CN101583626A - 抗cd20抗体和使用方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于治疗与CD20相关的疾病的组合物和方法，所述疾病包括淋巴瘤、自身免疫性疾病和移植排斥。组合物包含能够结合位于表达人CD20的细胞表面上的人CD20抗原的抗CD20抗体，其中所述抗体具有增加的补体依赖的细胞介导的细胞毒性(CDC)，这可通过使抗体的可变区内具有至少一个最优化的改造的CDR来获得。组合物还可包括单克隆抗体的抗原结合片段、变体和衍生物、产生这些抗体组合物的细胞系和编码抗体的氨基酸序列的分离的核酸分子。本发明还包括在药学上可接受的载体中的、包含本发明的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体、衍生物的药物组合物和使用这些抗CD20抗体的方法。

Description

抗CD20抗体和使用方法
发明领域
本发明涉及能够结合CD20的抗体、使用所述抗体的方法以及用于治疗与表达CD20的细胞相关的疾病的方法。
发明背景
抗CD20分子(也称为人B-淋巴细胞-限制性-分化抗原或Bp35)是位于前B淋巴细胞和成熟B淋巴细胞上的具有大约35kD的分子量的疏水性跨膜蛋白(Valentine等人(1989)J.Biol.Chem.264(19)：11282-11287；和Einfield等人(1988)EMBO J.7(3)：311-717)。在超过90％的来自外周血或淋巴样器官的B细胞表面上发现CD20，其在早期前B细胞发育过程中表达并且保持直至浆细胞分化。CD20存在于正常B细胞以及恶性B细胞上。特别地，CD20在超过90％的B细胞非非何杰金(氏)淋巴瘤(NHL)上表达(Anderson等人(1984)Blood63(6)：1424-1433)，但未在造血干细胞、前B细胞、正常浆细胞或其他正常组织中发现(Tedder等人(1985)J.Immunol.135(2)：973-979)。
CD20蛋白的85个氨基酸羧基端区域位于细胞质中。该区域的长度与其他B细胞特异性表面结构例如分别具有3、3、28、15和16个氨基酸的相对短的细胞质内区域的IgM、IgD和IgG重链或组织相容性抗原II类的α或β链形成对比(Komaromy等人(1983)NAR11：6775-6785)。在最后61个羧基端氨基酸中，21个是酸性残基，虽然只有2个是碱性的，表明该区域具有强净负电荷。GenBank登录号是NP_690605。
据认为，CD20可能参与调控B细胞的活化和分化过程中的早期步骤(Tedder等人(1986)Eur.J.Immunol.16：881-887)和可用作钙离子通道(Tedder等人(1990)J.Cell.Biochem.14D：195)。
尽管还不明确CD20在促进B细胞的增殖和/或分化中的实际功能，但其提供了抗体介导的疗法的重要靶标，以控制或杀伤参与癌症和自身免疫性病症的B细胞。特别地，CD20在肿瘤细胞例如NHL上的表达使其成为抗体介导的疗法的重要靶标，所述疗法将治疗剂特异性靶向CD20阳性的赘生性细胞。然而，虽然迄今为止获得的结果明确地将CD20确立为免疫疗法的有用靶标，但它们也显示出目前可获得的鼠抗体和嵌合抗体不构成理想的治疗剂。
发明概述
提供了用于治疗与CD20相关的疾病的组合物和方法，所述疾病包括淋巴瘤、自身免疫性疾病和移植排斥。组合物包括能够结合位于表达人CD20的细胞表面上的人CD20抗原的抗CD20抗体，其中所述抗体与利妥昔单抗相比具有增加的补体依赖的细胞介导的细胞毒性(CDC)。组合物还包括单克隆抗体的抗原结合片段、变体和衍生物、产生这些抗体组合物的细胞系以及编码抗体的氨基酸序列的分离的核酸分子。本发明还包括在药学上可接受的载体中的、包含本发明的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体、衍生物的药物组合物。
本文中公开的单克隆抗体具有对于CD20的强亲和力并且特征在于与利妥昔单抗相比提高的CDC功能。本发明的抗体介导对表达CD20的细胞的杀伤。本发明的抗体能够特异性结合在人细胞表面上表达的人CD20抗原并且特征在于在抗CD20重链和/或抗CD20轻链中具有至少一个最优化的互补决定区(CDR)。最优化的CDR已进行了修饰并且包括SEQ ID NO：1-8中任一个所示的序列。公开了在抗CD20重链的至少一个CDR中和轻链的CDR3中具有改变的特定抗体序列。本发明的组合物包含含有至少一个最优化的CDR的、抗CD20抗体和其抗原结合抗体片段、变体和衍生物。
在本发明的一个实施方式中，治疗方法包括对患者施用治疗有效剂量的药物组合物，所述药物组合物包含合适的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。与表达CD20的细胞相关的疾病包括自身免疫性疾病、癌症以及器官和组织移植物排斥。可通过本发明的方法治疗或预防的淋巴瘤包括非何杰金氏淋巴瘤(高度淋巴瘤、中度淋巴瘤和低度淋巴瘤)、何杰金氏病、急性成淋巴细胞性白血病(急性淋巴母细胞白血病)、骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病和成髓细胞性白血病(myeloblasts leukemias)。
使用本发明的方法治疗的特定免疫疾病包括系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、克罗恩病、银屑病、自身免疫性血小板减少性紫癜、多发性硬化症、强直性脊柱炎、重症肌无力和寻常天疱疮。此类抗体还可通过抑制自身免疫反应来用于预防器官和组织移植的排斥，用于通过靶向和杀伤B淋巴细胞来治疗淋巴瘤以及用于以特殊的方式将毒素递送至具有CD20的细胞。
附图概述
图1显示原始人源化鼠抗CD20单克隆抗体(mAb 1097)的H1286可变重链结构域(SEQ ID NO：29)和L373可变轻链结构域(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列。以下划线标示组成各可变结构域的互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)的残基。
图2显示在人源化鼠抗CD20mAb 1097的H1286可变重链结构域的CDR3内(该CDR3称为“271”)进行的产生1236(SEQ ID NO：1)、1237(SEQ ID NO：2)和1238(SEQ ID NO：3)最优化的CDR3的置换(参见实施例1)。271 CDR3序列(SEQ ID NO：30)与称为C2B8(利妥昔单抗)的嵌合鼠/人抗CD20抗体的重链内的可变结构域的CDR3的序列等同。
图3显示最优化的H1569(SEQ ID NO：12)、H1570(SEQ ID NO：13)和H1571(SEQ ID NO：14)可变重链结构域的氨基酸序列。H1569包括最优化的1236 CDR3(SEQ ID NO：1)；H1570包括最优化的1237CDR3(SEQ ID NO：2)，以及H1571包括最优化的1238 CDR3(SEQ IDNO：3)。将这些最优化的可变重链结构域的每一个与L373可变轻链结构域(SEQ ID NO：10)配对来产生最优化的mAb 1236、mAb 1237和mAb1238。分别以下划线标示组成各可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3的残基。
图4显示最优化的H1569(SEQ ID NO：19)、H1570(SEQ ID NO：20)和H1571(SEQ ID NO：21)可变重链结构域的编码序列。
图5显示L373可变轻链结构域的氨基酸(SEQ ID NO：10)和编码(SEQ ID NO：23)序列。分别以下划线标示CDR1、CDR2和CDR3的残基和编码序列。
图6A-6D显示与mAb 271(具有与利妥昔单抗相同的序列)相比，最优化的人源化mAb 1236、mAb1237和mAb 1238的结合特异性的结果。通过荧光微容量测定技术(Flurometric Microvolume AssayTechnology)(FMAT)测定这些最优化的mAb对于表达CD20的CHO细胞(图6A)、CD20+EB1细胞(图6B)、CD20-CHO载体(图6C)和CD20-NSO(图6D)的结合特异性。参见实施例2。NSO是不表达人CD20的小鼠骨髓瘤细胞系。
图7显示测定与mAb 271相比，最优化的mAb 1236、1237和1238的表位识别的鼠2H7阻断测定的结果。最优化的mAb全都识别与mAb271相同的表位。参见实施例2。
图8显示测定与mAb 271相比，最优化的mAb 1236、1237和1238的补体依赖细胞毒性(CDC)的CDC-mAb解离率(off-rate)测定的结果。最优化的mAb具有与对于mAb 271观察到的CDC功能活性相比增加的CDC功能活性。参见实施例2。
图9显示测定与mAb271相比，抗Daudi靶细胞的最优化mAb 1236、1237和1238的依赖抗体的细胞毒性(ADCC)活性的ADCC测定的结果。最优化的mAb具有至少等于对于mAb 271观察到的ADCC活性的ADCC活性。参见实施例2。
图10显示测定与用作同种型对照的mAb271和mAb11相比，抗Ramos(NHL)细胞的最优化mAb 1236、1237和1238的凋亡活性的直接凋亡测定(不依赖于CDC和ADCC活性)的结果。最优化的mAb在诱导凋亡方面与mAb 271一样有效。参见实施例2。
图11显示对于最优化的mAb 1589的H1639可变重链结构域(SEQID NO：16)和L373可变轻链结构域(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列。以下划线标示组成各可变结构域的互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)的残基。
图12分别显示最优化的mAb 1589的重链和轻链内的H 1639可变重链结构域(SEQ ID NO：22)和L373可变轻链结构域(SEQ ID NO：23)的编码序列。分别以下划线标示可变重链和可变轻链结构域的CDR1、CDR2和CDR3的密码子。
图13显示测定与mAb 271、阴性对照抗体mAb 11、最优化的mAb1237和利妥昔单抗
Figure A20078004286600221
相比，最优化的mAb 1588、1589、1590、1652和1692的表位识别的鼠2H7阻断测定的结果。除了阴性对照外，所有受试mAb识别相同的或重叠的表位。参见实施例4。
图14显示测定与对于mAb 271、11和最优化的mAb 1237观察到的CDC活性相比，抗靶Daudi(NHL)细胞的最优化mAb 1588、1589、1590、1652和1692的CDC活性的CDC测定的结果。所有最优化的mAb通常介导比mAb 271介导的更大的CDC功能活性。参见实施例4。
图15A和15B显示测定与对于mAb 271、mAb 11和最优化的mAb1237所观察到的CDC活性相比，抗两个靶B-CLL细胞系、EHEB细胞(图15A)和MEC-1细胞(图15B)的最优化mAb 1588、1589、1590、1652和1692的CDC活性的CDC测定的结果。所有最优化的mAb具有与mAb271相比增加的CDC功能活性。参见实施例4。
图16显示测定与mAb 271和最优化的mAb 1237相比，最优化的mAb 1588、1590、1652和1692的CDC活性的CDC-mAb解离率测定的结果。所有最优化的mAb具有与对于mAb 271所观察到的CDC功能活性相比增加的CDC功能活性。参见实施例4。
图17A和17B显示测定与对于mAb 271、最优化的mAb 1237和阴性对照mAb 11(在这些图中称为“NEG”)相比，抗两个靶NHL细胞系，Daudi细胞(图17A)和WIL2-S细胞(图17B)的最优化mAb 1588、1589、1590、1652和1692的CDC活性的非放射性CDC测定的结果。参见实施例4。
图18A和18B显示测定与对于mAb 271、最优化的mAb 1237和阴性对照mAb 11(在这些图中称为“NEG”)相比，抗两种靶B-CLL细胞系，EHEB细胞(图18A)和MEC-1细胞(图18B)的最优化mAb 1588、1589、1590、1652和1692的CDC活性的非放射性CDC测定的结果。参见实施例4。
图19A和19B显示测定与对于mAb 271、最优化的mAb 1237和阴性对照mAb 11(在这些图中称为“NEG”)所观察到的CDC活性相比，抗两种靶EBV-转化的B细胞系(“正常”B细胞)、SS BLCL细胞(图19A)和MelK BLCL细胞(图19B)的最优化mAb 1588、1589、1590、1652和1692的CDC活性的非放射性CDC测定的结果。参见实施例4。
图20显示测定与mAb 271、最优化的mAb 1237和对照IgG相比，抗Daudi(NHL)细胞的最优化mAb 1588、1589、1590、1652和1692的ADCC活性的ADCC测定的结果。最优化的mAb具有与对于mAb 271观察到的ADCC活性相似的ADCC活性。参见实施例4。
图21显示测定与mAb 271、最优化的mAb 1237和对照IgG相比，抗MEC-1(B-CLL)细胞的最优化mAb 1588、1589、1590、1652和1692的ADCC活性的ADCC测定的结果。最优化的mAb具有与对于mAb 271的所观察到的ADCC活性相似的ADCC活性。参见实施例4。
图22显示测定与用作同种型对照的mAb 271和mAb 11相比，抗Ramos(NHL)细胞的最优化mAb 1236、1237和1238的凋亡活性的直接凋亡测定(不依赖于CDC和ADCC活性)。最优化的mAb在诱导凋亡方面与mAb 271一样有效。参见实施例4。
图23显示测定与mAb 271和最优化的mAb 1237相比，抗Daudi(NHL)细胞的最优化mAb 1588、1589、1590、1652和1692的细胞杀伤活性的全血测定的结果。最优化的mAb具有与mAb 271相比，相等的或更好的对这些细胞的裂解作用。参见实施例4。
图24A和24B显示测定与mAb 271和最优化的mAb 1237相比，抗两种靶B-CLL细胞系，EHEB细胞(图24A)和MEC-1细胞(图24B)的最优化mAb 1588、1589、1590、1652和1692的细胞杀伤活性的全血测定的结果。最优化的mAb具有与mAb 271相比，相等的或更好的对这些细胞的裂解作用。参见实施例4。
图25显示测定与mAb 271和最优化的mAb 1237相比，抗EBV-转化的B细胞系MelK BLCL(“正常”B细胞)的最优化mAb 1588、1589、1590、1652和1692的ADCC活性的ADCC全血测定的结果。最优化的mAb具有与mAb 271相比，相等的或更好的对这些细胞的裂解作用。参见实施例4。
图26显示在Daudi细胞异种移植(xenograft)模型中，测定mAb1589的活性的最优化的人源化抗小鼠CD20单克隆抗体1589的体内测试的结果。mAb 1589抗体有效延长具有Daudi细胞异种移植物的小鼠的存活。参见实施例5。
发明详述
I.定义
要注意，术语“一”或“一个”实体是指一个或多个该实体；例如“一个抗CD20抗体”理解为代表一个或多个抗CD20抗体。这样，术语“一”(“一个”)、“一个或多个”、和“至少一个”可在本文中互换使用。
如此处所使用的，术语“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有的癌前细胞和组织。
术语“癌症”和“癌性的”是指或描述特征在于不受控制细胞生长的哺乳动物中的生理状况。癌症的实例包括但不限于淋巴瘤或白血病。
如此处所使用的，术语“多肽”意欲包括单个“多肽”以及多个“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何链，但不指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于表示两个或更多个氨基酸的链的任何其他术语包括在“多肽”的定义内，术语“多肽”可被这些术语的任一个替代或互换。术语“多肽”也意指多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于糖基化、酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团产生的衍生化、蛋白质水解切割或通过非天然的氨基酸产生的修饰。多肽可来源于天然生物源或通过重组技术产生，但不必从指定的核酸序列翻译而来。其可以以任何方式，包括通过化学合成来产生。
本发明的多肽可以是大约3或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个或者2,000个或更多个氨基酸的大小。多肽可具有确定的三维结构，尽管它们不必具有这样的结构。具有确定的三维结构的多肽称为折叠的，不具有确定的三维结构而采用大量不同的构象的多肽称为非折叠的。如此处所使用的，术语糖蛋白是指与至少一个糖部分偶联的蛋白质，所述糖部分通过氨基酸残基例如丝氨酸残基或天冬酰胺残基的含氧或含氮侧链与蛋白质连接。
“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物意指不存在于其天然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。例如，可从其天然或自然环境中取出分离的多肽。宿主细胞中表达的重组产生的多肽或蛋白质对于本发明的目的被认为是分离的，已通过任何合适的技术分离的、分级分离的或部分或大体上纯化的天然或重组多肽也被认为是分离的。
也包括为本发明的多肽的是上述多肽的片段、衍生物、类似物或变体以及其任何组合。术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”，当指本发明的抗CD20抗体或抗体多肽时，包括保留本发明的相应抗体或抗体多肽的至少一些抗原结合性质的任何多肽。除了本文其他地方描述的特定抗体片段外，本发明的多肽的片段包括蛋白水解片段以及缺失片段。本发明的抗CD20抗体和抗体多肽的变体包括上述片段，还有由于氨基酸置换、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以是天然的或是非天然的。非天然的变体可使用本领域内已知的诱变技术产生。变体多肽可包括保守的或非保守的氨基酸置换、缺失或添加。本发明的抗CD20抗体和抗体多肽的衍生物是已被改变以展示未在本发明的参照抗体或抗体多肽中发现的另外的性质的多肽。实例包括融合蛋白。变体多肽在本文中还可称为“多肽类似物”。如此所使用的，抗CD20抗体或抗体多肽的“衍生物”是指具有一个或多个通过功能侧基的反应化学衍生的残基的受试多肽。“衍生物”也包括包含一个或多个20种标准氨基酸的天然的氨基酸衍生物的那些多肽。例如，4-羟脯氨酸可置换脯氨酸；5-羟赖氨酸可置换赖氨酸；3-甲基组氨酸可置换组氨酸；高丝氨酸可置换丝氨酸；以及鸟氨酸可置换赖氨酸。
术语“多核苷酸”意欲包括单个核酸以及多个核酸，并且指分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包括常规磷酸二酯键或非常规键(例如，酰胺键，例如见于肽核酸(PNA)中的酰胺键)。术语“核酸”是指存在于多核苷酸中的任一种或多种核酸片段，例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸意指已从其天然环境取出的核酸分子，DNA或RNA。例如，载体中包含的编码抗CD20抗体的重组多核苷酸对于本发明的目的被认为是分离的。分离的多核苷酸的其他实例包括保持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的纯化的(部分或大体上)多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明的多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调控元件例如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
如本文中所使用的，“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸的部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不被翻译成氨基酸，但其可被认为是编码区的一部分，但任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等不是编码区的部分。本发明的两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中，例如存在于单个载体中或存在于单独的多核苷酸构建体中，例如存在于单独的(不同的)载体中。此外，任何载体可包含单个编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如单个载体可单独编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区(融合或未融合至编码抗CD20抗体或其片段、变体或衍生物的核酸的)。异源编码区包括但不限于具体的元件或基序，例如分泌信号肽或异源功能结构域。
在某些实施方式中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包含编码多肽的核酸的多核苷酸可包括与一个或多个编码区有效连接的启动子和/或其他转录或翻译控制元件。有效连接是当基因产物例如多肽的编码区与一个或多个调控序列以如将基因产物的表达置于调控序列的影响或控制之下的方式的方式连接时的连接。如果启动子功能的诱导导致编码期望的基因产物的mRNA转录和如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，那么两个DNA片段(例如编码多肽的区域和与其连接的启动子)是“有效连接的”。因此，如果所述启动子能够影响该核酸的转录，启动子区域可与编码多肽的核酸有效连接。启动子可以是只在预先确定的细胞中指导DNA充分转录的细胞特异性启动子。其他转录控制元件，除了启动子以外，例如增强子、操纵子、抑制子和转录终止信号可与指导细胞特异性转录的多核苷酸有效连接。本文中公开了合适的启动子和其他转录控制区。
许多转录控制区对于本领域技术人员来说是已知的。此类转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，例如但不限于来自巨细胞病毒(与内含子-A连接的立即早期启动子)、猿猴病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(例如劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强子片段。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因例如肌动蛋白、热激蛋白、牛生长激素和兔子β-珠蛋白的控制区以及能够在真核细胞中控制基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子(lymphokine)诱导型启动子(例如，由干扰素或白细胞介素诱导的启动子)。
类似地，许多翻译控制元件对于本领域技术人员来说是已知的。此类控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及来源于微小RNA病毒的元件(特别是内核糖体进入位点或IRES，也称为CITE序列)。
在其他实施方式中，本发明的多核苷酸是例如以信使RNA(mRNA)的形式存在的RNA。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可与编码分泌肽或信号肽的其他的编码区连接，所述分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，所述信号肽或分泌前导序列在起始生长蛋白质链外运穿过粗面内质网后被从成熟蛋白质切割。本领域技术人员认识到，由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合至所述多肽的N末端的信号肽，所述信号肽从完全或“全长”多肽切割，从而产生所述多肽的分泌的或“成熟的”形式。在某些实施方式中，使用天然信号肽例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或该序列的功能性衍生物(其保持指导与其有效连接的多肽的分泌的能力)。备选地，可使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可置换为人组织纤溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡糖苷酸酶的前导序列。
本发明涉及某些抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。除非特别地提及全长大小的抗体例如天然的抗体，术语“抗CD20抗体”包括全长大小的抗体以及这样的抗体的抗原结合片段、变体、类似物或衍生物，例如天然的抗体或免疫球蛋白分子或改造的抗体分子或以与抗体分子相似的方式结合抗原的片段。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用。抗体或免疫球蛋白包含至少重链的可变结构域，并且通常包含至少重链和轻链的可变结构域。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构相对详尽地为人理解。参见例如，Harlow等人(1988)Antibodies：A LaboratoryManual(2nd ed.；Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
术语“免疫球蛋白”包括可以通过生物化学方式区分的种类广泛的多肽，这将在下文中进行更详细的讨论。本领域的技术人员知道重链可以分为gamma、mu、alpha、delta或epsilon，(γ、μ、α、δ、ε)，并且其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的性质将抗体的“类别”分别确定为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等)是经过充分表征的，并且已知其赋予了功能特异性。根据本公开，这些类别和同种型的抗体中的每个的修饰形式对于技术人员而言都是易于辨别的，因此它们都在本发明的范围内。所有免疫球蛋白类别清楚地在本发明的范围内，以下讨论总体上针对免疫球蛋白分子的IgG类别。关于IgG，其是标准的免疫球蛋白分子，包含两条分子量为约23,000道尔顿的相同的轻链多肽和两条分子量为53,000-70,000的相同的重链多肽。四条链通常通过二硫键以“Y”的构型连接，其中轻链在“Y”的开口处开始括住重链并延续至整个可变区。
轻链可以分类为kappa或lambda(κ，λ)。每种类别的重链都可以与κ或λ轻链结合。总体而言，当免疫球蛋白是由杂交瘤细胞、B细胞或遗传改造的宿主细胞产生时，轻链和重链以共价方式彼此键合，并且两条重链的“尾”部通过共价二硫键连接或非共价连接彼此键合。在重链中，氨基酸序列是由位于Y构型的叉状末端的N末端开始直至位于各条链底端的C末端。
轻链和重链均被分成结构和功能同源的区域。术语“恒定的”和“可变的”是就功能而言来使用的。在这一点上，应该理解轻链的可变结构域(VL)部分和重链的可变结构域(VH)部分决定了抗原的识别和特异性。相反，轻链的恒定结构域(CL)和重链的恒定结构域(CH1，CH2或CH3)赋予了诸如分泌、经胎盘的灵活性、Fc受体的结合、补体的结合等等的重要的生物性质。根据惯例，随着恒定区结构域与抗体的抗原结合位点或氨基末端的距离越远，该结构域的数量增加。N末端部分为可变区，而C末端部分为恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。
如上文所述，可变区允许抗体选择性地识别并特异性地结合抗原上的表位。换言之，抗体的VL结构域和VH结构域、或者互补决定区(CDR)的亚区相结合，从而形成定义了三维抗原结合位点的可变区。这种四元抗体结构在Y构型的各个臂的末端处形成了抗原结合位点。更具体而言，抗原结合位点是由每个VH和VL链的三个CDR来定义的。在一些情况下，例如衍生自骆驼科物种(camelid species)或者基于骆驼科动物免疫球蛋白改造的某些免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可以仅由重链构成而不具有轻链。例如参见Hamers-Castermanet al.(1993)，Nature 363：446-448。
在天然抗体中，存在于各抗原结合结构域中的6个“互补决定区”或“CDR”是短的、非邻近的氨基酸序列，当所述的抗体在水性环境中呈现其三维构型时，所述的氨基酸序列特异性地定位，从而形成抗原结合结构域。抗原结合结构域中的其余氨基酸(称为“框架”区域)显示为低的分子内可变性。框架区主要采用β片构型，而CDR形成与β片结构相连的环，并且在某些情况下所述的环形成了β片结构的一部分。因此，框架区起到了形成支架的作用，其中所述的支架使得CDR通过链内非共价作用以正确的方向定位。由定位的CDR形成的抗原结合位点定义了与位于免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互补的表面促进了抗体与其同源的表位的非共价结合。对于任何给定的重链可变区和轻链可变区，本领域的任何普通技术人员都可以容易地分别鉴定含CDR区域和框架区的氨基酸，这是因为这些氨基酸已经被精确地定义(参见″Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，″Kabat，E.，et al.(1983)，U.S.Department of Healthand Human Services，；以及Chothia and Lesk，J.(1987)Mol.Biol.，196：901-917，在此，这些文献均以引用方式全文并入本文)。
在本领域使用和/或接受的术语具有两个或多个定义的情况下，本文所用的术语的定义旨在包括了所有的这些含义，除非明确地做出了相反的说明。具体实例为术语“互补决定区”(″CDR″)的使用，该术语描述的是在重链多肽和轻链多肽的可变区内发现的非连续的抗原结合位点。该特定的区域已经由Kabat等人(1983)，U.S.Dept.ofHealth and Human Services，″Sequences of Proteins ofImmunological Interest″和Chothia等人(1987)，J.Mol.Biol.196：901-917描述，在此将上述文献以引用方式并入本文，其中在将该区域彼此对比时，其定义包括氨基酸残基的重叠或亚区。但是，关于抗体或其变体的CDR的定义应用均在本文所定义和使用的术语的范围内。包括了由上述各引用文献所定义的CDR的合适的氨基酸残基均列于下表1中，以用于比较。包括了特定CDR的确切的残基数将随着CDR的序列和大小的变化而改变。根据抗体的可变区的氨基酸序列，本领域的技术人员可以通过常规方式确定哪些残基包含特定的CDR。
表1.CDR定义1
  Kabat   Chothia
  VHCDR1   31-35   26-32
  VHCDR2   50-65   52-58
  VHCDR3   95-102   95-102
  VLCDR1   24-34   26-32
  VLCDR2   50-56   50-52
  VLCDR3   89-97   91-96
1表1中所示的所有CDR定义的编号是根据由Kabat等人提出的编号惯例而来的(参见下文)。
Kabat等人还定义了用于任何抗体的可变结构域序列的编号系统。本领域的普通技术人员可以明确地将该“Kabat编号”系统指定用于任何可变结构域序列，而无需依靠序列本身以外的任何试验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat等人U.S.Dept.of Healthand Human Services，″Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest″(1983)提出的编号系统。除非另作说明，否则关于本发明的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中的特定氨基酸残基位置的编号均是根据Kabat编号系统而来的。
在骆驼科物种中，被称为VHH的重链可变区形成了完整的抗原结合结构域。骆驼科动物VHH可变区与由常规抗体衍生得到的可变区(VH)之间的主要差异包括：(a)与VHH的轻链接触表面相比，VH的轻链接触表面中含有更多的疏水性氨基酸；(b)VHH中的CDR3更长；以及(c)VHH中CDR1和CDR3之间的二硫键频繁形成。
本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括，但不限于：多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化、灵长类源化或嵌合抗体；单链抗体；表位结合片段，例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、由Fab表达库形成的片段；以及抗独特型(抗Id)抗体(例如包括抗本文公开的抗CD20抗体的抗Id抗体；此外例如参见Hudson，PJ.and Couriau，C，Nature Med.9：129-134(2003)；美国专利公开序号20030148409；美国专利序号5,837,242)。例如，scFv分子是本领域已知的并且在例如美国专利5,892,019中有所描述。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以为任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。
包括单链抗体在内的抗体片段可以包含单独的可变区或者可变区与以下的全部或部分的组合：铰链区、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域。此外，本发明还包括抗原结合片段，该片段还包含可变区与铰链区、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域的任意的组合。用于本文所公开的诊断和治疗方法中的抗体或其免疫特异性片段可以来自包括鸟和哺乳动物在内的任何动物来源。优选地，所述的抗体为人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼羊、马或鸡的抗体。在另一个实施方式中，所述的可变区可以condricthoid in origin(例如得自鲨鱼)。如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括由人免疫球蛋白库中或由对于一种或多种人免疫球蛋白转基因的动物中分离得到的抗体，其中所述的动物转基因不表达内源免疫球蛋白，如下文和例如Kucherlapati等人的美国专利序号5,939,598所述。
如本文所用，术语“重链部分”包括衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽包含以下中的至少一种：CH1结构域、铰链(例如上游铰链区、中游铰链区和/或下游铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、或者它们的变体或片段。例如，用于本发明的结合多肽可以包括：包含CH1结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH2结构域的多肽链；包含CH1结构域和CH3结构域的多肽；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH3结构域的多肽链；或者包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在另一个实施方式中，本发明的多肽包括：包含CH3结构域的多肽链。此外，用于本发明的结合多肽可以缺乏CH2结构域的至少一部分(例如CH2结构域的全部或部分)。如上文所述，本领域的普通技术人员都应该理解这些结构域(例如重链部分)可以被修饰使得它们的氨基酸序列由天然的免疫球蛋白分子发生了改变。
在本文所公开的某些抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，多聚体的一条多肽链的重链部分与该多聚体的第二条多肽链的重链部分相同。备选地，本发明的包含重链部分的单体是不同的。例如，各种单体可以包含不同的目标结合位点，从而形成例如双特异性抗体。
用于本文所公开的诊断和治疗方法中的结合多肽的重链部分可以衍生自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可以包含衍生自IgG1分子的CH1结构域、以及衍生自IgG3分子的铰链区。在另一实例中，重链部分可以包含部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG3分子的铰链区。在另一实例中，重链部分可以包含部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG4分子的嵌合铰链。
如本文所用，术语“轻链部分”包含衍生自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。优选地，所述的轻链部分包含至少一个VL或CL结构域。
可以根据抗原(例如抗体可以识别或特异性结合的靶多肽(C20))的表位或部分来描述或详细说明本文所公开的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。可以与抗体的抗原结合结构域特异性相互作用的靶多肽部分为“表位”或“抗原决定簇”。靶多肽可以包含单一表位，但是通常包含至少两个表位，并且可以包含任意数量的表位，这取决于抗原的大小、构型和类型。此外，应该注意靶多肽上的“表位”可以为或者可以包含非多肽元件，例如表位可以包含糖侧链。
认为用于抗原的肽或多肽的最小大小为约4至5个氨基酸。肽或多肽表位优选包含至少7个、更优选为至少9个、最优选为约15至约30个氨基酸。由于CDR以三级结构形式识别抗原性肽或多肽，所以具有表位的氨基酸不需要是相邻的，并且在某些情况下，这些氨基酸甚至可以不在相同的肽链上。在本发明中，被本发明的抗CD20抗体识别的肽或多肽表位包含C20序列的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、更优选地至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、或者约15至约30个相邻或不相邻的氨基酸。
“特异性结合”通常是指抗体通过其抗原结合结构域与表位结合，并且这种结合需要抗原结合结构域与表位之间一定的互补性。根据这个定义，当抗体通过其抗原结合结构域比该抗体与随意的、无关的表位结合得更容易与表位结合时，认为抗体与表位“特异性的结合”。术语“特异性”在本文中用于对某种抗体与某种表位结合的相对亲和力进行定性。例如，对于给定的表位，可以认为抗体“A”比抗体“B”具有更高的特异性；或者与相关的表位“D”相比，可以认为抗体“A”与表位“C”的结合具有更高的特异性。
“优先结合”是指与相关的、相似的、同源的或类似的表位相比，抗体更容易与表位特异性结合。因此，与相关的表位相比，与给定表位“优先结合”的抗体更可能与所述的给定表位结合，尽管该抗体与所述的相关表位可以发生交叉反应。
通过非限定性实例，如果抗体以一定的解离常数(KD)与第一表位结合，而该解离常数小于该抗体与第二表位的KD，则可认为该抗体优先与第一表位结合。在另一非限定性实例中，如果抗体以一定的亲和力与第一表位结合，而该亲和力比该抗体与第二表位的KD小至少一个数量级，则可认为该抗体优先与第一表位结合。在另一非限定性实例中，如果抗体以一定的亲和力与第一表位结合，而该亲和力比该抗体与第二表位的KD小至少两个数量级，则可认为该抗体优先与第一表位结合。
在另一非限定性实例中，如果抗体以一定的解离速率(k(off))与第一表位结合，而该解离速率小于该抗体与第二表位的k(off)，则可认为该抗体优先与第一表位结合。在另一非限定性实例中，如果抗体以一定的亲和力与第一表位结合，而该亲和力比该抗体与第二表位的k(off)小至少一个数量级，则可认为该抗体优先与第一表位结合。在另一非限定性实例中，如果抗体以一定的亲和力与第一表位结合，而该亲和力比该抗体与第二表位的k(off)小至少两个数量级，则可认为该抗体优先与第一表位结合。
可以认为本文所公开的抗体或者抗原结合片段、变体或衍生物以一定的解离速率(k(off))与本文所公开的靶多肽、或其片段或变体结合，其中所述的解离速率小于或等于5×10-2sec-1、10-2sec-1、5×10-3sec-1或10-3sec-1。更优选地，可以认为本发明的抗体以一定的解离速率(k(off))与本文所公开的靶多肽、或其片段或变体结合，其中所述的解离速率小于或等于5×10-4sec-1、10-4sec-1、5×10-5sec-1、10-5sec-1、5×10-6sec-1、10-6sec-1、5×10-7sec-1或10-7sec-1。
可以认为本文所公开的抗体或者抗原结合片段、变体或衍生物以一定的结合速率(k(on))与本文所公开的靶多肽、或其片段或变体结合，其中所述的结合速率大于或等于103M-1sec-1、5×103M-1sec-1、104M-1sec-1或5×104M-1sec-1。更优选地，可以认为本发明的抗体以一定的结合速率(k(on))与本文所公开的靶多肽、或其片段或变体结合，其中所述的结合速率大于或等于105M-1sec-1、5×105M-1sec-1、106M-1sec-1、5×106M-1sec-1或107M-1sec-1。
如果抗体优先结合给定的表位，其程度使得该抗体在一定程度上阻断了参照抗体与该表位的结合，则认为该抗体竞争性地抑制了参照抗体与所述的表位的结合。可以通过本领域中任何已知的方法(例如竞争性ELISA分析)来确定竞争性抑制。可以认为抗体竞争性地抑制了参照抗体与给定表位的结合至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。
如本文所用，术语“亲和力”是指个别表位与免疫球蛋白分子的CDR的结合强度的量度。例如参见Harlow et al.，Antibodies：ALaboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nded.1988)，第27-28页。术语“亲合性”是指免疫球蛋白与抗原群体之间的复合物的总体稳定性，即，免疫球蛋白与抗原形成的混合物的功能性结合强度。例如参见Harlow，第29-34页。亲合性与所述群体中个别免疫球蛋白分子与特定表位的亲和力有关，并且还与免疫球蛋白与抗原的效价有关。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复表位结构(例如聚合物)的抗原之间的相互作用是一种高亲合性。
此外，可以根据本发明的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的交叉反应性来对它们进行描述或详细说明。如本文所用，术语“交叉反应性”是指对一种抗原具有特异性的抗体与第二种抗原发生反应的能力；其为两种不同的抗原性物质之间的相关性的量度。因此，如果抗体除了与诱导其构造的一种表位结合外，还与另一种表位结合，则该抗体具有交叉反应性。交叉反应性表位通常包含与诱导表位相同的许多互补性结构特征，并且在某些情况下，交叉反应性表位实际上可以比原始的表位更合适。
例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，这是因为它们与相关的但却不同的表位结合，例如与参照表位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、以及至少50％的一致性(其可以采用本领域已知的方法和本文所述的方法来计算)的表位。如果抗体不能结合与参照表位的一致性(其可以采用本领域已知的方法和本文所述的方法来计算)小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、和小于50％的表位，则可认为该抗体几乎不具有或不具有交叉反应性。如果抗体不能与某种表位的任何其他类似物、直向同源物或同源物结合，则可认为该抗体对该表位具有“高度特异性”。
此外，可以根据本发明的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物与本发明多肽的结合亲和力来对它们进行描述或详细说明。优选的结合亲和力包括解离常数或Kd小于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M、或10-15M的那些。
本发明的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以是“多特异性的”，例如双特异性的、三特异性的、或者更多的多特异性，这是指其同时识别并结合存在于一个或多个不同的抗原(例如蛋白质)上的两个或更多个不同的表位。因此，不论抗CD20抗体是“单特异性的”或“多特异性的”(例如双特异性的)，均是指与结合多肽发生反应的不同表位的数量。多特异性抗体可以对本文所述的靶多肽的不同表位具有特异性，或者可以对靶多肽以及异源表位(例如异源多肽或固体支持材料)具有特异性。
如本文所用，术语“效价”是指存在于抗CD20抗体中、结合多肽或抗体上的潜在结合结构域(例如抗原结合结构域)的数目。每个结合结构域都特异性地与一个表位结合。当抗CD20抗体、结合多肽或抗体包含多于1个的结合结构域时，每个结合结构域可以特异性地结合相同的表位，对于具有两个结合结构域的抗体而言，其被称为“二价单特异性”；或者每个结合结构域可以与不同的表位结合，对于具有两个结合结构域的抗体而言，其被称为“二价双特异性”。就各种特异性而言，抗体还可以是双特异性且二价的(其被称为“双特异性四价抗体”)。在另一个实施方式中，可以制备四价微型抗体或结构域缺失抗体。
双特异性二价抗体及其制备方法在(例如)美国专利序号5,731,168、5,807,706、5,821,333、以及美国公开序号2003/020734和2002/0155537中有所描述，所有这些文献的公开内容均以引用方式并入本文。双特异性四价抗体及其制备方法在(例如)WO 02/096948和WO 00/44788中有所描述，这两份文献的公开内容均以引用方式并入本文。通常可参见PCT公开WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt et al.，J.Immunol.147：60-69(1991)；美国专利序号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny et al.(1992)，J.Immunol.148：1547-1553。
如之前所述，多种免疫球蛋白类别的恒定区的亚单元结构和三维构型是公知的。如本文所用，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，而术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(大部分的氨基末端)恒定区结构域。CH1结构域与VH结构域相邻，并且在免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
如本文所用，术语“CH2结构域”包括例如采用常规的编号方案由抗体的约第244个残基延伸至第360个残基(第244个残基至第360个残基，Kabat编号系统；第231-340个残基，EU编号系统，参见KabatEA et al.在引文中列举)的重链分子部分。CH2结构域是独特的，这是因为它没有与另一结构域紧密成对。而是，两条N连接的分枝糖链插入在完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。此外，已经清楚证明了CH3结构域由CH2结构域延伸至IgG分子的C末端，并且包含大约108个残基。
如本文所用，术语“铰链区”包括将CH1结构域与CH2结构域连接的重链分子的部分。该铰链区包含大约25个残基，并且是柔性的，由此使得两个N末端抗原结合区域可以独立地移动。铰链区可以被分为三个不同的结构域：上游、中部和下游铰链结构域(Roux et al.(1998)，J.Immunol.161：4083)。
如本文所用，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸具有巯基，该巯基可以与第二个巯基形成二硫键或桥。在大部分天然的IgG分子中，CH1和CL区域通过二硫键连接，并且两条重链在对应于采用Kabat标号系统的239和242的位置(采用EU编号系统的226或229的位置)处通过二硫键连接。
如本文所用，术语“嵌合抗体”被用于指其中免疫反应性区域或位点得自或衍生自第一种物种，而恒定区(其可以是完整的、部分的或是根据本发明修饰的)得自第二种物种的任何抗体。在优选的实施方式中，靶标结合区域或位点来自非人来源(例如小鼠或灵长类动物)而恒定区是人的。
如本文所用，术语“基因工程抗体”是其中重链和/或轻链中的可变区通过以下方式被改变的抗体：通过使用来自特异性已知的抗体的一个或多个CDR的至少部分替代，以及如果需要的话，通过部分框架区替代和序列变化。虽然，CDR可以衍生自与衍生出框架区的抗体相同类别、甚至亚类的抗体，但是应该想到是CDR衍生自不同类别的抗体，并且优选地衍生自来自不同物种的抗体。其中来自特异性已知的非人抗体的一个或多个“供体”CDR被移植到人重链或轻链框架区中的基因工程抗体在本文中被称为“人源化的抗体”。并非必需使用来自供体可变区的完整CDR来替代所有的CDR，以将一个可变区的抗原结合能力转移给另一个可变区。而是仅需要转移保持靶标结合位点的活性所必需的那些残基。
进一步承认，人源化抗体的重链或轻链或两者中的可变结构域内的框架区可以只包含人来源的残基，在该情况下，人源化抗体的这些框架区称为“完全人框架区”。备选地，如果必需保持与CD20抗原适当的结合或增强的结合，则可在人源化抗体的重链或轻链或两者的可变结构域的人框架区的相应位点内对供体可变结构域的框架区的一个或多个残基进行改造。已通过该方式改造的人框架区从而包含人和供体构架残基的混合物，在本文中称为“部分人框架区”。根据例如美国专利5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370中所示的解释，通过进行常规实验或通过试错检测(trial and error testing)来获得功能性改造的或人源化抗体完全在本领域技术人员的能力之内。
例如，可基本上按照Winter和同事(Jones等人(1986)Nature321：522-525；Riechmann等人(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen等人(1988)Science 239：1534-1536)的方法，通过用啮齿目动物或突变的啮齿目动物的CDR序列置换人抗CD20抗体的相应序列来进行抗CD20抗体的人源化。也参见美国专利5,225,539、5,585,089、5,693,761、5,693,762、5,859,205，通过引用合并入本文。所得的人源化抗CD20抗体可在人源化抗体的重链和/或轻链的可变结构域的全长人框架区内包含至少一个啮齿目动物或突变的啮齿目动物的CDR。在一些情况下，人源化抗CD20抗体的一个或多个可变结构域的框架区内的残基由相应的非人(例如，啮齿目动物)残基取代(参见，例如，美国专利5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370)，在该情况下，所得的人源化抗CD20抗体可在重链和/或轻链的可变结构域内包含部分人框架区。
此外，人源化抗体可包括未在受体抗体或在供体抗体中发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能(例如，以获得期望的亲和力)。一般地，人源化抗体将包括几乎所有至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或几乎所有CDR相应于非人免疫球蛋白的CDR，并且所有或几乎所有框架区是人免疫球蛋白序列的框架区。人源化抗体任选也包括免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常人免疫球蛋白的恒定区的至少部分。关于更详细的内容参见Jones等人(1986)Nature 331：522-525；Riechmann等人(1988)Nature 332：323-329；和Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596；通过引用合并入本文。因此，此类“人源化”抗体可包括这样的抗体，在所述抗体中，显著小于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列置换。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能地一些框架区残基被来自啮齿目动物抗体中的相似位点的残基置换的人抗体。参见，例如，美国专利5,225,539、5,585,089、5,693,761、5,693,762、5,859,205。也参见美国专利6,180,370，和国际公开号WO 01/27160，其中公开了人源化抗体和用于产生具有提高的对预先确定的抗原的亲和力的人源化抗体的技术。
如本文所用，术语“适当折叠的多肽”包括如下多肽(例如抗CD20抗体)，其中包含所述多肽的所有功能性结构域都具有明确的活性。如本文所用，术语“非适当折叠的多肽”包括如下多肽，其中所述多肽的至少一个功能性结构域不具有活性。在一个实施方式中，适当折叠的多肽包括通过至少一个二硫键连接的多肽链，相反地，非适当折叠的多肽包括没有通过至少一个二硫键连接的多肽链。
如本文所用，术语“改造的(engineered)”包括通过合成方法(例如通过重组技术、体外肽合成、通过肽的酶或化学偶联或者这些技术的某些组合)对核酸或多肽分子进行操作。
如本文所用，术语“连接的”、“融合的”或“融合”可交换使用。这些术语是指通过包括化学缀合或重组方法在内的任何方法将两个或多个元件或成分连接在一起。“符合读框融合(in-frame fusion)”是指将两个或多个多核苷酸开放阅读框(ORF)连接起来，从而以保持原始ORF的正确翻译阅读框的方式形成连续的并且更长的ORF。因此，重组融合蛋白质是单一一种蛋白质，其包含与原始ORF所编码的多肽相对应的两个或多个节段(这些节段在天然条件下通常不会连接)。虽然由此制得了在整个融合节段中连续的阅读框，但是这些节段可以通过例如符合读框连接体序列以物理地或空间地分离。例如，可以将编码免疫球蛋白可变区的CDR的多核苷酸符合读框融合，但是通过编码至少一个免疫球蛋白框架区或其他的CDR区域的多核苷酸分开，只要“融合的”CDR作为连续多肽的一部分进行共翻译即可。
在关于多肽的内容中，“线性序列”或“序列”是指多肽中由氨基末端至羧基末端方向的氨基酸的次序，其中在所述的序列中彼此相邻的残基在所述多肽的一级结构中是相邻的。
如本文所用，术语“表达”是指如下过程，通过该过程基因产生了生物化学物质，例如多肽。所述的过程包括在细胞内呈现基因功能的任何表现，包括，但不限于基因敲减、以及瞬时表达和稳定表达。表达包括，但不限于将基因转录成信使RNA(mRNA)，以及将该mRNA翻译成多肽。如果最终需要的产物为生物化学物质，则表达包括形成该生物化学物质及其任何前体。基因的表达产生了“基因产物”。如本文所用，基因产物可以为核酸(例如通过基因转录而产生的信使RNA)或多肽(其由转录本经翻译而得到)。本文所述的基因产物进一步包括经过转录后修饰(例如聚腺苷酸化)的核酸或者经过翻译后修饰(例如甲基化、糖基化、加入脂质、与其他蛋白质亚单元连接、蛋白水解切割等)的多肽。
如本文所用，术语“治疗”或“处理”是指治疗性处理、和预防性或防护性措施，其中对受试者预防或减慢(减轻)不需要的生理学变化或紊乱，例如多发性硬化的进展。有益的或所需要的临床效果包括，但不限于缓解症状、减轻疾病的程度、稳定(即，不恶化)疾病的状态、延迟或减慢疾病的进程、改善或减轻疾病的状态、以及消除(部分或全部)疾病的状态，而无论这些是可检测的或不可检测的。与在未接受治疗下所期望的存活相比，“治疗”还可以指延长的存活。需要治疗的对象包括已经患有症状或紊乱的那些、以及倾向于患有症状或紊乱的那些或者其中症状或紊乱有待预防的那些。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指需要诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人，家畜，农业动物，以及动物园、运动竞技或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。
如本文所用，短语例如“受益于施用抗CD20抗体的受试者”和短语“需要治疗的动物”包括如下受试者，例如哺乳动物受试者，该受试者受益于所用的抗CD20抗体的施用(例如用于检测C35多肽(例如用于诊断过程))和/或受益于使用抗CD20抗体的治疗(即，减轻或预防疾病)。如本文更详细描述那样，抗CD20抗体可以以非缀合方式使用或者可以以缀合与例如药品、药物前体或同位素缀合。
II.靶多肽的描述
B1(CD20)分子是人B淋巴细胞表面上的大约35,000道尔顿的磷蛋白，其可通过调节B细胞增殖和分化在体液免疫应答中起中心作用。编码CD20分子的DNA序列已被分离并且CD20的氨基酸序列已经确定。参见，Tedder等人(1988)Proc.Natl.Acad.Scl.USA 85：208-212。CD20的别名，如本领域内所公认的，包括B-淋巴细胞抗原CD20、B-淋巴细胞表面抗原B1、Leu-16、Bp35、BM5和LF5。
本发明的抗体具有对CD20人B细胞表面抗原的结合特异性。抗原是多肽或包括被Clark等人(1985)Proc.Natl.Acad.Scl.U.S.A.82：1766-1770中描述的2H7单克隆抗体结合的多肽。该抗原是已命名的磷蛋白(Bp35(CD20))，其只在B细胞谱系的细胞上表达。之前已制备了针对该抗原的鼠单克隆抗体，其描述于Clark等人，同上中；也参见Stashenko等人(1980)J.Immunol.125：1678-1685。
III.抗CD20抗体
在一个实施方式中，本发明涉及抗CD20抗体，包括其抗原结合片段、变体或衍生物。本发明的抗体是已就增强的活性进行最优化的抗CD20抗体。如本文中所使用的，术语“抗CD20抗体”是特异性识别大约35,000道尔顿的、通常命名为人B淋巴细胞限制性分化抗原Bp35(human B-lymphocyte restricted differentiation antigenBp35)(通常称为CD20)的细胞表面非糖基化磷蛋白的抗体。所述抗原在超过90％的B细胞非何杰金氏淋巴瘤上表达，但未见于造血干细胞、前B细胞、正常血浆细胞或其他正常组织。CD20调节细胞增殖和分化的活化过程中的早期步骤。更特别地，本发明的抗体结合与被上述2H7单克隆抗体结合的表位相同的表位。
基于美国专利5,736,137和(Reff等人(1994)Blood83：435-445)(通过引用合并入本文)中公开的单克隆抗体(mAb)C2B8、嵌合鼠/人抗CD20抗体最优化本发明的抗体。本发明的抗体序列包括经修饰的CDR，所述经修饰的CDR，当通过改造导入可变结构域抗CD20抗体的轻链和重链的可变结构域时，与利妥昔单抗相比，导致抗体的CDC活性增强，保持结合特异性和介导凋亡的能力。
如所指出的，本发明的抗CD20抗体展示与利妥昔单抗相比增强的CDC活性。利妥昔单抗是嵌合鼠/人抗CD20单克隆抗体(IDEC-C2B8；IDEC Pharmaceutical Corp.，San Diego，California；以商品名
Figure A20078004286600431
商购获得)，其包含人IgG1和κ恒定区以及从鼠抗CD20单克隆抗体IDEC-2B8(Reff等人(1994)Blood 83：435-445)分离的鼠可变区。利妥昔单抗用于治疗复发性B细胞低度淋巴瘤或滤泡非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。虽然不束缚于任何作用机制，但抗CD20抗体结合CD20抗原，细胞裂解的机制包括补体依赖细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)。因此，发现具有与利妥昔单抗(本文中也称为
Figure A20078004286600441
)相比，更高的CDC和/或ADCC活性和/或增加的结合亲和力的抗CD20抗体将潜在地改进B细胞淋巴瘤特别地B细胞非何杰金氏淋巴瘤的癌症疗法。将抗体在测定中以等量进行比较。本发明的抗CD20抗体和利妥昔单抗的“等量”意指对于各抗体使用相同的剂量。
这些新型抗CD20抗体对CD20的结合亲和力与对于利妥昔单抗使用CDC解离率测定法观察到的结合亲力相比，增加至少大约50％、大约75％、大约100％、大约125％。在非放射性CDC测定中，需要比使用本发明的抗CD20抗体时所需要的抗体量多至少大约2倍、大约3倍至大约4倍的利妥昔单抗以介导相同水平的对三种不同NHL系的杀伤。
本发明的抗CD20抗体包含至少一个最优化的互补决定区(CDR)。“最优化的CDR”意指CDR已被修饰，并且基于被赋予包含最优化的CDR的抗CD20抗体的提高的结合亲和力和/或提高的CDC活性选择最优化的序列。修饰包括CDR内氨基酸残基的替换，以使抗CD20抗体保持对于CD20抗原的特异性并具有提高的结合亲和力和/或提高的CDC活性。在美国申请公开号2004/0167319A1(通过引用合并入本文)中描述的功能测定中，与rituxamab相比，本发明的抗CD20抗体的CDC活性得到提高。本发明的新型抗CD20抗体、其合适的抗原结合片段、变体和衍生物也展示至少与利妥昔单抗展示的ADCC和凋亡活性相似的ADCC和凋亡活性，如在标准测定法例如美国申请公开号2004/0167319A1中描述的测定法中所测量的。本发明的最优化的CDR分别用于抗CD20抗体的重链和轻链的VH和VL结构域。本发明的抗CD20抗体的实例包含括选自SEQ ID NO：12-18(分别称为H1569、H1570、H1571、H1638、H1639、H1640、H1670)的VH结构域和/或选自SEQ ID NO：10和11(分别称为L373和L419)的VL结构域。
在特定的实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含最优化的CDR。即，本发明的抗CD20抗体包含至少一个选自SEQ ID NO：1-8或具有与选自SEQ ID NO：1-8的序列至少大约65％、大约70％、大约75％、大约80％、大约85％、大约90％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％序列同一性的氨基酸序列的最优化的CDR氨基酸序列。即，最优化的CDR包含SEQ ID NO：1-8中所示的序列和具有至少1、2、3、4或5个氨基酸置换(取决于涉及的CDR)的SEQ ID NO：1-8的序列。
因此，在一些实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含具有至少一个选自下列的最优化的CDR的VH结构域：
(a)包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列的CDR1；
(b)包含具有与SEQ ID：7中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR1，其中CDR1在相应于SEQ ID NO：7的残基7的位点上包含苯丙氨酸(Phe)残基；
(c)包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列的CDR2；
(d)包含具有与SEQ ID：5或SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR2，其中CDR2在相应于SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：6的残基8的位点上分别包含丙氨酸(Ala)或亮氨酸(Leu)残基；
(e)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：4中所示的氨基酸序列的CDR3；
(f)包含具有与SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中CDR3包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：1的残基9的位点上的天冬酰胺(Asn)残基，和(ii)相应于SEQ ID NO：1的残基12的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
(g)包含具有与SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中CDR3包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：2的残基5的位点上的丙氨酸(Ala)残基，(ii)相应于SEQ ID NO：2的残基9的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和(iii)相应于SEQ ID NO：2的残基12的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
(h)包含具有与SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中CDR3包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：3的残基5的位点上的丙氨酸(Ala)残基，(ii)相应于SEQ ID NO：3的残基9的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和(iii)相应于SEQ ID NO：3的残基12的位点上的天冬氨酸(Asp)残基；
(i)包含具有与SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中CDR3包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：4的残基5的位点上的丙氨酸(Ala)残基，(ii)相应于SEQ ID NO：4的残基9的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；(iii)相应于SEQ ID NO：4的残基11的位点上的甘氨酸(Gly)残基；和(iv)相应于SEQ ID NO：4的残基12的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
(j)包含具有与SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR1，其中CDR1在相应于SEQ ID NO：7的残基7的位点上包含作为苯丙氨酸(Phe)的保守性氨基酸置换的残基；
(k)包含具有与SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR2，其中CDR2在相应于SEQ ID NO：5的残基8的位点上包含作为丙氨酸(Ala)的保守性氨基酸置换的残基；
(l)包含具有与SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR2，其中CDR2在相应于SEQ ID NO：6的残基8的位点上包含作为亮氨酸(Leu)的保守性氨基酸置换的残基；
(m)包含具有与SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中CDR3包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：1的残基9的位点上的作为天冬酰胺(Asn)的保守性氨基酸置换的残基，和(ii)相应于SEQ ID NO：1的残基12的位点上的作为天冬酰胺(Asn)的保守性氨基酸置换的残基；
(n)包含具有与SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中CDR3包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：2的残基5的位点上的作为丙氨酸(Ala)的保守性氨基酸置换的残基，其中保守性氨基酸置换不是甘氨酸，(ii)相应于SEQ ID NO：2的残基9的位点上的作为天冬酰胺(Asn)的保守性氨基酸置换的残基；和(iii)相应于SEQ ID NO：2的残基12的位点上的作为天冬酰胺(Asn)的保守性氨基酸置换的残基；
(o)包含具有与SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中CDR3包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：3的残基5的位点上的作为丙氨酸(Ala)的保守性氨基酸置换的残基，其中保守性氨基酸置换不是甘氨酸，(ii)相应于SEQ ID NO：3的残基9的位点上的作为天冬酰胺(Asn)的保守性氨基酸置换的残基；和(iii)相应于SEQ ID NO：3的残基12的位点上的作为天冬氨酸(Asp)的保守性氨基酸置换的残基；和
(p)包含具有与SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中CDR3包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：4的残基5的位点上的作为丙氨酸(Ala)的保守性氨基酸置换的残基，其中保守性氨基酸置换不是甘氨酸，(ii)相应于SEQ ID NO：4的残基9的位点上的作为天冬酰胺(Asn)的保守性氨基酸置换的残基；和(iii)相应于SEQ ID NO：4的残基11的位点上的作为甘氨酸(Gly)的保守性氨基酸置换的残基；和(iv)相应于SEQ ID NO：4的残基12的位点上的作为天冬酰胺(Asn)的保守性氨基酸置换的残基。
在其他实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含具有至少一个选自下列的CDR的VL结构域：(a)包含SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的CDR3；(b)包含具有与SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中CDR3在相应于SEQ ID NO：8的残基4的位点上包含谷氨酰胺(Gln)残基，和(c)包含具有与SEQ IDNO：8中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中CDR3在相应于SEQ ID NO：8的残基4的位点上包含作为谷氨酰胺(Gln)的保守性氨基酸置换的残基，和(d)包含SEQ ID NO：9中所示的序列的CDR2。在这些实施方式的一些实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含具有SEQ ID NO：9中所示的序列的CDR2和选自下列CDR3的CDR3的VL结构域：(a)包含SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的CDR3；和(b)包含具有与SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中CDR3在相应于SEQ ID NO：8的残基4的位点上包含谷氨酰胺(Gln)残基。
在其他实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含具有选自上面(a)至(p)项中所述的最优化CDR的VH结构域；和具有至少一个选自下列CDR的CDR的VL结构域：(a)包含SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的CDR3；(b)包含具有与SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中CDR3在相应于SEQ ID NO：8的残基4的位点上包含谷氨酰胺(Gln)残基；(c)包含具有与SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中CDR3在相应于SEQ ID NO：8的残基4的位点上包含作为谷氨酰胺(Gln)的保守性氨基酸置换的残基；和(d)包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列的CDR2。在这些实施方式中的一些实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含具有CDR2和CDR3的VL结构域，所述CDR2包含SEQ ID NO：9中所示的序列，所述CDR3选自：(a)包含SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的CDR3；和(b)包含具有与SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中CDR3在相应于SEQID NO：8的残基4的位点上包含谷氨酰胺(Gln)残基。
在其他实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含具有选自上面(a)至(p)项中所述的最优化CDR的VH结构域和具有SEQ ID NO：10或SEQID NO：11中所示的序列的VL结构域。
在一些实施方式中，包含至少一个本发明的最优化CDR的抗CD20抗体是IgG1κ免疫球蛋白。在这样的实施方式中，IgG1κ免疫球蛋白可在免疫球蛋白的重链内包含人IgG1恒定区和在免疫球蛋白的轻链内包含人κ恒定区。在特定的实施方式中，IgG1κ免疫球蛋白在重链的可变区内和轻链的可变区内包含全部或部分人框架区。在其他实施方式中，IgG1κ免疫球蛋白在重链的可变区内和轻链的可变区内包含鼠框架区。
在本发明的另外的实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含具有选自SEQ ID NO：12-18的氨基酸序列的VH结构域和/或VL结构域，所述VL结构域具有选自SEQ ID NO：10和11的氨基酸序列或具有与SEQID NO：10-18中所示的序列至少大约80％、85％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％，、大约98％、大约99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明的其他实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含VH结构域，其中所述VH结构域选自：
(a)包含具有与选自SEQ ID NO：12-18的氨基酸序列至少90％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域；
(b)包含具有与SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中VH结构域包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：12的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基，和(ii)相应于SEQ ID NO：12的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
(c)包含具有与SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中VH结构域包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：13的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基，(ii)相应于SEQ ID NO：13的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基，和(iii)相应于SEQ ID NO：13的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
(d)包含具有与SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中VH结构域包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：14的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基，(ii)相应于SEQ ID NO：14的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基，和(iii)相应于SEQ ID NO：14的残基110的位点上的天冬氨酸(Asp)残基；
(e)包含具有与SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中VH结构域包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：15的残基31的位点上的苯丙氨酸(Phe)残基，(ii)相应于SEQ ID NO：15的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基，(iii)相应于SEQ ID NO：15的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和(iv)相应于SEQ ID NO：15的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
(f)包含具有与SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中VH结构域包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：16的残基57的位点上的丙氨酸(Ala)残基，(ii)相应于SEQ ID NO：16的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基，(iii)相应于SEQ ID NO：16的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和(iv)相应于SEQ ID NO：16的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
(g)包含具有与SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中VH结构域包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：17的残基57的位点上的亮氨酸(Leu)残基，(ii)相应于SEQ ID NO：17的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基，(iii)相应于SEQ ID NO：17的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和(iv)相应于SEQ ID NO：17的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
(h)包含具有与SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中VH结构域包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：18的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基，(ii)相应于SEQ ID NO：18的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基，(iii)相应于SEQ ID NO：18的残基109的位点上的甘氨酸(Gly)残基；和(iv)相应于SEQ ID NO：18的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
(i)包含具有与SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中VH结构域包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：12的残基107的位点上的作为天冬酰胺(Asn)的保守性氨基酸置换的残基，和(ii)相应于SEQ ID NO：12的残基110的位点上的作为天冬酰胺(Asn)的保守性氨基酸置换的残基；
(j)包含具有与SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中VH结构域包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：13的残基103的位点上的作为丙氨酸(Ala)的保守性氨基酸置换的残基，其中所述保守性氨基酸置换不是甘氨酸，(ii)相应于SEQ ID NO：13的残基107的位点上的作为天冬酰胺(Asn)的保守性氨基酸置换的残基，和(iii)相应于SEQ ID NO：13的残基110的位点上的作为天冬酰胺(Asn)的保守性氨基酸置换的残基；
(k)包含具有与SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中VH结构域包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：14的残基103的位点上的作为丙氨酸(Ala)的保守性氨基酸置换的残基，其中所述保守性氨基酸置换不是甘氨酸，(ii)相应于SEQ ID NO：14的残基107的位点上的作为天冬酰胺(Asn)的保守性氨基酸置换的残基，和(iii)相应于SEQ ID NO：14的残基110的位点上的作为天冬氨酸(Asp)的保守性氨基酸置换的残基
(l)包含具有与SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中VH结构域包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：15的残基31的位点上的作为苯丙氨酸(Phe)的保守性氨基酸置换的残基，(ii)相应于SEQ ID NO：15的残基103的位点上的作为丙氨酸(Ala)的保守性氨基酸置换的残基，其中所述保守性氨基酸置换不是甘氨酸，(iii)相应于SEQ ID NO：15的残基107的位点上的作为天冬酰胺(Asn)的保守性氨基酸置换的残基，和(iv)相应于SEQ ID NO：15的残基110的位点上的作为天冬酰胺(Asn)的保守性氨基酸置换的残基；
(m)包含具有与SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中VH结构域包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：16的残基57的位点上的作为丙氨酸(Ala)的保守性氨基酸置换的残基，(ii)相应于SEQ ID NO：16的残基103的位点上的作为丙氨酸(Ala)的保守性氨基酸置换的残基，其中所述保守性氨基酸置换不是甘氨酸，(iii)相应于SEQ ID NO：16的残基107的位点上的作为天冬酰胺(Asn)的保守性氨基酸置换的残基，和(iv)相应于SEQ ID NO：16的残基110的位点上的作为天冬酰胺(Asn)的保守性氨基酸置换的残基；
(n)包含具有与SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中VH结构域包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：17的残基57的位点上的作为亮氨酸(Leu)的保守性氨基酸置换的残基，(ii)相应于SEQ ID NO：17的残基103的位点上的作为丙氨酸(Ala)的保守性氨基酸置换的残基，其中所述保守性氨基酸置换不是甘氨酸，(iii)相应于SEQ ID NO：17的残基107的位点上的作为天冬酰胺(Asn)的保守性氨基酸置换的残基，和(iv)相应于SEQ ID NO：17的残基110的位点上的作为天冬酰胺(Asn)的保守性氨基酸置换的残基；和
(o)包含具有与SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中VH结构域包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：18的残基103的位点上的作为丙氨酸(Ala)的保守性氨基酸置换的残基，中所述保守性氨基酸置换不是甘氨酸，(ii)相应于SEQ ID NO：18的残基107的位点上的作为天冬酰胺(Asn)的保守性氨基酸置换的残基，(iii)相应于SEQ ID NO：18的残基109的位点上的作为甘氨酸(Gly)的保守性氨基酸置换的残基，和(iv)相应于SEQ ID NO：18的残基110的位点上的作为天冬酰胺(Asn)的保守性氨基酸置换的残基。
在一些实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含选自上面(a)至(o)项中所述的VH结构域；和包含可变轻链(VL)结构域，其中VL结构域选自：
(a)包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的序列的VL结构域；
(b)包含具有与SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的序列至少90％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域；
(c)包含具有与SEQ ID NO：10中所示的序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域，其中VL结构域包含SEQ ID NO：9中所示的CDR2；
(d)包含具有与SEQ ID NO：11中所示的序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域；其中VL结构域包含至少一个：(i)SEQ IDNO：9中所示的CDR2，和(ii)相应于SEQ ID NO：11的残基91的位点上的谷氨酰胺(Gln)残基；和
(e)包含具有与SEQ ID NO：11中所示的序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域；其中VL结构域包含至少一个：(i)SEQ IDNO：9中所示的CDR2，和(ii)相应于SEQ ID NO：11的残基91的位点上的谷氨酰胺(Gln)的保守性氨基酸置换。
在这些实施方式的一些实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含含有SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的VL结构域。在其他实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含含有SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的VL结构域。在某些其他实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含含有SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的VL结构域。在其他实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含含有SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的VL结构域。在其他实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含含有SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ IDNO：10中所示的氨基酸序列的VL结构域。在另外的实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含含有SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的VL结构域。在另外的实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含含有SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的VL结构域。在某些实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含含有SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的VL结构域。在其他实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含含有SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的VL结构域。在某些其他实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含含有SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的VL结构域。在其他实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含含有SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的VL结构域。在其他实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含含有SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ IDNO：11中所示的氨基酸序列的VL结构域。在其他实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含含有SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的VL结构域。在其他实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含含有SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的VL结构域。
在其他实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含含有具有与SEQ IDNO：12-18中所示的任一序列至少90％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域。在这些实施方式中的一些实施方式中，本发明的抗CD20抗体还包含含有SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的VL结构域。
在其他实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含SEQ ID NO：29中所示的VH结构域(命名为H1286)或具有与SEQ ID NO：29中所示的VH结构域至少大约80％、大约85％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％序列同一性的VH结构域。在这些实施方式中的一些实施方式中，这些抗CD20抗体还包含选自SEQ ID NO：10和11的VL结构域(分别命名为L373和L419)。
在其他实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含选自下列的VH结构域：(a)SEQ ID NO：29中所示的VH结构域，和(b)具有与SEQ ID NO：29中所示的VH结构域至少大约80％、大约85％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％序列同一性的VH结构域；和具有至少一个选自下列CDR的VL结构域：(a)包含SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的CDR3；(b)包含具有与SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸的CDR3，其中所述CDR3在相应于SEQ ID NO：8的残4的位点上包含谷氨酰胺(Gln)残基；和(c)包含具有与SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR3在相应于SEQ ID NO：8的残基4的位点上包含作为谷氨酰胺(Gln)的保守性氨基酸置换的残基。此类抗CD20抗体可任选地包含含有SEQ ID NO：9中所示的序列的CDR2。
在其他实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含选自下列的VH：(a)SEQ ID NO：29中所示的VH结构域，和(b)具有与SEQ ID NO：29中所示的VH结构域至少大约80％、大约85％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％序列同一性的VH结构域；和具有至少一个选自下列CDR的的VL结构域：(a)包含SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的CDR3；(b)包含具有与SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸的CDR3，其中所述CDR3在相应于SEQ ID NO：8的残4的位点上包含谷氨酰胺(Gln)残基；(c)包含具有与SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR3在相应于SEQ ID NO：8的残基4的位点上包含作为谷氨酰胺(Gln)的保守性氨基酸置换的残基；和(d)包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列的CDR2。
在这些实施方式的一些实施方式中，本发明的抗CD20抗体包含选自下列的VH结构域：(a)SEQ ID NO：29中所示的VH结构域，和(b)具有与SEQ ID NO：29中所示的VH结构域至少大约80％、大约85％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％序列同一性的VH结构域；和可变轻链(VL)结构域，其中所述VL结构域选自：(a)包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的序列的VL结构域；(b)包含具有与SEQ IDNO：10或SEQ ID NO：11中所示的序列至少90％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域；(c)包含具有与SEQ ID NO：10中所示的序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域，其中所述VL结构域包含SEQ IDNO：9中所示的CDR2；(d)包含具有与SEQ ID NO：11中所示的序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域，其中所述VL结构域包含至少一个：(i)SEQ ID NO：9中所示的CDR2，和(ii)相应于SEQ ID NO：11的残基91的位点上的谷氨酰胺(Gln)残基；和(e)包含具有与SEQID NO：11中所示的序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域，其中所述VL结构域包至少一个：(i)SEQ ID NO：9中所示的CDR2，和(ii)相应于SEQ ID NO：11的残基91的位点上的谷氨酰胺(Gln)的保守性氨基酸置换。
抗CD20抗体序列在本领域内是已知的。参见，例如，美国专利5,736,137、5,776,456、5,843,439、5,500,362、5,677,180、5,693,493、5,721,108、5,736,137、6,120,767、5,843,685、5,576,184、6,399,061和美国申请公开号2004/0167319；其全部通过引用合并入本文。已认识到，可对本领域内已知的任何抗CD20抗体或其组合产生本文中描述的修饰。因此本发明包括包含至少一个本文中描述的最优化CDR的鼠抗CD20抗体、嵌合抗CD20抗体和人源化抗CD20抗体。可通过本领域内已知的和本文中描述的测定法就增强的活性检测使用这些修饰和组合改造的抗CD20抗体。用于测量抗CD20抗体结合特异性的方法包括但不限于标准竞争结合测定法、用于监视B细胞的免疫球蛋白分泌的测定法、B细胞增殖测定法、Banchereau-样B细胞增殖测定法、用于抗体产生的T细胞辅助细胞测定法(T cellhelper assays for antibody production)、B细胞增殖的共刺激测定法和用于B细胞激活标记的上调的测定法。参见，例如，WO 00/75348和美国专利6,087,329中公开的此类测定法。关于CDC、ADCC和凋亡测定法，参见，例如，Subbramanian等人(2002)J.Clin.Microbiol.40：2141-2146；Ahman等人(1994)J.Immunol.Methods 36：243-254；Brezicka等人(2000)Cancer Immunol.Immunoiher.49：235-242；Gazzano-Santoro等人(1997)J.Immunol.Methods 202：163-171；Prang等人(2005)British J.Cancer 92：342-349；Shan等人(1998)Blood 92：3756-3771；Ghetie等人(2001)Blood 97：1392-1398；和Mathas等人(2000)Cancer Research 60：7170-7176；其全部通过引用合并入本文。
本发明的特定抗CD20抗体包括以任何组合与具有SEQ ID NO：10或11的氨基酸序列的VL结构域或其变体配对的具有选自SEQ ID NO：12-18的氨基酸序列的VH结构域或其变体。本发明的抗CD20抗体包括包含具有选自SEQ ID NO：12-18的氨基酸序列的VH结构域和具有选自SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VL结构域的抗体。
抗CD20抗体的适当的生物活性变体可用于本发明的方法。此类变体将保持期望的亲本抗CD20抗体的结合性质。制备抗体变体的方法通常可在本领域内获得。
例如，可通过编码目的氨基酸序列的克隆的DNA序列中的突变制备本文中描述的抗CD20抗体、抗体区域例如CDR(SEQ ID NO：1-8)或重链或轻链的抗体可变结构域例如SEQ ID NO：12-18的任一个中所示的VH结构域或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的VL结构域的氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列改变的方法在本领域内是熟知的。参见，例如，Walker和Gaastra，eds.(1983)Techniques inMolecular Biology(MacMillan Publishing Company，New York)；Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等人(1987)Methods Enzymol.154：367-382；Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor，NewYork)；美国专利4,873,192；和本文中引用的参考文献；通过引用合并入本文。关于不影响目的多肽的生物学活性的适当的氨基酸置换的指导可见于Dayhoff等人(1978)在Atlas of Protein Sequence andStructure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C)，pp.345-352(通过以其全文引用合并入本文)的模型中。Dayhoff等人的模型使用可接受点突变(Point Accepted Mutation)(PAM)氨基酸相似性矩阵(PAM 250矩阵)来确定合适的保守性氨基酸置换。保守性置换，例如一个氨基酸用具有相似性质的另一个氨基酸来置换，可以是优选的。由Dayhoff等人的模型的PAM 250矩阵教导的保守性氨基酸置换的实例包括但不限于Gly<＝>Ala、Val<＝>Ile<＝>Leu、Asp<＝>Glu、Lys<＝>Arg、Asn<＝>Gln和Phe<＝>Trp<＝>Tyr。
在构建目的抗CD20抗体多肽的变体中，这样产生修饰，以使变体继续具有期望的性质，即能够特异性结合在人细胞的表面上表达的人CD20抗原并具有增强的功能，特别地增加的CDC活性和/或增加的对CD20抗原的结合亲和力，如本文中所描述的。显然，编码变体多肽的DNA中产生的任何突变必需不能将序列置于阅读框架之外，优选将不产生可产生二级mRNA结构的互补区域。参见EP专利申请公开号75,444。
此外，可通过许多方法突变抗CD20抗体的恒定区来改变效应子作用。例如参见美国专利6,737,056B1和美国专利申请公开号2004/0132101A1，其公开了最优化结合Fc受体的抗体的Fc突变。
优选，参照抗CD20抗体的变体具有氨基酸序列，所述氨基酸序列具有与参照抗CD20抗体分子的氨基酸序列或与参照抗体分子的更短部分至少大约80、大约85％、大约88％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％或大约95％序列同一性的氨基酸序列。更优选，所述分子共有至少大约96％、大约97％、大约98％或大约99％序列同一性。当在本文中描述时，任何特定的多肽，包括本文中公开的CDR、VH结构域和VL结构域，与另一个多肽至少大约65％、大约70％、大约75％、大约80％、大约85％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或甚至大约100％的同一性，可使用本领域内已知的方法和计算机程序/软件来测定，例如，但不限于BESTFIT程序(Wisconsin Sequence AnalysisPackage，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI53711)。BESTFIT使用Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482-489的局部同源性比对来发现两个序列之间的同源性的最佳区段。当使用BESTFIT或任何其他序列比对程序来确定特定序列是否与根据本发明的参照序列例如95％的同一性时，当然，设置参数以使在参照多肽序列的全长上计算同一性的百分数和允许同源性中缺口达到参照序列的氨基酸总数的5％。
为了本发明的目的，使用缺口开放罚分为12和缺口延伸罚分为2的仿射性缺口搜寻(affine gap search)，62的BLOSUM矩阵，利用Smith-Waterman同源性搜寻算法测定百分数序列同一性。在Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482-489中教导了Smith-Waterman同源性搜寻算法。变体可以例如与参照抗CD20抗体相异少至1至15个氨基酸残基，少至1至10个氨基酸残基，例如6至10个，少至5个，少至4、3、2或甚至1个氨基酸残基。
至于两个氨基酸序列的最优比对，相对于参照氨基序列，变体氨基酸序列的连续区段可具有其他的氨基酸残疾或缺失的氨基酸残基。用于与参照氨基酸序列比较的连续区段将包含至少20个连续氨基酸残基，并且可以是30、40、50或更多个氨基酸残基。可进行关于与保守性残基置换或缺口相关的序列同一性的校正(参见Smith-Waterman同源性搜寻算法)。
当将任何两个多肽序列最优比对以进行比较时，公认比对中出现在彼此相对的残基占据它们各自多肽中彼此相应的位置。这样的位点在本文中称为“相应位点”，相应位点上的残基称为“相应的残基”或相互“相应”的残基。因此，例如，当将目的多肽对具有例如10个残基的参照多肽序列进行最佳比对时，目的多肽内显现参照序列的相对的残基5的残基称为参照序列的“相应于残基5的位点上的残基”。
能够特异性结合CD20和保留期望的CDC活性的增加和/或增加的对CD20抗原的结合亲和力的多肽的精确化学结构取决于许多因素。由于可电离的氨基和羧基存在于分子中，因此特定多肽可以以酸盐或碱盐或以中性形式获得。当置于合适的环境条件中时保持它们的生物学活性的所有此类制剂包括在本文中所使用的抗CD20抗体的定义内。此外，多肽的一级氨基酸序列可通过使用糖部分的衍生(糖基化)或通过其他补充分子例如脂质、磷酸、乙酰基等来增加。其还可以通过与糖缀合来增加。这样的增加的某些方面通过生产宿主的翻译后加工系统来完成；可体外导入其他此类修饰。无论如何，此类修饰包括在本文中使用的抗CD20抗体的定义之内，只要不破坏抗CD20抗体的期望的性质。预期此类修饰可在不同的测定中通过增强或减小多肽的活性来在数量上或质量上影响活性。此外，链中单个氨基酸残基可通过氧化、还原或其他衍生化来修饰，多肽可进行切割以获得保持活性的片段。不破坏期望的性质(即，对CD20的结合特异性和增加的CDC活性和/或增加的对CD20抗原的结合亲和力)的此类改变不将所述多肽序列排除在如本文中所使用的目的抗CD20抗体的定义外。
现有技术提供了关于多肽变体的制备和用途的详尽指导。在制备抗CD20抗体变体中，本领域技术人员可容易地确定对天然蛋白质核苷酸或氨基酸序列的修饰，所述修饰产生适合用作用于本发明的方法的药物组合物的治疗活性成分的变体。
在某些抗CD20抗体中，可使用本领域内已知的技术对Fc部分进行突变以减少效应子作用。例如，恒定区的缺失或失活(通过点突变或其他方法)可减少循环的经修饰抗体的Fc受体结合，从而增加肿瘤定位。在其他情况下，符合本发明的恒定区的修饰可能减小补体结合，从而减少血清半衰期和缀合的细胞毒素的非特异性结合。恒定区的其他修饰可用于修饰二硫键或寡糖部分，所述二硫键或寡糖部分由于增加的抗原特异性或抗体柔性而允许增强定位。所得的修饰的生理学特征、生物利用度和其他生物化学效应例如肿瘤定位、生物扰动和血清半衰期可使用熟知的免疫技术容易地测量和定量而无需过度实验。
本发明的抗CD20抗体还包括例如通过将任何类型的分子共价连接至抗体(使共价连接不阻止抗体对其关联(cognate)表位的特异性结合)来修饰的衍生物。例如，但不以限于，抗体衍生物包括已通过例如糖基化、酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、使用已知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、至细胞配体或其他蛋白的连接等修饰的抗体。可通过已知的技术进行许多化学修饰的任一种，所述技术包括但不限于特异性化学切割、酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，所述衍生物可包含一种或多种非经典氨基酸。
“保守性的氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有带相同电荷的侧链的氨基酸残基所代替。本领域已经定义具有带相同电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、具有β分枝侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。备选地，可以通过例如饱和突变来在编码序列的全部或一部分随机引入突变，并且可以针对生物活性来对所得的突变体进行筛选，从而鉴定出保留活性(例如结合抗CD20多肽的能力)的突变体。
例如，可以只在抗体分子的框架区或只在抗体分子的CDR区域引入突变。所引入的突变可以是沉默突变或中性的错义突变，即，对抗体结合抗原的能力不具有影响或几乎不具有影响。这些类型的突变可用于优化密码子选择或者提高杂交瘤抗体的产量。备选地，非中性的错义突变可以改变抗体结合抗原的能力。大部分沉默突变和中性的错义突变的位置可能位于框架区中，而大部分非中性的错义突变的位置可能位于CDR中，但这不是绝对必需的。本领域的技术人员能够设计和测试具有所需性质(例如抗原结合活性没有改变或者结合活性发生改变(例如抗原结合活性中的亲和力成熟或优化或者其他改善，或者抗体特异性的变化))的突变体分子。突变后，可以按常规方式表达所编码的蛋白质，并且可以采用本文所述的技术或通过本领域已知的常规修改的技术来测定编码蛋白质的功能活性和/或生物活性(例如免疫特异性结合CD20多肽的至少一个表位的能力)。
IV.编码抗CD20抗体的多核苷酸
本发明还提供了编码本发明的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的核酸分子。
在一个实施方式中，本发明提供了分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含、大体上由或由编码免疫球蛋白重链可变结构域(VH结构域)的核酸组成，其中VH结构域的至少一个CDR具有氨基酸序列，所述氨基酸序列为SEQ ID NO：1-7的任一个的至少大约80％、大约85％、大约90％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％相同或与之相同。
在其他实施方式中，本发明提供了分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含、大体上由或由编码免疫球蛋白VH结构域的核酸组成，其中VH结构域的至少一个CDR选自：(a)包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列的CDR1；(b)包含具有与SEQ ID：7中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR1，其中所述CDR1在相应于SEQ ID NO：7的残基7的位点包含苯丙氨酸(Phe)残基；(c)包含SEQ ID NO：5或SEQID NO：6中所示的氨基酸序列的CDR2；(d)包含具有与SEQ ID：5或SEQID NO：6中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR2，其中所述CDR2在相应于SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的残基8的位点上分别包含丙氨酸(Ala)或亮氨酸(Leu)残基；(e)包含SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列的CDR3；(f)包含具有与SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR3包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：1的残基9的位点上的天冬酰胺(Asn)残基，和(ii)相应于SEQ ID NO：1的残基12的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；(g)包含具有与SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR3包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：2的残基5的位点上的丙氨酸(Ala)残基，(ii)相应于SEQ ID NO：2的残基9的位点上的天冬酰胺(Asn)残基，和(iii)相应于SEQ ID NO：2的残基12的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；(h)包含具有与SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR3包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：3的残基5的位点上的丙氨酸(Ala)残基，(ii)相应于SEQ ID NO：3的残基9的位点上的天冬酰胺(Asn)残基，和(iii)相应于SEQ ID NO：3的残基12的位点上的天冬氨酸(Asp)残基；和(i)包含具有与SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR3包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：4的残基5的位点上的丙氨酸(Ala)残基，(ii)相应于SEQ ID NO：4的残基9的位点上的天冬酰胺(Asn)残基，(iii)相应于SEQ ID NO：4的残基11的位点上的甘氨酸(Gly)残基，和(iv)相应于SEQ ID NO：4的残基12的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；其中包含编码的VH结构域的抗CD20抗体特异性或优先结合CD20。
在一些实施方式中，本发明提供了分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含、大体上由或由编码免疫球蛋白VH结构域的核酸组成，其中VH结构域的至少一个CDR选自：(a)包含SEQ ID NO：7中所示的序列的CDR1；(b)包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6中所示的序列的CDR2；和(c)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中所示的序列的CDR3。在特定的实施方式中，编码免疫球蛋白VH结构域的分离的多核苷酸包含至少一个编码CDR的序列，所述编码CDR的序列选自SEQ ID NO：24(编码SEQ ID NO：1的最优化的CDR3)、SEQ IDNO：25(编码SEQ ID NO：2的最优化的CDR3)、SEQ ID NO：26(编码SEQ ID NO：3的最优化的CDR3)和SEQ ID NO：27(编码SEQ ID NO：5的最优化的CDR2)。
在另外的实施方式中，本发明包括分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含、大体上由或由编码VH结构域的核酸组成，所述VH结构域具有与参照VH结构域多肽序列至少大约80％、大约85％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％的同一性的氨基酸序列，所述参照VH结构域多肽序列选自SEQ ID NO：12-18和29，其中包含编码的VH结构域的抗CD20抗体特异性或优先结合CD20。
在其他实施方式中，本发明包括分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含、大体上由或由编码免VH结构域的核酸组成，所述VH结构域选自：(a)包含具有与选自SEQ ID NO：12-18和29的氨基酸序列至少90％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含具有与SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：12的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基，和(ii)相应于SEQ ID NO：12的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；(c)包含具有与SEQ IDNO：13中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：13的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基，(ii)相应于SEQ ID NO：13的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基，和(iii)相应于SEQ ID NO：13的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；(d)包含具有与SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：14的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基，(ii)相应于SEQ ID NO：14的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基，和(iii)相应于SEQ ID NO：14的残基110的位点上的天冬氨酸(Asp)残基；(e)包含具有与SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：15的残基31的位点上的苯丙氨酸(Phe)残基，(ii)相应于SEQ ID NO：15的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基，(iii)相应于SEQ ID NO：15的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基，和(iv)相应于SEQ ID NO：15的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；(f)包含具有与SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：16的残基57的位点上的丙氨酸(Ala)残基，(ii)相应于SEQ ID NO：16的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基，(iii)相应于SEQ ID NO：16的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基，和(iv)相应于SEQ ID NO：16的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；(g)包含具有与SEQ IDNO：17中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：17的残基57的位点上的亮氨酸(Leu)残基，(ii)相应于SEQID NO：17的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基，(iii)相应于SEQID NO：17的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基，和(iv)相应于SEQ ID NO：17的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和(h)包含具有与SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的残基：(i)相应于SEQ ID NO：18的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基，(ii)相应于SEQ ID NO：18的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基，(iii)相应于SEQ ID NO：18的残基109的位点上的甘氨酸(Gly)残基，和(iv)相应于SEQ ID NO：18的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基。
在另外的实施方式中，本发明包括分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含、大体上由或由编码VH结构域的核酸组成，其中所述核酸具有序列，所述序列具有与选自SEQ ID NO：19-22的核苷酸序列至少大约80％、大约85％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％序列同一性，其中包含编码的VH结构域的抗CD20抗体特异性或优先结合抗CD20。
在其他实施方式中，本发明包括分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含、大体上由或由编码免疫球蛋白轻链可变结构域(VL结构域)的核酸组成，其中VL结构域包含具有与SEQ ID NO：8中所示的CDR序列至少大约80％、大约85％、大约90％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％的同一性的氨基酸序列的CDR。
在另外的实施方式中，本发明包括分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含、大体上由或由编码免疫球蛋白轻链的VL结构域的核酸组成，其中所述VL结构域包含至少一个CDR，所述CDR选自：(a)包含SEQ IDNO：8中所示的氨基酸序列的CDR3；(b)包含具有与SEQ ID：8中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR3在相应于SEQ ID NO：8的残基4的位点包含谷氨酰胺(Gln)残基和(c)具有SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列的CDR2。在这些实施方式的一些实施方式中，本发明包括分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含、大体上由或由编码免疫球蛋白轻链的VL结构域的核酸组成，其中VL结构域包含具有SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列的CDR2和CDR3，所述CDR3选自：(a)包含SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的CDR3；和(b)包含具有与SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR3在相应于SEQ ID NO：8的残基4的位点上包含谷氨酰胺(Gln)残基。
在另外的实施方式中，本发明包括分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含、大体上由或由编码VL结构域的核酸组成，所述VL结构域具有与SEQ ID NO：11中所示的参照VL结构域多肽序列至少大约80％、大约85％、大约90％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％或100％的同一性的氨基酸序列，其中包含编码的VL结构域的抗CD20抗体特异性或优先结合CD20。
在其他实施方式中，本发明包括分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含、大体上由或由编码VL结构域的核酸组成，所述VL结构域选自：(a)包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的序列的VL结构域；(b)包含具有与SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的序列至少90％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域；(c)包含具有与SEQ ID NO：10中所示的序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO：9中所示的CDR2；和(d)包含具有与SEQID NO：11中所示的序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域，其中所述VL结构域包含至少一个：(i)SEQ ID NO：9中所示的CDR2，和(ii)相应于SEQ ID NO：11的残基91的位点上的谷氨酰胺(Gln)残基。
上述多核苷酸的任一个还可包括编码例如指导编码的多肽分泌的信号肽、本文中描述的抗体恒定区或本文中描述的其他异源多肽的其他的核酸。同样，如在本文的其他地方更详细地描述的，本发明包括含有多核苷酸的组合物，所述多核苷酸包含一个或多个上述多核苷酸。在一个实施方式中，本发明包括包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的组合物，其中所述第一多核苷酸编码本文中描述的VH结构域，其中所述第二多核苷酸编码本文中描述的VL结构域。特别地，组合物包含、大体上由或由编码VH结构域的多核苷酸(如SEQ ID NO：19-22的任一个中所示的)，和编码VL结构域的多核苷酸，例如，编码SEQ IDNO：10或SEQ ID NO：11中所示的VL结构域的多核苷酸组成。
本发明还包括本发明的多核苷酸的片段，如其他地方所描述的。此外，本发明还包括如本文中所描述的编码融合多肽、Fab片段和其他衍生物的多核苷酸。
多核苷酸可通过本领域内已知的任何方法产生或制备。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，编码抗体的多核苷酸可从化学合成的寡核苷酸装配(例如，Kutmeier等人(1994)BioTechniques 17：242中所描述的)，简而言之，这涉及包含编码抗体的序列部分的重叠寡核苷酸的合成，这些寡核苷酸的退火和连接，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
备选地，编码抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可从来自适合来源的核酸产生。如果包含编码特定抗体的核酸的克隆不可获得，但抗体的序列已知，那么编码该抗体的核酸可化学合成或通过如下方法从合适的来源(例如抗体cDNA文库或从任何表达抗体或其他抗CD20抗体的组织或细胞(例如选择以表达抗体的杂交瘤细胞)产生的cDNA文库、从任何表达抗体或其他抗CD20抗体的组织或细胞分离的核酸，优选poly A+RNA)获得，所述方法是通过使用可与序列的3′和5′末端杂交的合成引物的PCR扩增或通过使用对于待鉴定的特定基因序列是特异性的寡核苷酸探针的克隆(例如，来自编码其他抗CD20抗体的抗体的cDNA文库的cDNA克隆)。然后可使用本领域内熟知的任何方法将由PCR产生的扩增的核酸克隆入可复制的克隆载体。
在确定抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的核苷酸序列和相应的氨基酸序列后，可使用本领域内熟知的用于制备核苷酸序列的方法操作其核苷酸序列来产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸置换、缺失和/或插入，所述方法是例如，重组DNA技术、定向诱变、PCR等(参见Sambrook等人(1990)Molecular Cloning，ALaboratory Manual(第2版；Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY)和Ausubel等人，eds.(1998)Current Protocolsin Molecular Biology(John Wiley & Sons，NY)(以其全文通过引用合并入本文)中描述的技术。
编码抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成，其可以是未经修饰的RNA或DNA或者经修饰的RNA或DNA。例如，编码抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由单链和双链DNA、单链和双链区域的混合物的DNA、单链和双链RNA和单链和双链区域的混合物的RNA、包含DNA和RNA的可以是单链或更常见地双链或单链和双链区域的混合物的杂种分子组成。此外，编码抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由包含RNA或DNA或者RNA和DNA两者的三链区域组成。编码抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸还可包含一个或多个经修饰的碱基或者因稳定性或其他原因而修饰的DNA或RNA主链。“经修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基碱基和稀有碱基例如肌苷。可对DNA和RNA产生多种修饰；从而，“多核苷酸”包括化学、酶促或代谢修饰的形式。
编码来源于免疫球蛋白的多肽(例如，免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的非天然变体的分离的多核苷酸可通过将一个或多个核苷酸置换、添加或缺失导入免疫球蛋白的核苷酸序列来产生，这样一个或多个氨基酸置换、添加或缺失被导入编码的蛋白质。突变可通过标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变来导入。优选，在一个或多个非必需氨基酸残基上产生保守性氨基酸置换。
V.融合蛋白和抗体缀合物
如本文其他处更详细讨论的，本发明的抗CD20抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物可以进一步在N末端或C末端与异源多肽重组融合，或者化学缀合(包括共价缀合和非共价缀合)至多肽或其他组合物。例如，抗CD20抗体可以重组融合或缀合至作为检测测定法中的标记物的分子、以及效应器分子(例如异源多肽、药品、放射性核素或毒素)。例如参见PCT公开WO 92/08495、WO 91/14438、WO89/12624、美国专利序号5,314,995和EP 396,387。
本发明的抗CD20抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物包括修饰的衍生物，即，任何类型的分子与所述的抗体形成共价连接，使得该共价连接不会阻碍抗体与CD20的结合。例如但不限于，所述的抗体衍生物包括已经通过例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白质连接等方式而已经被修饰的抗体。可以采用已知的技术进行多种化学修饰中的任何修饰，其中所述的化学修饰包括，但不限于：特异性的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等等。此外，所述的衍生物可以包含一种或多种非常规的氨基酸。
本发明的抗CD20抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物可以由彼此通过肽键或修饰的肽键(即，肽的等排体)而连接的氨基酸构成，并且可以包含除了20个基因编码的氨基酸以外的氨基酸。抗CD20抗体可以通过天然方法(例如翻译后加工)或者通过本领域公知的化学修饰技术来进行修饰。这种修饰在基础课本中和更详细的专论中、以及在大量的研究文献中都具有较好的描述。修饰可以在抗CD20抗体中的任何位置处发生，所述的位置包括肽骨架、氨基酸侧链、氨基或羧基末端、或多个部分(例如糖)。应该理解，在给定的抗CD20抗体中，相同类型的修饰可以以相同的程度或不同的程度存在于多个位置处。此外，给定的抗CD20抗体可以包含许多类型的修饰。抗CD20抗体可以是分枝的(例如由于泛素化所导致)，并且它们可以是环状的，并具有或不具有分枝。环状、分枝、以及分枝环状的抗CD20抗体可以通过翻译后的天然过程形成，或者可以通过合成方法形成。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、核黄素的共价连接、亚铁血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键的形成、去甲基化、共价交联体的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧酸化、糖基化、GPI锚的形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫化、由转运RNA介导的向蛋白质中加入氨基酸(例如精氨酰化)、以及泛素化(例如参见Proteins-Structure And Molecular Pproperties，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York 2nd Ed.，(1993)；POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，pgs.1-12(1983)；Seifter et al.，Meth Enzymol 182：626-646(1990)；Rattan et al.，Ann NY Acad Sci 663：48-62(1992))。
本发明还提供了融合蛋白质，其包含抗CD20抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物，以及异源多肽。抗体与之融合的异源多肽可用于发挥功能或用于靶向表达C35多肽的细胞。在一个实施方式中，本发明的融合蛋白质包含、基本上由或者由所述的多肽或其片段或变体、以及异源多肽序列构成，其中所述的多肽具有本发明抗体的任何一个或多个VH结构域的氨基酸序列或者本发明抗体的任何一个或多个VL结构域的氨基酸序列。在另一个实施方式中，用于本文所述的诊断和治疗方法中的融合蛋白质包含、基本上由或者由所述的多肽或其片段或变体、以及异源多肽序列构成，其中所述的多肽具有抗CD20抗体或者其片段、或变体或衍生物的VH结构域的任何一个、两个、三个CDR的氨基酸序列或者抗CD20抗体或者其片段、或变体或衍生物的VL结构域的任何一个、两个、三个CDR的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述的融合蛋白质包含多肽或其片段、衍生物或变体、以及异源多肽序列，其中所述的多肽具有本发明抗CD20抗体的VH结构域的CDR3的氨基酸序列，并且所述的融合蛋白质特异性结合CD20的至少一个表位。在另一个实施方式中，融合蛋白质包含多肽或其片段、衍生物或变体、以及异源多肽序列，其中所述的多肽具有本发明抗CD20抗体的至少一个VH结构域的氨基酸序列和本发明抗CD20抗体的至少一个VL结构域的氨基酸序列。优选地，所述的融合蛋白质的VH和VL结构域对应于特异性结合CD20的至少一个表位的单一来源的抗体(或者scFv或Fab片段)。在另一个实施方式中，用于本文所述的诊断和治疗方法中的融合蛋白质包含多肽或其片段或变体、以及异源多肽序列，其中所述的多肽具有抗CD20抗体的VH结构域的任何一个、两个、三个或多个CDR的氨基酸序列和抗CD20抗体的VL结构域的任何一个、两个、三个或多个CDR的氨基酸序列。优选地，VH结构域或VL结构域的两个、三个、四个、五个、六个或多个CDR对应于本发明的单一来源的抗体(或者scFv或Fab片段)。本发明还包括编码所述的融合蛋白质的核酸分子。
文献中报道的示例性融合蛋白质包括以下物质的融合物，所述的物质为T细胞受体(Gascoigne et al(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：2936-2940)；CD4(Capon et al.(1989)，Nature 537：525-531；Traunecker et al(1989)，Nature 339：68-70；Zettmeissl et al.(1990)，DNA Cell Biol.USA P：347-353；和Byrn et al，Nature344：667-670(1990))；L-选择蛋白(归巢受体)(Watson et al(1990)，J.Cell.Biol.110：2221-2229；和Watson et al(1991)，Nature 349：164-167)；CD44(Aruffo et al(1990)，Cell 61：1303-1313)；CD28和B7(Linsley et al(1991)，J.Exp.Med.173：721-730)；CTLA-4(Lisley et al(1991)，J.Exp.Med.174：561-569)；CD22(Stamenkovic et al(1991)，Cell 66：1133-1144)；TNF受体(Ashkenazi et al(1991)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10535-10539；Lesslauer et al(1991)，Eur.J.Immunol..27：2883-2886；和Peppel et al(1991)，J.Exp.Med.174：1483-1489)；以及IgE受体(Ridgway和Gorman，J.(1991)Cell.Biol.Vol.115，Abstract No.1448)。
如本文中其他处所述，可以将本发明的抗CD20抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物融合到异源多肽中，以增长所述多肽的体内半衰期，或者用于使用本领域已知的方法的免疫测定。例如，在一个实施方式中，PEG可以与本发明的抗CD20抗体缀合，从而增长它们的体内半衰期。参见Leong，S.R.，et al.(2001)，Cytokine 16：106；Adv.in Drug Deliv.Rev.54：531(2002)；或Weir et al.(2002)，Biochem.Soc.Transactions 30：512。
此外，本发明的抗CD20抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物可以被融合到标记物序列(例如肽)中，从而有利于它们的纯化或检测。在优选的实施方式中，所述的标记物氨基酸序列为六组氨酸的肽，例如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，Calif.，91311)中提供的标签等，许多这种标记物是市售可得的。例如，如Gentz等人(1989)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824所述，六组氨酸提供融合蛋白质的方便的纯化方法。可用于纯化的其他肽标签包括，但不限于“HA”标签，其对应于衍生自流感血凝素蛋白质的表位(Wilson et al.(1984)，Cell 37：767)和“flag”标签。
可以采用本领域公知的方法来制备融合蛋白质(例如参见美国专利序号5,116,964和5,225,538)。可以凭经验选择进行融合的精确位点，从而优化融合蛋白质的分泌或结合特征。然后，将编码融合蛋白质的DNA转染到宿主细胞中，以用于表达。
本发明的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以以非缀合的形式使用，或者可以与多种分子中的至少一种缀合，从而例如改善所述分子的治疗性质，以有助于靶标的检测，或者用于患者的成像或治疗。当进行纯化时，可以在纯化之前或纯化之后将本发明的抗CD20抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物标记或缀合。
具体而言，可以将本发明的抗CD20抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物缀合至治疗性试剂、前体药物、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物应答修饰剂、药物试剂或PEG。
本领域的技术人员可以理解的是，还可以根据所选的待缀合的试剂来采用多种技术对缀合物进行组装。例如，通过例如使结合多肽与生物素的活化酯(例如生物素N-羟基琥珀酸亚胺酯)发生反应来制备具有生物素的缀合物。类似地，在偶联剂(例如本文所列出的那些)存在下，或者通过与异硫氰酸酯(优选为异硫氰酸荧光素)反应来制备具有荧光标记物的缀合物。可以按照类似的方式制备本发明的抗CD20抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的缀合物。
本发明还包括了缀合至诊断试剂或治疗性试剂的本发明的抗CD20抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物。所述的抗CD20抗体包括其抗原结合片段、变体或衍生物可以在诊断中使用，例如，作为临床检验过程的一部分来监测疾病的发展或进程，以例如确定给定的治疗和/或预防方案的效果。可以通过使抗CD20抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物与可检测的物质偶联来帮助检测。可检测物质的实例包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、利用了各种正电子发射断层显像的正电子发射金属、以及非放射性的顺磁金属离子。例如参见美国专利序号4,741,900中的金属离子，该金属离子可以与抗体缀合从而用于根据本发明的诊断剂。合适的酶的实例包括：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括：链霉亲核素/生物素、以及抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括：伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺(luminol)；生物发光材料的实例包括：荧光素酶、萤光素和发光蛋白质；合适的放射性材料的实例包括125I、131I、111In或99Tc。
抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可缀合至治疗性部分例如细胞毒素、治疗剂或放射性金属离子。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。实例包括硒、紫杉酚、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱(emetine)、丝裂霉素、依托泊甙、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光神霉素、更生霉素、1-双氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素以及其类似物或同源物。治疗剂包括但不限于，抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤，阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氮烯咪胺)、烷化剂(例如、氮芥(mechlorethamine)、thioepa苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、cyclothosphamide、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类药(例如、柔红霉素daunorubicin(以前称为柔红霉素daunomycin)和多柔比星)、抗生素(例如，更新霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))以及抗裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。本发明的缀合物可用于修饰给定的生物学反应。药物部分不解释为限定于化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有期望的生物学活性的蛋白质或多肽。此类蛋白可以包括例如毒素例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质例如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子、组织纤溶酶原激活物；或生物学反应修饰剂例如淋巴因子、白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。
还可以通过将抗CD20抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物与化学发光化合物偶联来可检测地标记所述的抗CD20抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物。然后，通过检测在发生化学反应的过程中产生的荧光的存在来确定化学发光标记的抗CD20抗体的存在情况。具体可用的化学发光标记化合物的实例为鲁米诺、异鲁米诺(isoluminol)、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
抗CD20抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物被可检测地标记的一种方式是通过将所述的抗CD20抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物与酶连接，并在酶免疫测定(EIA)中使用所得的连接产物(Voller，A.，″The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)″Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville，Md.，Diagnostic Horizons 2：1-7(1978)；Voller etal.，J.Clin.Pathol.31：507-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enrymol.73：482-523(1981)；Maggio，E.(ed.)，EnzymeImmunoassay，CRC Press，Boca Raton，Fla.，(1980)；Ishikawa，E.et al.，(ed s.)，Enzyme Immunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo(1981))。与所述的抗CD20抗体结合的酶与合适的底物(优选地显色底物)反应，以这种方式使得产生可以通过例如分光光度法、荧光法或目测方式检测的化学部分。可以用于以可检测地标记抗体的酶包括，但不限于：苹果酸脱氢酶、金黄色葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外，可以通过使用酶的显色底物的比色方法来完成所述的检测。还可以通过将底物的酶反应的程度与相似制备的标准品进行目视比较来完成检测。
还可以采用多种其他免疫测定法中的任何方法来完成检测。例如，使用放射性标记抗CD20抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物，可以通过利用放射性免疫测定(RIA)来检测抗体(例如参见Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Courseon Radioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，(March，1986)，这些文献以引用方式并入本文)。可以通过使用包括，但不限于γ计数器、闪烁计数器或放射自显影术在内的方法来检测放射性同位素。
还可以采用荧光发射金属(例如152Eu或镧系的其他元素)可检测地标记抗CD20抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物。利用例如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金属的螯合基团将这些金属与所述的抗体连接。
用于将各种部分缀合至抗CD20抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的技术是公知的，例如参见Arnon et al.(1985)，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy″，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，ed，Reisfeld et al.(Alan R.Liss，Inc.)，pp.243-56；Hellstromet al.，(1987)″Antibodies For Drug Delivery″，in ControlledDrug Delivery ed，Robinson et al.(2nd eds.，Marcel Dekker，Inc.)，pp.623-53；Thorpe(1985)，″Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review″，in MonoclonalAntibodies′84：Biological And Clinical Applications，Pincheraet al.ed，pp.475-506；″Analysis，Results，And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody InCancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies For Cancer DetectionAnd Therapy，ed.Baldwin et al.，Academic Press pp.303-16(1985)，以及Thorpe et al.(1982)，″The Preparation And CytotoxicProperties Of Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.62：119-58。
VI.抗体多肽的表达
可按照熟知的方法使用逆转录酶和DNA聚合酶同时或分开地制备编码抗体的轻链和重链的DNA序列。可以根据所公开的重链和轻链DNA以及氨基酸序列，通过共有的恒定区引物或通过更具有特异性的引物来开始PCR。如上文所讨论的那样，还可以利用PCR来分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况下，可以使用共有引物或更大的同源探针(例如小鼠恒定区探针)筛选文库。
可以采用本领域已知的技术从细胞中分离DNA，通常为质粒DNA，然后根据详细阐明(例如在关于重组DNA技术的现有文献中)的标准的公知的技术来制作限制性图谱并测序。当然，可以在分离过程或随后的分析过程中的任何时间点，根据本发明合成DNA。
在对用于提供本发明的C35抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的分离的基因材料进行处理后，通常将编码C35抗体的多核苷酸插入到用于引入宿主细胞中的表达载体中，其中所述的宿主细胞可以用于产生所需量的C35抗体。
与本文所述的靶分子(例如C35)结合的抗体或者其片段、衍生物或类似物(例如抗体的重链或轻链)的重组表达需要构建包含编码所述抗体的多核苷酸的表达载体。编码本发明的抗体分子或者抗体的重链或轻链、或者其部分(优选包含重链或轻链可变结构域)的多核苷酸一经获得，便可以采用本领域公知的技术通过重组DNA技术制备用于产生所述的抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达包含编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可以使用本领域的技术人员公知的方法来构建表达载体，所述的表达载体包含抗体编码序列、以及合适的转录和反应的调控信号。这些方法包括例如体内重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。因此，本发明提供了可复制的载体，其包含与启动子可操作地连接的、编码本发明抗体分子或者其重链或轻链、或重链或轻链可变结构域的核苷酸序列。这种载体可以包含编码所述的抗体分子的恒定区的核苷酸序列(例如参见PCT公开WO 86/05807；PCT公开WO 89/01036；和美国专利序号5,122,464)，并且所述抗体的可变结构域可以被克隆到这种载体中，以用于表达完整的重链或轻链。
术语“载体”或“表达载体”在本文中用于指根据本发明使用的、作为用于引入到宿主细胞中并在宿主细胞中表达所需的基因的媒介物的载体。如本领域的技术人员所知道的那样，这种载体可以容易地选自质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒。通常，与本发明相容的载体包含选择标记物、有助于克隆所需基因的合适的限制性位点、以及进入真核或原核细胞和/或在真核或原核细胞中复制的能力。
为了实现本发明的目的，可以使用多种表达载系统统。例如，一种类别的载体使用了衍生自动物病毒(例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒)的DNA元件。其他涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。此外，可以通过引入可对转染的宿主细胞进行选择一种或多种标记物来选择将所述DNA整合到其染色体中的细胞。所述的标记物可以提供针对营养缺陷型宿主的原营养、生物杀灭剂的抗性(例如抗生素)或者对重金属(例如铜)的抗性。可选择的标记物基因可以直接与待表达的DNA序列相连，或者通过共转化而被引入到相同的细胞中。还需要其他元件用于mRNA的最佳合成。这些元件包括信号序列、拼接信号、以及转录启动子、增强子和终止信号。
在特别优选的实施方式中，将克隆的可变区基因与按照上文所述合成的重链和轻链恒定区基因(优选为人的)一起插入到表达载体中。当然，本发明可以使用能够在真核细胞中引发表达的任何表达载体。合适的载体的实例包括，但不限于：质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2(来自Invitrogen，San Diego，CA)以及质粒pCI(来自Promega，Madison，WI)。通常，就表达了适当高水平的免疫球蛋白重链和轻链的细胞筛选大量转化细胞为常规试验，其可以通过(例如)自动系统来进行。
更通常的是，一旦制备出编码抗CD20抗体的单体亚单元的载体或DNA序列，便可以将表达载体引入到合适的宿主细胞中。可以采用本领域的技术人员公知的多种技术来完成质粒向宿主细胞中的引入。这些技术包括，但不限于：转染(包括电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、使用包膜DNA的细胞融合、显微注射以及使用完整病毒进行感染。参见Ridgway，(1988)″Mammalian Expression Vectors″Vectors，ed.Rodriguez和Denhardt(Butterworths，Boston，Mass.)，Chapter 24.2，pp.470-472。通常，向宿主中引入质粒是通过电穿孔进行的。使包含表达构建体的宿主细胞在适于产生轻链和重链的条件下生长，并就重链和/或轻链蛋白质的合成进行测试。示例性的测试技术包括酶联免疫吸附测试(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、荧光激活细胞分拣仪分析(FACS)、免疫组织化学等。
通过常规技术将表达载体转移到宿主细胞中，然后通过常规技术培养转染的细胞，从而产生在本文所述的方法中使用的抗体。因此，本发明包括宿主细胞，其包含编码与异源启动子可操作地连接的、本发明抗体或其重链或轻链的多核苷酸。在用于表达双链抗体的优选实施方式中，可以将既编码重链又编码轻链的载体在宿主细胞中共表达，从而表达完整的免疫球蛋白分子，如下文所述。
如本文所用，“宿主细胞”是指如下细胞，其包含采用重组DNA技术构建的并编码至少一个异源基因的载体。在从重组细胞分离抗体的过程的描述中，除非明确作出相反的说明，否则术语“细胞”和“细胞培养物”可交换使用，以表示抗体的来源。换言之，从“细胞”中回收多肽可以指由经离心的完整细胞中得到，或者由包含培养基和悬浮细胞的细胞培养物中得到。
可以使用多种宿主表达载体系统来表达在本文所述的方法中使用的抗体分子。这种宿主表达系统代表了如下媒介物，通过该媒介物，可以产生并随后纯化目的编码序列，而且所述的宿主表达系统还代表了如下细胞，当使用合适的核苷酸编码序列对该细胞进行转化或转染时，其可以原位表达本发明的抗体分子。这种宿主表达系统包括，但不限于如下微生物：使用包含抗体编码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的诸如细菌(例如大肠杆菌、枯草杆菌(B.subtilis))；使用包含抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如啤酒酵母(Saccharomyces)、毕赤酵母(pichia))；使用包含抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；使用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus，CaMV)、烟草花叶病毒(tobacco mosaicvirus，TMV))感染的、或者使用包含抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或者包含重组表达构建体(其包含衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒基因组(例如腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子)的启动子)的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BLK、293、3T3细胞)。优选地使用专门用于表达完整重组抗体分子的诸如大肠杆菌之类的细菌细胞，更优选地是真核细胞，来表达重组抗体分子。例如，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)之类的哺乳动物细胞与诸如来自人细胞巨化病毒的主要即刻早期基因启动子之类的载体相联合，是对于抗体的有效的表达系统(Foecking et al.，(1990)Gene 45：101(1986)；Cockett et al.，Bio/Technology 8：2)。
用于蛋白质表达的宿主细胞系通常是哺乳动物来源的；相信本领域的技术人员具有优先地确定具体的宿主细胞系的能力，所述的宿主细胞系最适合本文所述的、待表达的所需的基因产物。示例性的宿主细胞系包括，但不限于：CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR缺陷)、HELA(人子宫颈癌)、CVI(猴肾细胞系)、COS(具有SV40T抗原的CVI衍生物)、VERY、BHK(幼仓鼠肾细胞)、MDCK、293、WI38、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤细胞)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤细胞)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾细胞)。宿主细胞系通常来自商业机构、美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection)或者来自公开的文献。
此外，可以选择调节插入序列的表达、或者以所需的特定方式修饰并加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对于所述蛋白质的功能而言是重要的。对于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰而言，不同的宿主细胞具有特征性且特异性的机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统，以确保所表达的外源蛋白质的正确修饰和加工。至此，可以使用如下真核宿主细胞，其具有初始转录本进行适当的加工，并对基因产物进行糖基化和磷酸化的细胞机制。
为了长期、高产量地产生重组蛋白质，稳定的表达是优选的。例如，稳定地表达抗体分子的细胞系可以是经改造的。不使用包含病毒来源的复制物的表达载体，可以使用由合适的表达调控元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和可选择的标记物调控的DNA来转化宿主细胞。在引入了外源DNA之后，可以使改造的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换到选择性培养基中。重组质粒中的可选择标记物赋予了选择抗性，从而使细胞可以稳定地将质粒整合到其染色体中，并生长形成转化灶(foci)，该转化灶反过来可以被克隆并扩展到细胞系中。可以有利地使用该方法来对稳定表达抗体分子的细胞系进行改造。
可以分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中使用大量的选择系统，包括，但不限于：单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.(1977)，Cell11：223)基因、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska &Szybalski(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：202)基因和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy et al.(1980)，Cell 22：817)基因。此外，可以利用以下基因产生的抗代谢物的抗性来作为选择基础，所述的基因为：dhfr，其赋予了对甲氨蝶呤的抗性(Wigler et al.(1980)，Natl.Acad.Sci.USA 77：357；O’Hare et al.(1981)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527)；gpt，其赋予了对霉酚酸的抗性(Mulligan& Berg，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072)；neo，其赋予了对氨基糖苷G-418的抗性(Clinical Pharmacy 12：488-505；Wuand Wu(1991)，Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev(1993)，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan(1993)，Science260：926-932；以及Morgan and Anderson(1993)，Ann.Rev.Biochem.62：191-217；TIB TECH 11(5)：155-215(May，1993)；以及hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre et al.(1984)，Gene 30：147)。可以使用的、在重组DNA技术领域中通常已知的方法在Ausubel et al.(1993)，Current Protocols in Molecular Biology，(John Wiley& Sons，NY)；Kriegler(1990)，“Gene Transfer and Expression”in A Laboratory Manual(Stockton Press，NY)；以及在Chapters 12and 13，Dracopoli et al.(ed s)(1994)，Current Prolocols inHuman Genetics，(John Wiley & Sons，NY)；Colberre-Garapin etal.(1981)，J.Mol.Biol.150：1中有所描述，这些文献以引用方式全文并入本文。
可以通过载体的扩增来提高抗体分子的表达水平(综述，参见Bebbington and Hentschel(1987)“The use of vectors based on geneamplification for the expression of cloned genes in mammaliancells in DNA cloning“(Academic Press，NY)，Vol.3.)。当表达抗体的载体系统中的标记物是可扩增的时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂的水平提高会增加标记物基因的拷贝数。由于所扩增的区域与抗体基因有关，所述抗体的产量也增高(Grouse et al.(1983)，Mol.Cell.Biol.3：257)。
在体外，可以放大产量，从而得到大量所需的多肽。用于在组织培养条件下培养哺乳动物细胞的技术是本领域已知的，包括在例如气升式反应器或连续搅拌反应器中的异源悬浮培养或者在例如中空纤维、微囊中、琼脂糖微珠或陶瓷筒上的固定化或截留的细胞培养。如果必需和/或需要，多肽溶液可以在例如优先生物合成合成的铰链区多肽之后、或者在进行本文所述的HIC层析步骤之前或之后通过常规的层析方法(例如凝胶过滤、离子交换层析、在DEAE纤维素上层析或(免疫)亲和层析)来纯化。
编码本发明的抗CD20抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的基因还可以被诸如细菌、酵母或植物细胞之类的非哺乳动物细胞表达。容易获得核酸的细菌包括：肠杆菌科的成员，例如大肠杆菌或沙门氏菌菌株；芽孢杆菌科的成员，例如枯草杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌属的成员；链球菌属的成员；以及流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)。应该进一步理解，当异源多肽在细菌中表达时，该异源多肽通常成为包涵体的一部分。必须将异源多肽分离、纯化，然后组装到功能分子中。在需要抗体的四价形式时，可以将亚单元自组装到四价抗体中(WO02/096948A2)。
在细菌系统中，可以根据所计划的表达的抗体分子的用途来有利地选择多种表达载体。例如，当准备产生大量的所述蛋白质用于制备抗体分子的药物组合物时，指导了融合蛋白质产物(其易于纯化)高水平表达的载体是理想的。这种表达载体包括，但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther et al.(1983)，EMBO J.2：1791)，其中可以将抗体编码序列单独地连接到所述载体的lacZ编码区域的框架中，从而产生融合蛋白质；pIN载体(Inouye & Inouye(1985)，NucleicAcids Res.13：3101-3109；Van Heeke & Schuster(1989)，J.Biol.Chem.24：5503-5509)等。还可以使用pGEX载体表达与谷胱甘肽S-转移酶(GST)形成融合蛋白质的外源多肽。通常，这种融合蛋白质是可溶的，并且可以通过吸附并结合到基质谷胱甘肽琼脂糖珠子上、然后通过在游离谷胱甘肽存在的条件下洗脱，从裂解细胞中纯化。pGEX载体经设计以包含凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，使得可以从GST部分中释放出克隆的目标基因产物。
除了原核生物外，还可以使用真核微生物。在真核微生物中，最通常使用的是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通的发酵面包酵母，但是大量的其他菌株(例如巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris))通常也可以利用。
为了在酿酒酵母(Saccharomyces)中表达，通常使用例如质粒YRp7(Stinchcomb et al.(1979)，Nature 282：39；Kingsman et al.(1979)，Gene 7：141；Tschemper et al.(1980)，Gene 10：157)。这种质粒已经包含了TRP1基因，该基因提供了缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株(例如ATCC No.44076或PEP4-1)的选择标记物(Jones(1977)，Genetics 85：12)。那么，作为酵母宿主细胞基因组特征的trp1病变提供了用于通过缺乏色氨酸条件中生长检测转化的有效环境。
在昆虫系统中，通常使用苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcNPV)作为表达外源基因的载体。该病毒在草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞中生长。可以将抗体编码序列单独地克隆到所述病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)中，并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的调控之下。
一旦本发明的抗体分子被重组表达，便可以通过用于纯化免疫球蛋白分子领域中的任何已知的方法(例如层析(例如离子交换层析、亲和层析，特别是对蛋白质A之后的特异性抗原的亲和层析)以及分子筛柱层析)、离心、差异溶解或用于纯化蛋白质的任何其他标准的技术)来纯化该抗体分子。备选地，用于增加本发明抗体的亲和力的优选方法在US 2002/0123057A1中有所公开。
VII.使用治疗性抗CD20抗体的疗法
本发明的方法涉及抗CD20抗体包括其抗原结合片段、变体和衍生物用于治疗患有与表达CD20的细胞相关的疾病的患者的用途。“表达CD20的细胞”意指正常和恶性的表达CD20抗原的B细胞。用于检测CD20表达的方法在本领域内是熟知的，其包括但不限于PCR技术、免疫组织化学、流式细胞计量术、Western印迹法、ELISA等。“恶性”B细胞意指任何赘生性B细胞，包括但不限来源于淋巴瘤(包括低度、中度和高度B细胞淋巴瘤)、免疫母细胞性淋巴结瘤(immunoblasticlymphoma)、非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏病、EB病毒(EBV)诱导的淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、以及B细胞急性淋巴母细胞性白血病、骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性成髓细胞白血病等的B细胞。
虽然下列描述提及使用本发明的抗CD20抗体进行的对多种疾病或病症的诊断方法和治疗，但本文中描述的方法还可用于保持本发明的抗CD20抗体的期望的性质(即能够特异性结合CD20和具有增加的CDC活性和/或增加的对CD20抗原的结合亲和力)的这些抗CD20抗体的抗原结合片段、变体和衍生物。
“治疗”在本文中定义为对患者应用或施用抗CD20抗体，或对来自患者的分离的组织或细胞系应用或施用抗CD20抗体，其中患者具有疾病、疾病的症状或对疾病的易感性，其中目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救(remedy)、改善、好转或影响疾病、疾病的症状或对疾病的易感性。“治疗”也意指对患者应用或施用包含抗CD20抗体的药物组合物，或对来自患有疾病、疾病的症状或对疾病的易感性的患者的分离的组织或细胞系应用或施用包含抗CD20抗体的药物组合物，其中目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、好转或影响疾病、疾病的症状或对疾病的易感性。
“抗肿瘤活性”意指减小恶性的表达CD20细胞增殖或积累的速度，从而降低现有肿瘤的或者在现有赘生性(肿瘤)细胞或新形成的赘生性细胞的治疗和/或破坏过程中产生的肿瘤的生长速度，从而减小治疗过程中肿瘤的总体大小。“抗炎活性”意指炎症的减小或预防。使用至少一种抗CD20抗体的治疗引起生理反应，所述生理反应对于治疗与人中表达CD20的细胞相关的疾病状态是有益的。
这样，本发明的方法用于治疗与异常的不受控制的B细胞增殖或积累相关的非何杰金氏淋巴瘤。为发本发明的目的，此类淋巴瘤将按照Working Formulation分类方案归类，即这些B细胞淋巴瘤分类为低度、中度和高度的B细胞淋巴瘤(参见″The Non-Hodgkin′s LymphomaPathologic Classification Project″in Cancer 49：2112-2135(1982))。因此，低度B细胞淋巴瘤包括小淋巴细胞性淋巴瘤、滤泡性小裂细胞性淋巴瘤(Follicular small-cleaved cell lymphoma)和滤泡性小裂与大细胞混合型淋巴瘤(Follicular mixed small-cleavedand large cell lymphomas)；中度淋巴瘤包括滤泡性大细胞淋巴瘤、弥散性小裂细胞性淋巴瘤(diffuse small cleaved cell lymphoma)、弥散性混合小和大细胞淋巴瘤(diffuse mixed small and large celllymphoma)以及弥散性大细胞淋巴瘤；和高度淋巴瘤包括Burkitt′s和非Burkitt′s类型的大细胞免疫母细胞淋巴瘤(large cellimmunoblastic lymphoma)、淋巴母细胞性淋巴瘤(lymphoblasticlymphoma)和小型非裂开性细胞淋巴瘤(small non-cleaved celllymphoma)。
已认识到，本发明的方法用于按照修正的欧洲和美国淋巴瘤分类(Revised European and American Lymphoma Classification，REAL)系统分类的B细胞淋巴瘤的治疗性处理。此类B细胞淋巴瘤包括但不限于分类为前体B细胞赘生物的淋巴瘤，例如B淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤；外周B细胞赘生物(peripheral B cell neoplasms)，包括B细胞慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤(lymphopla smacytoid lymphoma)/免疫细胞瘤、外套细胞淋巴瘤(MCL)、滤泡性中央淋巴瘤(follicle center lymphoma)(滤泡)(包括弥散性小细胞淋巴瘤、弥散性混合小和大细胞淋巴瘤以及弥散性大细胞淋巴瘤)、脾边缘带B细胞淋巴瘤(包括结外、结和脾类型)、毛细胞性白血病、浆细胞瘤/骨髓瘤、亚型原发性纵隔(胸腺的)的弥散性大细胞B细胞淋巴瘤、Burkitt′s淋巴瘤和Burkitt′s样高度B细胞淋巴瘤；急性白血病；急性淋巴细胞性白血病；髓细胞性白血病；急性髓细胞白血病；早幼粒细胞性白血病；粒-单核细胞白血病；单核细胞白血病；红细胞白血病；粒细胞白血病(慢性髓细胞白血病)；慢性淋巴细胞性白血病；真性红细胞增多症；多发性骨髓瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血；重链疾病；和不可分类的低度或高度B细胞淋巴瘤。
已认识到，本发明的方法可用于阻止在治疗过程中产生的另外的肿瘤长出。本发明的方法特别适合用于治疗患有低度B细胞淋巴瘤的受试者，特别是在标准化疗后复发的受试者。低度B细胞淋巴瘤没有中度和高度B细胞淋巴瘤活跃，并且特征在于复发/缓和病程(relapsing/remitting course)。因此，使用本发明的方法可改进这些淋巴瘤的治疗，因为复发事件在次数和严重度上得到减少。
根据本发明的方法，至少一种本文其他地方定义的抗CD20抗体用于促进对恶性人B细胞的阳性治疗反应。关于癌症治疗的“阳性治疗反应”意指与这些抗体或其片段的抗肿瘤活性相关的疾病的改善，和/或与所述疾病相关的症状的改善。即，可观察到抗增殖效应、防止另外的肿瘤长出、减小肿瘤大小、减少肿瘤细胞数目和/或减少与疾病相关的一个或多个症状的。因此，例如，疾病的改善可表征为完全反应。“完全反应”意指缺乏具有任何之前异常的放射照相研究、骨髓和脑脊液(CSF)的正常化的临床可检测疾病。这样的反应必须在按照本发明的方法治疗后持续至少一个月。备选地，疾病的改善可分类为是部分反应。“部分反应”意指在新病变不存在的情况下所有可测量的肿瘤负荷(即，存在于受试者中的肿瘤细胞的数目)减少至少大约50％，并且持续至少一个月。这样的反应只可用于可测量的肿瘤。
可使用筛选技术例如磁共振成像(MRI)扫描、x射线成像、计算机断层(CT)扫描、生物发光成像例如荧光素酶成像、骨扫描成像和肿瘤活组织检查取样包括骨髓穿刺(BMA)来就肿瘤形态学(即，总肿瘤负荷(tumor burden)、肿瘤大小等)的变化评估肿瘤反应。除了这些阳性治疗反应外，经历使用抗CD20抗体治疗的受试者可经历改善与这些疾病相关的症状的有益效应。因此对于B细胞肿瘤，受试者可经历所谓的B症状即盗汗、发烧、体重减轻和/或荨麻疹的减少。
本文中描述的抗CD20抗体还可用于与表达CD20的细胞相关的炎性疾病和免疫系统的缺陷或病症的治疗，所述疾病包括但不限于全身性红斑狼疮、银屑病、硬皮病、CREST综合征、炎症性肌病、斯耶格伦综合征(Sjogren′s syndrome)、混合结缔组织病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎性肠疾病、急性呼吸窘迫综合征、肺炎(pulmonaryinflammation)、特发性肺纤维化、骨质疏松症、迟发型超敏反应、哮喘、原发性胆汁性肝硬化和特发性血小板减少性紫癜。
炎性疾病特征在于炎症和组织破坏或其组合。“炎性疾病”包括任何炎性免疫介导的过程，其中免疫反应的起始事件或靶牵涉非自身抗原，包括例如同种抗原、异种抗原、病毒抗原、细菌抗原、未知抗原或变应原。
此外，为了本发明的目的，要语“炎性疾病”包括“自身免疫性疾病”。如本文中所使用的，术语“自身免疫”通常理解为包括牵涉“自身”抗原的炎性免疫介导的过程。在自身免疫性疾病中，自身抗原触发宿主免疫反应。
同样，本发明包括治疗与组织移植排斥相关的炎症。“移植排斥”或“移植物排斥”是指抗移植物(包括但不限于HLA抗原、血型抗原等)的任何宿主发动的免疫反应。
本发明还可用于治疗移植物抗宿主病，例如与骨髓移植相关的移植物抗宿主病。在这样的移植物抗宿主病中，供体骨髓包含淋巴细胞和成熟为淋巴母细胞的细胞。供体的淋巴细胞将受体的抗原识别为非自身的并且发动炎性免疫反应。因此，如本文中所使用的，“移植物抗宿主病”或“移植物抗宿主反应”是指其中供体淋巴细胞与宿主抗原反应的任何T细胞介导的免疫反应。
可按照本发明的方法使用本文中描述的抗CD20来治疗自身免疫性和/或炎性病症，包括但不限于全身性红斑狼疮(SLE)、盘状狼疮、狼疮性肾炎、结节病、炎症性关节炎(包括幼年型关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、莱特尔综合征、强直性脊柱炎和痛风性关节炎)、器官或组织移植的排斥、超急性、急性或慢性排斥和/或移植物抗宿主病、多发性硬化症、高IgE综合征、结节性多动脉炎、原发性胆汁性肝硬化、炎性肠病、克罗恩病、乳糜泻(谷蛋白敏感性肠病)、自身免疫性肝炎、恶性贫血、自身免疫性溶血性贫血、银屑病、硬皮病、重症肌无力、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性甲状腺炎、Graves病、桥本甲状腺炎、免疫复合物病、慢性疲劳免疫功能紊乱综合征(CFIDS)、多肌炎和皮肌炎、冷球蛋白血症、血栓溶解、心肌病、寻常性天疱疮、肺间质纤维化、I型和II型糖尿病、1、2、3和4型延迟型超敏反应、过敏症或变应性紊乱、对治疗性蛋白的不想要的/不期望的免疫反应(参见例如，美国专利申请号US 2002/0119151和Koren，等人(2002)Curr.Pharm.Biotechnol.3：349-60)、哮喘、丘-施二氏综合征(变应性肉芽肿病)、特应性皮炎、过敏性和刺激性接触性皮炎、瘾疹、IgE-介导的过敏症、动脉硬化、血管炎、特发性炎性肌病、溶血性疾病、阿尔茨海默氏病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经炎等。在一些其他实施方式中，本发明的抗CD20抗体用于治疗肺炎，包括但不限于肺移植排斥、哮喘、结节病、肺气肿、囊性纤维症、特发性肺纤维化、慢性支气管炎、过敏性鼻炎和肺的变应性疾病例如过敏性肺炎、嗜酸粒细胞性肺炎、由于骨髓和/或肺移植或其他病因引起的闭塞性细支气管炎、移植物动脉粥样硬化/移植物静脉硬化以及由胶原、血管和自身免疫性疾病例如类风湿性关节炎和红斑狼疮引起的肺纤维化(pulmonary fibrosis)。
根据本发明的方法，至少一种本文中其他地方定义的抗CD20抗体用于促进对于自身免疫性疾病和/或炎性疾病的治疗或预防的阳性治疗反应。关于自身免疫性疾病和/或炎性疾病的“阳性治疗反应”意指与这些抗体的抗炎活性相关疾病的改善和/或与所述疾病相关的症状的改善。即，可观察到抗增殖效应、防止表达CD20的细胞的另外增殖、减少炎症反应包括但不限于减少的炎性细胞因子、附着分子、蛋白酶、免疫球蛋白(在其中具有CD20的细胞是B细胞的情况下)的分泌、及其组合等等、增加抗炎性蛋白的产生、减少自体反应细胞数目、增加免疫耐受性、抑制自体反应细胞的存活和/或减少由表达CD20的细胞的刺激介导的一种或多种症状。此类阳性治疗反应不受限于施用途径并且可包括对供体、供体组织(例如器官输注)、宿主的施用、其任何组合等的施用。
可使用筛选技术例如磁共振成像(MRI)扫描、x射线成像、计算机断层(CT)扫描、流式细胞计量术或荧光激活细胞分选器(FACS)分析、组织学、总病理学(gross pathology)和血液化学来评估临床反应，包括但不限于可通过ELISA、RIA、层析等检测的变化。除了这些阳性治疗反应外，使用抗CD20抗体或其抗原结合片段的治疗的受试者可经历改善与所述疾病相关的症状的有益效应。
“治疗有效剂量或量”或“有效量”意指当施用时对于患有与表达CD20的细胞相关疾病的患者的治疗产生阳性治疗反应的抗CD20的量。在本发明的一些实施方式中，抗CD20抗体的治疗有效剂量在大约0.01mg/kg至大约40mg/kg、大约0.01mg/kg至大约30mg/kg、大约0.1mg/kg至大约30mg/kg、大约1mg/kg至大约30mg/kg、大约3mg/kg至大约30mg/kg、大约3mg/kg至大约25mg/kg、大约3mg/kg至大约20mg/kg、大约5mg/kg至大约15mg/kg或大约7mg/kg至大约12mg/kg的范围内。已认识到，本发明的方法可包括抗CD20抗体的治疗有效剂量的单次施用或抗CD20抗体的治疗有效剂量的多次施用。
抗CD20抗体可以与已知的化学治疗剂和细胞因子组合使用以治疗包括表达CD20细胞的疾病状态。例如，本发明的抗CD20抗体可以与细胞因子例如白细胞介素-2组合使用。在另一个实施方式中，本发明的抗CD20抗体可以与利妥昔单抗(IDEC-C2B8；
Figure A20078004286600901
IDECPharmaceuticals Corp.，San Diego，California)组合使用。
这样，本文中描述的抗CD20抗体与至少一种其他癌症疗法组合施用，所述癌症疗法包括但不限于手术或手术操作(例如脾切除术、肝切除、淋巴结切除术、白细胞生成(leukophoresis)、骨髓移植等)；放射疗法；化学疗法，任选地与自体骨髓移植术组合，其中合适的化学治疗剂包括但不限于氟达拉滨或磷酸氟达拉滨、苯丁酸氮芥、长春新碱、喷司他丁、2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨)、环磷酰胺、多柔比星、泼尼松和其组合，例如，包含蒽环类抗生素的方案例如CAP(环磷酰胺、多人心+泼尼松)、CHOP(环磷酰胺、长春新碱、泼尼松+多柔比星)、VAD(长春新碱、多柔比星+地塞米松)、MP(美法仑+泼尼松)，和用于化学疗法的其他细胞毒性和/或治疗剂例如米托蒽醌、柔红霉素、伊达比星、天冬酰胺酶，和抗代谢物包括但不限于阿糖胞苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤和奈拉滨；其他抗癌单克隆抗体疗法(例如，阿仑珠单抗
Figure A20078004286600911
或靶向恶性B细胞上的CD52细胞表面糖蛋白的其他抗CD52抗体；利妥昔单抗
Figure A20078004286600912
完全人抗体HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫单抗/I-131托西莫单抗替伊莫单抗
Figure A20078004286600914
或靶向恶性B细胞上的CD20抗原的其他治疗性抗CD20抗体；抗CD 19抗体(例如，MT 103，双特异性抗体)；抗CD22抗体(例如，人源化单克隆抗体依帕珠单抗)；贝伐珠单抗
Figure A20078004286600915
或靶向人血管内皮生长因子的其他抗癌抗体；靶向恶性B细胞上的CD22抗原的抗CD22抗体(例如，单克隆抗体BL-22，一种CD22毒素)；靶向巨噬细胞集落刺激因子α-M-CSF抗体；靶向在多发性骨髓瘤中过度表达核因子κB(RANK)和其配体(RANKL)的受体激活物的抗体；靶向恶性B细胞上的CD23抗原的抗CD23抗体(例如，IDEC-152)；靶向CD80抗原的抗CD80抗体(例如，IDEC-114)；靶向恶性B细胞上的CD38抗原的抗CD38抗体；靶向在恶性B细胞上表达的主要组织相容性复合物II类受体的抗体(抗MHC抗体)；靶向恶性B细胞上的CD40抗原的抗CD40抗体(例如，SGN-40)；和靶向在许多造血来源的实体瘤和肿瘤上表达的肿瘤坏死因子相关诱导凋亡的配体受体1(TRAIL-R1)(例如，拮抗性人单克隆抗体HGS-ETR1)和TRAIL-R2的抗体；基于小分子的癌症疗法，包括但不限于微管和/或拓扑异构酶抑制剂(例如，有丝分裂抑制剂多拉司他汀和多拉司他汀类似物；微管结合剂T900607；XL119；和拓扑异构酶抑制剂氨基喜树碱)、SDX-105(盐酸苯达莫司汀)、ixabepilone(epothilone类似物，也称为BMS-247550)、蛋白激酶C抑制剂，例如米哚妥林((PKC-412、CGP 41251、N-苯甲酰星状孢子素)、匹蒽醌、乐沙定(抗肿瘤剂)、硝酸镓(硝酸镓)、
Figure A20078004286600916
(沙立度胺)、沙立度胺的免疫调节衍生物(例如，来那度胺(以前称为revimid))、AffinitakTM(蛋白激酶C-α的反义抑制剂)、SDX-101(R-依托度酸，诱导恶性淋巴细胞的凋亡)、第二代嘌呤核苷类似物例如氯法拉滨、癌细胞产生蛋白Bcl-2的抑制剂(例如，反义试剂oblimersen和
Figure A20078004286600921
)、蛋白酶体抑制剂(例如，VelcadeTM(硼替佐米))、小分子激酶抑制剂(例如，CHIR-258)、小分子VEGF抑制剂(例如，ZD-6474)、热激蛋白(HSP)90的小分子抑制剂(例如，17-AAG)、组蛋白脱乙酰基酶的小分子抑制剂(例如，杂种/极性细胞分化HPC)试剂例如suberanilohydroxamic acid(SAHA)和FR-901228)和凋亡剂例如
Figure A20078004286600922
(三氧化二砷)和
Figure A20078004286600923
(莫特沙芬钆)；基于疫苗/免疫疗法的癌症疗法包括但不限于疫苗方法(例如，Id-KLH、oncophage、vitalethine)、个性化免疫疗法或活性独特型免疫疗法(activeidiotype immunotherapy)(例如，
Figure A20078004286600924
个性化免疫疗法，以前称为GTOP-99)、
Figure A20078004286600925
(CpG 7909，toll样受体9(TLR9)的合成激动剂)、干扰素α疗法、白细胞介素-2(IL-2)疗法、IL-12疗法、IL-15疗法和IL-21疗法；类固醇疗法；或其他癌症疗法；其中在抗CD20抗体疗法之前、期间或之后施用另外的癌症疗法。
因此，当组合疗法包括将抗CD20抗体的施用与另一种治疗剂例如与化学疗法、放射疗法、其他抗癌抗体疗法、基于小分子的癌症疗法或基于疫苗/免疫疗法的癌症疗法的施用组合时，本发明的方法包括使用分开的制剂或单一的药物制剂的共施用以及以任一种顺序相继施用。当本发明的方法包括组合治疗方案时，这些疗法可同时提供，即将抗CD20抗体与其他癌症疗法同时施用或在与其他癌症疗法相同的时期内施用(即，所述疗法同时进行，但不用精确地在与其他癌症疗法相同的时间上施用抗CD20抗体)。备选地，还可在其他癌症疗法之前或之后施用本发明的抗CD20抗体。无论被治疗的受试者是否对第一疗程作出反应，可进行不同癌症疗法的相继施用从而减少缓解或复发的可能性。当组合疗法包括抗CD20抗体的施用与细胞毒性剂的使用组合时，优选在施用细胞毒性剂之前施用抗CD20抗体。
在本发明的一些实施方式中，将本文中描述的抗CD20抗体与化学疗法组合施用，和任选地与自体骨髓移植组合施用，其中抗体和化学治疗剂可以以任何顺序相继施用或同时施用(即，共同或在相同的时期内)。合适的化学治疗剂的实例包括但不限于氟达拉滨或磷酸氟达拉滨、苯丁酸氮芥、长春新碱、喷司他丁、2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨)、环磷酰胺、多柔比星、泼尼松和其组合，例如，包含蒽环类抗生素的方案例如CAP(环磷酰胺、多柔比星+泼尼松)、CHOP(环磷酰胺、长春新碱、泼尼松+多柔比星)、VAD(长春新碱、多柔比星+地塞米松)、MP(美法仑+泼尼松)和用于化学疗法的其他细胞毒性和/或治疗剂例如米托蒽醌、柔红霉素、伊达比星、天冬酰胺酶，和抗代谢物，包括但不限于阿糖胞苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺，6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤和奈拉滨。在一些实施方式中，在用化学治疗剂治疗之前施用抗CD20抗体。在备选实施方式中，在用化学治疗剂治疗之后施用抗CD20抗体。在其他实施方式中，将化学治疗剂与抗CD20抗体同时施用。
因此，例如，在一些实施方式中，抗CD20抗体与氟达拉滨或磷酸氟达拉滨组合使用。在一个这样的实施方式中，在施用氟达拉滨或磷酸氟达拉滨之前施用抗CD20抗体。在备选实施方式中，在使用氟达拉滨或磷酸氟达拉滨治疗之后施用抗CD20抗体。在其他实施方式中，氟达拉滨或磷酸氟达拉滨与抗CD20抗体同时施用。
在本发明的其他实施方式中，将苯丁酸氮芥(烷化剂)与本文中描述的抗CD20抗体组合施用。在一个这样的实施方式中，在施用苯丁酸氮芥之前施用抗CD20抗体。在备选实施方式中，在使用苯丁酸氮芥的治疗后施用抗CD20抗体。在其他实施方式中，将苯丁酸氮芥与抗CD20抗体同时施用。
在其他实施方式中，包含蒽环类抗生素的方案例如CAP(环磷酰胺、多柔比星+泼尼松)和CHOP(环磷酰胺，长春新碱，泼尼松+多柔比星)可与本文中描述的抗CD20抗体的施用组合。在一个这样的实施方式中，在施用包含蒽环类抗生素的方案之前施用抗CD20抗体。在其他实施方式中，在使用包含蒽环类抗生素的治疗方案之后施用抗CD20抗体。在其他实施方式中，将包含蒽环类抗生素的治疗方案与抗CD20抗体同时施用。
在备选实施方式中，将本文中描述的抗CD20抗体与阿仑珠单抗(
Figure A20078004286600941
由Berlex Laboratories，Richmond，California分配)组合施用。阿仑珠单抗是靶向恶性B细胞上表达的CD52抗原的重组人源化单克隆抗体(Campath-1H)。在一个这样的实施方式中，在施用阿仑珠单抗之前施用抗CD20抗体。在其他实施方式中，在使用阿仑珠单抗的治疗之后施用抗CD20抗体。在其他实施方式中，将阿仑珠单抗与抗CD20抗体同时施用。
在备选实施方式中，将本文中描述的抗CD20抗体与靶向恶性B细胞上的CD20抗原的另一种治疗性抗CD20抗体组合施用，所述另一种治疗性抗CD20抗体是例如，利妥昔单抗
Figure A20078004286600942
完全人抗体HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫单抗/I-131托西莫单抗
Figure A20078004286600943
或替伊莫单抗在一个这样的实施方式中，在施用其他抗CD20抗体之前施用本发明的抗CD20抗体。在其他实施方式中，在使用其他抗CD20抗体的治疗之后施用本发明的抗CD20抗体。在其他实施方式中，将本发明的抗CD20抗体与其他抗CD20抗体同时施用。
在备选实施方式中，将本文中描述的抗CD20抗体与基于小分子的癌症疗法组合施用，所述基于小分子的癌症疗法包括但不限于微管和/或拓扑异构酶抑制剂(例如，有丝分裂抑制剂多拉司他汀和多拉司他汀类似物；微管结合剂T900607；XL119；和拓扑异构酶抑制剂氨基喜树碱)、SDX-105(盐酸苯达莫司汀)、ixabepilone(epothilone类似物，也称为BMS-247550)、蛋白激酶C抑制剂，例如米哚妥林((PKC-412、CGP 41251、N-苯甲酰星状孢子素)、匹蒽醌、乐沙定(一种抗肿瘤剂)、硝酸镓(硝酸镓)、
Figure A20078004286600945
(沙立度胺)、沙立度胺的免疫调节衍生物(例如，来那度胺(以前称为revimid))、AffinitakTM(蛋白激酶C-α的反义抑制剂)、SDX-101(R-依托度酸，诱导恶性淋巴细胞的凋亡)、第二代嘌呤核苷类似物例如氯法拉滨、癌细胞产生蛋白Bcl-2的抑制剂(例如，反义试剂oblimersen和)、蛋白酶体抑制剂(例如，VelcadeTM(硼替佐米))、小分子激酶抑制剂(例如，CHIR-258)、小分子VEGF抑制剂(例如，ZD-6474)、热激蛋白(HSP)90的小分子抑制剂(例如，17-AAG)、组蛋白脱乙酰基酶的小分子抑制剂(例如，杂种/极性细胞分化HPC)试剂例如suberanilohydroxamic acid(SAHA)和FR-901228)和凋亡剂例如
Figure A20078004286600952
(三氧化二砷)和
Figure A20078004286600953
(莫特沙芬钆)；在一个这样的实施方式中，在施用基于小分子的癌症疗法之前施用抗CD20抗体。在其他实施方式中，在使用基于小分子的癌症疗法的治疗之后，施用抗CD20抗体。在其他实施方式中，将基于小分子的癌症疗法与抗CD20抗体同时施用。
在其他实施方式中，本文中描述的抗CD20抗体可与基于疫苗/免疫疗法的癌症疗法组合施用，所述基于疫苗/免疫疗法的癌症疗法包括但不限于疫苗方法(例如，Id-KLH、oncophage、vitalethine)、个性化免疫疗法或活性独特型免疫疗法(例如，
Figure A20078004286600954
个性化免疫疗法，以前称为GTOP-99)、
Figure A20078004286600955
(CpG 7909，toll样受体9(TLR9)的合成激动剂)、干扰素α疗法、白细胞介素-2(IL-2)疗法、IL-12疗法、IL-15疗法或IL-21疗法；或类固醇疗法。在一个这样的实施方式中，在施用基于疫苗/免疫疗法的癌症疗法之前施用抗CD20抗体。在其他实施方式中，在使用基于疫苗/免疫疗法的癌症疗法的治疗之后施用抗CD20抗体。在其他实施方式中，将基于疫苗/免疫疗法的癌症疗法与抗CD20抗体同时施用。
在一个这样的实施方式中，可将本文中描述的抗CD20抗体与IL-2组合使用。IL-2是已知的在被治疗的患者中扩增天然杀伤(NK)效应细胞的数目的试剂，可在本发明的抗CD20抗体之前施用或与其共施用。这种NK效应细胞数目的扩增可导致施用抗CD20抗体的增强的ADCC活性。在其他实施方式中，IL-21，当与本文中描述的抗CD20抗体组合施用时，用作免疫治疗剂来刺激NK细胞活性。
本发明的抗CD20抗体可与用于自身免疫性和炎性疾病的任何已知疗法组合使用，所述疗法包括已知用于或已经用于或目前用于以治疗自身免疫性和炎性疾病的任何试剂或试剂的组合。此类疗法和治疗剂包括但不限于手术或手术操作(例如脾切除术、淋巴结切除术、甲状腺切除术、血浆去除术、白细胞生成、细胞、组织或器官移植、肠内手术(intestinal procedure)、器官灌注(organ perfusion)等)、放射疗法、例如类固醇疗法和非类固醇疗法的疗法、激素疗法、细胞因子疗法、使用皮肤病药(例如，用于治疗皮肤状况例如过敏症、接触性皮炎和银屑病的局部试剂)的疗法、免疫抑制疗法和其他抗炎单克隆抗体疗法等。这样，将本文中描述的抗CD20抗体与至少一种其他疗法组合施用，所述其他疗法包括但不限于手术、器官灌注、放射疗法、类固醇疗法、非类固醇疗法、抗生素疗法、抗真菌疗法、激素疗法、细胞因子疗法、使用皮肤病药(例如，用于治疗皮肤病状例如过敏症、接触性皮炎和银屑病的局部试剂)的疗法、免疫抑制疗法、其他抗炎单克隆抗体疗法、其组合等。因此，当组合疗法包括将抗CD20抗体的施用与另一种治疗剂(如与类固醇类)的施用组合时，本发明的方法包括使用分开的制剂或单一的药物制剂的共施用以及以任一种顺序相继施用。
当本发明的方法包括组合治疗方案时，可同时提供这些疗法，即，抗CD20抗体与其他疗法同时施用或与其他疗法在相同的时期内施用(即，疗法同时进行，但不用精确地在与其他疗法相同的时间上施用抗CD20抗体)。备选地，本发明的抗CD20抗体还可在其他疗法之前或之后施用。无论被治疗的受试者是否对第一疗程作出反应，可进行不同癌症疗法的相继施用从而减少好转或复发的可能性。
在本发明的一些实施方式中，将本文中描述的抗CD20抗体与免疫抑制剂或抗炎剂组合施用，其中抗体和治疗剂可以以任何顺序相继施用或同时施用(即，共同地或在相同的时期内)。可与本发明的抗CD20抗体组合施用的合适的免疫抑制剂的实例包括但不限于甲氨蝶呤、环磷酰胺、咪唑立宾、苯丁酸氮芥、环孢霉素，例如雾化的环孢霉素(参见，美国专利申请公开号US20020006901，以其全文引用合并入本文)，他克莫司(FK506；ProGrafTM)、麦考酚酸吗乙酯和硫唑嘌呤(6-巯基嘌呤)、西罗莫司(雷怕霉素)、脱氧精胍菌素、来氟米特和其malononitriloamide类似物；和免疫抑制蛋白，包括，例如，抗CTLA4抗体和Ig融合物、抗B淋巴细胞刺激物抗体(例如，LYMPHOSTAT-BTM)和Ig融合物(BLyS-Ig)、抗CD80抗体和依那西普
Figure A20078004286600971
以及抗T细胞抗体例如抗CD3(OKT3)、抗CD4等。合适的抗炎剂的实例包括但不限于皮质激素例如氯倍他索、卤倍他索、氢化可的松、曲安西龙、倍他米松、氟轻松(fluocinole)、醋酸氟轻松(fluocinonide)、泼尼松、泼尼松龙、甲基氢化泼尼松；非类固醇类抗炎剂(NSAID)例如柳氮磺吡啶、包含5-氨基水杨酸的药物(称为5-ASA剂)、塞来考昔、双氯芬酸、依托度酸、fenprofen、氟吡洛芬、布洛芬、酮基布洛芬、meclofamate、美洛昔康、萘普酮、甲氧萘丙酸、噁丙嗪、吡罗昔康、罗非考昔、水杨酸盐、舒林酸和托美汀；抗炎性抗体例如阿达木单抗(
Figure A20078004286600972
TNF-α拮抗剂)和英夫利昔单抗(TNF-α拮抗剂)等。
移植排斥和移植物抗宿主病可以是超急性(体液)、急性(T细胞介导的)或慢性(未知的病因学)或其组合。因此，本发明的抗CD20抗体在一些实施方式中用于预防和/或改善与任何组织的超急性、急性和/或慢性移植排斥相关的排斥和/或症状，所述组织包括但不限于肝、肾、胰腺、胰岛细胞、小肠、肺、心脏、角膜、皮肤、血管、骨、异体骨髓(heterologous bone marrow)或自体骨髓等。移植组织可从任何供体获得和移植入任何受体宿主，从而移植过程可包括将动物组织移植至人(例如，异种移植)，将来自一个人的组织移植至另一个人(例如，同种异体移植)，和/或将组织从人体的一个部分移植至另一个部分(例如，自体移植)。使用本发明的抗体的治疗还可减少移植后遗症例如发烧、厌食、血液动力异常(hemodynamic abnormality)、白细胞减少、移植的器官/组织的白细胞浸润以及机会感染。
在一些实施方式中，本发明的抗CD20抗体可单独地或与免疫抑制剂组合使用来治疗和/或预防移植排斥例如超急性，急性和/或慢性排斥和/或移植物抗宿主病。因此，在其中本发明的抗CD20抗体用于治疗移植物排斥的一些实施方式中，抗体可与合适的免疫抑制剂组合使用，所述免疫抑制剂包括但不限于甲氨蝶呤；环磷酰胺；咪唑立宾；苯丁酸氮芥；环孢霉素，例如，雾化的环孢霉素(参见，美国专利申请公开号US20020006901，通过以其全文引用合并入本文)、他克莫司(FK506；ProGrafTM)，麦考酚酸吗乙酯和硫唑嘌呤(6-巯基嘌呤)，西罗莫司(雷怕霉素)，脱氧精胍菌素，来氟米特和其malononitriloamide类似物；和免疫抑制蛋白包括例如，抗CTLA抗体和Ig融合物、抗B淋巴细胞刺激物抗体(例如，LYMPHOSTAT-BTM)和Ig融合物(BLyS-Ig)、抗CD80抗体和依那西普
Figure A20078004286600981
以及抗T细胞抗体例如抗CD3(OKT3)、抗CD4等。
这样，特别地涉及，本发明的组合物和方法与其他药剂组合使用以进一步改善移植受体例如接受例如肺移植物的受体的症状和结果。因此，在一些实施方式中，本发明的抗CD20抗体单独地或与胃肠外和/不经肠施用的环孢霉素组合用于治疗移植排斥(例如，肺移植受体中的超急性、急性和/或慢性排斥或移植物抗宿主病)，所述环孢霉素包括例如口服环孢霉素，可注射的环孢霉素、雾化的(例如，吸入的)环孢霉素和其组合。在其中至少疗法的一种组分是雾化的环孢霉素的一些实施方式中，通过使用例如加压的递送装置或喷雾器以喷雾剂形式存在的环孢霉素来将环孢霉素递送至受体的肺。环孢霉素可以以粉剂或湿润形式(wet form)施用。
在一些其他实施方式中，本发明的本发明的抗CD20抗体可单独使用或与免疫抑制剂组合使用来治疗和/或预防类风湿性关节炎。因此在其中本发明的抗CD20抗体用于治疗类风湿性关节炎的一些实施方式中，抗体可与适合的免疫抑制剂组合使用，所述免疫抑制剂包括但不限于甲氨蝶呤、环磷酰胺、咪唑立宾、苯丁酸氮芥、环孢霉素、他克莫司(FK506；PROGRAFTM)、麦考酚酸吗乙酯和硫唑嘌呤(6-巯基嘌呤)、西罗莫司(雷怕霉素)、脱氧精胍菌素、来氟米特和其malononitriloamide类似物；和免疫抑制蛋白，包括例如，抗CTLA抗体和Ig融合物、抗B淋巴细胞刺激物抗体(例如，LYMPHOSTAT-BTM)和Ig融合物(BLyS-Ig)、其他抗CD20抗体(例如)；完全人抗体HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫单抗/I-131、托西莫单抗
Figure A20078004286600992
替伊莫单抗抗CD80抗体，和依那西普
Figure A20078004286600994
以及抗T细胞抗体例如抗CD3(OKT3)、抗CD4等。如上所述，治疗功效可使用任何方法来评估，并且包括但不限于通过美国风湿病学会标准、欧洲风湿联盟标准(EuropeanLeague of Rheumatism criteria)或任何其他标准界定的临床反应测量的功效。参见例如，Felson等人(1995)Arthritis.Rheum.38：727-35和van Gestel等人(1996)Arthritis Rheum.39：34-40。
在其他实施方式中，本发明的抗CD20抗体可单独使用或与免疫抑制剂组合使用来治疗和/或预防多发性硬化症。因此在其中本发明的抗CD20抗体用于治疗多发性硬化症的一些实施方式中，抗体可与合适的免疫抑制剂组合使用，所述免疫抑制剂包括但不限于甲氨蝶呤、环磷酰胺、咪唑立宾、苯丁酸氮芥、环孢霉素、他克莫司(FK506；PROGRAFTM)、麦考酚酸吗乙酯和硫唑嘌呤(6-巯基嘌呤)、西罗莫司(雷怕霉素)、脱氧精胍菌素、来氟米特和其malononitriloamide类似物；和免疫抑制蛋白，包括例如，抗CTLA抗体和Ig融合物、抗B淋巴细胞刺激物抗体(例如，LYMPHOSTAT-BTM)和Ig融合物(BLyS-Ig)、其他抗CD20抗体(例如，
Figure A20078004286600995
)；完全人抗体HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫单抗/I-131、托西莫单抗
Figure A20078004286600996
ibritumomabtituxetan
Figure A20078004286600997
抗CD80抗体，和依那西普
Figure A20078004286600998
以及抗T细胞抗体例如抗CD3(OKT3)、抗CD4等。
此外，使用两种或更多种治疗剂和本文中描述的抗CD20抗体的组合疗法还可用于治疗与表达CD20的细胞相关的疾病状态，例如，B细胞相关癌症和自身免疫性和/或炎性病症。非限定性地，实例包括三联疗法(triple combination therapy)，其中将两种化学治疗剂与本文中描述的抗CD20抗体组合施用，以及其中将化学治疗剂和另一种抗癌单克隆抗体(例如，阿仑珠单抗、利妥昔单抗或抗CD23抗体)与本文中描述的抗CD20抗体组合施用。这样的组合的实例包括但不限于氟达拉滨、环磷酰胺和抗CD20抗体的组合；以及氟达拉滨、另一种抗CD20抗体例如，利妥昔单抗(
Figure A20078004286601001
IDEC Pharmaceuticals Corp.，San Diego，California)和本发明的抗CD20抗体的组合。
本发明的另外的实施方式是抗CD20抗体用于作为临床试验程序的部分的组织中蛋白质水平的诊断监测的用途，例如，测定给定的治疗方案的功效。可通过将抗体连接至可检测的物质来帮助检测。可检测的物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括荧光素酶、萤光素和水母荧光素；以及合适的放射性材料的实例包括125I、131I、111In、35S或3H。
VIII.药物组合物和施用方法
制备和对需要其的受试者施用本发明的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的方法对于本领域技术人员来说是熟知的或由他们容易的确定。抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的施用途径可以是例如口服、胃肠外、通过吸入或局部施用。如本文所用，术语肠胃外包括(例如)：静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道给药。虽然给药的所有剂型都被清楚地认为包括在本发明的范围内，但是对于注射(特别对于静脉内注射或动脉内注射、或者点滴)而言，用于给药的剂型应该为溶液。通常，用于注射的合适的药物组合物可以包含：缓冲剂(例如醋酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、表面活性剂(例如聚山梨醇酯)、可热选的稳定剂(例如人清蛋白)等。但是，在与本文所教导的方法相容的其他方法中，可以将本发明的抗CD20抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物直接递送至有害细胞群体的位置处，从而增多疾病组织在治疗试剂中的暴露情况。
如之前所描述的，本发明的抗CD20抗体或抗原结合片段、变体或衍生物可以以用于体内治疗表达CD20的细胞介导的疾病的药学有效量进行施用，所述疾病是例如SLE、PBC、ITP、多发性硬化症、银屑病、克罗恩病、移植物排斥和B-细胞淋巴瘤。就这一点而言，应该理解的是对本文所公开的抗体进行配制，从而有助于给药和活性剂的稳定。优选的是，根据本发明的药物组合物包含药学上可接受的非毒性无菌载体，例如生理盐水、非毒性缓冲剂、防腐剂等。就本申请的目的而言，偶联的或非偶联的抗CD20抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的药物有效量是指这样的量，该量足以形成与靶物的有效结合，并且足以获得益处(例如缓解疾病或紊乱的症状)或者足以检测物质或细胞。
用于本发明的药物组合物包括药学上可接受的载体，包括例如离子交换剂、铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清白蛋)、缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸盐、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
用于胃肠外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油和可注射的有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水性溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲的介质。在本发明中，药学上可接受的载体包括但不限于，0.01-0.1M和优选0.05M磷酸缓冲液或0.8％盐溶液。其他常用的胃肠外媒介物包括磷酸盐溶液、林格葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格液或不挥发油。静脉注射媒介物包括流体和营养补充剂(nutrient replenisher)、电解质补充剂例如基于林格葡萄糖的电解质补充剂等。还可存在防腐剂和其他添加剂例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
更特别地，适合注射的药物组合物包括无菌水溶液(其中可溶于水的)或分散体以及用于无菌可注射溶液或分散体的临时制备的无菌粉剂。在该情况下，组合物必须是无菌的并且应当具有达到容易注射的程度的流动性。其应当在制造和贮存条件下是稳定的并且优选进行防腐处理以抗微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其合适的混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下通过保持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。用于本文中公开的治疗方法的合适的制剂描述于Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.)16thed.(1980)。
可通过各种抗菌剂和抗真菌剂例如例如，对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等预防微生物的作用。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂例如，糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇或氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来产生可注射组合物的延迟吸收。
无论如何，可通过将活性剂(例如，抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物本身或与其他活性剂组合)以所需量与本文中例举的成分的一种或其混合物(如果需要)整合在适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物整合入无菌媒介物(其包含基本分散介质和来自上面例举的成分的所需的其他成分)来制备分散体。在用于无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分的粉剂+来自其之前无菌过滤的溶液的任何另外的期望的成分。处理用于注射的制剂，按照本领域内已知的方法将其装填入容器例如安瓿、袋子、瓶子、注射器或小瓶，并且在无菌条件下进行封闭。此外，制剂可以以试剂盒例如共同未决的美国专利申请号，公布为09/259,337US-2002-0102208A1(其以其全文通过引用合并入本文)中描述的试剂盒的形式包装和销售。此类制品优选具有标明相关的组合物用于治疗患有疾病或病症或对所述疾病易感的受试者的标签或包装说明书。
胃肠外制剂可以是单次推注剂量(single bolus dose)，输注剂量或负荷推注剂量(loading bolus dose)，然后使用维持剂量。这些组合物可以以特定的固定间隔或可变间隔例如，每天一次或基于“当需要时的”基础施用。
用于本发明的某些药物组合物可以以可接受的剂型包括例如胶囊剂、片剂、水性悬浮剂或溶液口服施用。某些药物组合物还可通过鼻烟雾剂或吸入施用。此类组合物可使用苄醇或其他合适的防腐剂、增加生物利用度的吸收促进剂和/或其他常规稳定剂或分散剂制备为盐溶液。
可以与载体材料组合以产生单次剂型的抗CD20抗体或其片段、变体或衍生物的量将取决于被治疗的宿主和施用的特定模式而变化。组合物可以以单次剂量、多次剂量或在已确定的时期以输注的形式施用。还可调整给药方案以提供最佳的期望的反应(例如，治疗性或预防性反应)。
与本公开内容的范围一致，可按照上述治疗方法以有效地产生治疗效果的量对人或其他动物施用本发明的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。可以以常规剂型(按照已知的技术通过将本发明的抗体与常规药学上可接受的载体或稀释剂混合而制备的)来对这样的人或其他动物施用发明的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。本领域技术人员公认，药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特征取决于与其组合的活性剂的量、施用途径和其他熟知的变量。本领域技术人员还认识到，包含一种或更多种本发明的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的混合物可证明是特别有效的。
本发明的组合物用于治疗表达CD20的细胞介导疾病(例如SLE、PBC、ITP、多发性硬化症、银屑病、克罗恩病、移植物排斥和B细胞淋巴瘤)的有效剂量根据许多不同因素而变化，其中包括施用的方法、靶位点、患者的生理状况、患者是人还是动物、施用的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但包括转基因的哺乳动物的非人哺乳动物也可被治疗。可使用本领域技术人员已知的常规方法滴定治疗剂量以最优化安全性和功效。
至少一种待施用的抗CD20抗体的量由本领域技术人员根据本发明的公开内容容易地测定而无需过度实验。影响施用模式和至少一种抗CD20抗体、其抗原结合片段、变体或衍生物的各自剂量的因素包括但不限于疾病的严重度、病史和经历治疗的个体的年龄、身高、体重、健康和身体状况。类似地，待施用的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的量将取决于施用模式和受试者是否要经历该试剂的单次剂量还是多次剂量。待施用的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的剂量在大约0.0001至100mg/kg、0.003mg/kg至大约50mg/kg或大约0.01mg/kg至大约40mg/kg的范围内。因此，例如，剂量可以是0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg。
在一些实施方式中，为了使用抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物治疗表达CD20的细胞介导的疾病例如SLE、PBC、ITP、多发性硬化症、银屑病、克罗恩病、移植物排斥和B细胞淋巴瘤，剂量范围可以是例如大约0.0001至100mg/kg，更常见0.01至5mg/kg(例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)的宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内，优选至少1mg/kg。上述范围中间的剂量也预期在本发明的范围之内。可以以这样的剂量每天一次、隔日、每周一次或按照经验分析确定的其他时间表来对受试者施用。示例性服药日程包括在连续的日子1-10mg/kg或15mg/kg，隔日30mg/kg或每周一次60mg/kg。在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体，在该情况下施用的各抗体的剂量落在指定的范围之内。
可以在多种时机施用本发明的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。单次剂量之间的间隔可以是每天、每周、每月或每年。间隔也可以是不定期的，如通过测量患者的靶肽或靶分子的血液水平所指示的。在一些方法中，调整剂量以获得1-1000μg/ml的血浆多肽浓度和在一些方法25-300μg/ml的血浆多肽浓度。备选地，可以以持续释放制剂的形式施用本发明的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，在该情况下需要更少频率的施用。剂量和频率根据抗体在患者中的半衰期而变化。还可通过融合至稳定的多肽或部分(例如铝或PEG)来延长抗CD20抗体的半衰期。通常，人源化抗体显示最长的半衰期，然后是嵌合抗体和非人抗体。在一个实施方式中，可以以未缀合的形式施用本发明的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。在另一个实施方式中，可以以缀合的形式多次施用本发明的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。在另一个实施方式中，可以以未缀合的形式施用本发明的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，然后以缀合的形式施用，或反之亦然。
在本发明的另一个实施方式中，方法包括施用多个剂量的抗CD20抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物。该方法可包括施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多个治疗有效剂量的、包含抗CD20抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物组合物。包含抗体分子的药物组合物的多次剂量的施用的频率和持续时间可由本领域技术人员根据本文中的公开内容容易地测定而无需过度实验。此外，使用治疗有效量的抗体治疗受试者可包括单次治疗或，优选，可包括一系列治疗。在优选实施方式中，用抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物以大约0.1至20mg/kg体重之间的范围，每周一次，进行大约1至10周，优选大约2至8周，更优选大约3至7周和更优选大约4、5或6周来治疗受试者。治疗可每年进行一次来预防复发或针对复发的适应症。还应当认识到，用于治疗的抗体分子的有效剂量可在特定治疗的过程中增加或减少。剂量的变化可由本文中所述的诊断测定的结果造成产生和变得明显。
因此，在一个实施方式中，给药方案包括在治疗期的第1、7、14和21天首次施用治疗有效量的至少一种抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。在另一个实施方式中，给药方案包括在治疗期中的一周的第1、2、3、4、5、6和7天首次施用治疗有效剂量的至少一种抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。另外的施用方案包括这样的给药方案，所述给药方案在治疗期的一周的第1、3、5和7天首次施用治疗有效剂量的至少一种抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物；给药方案包括在治疗期的一周的第1和3天首次施用治疗有效剂量的至少一种抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物；和优选的给药方案包括在治疗期的一周的第1天首次施用治疗有效剂量的至少一种抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。治疗期可包括1周、2周、3周、1个月、3个月、6个月或1年。治疗期相互之间可连续或相隔1天、1周、2周、1个月、3个月、6个月或1年。
在一些实施方式中，抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的治疗有效剂量的范围为大约0.0001mg/kg至大约100mg/kg、大约0.003mg/kg至大约50mg/kg、大约0.01mg/kg至大约40mg/kg、大约0.01mg/kg至大约30mg/kg、大约0.1mg/kg至大约30mg/kg、大约0.5mg/kg至大约30mg/kg、大约1mg/kg至大约30mg/kg、大约3mg/kg至大约30mg/kg、大约3mg/kg至大约25mg/kg、大约3mg/kg至大约20mg/kg、大约5mg/kg至大约15mg/kg或大约7mg/kg至大约12mg/kg。因此，例如，任一种抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的剂量可以是0.003mg/kg、0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg，或落在大约0.0001mg/kg至大约100mg/kg的范围内的其他此类剂量。可在整个每一周的抗体给药中施用相同治疗有效剂量的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。备选地，可在整个治疗期过程中使用不同治疗有效剂量的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的不同治疗有效剂量。
IX.抗CD20抗体在制备药物中的用途
本发明还提供了抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗患有特征在于赘生性B细胞生长的癌症的患者，其中将所述药物与使用至少一种其他癌症疗法的治疗协同使用。特征在于赘生性B细胞生长的癌症包括但限于本文上面所述的B细胞相关癌症，例如，非何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、高度B细胞淋巴瘤、中度B细胞淋巴瘤、低度恶B细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴母细胞性白血病、成髓细胞白血病、何杰金氏病、浆细胞瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡性小裂细胞性淋巴瘤、滤泡性大细胞性淋巴瘤、滤泡性混合小裂细胞性淋巴瘤(follicular mixed small cleaved lymphoma)、弥散性小裂细胞性淋巴瘤、弥散性小淋巴细胞性淋巴瘤(diffuse small lymphocyticlymphoma)、前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、粘膜结合的淋巴样组织淋巴瘤(mucosal associated lymphoidtissue lymphoma)、单核细胞样B细胞淋巴瘤、脾淋巴瘤、毛细胞性白血病、弥漫性大细胞淋巴瘤、纵隔大B细胞性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、血管内淋巴瘤病、弥散性混合细胞淋巴瘤(diffuse mixed celllymphoma)、弥漫性大细胞淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴结瘤、伯基特淋巴瘤、AIDS-相关淋巴瘤和外套细胞淋巴瘤。
“协同的”意指在使用至少一种其他癌症疗法治疗受试者之前、期间或之后使用包含抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物。其他癌症疗法的实例包括但不限于手术；放射疗法；化学疗法，任选地与自体骨髓移植术组合，其中合适的化学治疗剂包括但不限于氟达拉滨或磷酸氟达拉滨、苯丁酸氮芥、长春新碱、喷司他丁、2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨)、环磷酰胺、多柔比星、泼尼松和其组合，例如，包含蒽环类抗生素的方案例如CAP(环磷酰胺、多柔比星+泼尼松)、CHOP(环磷酰胺、长春新碱、泼尼松+多柔比星)、VAD(长春新碱、多柔比星+地塞米松)、MP(美法仑+泼尼松)，和用于化学疗法的其他细胞毒性和/或治疗剂例如米托蒽醌、柔红霉素、伊达比星、天冬酰胺酶，和抗代谢物包括但不限于阿糖胞苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤和奈拉滨；其他抗癌单克隆抗体疗法(例如，阿仑珠单抗
Figure A20078004286601081
或靶向恶性B细胞上的CD52细胞表面糖蛋白的其他抗CD52抗体；利妥昔单抗
Figure A20078004286601082
完全人抗体HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫单抗/I-131托西莫单抗替伊莫单抗
Figure A20078004286601084
或靶向恶性B细胞上的CD20抗原的任何其他治疗性抗CD20抗体；抗CD 19抗体(例如，MT 103，双特异性抗体)；抗CD22抗体(例如，人源化单克隆抗体依帕珠单抗)；贝伐珠单抗
Figure A20078004286601085
或靶向人血管内皮生长因子的其他抗癌抗体；靶向恶性B细胞上的CD22抗原的抗CD22抗体(例如，单克隆抗体BL-22，αCD22毒素)；靶向巨噬细胞集落刺激因子α-M-CSF抗体；靶向在多发性骨髓瘤中过度表达核因子κB(RANK)和其配体(RANKL)的受体激活物的抗体；靶向恶性B细胞上的CD23抗原的抗CD23抗体(例如，IDEC-152)；靶向恶性B细胞上的CD38抗原的抗CD38抗体；靶向在恶性B细胞上表达的主要组织相容性复合物II类受体的抗体(抗MHC抗体)；靶向恶性B细胞上的CD40抗原的抗CD40抗体(例如，SGN-40)；和靶向在许多造血来源的实体瘤和肿瘤上表达的肿瘤坏死因子相关诱导凋亡的配体受体1(TRAIL-R1)(例如，拮抗性人单克隆抗体HGS-ETR1)；基于小分子的癌症疗法，包括但不限于微管和/或拓扑异构酶抑制剂(例如，有丝分裂抑制剂多拉司他汀和多拉司他汀类似物；微管结合剂T900607；XL119；和拓扑异构酶抑制剂氨基喜树碱)、SDX-105(盐酸苯达莫司汀)、ixabepilone(epothilone类似物，也称为BMS-247550)、蛋白激酶C抑制剂，例如米哚妥林((PKC-412、CGP 41251、N-苯甲酰星状孢子素)、匹蒽醌、乐沙定(抗肿瘤剂)、硝酸镓(硝酸镓)、
Figure A20078004286601086
(沙立度胺)、沙立度胺的免疫调节衍生物(例如，来那度胺(以前称为revimid))、AffinitaTM(蛋白激酶C-α的反义抑制剂)、SDX-101(R-依托度酸，诱导恶性淋巴细胞的凋亡)、第二代嘌呤核苷类似物例如氯法拉滨、癌细胞产生蛋白Bcl-2的抑制剂(例如，反义试剂oblimersen和
Figure A20078004286601091
)、蛋白酶体抑制剂(例如，VelcadeTM(硼替佐米))、小分子激酶抑制剂(例如，CHIR-258)、小分子VEGF抑制剂(例如，ZD-6474)、热激蛋白(HSP)90的小分子抑制剂(例如，17-AAG)、组蛋白脱乙酰基酶的小分子抑制剂(例如，杂种/极性细胞分化HPC)试剂例如suberanilohydroxamic acid(SAHA)和FR-901228)和凋亡剂例如
Figure A20078004286601092
(三氧化二砷)和
Figure A20078004286601093
(莫特沙芬钆)；基于疫苗/免疫疗法的癌症疗法包括但不限于疫苗方法(例如，Id-KLH、oncophage、vitalethine)、个性化免疫疗法或活性独特型免疫疗法(active idiotype immunotherapy)(例如，
Figure A20078004286601094
个性化免疫疗法，以前称为GTOP-99)、(CpG 7909，toll样受体9(TLR9)的合成激动剂)、干扰素α疗法、白细胞介素-2(IL-2)疗法、IL-12疗法、IL-15疗法和IL-21疗法；类固醇疗法；或其他癌症疗法；其中在使用包含抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物(如本文上面所指出的)的药物治疗受试者之前、期间或之后进行使用另外的癌症疗法的治疗。
在一些实施方式中，本发明提供了抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗受试者中的B细胞淋巴瘤例如非何杰金氏淋巴瘤，其中将所述药物与使用至少一种其他癌症疗法的治疗协同使用，所述癌症疗法选自化学疗法、抗癌抗体疗法、基于小分子的癌症疗法和基于疫苗/免疫疗法的癌症疗法，其中在使用其他癌症疗法治疗受试者之前、期间或之后或在多种组合疗法的情况下在使用其他癌症疗法治疗受试者之前、期间或之后使用所述药物。
因此，例如，在一些实施方式中，本发明提供了单克隆抗体1589或本发明的其他抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗受试者中的B细胞淋巴瘤例如非何杰金氏淋巴瘤，其中将所述药物与使用化学治疗剂的治疗协同使用，其中所述化学治疗剂选自环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松和其组合，例如CHOP。在其他实施方式中，本发明提供了单克隆抗体1589或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗受试者中的B细胞淋巴瘤例如非何杰金氏淋巴瘤，其中将所述药物与使用至少一种其他抗癌抗体的治疗协同使用，所述抗癌抗体选自阿仑珠单抗
Figure A20078004286601101
或靶向恶性B细胞上的CD52细胞表面糖蛋白的其他抗CD52抗体；利妥昔单抗完全人抗体HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫单抗/I-131托西莫单抗
Figure A20078004286601103
替伊莫单抗
Figure A20078004286601104
或靶向恶性B细胞上的CD20抗原的任何其他治疗性抗CD20抗体；抗CD19抗体(例如，MT103，双特异性抗体)；抗CD22抗体(例如，人源化单克隆抗体依帕珠单抗)；贝伐珠单抗或靶向人血管内皮生长因子的其他抗癌抗体；和其任何组合；其中在使用其他癌症疗法治疗受试者之前、期间或之后或在多种组合疗法的情况下在使用其他癌症疗法治疗受试者之前、期间或之后使用所述药物。
在其他实施方式中，本发明提供了单克隆抗体1589或其抗原结合片段、变体或衍生物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗受试者中的B细胞淋巴瘤，例如非何杰金氏淋巴瘤，其中将所述药物与使用至少一种其他基于小分子的癌症疗法的治疗协同使用，所述基于小分子的癌症疗法选自微管和/或拓扑异构酶抑制剂(例如，有丝分裂抑制剂多拉司他汀和多拉司他汀类似物；微管结合剂T900607；XL119；和拓扑异构酶抑制剂氨基喜树碱)、SDX-105(盐酸苯达莫司汀)、ixabepilone(epothilone类似物，也称为BMS-247550)、蛋白激酶C抑制剂，例如米哚妥林((PKC-412、CGP 41251、N-苯甲酰星状孢子素)、匹蒽醌、乐沙定(抗肿瘤剂)、硝酸镓(硝酸镓)、
Figure A20078004286601106
(沙立度胺)、凋亡剂例如
Figure A20078004286601107
(莫特沙芬钆)；癌细胞产生蛋白Bcl-2的抑制剂(例如，反义试剂oblimersen和
Figure A20078004286601108
)、奈拉滨和其任何组合；其中在使用其他癌症疗法治疗受试者之前、期间或之后或在多种组合疗法的情况下在使用其他癌症疗法治疗受试者之前、期间或之后使用所述药物。
在其他实施方式中，本发明提供了单克隆抗体1589或其抗原结合片段、变体或衍生物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗受试者中的B细胞淋巴瘤，例如非何杰金氏淋巴瘤，其中将所述药物与使用至少一种其他基于疫苗/免疫疗法的癌症疗法的治疗协同使用，所述基于疫苗/免疫疗法的癌症疗法选自疫苗方法(例如，Id-KLH、oncophage、vitalethine)、个性化免疫疗法或活性独特型免疫疗法(例如，
Figure A20078004286601111
个性化免疫疗法，以前称为GTOP-99)、
Figure A20078004286601112
(CpG 7909，toll样受体9(TLR9)的合成激动剂)、白细胞介素-2(IL-2)疗法、IL-12疗法、IL-15疗法和IL-21疗法和其任何组合；其中在使用其他癌症疗法治疗受试者之前、期间或之后或在多种组合疗法的情况下在使用其他癌症疗法治疗受试者之前、期间或之后使用所述药物。
在一些实施方式中，本发明提供了抗CD20抗体例如单克隆抗体1589或其抗原结合片段、变体或衍生物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗受试者中的B细胞相关淋巴瘤，例如B细胞急性淋巴细胞性白血病(B-ALL)，其中将所述药物与使用至少一种其他癌症疗法的治疗协同使用，所述癌症疗法选自化学疗法和抗代谢物疗法，其中在使用其他癌症疗法治疗受试者之前、期间或之后或在多种组合疗法的情况下在使用其他癌症疗法治疗受试者之前、期间或之后使用所述药物。此类实施方式的实例包括但不限于，其中将包含抗CD20抗体例如单克隆抗体1589或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物与使用化学治疗剂或抗代谢物的治疗协同使用，所述化学治疗剂或抗代谢物选自环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松、阿糖胞苷、米托蒽醌、依达比星、天冬酰胺酶、甲氨蝶呤、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤和其组合；其中在使用其他癌症疗法治疗受试者之前、期间或之后或在多种组合疗法的情况下在使用其他癌症疗法治疗受试者之前、期间或之后使用所述药物。在一个这样的实例中，将所述药物与使用阿糖胞苷+柔红霉素、阿糖胞苷+米托蒽醌和/或阿糖胞苷+依达比星的治疗协同使用；其中在使用其他癌症疗法治疗B-ALL受试者之前、期间或之后或在多种组合疗法的情况下在使用其他癌症疗法治疗受试者之前、期间或之后使用所述药物。
本发明还提供了抗CD20抗体例如本文中公开的单克隆抗体1589，或其抗原结合片段、变体或衍生物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗受试者的特征在于赘生性B细胞生长的癌症，所述癌症包括本文上面所述的B细胞相关癌症，其中所述药物用于已用至少一种其他癌症疗法预治疗的受试者。“预治疗的”或“预治疗”意指受试者在接受包含抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物之前已接受一种或多种其他癌症疗法(即，已用至少一种其他癌症疗法治疗)。“预治疗的”或“预治疗”包括在开始使用包含抗CD20抗体例如本文中公开的单克隆抗体1589，或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物的治疗之前的2年内、18个月内、1年内、6个月内、2个月内、6周内、1个月内、4周内、3周内、2周内、1周内、6天内、5天内、4天内、3天内、2天内或甚至1天内已用至少一种其他癌症疗法治疗的受试者。受试者不必是对使用先前的一种和多种癌症疗法的预治疗的反应者。因此，接受包含抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物的受试者可对使用之前的癌症疗法的预治疗或对一种或多种之前的癌症疗法(其中预治疗包括多个癌症疗法)反应或可对其反应(即，所述癌症是难控制的)。受试者在接受包含抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物之前可已经接受预治疗的其他癌症疗法的实例包括但不限于手术；放射疗法；化学疗法，任选地与自体骨髓移植术组合，其中合适的化学治疗剂包括但不限于，本文上面所列的化学治疗剂；其他抗癌单克隆抗体疗法包括但不限于本文上面所列的抗癌抗体；基于小分子的癌症疗法包括但不限于本文上面所列的小分子；基于疫苗/免疫疗法的癌症疗法包括但不限于本文上面所列的癌症疗法；类固醇疗法；其他癌症疗法；或其任何组合。
在本文中描述的药物与一种或多种其他癌症疗法的协同使用的上下文中的“治疗”在本文中定义为对受试者应用或施用所述药物或其他癌症疗法，或对来自受试者的分离的组织或细胞系应用或施用所述药物或其他癌症疗法，其中所述受试者具有特征在于赘生性B细胞生长的癌症、与该癌症相关的症状或对发生这样的癌症的易感性，其中目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、医治、改善、好转或影响癌症、所述癌症的任何相关症状或对癌症发生的易感性。
本发明还提供了抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗受试者中的自身免疫性疾病和/或为炎性疾病，其中将所述药物与至少一种其他疗法协同使用。“协同的”意指在用至少一种用于自身免疫性疾病和/或炎性疾病的其他疗法治疗受试者之前、期间或之后使用所述药物。其他疗法的实例包括但不限于本文上面描述的疗法，即手术或手术方法(例如脾切除术、淋巴结切除术、甲状腺切除术、血浆去除术、白细胞生成、细胞、组织或器官移植、器官灌注、肠内手术等)、放射疗法、疗法例如类固醇疗法和非类固醇疗法、激素疗法、细胞因子疗法、使用皮肤病药(例如，用于治疗皮肤状况例如过敏症、接触性皮炎和银屑病的局部试剂)的疗法、免疫抑制疗法和其他抗炎单克隆抗体疗法等，其中在使用本文中上述的包含抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物治疗受试者之前、期间或之后进行使用另外的疗法的治疗。在一个这样的实施方式中，本发明提供了单克隆抗体1589或其抗原结合片段、变体或衍生物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗受试者中的自身免疫性疾病和/或炎性疾病，其中将所述药物与使用至少一种本文中上述的其他疗法的治疗协同使用。
在一些实施方式中，将包含抗CD20抗体，例如本文中公开的单克隆抗体1589，或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物与使用两种其他疗法的治疗协同使用。其中将包含抗CD20抗体的药物与其他两种疗法协同使用，所述药物的使用可在用两种其他疗法的任一种或两种治疗受试者之前、期间或之后。
本发明还提供了抗CD20抗体，例如本文中公开的单克隆抗体1589，或其抗原结合片段、变体或衍生物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗受试者的自身免疫性疾病和/或炎性疾病，其中所述药物用于在已用至少一种其他疗法预治疗的受试者。“预治疗的”或“预治疗”意指受试者在接受包含抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物之前已用一种或多种其他疗法进行治疗。“预治疗的”或“预治疗”包括在开始使用包含抗CD20抗体例如本文中公开的单克隆抗体1589，或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物的治疗之前的2年内、18个月内、1年内、6个月内、2个月内、6周内、1个月内、4周内、3周内、2周内、1周内、6天内、5天内、4天内、3天内、2天内或甚至1天内已用其他疗法治疗的受试者。受试者不必是对使用先前的一种或多种疗法的预治疗的反应者。因此，接受包含抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物的受试者可对使用之前的疗法的预治疗或对一种或多种之前的疗法(其中预治疗包括多个疗法)反应或不反应。
在本文中描述的药物与一种或多种其他自身免疫性疾病和/或炎性疾病疗法的协同使用的上下文中的“治疗”在本文中定义为对受试者应用或施用所述药物或其他疗法，或对来自受试者的分离的组织或细胞系应用或施用所述药物或其他疗法，其中所述受试者具有与表达CD20的细胞相关的自身免疫性疾病和/或炎性疾病、与该疾病相关的症状或对这样的疾病的发生的易感性，其中目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、医治、改善、好转或影响疾病、所述疾病的任何相关症状或对疾病发生的易感性。
X.诊断学
本发明还提供了在表达CD20的细胞介导的疾病例如SLE、PBC、ITP、多发性硬化症、银屑病、克罗恩病、移植物排斥和B细胞淋巴瘤的诊断期间使用的诊断方法，所述方法包括测量CD20蛋白或转录物在来自个体的组织或其他细胞或体液中的表达水平，和将测量的表达水平与正常组织或体液中的标准CD20表达水平比较，其中与标准相比表达水平的增加预示着病症。
本发明的抗CD20抗体和抗原结合片段、变体和衍生物可用于使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法(例如，参见Jalkanen，等人(1985)J.Cell.Biol.101：976-985；Jalkanen等人(1987)J.Cell Biol.105：3087-3096)测定生物样品中的CD20蛋白水平。用于检测CD20蛋白表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定法例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫沉淀或western印迹。合适的测定法更详细地描述于本文中的其他地方。
“测定CD20多肽的表达水平”意指直接(例如，通过测定或评估绝对蛋白质水平)或相对地(例如，通过和与第二生物样品中的多肽水平相关的疾病比较)定性或定量测量或评估第一生物样品中CD20多肽的水平。优选，测量或评估第一生物样品中CD20多肽的表达水平，将其与标准CD20多肽水平比较，所述标准采自从不具有病症的个体获得的第二生物样品或通过平均来自不具有病症的个体的群体的水平来测定。如在本领域内所理解的，当知道“标准”CD20多肽水平后，其可重复用作比较的标准。
“生物样品”意指从个体、细胞系、组织培养物或可能表达CD20的细胞的其他来源获得的任何生物样品。用于获得来自哺乳动物的活组织检查样品和体液的方法在本领域内是熟知的。
XL.免疫测定法
可通过本领域内已知的任何方法就免疫特异性结合测定本发明的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。可以使用的免疫测试方法包括(但不限于)采用了多种技术的竞争性或非竞争性的测试体系，其中所述的技术例如有：western印迹、放射性免疫测试、ELISA(酶联免疫吸附测试)、“夹心”免疫测试、免疫沉淀测试、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测试、凝集测试、补体结合测试、免疫放射测试、荧光免疫测试、蛋白质A免疫测试，以上列举了一些，在此就不一一列举了。这些测试方法是常规的，并且是本领域公知的(参见，例如，Ausubel等人eds，(1994)Current Protocolsin Molecular Biology(John Wiley & Sons，Inc.，NY)第1卷，其以其全文通过引用合并入本文)。下文将对示例性的免疫测试法进行概述(但并非意欲限定本发明)。
免疫沉淀方案通常包括：在补充有蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如EDTA、PMSF、抑肽酶、钒酸钠)的诸如RIPA缓冲剂(1％NP-40或Triton X-100、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、0.15M NaCl、pH 7.2的0.01M磷酸钠、1％Trasylol)之类的裂解缓冲剂中，裂解细胞群体；向细胞裂解物中添加目的抗体；在4℃下温育一段时间(例如1-4小时)；向细胞裂解物中添加蛋白质A和/或蛋白质G琼脂糖珠子；在4℃下温育大于1小时或更长时间；在裂解缓冲剂中洗涤珠子；并将珠子再次悬浮于SDS/样品缓冲剂中。可以通过(例如)western印迹分析来评价目的抗体免疫沉淀特定抗原的能力。本领域的任一技术人员都熟知可以进行修饰以增强抗体与抗体的结合并减少背景(例如使用琼脂糖珠子对细胞裂解物进行预先净化)的参数。关于免疫沉淀方案的进一步讨论参见例如，Ausubel等人，eds，(1994)CurrentProtocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons，Inc.，NY)第1卷于10.161。
western印迹分析通常包括：制备蛋白质样品，在聚丙烯酰胺凝胶(例如8％-20％SDS-PAGE，这取决于抗原的分子量)中对该蛋白质样品进行电泳；将聚丙烯酰胺凝胶上蛋白质样品转移至诸如硝基纤维素、PVDF或尼龙之类的膜上；将所得的膜封闭于封闭液(例如包含3％BSA或脱脂乳粉的PBS)中；在洗涤缓冲剂(例如PBS-Tween 20)中洗涤膜；用稀释于封闭缓冲剂的一级抗体(目的抗体)温育膜；在洗涤缓冲剂中洗涤膜；用稀释于封闭缓冲剂中的、与酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(例如32p或1251)偶联的二级抗体(其识别一级抗体，例如抗人抗体)温育膜；在洗涤缓冲剂中洗涤膜；以及检测抗原的存在情况。本领域的任一技术人员都熟知可以进行修饰以增强检测信号并减少背景噪声的参数。关于western印迹方案的进一步讨论参见，例如，Ausubel等人，eds，(1994)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons，Inc.，NY)第1卷于10.8.1。
ELISA包括：制备蛋白质；用抗原涂敷96孔微孔板的孔；将与诸如酶底物(例如辣根过氧化物酶或减小磷酸酶)之类的可检测化合物偶联的关注抗体添加到96孔微孔板的孔中并温育一段时间；以及检测抗原的存在情况。在ELISA中，目的抗体并非必须与可检测的化合物偶联；而是可以将与可检测化合物偶联的第二种抗体(其识别目的抗体)添加到孔中。此外，没有使用抗原涂敷孔，可以将抗体涂敷到孔中。在这种情况下，可以在将目的抗原添加到经涂敷的孔中之后，添加可检测化合物偶联的第二种抗体。本领域的任一技术人员都熟知可以进行修饰以增强检测信号的参数以及本领域已知的ELISA的其他变量。关于ELISA的进一步讨论参见，例如，Ausubel等人，eds，(1994)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons，Inc.，NY)第1卷于11.2.1。
可通过竞争结合测定法测定抗体对抗原的结合亲和力以及抗体-抗原相互结合的解离率。竞争结合测定法的一个实例是这样的放射免疫测定法，其包括在逐渐增加的量的未标准的抗原存在的情况下用目的抗体温育标记的抗原(例如，3H或125I)，和检测与标记的抗原结合的抗体。目的抗体对特定抗原的亲和力和结合解离率可通过斯卡恰特作图(scatchard plot)分析从数据测定与二抗的竞争还可通过使用放射免疫测定法来测定。在该情况下，在逐渐增加的量的未标记的二抗存在的情况下，将抗原与缀合至标记的化合物(例如，3H或125I)的目的抗体一起温育。
此外，本发明的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可在组织学上(如在免疫荧光、免疫电子显微术或非免疫学测定法中)用于癌症抗原基因产物或其保守变体或肽片段的原位检测。可通过从患者取出组织学标本，对其使用标记的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，优选通过将标记的抗体(或片段)覆盖在组织样品上来使用来进行原位检测。通过使用该方法，可能不仅测定CD20蛋白或保守变体或肽片段的存在，而且还可测定其在检测的组织中的分布。通过使用本发明，本领域技术人员可容易地理解到，许多组织学方法中的任一种(例如染色法)可进行改变以获得这样的原位检测。
用于CD20基因产物或其保守变体或肽片段的免疫测定法和非免疫测定法通常包括在能够结合CD20或其保守变体或肽片段的可检测标记的抗体存在的情况下温育样品，例如生物流体、组织提取物、新收获的细胞或已在细胞培养物中温育的细胞的裂解物，和通过本领域内熟知的许多技术的任一种检测结合的抗体。
可使生物样品接触和固定在固相支持物或载体，例如硝酸纤维素或能够固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白质的其他固体支持物上。然后用合适的缓冲液洗涤支持物，然后用可检测标记的抗CD20抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物进行处理支持物。然后固相支持物用缓冲液洗涤第二次以除去未结合的抗体。任选，随后标记抗体。然后可通过常规方法检测固相支持物上结合的标记物的量。
“固相支持物或载体”是指能够结合抗原或抗体的任何支持物。熟知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩(gabbros)和磁铁。为了本发明的目的，载体的性质可以是在一定程度上可溶的或不溶的。支持材料事实上可具有任何可能的结构构型，只要偶联的分子能够结合抗原或抗体。因此，支持物构型可以球形的，如珠粒，或圆柱状的，如试管的内侧表面或棒的外表面。备选地，表面可以是扁平的例如片、试验带等。优选支持物包括聚苯乙烯珠粒。本领域技术人员应当知道用于结合抗体或抗原的许多其他合适的载体，或通过使用常规实验能够确定所述载体。
可以根据公知的方法来测定大量给定的抗CD20抗体或者其抗原结合片段、变体或衍生物的结合活性。本领域的技术人员能够通过采用常规的试验来测定用于各种测定方法的操作和最佳的测定条件。
已经存在多种用于测定抗体-抗原相互作用的亲和性的方法，但是用于测定速率常数的方法相对少些。大部分的方法依赖于对抗体或抗原进行标记，这不可避免地使常规的测量方法变复杂，并使得测量的量变得不可靠。
在多种测量抗体-抗原相互作用的亲和性的常规方法中，在BIAcore上进行的表面等离子体共振提供多种优点：(i)无需标记抗体或抗原；(ii)抗体无需预先纯化，可以直接使用细胞培养物的上清液；(iii)能够进行实时测定，从而可以对不同单克隆抗体的相互作用进行快速的半定量的比较，并且足以用于多种评价目的；(iv)生物特异性表面可以再生，这样可以在相同的条件下比较一系列不同的单克隆抗体；(v)分析过程完全是自动化的，并且可以在无需使用者进行干涉的条件下进行大量的测量。BIAapplications Handbook，版本AB(重印于1998)，BIACORE code No.BR-1001-86；BIAtechnology Handbook，版本AB(重印于1998)，BIACORE code No.BR-1001-84。
基于SPR的结合研究要求结合对的一个成员固定在传感器表面。被固定的结合伴侣称为配体。溶液中的结合伴侣称为分析物。在一些情况下，将配体通过与另一个固定的分子(其称为捕获分子)结合来与将其间接地附着至表面。SPR应答反映了当分析物结合或解离时检测器表面上的质量浓度的变化。
当上述情况发生时，基于SPR的实时BIAcore测量检测器直接相互作用。该技术非常适用于测定动力学参数。可以特别容易地对相对亲和性进行评定，并且动力学和亲和常数可以由传感图谱数据得到。
当在穿过配体的表面上以分离脉冲的方式注入分析物时，所得的传感图谱可以分为三个基本的阶段：(i)在注入样品期间，分析物与配体结合；(ii)在注入样品期间的均衡或稳定状态，其中分析物结合的速率与复合物解离的速率平衡；(iii)在缓冲剂流过期间分析物由所述的表面上解离。
结合和解离阶段提供了关于分析物-配体相互作用的动力学的信息(ka和kd，复合物的形成和解离速率，kd/ka＝KD)。均衡阶段提供了关于分析物-配体相互作用(KD)的亲和性的信息。
BIA评价软件提供了使用数值积分和整体拟合算法来进行曲线拟合的工具。采用合适的数据分析方法，可以通过简单的BIAcore研究获得用于相互作用的分离速率和亲和常数。通过上述技术测量的亲和力的范围非常宽，由mM至pM。
表位特异性是单克隆抗体的重要特征。与采用放射性免疫、ELISA、或其他表面吸附方法的常规技术截然不同的是，使用BIAcore制作表位的图谱不需要标记或纯化抗体，并且可以允许使用一系列的若干种单克隆抗体来进行多位点的特异性测试。此外，可以自动地进行大量的分析。
配对结合实验检测两个Mab同时结合相同抗原的能力。抗分开的表位的Mab将独立地结合，然而抗相同或紧密相关的表位的Mab将干扰彼此的结合。直接进行使用BIAcore进行的这些结合实验。
例如，可使用捕获分子结合第一Mab，然后相继加入抗原和第二Mab。感应图谱将显示：1.抗原结合抗体第一Mab的量，2.第二Mab结合表面附着的抗原的程度，3.如果第二Mab未结合，逆转配对试验的顺序是否可改变结果。
肽抑制是用于表位作图的另一个技术。该方法可补充配对抗体结合研究，并且在当抗原的一级序列已知时，可将功能性表位与结构特征相关联。就不同Mab与固定的抗原的结合的抑制检测肽或抗原片段。干扰给定的Mab的结合的肽被认为在结构上与由该Mab界定的表位相关。
除非另外指出，本发明的实施将使用在本领域技术范围之内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。在文献中详尽地解释了此类技术。参见，例如，Sambrook等人ed.(1989)Molecular Cloning A LaboratoryManual(第2版.；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人ed.(1992)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，(ColdSprings Harbor Laboratory，NY)；D.N.Glover ed.，(1985)DNACloning，第1和2卷；Gait，ed.(1984)Oligonucleotide Synthesis；Mullis等人美国专利4,683,195；Hames and Higgins，eds.(1984)Nucleic Acid Hybridization；Hames and Higgins，eds.(1984)Transcription And Translation；Freshney(1987)Culture OfAnimal Cells(Alan R.Liss，Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1986)；Perbal(1984)A Practical Guide To MolecularCloning；the treatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Miller and Calos eds.(1987)Gene Trans fer VectorsFor Mammalian Cells，(Cold Spring Harbor Laboratory)；Wu等人eds.，Methods In Enzymology，第154和155卷；Mayer and Walker，eds.(1987)Immunochemical Methods In Cell And MolecularBiology(Academic Press，London)；Weir和Blackwell，eds.，(1986)Handbook Of Experimental Immunology，第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1986)；和于Ausubel等人(1989)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland)中。
抗体工程的一般原理示于Borrebaeck，ed.(1995)AntibodyEngineering(第2版ed.；Oxford Univ.Press)。蛋白质工程的一般原理示于Rickwood等人eds.(1995)Protein Engineering，APractical Approach(IRL Press at Oxford Univ.Press，Oxford，Eng.)。抗体和抗体-半抗原结合的一般原理示于：Nisonoff(1984)Molecular Immunology(第2版；Sinauer Associates，Sunderland，MA)；和Steward(1984)Antibodies，Their Structure and Function(Chapman and Hall，New York，NY)。此外，本领域已知的并且并非特异描述的标准的免疫学方法通常可以根据Current Protocols inImmunology，John Wiley & Sons，New York；Stites等人，eds.(1994)Basic and Clinical Immunology(8th ed；Appleton & Lange，Norwalk，CT)以及Mishell和Shiigi(eds)(1980)Selected Methods inCellular Immunology(W.H.Freeman and Co.，NY)。
阐明免疫学的一般原理的标准参考著作包括Current Protocolsin Immunology，John Wiley & Sons，New York；Klein(1982)J.，Immunology：The Science of Self-Nonself Discrimination(JohnWiley & Sons，NY)；Kennett等人eds.(1980)MonoclonalAntibodies，Hybridoma：A New Dimension in Biological Analyses(Plenum Press，NY)；Campbell(1984)″Monoclonal AntibodyTechnology″in Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology，ed.Burden等人(Elsevere，Amsterdam)；Goldsby等人eds.(2000)Kuby Immunnology(第4版；H.Freemand& Co.)；Roitt等人(2001)。Immunology(第6版；London：Mosby)；Abbas等人(2005)Cellular and Molecular Immunology(第5版；Elsevier Health Sciences Division)；Kontermann和Dubel(2001)Antibody Engineering(Springer Verlan)；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Press)；Lewin(2003)Genes VIII(Prentice Hall2003)；Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Press)；Dieffenbach and Dveksler(2003)PCRPrimer(Cold Spring Harbor Press)。
上述所以有参考文献以及其中引用的所有参考文献以它们的全文通过引用合并入本文。
通过举例说明的方式而非限定性的方式提供下列实施例。
实施例
实施例1：人源化鼠抗CD20抗体的最优化
在其可变重链(VH；参见SEQ ID NO：29)和可变轻链(Vκ；参见SEQ ID NO：10)结构域的一个或多个互补决定区(CDR)内对人源化鼠抗CD20单克隆抗体mAb 1097进行改造以产生最优化的具有增加的CDC功能的mAb。初始人源化鼠抗CD20mAb是称为利妥昔单抗(即，mAbC2B8；参见美国专利5,736,137)的嵌合鼠/人抗CD20抗体的人源化形式。人源化鼠抗CD20mAb内的初始VH结构域(称为H1286)和初始Vκ结构域(称为L373)的3个CDR示于图1。L 373的CDR2(示于SEQ ID NO：9)来源于人Vκ而非鼠Vκ。
最初的最优化步骤包括对H1286VH结构域(参见图2)的起始CDR3(图1中称为“271”；SEQ ID NO：3O)的修饰。271 CDR3序列等同于mAb C2B8的重链内的可变结构域的CDR3的序列。对271 CDR3的初步修饰包括：
1)初始CDR3的位点9上的酪氨酸至天冬酰胺(Y→N)的置换和初始CDR3的位点12上的缬氨酸至天冬氨酸(V→N)的置换，以产生“1236”最优化的CDR3(SEQ ID NO：1)；
2)除了分别在位点9和12上的Y→N和V→N的置换外，初始CDR3的位点5上的甘氨酸至丙氨酸(G→A)的置换，以产生“1237”最优化的CDR3(SEQ ID NO：2)；或
3)除了分别在位点5和9上的G→A和Y→N的置换外，初始CDR3的位点12上的缬氨酸至天冬氨酸(V→D)的置换，以产生“1238”最优化的CDR3(SEQ ID NO：3)。
最优化的CDR3的个体编码序列示于SEQ ID NO：24(编码1236最优化的CDR3)、SEQ ID NO：25(编码1237最优化的CDR3)和SEQ IDNO：26(编码1238最优化的CDR3)。
然后将这些最优化的CDR3通过改造入H1286的初始人源化VH结构域框架区以产生下列最优化的VH结构域：H1569(SEQ ID NO：12)，包含SEQ ID NO：1的1236最优化的CDR3；H1570(SEQ ID NO：13)，包含SEQ ID NO：2的1237最优化的CDR3；和H1571(SEQ ID NO：14)，包含SEQ ID NO：3的1238的最优化的CDR3)(参见图3)。这些最优化的VH结构域的编码序列示于图4中，和示于SEQ ID NO：19(编码H1569)、SEQ ID NO：20(编码H1570)和SEQ ID NO：21(编码H1571)中。然后将这些最优化的VH结构域的每一个与初始(L373)Vκ结构域(参见图5；SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：23中所示的编码序列)配对来产生下列最优化的人源化mAB：mAb 1236、mAb 1237和mAb 1238。
实施例2：最优化的人源化鼠抗CD20单克隆抗体的结合和功能 特征
就它们各自的结合和功能特征评估实施例1中描述的最优化的人源化mAb 1236、mAb 1237和mAb 1238。对于每一个测定，具有与利妥昔单抗(IDEC-C2B8；IDEC Pharmaceuticals Corp.，SanDiego，California)相同的序列的mAb 271用作阳性对照。
通过荧光微体积数字图象测定技术(Fluorometric MicrovolumeAssay Technology)(FMAT，Applied Biosystems 8200 CellularDetection System)和流式细胞计量术评估结合特异性，所述流式细胞计量术列表显示CD20阳性(CD20+)和CD20阴性细胞系上染色的平均荧光强度(MFI)。FMAT分析显示对于CD20的结合特异性(图6A-6D)。流式细胞计量术分析显示这些最优化的人源化抗CD20mAb对CD20+Daudi和EB1细胞的结合(表2)。
表2.与CD20膜阳性和阴性细胞系的结合
流式细胞计量术结果(平均荧光强度)。
  Daudi   EB1   K562   U266
  MAb   CD20阳性   CD20阳性   CD20阴性   CD20阴性
  271   145   429   10   9
  1236   145   409   12   11
  1237   132   395   14   11
  1238   114   389   11   10
  11(阴性对照)   8   8   6   5
为了评估被mAb1236、mAb 1237和mAb 1238识别的表位，向FMAT板中加入3μg/ml的CD20特异性小鼠2H7抗体(或小鼠ISO)，然后在室温下温育2小时。然后加入受试mAb(30ng/ml)和抗人IgFc-Alexa647，通过FMAT检测荧光信号。对于小鼠2H7(m2H7)信号的减少表明表位封闭。
如可在图7中看到的，并且如所预期的，mAb 1236、mAb 1237和mAb 1238都识别与mAb 271(利妥昔单抗-序列抗体)识别的相同的表位。
评估补体依赖细胞毒性(CDC)和抗体依赖细胞毒性(ADCC)。对于CDC，使用抗体解离率测定法。这样，用51Cr，200μCi装填靶CD20+Daudi细胞进行2小时，然后进行洗涤。将洗涤的Daudi细胞与10μg/ml各mAb一起在25℃下温育15分钟。然后充分洗涤靶Daudi细胞，并在37℃下温育。在37℃下进行0、2、4和6小时温育后，将细胞与6％人血清(补体源)一起温育45分钟。对照包括自发和最大的51Cr释放，所有浓度上的mAb和单独的Daudi细胞以及血清和单独的Daudi细胞。然后处理上清液，通过γ计数器计数释放的51Cr。抗体特异性CDC通过扣除单独的mAb和血清对裂解的贡献来测定。
如可在图8中看到的，mAb 1236、mAb 1237和mAb 1238具有比mAb 271(利妥昔单抗-序列抗体)更好的CDC功能活性。
ADCC活性通过用51Cr，200μCi装载靶Daudi细胞进行2小时，然后进行洗涤来测定。将洗涤的Daudi细胞与浓度已滴定的各mAb和新制备的PBMC(NK源)以50∶1一起混合4小时。对照包括自发的和最大的51Cr释放，所有浓度上的mAb和单独的Daudi细胞以及PBMC和单独的Daudi细胞。然后处理上清液并且通过γ计数器计数释放的51Cr。通过扣除PBMC对裂解的贡献来测定抗体特异性ADCC。
如可在图9中所看到的，对于所有受试mAb，ADCC活性随mAb浓度的不断增加而增加。在所有mAb浓度上，mAb 1236、mAb 1237和mAb1238具有与对于对照mAb 271(利妥昔单抗-序列抗体)观察到的ADCC活性相同的ADCC活性。
还可使用不依赖于CDC和ADCC的直接凋亡测定法评估凋亡活性。这样，在交联抗体(5μg/ml山羊抗人IgG Fc)存在的情况下，将Ramos细胞(NHL)与10、2、0.4或0.08μg/ml的各mAb在37℃下一起温育18小时。mAb 11用作同种型对照。18小时后，收获和洗涤细胞，然后将其与膜联蛋白V-APC和碘化丙啶在25℃下一起温育15分钟。通过流式细胞计量术就膜联蛋白V阳性/PI阴性细胞的存在分析细胞。
如可在图10中看到的，最优化的人源化mAb 1236、1237和1238在诱导凋亡上与mAb 271(利妥昔单抗-序列抗体)一样有效。
实施例3：mAb 1237的进一步最优化
B细胞慢性淋巴性细胞白血病(B-CLL)细胞表达比NHL(非何杰金氏淋巴瘤)细胞更低水平的CD20。测试显示，最优化的mAb 1236、mAb1237和mAb 1238显示对B-CLL细胞弱的CDC。作为下一步骤，选择mAb 1237并且将其经历诱变以就亲和力的提高，以及从而B-CLL细胞的裂解的提高来对其进行筛选。亲和力提高策略包括随机VH和Vκ结构域中的特定位点，选择具有L373的突变VH结构域，选择具有H1570的突变Vκ结构域，组合VH或Vκ中的分开的有益的突变，和将突变VH与突变Vκ结构域组合。鉴定的新突变体示于表3。
表3.鉴定的新突变体。VH和Vκ结构域内的残基位点参考Kabat编号系统。
  mAb   VH   VK
  1588   H1638(H1570S31F)   L373
  1589   H1639(H1570D56A)   L373
  1590   H1640(H1570D56L)   L373
  1652   H1639(H1570D56A)   L419(L373T92Q)
  1692   H1670(H1570N101G)   L373
最优化的mAb 1588包含H1638VH结构域(SEQ ID NO：15)(其为在相应于SEQ ID NO：13中所示的H1570氨基酸序列的残基31的H1570的Kabat编号位点31上具有S→F的置换的H1570VH结构域)和L373VL结构域(SEQ ID NO：10)。该S→F置换导致H1638VH结构域内最优化的CDR1(参见SEQ ID NO：7)。
最优化的mAb 1589包含H1639VH结构域(SEQ ID NO：16)(其为在相应于SEQ ID NO：13中所示的H1570氨基酸序列的残基57的H1570的Kabat编号位点56上具有D→A的置换的H1570VH结构域)和L373VL结构域(SEQ ID NO：10)。该D→A的置换导致H1639VH结构域内最优化的CDR2(参见SEQ ID NO：5；由SEQ ID NO：27编码)。
最优化的mAb 1590包含H1640VH结构域(SEQ ID NO：17)(其为在相应于SEQ ID NO：13中所示的H1570氨基酸序列的残基57的H1570的Kabat编号位点56上具有D→L的置换的H1570VH结构域)和L373VL结构域(SEQ ID NO：10)。该D→L的置换导致H1640VH结构域内最优化的CDR2(参见SEQ ID NO：6)。
最优化的mAb 1652包含H1639VH结构域(SEQ ID NO：16)和L419VL结构域(SEQ ID NO：11)(其为在相应于SEQ ID NO：10中所示的L373氨基酸序列的残基91的L373的Kabat编号位点92上具有T→Q的置换的L373VL结构域)。该T→Q的置换导致L419VL结构域内最优化的CDR3(参见SEQ ID NO：8)。
最优化的mAb 1692包含H1670VH结构域(SEQ ID NO：18)(其为在相应于SEQ ID NO：13中所示的H1570氨基酸序列的残基109的H1570的Kabat编号位点101上具有N→G的置换的H1570VH结构域)。该N→G的置换导致H1670VH结构域内最优化的CDR3(参见SEQ IDNO：4)。
mAb 1589的H1639VH结构域(SEQ ID NO：16)和L373VL结构域(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列示于图11，并且各自编码序列示于图12；也参见SEQ ID NO：22(H1639的编码区)和SEQ ID NO：23(L373的编码区)。
实施例4：其他最优化的人源化鼠抗CD20单克隆抗体的结合和 功能特征
就它们各自的结合和功能特征评估实施例1的最优的化人源化mAb 1237和实施例3中描述的其他最优化的人源化mAb 1588、1589、1590、1652和1692。对于各测定，mAb 271，具有与利妥昔单抗(IDEC-C2B8；IDEC Pharmaceuticals Corp.，San Diego，California)相同的序列，用作阳性对照。
通过列表显示CD20阳性(CD20+)和CD20阴性细胞系上染色的平均荧光强度(MFI)的流式细胞计量术评估结合特异性。流式细胞计量术分析显示这些最优化的人源化抗CD20mAb与CD20结合，如可在表4中看到的。
表4.与CD20膜阳性和阴性细胞系的结合
流工细胞计量术的结果(平均荧光强度)
  Daudi   EHEB   CHO.CD20   HL60   K562   CHOVec载体
  mAb   CD20阳性   CD20阳性   CD20阳性   CD20阴性   CD20阴性   CD20阴性
  271   941   130   81   6   3   4
  1237   1373   161   106   8   9   6
  1588   2068   338   140   9   6   4
  1589   1029   345   140   8   6   5
  1590   1627   429   135   8   7   6
  1652   1422   529   135   6   6   5
  1692   1671   450   137   7   4   5
  11(阴性对照)   6   8   5   7   4   6
通过检查mAb 2H7阻断结合的能力来评估表位保守性。这样，向EB1细胞中加入小鼠2H7(或同种型Ig作为对照)，加入候选人mAb和抗人Ig Alexa 647。通过FMAT检测结合。信号的减少表示阻断和共同表位使用(usage)。
如可在图13中看到的，所有受试抗体识别相同或重叠的表位。
评估补体依赖细胞毒性(CDC)和抗体依赖细胞毒性(ADCC)。对于CDC，使用几种测定法。第一放射性测定法包括用51Cr，200μCi装载靶细胞进行2小时。将洗涤的靶细胞(Daudi(NHL)和B-CLL细胞)与浓度已滴定的mAb和人血清(补体源)一起温育4小时。对照包括自发和最大51Cr释放、所有浓度上的mAb和单独的细胞以及血清和单独的细胞。处理悬浮液并且使用γ计数器计数释放的51Cr。通过扣除单独的mAb和血清对裂解的贡献来测定抗体特异性CDC。Daudi和两个B-CLL细胞系的结果分别示于图14和图15A及15B。对于Daudi细胞，最优化的mAb通常介导，特别地以更低的浓度介导比mAb 271(利妥昔单抗-序列抗体)更大的CDC功能。对于B-CLL细胞，最优化的mAb显示超过mAb 271(利妥昔单抗-序列抗体)的增加的CDC功能。
也使用抗体解离率测定法评估CDC功能。这样，用51Cr，200Ci装载靶CD20+Daudi细胞，进行2小时，然后进行洗涤。将洗涤的Daudi细胞与10μg/ml各mAb一起在25℃下温育15分钟。然后充分洗涤靶Daudi细胞，在37℃下温育0、1、2、4和6小时后，将其与6％人血清(补体源)一起温育45分钟。对照包括自发和最大的51Cr释放、所有浓度上的mAb和单独的Daudi细胞以及血清和单独的Daudi细胞。然后处理悬浮液并且使用γ计数器计数释放的51Cr。通过扣除单独的mAb和血清对裂解的贡献来测定抗体特异性CDC。
如在图16所看到的，所有最优化的mAb具有比mAb 271(利妥昔单抗-序列抗体)显著更好的CDC功能活性。
CDC功能也使用非放射性(Alamar BlueTM)CDC测定法进行评估。这样，使用浓度已滴定的mAb和人血清(补体源)来洗涤靶细胞(NHL、B-CLL和正常B细胞系中的两个)。对照包括靶细胞和不含人血清的抗体(自发的细胞死亡)、靶细胞和不含抗体的血清(背景裂解)和用10％SDS(或5％的水中的Triton X100)替代抗体和血清的靶细胞的孔(用于最大细胞死亡)。2小时后向各孔中加入阿尔玛蓝(AlamarBlue)，在过夜温育后读出荧光。在该测定中，更多的荧光更多的活细胞和更少的细胞毒性归因于CDC的细胞毒性。
AlamarBlueTM是响应增殖细胞中的代谢活性而发荧光的氧化-还原指示剂。AlamarBlueTM与四唑盐(MTT)相似，因为两者可检测细胞的代谢作用的变化，但AlamarBlueTM毒性较低并且比MTT更灵敏。将AlamarBlueTM与51Cr释放测定法的使用相比，细胞介导的细胞毒性的测量中获得的结果表明AamarBlueTM法与51Cr释放的测定具有相同的特异性。结果示于图17A(Daudi NHL细胞系)和17B(WIL2-S NHL细胞系)、图18A(EHEB B-CLL细胞系)和18B(Mec-1 B-CLL细胞系)以及图19A(SS BLCL“正常”B细胞)和19B(Mel K BLCL“正常”B细胞)中。
放射性测定法是4小时的测定，而非放射性测定法是18至20小时的测定。与对照相比，最优化的mAb候选物通常在非放射性测定中产生更大的裂解。非放射性测定可代表与体内环境更相似的状况中，因为药物在体内环境中可以以高浓度存在大大超过4小时。
概述结果，对于Daudi NHL细胞，最优化的mAb的CDC活性至少等于mAb 271(利妥昔单抗-序列抗体)。最优化的mAb在解离率CDC测定中比mAb 271更好。更低的解离率表明最优化的mAb 271的亲和力更高。最后，最优化的mAb在裂解B-CLL细胞系和正常B细胞靶中比mAb 271更好。
通过用51Cr，200μCi装载靶细胞(Daudi和B-CLL)进行2小时，然后进行洗涤来测定ADCC活性。将洗涤的靶细胞与浓度已滴定的各mAb和新配制的PBMC(NK源)以50∶1一起温育4小时。对照包括自发和最大的51Cr释放、所有浓度上的mAb和单独的靶细胞以及PBMC和单独的靶细胞。然后处理上清液，通过γ计数器计数释放的51Cr。通过扣除PBMC对裂解的贡献来测定抗体特异性ACC。
如图20(Daudi NHL细胞)和图21(MEC-1 B-CLL细胞)中所看到的，对于所有受试mAb，ADCC的活性随mAb浓度的逐渐增加而增加。最优化的mAb具有与对于对照mAb 271(利妥昔单抗-序列抗体)观察到的ADCC活性相似的ADCC活性。
还使用不依赖于CDC和ADCC的直接凋亡测定法评估凋亡活性。这样，在交联抗体(5μg/ml山羊抗人IgG Fc)存在的情况下，将Ramos细胞(NHL)与2、0.4或0.08μg/ml的各最优化的mAb或对照mAb 271一起在37℃下温育18小时。在18小时后收获和洗涤细胞，然后将其与膜联蛋白V-APC和碘化丙啶在25℃下一起温育15分钟。通过流式细胞计量术就膜联蛋白V阳性/PI阴性细胞的存在分析细胞。
如可在图22中看到的，最优化的mAb在诱导凋亡方面与mAb 271(利妥昔单抗-序列抗体序列抗体)一样有效。
也使用全血测定法评估细胞杀伤活性。该方案与CDC或ADCC测定法相似，除了使用全血而非血清(CDC)或纯化的PBMC(ADCC)以外。在该测定法中，靶细胞的裂解归因于CDC、ADCC的累积活性和凋亡。
该全血测定的结果示于图23(Daudi NHL细胞)、图24A(EHEBB-CLL细胞)以及24B(MEC-1 B-CLL细胞)和图25(Mel K“正常”B细胞)。如可在这些图中看到的，最优化的mAb具有与mAb 271(利妥昔单抗-序列抗体)相等的或更好的抗这些各自靶细胞的裂解作用。
实施例5：施用最优化的人源化鼠抗CD20单克隆抗体1589在 Daudi细胞异种移植小鼠模型中延长存活
Daudi NHL细胞是在SCID小鼠中全身性生长的人B细胞淋巴瘤细胞系。Daudi细胞的生长在小鼠中导致麻痹(Ghetie等人(1990)Int JCancer 45：481-485)。进行研究以确定本发明的抗CD20抗体是否影响具有Daudi细胞异种移植的小鼠的存活。
饲养SCID小鼠并且将它们维持在无病原体的条件下。将DaudiNHL细胞(8×106)静脉内注射入3组5只SCID小鼠(总共15只小鼠)的尾静脉内。在肿瘤注射后第7天和第9天，通过相同的途径用PBS、50μg人IgG1或50μg mAb 1589注射小鼠。每周观察动物3次，在第一次观察到后肢麻痹的体征时杀死动物。如图26中所示，单克隆抗体1589延长具有人Daudi细胞异种移植物的小鼠的存活。
实施例6：序列和抗体设计的概述
不同的最优化的CDR、包含这些最优化的CDR的可变重链和可变轻链的结构域、这些元件的编码序列和初始人源化抗CD20抗体的可变重链结构域的序列标志符概述于下面。下面的表5概述了抗CD20抗体的设计。
序列标志符：
1.H1569的CDR3-a.a.
2.H1570的CDR3-a.a.
3.H1571的CDR3-a.a.
4.H1670的CDR3-a.a.
5.H1639的CDR2-a.a.
6.H1640的CDR2-a.a.
7.H1638的CDR1-a.a.
8.L419的CDR3-a.a.
9.L373的CDR2-a.a.
10.L373-a.a.
11.L419-a.a.
12.H1569-a.a.
13.H1570-a.a.
14.H1571-a.a.
15.H1638-a.a.
16.H1639-a.a.
17.H1640-a.a.
18.H1670-a.a.
19.H1569-nt seq
20.H1570-nt seq
21.H1571-nt seq
22.H1639-nt seq
23.L373-nt seq
24.H1569的CDR3-nt seq
25.H1570的CDR3-nt seq
26.H1571的CDR3-nt seq
27.H1639的CDR2-nt seq
28.L373的CDR2-nt seq
29.H1286-a.a.
30.H1286的CDR3-a.a.
表5.抗体设计
  抗体名称   VH结构域  VL结构域
  亲本人源化的鼠抗CD20   H1286(SEQ ID NO：29)  L373(SEQ ID NO：10)
  1236   H1569(SEQ ID NO：12)  L373(SEQ ID NO：10)
  1237   H1570(SEQ ID NO：13)  L373(SEQ ID NO：10)
  1238   H1571(SEQ ID NO：14)  L373(SEQ ID NO：10)
  1588   H1638(SEQ ID NO：15)  L373(SEQ ID NO：10)
  1589   H1639(SEQ ID NO：16)  L373(SEQ ID NO：10)
  1590   H1640(SEQ ID NO：17)  L373(SEQ ID NO：10)
  1593   H1570(SEQ ID NO：13)  L419(SEQ ID NO：11)
  1652   H1639(SEQ ID NO：16)  L419(SEQ ID NO：11)
  1692   H1670(SEQ ID NO：18)  L373(SEQ ID NO：10)
本发明所属领域技术人员清楚本文中所示的本发明的许多修饰和其他实施方式具有上述描述和相关附图中提供的教导的益处。因此，应当理解，本发明不限定于公开的特定实施方式，修饰或其他实施方式旨在包括在所附权利要求和本文中公开的实施方式的列表的范围之内。尽管本文使用了特殊术语，但它们只在一般性和描述的意义上使用并且不为限制目的。
本说明书中提及的所有出版物和专利申请表示与本发明所属领域的技术人员的水平。本文所提及的所有出版物、专利申请案都以引用的方式并入，其引用程度就如同将每一个别出版物、专利或专利申请案特定且个别地以全文引用的方式并入。
序列表
<110>Ernest S.Smith
     Terrence L.Fisher，Jr.
<120>抗CD20抗体和使用方法
<130>050827/333624
<150>11/869,170
<151>2007-10-09
<150>60/850,604
<151>2006-10-10
<160>30
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>H1569的CDR3
<400>1
Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn
 1               5                  10
<210>2
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>H1570的CDR3
<400>2
Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn
 1               5                  10
<210>3
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>H1571的CDR3
<400>3
Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asp
 1               5                  10
<210>4
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>H1670的CDR3
<400>4
Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Gly Asn
 1               5                  10
<210>5
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>H1639的CDR2
<400>5
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
 1               5                  10                  15
Gly
<210>6
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>H1640的CDR2
<400>6
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Leu Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
 1               5                  10                  15
Gly
<210>7
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>H1638的CDR1
<400>7
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Phe Tyr Asn Met His
 1               5                  10
<210>8
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>L419的CDR3
<400>8
Gln Gln Trp Gln Ser Asn Pro Pro Thr
 1               5
<210>9
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>L373的CDR2
<400>9
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
 1               5
<210>10
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>L373-人源化的鼠抗CD20轻链
<400>10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>11
<211>106
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>L419-抗CD20轻链变体
<400>11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
            20                  25                  30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr
        35                  40                  45
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Gln Ser Asn Pro Pro Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>12
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>H1569-抗CD20重链变体
<400>12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>13
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>H1570-抗CD20重链变体
<400>13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>14
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>H1571-抗CD20重链变体
<400>14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asp Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>15
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>H1638-抗CD20重链变体
<400>15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Phe Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>16
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>H1639-抗CD20重链变体
<400>16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>17
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>H1640-抗CD20重链变体
<400>17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Leu Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>18
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>H1670-抗CD20重链变体
<400>18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Gly Asn Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>19
<211>363
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>H1569-抗CD20重链变体
<221>CDS
<222>(1)...(363)
<400>19
cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc  48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
 1               5                   10                  15
tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct ggg tac acc ttc acc agt tac    96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
             20                  25                  30
aat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg cta gag tgg att    144
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
         35                  40                  45
gga gct att tat ccc gga aat ggt gat act tcc tac aat cag aag ttc    192
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
     50                  55                  60
aaa ggc aag gcc aca ata act gca gac aaa tcc acg agc aca gcc tac    240
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
atg gag ctc agc agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt    288
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
gca aga tcg act tac tac ggc ggt gac tgg aac ttc aat aac tgg ggc    336
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn Trp Gly
            100                 105                 110
cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca                                363
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>20
<211>363
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>H1570-抗CD20重链变体
<221>CDS
<222>(1)...(363)
<400>20
cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc    48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
 1               5                   10                  15
tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct ggg tac acc ttc acc agt tac  96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
             20                  25                  30
aat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg cta gag tgg att  144
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
         35                  40                  45
gga gct att tat ccc gga aat ggt gat act tcc tac aat cag aag ttc  192
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser TyrAsn Gln Lys Phe
     50                  55                  60
aaa ggc aag gcc aca ata act gca gac aaa tcc acg agc aca gcc tac  240
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
atg gag ctc agc agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt  288
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
gca aga tcg act tac tac gcc ggt gac tgg aac ttc aat aac tgg ggc  336
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn Trp Gly
            100                 105                 110
cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca                              363
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>21
<211>363
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>H1571-抗CD20重链变体
<221>CDS
<222>(1)...(363)
<400>21
cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc  48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
 1               5                   10                  15
tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct ggg tac acc ttc acc agt tac  96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
             20                  25                  30
aat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg cta gag tgg att  144
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
         35                  40                  45
gga gct att tat ccc gga aat ggt gat act tcc tac aat cag aag ttc  192
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
     50                  55                  60
aaa ggc aag gcc aca ata act gca gac aaa tcc acg agc aca gcc tac  240
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
atg gag ctc agc agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt  288
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
gca aga tcg act tac tac gcc ggt gac tgg aac ttc aat gac tgg ggc  336
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asp Trp Gly
            100                 105                 110
cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca                              363
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>22
<211>363
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>H1639-抗CD20重链变体
<221>CDS
<222>(1)...(363)
<400>22
cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc  48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
 1               5                   10                  15
tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct ggg tac acc ttc acc agt tac  96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
             20                  25                  30
aat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg cta gag tgg att  144
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
         35                  40                  45
gga gct att tat ccc gga aat ggt gct act tcc tac aat cag aag ttc  192
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
     50                  55                  60
aaa ggc aag gcc aca ata act gca gac aaa tcc acg agc aca gcc tac  240
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
 65                  70                  75                  80
atg gag ctc agc agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt  288
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
gca aga tcg act tac tac gcc ggt gac tgg aac ttc aat aac tgg ggc  336
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn Trp Gly
            100                 105                 110
cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca                              363
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>23
<211>318
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>L373-抗CD20轻链
<221>CDS
<222>(1)...(318)
<400>23
gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga  48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                   10                  15
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt tcg agc gtt agt tat ata  96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
             20                  25                  30
cat tgg ttt cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aaa ccc ctg atc tat  144
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr
         35                  40                  45
gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc agt  192
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
     50                  55                  60
gga tct ggg aca gat tac act ctc acc atc agc agt ctg caa cct gag  240
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
 65                  70                  75                  80
gat ttc gca act tac tac tgt caa cag tgg act tcc aac ccg ccc act  288
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
                 85                  90                  95
ttc ggc gga ggg acc aag ctc gag atc aaa                          318
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>24
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>H1569的CDR3
<400>24
tcgacttact acggcggtga ctggaacttc aataac                     36
<210>25
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>H1570的CDR3
<400>25
tcgacttact acgccggtga ctggaacttc aataac      36
<210>26
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>H1571的CDR3
<400>26
tcgacttact acgccggtga ctggaacttc aatgac                     36
<210>27
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>H1639的CDR2
<400>27
gctatttatc ccggaaatgg tgctacttcc tacaatcaga agttcaaagg c    51
<210>28
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>L373的CDR2
<400>28
gctgcatcca gtttgcaaag t                                     21
<210>29
<211>121
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>H1286-抗CD20重链
<400>29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
 1               5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                  120
<210>30
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>H1286的CDR3
<400>30
Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val
 1               5                  10

Claims (75)

1.特异性结合CD20的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含至少一个最优化的互补决定区(CDR)区域，其中所述CDR区域选自SEQ IDNO：1-8。
2.权利要求1的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含免疫球蛋白重链，所述重链包含具有CDR的可变结构域，所述CDR含有选自SEQ IDNO：1-7的氨基酸序列。
3.权利要求1的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含免疫球蛋白轻链，所述轻链包含具有CDR的可变结构域，所述CDR含有SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列。
4.权利要求1-3中任一项的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白是IgG1 κ免疫球蛋白。
5.权利要求4的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含所述免疫球蛋白的重链内的人IgG1恒定区和所述免疫球蛋白的轻链内的人κ恒定区。
6.权利要求5的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含所述重链的可变结构域内的和所述轻链的可变结构域内的完全或部分人框架区。
7.权利要求5的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含所述重链的可变结构域内的和所述轻链的可变结构域内的鼠框架区。
8.权利要求1的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白展示与利妥昔单抗相比增加的补体依赖细胞毒性(CDC)。
9.权利要求1的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含含有SEQID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链。
10.权利要求1的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含含有选自SEQ ID NO：12-18的氨基酸序列的免疫球蛋白重链。
11.权利要求1的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含含有选自SEQ ID NO：12-18中所示的序列的氨基酸序列的重链和含有SEQ IDNO：10或SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的轻链。
12.权利要求11的免疫球蛋白，其中所述重链包含SEQ ID NO：12中所示的序列以及所述轻链包含SEQ ID NO：10中所示的序列。
13.权利要求11的免疫球蛋白，其中所述重链包含SEQ ID NO：13中所示的序列以及所述轻链包含SEQ ID NO：10中所示的序列。
14.权利要求11的免疫球蛋白，其中所述重链包含SEQ ID NO：14中所示的序列以及所述轻链包含SEQ ID NO：10中所示的序列。
15.权利要求11的免疫球蛋白，其中所述重链包含SEQ ID NO：15中所示的序列以及所述轻链包含SEQ ID NO：10中所示的序列。
16.权利要求11的免疫球蛋白，其中所述重链包含SEQ ID NO：16中所示的序列以及所述轻链包含SEQ ID NO：10中所示的序列。
17.权利要求11的免疫球蛋白，其中所述重链包含SEQ ID NO：17中所示的序列以及所述轻链包含SEQ ID NO：10中所示的序列。
18.权利要求11的免疫球蛋白，其中所述重链包含SEQ ID NO：18中所示的序列以及所述轻链包含SEQ ID NO：10中所示的序列。
19.权利要求11的免疫球蛋白，其中所述重链包含SEQ ID NO：13中所示的序列以及所述轻链包含SEQ ID NO：11中所示的序列。
20.权利要求11的免疫球蛋白，其中所述重链包含SEQ ID NO：16中所示的序列以及所述轻链包含SEQ ID NO：11中所示的序列。
21.特异性结合CD20的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含可变重链(VH)结构域，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的互补决定区(CDR)：
a)包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列的CDR1；
b)包含具有与SEQ ID：7中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR1，其中所述CDR1在相应于SEQ ID NO：7的残基7的位点上包含苯丙氨酸(Phe)残基；
c)包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列的CDR2；
d)包含具有与SEQ ID：5或SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR2，其中所述CDR2在相应于SEQID NO：5或SEQ ID NO：6的残基8的位点上分别包含丙氨酸(Ala)或亮氨酸(Leu)残基；
e)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列的CDR3；
f)包含具有与SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR3包含至少一个选自下列的残基：
i)相应于SEQ ID NO：1的残基9的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和
ii)相应于SEQ ID NO：1的残基12的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
g)包含具有与SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR3包含至少一个选自下列的残基：
i)相应于SEQ ID NO：2的残基5的位点上的丙氨酸(Ala)残基；
ii)相应于SEQ ID NO：2的残基9的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和
iii)相应于SEQ ID NO：2的残基12的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
h)包含具有与SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR3包含至少一个选自下列的残基：
i)相应于SEQ ID NO：3的残基5的位点上的丙氨酸(Ala)残基；
ii)相应于SEQ ID NO：3的残基9的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和
iii)相应于SEQ ID NO：3的残基12的位点上的天冬氨酸(Asp)残基；和
i)包含具有与SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR3包含至少一个选自下列的残基：
i)相应于SEQ ID NO：4的残基5的位点上的丙氨酸(Ala)残基；
ii)相应于SEQ ID NO：4的残基9的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
iii)相应于SEQ ID NO：4的残基11的位点上的甘氨酸(Gly)残基；和
iv)相应于SEQ ID NO：4的残基12的位点上的天冬酰胺(Asn)残基。
22.权利要求21的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含含有可变结构域的免疫球蛋白轻链，所述可变结构域具有至少一个选自下列的CDR：
a)包含SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的CDR3；
b)包含具有与SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR3在相应于SEQ ID NO：8的残基4的位点上包含谷氨酰胺(Gln)残基；和
c)包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列的CDR2。
23.权利要求22的免疫球蛋白，其中所述轻链的可变结构域包含SEQ ID NO：9中所示的CDR2和SEQ ID NO：8中所示的CDR3。
24.特异性结合CD20的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包含免疫球蛋白轻链，其中所述免疫球蛋白轻链包含具有选自下列的互补决定区3(CDR3)的可变结构域：
a)包含SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的CDR3；和
b)包含具有与SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR3在相应于SEQ ID NO：8的残基4的位点上包含谷氨酰胺(Gln)残基。
25.权利要求24的免疫球蛋白，其中所述轻链的可变结构域包含具有SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)。
26.权利要求21-25中任一项的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白是IgG1 κ免疫球蛋白。
27.权利要求26的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含所述免疫球蛋白的重链内的人IgG1恒定区和所述免疫球蛋白的轻链内的人κ恒定区。
28.权利要求27的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含所述重链的可变结构域内的和所述轻链的可变结构域内的完全或部分人框架区。
29.权利要求27的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含所述重链的可变结构域内的和所述轻链的可变结构域内的鼠框架区。
30.特异性结合CD20的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含可变重链(VH)结构域，其中所述VH结构域选自：
a)包含具有与选自SEQ ID NO：12-18的氨基酸序列至少90％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域；
b)包含具有与SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的残基：
i)相应于SEQ ID NO：12的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和
ii)相应于SEQ ID NO：12的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
c)包含具有与SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的残基：
i)相应于SEQ ID NO：13的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基；
ii)相应于SEQ ID NO：13的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和
iii)相应于SEQ ID NO：13的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
d)包含具有与SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的残基：
i)相应于SEQ ID NO：14的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基；和
ii)相应于SEQ ID NO：14的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和
iii)相应于SEQ ID NO：14的残基110的位点上的天冬氨酸(Asp)残基；
e)包含具有与SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的残基：
i)相应于SEQ ID NO：15的残基31的位点上的苯丙氨酸(Phe)残基；
ii)相应于SEQ ID NO：15的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基；
iii)相应于SEQ ID NO：15的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和
iv)相应于SEQ ID NO：15的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
f)包含具有与SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的残基：
i)相应于SEQ ID NO：16的残基57的位点上的丙氨酸(Ala)残基；
ii)相应于SEQ ID NO：16的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基；
iii)相应于SEQ ID NO：16的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和
iv)相应于SEQ ID NO：16的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
g)包含具有与SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的残基：
i)相应于SEQ ID NO：17的残基57的位点上的亮氨酸(Leu)残基；
ii)相应于SEQ ID NO：17的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基；
iii)相应于SEQ ID NO：17的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和
iv)相应于SEQ ID NO：17的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和
h)包含具有与SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的残基：
i)相应于SEQ ID NO：18的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基；
ii)相应于SEQ ID NO：18的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
iii)相应于SEQ ID NO：18的残基109的位点上的甘氨酸(Gly)残基；和
iv)相应于SEQ ID NO：18的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基。
31.权利要求30的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含可变轻链(VL)结构域，其中所述VL结构域选自：
a)包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的序列的VL结构域；
b)包含具有与SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的序列至少90％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域；
c)包含具有与SEQ ID NO：10中所示的序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO：9中所示的互补决定区2(CDR2)；和
d)包含具有与SEQ ID NO：11中所示的序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域，其中所述VL结构域包含至少一个：
i)SEQ ID NO：9中所示的互补决定区2(CDR2)；和
ii)相应于SEQ ID NO：11的残基91的位点上的谷氨酰胺(Gln)残基。
32.包含可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域的免疫球蛋白，其中所述VH结构域包含具有与选自SEQ ID NO：12-18中所示的序列至少90％同一性的氨基酸序列的多肽序列，和其中所述免疫球蛋白特异性结合CD20。
33.权利要求32的免疫球蛋白，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的序列。
34.包含可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域的免疫球蛋白，其中所述VL结构域包含具有与SEQ ID NO：11中所示的序列至少90％同一性的氨基酸序列的多肽序列，和其中所述免疫球蛋白特异性结合CD20。
35.包含可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域的免疫球蛋白，其中所述VH结构域包含具有选自SEQ ID NO：12-18中所示的氨基酸序列的多肽，和其中所述VL结构域包含具有SEQ ID NO：10或SEQ IDNO：11中所示的氨基酸序列的多肽。
36.权利要求1-35和67中任一项的免疫球蛋白，其还包括与其融合的异源多肽。
37.权利要求1-35和67中任一项的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白缀合至选自治疗剂、前体药物、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物应答调节物、药物试剂和PEG的试剂。
38.包含权利要求1-37中任一项的免疫球蛋白和载体的组合物。
39.包含编码免疫球蛋白重链的可变重链(VH)结构域的核酸的分离的多核苷酸，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的互补决定区(CDR)：
a)包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列的CDR1；
b)包含具有与SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR1，其中所述CDR1在相应于SEQ ID NO：7的残基7的位点上包含苯丙氨酸(Phe)残基；
c)包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列的CDR2；
d)包含具有与SEQ ID：5或SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR2，其中所述CDR2在相应于SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：6的残基8的位点上分别包含丙氨酸(Ala)或亮氨酸(Leu)残基；
e)包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列的CDR3；
f)包含具有与SEQ ID：1中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR3包含至少一个选自下列的残基：
i)相应于SEQ ID NO：1的残基9的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和
ii)相应于SEQ ID NO：1的残基12的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
g)包含具有与SEQ ID：2中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR3包含至少一个选自下列的残基：
i)相应于SEQ ID NO：2的残基5的位点上的丙氨酸(Ala)残基；
ii)相应于SEQ ID NO：2的残基9的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和
iii)相应于SEQ ID NO：2的残基12的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
h)包含具有与SEQ ID：3中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR3包含至少一个选自下列的残基：
i)相应于SEQ ID NO：3的残基5的位点上的丙氨酸(Ala)残基；
ii)相应于SEQ ID NO：3的残基9的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和
iii)相应于SEQ ID NO：3的残基12的位点上的天冬氨酸(Asp)残基；和
i)包含具有与SEQ ID：4中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR 3包含至少一个选自下列的残基：
i)相应于SEQ ID NO：4的残基5的位点上的丙氨酸(Ala)残基；
ii)相应于SEQ ID NO：4的残基9的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
iii)相应于SEQ ID NO：4的残基11的位点上的甘氨酸(Gly)残基；和
iv)相应于SEQ ID NO：4的残基12的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和
其中包含所述VH结构域的免疫球蛋白特异性结合CD20.
40.包含编码免疫球蛋白轻链的可变轻链(VL)结构域的核酸的分离的多核苷酸，其中所述VL结构域包含选自下列的互补决定区3(CDR3)：
a)包含SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的CDR3；和
b)包含具有与SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的CDR3，其中所述CDR3在相应于SEQ ID NO：8的残基4的位点上包含谷氨酰胺(Gln)残基；
其中包含所述VL结构域的免疫球蛋白特异性结合CD20。
41.权利要求40的分离的多核苷酸，其中所述VL结构域包含具有SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列的CDR2。
42.包含编码免疫球蛋白重链的可变重链(VH)结构域的核酸的分离的多核苷酸，其中所述VH结构域选自：
a)包含具有与选自SEQ ID NO：12-18的氨基酸序列至少90％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域；
b)包含具有与SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的残基：
i)相应于SEQ ID NO：12的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和
ii)相应于SEQ ID NO：12的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
c)包含具有与SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的残基：
i)相应于SEQ ID NO：13的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基；和
ii)相应于SEQ ID NO：13的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和
iii)相应于SEQ ID NO：13的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
d)包含具有与SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的残基：
i)相应于SEQ ID NO：14的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基；和
ii)相应于SEQ ID NO：14的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和
iii)相应于SEQ ID NO：14的残基110的位点上的天冬氨酸(Asp)残基；
e)包含具有与SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的残基：
i)相应于SEQ ID NO：15的残基31的位点上的苯丙氨酸(Phe)残基；
ii)相应于SEQ ID NO：15的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基；
iii)相应于SEQ ID NO：15的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和
iv)相应于SEQ ID NO：15的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
f)包含具有与SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的残基：
i)相应于SEQ ID NO：16的残基57的位点上的丙氨酸(Ala)残基；
ii)相应于SEQ ID NO：16的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基；
iii)相应于SEQ ID NO：16的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和
iv)相应于SEQ ID NO：16的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
g)包含具有与SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的残基：
i)相应于SEQ ID NO：17的残基57的位点上的亮氨酸(Leu)残基；
ii)相应于SEQ ID NO：17的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基；
iii)相应于SEQ ID NO：17的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和
iv)相应于SEQ ID NO：17的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和
h)包含具有与SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域，其中所述VH结构域包含至少一个选自下列的残基：
i)相应于SEQ ID NO：18的残基103的位点上的丙氨酸(Ala)残基；
ii)相应于SEQ ID NO：18的残基107的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；和
iii)相应于SEQ ID NO：18的残基109的位点上的甘氨酸(Gly)残基；和
iv)相应于SEQ ID NO：18的残基110的位点上的天冬酰胺(Asn)残基；
其中包含所述VH结构域的免疫球蛋白特异性结合CD20。
43.权利要求42的分离的多核苷酸，其中所述VH结构域由包含选自SEQ ID NO：19-22的序列的核酸编码。
44.包含编码免疫球蛋白轻链的可变轻链(VL)结构域的核酸的分离的多核苷酸，其中所述VL结构域选自：
a)包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的序列的VL结构域；
b)包含具有与SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的序列至少90％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域；
c)包含具有与SEQ ID NO：10中所示的序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO：9中所示的互补决定区2(CDR2)；和
d)包含具有与SEQ ID NO：11中所示的序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域，其中所述VL结构域包含至少一个：
i)SEQ ID NO：9中所示的互补决定区2(CDR2)；和
ii)相应于SEQ ID NO：11的残基91的位点上的谷氨酰胺(Gln)残基；
其中包含所述VL结构域的免疫球蛋白特异性结合CD20。
45.包含权利要求39-44中任一项的多核苷酸的组合物。
46.包含权利要求39-44中任一项的多核苷酸的载体。
47.权利要求46的载体，其中所述多核苷酸与启动子有效连接。
48.载体，其包含权利要求39、42和43中任一项的多核苷酸和含有编码免疫球蛋白轻链的可变轻链(VL)结构域的的核酸的多核苷酸。
49.权利要求48的载体，其中所述VL结构域包含具有SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)。
50.权利要求49的载体，其中所述VL结构域包含具有SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列的互补决定区2(CDR2)。
51.权利要求48-50中任一项的载体，其中将编码所述VH结构域的所述多核苷酸和编码所述VL结构域的所述多核苷酸按读框融合，使它们从与之有效连接的单个启动子共转录，并且共翻译成单链抗体或其抗原-结合片段。
52.权利要求48-50中任一项的载体，其中将编码所述VH结构域的所述多核苷酸和编码所述VL结构域的所述多核苷酸从与之有效连接的单个启动子共转录，但分别翻译。
53.权利要求52的载体，其还包括排列在编码所述VH结构域的所述多核苷酸与编码所述VL结构域的所述多核苷酸之间的IRES序列。
54.权利要求48-50中任一项的载体，其中编码所述VH结构域的所述多核苷酸和编码所述VL结构域的所述多核苷酸分别转录，各自与单独的启动子有效连接。
55.权利要求54的载体，其中所述单独的启动子是相同启动子的拷贝。
56.权利要求54的载体，其中所述单独的启动子是不相同的。
57.包含权利要求46-56中任一项的载体的组合物。
58.包含权利要求1的免疫球蛋白的组合物。
59.包含权利要求39-44中任一项的多核苷酸的宿主细胞。
60.包含权利要求46-56中任一项的载体的宿主细胞。
61.产生特异性结合CD20的免疫球蛋白的方法，该方法包括培养权利要求59或60的宿主细胞，和回收所述免疫球蛋白。
62.通过权利要求61的方法产生的免疫球蛋白。
63.权利要求62的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白是IgG1 κ免疫球蛋白。
64.权利要求63的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含所述免疫球蛋白的重链内的人IgG1恒定区和所述免疫球蛋白的轻链内的人κ恒定区。
65.权利要求64的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含所述重链的VH结构域内的和所述轻链的VL结构域内的完全或部分人框架区。
66.权利要求64的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含所述重链的VH结构域内的和所述轻链的VL结构域内的鼠框架区。
67.特异性结合CD20的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白包含可变轻链(VL)结构域，其中所述VL结构域选自：
a)包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的序列的VL结构域；
b)包含具有与SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的序列至少90％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域；
c)包含具有与SEQ ID NO：10中所示的序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO：9中所示的CDR2；和
d)包含具有与SEQ ID NO：11中所示的序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域，其中所述VL结构域包含至少一个：
i)SEQ ID NO：9中所示的CDR2；和
ii)相应于SEQ ID NO：11的残基91的位点上的谷氨酰胺(Gln)残基。
68.用于治疗受试者的癌症的方法，其中所述癌症与所述受试者中表达CD20的细胞相关，该方法包括对所述受试者施用有效量的包含权利要求1-37和67中任一项的免疫球蛋白的组合物。
69.权利要求68的方法，其中所述癌症选自非何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、高度B细胞淋巴瘤、中度B细胞淋巴瘤、低度B细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴母细胞性白血病、成髓细胞白血病和何杰金氏病。
70.用于抑制正常人B细胞的生长或分化的方法，其包括将所述B细胞与有效量的权利要求1-37和67中任一项的免疫球蛋白接触。
71.用于抑制B细胞谱系的癌细胞的生长的方法，其包括将所述癌细胞与有效量的权利要求1-37和67中任一项的免疫球蛋白接触。
72.权利要求71的方法，其中癌细胞来自选自非何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、高度B细胞淋巴瘤、中度B细胞淋巴瘤、低度B细胞淋巴瘤、B细胞急性淋巴母细胞性白血病、成髓细胞白血病和何杰金氏病的癌症。
73.用于治疗受试者的自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，其中所述疾病与所述受试者中表达CD20的细胞相关的，该方法包括对所述受试者施用有效量的权利要求1-37和67中任一项的免疫球蛋白。
74.权利要求73的方法，其中所述自身免疫性疾病或炎性疾病选自：全身性红斑狼疮(SLE)、盘状狼疮、狼疮性肾炎、结节病、幼年型关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、莱特尔综合征、强直性脊柱炎、痛风性关节炎、器官或组织移植物的排斥、移植物抗宿主病、多发性硬化症、高IgE综合征、结节性多动脉炎、原发性胆汁性肝硬化、炎性肠病、克罗恩病、乳糜泻(谷蛋白敏感性肠病)、自身免疫性肝炎、恶性贫血、自身免疫性溶血性贫血、银屑病、硬皮病、重症肌无力、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性甲状腺炎、Graves病、桥本甲状腺炎、免疫复合物病、慢性疲劳免疫功能紊乱综合征(CFIDS)、多肌炎和皮肌炎、冷球蛋白血症、血栓溶解、心肌病、寻常性天疱疮、肺间质纤维化、结节病、I型和II型糖尿病、1、2、3和4型迟发型超敏反应、过敏症或变应性紊乱、哮喘、丘-施二氏综合征(变应性肉芽肿病)、变应性皮炎、过敏性和刺激性接触性皮炎、瘾疹、IgE-介导的过敏症、动脉粥样硬化、血管炎、特发性炎性肌病、溶血性疾病、阿尔茨海默氏病和慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经炎。
75.包含权利要求1-37和67中任一项的免疫球蛋白的药物组合物。
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