CN113795513A - 抗外周淋巴结地址素抗体及其用途 - Google Patents

抗外周淋巴结地址素抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本公开提供，尤其是，抗外周淋巴结地址素抗体及其抗原结合片段。本公开还提供包括含药物的聚合物颗粒的组合物，所述含药物的聚合物颗粒模拟体内淋巴细胞迁移、并且可特异性地递送免疫抑制或免疫调节药物至发生T细胞激活和T细胞介导的损伤的淋巴组织和慢性炎症部位；此类组合物包括本公开中描述的抗体或其抗原结合片段。本公开还包括抗体‑药物缀合物和包含抗体‑药物缀合物的组合物。还提供了制备和使用这些抗体、其抗原结合片段、及其组合物的方法。

Description

抗外周淋巴结地址素抗体及其用途
优先权声明
本申请要求2019年2月13日提交的美国临时专利申请系列号62/804,797的权益。前述的全部内容通过引用结合在此。
技术领域
本发明涉及抗外周淋巴结地址素(PNAd)抗体、其抗原结合片段、及其缀合物、和其用途。
背景技术
外周淋巴结地址素(PNAd)是在小鼠和人二者中高内皮细胞微静脉(HEV)上组成型表达的组织特异性内皮细胞抗原。PNAd是一组内皮唾液黏蛋白—CD34、足糖萼蛋白(podocalixin)、依赖于糖基化的细胞黏着分子1(GlyCAM-1)、和200kDa的唾液酸化糖蛋白(sgp200)—其全部包括硫酸化唾液酸化-路易斯X(sLeX)–样基序(von Andrian,U.H.&Mackay,C.R.,N Engl J Med 343:1020-1034,2000)。PNAd在外周淋巴结、扁桃体、几乎所有的炎症或淋巴瘤损伤部位的微静脉内皮上表达，但不在眼附属器、甲状腺、唾液腺和肺的正常组织中表达(Liu Y,J Clin Exp Hematopathol 44(1):33-37,2004)。PNAd在淋巴细胞归巢至发炎的损伤和在这些器官的MALT淋巴瘤组织中的淋巴瘤细胞的生物学行为中发挥重要作用。
炎症在从例如类风湿性关节炎等典型免疫介导的疾病至癌症的大量流行病中是关键致病过程。从其中白细胞侵入移植的器官的移植排斥、至其中淋巴细胞侵入脑的多发性硬化症、至其中白细胞加重脂质诱导的小血管和大血管损伤的动脉粥样硬化斑块，免疫或炎症应答对于这些疾病的发展是重要的。过去十年见证了新型免疫抑制药物的开发中的重大进展。这些药物在确保成功的器官移植方面起到重要作用，并且大大改善了患有危及生命的免疫介导的疾病的患者的预后。然而，免疫抑制剂的使用受到缺乏选择性和经常观察到的大量药物不良反应的阻碍。
发明内容
本公开提供了抗外周淋巴结地址素(PNAd)抗体、或其PNAd结合片段、及其使用方法。
在一方面，本公开的特征在于抗外周淋巴结地址素(PNAd)抗体、或其PNAd结合片段，其包含：(a)重链可变区(VH)，其中VH包含以下：包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH互补决定区1(CDR1)、包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH CDR2、和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变区(VL)，其中VL包含以下：包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR2、和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR3。
在一些实施方案中，VH包含以下：包含SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列的VH框架区1(FR1)、包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列的VH FR2、包含SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列的VH FR3、和包含SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列的VH FR4。
在一些实施方案中，VL包含以下：包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列的VLFR1、包含SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列的VL FR2、包含SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列的VL FR3、和包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的VL FR4。
在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列和VL包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是鼠抗体。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。
在一些实施方案中，抗体、或其PNAd结合片段包含人源重链和轻链恒定区。在一些实施方案中，抗体、或其PNAd结合片段包含同种型免疫球蛋白mu(IgM)的重链恒定区。
在一些实施方案中，PNAd结合片段选自由单链Fv片段(scFv)、F(ab')片段、F(ab)片段、和F(ab')2片段组成的组。
在一些实施方案中，抗体、或其PNAd结合片段缀合至试剂。在一些实施方案中，所述试剂是显像剂、细胞毒素剂、或药物。在一些实施方案中，所述试剂是含药物的聚合物颗粒。在一些实施方案中，所述含药物的聚合物颗粒包含免疫抑制或免疫调节药物。在一些实施方案中，与试剂的缀合是共价缀合。在一些实施方案中，与试剂的缀合是通过连接子的缀合。在一些实施方案中，所述连接子是聚乙二醇。
本文还提供了包括编码前述抗体或其PNAd结合片段的核酸序列的多核苷酸。
本文进一步提供了包括编码重链可变区(VH)的核酸序列的多核苷酸，其中VH包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸包括SEQ ID NO:1中所示的核酸序列。在一些实例中，多核苷酸可操作地连接至启动子。
此外，本文提供了包括编码重链的核酸序列的多核苷酸，其中重链包含重链可变区(VH)，其中VH包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:1中所示的核酸序列。在一些情况中，多核苷酸可操作地连接至启动子。
本文还提供了包含编码轻链可变区(VL)的核酸序列的多核苷酸，其中VL包含SEQID NO:7中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:6中所示的核酸序列。在一些情况中，多核苷酸可操作地连接至启动子。
本文还提供了包括编码轻链的核酸序列的多核苷酸，其中轻链包含轻链可变区(VL)，其中VL包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸包括SEQID NO:6中所示的核酸序列。在一些情况中，多核苷酸可操作地连接至启动子。
本文还提供了包含可操作地连接至包含编码以下的核酸序列的前述多核苷酸的启动子的载体：(i)可操作地连接至启动子的包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的VH；或(ii)包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的VL。
本文还提供了包含可操作地连接至包含编码重链的核酸序列的前述多核苷酸的启动子的载体，所述重链包括包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的VH。
本文还提供了包括可操作地连接至包含编码轻链的核酸序列的前述多核苷酸的启动子的载体，所述轻链包括包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的VL。
本文还提供了包含以下的载体：(i)可操作地连接至包含编码重链的核酸序列的前述多核苷酸的第一启动子，所述重链包括包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的VH；和(ii)可操作地连接至包含编码轻链的核酸序列的前述多核苷酸的第二启动子，所述轻链包括包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的VL。
本文还提供了包含可操作地连接至启动子(一种或多种)的一种或多种前述多核苷酸的宿主细胞。
本文还提供了包含一种或多种前述载体的宿主细胞。
本文还提供了生产抗外周淋巴结地址素(PNAd)抗体或其PNAd结合片段的方法，其包括：(a)培养前述宿主细胞；和(b)从培养物分离抗体。
本文还提供了包含治疗有效量的前述抗体或其PNAd结合片段和药学上可接受的载体的药物组合物。
本文还提供了抑制有需要的受试者中淋巴细胞介导的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的前述药物组合物。
本文还提供了治疗有需要的受试者中自身免疫性糖尿病或延迟有需要的受试者中自身免疫性糖尿病的进展的方法，向所述受试者施用治疗有效量的前述药物组合物。
本文还提供了治疗有需要的受试者中淋巴细胞介导的炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的前述药物组合物。
本文还提供了治疗有需要的受试者中表达外周淋巴结地址素(PNAd)的恶性肿瘤或降低有需要的受试者中表达外周淋巴结地址素(PNAd)的恶性肿瘤的转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的前述药物组合物。在一些实施方案中，表达PNAd的恶性肿瘤是淋巴瘤。在一些实施方案中，表达PNAd的恶性肿瘤是癌症。在一些情况中，所述癌症是乳腺癌。
本文还提供了递送药物至有需要的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的前述药物组合物，其中递送至所述受试者的药物是缀合至药物组合物的抗体或其PNAd结合片段的含药物的聚合物颗粒的药物。在一些实施方案中，将药物递送至受试者中一个或多个淋巴组织或一个或多个慢性炎症部位。
本发明的一个或多个实施方案的细节示于附图和下文的描述中。本发明的其它特征、目的、和优点将从该描述和附图、以及从权利要求中显而易见。
附图说明
图1A-B：MHA112单克隆抗体(mAb)识别小鼠和人中高内皮细胞微静脉(HEV)。(图1A)免疫荧光染色显示MHA112 mAb的HEV染色的低放大率图像。比例尺，500μm。(图1B)免疫荧光染色显示小鼠淋巴结(LN)和人扁桃体中MHA112 mAb的HEV染色的高放大率图像。比例尺，100μm。
图2：MHA112 mAb分型。通过分型酶联免疫吸附试验(ELISA)来确定MHA112 mAb同种型。在450nm处记录吸光度。
图3A-B：MHA112 mAb缀合纳米颗粒(NP)至LN的运输。(图3A)荧光图像显示不同LN中的MHA112 mAb缀合NP(MHA112-IR800-NP)的分布。仅NP(IR800-NP)用作阴性对照和MECA79-NP(MECA79_IR800-NP)用作阳性对照。(图3B)腋窝LN中的MECA79-NP和MHA112-NP分布的免疫荧光分析。HEV染色为绿色，NP中的IR800染料为红色。比例尺，50μm。
图4：MHA112 mAb，而不是MECA79 mAb，阻断T细胞归巢至LN。对照(PBS，MECA79)和MHA112 mAb处理组中标记的T细胞归巢至LN的流式细胞术分析。来自三只小鼠/组(n＝3)的数据表明标记的T细胞百分比的变化并且总结于条形图中。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，t-检验，n.s.：不显著。
图5：MHA112序列。显示MHA112重链和轻链可变区(分别地，VH和VL)的序列，描绘了框架区(FR1-FR4)和IMGT互补决定区(CDR1-CDR3)。VH＝SEQ ID NO:2；分别地，VH FR1-FR4＝SEQ ID NO:11-14；分别地，VH CDR1-3＝SEQ ID NO:3-5；VL＝SEQ ID NO:7；分别地，VLFR1-FR4＝SEQ ID NO:15-18；分别地，VL CDR1-3＝SEQ ID NO:3-5。
图6：通过ELISA的MECA79和MHA112 mAb的结合亲和性的确定。针对CHO-PNAd细胞，测试不同浓度的MECA79和MHA112。计算Kd。发现MHA112具有比MECA79更好的结合亲和性。
图7：乳腺肿瘤生长曲线表明由游离紫杉醇和MHA112-紫杉醇(等同于移植后每两天静脉注射160ng游离紫杉醇，持续33天)(n＝12)处理的BALB/c-WT小鼠中的4T1小鼠乳腺肿瘤的生长显著慢于由PBS处理的对照组(n＝12)。数据表示为平均值+/-SD。**P<0.01，***P<0.001。x轴上的三角形表示注射点。与游离紫杉醇和未处理组相比，MHA112-紫杉醇组具有显著更小尺寸的肿瘤。
图8：乳腺肿瘤引流淋巴结(DLN)的荧光显微照片显示，与对照或游离紫杉醇组相比，HEV和LYVE1+淋巴管(绿色)在MHA112-紫杉醇组中较少扩张。泛细胞角蛋白(红色)表明4T1在TDLN中转移。比例尺：100μm。与游离紫杉醇和未处理组相比，MHA112-紫杉醇组显示显著更少的肿瘤转移以及淋巴扩张。
图9：乳腺肿瘤DLN的荧光显微照片表明，与对照或游离紫杉醇组相比，MHA112-紫杉醇组中不太严重的纤维化(如胶原I、胶原IV和层粘连蛋白所表示)。比例尺：100μm。与游离紫杉醇和未处理组相比，MHA112-紫杉醇组显示显著更少的淋巴结纤维化。
图10：存活曲线显示，与对照和游离紫杉醇组相比，接受MHA112-紫杉醇(n＝5)的4T1乳腺肿瘤肝门静脉转移模型的显著更长的存活。***P<0.001。三角形表示注射天数。
图11：胰腺中panc02胰腺肿瘤的存活曲线显示与对照和游离紫杉醇组(n＝5)相比，MHA112-紫杉醇(n＝5)显著更长的存活。
具体实施方式
I.定义
应注意，术语不定冠词“a”或“an”实体是指一种(个)或多种(个)该实体；例如，“一种(个)抗体”理解为表示一种(个)或多种(个)抗体。就其自身而言，术语不定冠词“a”(或“an”)、“一种(个)或多种(个)”、和“至少一种(个)”可在本文中交换使用。
如本文所用，术语“多肽”旨在包括单数“多肽”以及复数“多肽”，并且是指由酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何链或多条链，而不是指产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”、或用于指两个或更多个氨基酸的一条或多条链的任何其它术语包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可用于代替任何这些术语或与任何这些术语交换使用。
术语“多肽”还旨在指代多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、由已知的保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解断裂、或由非天然存在的氨基酸的修饰。多肽源自天然生物来源或通过重组技术产生，但不必须翻译自指定的核酸序列。多肽可以以任何方式产生，包括通过化学合成。
本文所描述的多肽的大小可为约3个以上、5个以上、10个以上、20个以上、25个以上、50个以上、75个以上、100个以上、200个以上、500个以上、1,000个以上、或2000个以上的氨基酸。多肽可具有限定的三维结构，尽管它们不必须具有这样的结构。具有限定的三维结构的多肽称为折叠的，不具有限定的三维结构、而是采用大量不同构象的多肽称为未折叠的。如本文所用，术语糖蛋白是指与至少一个碳水化合物部分偶联的蛋白，所述碳水化合物部分通过例如丝氨酸残基或天冬酰胺残基等氨基酸残基的含氧或含氮侧链连接至蛋白。
“分离的”多肽或其片段、变体、或衍生物是指不在其天然环境中的多肽。不需要特定水平的纯化。例如，可从多肽的原生或天然环境移出分离的多肽。在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白被认为是为了本文所描述的目的而分离的，已通过任何合适的技术分离、分级、或部分或基本上纯化的天然或重组蛋白也是如此。
作为多肽还包括前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体、及其任何组合。当指代本文所描述的抗体或抗体多肽时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括保持相应天然结合分子、抗体、或多肽的至少一些的抗原结合性质的任何多肽。除了本文其它部分讨论的特定抗体片段以外，本文所描述的多肽的片段包括蛋白水解片段、以及缺失片段。本文描述的抗体和抗体多肽的变体包括如上所描述的片段，还包括具有由于氨基酸取代(例如，保守或非保守氨基酸取代)、缺失、或插入而引起的改变的氨基酸序列的多肽。变体可为天然或非天然存在的。非天然存在的变体可为使用本领域已知诱变技术产生的。变体多肽可包含保守或非保守氨基酸取代(例如，保守或非保守氨基酸取代)、缺失或添加。PNAd特异性结合分子的衍生物，例如，本文描述的抗体和抗体多肽，是已改变以表现在天然多肽中未发现的附加特征的多肽。实例包括融合蛋白。变体多肽在本文中还可是指“多肽类似物”。如本文所用，结合分子或其片段、抗体、或抗体多肽的“衍生物”是指具有通过功能性侧基团的反应而化学衍生的一种或多种残基的对象多肽。作为“衍生物”还包括含有20种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如，4-羟脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸；和鸟氨酸可取代赖氨酸。
术语“多核苷酸”旨在包括单数核酸以及复数核酸，并且是指分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如，酰胺键，诸如在肽核酸(PNA)中发现的)。术语“核酸”是指存在于多核苷酸中的任何一种或多种核酸片段，例如，DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸是指已从其原生环境移出的核酸分子、DNA或RNA。例如，编码载体中包含的抗体的重组多核苷酸被认为是为了本文所描述的目的分离的。分离的多核苷酸的进一步的实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液纯化的(部分或基本上)多核苷酸。分离的RNA分子包括本文描述的多核苷酸的体内和体外RNA转录本。本文描述的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的这样的分子。此外，多核苷酸或核酸可为调控元件或可包括调控元件，例如启动子、核糖体结合位点、或转录终止子。
如本文所用，“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸区域。尽管“终止密码子”(TAG、TGA、或TAA)不翻译成氨基酸，但可被认为是编码区的一部分，但例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、和内含子等任何侧翼序列不是编码区的一部分。本文描述的两种或更多种编码区可存在于单个多核苷酸构建体中，例如在单个载体上，或存在于各自的多核苷酸构建体中，例如，在各自的(不同的)载体上。此外，任何载体可包含单个编码区、或可包括两个或更多个编码区，例如，单个载体可分别地编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，本文描述的载体、多核苷酸、或核酸可编码异源编码区，融合或未融合至编码结合分子、抗体、或其片段、变体、或衍生物的核酸。异源编码区包括但不限于特定元件或基序，例如分泌信号肽或异源功能性结构域。
在一些实施方案中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情形中，包含编码多肽的核酸的多核苷酸通常可包括与一个或多个编码区可操作地关联的启动子和/或其它转录或翻译控制元件。可操作的关联是当基因产物如多肽的编码区与一个或多个调控序列相关联时，使得基因产物的表达处于调控序列(一种或多种)的影响或控制之下。如果启动子功能的诱导导致编码期望的基因产物的mRNA的转录、和如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调控序列指导基因产物的表达的能力或不干扰待转录的DNA模板的能力时，两个DNA片段(例如，多肽编码区和与其相关的启动子)为“可操作地关联”或“可操作地连接”。因此，如果启动子能够影响核酸的转录，那么启动子区可与编码多肽的核酸可操作地关联。启动子可为仅在预定细胞中指导DNA的实质转录的细胞特异性启动子。除了启动子以外，例如增强子、操作子、抑制子、和转录终止信号等其它转录控制元件可与多核苷酸可操作地关联，以指导细胞特异性转录。本文公开了合适的启动子和其它转录控制区。
本领域技术人员已知各种转录控制区。这些包括但不限于，在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，例如但不限于，来自巨细胞病毒(即刻早期启动子，与intron-A连接)、猿猴病毒40(早期启动子)、和逆转录病毒(例如劳氏肉瘤病毒)的启动子和增强子片段。其它转录控制区包括源自脊椎动物基因的那些，例如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β-球蛋白，以及能够在真核细胞中控制基因表达的其它序列。附加的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子，以及淋巴因子-诱导性启动子(例如，由干扰素或白介素诱导的启动子)。
类似地，本领域技术人员已知各种翻译控制元件。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子、和源自小核糖核酸病毒的元件(特别地，内部核糖体进入位点，或IRES，也被称为CITE序列)。
在一些实施方案中，本文描述的多核苷酸是RNA，例如，以信使RNA(mRNA)的形式呈现。
本文描述的多核苷酸和核酸编码区可与编码分泌或信号肽的附加编码区有关，所述附加编码区指导由本文描述的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，哺乳动物细胞分泌的蛋白具有信号肽或分泌前导序列，一旦开始生长的蛋白链穿过粗面内质网，所述信号肽或分泌前导序列就会从成熟蛋白质上切割下来。本领域技术人员意识到，由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合至多肽的N-末端的信号肽，所述信号肽从完整的或“全长”多肽切割以产生多肽的分泌或“成熟”形式。在一些实施方案中，使用例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽等天然信号肽，或保持指导与序列的功能性衍生物可操作地关联的多肽的分泌的能力的序列的功能性衍生物。可选地，可使用异源哺乳动物信号肽、或其功能性衍生物。例如，野生型前导序列可以代替人组织型纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸酶的前导序列。
除非另外指出，否则术语“病症”和“疾病”在本文可交换使用。
本文所用的“结合分子”主要涉及抗体、及其片段，但还可以是指结合PNAd的其它非抗体分子，包括但不限于激素、受体、配体、主要组织相容性复合体(MHC)分子、伴侣蛋白如热休克蛋白(HSP)，以及细胞-细胞粘附分子如钙粘蛋白、整合素、C型凝集素和免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。因此，仅为了清楚且不限制本公开的范围，以下实施方案的大部分是针对表现用于治疗和诊断试剂的开发的结合分子的特定实施方案的抗体和抗体样分子来讨论的。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文可交换使用。抗体或免疫球蛋白是至少包含重链的可变结构域、和通常至少包含重链和轻链的可变结构域的PNAd结合分子。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构被相对较好地理解；参见，例如，Harlow等人,Antibodies:ALaboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)。
如下文中将更详细地讨论的，术语“免疫球蛋白”包含可被生化鉴定的多肽的各种大类。本领域技术人员将理解，重链被分类为伽玛、谬、阿尔法、德尔塔、或艾普西隆(γ、μ、α、δ、ε)，其中具有一些亚类(例如，γ1-γ4)。正是该链的性质决定了抗体的“类别”，分别为IgG、IgM、IgA、IgG、或IgE。例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等免疫球蛋白亚类(同种型)被良好地表征并且已知赋予功能特化。考虑到本公开，这些类别和同种型的各自的修饰版本对本领域技术人员来说是容易辨别的，因此，在本公开的范围内。所有免疫球蛋白类明确地在本公开的范围内，以下讨论将通常针对免疫球蛋白分子的IgG类。关于IgG，是包含分子量约23,000道尔顿的两条相同轻链多肽、和分子量53,000-70,000的两条相同重链多肽的标准免疫球蛋白分子。四条链由二硫键以“Y”构型典型地连接，其中轻链在“Y”的开口处开始括住(bracket)重链并继续通过可变区。
轻链分类为卡帕或拉姆达(κ、λ)。各重链类可与κ或λ轻链任一者结合。通常，当免疫球蛋白是由杂交瘤、B细胞或基因工程化宿主细胞产生时，轻链和重链彼此共价结合，并且两条重链的“尾”部通过共价二硫键连接或非共价连接彼此结合。重链中，氨基酸序列从Y构型的叉端的N-末端延伸(run)至各链的底部的C-末端。
轻链和重链都分为结构和功能同源的区域。术语“恒定”和“可变”功能性地使用。在这方面，应理解，轻(VL)和重(VH)链部分二者的可变结构域决定抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要的生物学性质，例如分泌、跨胎盘迁移(transplacental mobility)、Fc受体结合、互补结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号随着恒定区结构域远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N末端部分是可变区，C末端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包括重链和轻链的羧基末端。
如上所示，可变区允许抗体选择性鉴定并特异性结合抗原上的表位。即，组合抗体的VL结构域和VH结构域、或互补决定区(CDR)的子集以形成限定了三维抗原结合位点的可变区。该四级抗体结构形成存在于Y的各个臂的末端处的抗原结合部位。更具体地，抗原结合位点由各个VH和VL链上的三个CDR限定。包含足够的结构以特异性结合PNAd的任何抗体或免疫球蛋白片段在本文中可交换地指定为“结合片段”或“免疫特异性片段”。
在天然存在的抗体中，抗体包含存在于各抗原结合结构域上的六个高变区，有时称为“互补决定区”或“CDR”，其为短的、非连续的氨基酸序列，当抗体在水性环境中呈现其三维构型时，它们特异性定位以形成抗原结合结构域。“CDR”两侧为显示低分子间可变性的四个相对保守的“框架”区或“FR”。框架区主要采用β-折叠构象并且CDR形成连接β-折叠结构并且在一些情况中形成β-折叠结构的一部分的环。因此，框架区起到形成支架的作用，提供所述支架用于通过链间、非共价相互作用以正确的方向定位CDR。通过定位CDR形成的抗原结合结构域限定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。该互补表面促进抗体与其同源表位的非共价结合。本领域技术人员对任何给定的重链或轻链可变区可容易地鉴定分别包含CDR和框架区的氨基酸，因为它们已被精确地定义；参见，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”Kabat,E.,等人,U.S.Department of Health and HumanServices,(1983)；和Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196(1987),901-917，其通过引用以其整体结合在此。
在本领域中使用和/或接受术语的两个或更多个定义的情况中，除非明确指出是相反的，否则本文所用的术语的定义旨在包括所有的这些含义。具体实例是使用术语“互补决定区”(“CDR”)描述在重链和轻链多肽二者的可变区中发现的非连续抗原结合位点。该特定区域已由Kabat等人,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequences ofProteins of Immunological Interest"(1983)和由Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196(1987),901-917描述，其通过引用结合在此，其中当针对彼此比较时，定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一定义来指代抗体或其变体的CDR旨在落入如本文所定义的和所用的范围内。包括如各自上述引用的参考文献所定义的CDR的合适的氨基酸残基示于下表1中作为比较。包含特定CDR的精确的残基数因CDR的序列和大小而异。给定抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员常规地确定哪个残基包含人IgG亚型抗体的特定高变区或CDR。
表1：CDR定义1
Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1表1中所有CDR定义的编号是根据由Kabat等人所示的编号惯例(参见下文)。
Kabat等人还定义了可适用于任何抗体的可变结构域序列的编号系统。本领域技术人员可明确地将该“Kabat编号”系统指定至任何可变结构域序列，而不依赖于超过序列自身的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat等人,U.S.Dept.of Healthand Human Services,"Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)所示的编号系统。除非另外指出，否则关于本文描述的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物中特定氨基酸残基位置的编号是根据Kabat编号系统，然而，其是理论上的并且不能等同地应用于本文描述的每个抗体。例如，取决于第一CDR的位置，后续CDR可能在任一方向上移位。
本文描述的抗体或其抗原结合片段、免疫特异性片段、变体、或衍生物包括但不限于，多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化、灵长类化(primatized)、鼠源化或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如，Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段、和抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，针对本文公开的抗体的抗Id抗体)。scFv分子是本领域已知的并且描述于例如美国专利5,892,019。本文描述的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、和IgY)、类(例如，IgG1、IgG2、gG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
在一些实施方案中，抗体不是具有五价结构的IgM或其衍生物。特别地，在具体应用中，特别是治疗用途中，IgM比IgG和其它二价抗体或相应结合分子较少有用，因为IgM由于它们的五价结构和缺乏亲和性成熟，通常显示非特异性交叉反应性和非常低的亲和性。
在一些实施方案中，抗体是具有五价结构的IgM或其衍生物。
在一些实施方案中，抗体不是多克隆抗体，即，其实质上由一个特定抗体种组成，而不是获得自血浆免疫球蛋白样品的混合物。
包括单链抗体的抗体片段可仅包含可变区(一个或多个)或可变区(一个或多个)与以下的全部或部分的组合：铰链区、CH1、CH2、和CH3结构域。本文还提供了也包含可变区(一个或多个)与铰链区、CH1、CH2、和CH3结构域的任何组合的PNAd结合片段。本文描述的抗体或其免疫特异性片段可来自包括鸟和哺乳动物的任何动物来源。在一些实施方案中，抗体为人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马、或鸡抗体。在另一实施方案中，可变区可为软骨鱼(condricthoid)来源(例如，来自鲨鱼)。
在一些实施方案中，抗体是分离自人的单克隆抗体。任选地，根据数据库中相关的人种系可变区序列(pertinent human germ line variable region sequence)比对并采用人抗体的框架区；参见，例如，蛋白质工程MRC中心(MRC Centre for ProteinEngineering)(Cambridge，UK)主办的Vbase(vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)。例如，认为氨基酸潜在地偏离真种系序列可能是因为在克隆过程中混入PCR引物序列。与例如来自噬菌体展示抗体文库或异种小鼠的单链抗体片段(scFv)等人工产生的人样抗体相比，本文描述的人单克隆抗体的特征在于(i)使用人免疫应答、而不是动物替代物的免疫应答获得，即抗体是在响应人体内其相关构象的天然PNAd时产生的，(ii)已经保护了个体或至少对于PNAd的存在为重要的，和(iii)由于抗体是人来源的，因此将针对自身抗原的交叉反应的风险降至最低。因此，如本文所用，术语“人单克隆抗体”、“人单克隆自身抗体”、和“人抗体”等用于指代人来源的PNAd结合分子，即，其分离自例如B细胞或其杂交瘤，或其cDNA直接克隆自例如人记忆B细胞等人细胞的mRNA。即使在抗体中进行氨基酸取代，例如，以改善结合特性，人抗体仍为“人的”。
如下文中所述，抗体源自人免疫球蛋白文库或源自一种或多种人免疫球蛋白的转基因动物和不表达内源免疫球蛋白的转基因动物，例如在Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598中表示为人样抗体，以将它们与本文描述的真正的人抗体区别开。
例如，诸如通常分离自噬菌体展示的合成和半合成抗体等人样抗体的重链和轻链的配对不必须反映原始配对，因为其发生于原始人B细胞中。因此，常用于现有技术中的获得自重组表达文库的Fab和scFv片段被认为是人工的，具有对免疫原性和稳定性的所有可能的相关作用。
如本文所用，术语“重链部分”包括源自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽含有以下至少一者：CH1结构域、铰链(例如，上、中、和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、或其变体或片段。例如，用于本文描述的方法的结合多肽可包含含有CH1结构域的多肽链；含有CH1结构域、至少铰链结构域的一部分、和CH2结构域的多肽链；含有CH1结构域和CH3结构域的多肽链；含有CH1结构域、至少铰链结构域的一部分、和CH3结构域的多肽链，或含有CH1结构域、至少铰链结构域的一部分、CH2结构域、和CH3结构域的多肽链。在另一实施方案中，本文描述的多肽包含含有CH3结构域的多肽链。此外，用于本文描述的方法的结合多肽可缺乏CH2结构域的至少一部分(例如，CH2结构域的全部或部分)。如上所示，本领域技术人员将理解，这些结构域(例如，重链部分)可以修饰，使得它们在来自天然存在的免疫球蛋白分子的氨基酸序列中改变。
在本文公开的某些抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物中，多聚体的一条多肽链的重链部分与多聚体的第二多肽链的重链部分相同。可选地，本文描述的含有重链部分的单体不相同。例如，各个单体可包含不同的靶结合位点，形成例如双特异性抗体或双抗体。
在一些实施方案中，本文公开的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物由例如scFv等单个多肽链构成，并且是细胞内表达的(胞内抗体(intrabodies))用于潜在的体内治疗和诊断应用。
用于本文公开的诊断和治疗方法的结合多肽的重链部分可源自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可包含源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一实例中，重链部分可包含部分源自IgG1分子、和部分源自IgG3分子的铰链区。在另一实例中，重链部分可包含部分源自IgG1分子、和部分源自IgG4分子的嵌合铰链。
如本文所用，术语“轻链部分”包括源自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链部分包含VL或CL结构域的至少一者。
抗体的肽或多肽表位的最小大小被认为是约4至5个氨基酸。肽或多肽表位可包含至少7个氨基酸、至少9个氨基酸或在至少约15个至约30个氨基酸之间。由于CDR可以其三级形式鉴定抗原肽或多肽，因此包含表位的氨基酸不必须为连续的，并且在一些情况中，甚至可以不在同一肽链上。在一些实施方案中，由本文描述的抗体识别的肽或多肽表位可包含PNAd的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、或约5个至约30个之间、约10个至约30个之间或约15个至约30个之间的连续或非连续氨基酸。
本文可交换使用的“特异性结合”或“特异性鉴定”，通常意味着例如抗体等结合分子通过其抗原结合结构域结合至表位，并且意味着结合需要抗原结合结构域和表位之间的一些互补性。根据该定义，当抗体通过其抗原结合结构域与表位结合时，该抗体被称为与其结合至随机的、无关的表位相比更容易地“特异性结合”至该表位。本领域技术人员理解，抗体可特异性地结合、或特异性地鉴定包含对应于非连续表位的线性部分的氨基酸残基或由其组成的分离的多肽。本文使用术语“特异性”以限定特定抗原结合至某些表位的相关亲和性。例如，抗体“A”可被认为具有比抗体“B”更高的对给定表位的特异性，或抗体“A”可被称为以比其对于相关表位“D”更高的特异性结合至表位“C”。
当存在时，术语抗体与抗原的“免疫学结合特性”或其它结合特性，在其所有语法形式中，是指抗体的特异性、亲和性、交叉反应性、和其它结合特性。
通过“优选结合”，意味着例如抗体等结合分子与其结合至相关、相似、同源、或类似表位相比更容易地特异性结合至表位。因此，“优选结合”至给定表位的抗体将比结合至相关表位更可能结合至该表位，即使这样的抗体可能与相关表位交叉反应。
通过非限制性实例，如果例如抗体等结合分子以比对于第二表位的抗体的解离常数(KD)小的KD结合第一表位，则例如抗体等结合分子可被认为优选结合第一表位。在另一非限制性实例中，如果抗体以比对于第二表位的抗体的KD小至少一个数量级的亲和力结合第一表位，则抗体可被认为优选结合第一抗原。在另一非限制性实例中，如果抗体以比对于第二表位的抗体的KD小至少两个数量级的亲和力结合第一表位，则抗体可被认为优选结合第一表位。
在另一非限制性实例中，如果例如抗体等结合分子以比对于第二表位的抗体的解离率(k(off))小的k(off)结合第一表位，则例如抗体等结合分子被认为优选结合第一表位。在另一非限制性实例中，如果例如抗体等结合分子以比对于第二表位的抗体的k(off)小至少一个数量级的亲和力结合第一表位，则例如抗体等结合分子被认为优选结合第一表位。在另一非限制性实例中，如果例如抗体等结合分子以比对于第二表位的抗体的k(off)小至少两个数量级的亲和性结合第一表位，则例如抗体等结合分子被认为优选结合第一表位。
如果例如抗体等结合分子与给定表位优选结合到某种程度上阻断了参考抗体与该表位的结合的程度，则例如抗体等结合分子被称为是竞争性抑制参考抗体与给定表位的结合。可通过本领域已知的任何方法来确定竞争性抑制，例如，竞争ELISA试验。可以说抗体竞争性抑制参考抗体与给定表位的结合至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、或至少50％。本领域技术人员理解，抗体与其表位的结合还可被不是抗体的结合分子竞争性抑制。
如本文所用，术语“亲和力”是指单个表位与例如免疫球蛋白分子等结合分子的CDR的结合的强度的测量；参见，例如，Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版(1988)，第27-28页。如本文所用，术语“亲合力(avidity)”是指免疫球蛋白的群体和抗原的之间的复合物的整体稳定性，即，免疫球蛋白混合物与抗原的功能性结合强度；参见，例如，Harlow第29-34页。亲合力涉及群体中的具有特定表位的单个免疫球蛋白分子的亲和力(affinity)、以及免疫球蛋白和抗原的化合价。例如，二价单克隆抗体和例如聚合物等具有高重复表位结构的抗原之间的相互作用将为高亲合力之一。抗体对于抗原的亲和力或亲合力可使用任何合适的方法通过试验确定；参见，例如，Berzofsky等人，“Antibody-Antigen Interactions”In FundamentalImmunology,Paul,W.E.,Ed.,Raven Press New York,N Y(1984),Kuby,JanisImmunology,W.H.Freeman and Company New York,N Y(1992)，以及本文描述的方法。用于测定抗体对抗原的亲和力的常规方法包括ELISA、RIA、和表面等离子体共振。如果在例如盐浓度、pH等不同条件下测定，测定的特定抗体-抗原相互作用的亲和性的可改变。因此，亲和力和例如KD、IC50等其它抗原结合参数的测定优选由抗体和抗原的标准化溶液、和标准化缓冲液来进行。
例如本文所描述的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物等结合分子还可在它们的交叉反应性方面描述或说明。如本文所用，术语“交叉反应性”是指对一种抗原特异的抗体与第二抗原反应的能力；两种不同抗原物质之间的关联性的测定。因此，如果抗体结合至诱导其形成的表位以外的表位，抗体是交叉反应性的。交叉反应的表位通常包含许多与诱导表位相同的互补结构特征，并且在一些情况中，事实上比原始的适合得更好。
例如，某些抗体具有一些程度的交叉反应性，因为它们结合相关的、但不相同的表位，例如，与参考表位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、和至少50％同一性(如使用本领域已知的和本文描述的方法计算的)的表位。如果抗体不结合与参考表位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、和至少50％同一性(如使用本领域已知的和本文描述的方法计算的)的表位，则抗体被称为是具有少的或无交叉反应性。如果抗体不结合表位的任何其它类似物、直系同源物、或同源物，抗体被认为对于某一表位为“高度特异性”。
例如本文描述的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物等结合分子还可在它们与PNAd的结合亲和力方面描述或说明。
如前所述，各种免疫球蛋白类的恒定区的亚单元结构和三维构型是众所周知的。如本文所用，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基酸末端可变结构域，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(最氨基末端)恒定区结构域。CH1结构域邻近VH结构域并且位于免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
如本文所用，术语“CH2结构域”包括从例如使用常规编码方案的抗体的约残基244至残基360(残基244至360，Kabat编码系统；和残基231-340，EU编码系统；参见Kabat EA等人，前文中引用的)延伸的重链分子的部分。CH2结构域独特之处在于，其不与另一结构域紧密配对。相反，两个N-连接的支链糖链插入完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。有充分记载，CH3结构域从CH2结构域延伸到IgG分子的C端并包含大约108个残基。
如本文所用，术语“铰链区”包括连接CH1结构域和CH2结构域的重链分子的部分。该铰链区包含约25个残基并且是柔性的，因此允许两个N末端抗原结合区独立地移动。铰链区可细分为三个不同的结构域：上、中、和下铰链结构域；参见Roux等人,J.Immunol.161(1998),4083。
如本文所用，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可与第二硫醇基团形成二硫键或桥连的硫醇基团。在大部分天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接并且在使用Kabat编号系统的对应于239和232位置(位置226或229，EU编号系统)处两条重链通过两个二硫键连接。
如本文所用，术语“连接的”、“融合的”或“融合”可交换使用。这些术语是指将两个或更多个元素或组分通过包括化学结合或重组方法的任何方法连接在一起。“框内融合”是指以维持原始ORF的正确翻译阅读框架的方式、连接两个或更多个多核苷酸开放阅读框(ORF)以形成连续的长ORF。因此，重组融合蛋白是包含对应于由原始ORF(其片段在本质上通常不是这样连接的)编码的多肽的两个或更多个片段的单个蛋白。尽管由此使阅读框在整个融合片段中为连续的，片段可通过例如框内连接子序列物理地或空间地分离。例如，编码免疫球蛋白可变区的CDR的多核苷酸可为框内融合的，但通过编码至少一个免疫球蛋白框架区或另外的CDR区的多核苷酸分离，只要“融合的”CDR共翻译为连续多肽的一部分即可。
本文所用的术语“表达”是指通过基因产生例如RNA或多肽等生化物(biochemical)的过程。该过程包括细胞内的基因的功能性存在的任何表现，包括但不限于，基因敲低以及瞬时表达和稳定表达。其包括但不限于，基因至信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其它RNA产物的转录，以及此类mRNA至多肽(一种或多种)的翻译。如果最终期望产物是生化物，表达包括生化物和任何前体的产生。基因的表达产生“基因产物”。如本文所用，基因产物可为核酸，例如由基因的转录产生的信使RNA，或多肽，其翻译自转录本。本文所述的基因产物还包括具有例如多腺苷酸化等转录后修饰的核酸、或具有例如甲基化、糖基化、脂质的添加、与其它蛋白亚基的缔合、和蛋白水解切割等翻译后修饰的多肽。
如本文所用，术语“样品”是指获得自受试者或患者的任何生物材料。在一方面，样品可包含血液、血浆、或尿。在其它方面，样品可包含全血、血浆、富集自血液样品的B细胞、和培养的细胞(例如，来自受试者的B细胞)。样品还可包括活组织或包括神经组织的组织样品。在仍另一方面，样品可包含完整细胞和/或细胞的裂解物。血液样品可通过本领域已知的方法来收集。在一方面，沉淀可通过在200μl缓冲物(20mM Tris、pH.7.5、0.5％诺乃(Nonidet)、1mM EDTA、1mM PMSF、0.1M NaCl、IX Sigma蛋白酶抑制剂、和IX Sigma磷酸酶抑制剂1和2)中在4℃下涡旋来重悬浮。可将悬浮液保持在冰上20分钟，间歇涡旋。在约4℃下以15,000x g离心5分钟后，在约-70℃下储存等分的上清液。
如本文所用，术语“处理”或“治疗”是指治疗性处理和预防性或防范性措施，其中目的为预防或减慢(减少)不期望的生理变化或本文描述的病症。有利的或期望的临床结果包括但不限于，症状的缓和、疾病程度的降低、稳定(即，不恶化)疾病状态、延迟或减慢疾病进展、改善或减轻疾病状态、和缓解(部分地或全部地)，无论可检测的或不可检测的。“治疗”还可意味着与如果不接受治疗的预期存活相比，延长的存活。有治疗需要的那些包括已患有病况或病症的那些、以及倾向于患有病况或病症的那些、或其中病况或病症的表现将被预防的那些。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指对期望接受诊断、预后、预防、或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者，例如，人患者。
包含组分或步骤的本文描述的组合物或方法还可实质上由那些组分或步骤组成、或由那些组分或步骤组成。
II.抗体
提供了抗外周淋巴结地址素(PNAd)抗体及其抗原结合片段。本文还提供了抗PNAd抗体或其抗原结合片段的衍生物或变体。本文还提供了包含此类抗体或其PNAd结合片段或其衍生物或变体的缀合物。在一些实施方案中，本文描述的抗体或其PNAd结合片段显示了如以下实施例部分中说明的针对抗体MHA112所概述的结合特征和/或生物学特性。如以下实施例部分中描述的，抗PNAd抗体MHA112显示对表达PNAd的细胞的改善的结合亲和力(实施例6)和改善的阻断T细胞归巢至淋巴结的能力(实施例4)。施用缀合至MHA112的药物除了导致增加的存活时间(实施例8)以外，还导致降低的肿瘤生长、降低的肿瘤转移、和降低的肿瘤引流淋巴结纤维化(实施例7)。此外，施用缀合至MHA112的药物还在胰腺肿瘤模型中增加存活时间(实施例9)。
抗体及其抗原结合片段的特征在于在它们的可变区中，例如结合结构域中包含图5中描述的任一氨基酸序列的VH和/或VL可变区的至少一个互补决定区(CDR)。编码上述鉴定的可变区的相应核苷酸序列示于下表4中。VH和/或VL区的上述氨基酸序列的CDR的示例性描述于图5和表2。表2中的CDR的相应框架区示于表3。然而，如下文中所讨论的，本领域技术人员熟知可以另外地或可选地使用CDR的事实，在CDR2和CDR3的情况中，它们的氨基酸序列与图5中所示的那些存在1个、2个、3个或甚至更多个氨基酸的不同。
表2：IMGT CDR序列
Figure BDA0003297601240000231
表3：框架区序列
Figure BDA0003297601240000232
表4：可变区序列
Figure BDA0003297601240000233
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段包含含有选自由SEQ IDNO:3-5和8-10组成的组的氨基酸序列、或由选自由SEQ ID NO:3-5和8-10组成的组的氨基酸序列组成的至少一个CDR。在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段包括含有选自由SEQ ID NO:3-5和8-10组成的组的氨基酸序列、或由SEQ ID NO:3-5和8-10组成的组的氨基酸序列组成的1个、2个、3个、4个、5个或6个CDR(参见，例如，表2)。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区(VH)互补决定区1(CDR1)、含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH CDR2、和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR3。在一些实施方案中，抗体或其PNAd结合片段包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH CDR1、含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH CDR2、和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR3，并且还包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区(VL)CDR1、含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR2、和含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR3。
在一些实施方案中，抗体或其PNAd结合片段包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL CDR1、含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR2、和含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方案中，抗体或其PNAd结合片段包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL CDR1、含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR2、和含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR3，并且还包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH CDR1、含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH CDR2、和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR3。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗体结合片段可包含含有以下的VH：(i)含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH CDR1；(ii)含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VHCDR2；和(iii)含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR3。在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗体结合片段可包含含有以下的轻链可变区(VL)：(i)含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL CDR1；(ii)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR2；和(iii)含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL CDR3。在一些实施方案中，抗体或其PNAd结合片段可还包含含有以下的重链可变区：SEQ ID NO:3的VH CDR1；SEQ ID NO:4的VH CDR2；和SEQ ID NO:5的VHCDR3，并且可还包含含有以下的轻链可变区：SEQ ID NO:8的VL CDR1；SEQ ID NO:9的VLCDR2；和SEQ ID NO:10的VL CDR3。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段可包含含有以下的重链可变区：含有SEQ ID NO:3或由其组成的VH CDR1；含有SEQ ID NO:4或由其组成的VH CDR2；和含有SEQ ID NO:5或由其组成的VH CDR3。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段可包含含有以下的轻链可变区：含有SEQ ID NO:8或由其组成的VL CDR1；含有SEQ ID NO:9或由其组成的VL CDR2；和含有SEQ ID NO:10或由其组成的VL CDR3。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段可包含含有以下的重链可变区：含有SEQ ID NO:3或由其组成的VH CDR1；含有SEQ ID NO:4或由其组成的VH CDR2；和含有SEQ ID NO:5或由其组成的VH CDR3，并且可还包含含有以下的轻链可变区：含有SEQID NO:8或由其组成的VL CDR1；含有SEQ ID NO:9或由其组成的VL CDR2；和含有SEQ IDNO:10或由其组成的VL CDR3。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段包含含有以下的VH：含有SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列的重链框架区1(FR1)、含有SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列的重链FR2、含有SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列的重链FR3、和含有SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列的重链FR4。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段包含含有以下的VL：含有SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列的轻链FR1、含有SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列的轻链FR2、含有SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列的轻链FR3、和含有SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的轻链FR4。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段包含含有以下的VH：含有SEQ ID NO:3或由其组成的VH CDR1；含有SEQ ID NO:4或由其组成的VH CDR2；和含有SEQID NO:5或由其组成的VH CDR3，其中VH与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段包含含有以下的VH：含有SEQ ID NO:3或由其组成的VH CDR1；含有SEQ ID NO:4或由其组成的VH CDR2；和含有SEQ ID NO:5或由其组成的VH CDR3，其中相对于SEQ ID NO:2的氨基酸序列，VH具有1至10个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个)氨基酸取代、添加、或缺失。在一些情况中，氨基酸取代为保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段包含含有以下的VL：含有SEQ ID NO:8或由其组成的VL CDR1；含有SEQ ID NO:9或由其组成的VL CDR2；和含有SEQID NO:10或由其组成的VL CDR3，其中VL与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段包含含有以下的VL：含有SEQ ID NO:8或由其组成的VL CDR1；含有SEQ ID NO:9或由其组成的VL CDR2；和含有SEQ ID NO:10或由其组成的VL CDR3，其中相对于SEQ ID NO:7的氨基酸序列，VL具有1至10个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个)氨基酸取代、添加、或缺失。在一些情况中，氨基酸取代为保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段包含：(a)含有以下的VH：含有SEQ ID NO:3或由其组成的VH CDR1；含有SEQ ID NO:4或由其组成的VH CDR2；和含有SEQ ID NO:5或由其组成的VH CDR3，其中VH与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或100％的序列同一性，和(b)含有以下的VL：含有SEQ ID NO:8或由其组成的VL CDR1；含有SEQ ID NO:9或由其组成的VL CDR2；和含有SEQID NO:10或由其组成的VL CDR3，其中VL与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或100％的序列同一性。在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段包含：(a)含有以下的VH：含有SEQ ID NO:3或由其组成的VHCDR1；含有SEQ ID NO:4或由其组成的VH CDR2；和含有SEQ ID NO:5或由其组成的VH CDR3，其中相对于的SEQ ID NO:2的氨基酸序列，VH具有1至10个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个)氨基酸取代、添加、或缺失；和(b)含有以下的VL：含有SEQ ID NO:8或由其组成的VLCDR1；含有SEQ ID NO:9或由其组成的VL CDR2；和含有SEQ ID NO:10或由其组成的VLCDR3，其中相对于SEQ ID NO:7的氨基酸序列，VL具有1至10个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个)氨基酸取代、添加、或缺失。在一些实施方案中，取代为保守取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基由具有带类似电荷的侧链的氨基酸残基取代的取代。本领域中已定义具有带类似电荷的侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有以下的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、未带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、和β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在一些实施方案中，本文描述的抗体的变体(例如，具有分别相对于SEQ ID NO:2和7中所示的氨基酸序列的VH和/或VL的氨基酸取代、添加、或缺失的抗体或其抗原结合片段)保持结合PNAd的能力和/或保持以下实施例中描述的抗体MHA112的一个或多个特性。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列、或由其组成的重链可变区(VH)。在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列、或由其组成的轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列、或由其组成的重链可变区(VH)，并且还包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列、或由其组成的轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:2的VH和SEQ ID NO:7的VL。
在一些实施方案中，本文描述的抗体包含含有本文描述的VH的重链。在一些情况中，重链包括IgM恒定区。在一些情况中，重链包括人IgM恒定区。
在一些实施方案中，本文描述的抗体包含含有本文描述的VL的轻链。在一些情况中，轻链包含κ恒定区。在一些情况中，轻链包含人κ恒定区。在一些情况中，轻链包含λ恒定区。在一些情况中，轻链包含人λ恒定区。
在一些实施方案中，本文描述的其抗体包含含有本文描述的VH的重链和含有本文描述的VL的轻链，其中重链包含IgM(例如，人IgM)恒定区，轻链包含κ(例如，人κ)恒定区。在一些实施方案中，本文描述的抗体包含含有本文描述的VH的重链和含有本文描述的VL的轻链，其中重链包含IgM(例如，人IgM)恒定区，轻链包含κ(例如，人κ)恒定区。
可选地，本文描述的抗体是抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体，其与具有SEQID NO:3-5中分别所示的VH CDR 1-3的抗体竞争结合PNAd。可选地，本文描述的抗体是抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体，其与具有SEQ ID NO:8-10中分别所示的VL CDR 1-3的抗体竞争结合PNAd。可选地，本文描述的抗体是抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体，其与具有SEQ ID NO:3-5中分别所示的VH CDR 1-3、和SEQ ID NO:8-10中分别所示的VL CDR1-3的抗体竞争结合PNAd。可选地，本文描述的抗体是抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体，其与具有SEQ ID NO:2和7中分别所示的VH和/或VL的抗体竞争结合PNAd。这些抗体可为人、啮齿动物(例如，鼠)、嵌合、或人源化的，特别是用于治疗应用。
可选地，本文所描述的抗体是抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体，其结合与含有SEQ ID NO:2的VH和SEQ ID NO:7的VL的抗PNAd抗体相同的表位。
抗体之间的竞争是通过其中受验免疫球蛋白抑制参考抗体对例如PNAd等常规抗原的特异性结合的试验来确定的。已知各种类型的竞争性结合试验，例如：固相直接或间接放射免疫分析法(RIA)、固相直接或间接酶免疫分析法(EIA)、夹心竞争试验；参见Stahli等人,Methods in Enzymology 9(1983),242-253；固相直接生物素-亲和素EIA；参见Kirkland等人,J.Immunol.137(1986),3614-3619和Cheung等人,Virology 176(1990),546-552；固相直接标记试验、固相直接标记夹心试验；参见Harlow和Lane,Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988)；使用I125标签的固相直接标记RIA；参见Morel等人,Molec.Immunol.25(1988),7-15和Moldenhauer等人,Scand.J.Immunol.32(1990),77-82。通常，此类试验涉及使用结合至固体表面或带有这些中任一种、未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白，即本文描述的人单克隆抗体的细胞的纯化的PNAd或其聚集体。竞争性抑制是通过在测试免疫球蛋白的存在下、测定结合至固体表面或细胞的标签的量来测定的。通常测试免疫球蛋白以过量存在。在一些实施方案中，竞争性结合试验是在如所附实施例中对于ELISA试验所描述的条件下进行的。通过竞争试验鉴定的抗体(竞争抗体)包括结合至与参考抗体相同的表位的抗体和结合至充分靠近由参考抗体结合的表位的邻近抗体以发生位阻的抗体。通常，当竞争抗体以过量存在时，其将抑制参考抗体至常规抗原的特异性结合至少50％或75％。因此，本发明还涉及抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中抗体竞争性抑制含有SEQ ID NO:2的VH和SEQID NO:7的VL的参考抗体与PNAd结合。
在一些实施方案中，本文提供了包含免疫球蛋白重链可变区(VH)的分离的多肽，其中重链可变区的VH-CDR的至少一个或重链可变区的VH-CDR的至少两个与来自本文公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列(参见，例如，关于VH CDR序列的表2)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。可选地，VH的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区与来自本文公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列(参见，例如，关于VH CDR序列的表2)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。因此，本文公开的重链可变区可具有与表2的序列(即，SEQ IDNO:3-5)相关的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3。尽管表2显示由IMGT系统定义的VH-CDR，但例如由Kabat或Chothia系统定义的VH-CDR等其它CDR定义也可包含在本发明中，并且可由本领域技术人员使用表2-4中显示的序列容易地鉴定。在一些实施方案中，参考VH CDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:3；参考VH CDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:4；和参考VH CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:5。
本文描述的分离的多肽可包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与表2中示出的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列(即，SEQ ID NO:3-5)相同的多肽序列。在一些实施方案中，VH CDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:3；VH CDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:4；和VH CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:5。
此外，分离的多肽可包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，其中，除了在任一VH-CDR中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸取代，VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与表2中示出的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列(即，SEQ ID NO:3-5)相同的多肽序列。在一些实施方案中，氨基酸取代是保守的。在一些实施方案中，VH CDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:3；VHCDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:4；和VH CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:5。
分离的多肽可包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其中轻链可变区的VL-CDR的至少一个或轻链可变区的VL-CDR的至少两个与来自本文公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列(参见，例如，关于VL CDR序列的表2)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。可选地，VL的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区与来自本文所公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列(参见，例如，关于VL CDR序列的表2)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。因此，轻链可变区可具有与表2的序列(即，SEQ ID NO:8-10)相关的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3多肽序列。尽管表2显示由IMGT系统定义的VH-CDR，例如由Kabat或Chothia系统定义的VH-CDR等其它CDR定义也可包含在本发明中。在一些实施方案中，参考VL CDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:8；参考VL CDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:9；和参考VL CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:10。
本文还提供了包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)的分离的多肽，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与表2的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列相同的多肽序列。在一些实施方案中，VL CDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:8；VL CDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:9；和VL CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:10。
分离的多肽还可包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其中除了在任一VL-CDR中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸取代，VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与表2的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3相同的多肽序列。在一些实施方案中，氨基酸取代为保守的。在一些实施方案中，VL CDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:8；VL CDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:9；和VL CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:10。
免疫球蛋白或其编码cDNA可被修饰。因此本文描述的方法可包括产生嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、Fab片段、双特异性抗体、融合抗体、标记抗体或这些的任一者的类似物的步骤(一个或多个)的任一者。相应的方法对于本领域技术人员是已知的并且描述于，例如Harlow和Lane"Antibodies,A Laboratory Manual",CSH Press,Cold SpringHarbor(1988)。当通过噬菌体展示技术来获得所述抗体的衍生物时，BIAcore系统中采用的表面等离子体共振可用于增加结合至与本文描述的抗体的任一者所结合的相同的表位的噬菌体抗体的功效(Schier,Human Antibodies Hybridomas 7(1996),97-105；Malmborg,J.Immunol.Methods 183(1995),7-13)。嵌合抗体的产生描述于例如国际申请WO89/09622。用于产生人源化抗体的方法描述于，例如，欧洲申请EP-A1 0 239 400和国际申请WO90/07861。根据本发明使用的进一步的抗体来源称为异种抗体。用于产生例如小鼠中人样抗体等异种抗体的一般原理描述于，例如，国际申请WO91/10741、WO94/02602、WO96/34096和WO96/33735。如上所述，本文所描述的抗体可以以完整抗体以外的各种形式存在；包括，例如，Fv、Fab、和F(ab)2、以及以单链的形式；参见，例如，国际申请WO88/09344。本文还提供了通过此类方法产生的抗体。
可使用本领域已知的常规技术进一步修饰本文描述的抗体或它们相应地免疫球蛋白链(一条或多条)，例如，通过单独或组合使用本领域已知的氨基酸缺失(一个或多个)、插入(一个或多个)、取代(一个或多个)、添加(一个或多个)、和/或重组(一个或多个)和/或任何其它修饰(一种或多种)。用于免疫球蛋白链的氨基酸序列的潜在的DNA序列中引入此类修饰的方法是本领域技术人员众所周知的；参见，例如，Sambrook,Molecular Cloning ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel,CurrentProtocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and WileyInterscience,N.Y.(1994)。本文描述的抗体的修饰包括在一个或多个组成氨基酸处的化学和/或酶衍生化，包括侧链修饰、主链修饰、和包括乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化、和糖类或脂质部分的附着、和辅助因子等N-和C-末端修饰。类似地，本发明包括嵌合蛋白的产生，其包含氨基末端处的描述的抗体或其一些片段融合至羧基末端处的例如免疫刺激配体等异源分子；对于相应的技术细节，参见，例如，国际申请WO00/30680。
此外，本文提供了包括含有如上所述的结合分子的那些的肽，例如含有前述抗体的任一者的可变区的CDR3区，特别是重链的CDR3，因为经常观察到重链CDR3(HCDR3)是具有更大程度的可变性并且主要参与抗原-抗体相互作用的区域。此类肽可容易地合成或通过重组手段产生以产生如本文所描述的结合剂。此类方法对于本领域技术人员来说是已知的。可例如使用商业可获得的自动肽合成仪来合成肽。肽还可通过将表达肽的DNA引入表达载体并用表达载体转化细胞来产生肽的重组技术来产生。
因此，本文描述了结合分子，例如，结合本文描述的人抗PNAd抗体并表现所提及的性质，即特异性鉴定(结合至)PNAd的抗体或其结合片段。可通过如本文所述的ELISA和免疫印迹法和免疫组织化学测试此类抗体和结合分子的结合特异性和亲和力，参见，例如，实施例。
作为直接从永生化B细胞或B记忆细胞的培养物获得免疫球蛋白的替代，本文描述的永生化细胞可用作重新排列的重链和轻链基因座的来源用于后续表达和/或遗传操作。可从合适的mRNA逆转录重新排列的抗体基因以产生cDNA。根据需要，重链恒定区可与不同同种型的重链恒定区交换或整体消除。可连接可变区以编码单链Fv区。可连接多个Fv区以向多于一个的靶标赋予结合能力或可采用嵌合重链和轻链组合。一旦遗传材料为可用的，保持它们结合期望的靶标的能力的上述类似物的设计是明确的。用于克隆抗体可变区和产生重组抗体的方法是本领域技术人员已知的并且描述于，例如，Gilliland等人,TissueAntigens 47(1996),1-20；Doenecke等人,Leukemia 11(1997),1787-1792。
一旦获得合适的遗传材料并根据需要修饰以编码类似物，可将包括最小编码重链和轻链的可变区的那些的编码序列插入至包含在转染至标准重组宿主细胞的载体上的表达系统。可使用各种这样的宿主细胞；然而，为了有效加工，可考虑哺乳动物细胞。对于该目的为有用的典型哺乳动物细胞系包括但不限于，CHO细胞、HEK 293细胞、或NSO细胞。
然后，抗体或类似物的生产开始于在适于宿主细胞的生长和编码序列的表达的条件下培养修饰的重组宿主。然后，通过从培养物分离抗体来回收抗体。表达系统设计成包括信号肽，使得所得抗体分泌至培养基；然而，细胞内生产也是可能的。
根据上述，本发明还涉及编码本文描述的抗体或同等结合分子的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸至少编码上述抗体的免疫球蛋白链的可变区。典型地，由多核苷酸编码的所述可变区包含所述抗体的可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)。
本领域技术人员将容易地理解，具有上述可变结构域的抗体的可变结构域可用于构建期望的特异性和生物功能的其它多肽或抗体。因此，本文提供了包含上述可变结构域的至少一个或多个CDR、例如全部CDR的多肽和抗体，并且有利地具有与所附实施例中所描述的抗体相同或类似的结合性质。本领域技术人员已知，结合亲和力可通过在CDR中或在如Kabat所定义的与CDR部分重叠的高变环中进行氨基酸取代来增强(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196(1987),901-917)；参见，例如Riechmann,等人,Nature 332(1988),323-327。因此，本文还提供了其中一个或多个提及的CDR包含一个或多个、但不多于两个氨基酸取代的抗体。在一些实施方案中，本文描述的抗体在其免疫球蛋白链的一条或两条中包含如表2中所示的可变区的两个或全部三个CDR。
如本领域技术人员所知的例如本文描述的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物等结合分子可包含恒定区，其介导一个或多个效应子功能。例如，补体的C1组分与抗体恒定区的结合可激活补体系统。补体的激活在调理作用和细胞病原体的裂解中是重要的。补体的激活还刺激免疫应答并且可涉及自身免疫超敏反应。此外，抗体通过Fc区结合各种细胞上的受体，其中抗体Fc区上的Fc受体结合位点结合细胞上的Fc受体(FcR)。存在对于不同种类的抗体具有特异性的许多Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合触发许多重要的且多样的生物应答，包括抗体包被的颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、杀伤细胞裂解抗体包被的靶细胞的(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、炎症介质的释放、胎盘转移和免疫球蛋白产生的控制。
因此，本文所描述的一些实施方案包括抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物，其中一个或多个的恒定区结构域的至少一部分已缺失或以其它方式改变以便提供期望的生物化学特性，例如，与近似相同免疫原性的完整的、未改变的抗体相比，减少的效应子功能、非共价二聚的能力、增加的定位在PNAd的位点处的能力、减少的血清半衰期、或增加的血清半衰期。例如，用于本文描述的诊断和治疗方法的一些抗体是包含类似于免疫球蛋白重链的多肽链、但缺乏一个或多个重链结构域的至少一部分的结构域缺失的抗体。例如，在某些抗体中，修饰的抗体的恒定区的一个完整结构域将缺失，例如，CH2结构域的全部或部分缺失。在其它实施方案中，用于本文描述的诊断和治疗方法的某些抗体具有恒定区，例如，IgM重链恒定区，其改变以消除糖基化，在本文其它部分称为无糖基化的(aglycosylated)或“非糖基化(agly)”抗体。此类“非糖基化”抗体可通过酶促以及通过工程化恒定区中共有糖基化位点(一个或多个)来制备。不受理论的限制，认为“非糖基化”抗体可具有改善的体内安全性和稳定性特征。生产具有期望的效应子功能的无糖基化抗体的方法可于例如国际申请WO2005/018572，以其整体结合在此。
在本文描述的某些抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物中，可使用本领域已知的技术突变Fc部分以减少效应子功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其它方法)可减少循环修饰的抗体的Fc受体结合，从而增加PNAd定位。在其它情况中，与本发明一致的恒定区修饰缓和互补结合，从而减少缀合的细胞毒素的血清半衰期和非特异性缔合。然而恒定区的其它修饰可用于修饰二硫键或低聚糖部分，允许由于增加的抗原特异性或抗体灵活性而增强的定位。修饰的所得生理学特性、生物有效性和其它生物化学作用，例如PNAd定位、生物分布和血清半衰期，可在不过度实验的情况下使用已知的免疫学技术容易地测定并量化。
在本文描述的一些抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物中，例如通过由Fcγ受体、LRP、或Thy1受体增强抗体的受体介导的胞吞作用或通过被认为使抗体能够穿梭至活细胞而不损害它们的“超级抗体技术(SuperAntibody Technology)”，Fc部分可突变或交换为可选的蛋白序列以增加抗体的细胞摄取(Expert Opin.Biol.Ther.(2005),237-241)。例如，可使用本领域已知的技术工程化抗体结合区的融合蛋白的产生和细胞表面受体的同源蛋白配体或具有结合至PNAd以及细胞表面受体的特异性序列的双特异性或多特异性抗体。
在本文描述的一些抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物中，Fc部分可突变或交换为可选蛋白序列，或抗体可被化学修饰以增加其血脑屏障穿透。
本文描述的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物的修饰形式可使用本领域已知技术由完整前体或亲本抗体制成。本文更详细讨论了示例性技术。本文描述的抗体、或其抗体结合片段、变体、或衍生物可使用本领域已知的技术制备或生产。在一些实施方案中，抗体分子或其片段是“重组产生的”，即，是使用重组DNA技术产生的。在本文其它部分更详细描述了用于制备抗体分子或其片段的示例性技术。
本文描述的抗体、或其抗体结合片段、变体、或衍生物还包括例如通过任何类型的分子与抗体的共价结合、使得共价结合不阻止抗体特异性结合其同源表位来修饰的衍生物。例如，不受理论的限制，抗体衍生物包括例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、由已知保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白连接等来修饰的。可通过已知技术进行任何许多的化学修饰，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，衍生物可包括一种或多种非典型氨基酸。
在一些实施方案中，本文描述的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物将不在被治疗的动物、例如人中引起有害免疫应答。在一些实施方案中，本文描述的结合分子、例如抗体、或其抗原结合片段，源自例如人患者等患者，并且后续用于它们所衍生自的相同物种，例如人，减轻或最小化有害免疫应答的发生。
去免疫化还可用于降低抗体的免疫原性。如本文所用，术语“去免疫化”包括改变抗体以修饰T细胞表位；参见，例如，国际申请WO98/52976和WO00/34317。例如，分析来自起始抗体的VH和VL序列并“映射”来自各个V区的人T细胞表位，显示与序列内互补决定区(CDR)和其它关键残基相关的表位的定位。分析来自T细胞表位映射的个体T细胞表位以识别具有改变最终抗体的活性的低风险的替代性氨基酸取代。设计一系列包含氨基酸取代的组合的可选VH和VL序列，并且这些序列随后整合入一系列结合多肽，例如PNAd特异性抗体或其免疫特异性片段，用于本文描述的诊断和治疗方法，然后测试其功能。典型地，产生并测试12和24个之间的变体抗体。然后将包含修饰的V区和人C区的完整重链和轻链基因克隆至表达载体并且随后将质粒引入至细胞系用于产生全抗体。然后，在合适的生物化学和生物学试验中比较抗体，鉴定最佳的变体。
使用本领域已知的多种技术制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组、和噬菌体展示技术、或其组合。例如，使用包括本领域中已知和例如在Harlow等人,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,第二版(1988)；Hammerling等人,in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier,N.Y.,563-681(1981)中教导的那些的杂交瘤技术产生单克隆抗体，所述参考文献以其整体引用结合在此。本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指源自单个克隆的抗体，包括任何真核、原核、或噬菌体克隆，而不是产生其的方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。
在众所周知的杂交瘤方法(Kohler等人,Nature 256(1975),495)中，来自哺乳动物的相对短寿命的、或致死的淋巴细胞，例如源自如本文所述的鼠受试者的B细胞，与永生肿瘤细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)融合，由此，产生杂交细胞或“杂交瘤”，其为永生的并且能够产生B细胞的基因编码抗体。通过选择、稀释、和与包含用于形成单个抗体的特定基因的各单个株的再生长，将所得杂交物(hybrids)分离至单个遗传株。它们产生抗体，针对期望的抗原为同源的，并且参考它们的纯基因世系(parentage)称为“单克隆的”。
将由此制备的杂交瘤细胞接种在合适的培养基中并生长，所述培养基包含抑制未融合的、亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的一种或多种物质。本领域技术人员将理解，用于杂交瘤形成、筛选和生长的药剂、细胞系和培养基是从许多来源的市售可获得的，并且已很好的确立了标准化方法。通常，对杂交瘤细胞生长的培养基检测针对期望抗原的单克隆抗体的产生。通过体外检测例如如本文所述的免疫沉淀法、放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)确定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。在鉴定杂交瘤细胞产生期望的特异性、亲和力和/或活性的抗体后，克隆可通过由标准方法的有限稀释法和生长来亚克隆；参见，例如，Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,pp 59-103(1986)。将进一步理解地，由亚克隆分泌的单克隆抗体可通过常规纯化方法例如如蛋白A、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱从培养基、腹水、血清分离。
在一些实施方案中，可通过显微操作选择淋巴细胞并分离可变基因。例如，外周血单核细胞可分离自例如人等免疫的或天然免疫哺乳动物，并在体外培养约7天。筛选培养物满足筛选条件的特异性免疫球蛋白。可分离来自阳性孔的细胞。可通过FACS或通过在补体介导的溶血斑试验中鉴定单个产生Ig的B细胞来分离单个产生Ig的B细胞。产生Ig的B细胞可显微操作至管并且可以使用例如RT-PCR等扩增VH和VL基因。VH和VL基因可克隆至抗体表达载体并转染至细胞(例如，真核或原核细胞)以表达。
可选地，可以使用本领域技术人员已知的技术来选择和培养产生抗体的细胞系。此类技术描述于各种实验室手册和原始出版物。在这方面，适用于在下文中描述的方法和组合物的技术描述于Current Protocols in Immunology,Coligan等人,Eds.,GreenPublishing Associates and Wiley-Interscience,John Wiley and Sons,New York(1991)，其以其整体引用结合在此，包括补充文件。
可通过已知技术产生鉴定特定表位的抗体片段。例如，Fab和F(ab')2片段可为使用例如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab')2片段)等酶重组产生的或通过免疫球蛋白分子的蛋白水解切割产生的。F(ab')2片段包含可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。这类片段足以用于例如涉及将免疫球蛋白的免疫特异性部分缀合至例如放射性同位素等检测试剂的免疫诊断过程。
在一些实施方案中，本文描述的抗体包含抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一实施方案中，本文所描述的抗体包括来自一个或多个抗体分子的至少两个CDR。在另一实施方案中，本文描述的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少三个CDR。在另一实施方案中，本文描述的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少四个CDR。在另一实施方案中，本文描述的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少五个CDR。在另一实施方案中，本文描述的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少六个CDR。示例性抗体分子包含可包含在本文描述的对象抗体中的至少一个CDR。
本文描述的抗体可通过本领域中已知的用于合成抗体的任何方法来生产，特别地，通过化学合成或如本文所述的重组表达技术。
在一些实施方案中，本文所描述的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物包含合成恒定区，其中一个或多个结构域部分地或完全地缺失(“结构域缺失的抗体”)。在一些实施方案中，相容的修饰的抗体将包含结构域缺失的构建体或变体，其中已去除整个CH2结构域。对于其它实施方案，可由短连接肽取代缺失的结构域以提供可变区的灵活性和运动自由。本领域技术人员将理解，由于CH2结构域对抗体的分解代谢速率的调控性质，此类构建体是特别优选的。结构域缺失的构建体可使用编码IgG1人恒定结构域的载体来获得，参见，例如，国际申请WO02/060955和WO02/096948A2。该载体工程化以缺失CH2结构域并提供表达结构域缺失的IgG1恒定区的合成载体。
在一些实施方案中，本文描述的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物是微型抗体(minibody)。微型抗体可使用本领域描述的方法来制备，参见，例如，美国专利5,837,821或国际申请WO 94/09817。
在一些实施方案中，本文描述的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物包含具有一些或甚至单个氨基酸的缺失或取代的免疫球蛋白重链，只要其允许单体亚基之间的缔和并保持与PNAd的结合即可。例如，在CH2结构域的选定区域中的单个氨基酸的突变可足以实质上减少Fc结合，从而增加PNAd定位。类似地，可期望将控制待调控的效应子功能(例如，补体结合)的一个或多个恒定区结构域的一部分简单地缺失。恒定区的此类部分地缺失可改善抗体的所选特性，同时使与目标恒定区结构域有关的其它所需功能完整。此外，如上所述，所公开的抗体的恒定区可通过增强所得构建体的性质的一个或多个氨基酸的突变或取代来合成。在这方面，可以破坏由保守结合位点(例如，Fc结合)提供的活性，同时基本上维持修饰的抗体的构型和免疫原性特征。仍另一个实施方案包括向恒定区添加一个或多个氨基酸以增强例如效应子功能等期望的特性或提供更多的细胞毒素或糖类附着。在此类实施方案中，可以期望插入或复制源自所选恒定区结构域的特定序列。
本发明还提供了包含本文描述的抗体分子(例如，VH区和/或VL区)的变体(包括衍生物)、基本上由其组成、或由其组成的抗体，其中抗体或其片段免疫特异性地结合PNAd。对本领域技术人员已知的标准技术可用于在编码抗体的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于，导致氨基酸取代的定点诱变和PCR介导的诱变。在一些实施方案中，相对于参考VH区、VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL区、VL-CDR1、VL-CDR2、或VL-CDR3，变体(包括衍生物)编码小于50个氨基酸取代、小于40个氨基酸取代、小于30个氨基酸取代、小于25个氨基酸取代、小于20个氨基酸取代、小于15个氨基酸取代、小于10个氨基酸取代、小于5个氨基酸取代、小于4个氨基酸取代、小于3个氨基酸取代、或小于2个氨基酸取代。可选地，突变可与全部或部分的编码序列随机引入，例如，通过饱和诱变，并且筛选所得突变体的生物活性以鉴定鉴定维持活性(例如，结合PNAd的能力)的突变。
例如，可以仅在抗体分子的框架区中或仅在CDR区中引入突变。引入的突变可以是沉默突变或天然错义突变，例如，对抗体结合抗原的能力的没有影响、或具有较少的影响，事实上，一些这样的突变不会改变任何氨基酸序列。这些类型的突变可有用于优化密码子使用、或改善杂交瘤的抗体生产。在本文其它部分公开了编码本文描述的抗体的密码子优化的编码区。可选地，非天然错义突变可改变抗体结合抗原的能力。大部分沉默突变或天然错义突变的定位可能在框架区中，而大部分非天然错义突变的定位可能在CDR中，尽管这不是绝对的要求。本领域技术人员能够设计并测试具有期望性质例如抗原结合活性没有改变或结合活性没有改变(例如，抗原结合活性改善或抗体特异性改变)的突变分子。在诱变后，编码的蛋白可常规表达，并且编码的蛋白的功能和/或生物活性(例如，免疫特异性结合PNAd的至少一个表位的能力)可使用本文描述的技术或通过本领域中已知的常规修饰技术确定。
结合PNAd的试剂，例如但不限于，本文描述的结合PNAd的抗体可使用任何体内或体外模型来表征。本领域技术人员容易理解，本文描述的结合PNAd的试剂(例如，抗体)可在本文描述的小鼠模型中表征。
III.编码抗体的多核苷酸
本文还提供了编码本文描述的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物的多核苷酸。编码抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物的多核苷酸可由任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸构成，其可为未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。例如，编码抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物的多核苷酸可由以下构成：单链或双链DNA、作为单链区或双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA、和作为单链区或双链区的混合物的RNA、包含DNA和RNA的杂交分子，所述杂交分子可为单链或、更典型地、双链或单链区和双链区的混合物。此外，编码抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物的多核苷酸可由包含RNA或DNA或RNA和DNA二者的三链区构成。编码抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物的多核苷酸还可包含为了稳定性或为了其它目的而修饰的一个或多个修饰的碱基或DNA或RNA主链。“修饰的”碱基包括例如，三酰化碱基和不常见的碱基诸如肌苷。可对DNA和RNA进行各种修饰；因此，“多核苷酸”包括化学地、酶促地、或代谢地修饰形式。
编码源自免疫球蛋白(例如，免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的多肽的非天然变体的分离的多核苷酸可通过以下来产生：将一个或多个核苷酸取代、添加或缺失引入免疫球蛋白的核苷酸序列，使得将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入编码的蛋白质。突变可通过例如定点诱变或PCR介导的诱变等标准技术来引入。在一些实施方案中，在一个或多个非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸取代。
众所周知，RNA可通过标准技术例如异硫氰酸胍提取和沉淀、接着离心或色谱法分离自原始B细胞、杂交瘤细胞或分离自其它转化细胞。期望地，RNA可通过标准技术例如对oligo dT纤维素的色谱法分离自总RNA。合适的技术在本领域中是熟悉的。在一些实施方案中，编码抗体的轻链和重链的cDNA可根据众所周知的方法使用逆转录酶或DNA聚合酶、同时地或分别地制备。PCR可通过基于公开的重链和轻链DNA的氨基酸序列共有恒定区引物或通过更特异性的引物来引发。如上所讨论的，PCR还可用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在该情况中，可通过共有引物或例如人恒定区引物等更大的同源探针来筛选文库。
DNA，通常为质粒DNA，可使用本领域已知的技术分离自细胞，根据例如在涉及重组DNA技术的前述参考文献中详细记载的标准的众所周知是技术来绘制限制性图谱并测序。当然，DNA可在分离过程或随后的分析期间中的任何时间点、根据本发明来合成。
在一些实施方案中，本文提供了分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸、基本上由其组成、或由其组成，其中重链可变区的至少一个CDR或重链可变区的至少两个VH-CDR与来自本文公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2、或VH-CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。可选地，VH的VH-CDR1、VH-CDR2、或VH-CDR3区与来自本文公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2、或VH-CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。因此，根据该实施方案，本文描述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区具有与图5中所示的多肽序列相关的VH-CDR1、VH-CDR2、或VH-CDR3多肽序列。在一些实施方案中，参考VH CDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:3；参考VH CDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:4；和参考VH CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:5。
在一些实施方案中，本文提供了分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸、基本上由其组成、或由其组成，其中VH-CDR1、VH-CDR2、和VH-CDR3区除了任一VH-CDR中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、或十个氨基酸取代以外，具有与图5中所示的VH-CDR1、VH-CDR2、和VH-CDR3组相同的多肽序列。在一些实施方案中，氨基酸取代是保守的。在一些实施方案中，VH CDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:3；VHCDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:4；和VH CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:5。
在另一实施方案中，本文提供了分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸、基本上由其组成、或由其组成，其中轻链可变区的VL-CDR的至少一个或轻链可变区的VL-CDR的至少两个VL-CDR与来自本文公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2、或VL-CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。可选地，VL的VL-CDR1、VL-CDR2、或VL-CDR3区与来自本文公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2、或VL-CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。因此，根据该实施方案，本文描述的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区具有与图5中所示的多肽序列相关的VL-CDR1、VL-CDR2、或VL-CDR3多肽序列。在一些实施方案中，参考VL CDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:8；参考VL CDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:9；和参考VL CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:10。
在另一实施方案中，本文提供了分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸、基本上由其组成、或由其组成，其中VL-CDR1、VL-CDR2、和VL-CDR3区除了任一VH-CDR中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、或十个氨基酸取代以外，具有与图5中所示的VL-CDR1、VL-CDR2、和VL-CDR3组相同的多肽序列。在一些实施方案中，氨基酸取代是保守的。在一些实施方案中，VL CDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:8；VLCDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:9；和VL CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:10。
在另一实施方案中，本文提供了分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸、基本上由其组成、或由其组成，其中VH-CDR1、VH-CDR2、和VH-CDR3区具有与图5中所示的VH-CDR1、VH-CDR2、和VH-CDR3组相同的多肽序列。在一些实施方案中，VHCDR1的氨基酸序列包含SEQ ID NO:3；VH CDR2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:4；和VH CDR3的氨基酸序列包含SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，VH CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:3组成；VH CDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:4组成；和VH CDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:5组成。
在另一实施方案中，本文提供了分离的多核苷酸，其包含编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸、基本上由其组成、或由其组成，其中VL-CDR1、VL-CDR2、和VL-CDR3区具有与图5中所示的VL-CDR1、VL-CDR2、和VL-CDR3组相同的多肽序列。在一些实施方案中，VLCDR1的氨基酸序列是SEQ ID NO:8；VL CDR2的氨基酸序列是SEQ ID NO:9；和VL CDR3的氨基酸序列是SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，VL CDR1的氨基酸序列由SEQ ID NO:8组成；VL CDR2的氨基酸序列由SEQ ID NO:9组成；和VL CDR3的氨基酸序列由SEQ ID NO:10组成。
本领域已知，两个多肽或两个多核苷酸之间的“序列同一性”是通过将一个多肽或多核苷酸的氨基酸或核酸序列与第二个多肽或多核苷酸的序列相比较来确定的。当在本文中讨论时，可使用本领域已知的方法和计算机程序/软件来确定任何特定多肽是否与另一多肽具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性，例如，但不限于，BESTFIT程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575Science Drive,Madison,WI 53711)。BESTFIT使用Smith和Waterman,Advances in Applied Mathematics2(1981),482-489的局部同源性算法以发现两个序列之间的最佳同源性片段。当使用BESTFIT或任何其它序列比对程序来确定特定序列是否与本文描述的参考序列(例如，本文描述的抗体或其抗原结合片段)可以例如95％的同一性时，当然地，设定参数使得覆盖参考多肽序列的全长来计算同一性百分比并且允许参考序列中多至氨基酸总数的5％的同源性空位。
在一些实施方案中，多核苷酸包含具有表4中显示的抗PNAd抗体的VH或VL区的多核苷酸序列的核酸、基本上由其组成、或由其组成。在这方面，本领域技术人员容易地理解，编码至少轻链和/或重链的可变结构域的多核苷酸可编码两条免疫球蛋白链或仅一条免疫球蛋白链的可变结构域。此外，本文提供了包含编码SEQ ID:2的氨基酸序列的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸序列)和/或编码SEQ ID:7的氨基酸序列的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO:6的核苷酸序列)、或由其组成的多核苷酸。在具体实施方案中，本文提供了包含编码SEQ ID:2的氨基酸序列的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸序列)、或由其组成的多核苷酸。在另一具体实施方案中，本文提供了包含编码SEQ ID:7的氨基酸序列的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO:6的核苷酸序列)、或由其组成的多核苷酸。
在一些实施方案中，本文提供了分离的多核苷酸，其包含编码与参考重链VH具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％或95％的同一性的免疫球蛋白重链可变区的核酸、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，参考重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:2。
在一些实施方案中，本文提供了分离的多核苷酸，其包含编码与参考轻链VL具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％或95％的同一性的免疫球蛋白轻链可变区的核酸、基本上由其组成、或由其组成。在一些实施方案中，参考轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID NO:7。
本文还提供了本文描述的多核苷酸的片段，如其它部分所描述的。另外，也包含了编码如本文所述的融合多核苷酸、Fab片段或其它变体的多核苷酸。
多核苷酸可通过本领域已知的任何方法来生产或制备。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，则编码抗体的多核苷酸可从化学合成的寡核苷酸组装，例如，如Kutmeier等人,BioTechniques 17(1994),242中所述，简而言之，其涉及含有编码抗体的序列的部分的重叠寡核苷酸的合成、退火并连接这些寡核苷酸、然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
可选地，编码抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物的多核苷酸可从来自合适的来源的核酸产生。如果不可获得含有编码特定抗体的核酸的克隆，但抗体分子的序列是已知的，则编码抗体的核酸可以是化学合成的或通过使用可杂交至序列的3’和5’端的合成引物的PCR扩增、或通过使用对特定基因序列为特异性的寡核苷酸探针的克隆以鉴定例如编码抗体的cDNA文库的cDNA克隆以获得自合适的来源(例如，抗体cDNA文库、或从例如选择以表达抗体的杂交瘤细胞等表达PNAd特异性抗体的任何组织或细胞产生的cDNA文库、或从例如选择以表达抗体的杂交瘤细胞等表达PNAd特异性抗体的任何组织或细胞分离的核酸、优选polyA+RNA)鉴定。然后使用本领域众所周知的任何方法可将由PCR产生的扩增的核酸克隆至可复制的克隆载体中。
一旦确定了抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物的核苷酸序列或相应的氨基酸序列，可使用本领域众所周知的用于操作核苷酸序列的方法来操作其核苷酸序列，例如，重组DNA技术、定点诱变、PCR等(参见，例如，描述于Sambrook等人,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)和Ausubel等人,eds.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1998)中的技术，二者以其整体引用结合在此)，以产生具有不同氨基酸序列例如产生氨基酸取代、缺失、和/或插入的抗体。
IV.抗体多肽的表达
在操作分离的基因材料以提供本文描述的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物后，编码抗体的多核苷酸通常插入在表达载体中以引入至可用于产生期望的量的抗体的宿主细胞。本文描述了抗体、或其片段、衍生物或类似物的重组表达，例如结合靶标分子的抗体的重链或轻链。一旦已经获得编码本文描述的抗体分子或抗体的重链或轻链、或其部分(优选含有重链或轻链可变结构域)的多核苷酸，通过使用本领域众所周知的技术的重组DNA技术产生用于生产抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达含有编码核苷酸序列的抗体的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可以使用本领域技术人员已知的方法以构建含有抗体编码序列和合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术、和体内基因重组。因此，本文提供了包含可操作地接至启动子的编码本文描述抗体分子、或其抗原结合片段、或其重链或轻链、或重链或轻链可变结构域的核苷酸序列。此类载体可包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见，例如，国际申请WO 86/05807和WO 89/01036；和美国专利号5,122,464)，并且抗体的可变结构域可克隆至这样的载体用于表达完整重链或轻链。
本文使用的术语“载体”或“表达载体”是指根据本文描述的方法用作引入宿主细胞并在宿主细胞中表达期望的基因的运载体的载体。本领域技术人员已知，可从由质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒组成的组容易地选择这类载体。通常，本文描述的载体将包括选择标志物、合适的限制性位点以促进期望基因的克隆、以及进入真核或原核细胞和/或在真核和原核细胞中复制的能力。可采用许多的表达载体系统。例如，一类载体利用源自动物病毒例如牛乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA元件。其它涉及具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统的使用。此外，可通过引入允许选择转染的宿主细胞的一种或多种标志物来选择已将DNA整合至其染色体的细胞。标志物可为免疫缺陷型宿主提供原营养、提供杀生物剂耐性(例如，抗生素)或对例如铜等重金属的耐性。选择性标志物基因可直接连接至待表达的DNA序列、或通过共转化引入相同的细胞。为了优化mRAN的合成，还需要额外的元件。这些元件可包括信号序列、剪接信号、以及转录启动子、增强子、和终止子信号。
在具体实施方案中，克隆的可变区基因可与如上所讨论的重链和轻链恒定区基因(例如，人重链和轻链恒定区基因)一起插入表达载体。可以使用能够在真核细胞中引起表达的任何表达载体。合适的载体的实例包括但不限于，质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、和pZeoSV2(可获得自Invitrogen,San Diego,CA)、和质粒pCI(可获得自Promega,Madison,WI)。通常，如果免疫球蛋白重链和轻链是常规实验，例如通过机器人系统来进行，则筛选大量转化的细胞表达适当高水平的那些。在美国专利号5,736,137和5,658,570中还教导了载体系统，其各自以其整体引用结合在此。该系统提供高水平表达，例如，>30pg/细胞/天。其它示例性载体系统公开于，例如，美国专利号6,413,777。
在其它实施方案中，本文描述的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可使用例如美国专利申请公开号2003-0157641 A1中公开的那些等多顺反子构建体来表达，所述文献以其整体引用结合在此。在这些表达系统中，例如抗体的重链和轻链等多个目标基因产物可产生自单个多顺反子构建体。这些系统有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)以提供相对高水平的抗体。相容IRES序列公开于美国专利号6,193,980，其也结合在此。本领域技术人员将理解，此类表达系统可用于有效产生全范围的本申请中公开的抗体。
更具体地，一旦已制备编码抗体的单体亚基的载体或DNA序列，表达载体可引入合适的宿主细胞。可通过本领域技术人员众所周知的各种技术来完成质粒至宿主细胞的引入。这些包括但不限于，包括使用例如
Figure BDA0003297601240000481
或lipofectamine的脂质体转染的转染、原生质体融合、磷酸钙沉淀、细胞与包膜DNA融合、显微注射、和由完整病毒的感染。通常地，质粒通过标准磷酸钙共沉淀法引入宿主。具有表达构建体的宿主细胞在适合产生轻链和重链的条件下生长，并检测重链和/或轻链蛋白合成。示例性检测技术包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、或荧光激活细胞分选仪分析(FACS)、和免疫组织化学法等。
通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞以产生用于本文描述的方法的抗体。因此，本文还提供了包括可操作地连接至异源启动子的编码本文描述的抗体或其抗原结合片段、或其重链或轻链的多核苷酸的宿主细胞。在具体实施方案中，为了表达双链的抗体，编码重链和轻链的载体可在宿主细胞中共表达以表达完整的免疫球蛋白分子，如下文中所详述的。
宿主细胞可由本文描述的编码重链衍生多肽的第一载体和编码轻链衍生多肽的第二载体这两种表达载体共转染。两种载体可包含相同的选择性标志物，其可以同等地表达重链和轻链多肽。可选地，可使用其编码重链和轻链多肽二者的单个载体。在这样的情况下，将轻链有利地置于重链之后以避免过量的无毒重链；参见Proudfoot,Nature 322(1986),52；Kohler,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980),2197。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
如本文所用，“宿主细胞”是指其具有使用重组DNA技术构建的且编码至少一种异源基因的载体的细胞。在从重组宿主分离抗体的过程的描述中，除非明确另外指出，否则术语“细胞”和“细胞培养物”可交换使用以表示抗体的来源。换言之，来自“细胞”的多肽的回收可指从离心的整个细胞、或从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物中回收。
各种宿主表达载体系统可用于表达用于本文描述的方法的抗体分子。此类宿主表达系统代表可以产生和随后纯化目标编码序列的载体，但也代表当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本文描述的抗体分子的细胞。这些包括但不限于，例如由重组噬菌体DNA、含有抗体编码序列质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；由含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia))等微生物；由含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；由重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的、或由含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或具有含有源自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)、或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、NSO、BLK、293、3T3细胞)。在一些实施方案中，特别是对于表达完全重组抗体分子，例如大肠杆菌等细菌细胞，和更优选地，真核细胞，用于表达重组抗体分子。例如，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞等哺乳动物细胞，与例如来自人巨细胞病毒的主要立即早期基因启动子元件结合，是抗体的有效表达系统，参见，例如Foecking等人,Gene 45(1986),101；Cockett等人,Bio/Technology 8(1990),2。
用于蛋白表达的宿主细胞系通常是哺乳动物来源的；本领域技术人员被认为具有确定特定宿主细胞系最适于其中待表达期望的基因产物的能力。示例性宿主细胞系包括但不限于，CHO(中国仓鼠卵巢)、DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢系，DHFR缺陷型(minus))、HELA(人宫颈癌)、CVI(猴肾系)、COS(具有SV40 T抗原的CVI的衍生物)、VERY、BHK(幼仓鼠肾)、MDCK、WI38、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾)。在具体实施方案中，宿主细胞系是CHO或293细胞。宿主细胞系通常可获得自商业供应商、美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection)或来自公开文献。
此外，可选择其调控插入的序列的表达、或以期望的特定形式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。此类蛋白质产物的修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)对于蛋白质的功能为重要的。不同的宿主细胞可具有用于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征和特定机制。可选择合适的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白质的正确的修饰和加工。为此，可使用具有用于初级转录本的适当的加工、基因产物的糖基化、和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。
为了重组蛋白的长期、高产量的生产，优选稳定表达。例如，可工程化稳定表达抗体分子的细胞系。而不是使用包含病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可由通过合适的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化(polyadenylation)位点等)控制的DNA、和选择性标志物转化。在引入外源DNA后，可允许工程化细胞在加富培养基中生长1-2天，然后转成选择培养基。重组质粒中的选择性标志物赋予对选择的耐性并允许细胞稳定地将质粒整合至它们的染色体并生长以形成病灶(foci)，继而可克隆和扩展为细胞系。该方法可有利地用于工程化稳定表达抗体分子的细胞系。
可使用各种选择系统，包括但不限于，单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人,Cell11(1977),223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska&Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48(1992),202)、和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人,Cell 22(1980),817)基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。此外，可使用抗代谢抗性作为用于以下基因的选择的基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等人,Natl.Acad.Sci.USA77(1980),357；O'Hare等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981),1527)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981),2072)；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Goldspiel等人,Clinical Pharmacy 12(1993),488-505；Wu和Wu,Biotherapy 3(1991),87-95；Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32(1993),573-596；Mulligan,Science 260(1993),926-932；和Morgan和Anderson,Ann.Rev.Biochem.62(1993),191-217；TIB TECH 11(1993),155-215；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人,Gene 30(1984),147。可使用的重组DNA技术的本领域已知的常规方法描述于Ausubel等人(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1993)；Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,StocktonPress,NY(1990)；和在章节12和13中，Dracopoli等人(eds),Current Protocols in HumanGenetics,John Wiley&Sons,NY(1994)；Colberre-Garapin等人,J.Mol.Biol.150:1(1981)，其以其整体引用结合在此。
抗体分子的表达水平可通过载体扩增来增加，关于综述，参见Bebbington和Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells in DNA cloning,Academic Press,New York,Vol.3.(1987)。当表达抗体的载体系统中的标志物为可扩增时，宿主细胞的培养中存在的抑制剂的水平的增加将增加标志物基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体基因有关，抗体的产生也将增加；参见Crouse等人,Mol.Cell.Biol.3(1983),257。
体外生产允许扩大至提供大量的期望的多肽。用于组织培养条件下的哺乳动物细胞培养的技术是本领域已知的并且包括例如在气升式反应器或在连续搅拌器反应器中均匀悬浮培养，或例如在中空纤维、微胶囊中、在琼脂微珠或陶瓷盒(ceramic cartridge)上固定化或截留细胞培养。如果需要和/或期望的，可通过通常的色谱法例如，凝胶过滤、离子交换色谱法、在DEAD-纤维素上的色谱法或(免疫)亲和性色谱法来纯化多肽的溶液，例如，在合成铰链区多肽的优先生物合成后、或在本文描述的HIC色谱法之前或之后。
编码本文描述的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物的基因也可表达于例如细菌或昆虫或酵母或植物细胞等非哺乳动物细胞中。容易地摄取核酸的细菌包括肠杆菌科的成员，例如，大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的株；芽孢杆菌科，例如，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌属；链球菌属，和流感肝血杆菌。将进一步地理解，当在细菌中表达时，异源多肽通常变为内含体的一部分。必须分离、纯化异源多肽，然后组装成功能性分子。当期望抗体的四价形式时，则亚基将自组装成四价抗体；参见，例如，国际申请WO02/096948。
在细菌系统中，根据所表达的抗体的分子的预期用途，可有利地选择许多表达载体。例如，当产生大量的此类蛋白质时，用于产生抗体分子的药物组合物时，可期望指导容易纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体。这类载体包括但不限于，大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人,EMBO J.2(1983),1791)，其中抗体编码序列可单独地连接至具有lacZ编码区的框架的载体中，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye&Inouye,Nucleic AcidsRes.13(1985),3101-3109；Van Heeke&Schuster,J.Biol.Chem.24(1989),5503-5509)；等。pGEX载体也可用于表达外源多肽作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，此类融合蛋白是可溶的并且可通过吸附和结合至谷胱甘肽-琼脂糖珠基质上、然后通过在游离谷胱甘肽存在下洗脱而容易地从裂解的细胞中纯化。pGEX载体设计为包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，使得克隆的靶基因产物可从GST部分释放。
除了原核生物以外，还可以使用真核微生物。在真核微生物中，最通常使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、或常见的面包酵母，尽管大量的其它均株为通常可获得的，例如，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。为了在酵母属中表达，通常使用例如质粒YRp7(Stinchcomb等人,Nature 282(1979),39；Kingsman等人,Gene 7(1979),141；Tschemper等人,Gene 10(1980),157)。该质粒已包含TRP1基因，其对在色氨酸中缺乏生长能力的酵母的突变株(ATCC No.44076或PEP4-1(Jones,Genetics 85(1977),12))提供选择标志物。trp1损害的存在作为酵母宿主细胞基因组的特征，然后对通过在不存在色氨酸的情况中的生长来提供检测转化的有效环境。
在昆虫系统中，苜蓿尺蠖核型多角体病毒(Autographa californica nuclearpolyhedrosis virus，AcNPV)通常用作载体以表达外源基因。病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。抗体编码序列可单独地克隆至病毒的非必需区域(例如，多角体蛋白基因)并置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制下。
一旦本文描述的抗体已被重组表达，本文描述的全抗体、它们的二聚物、单个轻链和重链、或其它免疫球蛋白形式可根据本领域的标准程序来纯化，包括例如，通过色谱法(例如，离子交换、亲和性，特别是通过蛋白A后对特定抗原的亲和性，和分级柱色谱法(sizing column chromatography))、离心、差异溶解性，例如硫酸铵沉淀，或通过用于纯化蛋白的任何其它标准技术；参见，例如Scopes,"Protein Purification",SpringerVerlag,N.Y.(1982)。可选地，本文所描述的用于增加抗体的亲和性的另一方法公开于美国专利公开2002-0123057 A1。
V.融合蛋白和缀合物
在一些实施方案中，抗体多肽包括通常不与抗体结合的氨基酸序列或一个或多个部分。在下文中更详细描述示例性修饰。例如，本文所描述的单链fv抗体片段可包含柔性连接子序列，或可被修饰以添加功能性部分(例如，PEG、药物、毒素、或标签诸如荧光的、放射性的、酶、核磁、和重金属等)。
本文描述的抗体多肽可包含融合蛋白、基本上由其组成、或由其组成。融合蛋白可以是包含例如具有至少一个靶结合位点和至少一个异源部分、即在自然界中不与其天然连接的部分的免疫球蛋白PNAd结合结构域。氨基酸序列可通常存在于在融合多肽中聚集在一起的单独的蛋白质中，或它们通常可存在于相同的蛋白质中但在融合多肽中以新的排列放置。融合蛋白可例如通过化学合成、或通过产生和翻译其中肽区域以期望的关系编码的多核苷酸来产生。
应用于多核苷酸和多肽的术语“异源的”是指多核苷酸或多肽源自与进行比较的实体的其余部分的实体不同的实体。例如，如本文所用，与抗体或其抗原结合片段、变体或类似物融合的“异源多肽”源自相同物种的非免疫球蛋白多肽、或不同物种的免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽。
如本文中其它地方更详细讨论的，本文描述的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可进一步在N-或C-末端重组融合至异源多肽或化学缀合(包括共价和非共价缀合)至多肽或其它组合物。例如，抗体可重组融合或缀合至在检测分析中用作标签的分子和例如异源多肽、药物、放射性核素、或毒素等效应分子；参见，例如，国际申请WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美国专利号5,314,995；和欧洲专利申请EP 0 396 387。
在一些情况中，抗体或其抗原结合片段缀合至药物。生产此类药物缀合物的方法是本领域已知的并且在本文中描述(参见，例如，下文中实施例7-9)。在一些情况中，药物是免疫抑制药物(对于免疫抑制药物的实例，参见，例如，以下章节“免疫抑制或免疫调节药物”)。在一些情况中，药物是紫杉醇。在一些情况中，药物直接缀合至抗体或其抗原结合片段。在一些情况中，药物通过连接子缀合至抗体或其抗原结合片段。可用于将药物缀合至本文描述的抗体或其抗原结合片段的连接子的实例包括，磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)或马来酰亚胺乙酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(mc-vc-PAB)。在一些情况中，药物共价缀合至抗体或其抗原结合片段。可如下文中实施例部分中所述进行药物与抗体或其抗原结合片段的共价缀合。例如，药物可使用例如戊二醛进行化学修饰以产生羧基基团，然后使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)化学品活化；所得药物优选与抗体或其抗原结合片段(例如，赖氨酸上的那些)上的伯胺反应(即，缀合)。
本文描述的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可由通过肽键或修饰的肽键彼此连接的氨基酸构成、即肽等排体(peptide isosteres)，并且可包含除了20个基因编码的氨基酸以外的氨基酸。抗体可通过例如翻译后加工等自然过程、或通过本领域众所周知的化学修饰技术来修饰。此类修饰在基础课本和更详细的专著以及大量的研究文献中都有很好的描述。修饰可发生在抗体中的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端，或在例如碳水化合物等部分上。应理解，相同类型的修饰可在给定的抗体中的多个位点处以相同或不同的程度存在。此外，给定的抗体可包含许多类型的修饰。例如，作为泛素化的结果，抗体可以是支链的，并且它们可为具有或不具有支链的环状。环状、支链的、和支链的环状抗体可源自翻译后天然加工或可通过合成方法来制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分(heme moiety)的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚定形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移-RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加，例如精氨酸化和泛素化；参见，例如，Proteins-Structure And Molecular Properties,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York第2版,(1993)；PosttranslationalCovalent Modification Of Proteins,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York,pgs.1-12(1983)；Seifter等人,Meth.Enzymol.182(1990),626-646；Rattan等人,Ann.NYAcad.Sci.663(1992),48-62)。
本文还提供了包含抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物、和异源多肽的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白包含具有本文描述的抗体的VH区的任一个或多个的氨基酸序列或本文描述的抗体或其片段或变体的VL区的任一个或多个的氨基酸序列、和异源多肽序列的多肽，基本上由其组成，或由其组成。在另一实施方案中，用于本文所公开的诊断和治疗方法的融合蛋白包含具有抗体、或其片段、变体、或衍生物的VH-CDR的任一个、两个、三个的氨基酸序列、或抗体、或其片段、变体、或衍生物的VL-CDR的任一个、两个、三个的氨基酸序列、和异源多肽序列的多肽，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，融合蛋白包含具有本文描述的抗体、或其片段、衍生物、或变体的VH-CDR3的氨基酸序列、和异源多肽序列的多肽，其中融合蛋白特异性结合PNAd。在另一实施方案中，融合蛋白包含具有本文描述的抗体的至少一个VH区的氨基酸序列和本文所描述的抗体或其片段、衍生物或变体的至少一个VL区的氨基酸序列、和异源多肽序列的多肽。在一些实施方案中，融合蛋白的VH和VL区对应于特异性结合PNAd的单一来源抗体(或scFv或Fab片段)。在仍另一实施方案中，用于本文公开的诊断和治疗方法的融合蛋白包含具有抗体的VH CDR的任一个、两个、三个或多个的氨基酸序列和抗体、或其片段或变体的VL CDR的任一个、两个、三个或多个的氨基酸序列、和异源多肽序列的多肽。在一些实施方案中，两个、三个、四个、五个或多个的VH-CDR(一个或多个)或VL-CDR(一个或多个)对应于本文描述的单一来源抗体(或scFv或Fab片段)。本文还提供了编码这些融合蛋白的核酸分子。
文献中报道的示例性融合蛋白包括T细胞受体(Gascoigne等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987),2936-2940；CD4(Capon等人,Nature 337(1989),525-531；Traunecker等人,Nature 339(1989),68-70；Zettmeissl等人,DNA Cell Biol.USA 9(1990),347-353；和Byrn等人,Nature 344(1990),667-670)；L-选择素(归巢受体)(Watson等人,J.Cell.Biol.110(1990),2221-2229；和Watson等人,Nature 349(1991),164-167)；CD44(Aruffo等人,Cell 61(1990),1303-1313)；CD28和B7(Linsley等人,J.Exp.Med.173(1991),721-730)；CTLA-4(Lisley等人,J.Exp.Med.174(1991),561-569)；CD22(Stamenkovic等人,Cell 66(1991),1133-1144)；TNF受体(Ashkenazi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991),10535-10539；Lesslauer等人,Eur.J.Immunol.27(1991),2883-2886；和Peppel等人,J.Exp.Med.174(1991),1483-1489(1991)；和IgE受体a(Ridgway and Gorman,J.Cell.Biol.115(1991),Abstract No.1448)的融合。
如本文中其它部分所讨论的，本文描述的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可融合至异源多肽以增加多肽的体内半衰期或用于使用本领域已知方法的免疫测定。例如，在一些实施方案中，PEG缀合至本文描述的抗体以增加他们的体内半衰期；参见，例如Leong等人,Cytokine 16(2001),106-119；Adv.in Drug Deliv.Rev.54(2002),531；或Weir等人,Biochem.Soc.Transactions 30(2002),512。
此外，本文描述的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可融合至例如肽等标志物序列以促进它们的纯化和检测。在具体实施方案中，标志物氨基酸序列是六-组氨酸肽(HIS)，例如pQE载体中提供的标签(QIAGEN,Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91311)，其中，许多是商业可获得的。如Gentz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989),821-824中所述的，例如，提供六-组氨酸为了方便融合蛋白的纯化。有利于纯化的其它肽标签包括但不限于，“HA”标签，其对应于源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人,Cell 37(1984),767)和“flag”标签。
可使用本领域众所周知的方法制备融合蛋白；参见，例如，美国专利号5,116,964和5,225,538。可经验地选择进行融合的精确位点以优化融合蛋白的分泌或结合特性。然后，将编码融合蛋白的DNA转染至宿主细胞用于表达。
本文描述的抗体可以非缀合形式使用、或可缀合至各种分子的至少一者，例如，以改善分子的治疗特性、以促进靶标检测、或用于患者的成像或治疗。当进行纯化时，本文描述的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物在纯化前后可为标记的或缀合的。具体地，本文描述的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可缀合至治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药剂、或PEG。
包括常规抗体的免疫毒素缀合物已在本领域中得到广泛描述。毒素可通过常规偶联技术与抗体偶联，或含免疫毒素的蛋白毒素部分可作为融合蛋白产生。可以以相应的方式使用本文描述的抗体来获得此类免疫毒素。此类免疫毒素的说明是由Byers,SeminarsCell.Biol.2(1991),59-70和由Fanger,Immunol.Today 12(1991),51-54描述的那些。
本领域技术人员将理解，取决于所选择的待缀合的试剂，缀合物也可以使用多种技术来组装。例如，具有生物素的缀合物是通过使PNAd结合多肽与例如生物素N-琥珀酰亚胺基酯等生物素的活化酯反应来制备的。类似地，具有荧光标志物的缀合物可在例如本文中列出的那些等偶联剂的存在下制备，或通过与异硫氰酸盐、或异硫氰酸荧光素反应来制备。本文描述的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物的缀合以类似的方式制备。
本文还提供了缀合至诊断剂或治疗剂的本文描述的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物。抗体可用于诊断，例如，证明PNAd相关疾病的存在、指示患PNAd相关疾病的风险、以监测PNAd相关疾病的发展或进展，即，作为用于例如确定给定治疗和/或预防方案的功性的临床检测程序的一部分。通过将抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物偶联至可检测的物质以促进检测。可检测的物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、使用各种正电子发射断层成像的正电子发射金属、和非放射性顺磁性金属离子；对于可缀合至抗体用于诊断学的金属离子，参见，例如，美国专利号4,741,900。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯、或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物性发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素、和水母发光蛋白(aequorin)；和合适的放射性物质的实例包括125I、131I、111In或99Tc。
抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物还可通过将其偶联至化学发光化合物而可检测地标记。然后，通过检测化学反应过程中出现的发光来确定化学发光标签的抗体的存在。特别有用的化学发光标记的化合物的实例为鲁米诺、异鲁米诺、索玛吖啶鎓酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖啶盐和草酸盐。
抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可检测地标记的方法之一是通过将其连接至酶并在酶免疫测定法(EIA)使用连接产物(Voller,A.,"The Enzyme LinkedImmunosorbent Assay(ELISA)"Microbiological Associates Quarterly Publication,Walkersville,Md.,Diagnostic Horizons 2(1978),1-7)；Voller等人,J.Clin.Pathol.31(1978),507-520；Butler,Meth.Enzymol.73(1981),482-523；Maggio,E.(ed.),EnzymeImmunoassay,CRC Press,Boca Raton,Fla.,(1980)；Ishikawa,E.等人,(eds.),EnzymeImmunoassay,Kgaku Shoin,Tokyo(1981)。结合至抗体的酶将与合适的底物，优选显色底物反应，以产生例如可通过分光光度法、荧光法、或通过视觉手段检测的化学部分。可用于可检测地标记抗体的酶包括但不限于，苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、糖化酶和乙酰胆碱酯酶。此外，检测可通过比色法来完成，所述比色法使用酶的显色底物。检测也可以通过目视比较底物的酶促反应程度与类似制备的标准品来完成。
检测还可使用任何各种其它免疫测定法来进行。例如，通过放射性标记抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物，其可以通过使用放射免疫测定法(RIA)来检测抗体(参见，例如，Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques,The Endocrine Society,(1986年3月))，引用其结合在此。可通过使用包括但不限于γ射线计数器、闪烁计数器、或射线自显影法的方法来检测放射性同位素。
还可使用例如152Eu等荧光发射金属、或其它镧系元素来可检测地标记抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物。这些金属可使用例如二乙烯三胺五醋酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合基团附着至抗体。
用于将各种部分缀合至抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物的技术是众所周知的，参见，例如，Arnon等人,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of DrugsIn Cancer Therapy",in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(eds.),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.(1985)；Hellstrom等人,"Antibodies For DrugDelivery",in Controlled Drug Delivery(第2版),Robinson等人(eds.),MarcelDekker,Inc.,pp.623-53(1987)；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents InCancer Therapy:A Review",in Monoclonal Antibodies'84:Biological And ClinicalApplications,Pinchera等人(eds.),pp.475-506(1985)；"Analysis,Results,And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy",in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(eds.),Academic Press pp.303-16(1985),and Thorpe等人,"The Preparation AndCytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates",Immunol.Rev.62(1982),119-158。
如所提及的，在一些实施方案中，可缀合增强例如结合多肽等结合分子的稳定性或功效的部分，例如抗体或其免疫特异性片段。例如，在一些实施方案中，PEG可缀合至本文描述的结合分子以增加它们的体内半衰期。Leong等人,Cytokine 16(2001),106；Adv.inDrug Deliv.Rev.54(2002),531；或Weir等人,Biochem.Soc.Transactions 30(2002),512。
A.含药物的聚合物颗粒
本文还提供了与本文描述的抗体或其抗原结合片段缀合的纳米颗粒或微粒。本文描述的纳米颗粒或微粒可由以下材料制成：(i)生物相容性的，即，当以药学相关量使用时，不会在活体动物中引起显著的不良反应；(ii)可共价连接淋巴细胞归巢粘附分子或本文描述的抗体或其抗原结合片段的特征官能团(feature functional group)，(iii)表现出与其它分子的低非特异性结合，和(iv)在溶液中为稳定的，即，颗粒不沉淀。颗粒可为单分散的(材料的单个晶体，例如每颗粒的金属)或多分散的(多个晶体，例如每颗粒2、3、或4个)。
本领域已知许多生物相容性颗粒，例如有机或无机纳米颗粒或微粒。脂质体、树枝状聚合物、碳材料和聚合物胶束是有机颗粒的实例。也可使用量子点。无机颗粒包括例如Au、Ni、Pt和TiO2纳米颗粒或微粒等金属颗粒。也可使用磁性颗粒，例如具有葡聚糖或PEG分子围绕的Fe2+和/或Fe3+核的10-20nm的球形纳米晶体。胶体金纳米颗粒描述于例如，Qian等人,Nat.Biotechnol.26(1):83-90(2008)；美国专利号7060121；7232474；和美国预授权公开号(U.S.P.G.Pub.No.)2008/0166706。合适的纳米颗粒、和用于构建和使用多功能纳米颗粒的方法讨论于例如anvicens和Marco,Trends Biotech.,26(8):425-433(2008)中。
在一些情况中，颗粒是聚合物颗粒。本领域已知许多适用于生产本文所描述的聚合物颗粒的生物相容性聚合物，例如，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乳酸、聚乙醇酸(polyglycolide)。在具体实施方案中，聚合物颗粒包含PLGA聚合物。在具体实施方案中，聚合物颗粒包含聚乳酸聚合物。在具体实施方案中，聚合物颗粒包含聚乙醇酸聚合物。
在一些实施方案，聚合物颗粒可以是聚(乙二醇)化的(聚乙二醇化)，例如，如描述于美国专利号7291598；5145684；6270806；7348030和其它，以降低血蛋白结合、和/或肝和脾摄入。例如，在一些实施方案中，聚合物颗粒包含聚乙二醇化的PLGA聚合物。在另一实例中，聚合物颗粒包含聚乙二醇化的聚乳酸聚合物。在仍另一实例中，聚合物颗粒包含聚乙二醇化的聚乙醇酸聚合物。聚乙二醇化产生了隐形(stealth-like)结构以避开巨噬细胞的免疫鉴定，由此实现抑制调理作用和增强颗粒在循环中的保留。例如聚乙二醇化等这样的简单的表面改性可将颗粒的循环半衰期从几分钟增加至几小时或几十小时。
在一些实施方案中，聚合物颗粒可附着(连接，例如，共价缀合)至本文描述的抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段可通过聚合物纳米颗粒的聚合物的官能团附着至聚合物颗粒。例如，抗体或其抗原结合片段可缀合至聚合物颗粒。
纳米颗粒或微粒通过官能团(一个或多个)附着(连接)至本文描述的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，纳米颗粒或微粒与包括官能团(一个或多个)的聚合物结合，并且还用于保持金属氧化物彼此分散。聚合物可以是合成聚合物，例如但不限于，聚乙二醇或硅烷、天然聚合物、或合成或天然聚合物的衍生物、或这些的组合。有用的聚合物是亲水的。在一些实施方案中，聚合物“涂层”不是磁性金属氧化物周围的连续膜，而是附着至并围绕金属氧化物的延伸的聚合物链的“网”或“云”。聚合物可包含多糖和衍生物，包括葡聚糖、普鲁兰(pullanan)、羧基葡聚糖、羧甲基葡聚糖、和/或还原羧甲基葡聚糖。金属氧化物可以是彼此接触的一个或多个晶体的集合，或是被聚合物单独截留或围绕。
在其它实施方案中，纳米颗粒或微粒与非聚合物型官能团组合物结合。已知合成不与聚合物结合的稳定的、功能化的纳米颗粒或微粒的方法，这也在本发明的范围内。此类方法描述于，例如，Halbreich等人,Biochimie,80(5-6):379-90,1998中。
在一些实施方案中，本文描述的免疫抑制或免疫调节药物可包封在在纳米颗粒或微粒内，例如混合在纳米颗粒或微粒的涂层内或涂层之下。在一些实施方案中，本文描述的免疫抑制或免疫调节药物可与纳米颗粒或微粒的表面的外部缀合。
i.免疫抑制或免疫调节药物
已将三种典型的免疫抑制药物，环孢素A、雷帕霉素、和他克莫司成功掺入本文描述的含有药物的颗粒中，这显示受控的药物释放和体外T细胞活性的抑制(Azzi,J.,等人,FASEB J 24:3927-3938,2010；Tang,L.,等人,J.Transplantation,2012:896141,2012；Tong,R.和Cheng,J.J.,Macromolecules 45:2225-2232,2012)。
在一些实施方案中，将他克莫司(也称为TAC、FK-509、或藤霉素(fujimycin))掺入本文描述的含有药物的颗粒中。他克莫司是主要在异体器官移植后使用以降低宿主的免疫应答和降低器官排斥的风险的免疫抑制药物。在细胞水平下，他克莫司是可降低由T细胞产生的白细胞介素-2(IL-2)的大环内酯(Liu J,Farmer J,Lane W,Friedman J,Weissman I,Schreiber S,Cell 66(4):807–815,1991)。可掺入至本递送系统的其它合适的免疫抑制或免疫调节药物包括但不限于，霉酚酸酯(mycophenolate,mofetil)、环孢霉素、西罗莫司、芬戈莫德、多球壳菌素、环磷酰胺、皮质类固醇(例如，皮质醇、皮质酮、可的松、或醛固酮)、雷帕霉素、霉酚酸酯(mycophenolate,mofetil)、检查点抑制剂(例如，抗CTLA-4抗体、抗PD1抗体、抗PDL1抗体)、抗炎剂(例如，抗TNF药物，诸如，例如，如阿达木单抗)、化学治疗剂、和单克隆抗体诸如，例如，抗CD3抗体、抗CD25抗体、抗IL6抗体、CTLA-4-Ig、阿达木单抗、抗CD52抗体(例如，阿伦单抗)。在一些实施方案中，紫杉醇掺入本文描述的含药物的颗粒中。在一些实施方案中，免疫抑制或免疫调节药物具有一个或多个羟基或硫醇基，并且可在某些催化剂的存在下起到聚合引发剂的作用。
在一些实施方案中，药物是化学治疗剂。化学疗法可以是，例如，使用对细胞有害的细胞毒素或细胞毒素剂。实例包括紫杉醇、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂包括但不限于，抗代谢药(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟脲嘧啶、氨烯咪胺(decarbazine))、烷化剂(例如，氮芥、硫喷妥苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C、顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类药物(例如，柔红霉素(daunorubicin)(原名道诺霉素(daunomycin))和多柔比星)、抗生素(例如，放线菌素(dactinomycin)(原名放线菌素(actinomycin))、博莱霉素、光辉霉素、和安曲霉素(AMC))、和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。参见，例如，Johnson和Win,Oncoimmunology.2018年3月13日；7(4):e1408744；Chowdhury等人,J InternMed.2018Feb；283(2):110-120；Tang等人,Nature Reviews Drug Discovery 17:854–855(2018)。
ii.含药物的聚合物颗粒的合成
存在各种可制备含药物的纳米颗粒或微粒的方法，但在所有的方法中，结果必须是具有可用于将颗粒连接至本文所描述的抗体或其抗原结合片段的功能性基团的颗粒。
在一些实施方案中，本文描述的免疫抑制或免疫调节药物可包封在纳米颗粒或微粒内，例如混合在纳米颗粒或微粒的涂层内或涂层之下。此类药物包封的颗粒可以使用纳米沉淀法合成，例如，描述于Tang,L.,等人,J.Transplantation,2012:896141,2012，其内容通过引用结合在此。简要地，待递送的药物和聚乙二醇化的聚合物可溶解于合适的有机溶剂中。所得溶液可在剧烈搅拌下滴加至例如水等非溶剂中，以形成聚乙二醇化的药物包封聚合物颗粒。然后可在室温下搅拌颗粒悬浮液以蒸发有机溶剂。可以将颗粒悬浮液的等分试样离心并且可以例如通过反相HPLC分析上清液，以确定药物在颗粒中的掺入效率和负载。然后可例如通过超滤纯化并收集颗粒。任选地，可将例如牛血清白蛋白(BSA)等冻干保护剂添加至颗粒溶液，然后冻干所述颗粒溶液并储存在-20℃下。可通过动态光散射(DLS)和/或扫描电子显微镜(SEM)确定所得颗粒的大小和多分散性。
在一些实施方案中，本文描述的免疫抑制或免疫调节药物可与例如在纳米颗粒或微粒的表面外部缀合。可使用描述于Azzi,J.,等人,FASEB J 24:3927-3938,2010、或在国际申请公开WO 2008/109483中的方法合成此类药物缀合的颗粒，其内容通过引用结合在此。简要地，待递送的药物可在合适的溶剂中与一种或多种环状单体和催化剂混合。药物在开环聚合反应中起到引发剂的作用以形成药物-聚合物缀合物，其中药物与聚合物共价连接。由于药物用作聚合物的引发剂，药物与聚合物的缀合效率非常高，并且药物负载百分比可通过调整单体/引发剂比来控制。然后可将药物-聚合物缀合物和聚乙二醇化聚合物在剧烈搅拌下滴加至例如水等非溶剂中，以形成聚乙二醇化的药物缀合聚合物颗粒。然后，可在室温下搅拌颗粒悬浮液以蒸发有机溶剂。可例如通过超滤纯化和收集颗粒。任选地，可将例如牛血清白蛋白(BSA)等冻干保护剂添加至颗粒溶液，然后冻干所述颗粒溶液并储存在-20℃下。可通过动态光散射(DLS)和/或扫描电子显微镜(SEM)确定所得颗粒的大小和多分散性。
用于开环聚合的合适的单体包括各种环状单体，例如，环状酯、环状碳酸酯、环状硅氧烷、环状磷酸酯、环状肽或氨基酸衍生物、或环状磷烷(phosphazane)。示例性环状单体包括丙交酯或乙交酯。
本文描述的聚合物颗粒可用于递送包含例如羟基或硫醇基等能够引发开环聚合反应的至少一种官能团的任何小分子药物。药物可包含多个这样的聚合引发基团，例如，多个羟基或硫醇基。在一些实施方案中，药物仅包含这类聚合基团的一个。羟基可以是伯、仲、或叔羟基。类似地，硫醇基可以是伯、仲、或叔硫醇基。羟基还可以是酚羟基。在一些实施方案中，药物包含一个或多个非酚羟基。在一些实施方案中，药物包含一个或多个为伯或仲羟基的非酚羟基。在一些实施方案中，药物包含单个非酚羟基。在一些实施方案中，药物包含单个伯或仲羟基。在一些实施方案中，具有一个或多个羟基或硫醇基的免疫抑制或免疫调节药物在某些催化剂的存在下起到聚合引发剂的作用。
可使用多种催化剂以促进含药物的聚合物颗粒的形成。示例性催化剂包括为环状单体的受控活性聚合而开发的多种金属氧化物(M-OR)和醇-金属氧化物(RO-M)(O.Dechy-Cabaret,B.Martin-Vaca,&D.Bourissou,Chemical Reviews 104:6147-6176,2004)。金属氧化物可通过将含羟基的化合物与例如金属-酰氨基化合物等活性金属配合物混合来原位制备(B.M.Chamberlain,M.Cheng,D.R.Moore,T.M.Ovitt,E.B.Lobkovsky,G.W.Coates,J.Am.Chem.Soc.123:3229,2001)。例如，可采用用于丙交酯的聚合的非常活跃的催化剂(BDI)MgN(TMS)2(Chamberlain,2001)。例如(BDI)ZnN(TMS)2等某些Zn催化剂促进快速起始和相对慢的链增长，并且可用作聚合催化剂。Zn介导的丙交酯聚合可产生具有多分散性窄的聚合物。其它有用的催化剂包括Ca和Fe催化剂。由于Mg、Zn、Ca、和Fe是在人体中发现的元素，因此含有这些元素的催化剂比其它含有Al和Sn的活性催化剂具有更好的安全性。示例性的Zn、Mg、Ca、和Fe催化剂，包括描述于WO 2008/109483的有机催化剂。在一些实施方案中，例如(BDI)ZnN(TMS)2等Zn催化剂用于引发含药物的聚合物颗粒。
本文描述的颗粒已显示高药物负载(约50％)和负载效率(98-100％)，无突释效果的良好受控的药物释放动力学和粒径分布非常窄的优异受控的粒径(Tong,R.&Cheng,J.,Angew.Chem.,Int.Ed.47:4830-4834,2008；Tong,R.&Cheng,J.,J.Am.Chem.Soc.131:4744-4754,2009)。
可通过调节反应条件例如通过如美国专利号5,262,176中所述改变温度来控制粒径。也可通过使用离心、超滤、或凝胶过滤分级颗粒来制造均匀粒径材料，如例如美国专利号5,492,814中所述。
本文描述的含药物的聚合物颗粒的大小可在约2nm至约500μm范围。在一些实施方案中，含药物的聚合物颗粒具有约0.01μm至约10μm的范围，例如约0.05μm至约5μm、约0.1μm至约3μm、约1μm至约2.5μm的整体大小。在一些实施方案中，含药物的聚合物颗粒具有约500nm至约5μm范围的整体大小。在一些实施方案中，含药物的聚合物颗粒具有约1μm至约2.5μm范围的整体大小。在一些实施方案中，含药物的聚合物颗粒具有约200nm至约800nm范围的整体大小。在一些实施方案中，含药物的聚合物颗粒具有约2-20nm范围的整体大小并且特别有利于递送至细胞。
在一些实施方案中，可表面修饰本文公开的含药物的聚合物颗粒以提供可用于将颗粒连接至本文描述的抗体或其抗原结合片段的官能团。例如，可根据Albrecht等人,Biochimie,80(5-6):379-90,1998的方法的版本官能化颗粒。二巯基丁二酸可结合颗粒并提供羧基官能团。官能化是指存在可用于将期望的部分附着至颗粒的氨基或羧基或其它反应性基团。
可例如根据Gorman(参见WO 00/61191)的方法制造羧基官能化的纳米颗粒或微粒。羧基官能化颗粒还可通过与强碱中的溴乙酸或氯乙酸反应以附着羧基来从多糖包覆的颗粒制备。此外，羧基官能化颗粒可通过使用例如琥珀酸酐或马来酸酐等试剂将氨基转换为羧基来从氨基官能化的颗粒制备。
还可用高碘酸盐处理颗粒以形成醛基。然后，可使含醛基的颗粒与二元胺(例如，乙二胺或己二胺)反应，这将产生席夫碱(Schiff base)，接着用硼氢化钠或氰基硼氢化钠还原。
还可制造葡聚糖包覆的颗粒并与例如环氧氯丙烷交联。氨的添加将与环氧基反应以产生胺基，参见Hogemann等人,Bioconjug.Chem.2000.11(6):941-6，和Josephson等人,Bioconjug.Chem.,1999,10(2):186-91。
通过使用例如乙二胺或己二胺等水溶性碳化二亚胺和二元胺羧基官能化颗粒，可将羧基官能化颗粒转换为氨基官能化磁性颗粒。
亲和素和链霉亲和素可附着至颗粒用于生物素化的结合部分，例如寡核苷酸或多肽。参见，例如，Shen等人,Bioconjug.Chem.,1996,7(3):311-6。类似地，生物素可附着至颗粒用于亲和素标记的结合部分。
在一些实施方案中，含药物的聚合物颗粒可为聚乙二醇化的，例如，如美国专利号7291598；5145684；6270806；7348030和其它中所述，以降低血蛋白结合、和/或肝和脾摄入。聚乙二醇化产生了隐形结构以避开巨噬细胞的免疫鉴定，由此实现抑制的调理作用和循环中增强的颗粒的保留。例如聚乙二醇化等这样的简单的表面改性可将颗粒的循环半衰期从几分钟增加至几小时或几十小时。
iii.缀合方法
本文描述的含药物的聚合物颗粒与本文描述的抗体或其抗原结合片段缀合。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可通过共价连接而连接至含药物的聚合物颗粒，例如通过分子上的官能团和含药物的聚合物颗粒上的官能团之间的化学键。官能团可以是可用于将期望的部分附着至例如抗体或其抗原结合片段等颗粒的氨基或羧基或其它反应性基团。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段可通过连接子或结合剂附着至含药物的聚合物颗粒。连接子或结合剂可具有末端氨基、羧基、巯基、或磷酸基团。有用的连接子或结合剂的示例性实例包括例如聚乙二醇(PEG)等有机聚合物及其衍生物、蛋白质、和小分子。
VI.使用方法
如上所述，本公开是基于、至少部分地基于具有对表达PNAd的细胞的改善的结合亲和性(实施例6)和改善的阻断T细胞归巢至淋巴结的能力(实施例4)的抗PNAd抗体的开发。施用本文描述的缀合至抗PNAd抗体的药物，除了引起增加的存活时间(实施例8)以外，引起降低的肿瘤生长、降低的肿瘤转移、和降低的肿瘤引流淋巴结纤维化(实施例7)。此外，施用本文描述的缀合至抗PNAd抗体的药物还增加了心脏移植后的存活时间(实施例9)。因此，本文描述的和以下实施例中的抗体-药物缀合物可用于治疗原发性肿瘤和淋巴结中的局部转移和远处转移；抗体的该用途并不是意料之中的，这是因为并不知晓转移性病变是否表达HEV。因此，本公开提供了用于以下的组合物和方法：在有需要的受试者中抑制淋巴细胞介导的免疫应答、在有需要的受试者中治疗自身免疫性糖尿病或延迟自身免疫性糖尿病的进展、在有需要的受试者中治疗淋巴细胞介导的炎症、和在有需要的受试者中治疗表达外周淋巴结地址素(PNAd)的恶性肿瘤或降低表达外周淋巴结地址素(PNAd)的恶性肿瘤的转移。这些方法可包括鉴定有治疗需要的受试者并向受试者施用本文描述的一种或多种组合物。有治疗需要的受试者可例如由医师来鉴定。在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段(或包含抗体或其抗原结合片段的组合物或颗粒(例如，含有药物的颗粒))可用于在有需要的受试者中抑制淋巴细胞介导的免疫应答的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文描述的抗体或其抗原结合片段(或含有抗体或其抗原结合片段的组合物或颗粒(例如，含有药物的颗粒))。在一些实施方案中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段(或含有抗体或其抗原结合片段的组合物或颗粒(例如，含有药物的颗粒))可用于在有需要的受试者中治疗自身免疫性糖尿病或延迟自身免疫性糖尿病的进展的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文描述的抗体或其抗原结合片段(或含有抗体或其抗原结合片段的组合物或颗粒(例如，含有药物的颗粒))。在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段(或含有抗体或其抗原结合片段的组合物或颗粒(例如，含有药物的颗粒))可用于在有需要的受试者中治疗淋巴细胞介导的炎症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文描述的抗体或其抗原结合片段(或含有抗体或其抗原结合片段的组合物或颗粒(例如，含有药物的颗粒))。在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段(或含有抗体或其抗原结合片段的组合物或颗粒(例如，含有药物的颗粒))可用于在有需要的受试者中治疗或降低表达PNAd的恶性肿瘤转移的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文描述的抗体或其抗原结合片段(或包含抗体或其抗原结合片段的组合物或颗粒(例如，含有药物的颗粒))。在一些实施方案中，表达PNAd的恶性肿瘤是淋巴瘤。在一些实施方案中，表达PNAd的恶性肿瘤是癌症。在一些情况中，癌症是乳腺癌。在一些情况中，癌症是原发性肿瘤。在一些情况中，癌症是局部转移。在一些情况中，癌症是淋巴结中的局部转移。在一些情况中，癌症是远处转移(即，远离原发性肿瘤的位置)。
如上所述，本文描述的抗体及其抗原结合片段特别有用于模仿体内淋巴细胞迁移的含药物的聚合物颗粒的开发，并且可将例如免疫抑制或免疫调节药物等药物特异性地递送至发生T细胞激活和T细胞介导的损伤的淋巴组织和慢性炎症的部位。因此，本公开提供了用于在以下治疗或延迟疾病进展的组合物或方法：在有免疫抑制需要的受试者(例如，人)中，例如，用于诸如1型糖尿病或类风湿性关节炎等自身免疫或炎性病症；和在有移植后的免疫抑制需要的受试者(例如，人)中，例如，在心脏或其它器官移植中。本公开还提供了用于在患有癌症(例如，淋巴瘤或乳腺癌)的受试者中治疗、或延迟疾病进展的组合物和方法。本公开还提供了治疗或延迟诸如癌症，例如淋巴瘤等恶性肿瘤进展的方法，其中淋巴细胞归巢过程在肿瘤的散播中起作用，和/或其中恶性肿瘤通过将化学治疗药物递送至淋巴组织来表达PNAd。
这些方法可包括鉴定有治疗需要的受试者和向受试者施用本文描述的一种或多种组合物。可例如由医师鉴定有治疗需要的受试者。
A.自身免疫性糖尿病的治疗方法
1型糖尿病(T1D)的特征是自身反应性T细胞对胰岛中产生胰岛素的β细胞进行自身免疫性破坏(Hoglund,P.,等人,J Exp Med 189:331-339,1999)。自身免疫性糖尿病的发病机理的核心在于，由引流胰淋巴结中抗原呈递细胞将胰岛抗原(islet antigen)呈递给T细胞，从而激活自身反应性T细胞(Roncarolo,M.G.&Battaglia,M.,Nat Rev Immunol 7:585-598,2007)。许多研究表明，胰淋巴结在自身免疫性糖尿病的发病机制中起关键作用(Katz,J.D.,Wang,B.,Haskins,K.,Benoist,C.&Mathis,D.Cell 74:1089-1100,1993；Hoglund,P.,等人,J Exp Med 189,331-339,1999；Turley,S.,Poirot,L.,Hattori,M.,Benoist,C.&Mathis,D.,J Exp Med 198:1527-1537,2003；Turley,S.J.,Lee,J.W.,Dutton-Swain,N.,Mathis,D.&Benoist,C.,Proc Natl Acad Sci U S A 102:17729-17733,2005)。启动后，激活的自身反应性T细胞募集到胰腺，导致胰岛炎。
PNAd途径已显示在NOD小鼠中调节淋巴细胞运输至淋巴组织(Hanninen,A.,Salmi,M.,Simell,O.,Andrew,D.和Jalkanen,S.,Blood 88:934-944,1996；Xu,B.,等人,JExp Med 197:1255-1267,2003；Xu,B.,Cook,R.E.和Michie,S.A.,J Autoimmun.35:124-129,2010)。此外，在炎症状态和例如T1D等自身免疫性疾病中，PNAd在静脉内皮细胞上上调(Michie,S.A.,Streeter,P.R.,Bolt,P.A.,Butcher,E.C.和Picker,L.J.,Am J Pathol143:1688-1698,1993；Mikulowska-Mennis,A.,Xu,B.,Berberian,J.M.和Michie,S.A.,AmJ Pathol 159:671-681,2001；Penaranda,C.和Bluestone,J.A.,Immunity 31:534-536,2009)。已报道，胰岛炎期间的炎症信号和内皮细胞激活对表达PNAd的HEV赋予胰岛内皮形态和特征。因此，据报道胰岛炎的发作与PNAd的胰岛表达相关(Hanninen,A.,Salmi,M.,Simell,O.,Andrew,D.&Jalkanen,S.,Blood 88,934-944,1996；Faveeuw,C.,Gagnerault,M.C.,Kraal,G.和Lepault,F.,Int Immunol 7:1905-1913,1995；Yang,X.D.,等人,ProcNatl Acad Sci U S A 91:12604-12608,1994；Yang,X.D.,等人,J Autoimmun 7:859-864,1994；Faveeuw,C.,Gagnerault,M.C.和Lepault,F.,J Immunol 152:5969-5978,1994；Hanninen,A.,Salmi,M.,Simell,O.&Jalkanen,S.,Diabetes 45:1173-1180,1996；Dong,H.,Burke,S.D.和Croy,B.A.,Placenta 29:201-209,2008)。白细胞与内皮细胞通过粘附分子的相互作用为设计各种策略提供了很好的机会，诸如开发靶向白细胞的运输的抑制剂或抗体(Mackay,C.R.,Nat Immunol 9:988-998,2008)。
本文描述的抗体或其抗原结合片段、或其缀合物可用于将免疫抑制剂选择性递送至胰淋巴结和胰腺以有效抑制自身反应性T细胞和治疗或延迟例如1型糖尿病(T1D)等自身免疫性糖尿病的进展。具有一些胰腺β细胞功能的受试者更可能受益于本治疗方法。此类受试者可例如通过确定受试者中C肽水平高于阈值来鉴定。
B.移植后的免疫抑制
在组织或器官移植后，免疫细胞针对存在于同种异体移植物上的外源性抗原而被激活。激活的免疫细胞可移动至移植的组织或器官并在那里造成损伤。将少量的免疫抑制药物直接递送至免疫细胞被激活的部位可降低它们的激活并增加同种异体移植存活。免疫抑制药物的这种靶向递送还降低了在全身施用大量的免疫抑制药物时所见的毒性。本文描述的组合物是是将免疫抑制剂直接递送至器官移植的部位并增加同种异体移植存活的有用的运载体。
C.淋巴瘤的治疗方法
本文描述的组合物还可用于治疗淋巴瘤，例如，表达PNAd的淋巴瘤。淋巴细胞归巢过程已知在一些肿瘤的散播中起作用。例如，非霍奇金淋巴瘤(NHL)的散播是由淋巴细胞归巢程序介导的(Pals S.T.,de Gorter D.J.J.,和Spaargaren M,Blood 110(9):3102-3111,2007)。可由本文公开的组合物治疗的其它示例性淋巴瘤包括小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤(BL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、例如皮肤T细胞淋巴瘤(CLCL)等皮肤淋巴瘤、例如肠道T细胞淋巴瘤(ITL)等肠道淋巴瘤、淋巴结T细胞淋巴瘤(nodal T-cell lymphoma)、肠道相关淋巴组织或皮肤中发生的淋巴结外淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、粘膜相关的淋巴组织(MALT)的B细胞淋巴瘤、原发性滤泡淋巴瘤(FL)、B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、和毛细胞白血病(HCL)。
在一些实施方案中，本文描述的抗体或其抗原结合片段缀合物用于治疗或延迟表达PNAd的淋巴瘤的进展。
VII.药物组合物
可将治疗有效量的一种或多种本文描述的抗体或其抗原结合片段、或其缀合物掺入至适合于递送至例如人等受试者的药物组合物中。这类组合物通常包括抗体或其抗原结合片段、或其缀合物和药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何及所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。已知这样的介质和试剂用于药学活性物质的用途。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则此类介质可用于本文描述的组合物中。也可将补充活性化合物掺入组合物中，例如，配体降解抑制剂。
药物组合物可配制成与其预期的施用途径相容。用于肠胃外、皮内、或皮下施用的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或尼泊金甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。可由酸或碱调节pH，例如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可包封在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
适于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(在那里水溶性的)或分散体和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、CREMOPHOR ELTM(蓖麻油聚氧乙烯醚；BASF,Parsippany,NJ)、或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况中，组合物必须为无菌的并且应为存在容易注射的程度的液体。在制造和储存条件下必须为稳定的，并且必须能够防止细菌和真菌等微生物的污染作用。载体可为溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)、及其合适的混合物。适当的流动性可例如通过使用例如卵磷脂等包衣、通过在分散的情况下保持所需的粒径和通过使用表面活性剂来保持。可通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如，尼泊金类、氯丁醇、酚、抗坏血酸、和硫柳汞(thimerosal)等防止微生物的作用。在许多情况中，优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖、诸如甘露醇、山梨醇等多元醇、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
无菌可注射溶液可通过将所需量的组合物(例如，本文描述的试剂)掺入具有上述列举的一种或组合的适当溶剂中，根据需要，然后过滤除菌来制备。通常，通过将活性成分混入含有基本分散介质和来自上述列举的那些所需的其它成分的无菌载体中，来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何其它期望的成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可封装在明胶胶囊或压制成片剂。出于口服治疗施用的目的，活性化合物可与赋形剂混合并以片剂、锭剂、或胶囊剂的形式使用。口服组合物还可使用液体载体制备用于作为漱口水，其中，液体载体中的化合物经口施用并漱口和吐出或吞下。可包含药学上相容的结合剂、和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、和锭剂等可包含任何以下成分、或类似性质的化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖，崩解剂，例如海藻酸、PRIMOGELTM(羧甲淀粉钠)、或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或STEROTESTM；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或调味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯、或橙风味。
还可通过经粘膜或经皮方法来全身施用。对于经粘膜或经皮施用，在制剂中使用适于待渗透屏障的渗透剂。这类渗透剂通常是已知，并且包括例如用于经粘膜施用的去污剂、胆汁盐、和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可通过使用鼻喷雾剂或栓剂来实现。对于经皮施用，将活性化合物配制成本领域公知的软膏(ointment)、油膏(salve)、凝胶、或乳膏。
在一些实施方案中，活性化合物(例如，抗体或其抗原结合片段、或其缀合物)与保护化合物免于从身体快速消除的载体一起制备，例如，控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯(polyorthoester)、和聚乳酸。此类制剂的制备方法对于本领域技术人员是显而易见的。材料还可商业获得自Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc.。脂质体悬浮液还可用作药学上可接受的载体。可根据本领域技术人员已知的方法制备这些，例如，如描述于美国专利号4,522,811。
药物组合物可与用于施用的说明一起包含在容器、包装、或分配器中。在一方面，可包含药物组合物作为试剂盒的一部分。
通常，用于施用药物组合物的剂量有利于预防和/或治疗的预期目的，而无不期望的副作用，例如毒性、刺激或过敏反应。尽管个体需求可变化，但制剂的有效量的优选范围的确定在本领域技术范围内。可容易地从动物研究中推测人剂量(Katocs等人,Chapter27In:“Remington's Pharmaceutical Sciences”,第18版,Gennaro,ed.,Mack PublishingCo.,Easton,Pa.,1990)。通常，可由本领域技术人员调节的提供有效量的制剂所需的剂量将取决于多个因素而变化，包括受试者的年龄、健康、身体状况、体重、疾病或病症的类型和程度、治疗频率、同步治疗的性质，根据需要，和期望的效果(一个或多个)的性质和范围(Nies等人,第3章,In:Goodman&Gilman's“The Pharmacological Basis ofTherapeutics”,第9版,Hardman等人,eds.,McGraw-Hill,New York,N.Y.,1996)。
VIII.施用
一种或多种本文描述的组合物的治疗有效量可通过标准方法来施用，例如通过一种或多种施用途径，例如通过美国食品和药物管理局(FDA；参见，例如万维网地址fda.gov/cder/dsm/DRG/drg00301.htm)目前批准的一种或多种施用途径，例如，口服、局部、粘膜、或肠胃外，例如静脉内或肌内。
IX.试剂盒
本发明还包括用于本文描述的方法的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括一个或多个剂量的本文描述的组合物。用于诱导方案和维持方案的组合物、形状、和剂型类型将取决于受试者的需求而改变。例如，剂型可为肠胃外剂型、口服剂型、延迟或控释剂型、局部、和粘膜剂型，包括其任何组合。
在具体实施方案中，试剂盒可在包装或容器中包含以下的一个或多个：(1)一个或多个剂量的本文描述的组合物；(2)一种或多种药学上可接受的佐剂或赋形剂(例如，药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、立体异构体、或包合物)；(3)用于剂量的施用的一种或多种载体；(5)用于施用的说明。还可使用其中组分(1)-(5)的两个或更多个、包括全部发现于相同容器中的实施方案。
当提供试剂盒时，包含的组合物的不同组分可包装在单独的容器中并在使用即刻之前混合。这样单独地包装组分可允许长期储存而不损失活性组分的功能。当在特定试剂盒中包含多于一种的生物活性剂(例如，抗体或其抗原结合片段或其缀合物)时，生物活性剂可为(1)单独包装并在使用即刻之前与合适的(类似或不同，但相容的)佐剂或赋形剂分别混合，(2)包装在一起并在使用即刻之前混合在一起，或(3)单独包装并在使用即刻之前混合在一起。如果所选化合物(例如，抗体或其抗原结合片段、或其缀合物)在混合后将保持稳定，化合物可在使用之前的时间混合而不是使用的即刻之前，包括，例如，分钟、小时、天、月、年、和制造时间。
包含在特别是本发明的试剂盒中的组合物可在任何类型的容器中提供，使得最佳保存不同组分的寿命并不被容器的材料吸收或改变。用于这些容器的合适的材料可包括，例如，玻璃、有机聚合物(例如，聚碳酸酯和聚苯乙烯)、陶瓷、金属(例如，铝)、合金、或通常采用以保持类似试剂的任何其它材料。示例性容器可包括但不限于，试管、小瓶(vial)、烧瓶、瓶(bottle)、和注射器等。
如上所述，试剂盒可与说明性材料一起提供。这些说明可为打印的和/或可以作为电子可读媒介来提供，但不限于，例如，软盘、CD-RO、DVD、Zip盘、录像带、录音带、和闪存记忆装置。可选地，说明可为互联网网页上公开的或作为电子邮件分发至用户。
实施例
在以下实施例中进一步描述本发明，以下实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实施例1：MHA112单克隆抗体(mAb)识别小鼠和人中的HEV
由表达修饰有唾液酸化路易斯X(sLeX)型聚糖的CD34的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系免疫缺乏外周淋巴结血管地址素(PNAd)的两只GlcNAc6ST1/2/4三重敲除(KO)小鼠。通过HEV免疫荧光染色来鉴定MHA112单杂交瘤克隆。收集MHA112杂交瘤培养物的上清液并用于染色小鼠淋巴结(LN)和人扁桃体切片。图1A显示由MHA112杂交瘤上清液识别的、小鼠LN的高内皮细胞微静脉(HEV)结构的低放大率图像。高放大率图像(图1B)显示MHA112染色的小鼠和人HEV结构。
实施例2：MHA112 mAb分型
然后，进行分型酶联免疫吸附试验(ELISA)以鉴定MHA112 mAb的免疫球蛋白(Ig)形式。如图2A中所示，MHA112上清液在抗IgM包被的孔中为阳性的。这些数据表明MHA112同种型为小鼠IgM。
实施例3：MHA112 mAb缀合的NP至LN的运输
MECA79是识别内皮微静脉—PNAd上的所有已知L-选择素配体的单克隆配体，包括CD34、GlyCAM-1、和MAdCAM-1的子集(Hemmerich,S.,Butcher,E.C.&Rosen,S.D.,J Exp Med180,2219-2226,1994)。通过使用胶原酶分散的肠系膜的和外周淋巴结基质的元件作为免疫原并基于外周淋巴结HEV的选择性染色的选择来生产MECA79(Streeter等人,J.Cell.Biol.107:1853-1862,1988)。
将MHA112缀合的、MECA79缀合的和非缀合的颗粒(负载有IR800染料)静脉注射至小鼠。注射后24小时分析显示与注射有非缀合的IR800-NP的小鼠相比，MHA112-NP和阳性对照MECA79-NP组的LN中的高信号(图3A)。然后染色腋窝LN的切片以评价注射后24小时NP的内部LN分布。细胞核由DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)染为蓝色。使用MECA79 mAb将PNAd染为绿色，NP可视为红色。在24小时中，MECA79-NP和MHA112-NP定位在HEV周围。在注射有非靶NP的小鼠的LN中检测到显著较少的NP(图3B)。MHA112-NP至LN的运输与MECA79-NP相当，突出了MHA112 mAb在有效运输NP至LN中的特异性。
实施例4：MHA112 mAb阻断T细胞归巢至LN
为了测试MHA112 mAb是否可体内阻断T细胞归巢至LN，由异硫氰酸荧光素(FITC)荧光染料标记T细胞并转移至空白小鼠(
Figure BDA0003297601240000771
mice)，并且在19小时后评价它们的分布。MHA112(抗HEV)降低进入腋窝(Axi)、腹股沟(Ing)和臂(Bra)LN的转移的T细胞的数量超过25％(图4)。此外，在MHA112的存在下，进入肠系膜LN的T细胞的数量也降低PBS对照的约12％(图4)。相反地，MECA79不降低进入腋窝、腹股沟、臂、或肠系膜LN的转移的T细胞的数量(图4)。在三组中，进入脾脏的标记的T细胞未改变(图4)。这些数据表明，MHA112 mAb在HEV中与T细胞分享结合位点并体内阻断T细胞归巢。与MECA79抗体相比，MHA112 mAb在阻断T细胞归巢方面显著更好。
实施例5：MHA112 mAb序列
图5中示出MHA112重链和轻链可变区(分别地，VH和VL)的序列并且描绘了框架区(FR1-FR4)和IMGT互补决定区(CDR1-CDR3)。
用于实施例1至5的材料和方法
免疫和抗体分离
由表达修饰有sLeX型聚糖的CD34的CHO细胞系免疫缺乏PNAd的两只GlcNAc6ST1/2/4三重KO小鼠。在第三次免疫后，为了杂交瘤处死小鼠。通过HEV染色筛选约500个单个克隆。鉴定针对小鼠和人HEV的单克隆抗体MHA112。
免疫组织化学
将新鲜的LN包埋在组织冷冻介质中。切出冷冻切片(8μm厚)用于通过荧光共聚焦显微镜的成像。MHA112作为一抗用于组织染色。Alexa Fluor 488缀合的抗小鼠IgM用作二抗。DAPI用于染色细胞核。
ELISA
由山羊抗小鼠IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3(5μg/mL)涂布96孔ELISA板并在4℃下培养过夜。然后，用杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中5％BSA封闭板，并用DPBS+0.05％Tween-20(PBST)洗涤三次。然后，向孔添加MHA112杂交瘤上清液(1:500)，在37℃下培养1小时。用PBST再次洗涤孔，并在37℃下由辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig)(Invitrogen)培养1小时。在用PBST洗涤三次后，用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺处理样品，使用VersaMax酶标仪(microplate reader)(Molecular Devices Corp.)记录450nm处的吸光度。
淋巴结运输
使用硫醇-马来酰亚胺化学品将MECA79和MHA112 mAb缀合至纳米颗粒(NP)的功能性表面。用温和还原剂(三(2-羧乙基)膦(TCEP)，15分钟，室温)预处理MECA79和MHA112 mAb以断裂硫醇基并且立即与NP悬浮液混合。NP上的马来酰亚胺基团与MECA79和MHA112抗体的断裂的硫醇共价缀合。在使用前，在4℃下贮存MECA79-NP和MHA112-NP。8-10周龄C57BL/6J(JAX#000664)小鼠用于生物分布研究。通过眶后注射(retro-orbital injection)静脉内施用样品。使用装配有750-780nm激发滤波器和800nm长通发射滤波器的UVP iBOXExplorer成像显微镜(UVP)研究荧光的MECA79-IR-NP和MHA112-IR-NP的运输。收获了包括腋窝、臂、腹股沟、肾、和肠系膜的多个LN，并使用iBOX成像。
T细胞阻断
从三只C57BL/6小鼠收获脾。制备单细胞悬浮液，根据制造商的说明、使用MACS试剂和柱(Miltenyi Biotech,Bergisch Gladbach,Germany)对细胞进行T细胞阳性富集。对于注射，由CellTracker Green(Thermo Fisher)标记T细胞并在无菌盐水中重悬浮，以100μl每小鼠注射5百万个T细胞。在T细胞注射前2小时，以200μl每小鼠腹腔内(i.p.)施用200μg阻断抗体MHA112和MECA79。转移后19小时，安乐死小鼠并处理LN用于流式细胞术。
实施例6：MHA112结合亲和性
为了将MHA112的亲和性与MECA79相比较，进行基于细胞的ELISA。将表达PNAd的CHO细胞(CHO-PNAd)(2x104)涂布在96孔板上并在37℃下培养过夜。在用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤5次后，用1％多聚甲醛(PFA)固定板并由3％牛血清白蛋白(BSA)阻断。从1ng/ml至300μg/ml连续稀释MECA79和MHA112。在PBST中洗涤5次后，以1:10,000稀释添加辣根过氧化物酶-(HRP-)缀合的山羊抗小鼠和抗大鼠二抗，并在室温下培养1小时。通过添加TMB(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺)底物检测结合，并通过添加TMB停止液(N600,Thermo Scientific)停止反应。在450nm处读取吸光度信号。如图6中所示，构建MECA79和MHA112的结合亲和性的拟合曲线，Kd值分别为1.41nM和0.97nM。该数据表明，MHA112的结合亲和性比MECA79更高(30％)(图6)。
实施例7：MHA112-药物缀合降低肿瘤生长、纤维化、和转移
用异氟烷麻醉小鼠并在乳腺中进行皮下注射4T1乳腺肿瘤细胞(1x105个细胞每小鼠)。在移植后9天开始，每隔一天腹腔内施用游离紫杉醇或MHA112-紫杉醇，持续24天。通过电子卡尺每周两次监测肿瘤生长。在移植后5周，MHA112-紫杉醇组的肿瘤大小比对照组(磷酸盐缓冲盐水处理)和游离紫杉醇组分别小约3倍或约2倍(p＝0.0001)(图7)。这些结果显示，MHA112-紫杉醇在治疗乳腺肿瘤的鼠模型中的优势。LN中药物递送的动力学在很大程度上为未知的。引流淋巴结是转移的主要部位。淋巴结中这些转移部位即使由化学治疗药的高剂量全身施用也极难治疗，这通常导致患者方面显著的毒性和不耐受。
MHA112具有一个独特的前提以靶向LN中隐藏的转移性龛。因此，调查了LN中肿瘤群体中MHA112的LN递送的作用。还调查了MHA112能够恢复LN的整体结构的程度。肿瘤已知产生纤维化环境。通过冷冻切片切割4T1肿瘤引流淋巴结(TDLN)并由以下染色：抗HEV(sc-19602,SCBT)、抗LYVE1(ab14917,Abcam)、抗泛细胞角蛋白(C2931,Sigma)、抗胶原I(ab34710,Abcam)、抗胶原IV(ab6586,Abcam)、和抗层粘连蛋白(ab11575,Abcam)。DAPI(VECTASHIELD,Vector Laboratories)用于复染色细胞核。使用EVOSTM FL Auto 2成像系统可视化染色的组织切片。图8中的图像显示，对照组和游离紫杉醇组中的TDLN在HEV和淋巴(LYVE1)区域中扩展。MHA112-紫杉醇TDLN中HEV和淋巴的扩展比其它组少。此外，泛细胞角蛋白表明，与其它组相比，MHA112-紫杉醇组的TDLN中的原发性肿瘤转移也显著降低。还检验了TDLN的结构改变。如图9中所示，胶原I、IV和层粘连蛋白表达水平在MHA112-紫杉醇中较低。该数据表明，MHA112-紫杉醇的TDLN纤维化已得到改善。
实施例8：MHA112-药物缀合在体内转移癌模型中增加存活
为了调查MHA112-紫杉醇对肿瘤转移的作用，将4T1肿瘤细胞系缓慢注射至小鼠肝的门静脉(1x104个细胞每小鼠)。移植后4小时开始，每隔一天腹腔内注射160ng的游离紫杉醇或MHA112-紫杉醇，持续20天。每天监测存活。图10中的存活曲线显示，对照组和游离紫杉醇组的中位生存期(MST)分别为36天和37天。MHA112-紫杉醇组中的MST显著更长(p<0.0001)，MST＝58。
实施例9：MHA112-药物缀合增加pan02胰腺癌模型的存活
用异氟烷麻醉小鼠，并在小鼠的胰腺中缓慢注射Panc02胰腺肿瘤细胞。对于Panc02肿瘤模型，每小鼠注射2百万个细胞(2x106个细胞)。移植后4小时开始，每隔一天腹腔内注射160ng的游离紫杉醇或MHA112-紫杉醇，持续20天。每天监测存活。图11中的存活曲线显示，对照组和游离紫杉醇组的中位生存期(MST)分别为30天和32天。MHA112-紫杉醇中的MST显著更长(p<0.001)，MST＝45。
用于实施例7至9的材料和方法
抗体-药物缀合物
在4mL小瓶中制备戊二酸酐(100mg,Sigma-Aldrich)和紫杉醇(33mg,LClaboratories)，在高真空下干燥24小时并溶解于1mL的吡啶。在Ar气氛下、在室温下搅拌溶液2小时。通过在高真空下去除溶剂来淬灭反应2小时。通过具有梯度溶剂系统(具有0.1％甲酸的15％至75％ACN/H2O，40分钟)的反向HPLC(Phenomenex Luna 5μm C18 250×10.0mm，流速2mL/min，UV 250nm检测)纯化2’-戊二酰紫杉醇。溶解于DMSO(ThermoScientific Fisher)中的2’-戊二酰紫杉醇(0.2mg)在室温下在MES缓冲液(pH 6.0，ThermoScientific Fisher)中由1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，0.4mg，Sigma-Aldrich)和Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)(1.1mg,Thermo ScientificFisher)激活15分钟(最终溶液；10％DMSO中～1mL)。由2-巯基乙醇(1.4μL,Sigma-Aldrich)淬灭EDC 10分钟。立即，溶液的pH由Na2CO3(0.1M,Sigma-Aldrich)增加至～8。溶解于PBS(pH7.4,Corning)的MHA112在室温下与激活的2’-戊二酰紫杉醇混合2小时(MHA112对紫杉醇的1:20摩尔比，最终溶液；10％DMSO)。通过以10,000rpm由离心过滤器(
Figure BDA0003297601240000811
10kDMWCO,Sigma-Aldrich)进行透析15分钟、2次，以去除游离紫杉醇。通过脱盐柱(ZebaTM,7kDMWCO,Thermo Scientific Fisher)进一步纯化溶液。
其它实施方案
应理解，尽管已结合本发明的详细描述说明了本发明，前述描述旨在说明性的而不限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点、和修饰在所附权利要求的范围内。

Claims (48)

1.一种抗外周淋巴结地址素(PNAd)抗体、或其PNAd结合片段，其包括：
(a)重链可变区(VH)，其中所述VH包含以下：包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH互补决定区1(CDR1)、包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH CDR2、和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VH CDR3；和
(b)轻链可变区(VL)，其中所述VL包含以下：包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VLCDR1、包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VL CDR2、和包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VLCDR3。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体、或其PNAd结合片段，其中所述VH包含以下：包含SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列的VH框架区1(FR1)、包含SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列的VH FR2、包含SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列的VH FR3、和包含SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列的VH FR4。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体、或其PNAd结合片段，其中所述VL包含以下：包含SEQ ID NO:15中所示的氨基酸序列的VL FR1、包含SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列的VL FR2、包含SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列的VL FR3、和包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的VL FR4。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体、或其PNAd结合片段，其中所述VH包含SEQID NO:2中所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体、或其PNAd结合片段，其中所述VL包含SEQID NO:7中所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的抗体、或其PNAd结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列和所述VL包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体、或其PNAd结合片段，其为单克隆抗体。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体、或其PNAd结合片段，其为鼠抗体。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体、或其PNAd结合片段，其为嵌合抗体。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体、或其PNAd结合片段，其为人源化抗体。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体、或其PNAd结合片段，其为抗体。
12.根据权利要求11所述的抗体、或其PNAd结合片段，其包含人源重链和轻链恒定区。
13.根据权利要求11或12所述的抗体、或其PNAd结合片段，其包含同种型免疫球蛋白mu(IgM)的重链恒定区。
14.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体、或其PNAd结合片段，其为抗体的PNAd结合片段。
15.根据权利要求14所述的抗体、或其PNAd结合片段，其中所述PNAd结合片段选自由单链Fv片段(scFv)、F(ab')片段、F(ab)片段、和F(ab')2片段组成的组。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的抗体、或其PNAd结合片段，其缀合至试剂。
17.根据权利要求16所述的抗体、或其PNAd结合片段，其中所述试剂为显像剂、细胞毒素剂、或药物。
18.根据权利要求16所述的抗体、或其PNAd结合片段，其中所述试剂为含药物的聚合物颗粒。
19.根据权利要求18所述的抗体、或其PNAd结合片段，其中所述含药物的聚合物颗粒包含免疫抑制或免疫调节药物。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的抗体、或其PNAd结合片段，其中所述缀合为共价缀合。
21.根据权利要求16至19中任一项所述的抗体、或其PNAd结合片段，其中所述缀合是通过连接子的缀合。
22.根据权利要求21所述的抗体、或其PNAd结合片段，其中所述连接子为聚乙二醇。
23.一种包含编码根据权利要求1至15中任一项所述的抗体、或其PNAd结合片段的核酸序列的多核苷酸。
24.一种包含编码重链可变区(VH)的核酸序列的多核苷酸，其中所述VH包含SEQ IDNO:2中所示的氨基酸序列。
25.一种包含编码重链的核酸序列的多核苷酸，其中所述重链包含重链可变区(VH)，其中所述VH包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
26.根据权利要求24或25所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:1中所示的核酸序列。
27.一种包含编码轻链可变区(VL)的核酸序列的多核苷酸，其中所述VL包含SEQ IDNO:7中所示的氨基酸序列。
28.一种包含编码轻链的核酸序列的多核苷酸，其中所述轻链包含轻链可变区(VL)，其中所述VL包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。
29.根据权利要求27或28所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO:6中所示的核酸序列。
30.一种载体，其包含可操作地连接至启动子的根据权利要求24或27所述的多核苷酸。
31.一种载体，其包含可操作地连接至启动子的根据权利要求25所述的多核苷酸。
32.一种载体，其包含可操作地连接至启动子的根据权利要求28所述的多核苷酸。
33.一种载体，其包含可操作地连接至第一启动子的根据权利要求25所述的多核苷酸和可操作地连接至第二启动子的根据权利要求28所述的多核苷酸。
34.一种宿主细胞，其包含根据权利要求24或27所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接至启动子。
35.一种宿主细胞，其包含根据权利要求25和28所述的多核苷酸，其中各多核苷酸可操作地连接至启动子。
36.一种宿主细胞，其包含根据权利要求30所述的载体。
37.一种宿主细胞，其包含根据权利要求31所述的载体和根据权利要求32所述的载体。
38.一种宿主细胞，其包含根据权利要求33所述的载体。
39.一种生产抗外周淋巴结地址素(PNAd)抗体、或其PNAd结合片段的方法，其包括：(a)培养根据权利要求35、37、或38所述的宿主细胞；和(b)从培养物分离抗体。
40.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1至17中任一项所述的抗体或其PNAd结合片段和药学上可接受的载体。
41.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求18或19所述的抗体或其PNAd结合片段和药学上可接受的载体。
42.一种抑制有需要的受试者中淋巴细胞介导的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求40或41所述的药物组合物。
43.一种治疗有需要的受试者中自身免疫性糖尿病或延迟有需要的受试者中自身免疫性糖尿病的进展的方法，向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求40或41所述的药物组合物。
44.一种治疗有需要的受试者中淋巴细胞介导的炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求40或41所述的药物组合物。
45.一种治疗有需要的受试者中表达外周淋巴结地址素(PNAd)的恶性肿瘤或降低有需要的受试者中表达外周淋巴结地址素(PNAd)的恶性肿瘤的转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求40或41所述的药物组合物。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述表达PNAd的恶性肿瘤是淋巴瘤。
47.一种将药物递送至有需要的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求41所述的药物组合物，其中递送至所述受试者的药物是缀合至所述抗体或其PNAd结合片段的所述含药物的聚合物颗粒的药物。
48.根据权利要求47所述的方法，其中将所述药物递送至所述受试者中一个或多个淋巴组织或一个或多个慢性炎症部位。
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