastin-Like Recombinant Peptides and Methods of Use <130> 21101.0372P1 <150> US 62/890,936 <151> 2019-08-29 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 Gly Ala Gly Val Pro Gly 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 3 Val Pro Gly Phe Gly Ala Gly Ala Gly 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 4 Val Pro Gly Leu Gly Ala Gly Ala Gly 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 5 Val Pro Gly Leu Gly Val Gly Ala Gly 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 6 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly 1 5 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Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu 180 185 190 Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly 195 200 205 Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly 210 215 220 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val 225 230 235 240 Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro 245 250 255 Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val 260 265 270 Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly 275 280 285 Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu 290 295 300 Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly 305 310 315 320 Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly 325 330 335 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val 340 345 350 Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro 355 360 365 Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val 370 375 380 Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly 385 390 395 400 Gly Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu 405 410 415 Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys 420 425 430 Ala Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr 435 440 445 Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu 450 455 460 <210> 38 <211> 845 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 38 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val 1 5 10 15 Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro 20 25 30 Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val 35 40 45 Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly 50 55 60 Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu 65 70 75 80 Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly 85 90 95 Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly 100 105 110 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val 115 120 125 Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro 130 135 140 Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val 145 150 155 160 Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly 165 170 175 Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu 180 185 190 Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly 195 200 205 Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly 210 215 220 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val 225 230 235 240 Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro 245 250 255 Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val 260 265 270 Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly 275 280 285 Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu 290 295 300 Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly 305 310 315 320 Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly 325 330 335 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val 340 345 350 Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro 355 360 365 Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val 370 375 380 Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly 385 390 395 400 Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu 405 410 415 Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly 420 425 430 Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly 435 440 445 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val 450 455 460 Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro 465 470 475 480 Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val 485 490 495 Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly 500 505 510 Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu 515 520 525 Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly 530 535 540 Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly 545 550 555 560 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val 565 570 575 Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro 580 585 590 Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val 595 600 605 Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly 610 615 620 Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu 625 630 635 640 Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly 645 650 655 Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly 660 665 670 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val 675 680 685 Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro 690 695 700 Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val 705 710 715 720 Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly 725 730 735 Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu 740 745 750 Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly 755 760 765 Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly 770 775 780 Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr 785 790 795 800 Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu 805 810 815 Lys Ala Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp 820 825 830 Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu 835 840 845 <210> 39 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 39 Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Cys Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Cys 20 <210> 40 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 40 Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Cys Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Cys 20 <210> 41 <211> 277 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 41 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val 1 5 10 15 Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro 20 25 30 Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val 35 40 45 Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly 50 55 60 Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu 65 70 75 80 Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly 85 90 95 Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly 100 105 110 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val 115 120 125 Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro 130 135 140 Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val 145 150 155 160 Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly 165 170 175 Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu 180 185 190 Pro Gly Val Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly 195 200 205 Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Tyr 210 215 220 Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys 225 230 235 240 Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gln Tyr Ala Asn 245 250 255 Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr 260 265 270 Phe Thr Val Thr Glu 275 <210> 42 <211> 473 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 42 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val 1 5 10 15 Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro 20 25 30 Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val 35 40 45 Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly 50 55 60 Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu 65 70 75 80 Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly 85 90 95 Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly 100 105 110 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val 115 120 125 Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro 130 135 140 Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val 145 150 155 160 Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly 165 170 175 Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu 180 185 190 Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly 195 200 205 Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly 210 215 220 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val 225 230 235 240 Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro 245 250 255 Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val 260 265 270 Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly 275 280 285 Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu 290 295 300 Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly 305 310 315 320 Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly 325 330 335 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val 340 345 350 Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro 355 360 365 Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val 370 375 380 Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly 385 390 395 400 Gly Cys Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly 405 410 415 Ser Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu 420 425 430 Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys 435 440 445 Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp 450 455 460 Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu 465 470 <210> 43 <211> 865 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 43 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val 1 5 10 15 Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro 20 25 30 Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val 35 40 45 Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly 50 55 60 Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu 65 70 75 80 Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly 85 90 95 Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly 100 105 110 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val 115 120 125 Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro 130 135 140 Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val 145 150 155 160 Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly 165 170 175 Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu 180 185 190 Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly 195 200 205 Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly 210 215 220 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val 225 230 235 240 Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro 245 250 255 Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val 260 265 270 Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly 275 280 285 Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu 290 295 300 Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly 305 310 315 320 Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly 325 330 335 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val 340 345 350 Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro 355 360 365 Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val 370 375 380 Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly 385 390 395 400 Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu 405 410 415 Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly 420 425 430 Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly 435 440 445 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val 450 455 460 Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro 465 470 475 480 Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val 485 490 495 Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly 500 505 510 Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu 515 520 525 Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly 530 535 540 Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly 545 550 555 560 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val 565 570 575 Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro 580 585 590 Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val 595 600 605 Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly 610 615 620 Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu 625 630 635 640 Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly 645 650 655 Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly 660 665 670 Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val 675 680 685 Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro 690 695 700 Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val 705 710 715 720 Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly 725 730 735 Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu 740 745 750 Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly 755 760 765 Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly Gly Val Leu Pro Gly Val Gly 770 775 780 Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Cys Gly 785 790 795 800 Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile 805 810 815 Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala 820 825 830 Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val 835 840 845 Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr 850 855 860 Glu 865

Claims (79)

  1. 상동성 아미노산 반복 서열을 포함하고, 상기 상동성 아미노산 반복 서열과 적어도 75%의 아미노산 서열 동일성을 가지고, 여기서 상기 상동성 아미노산 반복 서열은:
    Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly (서열번호 1);
    Gly-Ala-Gly-Val-Pro-Gly (서열번호 2);
    Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly (서열번호 3);
    Val-Pro-Gly-Leu-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly (서열번호 4);
    Val-Pro-Gly-Leu-Gly-Val-Gly-Ala-Gly (서열번호 5);
    Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly-Gly (서열번호 6);
    Gly-Val-Leu-Pro-Gly (서열번호 7);
    Gly-Leu-Val-Pro-Gly-Gly (서열번호 8);
    Gly-Leu-Val-Pro-Gly (서열번호 9);
    Gly-Val-Pro-Leu-Gly (서열번호 10);
    Gly-Ile-Pro-Gly-Val-Gly (서열번호 11);
    Gly-Gly-Val-Leu-Pro-Gly (서열번호 12);
    Gly-Val-Gly-Val-Leu-Pro-Gly (서열번호 14); 또는
    Gly-Val-Pro-Gly (서열번호 15); 및
    IgG 결합 도메인인, 재조합 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 상동성 아미노산 반복 서열은 Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly (서열번호 1) 또는 Gly-Ala-Gly-Val-Pro-Gly (서열번호 2)인, 재조합 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 상동성 아미노산 반복 서열은 반복되는, 재조합 폴리펩티드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 상동성 아미노산 반복 서열은 20 내지 30회, 30 내지 40회, 40 내지 50회, 50 내지 60회, 60 내지 70회, 70 내지 80회, 80 내지 90회, 90 내지 100회, 100 내지 110회, 또는 110 내지 120회 반복되는, 재조합 폴리펩티드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 상동성 아미노산 반복 서열은 (Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly)28 (서열번호 13); (Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly)56 (서열번호 16); 또는 (Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly)112 (서열번호 17)인, 재조합 폴리펩티드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 IgG 결합 도메인은 단백질 G로부터 유래되는, 재조합 폴리펩티드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 IgG 결합 도메인은 서열을 포함하거나 아미노산 서열 TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 18)와 적어도 75% 동일한, 재조합 폴리펩티드.
  8. 제1항에 있어서, 하나 이상의 링커 서열을 더 포함하는, 재조합 폴리펩티드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 링커 서열은 GGGGS(서열번호 34) 또는 GGGGC(서열번호 35)인, 재조합 폴리펩티드.
  10. 제8항에 있어서, 상기 링커 서열은 상기 상동성 아미노산 반복 서열과 상기 IgG 결합 도메인 사이에 있는, 재조합 폴리펩티드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드는 아미노산 서열 (GVLPGVG)28-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 36);
    (GVLPGVG)56-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 37); 또는
    (GVLPGVG)112-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 38)를 포함하는, 재조합 폴리펩티드.
  12. 제9항에 있어서, 제2 링커 서열을 더 포함하고, 상기 제2 링커 서열은 (GGGGC)4 (서열번호 40)인, 재조합 폴리펩티드.
  13. 제12항에 있어서, (GGGGC)4 (서열번호 40)는 상기 상동성 아미노산 반복 서열과 상기 제1 링커 서열 사이에 있는, 재조합 폴리펩티드.
  14. 제12항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드는 아미노산 서열 (GVLPGVG)28-(GGGGC)4-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 41);
    (GVLPGVG)56-(GGGGC)4-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 42); 또는
    (GVLPGVG)112-(GGGGC)4-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 43)를 포함하는, 재조합 폴리펩티드.
  15. 제1항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드는 N-말단, C-말단, 또는 상기 N-말단 및 C-말단 모두에 위치한 하나 이상의 아미노산 잔기를 더 포함하고, 상기 하나 이상의 아미노산 잔기는 글리신, 알라닌 또는 세린 또는 이들의 조합인, 재조합 폴리펩티드.
  16. 제1항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드는 20 내지 100 kDa의 확인된 분자량을 포함하는, 재조합 폴리펩티드.
  17. 제1항에 있어서, 상기 상동성 아미노산 반복 서열은 다음 아미노산 서열을 포함하지 않는, 재조합 폴리펩티드: Gly-Gly-Val-Pro-Gly (서열번호 28).
  18. 제1항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드는 이중 블록 중합체를 포함하고, 상기 이중 블록 중합체는 Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly (서열번호 1) 및 Gly-Ala-Gly-Val-Pro-Gly (서열번호 2)를 포함하는, 재조합 폴리펩티드.
  19. 제1항에 있어서, 하나 이상의 치료제를 더 포함하는, 재조합 폴리펩티드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 하나 이상의 치료제는 상기 IgG 결합 도메인에 비공유 결합되는, 재조합 폴리펩티드.
  21. 제19항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드 및 상기 치료제는 0.5:1, 1:1, 2:1, 4:1, 8:1, 16:1, 24:1 또는 32:1 (재조합 폴리펩티드:치료제)의 비율로 존재하는, 재조합 폴리펩티드.
  22. 제19항에 있어서, 상기 치료제는 항암제; 펩티드; 또는 항체 또는 이의 단편인, 재조합 폴리펩티드.
  23. 제22항에 있어서, 상기 항암제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 또는 항-CTLA-4 항체인, 재조합 폴리펩티드.
  24. 제23항에 있어서, 상기 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 또는 세미플리맙인, 재조합 폴리펩티드.
  25. 제23항에 있어서, 상기 항-PD-L1 항체는 아벨루맙, 더발루맙 또는 아테졸리주맙인, 재조합 폴리펩티드.
  26. 제23항에 있어서, 상기 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙인, 재조합 폴리펩티드.
  27. 제1항 또는 제19항의 재조합 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 비경구 투여, 피하 투여 또는 직접 주사용으로 제형화되는 약제학적 조성물.
  29. 암을 가진 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 대상체는 인간 환자인, 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 대상체는 상기 투여 단계 전에 치료를 필요로 하는 것으로 이전에 확인되었거나 확인되는, 방법.
  32. 제29항에 있어서, 상기 암은 원발성 또는 이차 종양인, 방법.
  33. 제29항에 있어서, 상기 원발성 또는 이차 종양은 유방암, 난소암, 폐암, 대장암, 위암, 두경부암, 교모세포종, 신장암, 자궁경부암, 복막암, 신장암, 췌장암, 뇌암, 비장암, 전립선암, 요로상피 암종, 골수종, 림프종, 또는 백혈병인, 방법.
  34. 제29항에 있어서, 암은 전이성인, 방법.
  35. 제19항에 있어서, 상기 치료제가 단독으로 투여되거나 상기 재조합 폴리펩티드에 결합되지 않을 때와 비교하여, 상기 치료제는 상기 재조합 폴리펩티드에 결합되어 투여될 때, 증가된 효능 또는 감소된 부작용을 갖는, 방법.
  36. 제19항에 있어서, 상기 치료제가 단독으로 투여되거나 상기 재조합 폴리펩티드에 결합되지 않을 때와 비교하여, 상기 치료제는 상기 재조합 폴리펩티드에 비공유 결합으로 투여될 때 증가된 반감기를 갖는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 제항의 약제학적 조성물의 투여는 제2의 상이한 약제학적 조성물과 조합되는, 방법.
  38. 종양 크기를 감소시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 이를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 제항의 재조합 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, IgG 결합 도메인은 치료제에 비공유 결합되고, 이에 의해 종양 크기를 감소시키는, 방법.
  39. 제36항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드는 천연 고분자, 보강제, 부형제, 보존제, 흡수를 지연시키기 위한 제제, 필러, 결합제, 흡수제, 완충제, 또는 이들의 조합을 더 포함하는, 방법.
  40. 제38항에 있어서, 종양은 악성 종양인, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 악성 종양은 유방암, 난소암, 폐암, 대장암, 위암, 두경부암, 교모세포종, 신장암, 자궁경부암, 복막암, 신장암, 췌장암, 뇌암, 비장암, 전립선암, 요로상피 암종, 피부암, 골수종, 림프종, 또는 백혈병인, 방법.
  42. 제38항에 있어서, 상기 상동성 아미노산 반복 서열은 (Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly)28 (서열번호 13); (Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly)56 (서열번호 16); 또는 (Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly)112 (서열번호 17)인, 방법.
  43. 제38항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드는 이중 블록 중합체를 포함하고, 상기 이중 블록 중합체는 Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly (서열번호 1) 및 Gly-Ala-Gly-Val-Pro-Gly (서열번호 2)를 포함하는, 방법.
  44. 제38항에 있어서, 상기 IgG 결합 도메인은 서열을 포함하거나 TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 18)와 적어도 75% 동일한 아미노산 서열인, 방법.
  45. 제38항에 있어서, 재조합 폴리펩티드는 제1 링커 서열을 더 포함하고, 상기 제1 링커 서열은 GGGGS(서열번호 34)인, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 제1 링커 서열은 상기 상동성 아미노산 반복과 상기 IgG 결합 도메인 사이에 있는, 방법.
  47. 제38항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드는 아미노산 서열 (GVLPGVG)28-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 36);
    (GVLPGVG)56-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 37); 또는
    (GVLPGVG)112-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 38)를 포함하는, 방법.
  48. 제38항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드는 제2 링커 서열을 더 포함하고, 상기 제2 링커 서열은 (GGGGC)4 (서열번호 40)이고, 상기 제2 링커 서열은 상기 상동성 아미노산 반복과 상기 제1 링커 서열 사이에 있는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드는 아미노산 서열 (GVLPGVG)28-(GGGGC)4-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 41);
    (GVLPGVG)56-(GGGGC)4-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 42); 또는
    (GVLPGVG)112-(GGGGC)4-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 43)를 포함하는, 방법.
  50. 제38항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드 및 상기 치료제는 0.5:1, 1:1, 2:1, 4:1, 8:1, 16:1, 24:1 또는 32:1 (재조합 폴리펩티드:치료제)의 비율로 존재하는, 방법.
  51. 제38항에 있어서, 상기 치료제는 항암제; 펩티드; 또는 항체 또는 이의 단편인, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 항암제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 또는 항-CTLA-4 항체인, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 또는 세미플리맙인, 방법.
  54. 제51항에 있어서, 상기 항-PD-L1 항체는 아벨루맙, 더발루맙 또는 아테졸리주맙인, 방법.
  55. 제52항에 있어서, 상기 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙인, 방법.
  56. 재조합 폴리펩티드에 접합된 치료제를 대상체에게 투여하는 방법으로서, 상기 재조합 폴리펩티드는 IgG 결합 도메인에 공유 결합된 상동성 아미노산 반복 서열을 포함하고, 상기 치료제는 상기 IgG 결합 도메인에 비공유적으로 접합되고, 상기 접합체는 직접 주사에 의해 투여되는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 비접합 형태로 동일한 방식으로 대상체에게 투여된 동일한 양의 치료제와 비교하여 치료제가 접합체로서 접합된 형태로 대상체에게 투여되는 경우 대상체에서 (i) 치료제의 생체이용률이 더 크고; (ii) 치료제의 반감기가 더 크고, (iii) 치료제의 전신 독성이 더 적은 경우 중 적어도 하나인, 방법.
  58. 대상체에서 치료제의 효능을 증가시키거나 치료제의 반을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 폴리펩티드에 접합된 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 재조합 폴리펩티드는 IgG 결합 도메인에 공유 결합된 상동성 아미노산 반복 서열을 포함하고, 상기 치료제는 상기 IgG 결합 도메인에 비공유 접합되고, 상기 접합체는 직접 주사에 의해 투여되고, 이에 의해 상기 치료제의 효능 또는 반감기가 증가되는, 방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 치료제는 항암제인, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 항암제는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 또는 항-CTLA-4 항체인, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 또는 세미플리맙인, 방법.
  62. 제60항에 있어서, 상기 항-PD-L1 항체는 아벨루맙, 더발루맙 또는 아테졸리주맙인, 방법.
  63. 제60항에 있어서, 상기 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙인, 방법.
  64. 제56항 또는 제58항에 있어서, 상기 접합체는 치료 유효량으로 대상체에게 투여되는, 방법.
  65. 제56항 또는 제58항에 있어서, 상기 접합체는 비경구 주사에 의해 대상체에게 투여되는, 방법.
  66. 제56항 또는 제58항에 있어서, 상기 접합체는 대상체에게 피하 투여되는, 방법.
  67. 제56항 또는 제58항에 있어서, 상기 대상체는 암을 갖는, 방법.
  68. 제56항 또는 제58항에 있어서, 상기 암은 고형 암인, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 고형 암은 폐암, 결장암, 유방암, 뇌암, 간암, 전립선암, 비장암, 근암, 난소암, 췌장암, 피부암, 및 흑색종인, 방법.
  70. 제56항 또는 제58항에 있어서, 상기 치료제의 생체 내 효능은 비접합 형태로 대상체에게 투여되는 치료제의 동일한 양과 비교하여 대상체에서 향상되는, 방법.
  71. 제56항 또는 제58항에 있어서, 상기 상동성 아미노산 반복 서열로서, 상기 상동성 아미노산 반복과 적어도 75%의 아미노산 서열 동일성을 가지고, 상기 상동성 아미노산 반복은:
    Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly (서열번호 1);
    Gly-Ala-Gly-Val-Pro-Gly (서열번호 2);
    Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly (서열번호 3);
    Val-Pro-Gly-Leu-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly (서열번호 4);
    Val-Pro-Gly-Leu-Gly-Val-Gly-Ala-Gly (서열번호 5);
    Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly-Gly (서열번호 6);
    Gly-Val-Leu-Pro-Gly (서열번호 7);
    Gly-Leu-Val-Pro-Gly-Gly (서열번호 8);
    Gly-Leu-Val-Pro-Gly (서열번호 9);
    Gly-Val-Pro-Leu-Gly (서열번호 10);
    Gly-Ile-Pro-Gly-Val-Gly (서열번호 11);
    Gly-Gly-Val-Leu-Pro-Gly (서열번호 12);
    Gly-Val-Gly-Val-Leu-Pro-Gly (서열번호 14); 또는 Gly-Val-Pro-Gly (서열번호 15)인, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 상동성 아미노산 반복 서열은 Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly (서열번호 1)인, 방법.
  73. 제56항 또는 제58항에 있어서, 상기 상동성 아미노산 반복 서열은 (Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly)28 (서열번호 13); (Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly)56 (서열번호 16); 또는 (Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly)112 (서열번호 17)인, 방법.
  74. 제56항 또는 제58항에 있어서, 상기 IgG 결합 도메인은 서열을 포함하거나 TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 18)와 적어도 75% 동일한 아미노산 서열인, 방법.
  75. 제56항 또는 제58항에 있어서, 재조합 폴리펩티드는 제1 링커 서열을 더 포함하고, 상기 제1 링커 서열은 GGGGS(서열번호 34)이고, 상기 상동성 아미노산 반복과 상기 IgG 결합 도메인 사이에 있는, 방법.
  76. 제56항 또는 제58항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드는 아미노산 서열 (GVLPGVG)28-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 36);
    (GVLPGVG)56-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 37); 또는
    (GVLPGVG)112-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 38)를 포함하는, 방법.
  77. 제75항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드는 제2 링커 서열을 더 포함하고, 상기 제2 링커 서열은 (GGGGC)4 (서열번호 40)이고, 상기 제2 링커 서열은 상기 상동성 아미노산 반복과 상기 제1 링커 서열 사이에 있는, 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드는 아미노산 서열 (GVLPGVG)28-(GGGGC)4-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 41);
    (GVLPGVG)56-(GGGGC)4-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 42); 또는
    (GVLPGVG)112-(GGGGC)4-GGGGS-TTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE (서열번호 43)를 포함하는, 방법.
  79. 제56항 또는 제58항에 있어서, 상기 재조합 폴리펩티드 및 상기 치료제는 .5:1, 1:1, 2:1, 4:1, 8:1, 16:1, 24:1 또는 32:1 (재조합 폴리펩티드:치료제)의 비율로 존재하는, 방법.
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