CN113286876A - 用于生物降解酒精的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种药物组合物，其含有作为活性成分的10mg至约100g KRED和/或长效酒精脱氢酶和药学上可接受的载体。此外，本文提供了通过施用本发明的药物组合物降低血液酒精水平的方法、预防由酒精消耗引起的症状或风险的方法以及治疗患有酒精中毒的受试者的方法。

Description

用于生物降解酒精的组合物和方法
技术领域
本发明涉及；尤其是在生理环境中清除酒精的组合物和方法。
背景技术
酒精脱氢酶(ADH)是指催化伯醇或仲醇可逆氧化为醛或酮的酶家族。ADH在体内具有多种作用；主要功能是催化乙醇(EtOH)氧化为乙醛，作为通过肝脏的EtOH代谢的第一步，在此过程中使用NAD+或NADP+作为电子受体。
存在超过9种不同形式的由人体产生的ADH，并且每种在消化道的不同区域具有特定的作用，尽管已发现该酶在肝脏和肾脏中特别高度浓缩。使用特定治疗或制剂分解酒精的能力将成为临床和药理学用途的必要工具。
酒精滥用是事故和死亡的重要原因。主要的与酒精相关的问题几乎存在于人类活动的每个阶段，包括娱乐和工作场所。长期酒精滥用导致许多严重的疾病，最常见的是肝硬化。在美国，20％的急诊室出诊(大约9000万出诊)与酒精有关。致命的血液乙醇浓度一般在0.25％和1.50％之间。在美国，无并发症的乙醇过剂量导致每年约1000例死亡。
乙醇从肠道被快速输送到血液中，并且也从胃被输送到血液中。通过来自血液的乙醇的消失测量的摄入酒精的代谢遵循高于2mM的血液酒精浓度(BAC)值的零级动力学。血液酒精清除的线性速率为2至5mM/小时，因此，从体内去除大部分酒精需要4至10小时。
如乙醇的生物化学和药理学，第1卷(Majchrowicz,ed.,Plenum Press,N.Y.,1979)中所综述的，乙醇通过呼吸、排泄和代谢被清除，其90％发生在肝脏中。一般来说，肝脏酒精脱氢酶(LADH)代谢大部分乙醇。酒精代谢率受到相对低值的LADH米氏常数(Km)和NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原型)氧化(再生)率限制。位于肝细胞平滑内质网微粒体中的微粒体酒精氧化系统(MAOS)是第二种酒精代谢机制。这种机制依赖于NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，还原型)的再生。第三种酒精代谢机制取决于过氧化氢酶和过氧化氢。由于酶位点需要过氧化氢，这种机制被认为在体内代谢相对较少的乙醇。胃黏膜中存在的胃酒精脱氢酶是第四种酒精代谢机制。酒精代谢的该第四种机制相对于LADH机制的重要性目前尚不清楚。
已知只有两种方法加速体内乙醇清除。在一些受试者中，摄入果糖可使乙醇清除率比对照值提高0％至25％。据认为，果糖仅增加NADH再生，从而有助于将LADH机制维持在其最大的乙醇代谢固有速率。使用传统的肾透析法透析含酒精的血液只会略微加速酒精的清除。
在1980年，J.C.Commander在阿拉巴马州奥本大学的硕士论文中提出了用于酒精解毒的酶系统。该研究报道，当血液乙醇浓度大于肠乙醇浓度时，乙醇会从血液扩散到肠腔内。Commander提出了使用从肝脏分离的酶系统，该系统在肠道中保持活性。通常，肠腔的pH值为6.0至8.0，并且摄入的乙醇中80％会从肠腔吸收到血液中。他在体外测试的多酶系统包括含有各种浓度的牛血清白蛋白(BSA)、钾离子、硫醇基团(如β-2-巯基乙醇)、NAD、NADH、乙醛、酒精脱氢酶和醛脱氢酶(ALDH)的缓冲盐。
在1988年，D.R.Whitmire发表了他的博士学位论文“具有底物泵送的NAD循环的多酶系统应用于狗的乙醇解毒”。该论文报道了使用在适当的缓冲剂中的酵母酒精脱氢酶(YADH)和酵母醛脱氢酶(YALDH)使用乳酸脱氢酶(LDH)催化的丙酮酸泵送的NAD循环将酒精氧化为乙酸盐的方法的开发。还开发了使用在适当的缓冲剂中的无细胞弱氧化葡萄糖酸杆菌(gluconobacter suboxydan)提取物的第二系统，并显示氧化乙醇。还描述了使用YADH、YALDH与甘油脱氢酶(GDH)组合作为循环酶的第三种系统。使用蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂和蔗糖-磷酸-二硫苏糖醇缓冲剂克服了酶的胃pH失活、蛋白水解降解和胆汁盐失活的问题。然而，这些酶系统的体内使用带来了重大问题：该系统对丙酮酸的需求量很高，其通常在肠道中不会大量存在；需要蔗糖缓冲剂(50％w/v)来稳定YALDH以抵抗胆汁盐作用；丙酮酸和乳酸是盐的单价离子，每摩尔盐产生两摩尔溶质；高蔗糖浓度和高盐浓度导致酶系统高渗；以及循环反应产生的乳酸可潜在地导致乳酸性酸中毒。因此，虽然这种方法证明了使用口服施用的酶制剂快速氧化释放(exsorbed)到肠道中的乙醇的理论可行性，但由于上面列举的重大问题，它没有提供一种实用的、商业上可接受的加速从体内清除乙醇的手段。
发明内容
在一个实施方式中，本发明提供了包括与至少一种长效分子或复合分子结合的编码ADH/KRED的氨基酸序列的蛋白。
在一个实施方式中，本发明提供了包括10mg至100g的KRED和药学上可接受的载体的药物组合物。
在一个实施方式中，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含包括与至少一种长效分子结合的编码ADH/KRED的氨基酸序列的蛋白和药学上可接受的载体。
在另一实施方式中，本发明进一步提供了降低有需要的受试者中的血液酒精的方法，其包括向所述受试者施用包括有效量的包括与至少一种长效分子结合的编码ADH/KRED的氨基酸序列的蛋白的组合物，从而降低有需要的受试者中的血液酒精。
在另一实施方式中，本发明进一步提供了降低有需要的受试者中的血液酒精的方法，其包括向所述受试者施用包括有效量的KRED的组合物，从而降低有需要的受试者中的血液酒精。
在另一实施方式中，本发明进一步提供了预防有需要的受试者中由酒精消耗引起的症状或风险的方法，其包括向所述受试者施用包括有效量的KRED的组合物，从而预防有需要的受试者中由酒精消耗引起的症状或风险的方法。
在另一实施方式中，本发明进一步提供了，本发明的方法包括在酒精消耗之前、酒精消耗之后、或在酒精消耗之前和之后施用。
在另一实施方式中，本发明进一步提供了治疗患有酒精中毒的受试者的方法，其包括向所述受试者施用包括有效量的KRED的组合物，从而治疗患有酒精中毒的受试者。
在另一实施方式中，本发明进一步提供了治疗患有酒精中毒或醇类中毒(alcoholpoisoning)的受试者的方法，其包括向所述受试者施用包括有效量的包括与至少一种长效分子结合的编码KRED和/或ADH/KRED的氨基酸序列的蛋白的组合物，从而治疗患有酒精中毒或醇类中毒的受试者。
附图说明
图1是显示EtOH剂量(0.05g/ml-0.2g/ml)对开放场地活动(活动箱)的影响的柱状图。
图2是显示EtOH(0.5g/kg)和ADH(10、100和500mg/kg)(周期1&2)在30min的试验期间对在活动箱测试中行进的距离的影响的柱状图。
图3是显示在消耗之前和之后拯救和预防EtOH的神经学影响的能力的柱状图。
图4是显示用EtOH处理后小鼠的横梁行走能力的柱状图。
图5是显示ADH对EtOH处理的小鼠横梁行走能力的拯救效果的柱状图，
图6是显示ADH I通过在EtOH施用之前和之后施用是有效的柱状图。
图7是显示ADH对人血浆中EtOH浓度的影响的离体评估的柱状图(3名志愿者，添加ADH后30分钟)。
图8-10是显示ADH对人血浆中EtOH浓度的影响的离体评估的柱状图(3名志愿者，添加ADH后30分钟)。
图11A-11D是显示ADH对小鼠中不同剂量的急性EtOH中毒的影响评估的图。
具体实施方式
在一个实施方式中，本发明提供了与野生型ADH对应物相比具有增强的寿命的酒精脱氢酶(ADH)。在另一实施方式中，本发明提供了与野生型ADH对应物相比具有增强的体内效力的酒精脱氢酶(ADH)。在另一实施方式中，本发明提供了与野生型ADH对应物相比长效的酒精脱氢酶(ADH)。在另一实施方式中，待根据本发明进行修饰的ADH的酶委员会编号为EC 1.1.1.1。在一个实施方式中，本发明提供了一种组合物，其包含10mg至100g的KRED。在一个实施方式中，本发明提供了一种组合物，其包含10mg至10g的KRED。在另一实施方式中，KRED是Codexis KRED。
在另一实施方式中，ADH包括在辅因子存在的情况下，本发明的KRED将酒精底物氧化至对应的酮/醛产物，辅因子诸如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)。
在另一实施方式中，与野生型ADH相比，本发明的长效酒精脱氢酶(ADH)具有延长的循环半衰期。与野生型ADH相比，本发明的长效酒精脱氢酶(ADH)具有增强的效力。
在另一实施方式中，与野生型ADH对应物相比，本发明的长效酒精脱氢酶(ADH)在血液和/或血清内具有更高的曲线下面积(AUC)。在另一实施方式中，与野生型ADH对应物相比，本发明的长效酒精脱氢酶(ADH)在血液和/或血清内具有更低的清除率值。在另一实施方式中，与野生型ADH对应物相比，本发明的长效酒精脱氢酶(ADH)在血液和/或血清内具有更低的清除速率值。在另一实施方式中，与野生型ADH对应物相比，本发明的长效酒精脱氢酶(ADH)在血液和/或血清内具有更高的t1/2度量。在另一实施方式中，与野生型ADH对应物相比，本发明的长效酒精脱氢酶(ADH)在血液和/或血清内具有更高的C最大和/或CZ值。在一个实施方式中，短语：“增强的寿命”和“长效”可交换地使用。
在另一实施方式中，本发明的ADH是嵌合蛋白。在另一实施方式中，本发明的ADH是重组蛋白。在另一实施方式中，本发明提供了嵌合和/或重组ADH蛋白和编码嵌合和/或重组ADH蛋白的DNA分子。
在另一实施方式中，本发明的ADH作用于伯醇或叔醇或半缩醛。在另一实施方式中，本发明的ADH相比甲醇更好地氧化EtOH。在另一实施方式中，本发明的ADH作用于环仲醇。在另一实施方式中，本发明的ADH促进醇和醛或酮之间的相互转化以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原(NAD+至NADH)。在另一实施方式中，本发明的ADH分解酒精。在另一实施方式中，本发明的ADH分解否则有毒的酒精。
在另一实施方式中，本发明的ADH附接至环糊精。
在另一实施方式中，本发明的ADH共价附接至聚乙二醇(PEG)。在另一实施方式中，本发明的ADH共价附接至聚唾液酸(PSA)。在另一实施方式中，PEG是线性的。在另一实施方式中，PEG是分支的。
在另一实施方式中，本发明的ADH是PEG化的。在另一实施方式中，本发明的ADH修饰有可脱离的PEG分子(可逆PEG化)。在另一实施方式中，本发明的ADH是包括人工重复序列PSTAD的至少一个重复的嵌合蛋白和/或重组蛋白。
在另一实施方式中，本发明的ADH是融合至血清白蛋白(诸如HAS)的嵌合蛋白和/或重组蛋白。在另一实施方式中，本发明的ADH是融合至血清白蛋白片段的嵌合蛋白和/或重组蛋白。在另一实施方式中，本发明的ADH是包括绒毛膜促性腺素的C-末端肽(CTP)的至少一个重复的嵌合蛋白和/或重组蛋白。在另一实施方式中，本发明的ADH是融合至免疫球蛋白(Ig)G的恒定片段(Fc)结构域的嵌合蛋白和/或重组蛋白。在另一实施方式中，本发明的ADH是融合至XTEN的嵌合蛋白和/或重组蛋白。
在另一实施方式中，本发明的ADH是包括哺乳动物绒毛膜促性腺素的C-末端肽(CTP)的至少一个重复的嵌合蛋白和/或重组蛋白。在另一实施方式中，本发明的ADH是包括人绒毛膜促性腺素的C-末端肽(CTP)的至少一个重复的嵌合蛋白和/或重组蛋白。在另一实施方式中，CTP肽是在美国专利号5,712,122中描述的CTP，其通过引用以其整体并入本文。
在另一实施方式中，CTP肽是与天然CTP有1-5个保守氨基酸取代不同的绒毛膜促性腺素CTP的变体，如美国专利号5,712,122中描述。在另一实施方式中，CTP肽是与天然CTP有1个保守氨基酸取代不同的绒毛膜促性腺素CTP的变体。在另一实施方式中，CTP肽是与天然CTP有2个保守氨基酸取代不同的绒毛膜促性腺素CTP的变体。在另一实施方式中，CTP肽是与天然CTP有3个保守氨基酸取代不同的绒毛膜促性腺素CTP的变体。在另一实施方式中，CTP肽是与天然CTP有4个保守氨基酸取代不同的绒毛膜促性腺素CTP的变体。在另一实施方式中，CTP肽是与天然CTP有5个保守氨基酸取代不同的绒毛膜促性腺素CTP的变体。在另一实施方式中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽具有至少70％同源性。在另一实施方式中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽具有至少80％同源性。在另一实施方式中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽具有至少90％同源性。在另一实施方式中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽具有至少95％同源性。
在另一实施方式中，与野生型ADH相比，本发明的ADH是包括至少一个额外的糖基化位点或氨基酸残基的嵌合蛋白和/或重组蛋白。在另一实施方式中，与野生型ADH相比，本发明的ADH是高糖基化的。在另一实施方式中，本发明的ADH进一步包括N-联接的寡糖序列：Asn-Xxx-Ser/Thr，其中Xxx是除脯氨酸外的任意。在另一实施方式中，本发明的ADH进一步包括至少一个丝氨酸和/或苏氨酸残基。在另一实施方式中，本发明的ADH进一步包括至少一个惰性肽重复聚合物(PEG缀合方法的杂化物和与天然长半衰期蛋白IgG Fc、白蛋白或转铁蛋白的融合体)。
在另一实施方式中，与野生型ADH相比，本发明的ADH包括更高的糖基化程度。在另一实施方式中，与野生型ADH相比，本发明的ADH包括更高的聚糖大小。在另一实施方式中，与野生型ADH相比，本发明的ADH包括升高数量的带电末端聚糖(如，唾液酸)。在另一实施方式中，本发明的ADH通过缀合至聚氨基酸聚合物(如，聚谷氨酸(PGA)、N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HPMA)和杂化修饰的PEG聚合物)进行修饰。在另一实施方式中，本发明的ADH通过附接至包括谷氨酸和维生素E的聚合物(
Figure BDA0003132404110000051
聚合物)进行修饰。在另一实施方式中，本发明的ADH用杂化PEG聚合物，诸如但不限于PGCTM修饰。在另一实施方式中，本发明的ADH用淀粉修饰。在另一实施方式中，本发明的ADH用羟基乙基淀粉(HES)修饰。在另一实施方式中，本发明的ADH用长度范围在36至288个氨基酸残基的XTEN(也称为重组PEG或“rPEG”)修饰。在另一实施方式中，本发明的ADH用高氨基酸聚合物(HAP)修饰。在另一实施方式中，本发明的ADH用脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物(PAS)修饰。在另一实施方式中，PAS是50-400个重复的聚合物。在另一实施方式中，本发明的ADH用弹性蛋白样肽(ELP)修饰。在另一实施方式中，本发明的ADH用明胶样蛋白(GLK)聚合物修饰。在另一实施方式中，明胶样蛋白(GLK)聚合物、免疫球蛋白(Ig)G的恒定片段(Fc)结构域、CTP重复、糖基化氨基酸残基、高糖基化氨基酸序列、N-联接的寡糖序列、Asn-Xxx-Ser/Thr(其中Xxx是除脯氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸残基以外的任意)、惰性肽重复聚合物、白蛋白、转铁蛋白、带电末端聚糖、聚氨基酸聚合物、PEG聚合物、杂化修饰的PEG聚合物、HPMA、谷氨酸和维生素E、
Figure BDA0003132404110000052
聚合物、HES、XTEN、rPEG、HAP、PAS或其任意组合被称为“长效分子”。在另一实施方式中，“长效分子”是能够延长肽或蛋白的t1/2的任何氨基酸、氨基酸序列或分子。在另一实施方式中，“长效分子”是能够延长ADH/KRED的t1/2的任何氨基酸、氨基酸序列或分子。在另一实施方式中，“长效分子”是能够增强ADH/KRED的C最大的任何氨基酸、氨基酸序列或分子。在另一实施方式中，“长效分子”是能够延长ADH/KRED的AUC的任何氨基酸、氨基酸序列或分子。在另一实施方式中，“长效分子”是能够延长ADH/KRED的Km的任何氨基酸、氨基酸序列或分子。在另一实施方式中，“长效分子”是能够延长/增强ADH/KRED的V最大的任何氨基酸、氨基酸序列或分子。
在另一实施方式中，本发明的ADH是包括偶联至天然长半衰期蛋白或蛋白结构域(诸如但不限于Fc融合、转铁蛋白、CTP、白蛋白或其任意组合)的ADH的融合蛋白(嵌合体和/或重组体)。在另一实施方式中，融合蛋白的ADH部分是嵌合体的生物活性部分。在另一实施方式中，天然长半衰期蛋白或其结构域偶联至：ADH的氨基末端、ADH的羧基末端或两个末端。
在另一实施方式中，本文描述的任意修饰包括向ADH的编码序列添加至少一个氨基酸残基。在另一实施方式中，本文描述的任意修饰包括向ADH的编码序列添加至少两个氨基酸残基。在另一实施方式中，本文描述的任意修饰包括向ADH的编码序列添加至少3个氨基酸残基在另一实施方式中，本文描述的任意修饰包括向ADH的编码序列添加至少4个氨基酸残基。在另一实施方式中，本文描述的任意修饰包括向ADH的编码序列添加至少5个氨基酸残基。在另一实施方式中，本文描述的任意修饰包括向ADH的编码序列添加至少6个氨基酸残基。在另一实施方式中，本文描述的任意修饰包括向ADH的编码序列添加至少7个氨基酸残基。在另一实施方式中，本文描述的任意修饰包括向ADH的编码序列添加至少8个氨基酸残基。在另一实施方式中，本文描述的任意修饰包括向ADH的编码序列添加至少9个氨基酸残基。在另一实施方式中，本文描述的任意修饰包括向ADH的编码序列添加至少10个氨基酸残基。在另一实施方式中，ADH包括KRED蛋白。在另一实施方式中，本发明的ADH和/或KRED在美国专利号US7,833,767中进行公开，其通过引用以其全部并入本文。在另一实施方式中，本发明的ADH和/或KRED在国际公开号中进行公开。
在另一实施方式中，本发明的ADH和/或KRED在国际公开号中进行公开。在另一实施方式中，ADH和/或KRED的任意突变体也被术语“ADH”、“KRED”和/或“ADH/KRED”涵盖。在另一实施方式中，ADH/KRED还是ADH/KRED的生物活性片段。在另一实施方式中，“片段”是具有1至10个氨基酸残基缺失的ADH/KRED。在另一实施方式中，“片段”意思是具有2至8个氨基酸残基缺失的ADH/KRED。在另一实施方式中，“片段”意思是从羧基末端具有1至15个氨基酸残基缺失的ADH/KRED。在另一实施方式中，“片段”意思是从氨基末端具有1至15个氨基酸残基缺失的ADH/KRED。在另一实施方式中，“片段”意思是从羧基末端和氨基末端二者具有1至15个氨基酸残基缺失的ADH/KRED。在另一实施方式中，“片段”意思是从羧基末端、氨基末端或二者具有1至10个氨基酸残基缺失的ADH/KRED。在另一实施方式中，“片段”意思是从羧基末端、氨基末端或二者具有2至8个氨基酸残基缺失的ADH/KRED。
在另一实施方式中，本文所描述的ADH/KRED是购买自Codexis的KRED。在另一实施方式中，本文所描述的ADH/KRED在Codexis'Codex筛选试剂盒中进行描述。在另一实施方式中，本文所描述的ADH/KRED在Codexis'Codex筛选试剂盒(筛选方案版本：日期2013-10-04)中进行描述。
在另一实施方式中，本文描述的“修饰”是使ADH成为长效ADH(与野生型ADH对应物相比)。在另一实施方式中，长效是体内或离体长效。在另一实施方式中，长效是血液长效。在另一实施方式中，长效是血浆长效。在另一实施方式中，长效是体液长效。在另一实施方式中，长效是肠长效。在另一实施方式中，长效是胃长效。
在另一实施方式中，本文描述的任意修饰包括向ADH的编码序列添加1至60个氨基酸残基。在另一实施方式中，本文描述的任意修饰包括向ADH的编码序列添加1至25个氨基酸残基。在另一实施方式中，本文描述的任意修饰包括向ADH的编码序列添加3至25个氨基酸残基。在另一实施方式中，本文描述的任意修饰包括向ADH的编码序列添加5至30个氨基酸残基。在另一实施方式中，本文描述的任意修饰包括向ADH的编码序列添加12至60个氨基酸残基。在另一实施方式中，本文描述的任意修饰包括向ADH的编码序列添加6至40个氨基酸残基。
在一个实施方式中，本发明描述了长效ADH/KRED以及生产和使用其的方法。在另一实施方式中，长效ADH/KRED包括赋予ADH/KRED的长效活性的一种或多种分子。在另一实施方式中，本发明的长效ADH/KRED或嵌合体包括赋予ADH/KRED的长效活性的一种或多种分子。
在一个实施方式中，本发明描述了包括至少一种长效分子的长效ADH/KRED(融合体/重组体/嵌合体)。在一个实施方式中，本发明描述了包括至少两种长效分子的长效ADH/KRED(融合体/重组体/嵌合体)。在一个实施方式中，本发明描述了包括至少三种长效分子的长效ADH/KRED(融合体/重组体/嵌合体)。在一个实施方式中，本发明描述了包括至少四种长效分子的长效ADH/KRED(融合体/重组体/嵌合体)。在一个实施方式中，本发明描述了包括至少五种长效分子的长效ADH/KRED(融合体/重组体/嵌合体)。在一个实施方式中，本发明描述了包括至少六种长效分子的长效ADH/KRED(融合体/重组体/嵌合体)。
在一个实施方式中，本发明描述了包括1至20个长效分子的长效ADH/KRED(融合体/重组体/嵌合体)。在一个实施方式中，本发明描述了包括1至5个长效分子的长效ADH/KRED(融合体/重组体/嵌合体)。在一个实施方式中，本发明描述了包括2至8个长效分子的长效ADH/KRED(融合体/重组体/嵌合体)。在一个实施方式中，本发明描述了包括2至5个长效分子的长效ADH/KRED(融合体/重组体/嵌合体)。在一个实施方式中本发明描述了包括3至7个长效分子的长效ADH/KRED(融合体/重组体/嵌合体)。在一个实施方式中，本发明描述了包括5至15个长效分子的长效ADH/KRED(融合体/重组体/嵌合体)。
在另一实施方式中，多个长效分子意思是多个一种长效分子，诸如但不限于多个PEG分子。在另一实施方式中，多个长效分子意思是不同的长效分子的组合，诸如但不限于PEG分子和CTP分子。
在另一实施方式中，长效ADH/KRED包括附接至ADH/KRED的至少一种长效分子，其中至少一种长效分子附接至ADH/KRED的氨基末端。在另一实施方式中，长效ADH/KRED包括附接至ADH/KRED的至少一种长效分子，其中至少一种长效分子附接至ADH/KRED的羧基末端。在另一实施方式中，长效ADH/KRED包括附接至ADH/KRED的至少两种长效分子，其中至少两种长效分子中的第一种长效分子附接至ADH/KRED的氨基末端和至少两种长效分子中的第二种长效分子附接至ADH/KRED的羧基末端。
在另一实施方式中，长效分子经由连接体附接至ADH/KRED。在另一实施方式中，将长效分子连接至ADH/KRED的连接体是共价键。在另一实施方式中，将长效分子连接至ADH/KRED的连接体是肽键。在另一实施方式中，将长效分子连接至ADH/KRED的连接体是取代的肽键。
在另一实施方式中，复合分子附接至ADH/KRED，其包括但不限于环糊精。
在另一实施方式中，短语“ADH/KRED”、“ADH”或“KRED”是指具有ADH生物活性的任何多肽。在另一实施方式中，ADH/KRED是糖基化的。在另一实施方式中，ADH/KRED是非糖基化的。在另一实施方式中，长效分子融合至ADH/KRED。
在一些实施方式中，在ADH/KRED的氨基末端和ADH/KRED的羧基末端二者处放置长效分子提供抵抗ADH/KRED降解的增强的保护。在一些实施方式中，在ADH/KRED的氨基末端和ADH/KRED的羧基末端二者处放置长效分子提供附接的ADH/KRED的延长的半衰期。
在一些实施方式中，ADH/KRED的氨基末端处的长效分子、ADH/KRED的羧基末端处的长效分子、和串联附接至羧基末端处的长效分子的至少一种额外的长效分子提供抵抗ADH/KRED降解的增强的保护。在一些实施方式中，ADH/KRED的氨基末端处的长效分子、ADH/KRED的羧基末端处的长效分子、和串联附接至羧基末端处的ADH/KRED序列的至少一种额外的长效分子序列向附接的ADH/KRED提供延长的半衰期。
在一些实施方式中，ADH/KRED的氨基末端处的长效分子、ADH/KRED的羧基末端处的长效分子、和串联附接至羧基末端处的长效分子的至少一种额外的长效分子提供附接的ADH/KRED的增强的活性。
在一些实施方式中，ADH/KRED的氨基末端处的长效分子、ADH/KRED的羧基末端处的长效分子、和串联附接至氨基末端处的长效分子的至少一种额外的长效分子提供抵抗附接的ADH/KRED降解的保护。在一些实施方式中，ADH/KRED的氨基末端处的长效分子、ADH/KRED的羧基末端处的长效分子、和串联附接至氨基末端处的长效分子的至少一种额外的长效分子提供附接的ADH/KRED的延长的半衰期。在一些实施方式中，ADH/KRED的氨基末端处的长效分子、ADH/KRED的羧基末端处的长效分子、和串联附接至氨基末端处的长效分子的至少一种额外的长效分子提供附接的ADH/KRED的增强的活性。
在一个实施方式中，本发明的ADH/KRED也称为同源的。在一个实施方式中，本发明的ADH/KRED氨基酸序列与NCBI上列举的和/或使用the National Center ofBiotechnology Information(NCBI)的BlastP软件使用默认参数确定的ADH/KRED具有至少50％同源性。在一个实施方式中，本发明的ADH/KRED氨基酸序列与NCBI上列举的和/或使用the National Center of Biotechnology Information(NCBI)的BlastP软件使用默认参数确定的ADH/KRED具有至少60％同源性。在一个实施方式中，本发明的干扰素氨基酸序列与NCBI上列举的和/或使用the National Center of Biotechnology Information(NCBI)的BlastP软件使用默认参数确定的ADH/KRED具有至少70％同源性。在一个实施方式中，本发明的干扰素氨基酸序列与NCBI上列举的和/或使用the National Center ofBiotechnology Information(NCBI)的BlastP软件使用默认参数确定的ADH/KRED具有至少80％同源性。在一个实施方式中，本发明的干扰素氨基酸序列与NCBI上列举的和/或使用the National Center of Biotechnology Information(NCBI)的BlastP软件使用默认参数确定的ADH/KRED具有至少90％同源性。在一个实施方式中，本发明的干扰素氨基酸序列与NCBI上列举的和/或使用the National Center of Biotechnology Information(NCBI)的BlastP软件使用默认参数确定的ADH/KRED具有至少50％同源性。在一些实施方式中，根据本发明的同源性还涵盖缺失、插入或取代变体，其包括氨基酸取代、以及其生物活性多肽片段。
在一些实施方式中，ADH/KRED是其序列在基因库中公开的已知ADH/KRED。在一些实施方式中，ADH/KRED是保持体内和/或离体ADH活性的已知ADH/KRED的同系物。在另一实施方式中，根据本发明的“同系物”或“同源物”还涵盖缺失、插入或取代变体，其包括氨基酸取代、以及其生物活性多肽片段。
在另一实施方式中，本发明的方法提供编码ADH/KRED(蛋白)的核酸序列，所述ADH/KRED(蛋白)额外地具有在N-末端上的至少一种长效分子和/或在C-末端上的至少一种长效分子，用于降低血液酒精水平或血液酒精浓度。在另一实施方式中，本发明的方法提供编码ADH/KRED的核酸序列，所述ADH/KRED额外地具有在N-末端上的一种长效分子和/或在C-末端上的两种长效分子，用于降低血液酒精水平或血液酒精浓度。
在另一实施方式中，本发明进一步提供了组合物和/或药物组合物，其包括10mg至100g的长效ADH/KRED。在一个实施方式中，本发明提供了组合物和/或药物组合物，其包括10mg至10g的长效ADH/KRED。在另一实施方式中，长效ADH/KRED是融合至或联接至长效分子的Codexis KRED。在另一实施方式中，Codexis KRED是KRED-P1-A04、KRED-P1-A12、KRED-P1-B05、KRED-P1-B10或其任意组合。在一个实施方式中，本发明提供了组合物，其包括KRED和/或长效ADH/KRED和可接受的载体或稀释剂。在另一实施方式中，药物组合物是可注射的药物组合物。
在另一实施方式中，药物组合物包括10mg至8g的KRED和/或长效ADH/KRED。在另一实施方式中，药物组合物包括10mg至5g的KRED和/或长效ADH/KRED。在另一实施方式中，药物组合物包括10mg至1g的KRED和/或长效ADH/KRED。在另一实施方式中，药物组合物包括10mg至100mg的KRED和/或长效ADH/KRED。在另一实施方式中，药物组合物包括100mg至0.5g的KRED和/或长效ADH/KRED。在另一实施方式中，药物组合物包括1mg至100mg的KRED和/或长效ADH/KRED。在另一实施方式中，药物组合物包括5mg至300mg的KRED和/或长效ADH/KRED。在另一实施方式中，药物组合物包括500mg至30g的KRED和/或长效ADH/KRED。在另一实施方式中，药物组合物包括1g至30g的KRED。在另一实施方式中，药物组合物包括5mg至50g的KRED和/或长效ADH/KRED。
在另一实施方式中，本文提供了用于降低有需要的受试者中的血液酒精的方法，其包括向所述受试者施用包括有效量的KRED和/或长效ADH/KRED的组合物，从而降低有需要的受试者中的血液酒精。在另一实施方式中，有效量是1至5000mg/kg(体重)。在另一实施方式中，有效量是0.2至5mg/kg(体重)。在另一实施方式中，有效量是0.5至100mg/kg(体重)。
在另一实施方式中，本文提供了用于降低与高血液酒精浓度和/或长期升高的血液酒精浓度有关的风险的方法，其包括向消耗酒精的受试者施用包括有效量的KRED和/或长效ADH/KRED的组合物。在另一实施方式中，与高血液酒精浓度和/或长期升高的血液酒精浓度有关的风险是：神经元损伤、肝损伤、脑损伤、肾损伤、胃肠道损伤、内分泌损伤、糖尿病、心血管疾病、失明、中风、代谢疾病或其任何组合。
在另一实施方式中，有效量是1至50mg/kg(体重)。在另一实施方式中，有效量是20至300mg/kg(体重)。在另一实施方式中，有效量是100至1000mg/kg(体重)。在另一实施方式中，有效量是10至90mg/kg(体重)。在另一实施方式中，有效量是50至250mg/kg(体重)。在另一实施方式中，有效量是100至500mg/kg(体重)。
在另一实施方式中，有需要的受试者具有按血液体积计0.0001％以上的血液乙醇浓度。在另一实施方式中，有需要的受试者具有按血液体积计0.001％以上的血液乙醇浓度。在另一实施方式中，有需要的受试者具有按血液体积计0.1％以上的血液乙醇浓度。在另一实施方式中，有需要的受试者具有按血液体积计0.5％以上的血液乙醇浓度。
在另一实施方式中，降低血液酒精水平是酒精解毒。在另一实施方式中，降低血液酒精水平(浓度)是减少酒精的神经副作用。在另一实施方式中，降低血液酒精水平是减少酒精施加至组织的损伤。在另一实施方式中，降低血液酒精水平是减少酒精施加至肝脏的损伤。在另一实施方式中，降低血液酒精水平是减少与酒精消耗有关的风险。
在另一实施方式中，本文提供了用于预防有需要的受试者中由酒精消耗引起的症状或风险的方法，其包括向受试者施用包括有效量的KRED和/或长效ADH/KRED的组合物，从而预防有需要的受试者中由酒精消耗引起的症状或风险。在另一实施方式中，有需要的受试者是即将消耗酒精的受试者。在另一实施方式中，即将消耗酒精的受试者即将在2至1000分钟内消耗酒精。在另一实施方式中，即将消耗酒精的受试者即将在2至500分钟内消耗酒精。在另一实施方式中，即将消耗酒精的受试者即将在20至700分钟内消耗酒精。在另一实施方式中，即将消耗酒精的受试者即将在60至600分钟内消耗酒精。在另一实施方式中，即将消耗酒精的受试者即将在2至60分钟内消耗酒精。在另一实施方式中，即将消耗酒精的受试者即将在2至30分钟内消耗酒精。在另一实施方式中，即将消耗酒精的受试者即将在5至60分钟内消耗酒精。在另一实施方式中，即将消耗酒精的受试者即将在20至120分钟内消耗酒精。在另一实施方式中，即将消耗酒精的受试者即将在10至90分钟内消耗酒精。
在另一实施方式中，本文提供了用于治疗患有酒精中毒的受试者的方法，其包括向所述受试者施用包括有效量的KRED和/或长效ADH/KRED的组合物。在另一实施方式中，本文提供了用于降低血液酒精水平和/或降低与酒精有关的症状和风险的方法，其包括在酒精消耗之前、酒精消耗之后、酒精消耗之前和之后、或其任意组合，施用本文描述的组合物。
在另一实施方式中，本发明的KRED属于酮还原酶(KRED)或羰基还原酶类(EC1.1.1.184)。在另一实施方式中，本发明的KRED和/或长效ADH/KRED在辅因子(诸如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP))存在的情况下，将酒精底物氧化为对应的酮/醛产物。
在另一实施方式中，本发明的KRED在美国专利号US7,833,767中公开，其通过引用以其全部并入本文。在另一实施方式中，本发明的KRED包括以下氨基酸序列：MAKNFSNVEYPAPPPAHTKNESLQVLDLFKLNGKVASITGSSSGIGYALAEAFAQVGADVAIWYNSHDATGKAEALAKKYGVKVKAYKANVSSSDAVKQTIEQQIKDFGHLDIVVANAGIPWTKGAYIDQDDDKHFDQVVDVDLKGVGYVAKHAGRHFRERFEKEGKKGALVFTASMSGHIVNVPQFQATYNAAKAGVRHFAKSLAVEFAPFARVNSVSPGYINTEISDFVPQETQNKWWSLVPLGRGGETAELVGAYLFLASDAGSYATGTDIIVDGGYTLP(SEQ ID NO:1)。在另一实施方式中，本发明的KRED相对于SEQ ID NO:1的KRED具有增强的KRED活性。在另一实施方式中，本发明的KRED与SEQ ID NO:1有1-25个氨基酸残基不同。在另一实施方式中，本发明的KRED与SEQ IDNO:1有1-20个氨基酸残基不同。在另一实施方式中，本发明的KRED与SEQ ID NO:1有5-15个氨基酸残基不同。在另一实施方式中，本发明的KRED与SEQ ID NO:1有2-8个氨基酸残基不同。在另一实施方式中，本发明的KRED包括SEQ ID NO:1的突变形式。在另一实施方式中，本文描述的ADH/KRED包括本文描述的KRED。
在另一实施方式中，本发明的KRED包括国际公开号(PCT)：WO2005017135的SEQ IDNo:506、520、526、536和538，其通过引用以其全部并入本文。在另一实施方式中，(PCT):WO2014174505的KRED和/或长效ADH/KRED，其通过引用以其全部并入本文。
在另一实施方式中，本发明的KRED和/或长效ADH/KRED是或包括SEQ ID NO:1的片段。在另一实施方式中，当作为裂解物进行测量时，本发明的KRED和/或长效ADH/KRED是或包括具有1.2至约100倍未修饰的ADH/KRED的ADH/KRED活性的SEQ ID NO:1的片段。在另一实施方式中，长效KRED和/或ADH/KRED具有至少与SEQ ID NO:1的野生型KRED相当的活性。在另一实施方式中，“片段”意思是具有1至15个氨基酸残基缺失的多肽。在另一实施方式中“片段”意思是具有1至10个氨基酸残基缺失的多肽。在另一实施方式中，“片段”意思是具有2至8个氨基酸残基缺失的多肽。在另一实施方式中，“片段”意思是从羧基末端具有1至15个氨基酸残基缺失的多肽。在另一实施方式中，“片段”意思是从氨基末端具有1至15个氨基酸残基缺失的多肽。在另一实施方式中，“片段”意思是从羧基末端和安氨基末端二者具有1至15个氨基酸残基缺失的多肽。在另一实施方式中，“片段”意思是从羧基末端、氨基末端或二者具有1至10个氨基酸残基缺失的多肽。在另一实施方式中，“片段”意思是从羧基末端、氨基末端或二者具有2至8个氨基酸残基缺失的多肽.
在另一实施方式中，SEQ ID NO:1的突变形式包括以下一个或多个氨基酸残基置换：A2V；K3E；F5L或C；N7K；E9G或K；A12V；P13L；P14A；A16G或V；T18A；K19I；N20D或S；E21K；S22N或T；Q24H或R；V25A；N32S或D；A36T；S41G；S42N；I45L；A48T；V56A；V60I；Y64H；N65K、D、Y或S；S66G或R；H67L或Q；D68G或N；G71D；E74K或G；K78R；K79R；K85R；A86V；N90D；S93N或C；D95N、G、V、Y或E；K98R；Q99L、R、或H；T100A；IlOlV；Q103R；1105V或T；K106R或Q；H110Y、C或R；V114A；A116G；I120V；K124R；D129G或N；D131G或V；D132N；K134M、V、E或R；D137N或G；Q138L；V140I；D143N；L144F；K145R；V147A；V150A；H153Y或Q；H157Y；F158L或Y；R159K；E160G或V；F162Y或S；E163G或K；E165D、G或K；K167I或R；A170S；V172I；F173C；M177V或T；H180Y；V184I；T190A；A193V；A194V；F201L；K203R；F209Y；V218I；N224S；E226K、G或D；S228T；D229A；V231I或A；Q233K或R；E234G或D；T235K或A；N237Y；K238R或E；T251A；V255A；F260L；A262V；T272A；I274L；I275L或V；P283R，或其任意组合。
在另一实施方式中，本文描述的KRED是由Codexis购买的KRED。在另一实施方式中，本文描述的KRED在Codexis'Codex筛选试剂盒中进行描述。在另一实施方式中，本文描述的KRED在Codexis'Codex筛选试剂盒(筛选方案版本：日期2013-10-04)中进行描述。
在另一实施方式中，当作为裂解物进行测量时，本文描述的KRED和/或长效ADH/KRED具有1.2至约10倍或1.2至约100倍未修饰的ADH/KRED的ADH/KRED活性或SEQ ID NO:1的多肽的未修饰的KRED活性。在另一实施方式中，当作为裂解物进行测量时，本文描述的KRED具有1.2至约10倍SEQ ID NO:1的多肽的KRED活性。在另一实施方式中，当作为裂解物进行测量时，本文描述的长效ADH/KRED或KRED具有2至约50倍SEQ ID NO:1的未修饰的KRED和/或ADH/KRED多肽的KRED或ADH/KRED活性。在另一实施方式中，当作为裂解物进行测量时，本文描述的长效ADH/KRED和/或KRED具有4至约30倍SEQ ID NO:1的KRED、未修饰的KRED和/或ADH/KRED的ADH/KRED和/或KRED活性。
在另一实施方式中，与包括SEQ ID NO:1的蛋白相比，本文描述的长效ADH/KRED具有抵抗降解的增强的保护。在另一实施方式中，与未修饰的ADH/KRED相比，本文描述的KRED和/或长效ADH/KRED在生理条件下具有抵抗降解的增强的保护。在另一实施方式中，与未修饰的ADH/KRED或包括SEQ ID NO:1的蛋白相比，本文描述的任意包括KRED的多肽具有增强的热稳定性。在另一实施方式中，与未修饰的ADH/KRED和/或包括SEQ ID NO:1的蛋白相比，本文描述的KRED和/或长效ADH/KRED在生理条件下具有增强的热稳定性。
在另一实施方式中，本文描述的本发明的KRED和/或长效ADH/KRED在其施用0.2-24小时后保持至少15％的初始(温育前)KRED和/或ADH/KRED活性。在另一实施方式中，本文描述的本发明的长效ADH/KRED或本发明的KRED在其施用0.2-2小时后保持至少15％的初始(温育前)KRED和/或ADH/KRED活性。在另一实施方式中，本文描述的本发明的KRED和/或长效ADH/KRED在其施用0.2-4小时后保持至少15％的初始(温育前)KRED和/或ADH/KRED活性。在另一实施方式中，本文描述的本发明的KRED和/或长效ADH/KRED在其施用1-7小时后保持至少15％的初始(温育前)KRED和/或ADH/KRED活性。
在另一实施方式中，本文描述的本发明的KRED和/或长效ADH/KRED在其施用0.5-70小时后保持至少15％的初始(温育前)KRED和/或ADH/KRED活性。在另一实施方式中，本文描述的本发明的KRED和/或长效ADH/KRED在其施用1-50小时后保持至少15％的初始(温育前)KRED和/或ADH/KRED活性。在另一实施方式中，本文描述的本发明的KRED和/或长效ADH/KRED在其施用0.5-10小时后保持至少15％的初始(温育前)KRED和/或ADH/KRED活性。在另一实施方式中，施用是指将KRED和/或ADH/KRED施用至生理环境中。在另一实施方式中，施用是指血液内的KRED和/或ADH/KRED。在另一实施方式中，施用是指血清内的KRED和/或ADH/KRED。
在另一实施方式中，至少15％是15％至75％。在另一实施方式中，至少15％是15％至50％。在另一实施方式中，至少15％是15％至30％。在另一实施方式中，0.5-10小时是0.5-4小时。在另一实施方式中，0.5-10小时是0.5-2小时。在另一实施方式中，0.5-10小时是0.5-4小时。在另一实施方式中，0.5-10小时是0.5-2.5小时。
在另一实施方式中，与未修饰的ADH/KRED和/或包括SEQ ID NO:1的蛋白相比，本文描述的KRED和/或ADH/KRED在标准蛋白储存条件下具有抵抗降解的增强的保护。在另一实施方式中，与未修饰的ADH/KRED和/或包括SEQ ID NO:1的蛋白相比，本文描述的KRED和/或ADH/KRED具有1.2至约100倍以下参数：血清半衰期、循环半衰期、AUC、CL、Ke、t1/2、C最大、T最大、Vdz或其任意组合。
在另一实施方式中，在制造本文描述的KRED和/或ADH/KRED工艺中使用编码本发明的KRED和/或ADH/KRED的DNA序列。在另一实施方式中，在制造本文描述的突变的KRED和/或ADH/KRED工艺中使用编码本发明的KRED和/或ADH/KRED的DNA序列。在另一实施方式中，编码KRED和/或ADH/KRED的DNA序列是载体或质粒。
在一些实施方式中，KRED和/或ADH/KRED是多肽。在一个实施方式中，本文使用的“多肽”涵盖天然多肽(降解产物，合成地合成多肽或重组多肽)和肽模拟物(peptidomimetics)(通常地，合成地合成多肽)，以及拟肽和半拟肽，在一些实施方式中，其是具有使多肽在体内时甚至更加稳定或更能够渗透入细胞的修饰的多肽类似物。在一个实施方式中，本文使用的“多肽”是KRED或ADH/KRED。在一个实施方式中，ADH/KRED是长效ADH/KRED。
在一些实施方式中，修饰包括但不限于N末端修饰、C末端修饰、多肽键修饰(包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH)、主链修饰和残基修饰。用于制备肽模拟物化合物的方法在本领域内是已知的并且例如在Quantitative Drug Design,C.A.Ramsden Gd.,Chapter 17.2,F.Choplin PergamonPress(1992)中详细说明，其通过引用并入本文，如在本文中完全叙述。下文提供该方面的进一步细节。
在一些实施方式中，多肽内的肽键(-CO-NH-)被取代。在一些实施方式中，多肽键被N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)取代。在一些实施方式中，多肽键被酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)取代。在一些实施方式中，多肽键被酮亚甲基键(-CO-CH2-)取代。在一些实施方式中，多肽键被α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)取代，其中R是任意烷基，如甲基、卡巴键(carbabond)(-CH2-NH-)。在一些实施方式中，多肽键被羟亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)取代。在一些实施方式中，多肽键被硫酰胺键(-CS-NH-)取代。在一些实施方式中，多肽键被烯烃双键(-CH＝CH-)取代。在一些实施方式中，多肽键被反酰胺键(-NH-CO-)取代。在一些实施方式中，多肽键被多肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)取代，其中R是“正常”侧链，天然存在于碳原子上。在一些实施方式中，这些修饰沿多肽链在任意键并且甚至同时在若干键(2-3个键)处出现。
在一些实施方式中，多肽的天然芳香族氨基酸诸如Trp、Tyr和Phe，被取代为合成的非天然酸诸如苯甘氨酸、TIC、萘丙氨酸(Nol)、Phe的环甲基化衍生物、Phe的卤化衍生物或邻甲基-Tyr。在一些实施方式中，本发明的多肽包括一种或多种修饰的氨基酸或一种或多种非氨基酸单体(如脂肪酸、复合碳水化合物等)。
在一个实施方式中，“氨基酸”或“氨基酸”被理解为包括20种天然存在的氨基酸；经常在体内进行翻译后修饰的那些氨基酸，包括例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其他不常见的氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链素(isodesmosine)、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。在一个实施方式中，“氨基酸”包括D-和L-氨基酸。
在一些实施方式中，本发明的多肽用于需要多肽呈可溶形式的治疗剂中。在一些实施方式中，本发明的多肽包括一种或多种非天然或天然极性氨基酸，其包括但不限于丝氨酸和苏氨酸，由于它们的含羟基侧链能够增加多肽溶解度。
在一些实施方式中，本发明的多肽以线性形式使用，尽管本领域技术人员将认识到，在环化不严重干扰多肽特性的情况下，也可以使用环状形式的多肽。
在一些实施方式中，本发明的多肽是生物化学合成的，诸如通过使用标准固相技术。在一些实施方式中，这些生物化学方法包括专一固相合成、部分固相合成、片段缩合或经典溶液合成。在一些实施方式中，当多肽相对较短(约5-15kDa)和/或当它不能通过重组技术产生(即，不由核酸序列编码)并且因此涉及不同的化学时，使用这些方法。
在一些实施方式中，固相多肽合成程序是本领域技术人员众所周知的，并由JohnMorrow Stewart and Janis Dillaha Young,Solid Phase Polypeptide Syntheses(2ndEd.,Pierce Chemical Company,1984)进一步描述。在一些实施方式中，合成多肽通过制备型高效液相色谱纯化[Creighton T.(1983)Proteins,structures and molecularprinciples.WH Freeman and Co.N.Y.]，并且其组成可以通过本领域技术人员已知的方法通过氨基酸测序进行确认。
在一些实施方式中，重组蛋白技术用于生成本发明的多肽。在一些实施方式中，重组蛋白技术用于生成相对较长的多肽(如，长于18-25个氨基酸)。在一些实施方式中，重组蛋白技术用于生成大量本发明的多肽。在一些实施方式中，重组技术通过以下文献描述，Bitter et al.,(1987)Methods in Enzymol.153:516-544，Studier et al.(1990)Methods in Enzymol.185:60-89，Brisson et al.(1984)Nature 310:511-514，Takamatsuet al.(1987)EMBO J.6:307-311，Coruzzi et al.(1984)EMBO J.3:1671-1680，和Brogliet al,(1984)Science 224:838-843，Gurley et al.(1986)Mol.Cell.Biol.6:559-565和Weissbach&Weissbach,1988,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,NY,Section VIII,pp 421-463。
在一个实施方式中，本发明的多肽使用编码本发明多肽的多核苷酸合成。在一些实施方式中，将编码本发明多肽的多核苷酸连接到表达载体中，该表达载体包含顺式调节序列(如，启动子序列)的转录控制。在一些实施方式中，顺式调节序列适合指导本发明多肽的组成型表达。在一些实施方式中，顺式调节序列适合指导本发明多肽的组织特异性表达。在一些实施方式中，顺式调节序列适合指导本发明多肽的诱导型表达。
在一些实施方式中，表达本发明多肽的多核苷酸如在SEQ ID NO:20、21、44、45和46中叙述。
在一些实施方式中，适用于本发明的组织特异性启动子包括在特定细胞群中有功能的序列，实例包括但不限于启动子，诸如肝脏特异性白蛋白[Pinkert et al.,(1987)Genes Dev.1:268-277]、淋巴特异性启动子[Calame et al.,(1988)Adv.Immunol.43:235-275]；特别是T细胞受体的启动子[Winoto et al.,(1989)EMBO J.8:729-733]和免疫球蛋白；[Banerji et al.(1983)Cell 33729-740]，神经元特异性启动子，如神经丝启动子[Byrne et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473-5477]，胰腺特异性启动子[Edlunch et al.(1985)Science 230:912-916]或乳腺特异性启动子，如乳清启动子(U.S.Pat.No.4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。适用于本发明的诱导型启动子包括例如四环素诱导型启动子(Srour,M.A.,et al.,2003.Thromb.Haemost.90:398-405)。
在一个实施方式中，短语“多核苷酸”是指分离的并且以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列(如，以上的组合)的形式提供的单链或双链核酸序列。
在一个实施方式中，“互补多核苷酸序列”是指使用逆转录酶或任何其他RNA依赖性DNA聚合酶由信使RNA逆转录产生的序列。在一个实施方式中，该序列可以随后使用DNA聚合酶在体内或体外扩增。
在一个实施方式中，“基因组多核苷酸序列”是指从染色体衍生(分离)的序列，因此其代表染色体的连续部分。
在一个实施方式中，“复合多核苷酸序列”是指至少部分互补并且至少部分基因组的序列。在一个实施方式中，复合序列可以包括编码本发明多肽所需的一些外显子序列，以及一些在其间插入的内含子序列。在一个实施方式中，内含子序列可以是任何来源的，包括其他基因的，并且通常将包括保守的剪接信号序列。在一个实施方式中，内含子序列包括顺式作用表达调节元件。
在一个实施方式中，本发明的多核苷酸进一步包含编码用于分泌本发明多肽的信号肽的信号序列。
在一个实施方式中，在表达和分泌之后，信号蛋白从前体蛋白中裂解，产生成熟蛋白。
在一些实施方式中，本发明的多核苷酸使用如实施例1中所述的PCR技术或本领域技术人员已知的任何其他方法或程序制备。在一些实施方式中，该程序涉及到两个不同的DNA序列的连接(参见，例如，“Current Protocols in Molecular Biology”,eds.Ausubelet al.,John Wiley&Sons,1992)。
在一个实施方式中，将本发明的多核苷酸插入表达载体(即核酸构建体)中以能够表达重组多肽。在一个实施方式中，本发明的表达载体包括使该载体适用于在原核生物中复制和整合的附加序列。在一个实施方式中，本发明的表达载体包括使该载体适合在真核生物中复制和整合的附加序列。在一个实施方式中，本发明的表达载体包括使该载体适合在原核生物和真核生物二者中复制和整合的穿梭载体。在一些实施方式中，克隆载体包括转录和翻译起始序列(如，启动子、增强子)以及转录和翻译终止子(如，聚腺苷酸化信号)。
在一个实施方式中，多种原核或真核细胞可用作宿主表达系统来表达本发明的多肽。在一些实施方式中，这些包括但不限于微生物，诸如用含有多肽编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用含有多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有多肽编码序列的重组质粒表达载体，如Ti质粒转化的植物细胞系统。
在一些实施方式中，使用非细菌表达系统(如，哺乳动物表达系统，诸如CHO细胞)来表达本发明的多肽。在一个实施方式中，用于在哺乳动物细胞中表达本发明的多核苷酸的表达载体是包含CMV启动子和新霉素抗性基因的pCI-DHFR载体。在实施例1中根据一个实施方式描述了pCI-dhfr载体的构建。
在一些实施方式中，在本发明的细菌系统中，可以有利地根据所表达多肽的预期用途选择多种表达载体。在一个实施方式中，需要大量的多肽。在一个实施方式中，需要指导高水平蛋白产物的表达——可能作为与疏水信号序列的融合——的载体，所述疏水信号序列将表达的产物引导到细菌的周质或容易纯化蛋白产物的培养基中。在一个实施方式中，某些融合蛋白工程化具有特定的切割位点以帮助回收多肽。在一个实施方式中，适用于这种操作的载体包括但不限于大肠杆菌表达载体的pET系列[Studier et al.,Methods inEnzymol.185:60-89(1990)]。
在一个实施方式中，使用酵母表达系统。在一个实施方式中，如美国专利号5,932,447中公开的，许多含有组成型或诱导型启动子的载体可用于酵母中。在另一实施方式中，使用促进外源DNA序列整合到酵母染色体中的载体。
在一个实施方式中，本发明的表达载体可以进一步包括额外的多核苷酸序列，其允许例如从单个mRNA翻译几种蛋白，例如内部核糖体进入位点(IRES)和用于启动子-嵌合多肽的基因组整合的序列。
在一些实施方式中，哺乳动物表达载体包括但不限于，pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81，这些可由Invitrogen获得；pCI，其可由Promega获得；pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV，这些可由Strategene获得；pTRES，其可由Clontech获得；以及它们的衍生物。
在一些实施方式中，本发明使用含有来自真核病毒例如逆转录病毒的调节元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。在一些实施方式中，衍生自牛乳头瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，和衍生自EB病毒的载体包括pHEBO和p2O5。其他示例性载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE和允许在SV-40早期启动子、SV-40后期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠类乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其他在真核细胞中显示有效表达的启动子的指导下表达蛋白的任何其他载体。
在一些实施方式中，重组病毒载体可用于体内表达本发明的多肽，因为它们提供诸如侧向感染(lateral infection)和靶向特异性等优点。在一个实施方式中，侧向感染是例如逆转录病毒的生命周期中固有的并且是单个受感染细胞产生许多子代病毒粒子的过程，这些子代病毒粒子出芽并感染邻近细胞。在一个实施方式中，结果是大面积被迅速感染，其中大部分最初并未被原始病毒粒子感染。在一个实施方式中，产生无法横向扩散的病毒载体。在一个实施方式中，如果期望的目的是将特定基因引入仅局部数量的靶细胞，则该特性可能有用。
在一个实施方式中，可以使用多种方法将本发明的表达载体引入细胞。此类方法在Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Springs HarborLaboratory,New York(1989,1992)；Ausubel et al.,Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1989),Chang et al.,Somatic GeneTherapy,CRC Press,Ann Arbor,Mich.(1995),Vega et al.,Gene Targeting,CRC Press,Ann Arbor Mich.(1995),Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and TheirUses,Butterworths,Boston Mass.(1988)和Gilboa et at.[Biotechniques 4(6):504-512,1986]中进行描述，并且包括例如，稳定或瞬时转染、脂质转染、电穿孔和重组病毒载体感染。另外，参见，美国专利号5,464,764和5,487,992，用于阳性-阴性选择方法。
在一些实施方式中，通过病毒感染引入核酸比其他方法如脂质转染和电穿孔具有数个优点，这是因为由于病毒的传染性可以获得更高的转染效率。
在一个实施方式中，应当认识到，本发明的多肽也可以由使用上文描述的任何合适的施用模式(即，体内基因疗法)施用于个体的核酸构建体表达。在一个实施方式中，核酸构建体通过合适的基因递送载体/方法(转染、转导、同源重组等)和需要的表达系统被引入合适的细胞，然后修饰的细胞在培养基中扩增并返回个体(即，离体基因疗法)。
在一个实施方式中，使用植物表达载体。在一个实施方式中，多肽编码序列的表达由许多启动子驱动。在一些实施方式中，使用病毒启动子，诸如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子[Brisson et al.,Nature 310:511-514(1984)]，或TMV的包被蛋白启动子[Takamatsuet al.,EMBO J.6:307-311(1987)]。在另一实施方式中，使用植物启动子，诸如，例如，RUBISCO的小亚基[Coruzzi et al.,EMBO J.3:1671-1680(1984)；和Brogli et al.,Science 224:838-843(1984)]或热休克启动子，如，大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B[Gurleyet al.,Mol.Cell.Biol.6:559-565(1986)]。在一个实施方式中，使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接NA转化、显微注射、电穿孔和技术人员熟知的其他技术将构建体引入植物细胞中。参见，例如，Weissbach&Weissbach[Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,NY,Section VIII,pp 421-463(1988)]。本发明也可以使用本领域公知的其他表达系统，例如昆虫和哺乳动物宿主细胞系统。
应当认识到，除了包含插入的编码序列(编码多肽)的转录和翻译所必需的元件之外，本发明的表达构建体还可以包括工程化以优化表达的多肽的稳定性、生产、纯化、产量或活性的序列。
在一些实施方式中，可以采用多种方法将本发明的表达载体引入宿主细胞系统中。在一些实施方式中，这类方法通常在以下文献中进行描述：Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory,New York(1989,1992),in Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley and Sons,Baltimore,Md.(1989),Chang et al.,Somatic Gene Therapy,CRCPress,Ann Arbor,Mich.(1995),Vega et al.,Gene Targeting,CRC Press,Ann ArborMich.(1995),Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses,Butterworths,Boston Mass.(1988)和Gilboa et at.[Biotechniques 4(6):504-512,1986]，并且包括，例如，稳定或瞬时转染、脂质转染、电穿孔和重组病毒载体感染。另外，参见，美国专利号5,464,764和5,487,992，用于阳性-阴性选择方法。
在一些实施方式中，转化细胞在有效条件下培养，其允许大量重组多肽的表达。在一些实施方式中，有效培养条件包括但不限于允许蛋白生产的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。在一个实施方式中，有效培养基是指其中培养细胞以产生本发明的重组多肽的任何培养基。在一些实施方式中，培养基通常包括具有可同化碳源、氮源和磷酸盐源以及适当的盐类、矿物质、金属和其他营养素(例如维生素)的水溶液。在一些实施方式中，本发明的细胞可以在常规发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定板和培养皿中培养。在一些实施方式中，在适合重组细胞的温度、pH和氧含量下进行培养。在一些实施方式中，培养条件在本领域普通技术人员的专业知识范围内。
在一些实施方式中，取决于用于生产的载体和宿主系统，本发明的所得多肽保留在重组细胞内、分泌到发酵培养基中、分泌到两个细胞膜之间的空间中，例如大肠杆菌中的周质空间；或保持在细胞或病毒膜的外表面上。
在一个实施方式中，在培养预定时间后，实现重组多肽的回收。
在一个实施方式中，本文使用的短语“回收重组多肽”是指收集含有多肽的整个发酵培养基并且不需要暗示额外的分离或纯化步骤。
在一个实施方式中，本发明的多肽使用多种标准蛋白纯化技术纯化，诸如但不限于亲和力色谱、离子交换色谱、过滤、电泳、疏水相互作用色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱、伴刀豆球蛋白A色谱、色谱聚焦和差异增溶。
在一个实施方式中，为了促进回收，可以将表达的编码序列工程化为编码本发明的多肽和融合的可切割部分。在一个实施方式中，融合蛋白可以经设计，使得可以通过亲和力色谱容易地分离多肽；例如，通过固定在对可切割部分特异的柱上。在一个实施方式中，切割位点工程化在多肽和可切割部分之间，并且通过用在该位点处特异性切割融合蛋白的适当的酶或试剂处理，多肽可以从色谱柱中释放出来[如，参见Booth et al.,Immunol.Lett.19:65-70(1988)；和Gardella et al.,J.Biol.Chem.265:15854-15859(1990)]。
在一个实施方式中，本发明的多肽以“基本纯”的形式被回收。
在一个实施方式中，短语“基本纯”是指允许在本文所述的应用中有效使用蛋白的纯度。
在一个实施方式中，本发明的多肽也可以使用体外表达系统合成。在一个实施方式中，体外合成方法是本领域众所周知的，并且该系统的部件是可商购的。
在一个实施方式中，“药物组合物”是指本文所述的一种或多种活性成分或长效ADH/KRED和/或KRED与其他化学组分诸如生理上合适的载体和赋形剂的制品。药物组合物的目的是促进将化合物施用于生物体。
在一个实施方式中，“活性成分”是指感兴趣的多肽序列——KRED和/或长效ADH/KRED，其负责如本文所述的生物效应。
在一个实施方式中，本发明提供了组合制品。在一个实施方式中，“组合制品”特别定义了“套件试剂盒(kit of parts)”，其含义是如上定义的组合配偶体可以独立给药或通过使用具有不同量组合配偶体的不同固定组合给药，即同时、并行、单独或顺序地。在一些实施方式中，套件试剂盒的套件然后可以，例如，同时或按时间顺序交错施用，即在不同的时间点并且对于套件试剂盒的任何套件具有相等或不同的时间间隔。在一些实施方式中，组合配偶体的总量的比例可以以组合制品施用。在一个实施方式中，组合制品可以变化，如，为了满足待治疗的患者亚群的需要或单个患者的需要，该不同的需要可能是由于特定疾病、疾病的严重性、年龄、性别或体重，如本领域技术人员可以容易地确定的。
在一个实施方式中，可互换使用的短语“生理上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不会对生物体造成显著刺激并且不会消除所施用化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。在这些短语下包括佐剂。在一个实施方式中，包括在药学上可接受的载体中的成分之一可以是例如聚乙二醇(PEG)——在有机和水性介质中具有广泛溶解度的生物相容性聚合物(Mutter et al.(1979)。
在一个实施方式中，“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分施用的惰性物质。在一个实施方式中，赋形剂包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖类和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
在最新版的“Remington’s Pharmaceutical Sciences,"Mack Publishing Co.,Easton,PA”中发现药物配制和施用的技术，其通过引用并入本文。
在一个实施方式中，例如，合适的施用途径包括口服、直肠、经粘膜、经鼻、肠或肠胃外递送，包括肌肉内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
在一个实施方式中，制品以局部而非全身方式施用，例如通过将制品直接注射到患者身体的特定区域。
本发明考虑了剂量范围的各种实施方式。在一个实施方式中，本发明多肽的剂量在0.05-800mg/天的范围内。在一个实施方式中，本发明多肽的剂量在0.05-10g/天的范围内。在一个实施方式中，本发明多肽的剂量在5-150g/天的范围内。在一个实施方式中，本发明多肽的剂量在1-30g/天的范围内。在一个实施方式中，本发明多肽的剂量在0.05-80mg/天的范围内。在另一实施方式中，剂量在0.05-50mg/天的范围内。在另一实施方式中，剂量在0.1-20mg/天的范围内。在另一实施方式中，剂量在0.1-10mg/天的范围内。在另一实施方式中，剂量在0.1-5mg/天的范围内。在另一实施方式中，剂量在0.5-5mg/天的范围内。在另一实施方式中，剂量在0.5-50mg/天的范围内。在另一实施方式中，剂量在5-80mg/天的范围内。在另一实施方式中，剂量在35-65mg/天的范围内。在另一实施方式中，剂量在35-65mg/天的范围内。在另一实施方式中，剂量在20-60mg/天的范围内。在另一实施方式中，剂量在40-60mg/天的范围内。在另一实施方式中，剂量在45-60mg/天的范围内。在另一实施方式中，剂量在40-60mg/天的范围内。在另一实施方式中，剂量在60-120mg/天的范围内。在另一实施方式中，剂量在120-240mg/天的范围内。在另一实施方式中，剂量在40-60mg/天的范围内。在另一实施方式中，剂量在240-400mg/天的范围内。在另一实施方式中，剂量在45-60mg/天的范围内。在另一实施方式中，剂量在15-25mg/天的范围内。在另一实施方式中，剂量在5-10mg/天的范围内。在另一实施方式中，剂量在55-65mg/天的范围内。
在一个实施方式中，剂量是20mg/天。在另一实施方式中，剂量是30mg/天。在另一实施方式中，剂量是40mg/天。在另一实施方式中，剂量是50mg/天。在另一实施方式中，剂量是60mg/天。在另一实施方式中，剂量是70mg/天。在另一实施方式中，剂量是80mg/天。在另一实施方式中，剂量是90mg/天。在另一实施方式中，剂量是100mg/天。
在一个实施方式中，口服施用包括单位剂型，其包括片剂、胶囊、锭剂、咀嚼片、悬浮剂、乳剂等。此类单位剂型包含安全且有效量的期望的一种或多种化合物，其中每种在一个实施方式中为约1或10mg至约50mg/70kg，或在另一实施方式中为约1或10mg至约10g/70kg。此类单位剂型包含安全且有效量的期望的一种或多种化合物，其中每种在一个实施方式中为约0.7或3.5mg至约280mg/70kg，或在另一实施方式中为约0.5或10mg至约210mg/70kg。适用于制备用于经口施用的单位剂型的药学上可接受的载体是本领域公知的。在一些实施方式中，片剂通常包含常规药学上相容的佐剂作为惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、甘露醇、乳糖和纤维素；粘合剂诸如淀粉、明胶和蔗糖；崩解剂诸如淀粉、藻酸和交联羧甲基纤维素；润滑剂诸如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石。在一个实施方式中，诸如二氧化硅的助流剂可用于改善粉末混合物的流动特性。在一个实施方式中，可添加着色剂，例如FD&C染料以改善外观。甜味剂和调味剂，例如阿斯巴甜、糖精、薄荷醇、薄荷和水果香料，是咀嚼片的有用佐剂。胶囊通常包含一种或多种以上公开的固体稀释剂。在一些实施方式中，载体组分的选择取决于次要考虑因素，例如味道、成本和货架稳定性，这些对于本发明的目的而言并不重要，并且本领域技术人员可以容易地做出。
在一个实施方式中，口服剂型包含预定义的释放曲线。在一个实施方式中，本发明的口服剂型包括延长释放片剂、胶囊、锭剂或咀嚼片。在一个实施方式中，本发明的口服剂型包括缓释片剂、胶囊、锭剂或咀嚼片。在一个实施方式中，本发明的口服剂型包括速释片剂、胶囊、锭剂或咀嚼片。在一个实施方式中，根据本领域技术人员已知的药物活性成分的所需释放曲线配制口服剂型。
在一些实施方式中，口服组合物包括液体溶液、乳液、悬浮液等。在一些实施方式中，适用于制备此类组合物的药学上可接受的载体是本领域公知的。在一些实施方式中，液体口服组合物包含约0.012％至约0.933％的所需一种或多种化合物，或在另一实施方式中，约0.033％至约0.7％。
在一些实施方式中，用于本发明方法的组合物包括溶液或乳液，在一些实施方式中，其是水溶液或乳液，其包含安全且有效量的本发明化合物和任选的旨在用于局部鼻内施用的其他化合物。在一些实施方式中，组合物包含约0.01％至约10.0％w/v的主题化合物，更优选约0.1％至约2.0，其用于通过鼻内途径全身递送化合物。
在另一实施方式中，药物组合物通过液体制品的静脉内、动脉内或肌肉内注射施用。在一些实施方式中，液体制剂包括溶液、悬浮液、分散液、乳液、油等。在一个实施方式中，药物组合物通过静脉施用，并因此以适合静脉施用的形式配制。在另一实施方式中，药物组合物通过动脉内施用，并因此以适合动脉内施用的形式配制。在另一实施方式中，药物组合物通过肌肉内施用，并因此以适合于肌肉内施用的形式配制。
此外，在另一实施方式中，药物组合物被局部施用至体表，并因此以适合局部施用的形式配制。合适的局部制剂包括凝胶、软膏、乳膏、洗剂、滴剂等。对于局部施用，本发明的化合物与另外的合适的一种或多种治疗剂组合，制备并作为在生理学上可接受的稀释剂中的溶液、悬浮液或乳剂施用，其含或不含药物载体。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物通过本领域众所周知的方法制造，例如通过常规混合、溶解、制粒、糖衣丸制造、研磨、乳化、包封、包埋或冻干过程。
在一个实施方式中，根据本发明使用的药物组合物使用一种或多种生理上可接受的载体以常规方式配制，所述生理上可接受的载体包括赋形剂和助剂，其促进将活性成分加工为可以药学上使用的制品。在一个实施方式中，制剂取决于所选择的施用途径。
在一个实施方式中，本发明的注射剂在水溶液中配制。在一个实施方式中，本发明的注射剂在生理上相容的缓冲剂中配制，例如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐缓冲剂。在一些实施方式中，对于经粘膜施用，制剂中使用了适合于待被渗透的屏障的渗透剂。这种渗透剂是本领域公知的。
在一个实施方式中，本文所述的制品被配制用于肠胃外施用，例如通过弹丸注射或连续输注。在一些实施方式中，用于注射的制剂以单位剂型呈现，如在安瓿或多剂量容器中，其具有任选添加的防腐剂。在一些实施方式中，组合物是在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液，并含有配方剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
在一些实施方式中，组合物还包括防腐剂，诸如苯扎氯铵和硫柳汞等；螯合剂，诸如依地酸钠等；缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐；张力剂，如氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇等；抗氧化剂，诸如抗坏血酸、乙酰胱氨酸、焦亚硫酸钠等；芳香剂；粘度调节剂，诸如聚合物，包括纤维素及其衍生物；以及聚乙烯醇和酸与碱，以按需调节这些水性组合物的pH值。在一些实施方式中，组合物还包含局部麻醉剂或其他活性物质。组合物可用作喷雾剂、雾剂、滴剂等。
在一些实施方式中，用于肠胃外施用的药物组合物包括水溶性形式的活性制品的水溶液。此外，在一些实施方式中，活性成分的悬浮液被制备成合适的油性或水基注射悬浮液。在一些实施方式中，合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油诸如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。在一些实施方式中，水性注射悬浮液含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧基甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。在另一实施方式中，悬浮液还含有合适的稳定剂或增加活性成分的溶解度的试剂，以便制备高浓度溶液。
在另一实施方式中，活性化合物可以在囊泡中递送，特别是在脂质体中递送(参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)；Treat et al.,in Liposomes in the Therapyof Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein and Fidler(eds.),Liss,NewYork,pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein,同上，pp.317-327；一般见同上)。
在另一实施方式中，在控释系统中递送的药物组合物被配制用于静脉输注、植入式渗透泵、透皮贴剂、脂质体或其他施用方式。在一个实施方式中，使用泵(参见Langer,supra；Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987)；Buchwald et al.,Surgery 88:507(1980)；Saudek et al.,N.Engl.J.Med.321:574(1989))。在另一实施方式中，可以使用聚合物材料。在仍另一实施方式中，可以将控释系统放置在治疗靶标即脑附近，从而仅需要全身剂量的一部分(参见，如，Goodson,in Medical Applications of ControlledRelease，如上述，vol.2,pp.115-138(1984))。Langer的综述(Science 249:1527-1533(1990))讨论了其他控释系统。
在一些实施方式中，活性成分是粉末形式，在使用前用合适的载体如无菌、无热原的水基溶液构建。在一些实施方式中，组合物被配制用于雾化和吸入施用。在另一实施方式中，组合物包含在带有附接雾化装置的容器中。
在一个实施方式中，本发明的制品被配制成直肠组合物，诸如栓剂或保留灌肠剂，使用如常规栓剂基料，诸如可可脂或其他甘油酯。
在一些实施方式中，适用于本发明上下文的药物组合物包括其中活性成分以有效实现预期目的的量包含的组合物。在一些实施方式中，治疗有效量是指有效预防、减轻或缓解疾病症状或延长正治疗受试者存活的活性成分的量。
在一个实施方式中，治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。
该组合物还包含防腐剂，诸如苯扎氯铵和硫柳汞等；螯合剂，诸如依地酸钠等；缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐；张力剂，诸如氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇；抗氧化剂，诸如抗坏血酸、乙酰胱氨酸、焦亚硫酸钠等；芳香剂；粘度调节剂，诸如聚合物，包括纤维素及其衍生物；以及聚乙烯醇和酸与碱，以根据需要调节这些水性组合物的pH值。该组合物还包含局部麻醉剂或其他活性物质。该组合物可用作喷雾剂、雾剂、滴剂等。
可用作药学上可接受的载体或其组分的物质的一些实例是糖类，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧基甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可属的油；多元醇，例如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；藻酸；乳化剂，如TweenTM牌乳化剂；润湿剂，如十二烷基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐水；和磷酸盐缓冲溶液。与化合物联合使用的药学上可接受的载体的选择基本上由化合物的施用方式决定。在一个实施方式中，如果要注射主题化合物，药学上可接受的载体是无菌生理盐水，其具有血液相容的悬浮剂，其pH值已调至约7.4。
此外，组合物还包括粘合剂(如，金合欢、玉米淀粉、明胶、卡波姆、乙基纤维素、瓜尔胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮)、崩解剂(如，玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸、二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、瓜尔胶、淀粉乙醇酸钠)、各种pH值和离子强度的缓冲剂(如，Tris-HCl、醋酸盐、磷酸盐)、添加剂如白蛋白或明胶以防止表面吸附、清洁剂(如，Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆汁酸盐)、蛋白酶抑制剂、表面活性剂(如十二烷基硫酸钠)、渗透增强剂、增溶剂(如甘油、聚乙二醇)、抗氧化剂(如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠、丁基化羟基茴香醚)、稳定剂(如，羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、增粘剂(如，卡波姆、胶体二氧化硅、乙基纤维素、瓜尔胶)、甜味剂(如，阿斯巴甜、柠檬酸)、防腐剂(如硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)、润滑剂(如，硬脂酸、硬脂酸镁、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠)、助流剂(如，胶体二氧化硅)、增塑剂(如，邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯)、乳化剂(如，卡波姆、羟丙基纤维素、十二烷基硫酸钠)、聚合物包被(如泊洛沙姆或泊洛沙胺)、包衣和成膜剂(如乙基纤维素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯)和/或佐剂。
糖浆、酏剂、乳剂和悬浮液的载体的典型组分包括乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、液体蔗糖、山梨糖醇和水。对于悬浮液，典型的悬浮剂包括甲基纤维素、羧基甲基纤维素钠、纤维素(如，AvicelTM，RC-591)、黄蓍胶和藻酸钠；典型的润湿剂包括卵磷脂和聚环氧乙烷脱水山梨糖醇(如聚山梨醇酯80)。典型的防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯和苯甲酸钠。在另一实施方式中，经口液体组合物还包含一种或多种组分，诸如上文公开的甜味剂、调味剂和着色剂。
组合物还包括将活性材料并入聚合化合物如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝胶等的颗粒制品中或颗粒制品上，或并入脂质体、微乳液、胶束、单层或多层囊泡、红细胞影或原生质球上。此类组合物将影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放速率和体内清除率。
本发明还包括用聚合物(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)包被的颗粒组合物和与针对组织特异性受体、配体或抗原的抗体偶联或与组织特异性受体的配体偶联的化合物。
在一些实施方式中，化合物通过水溶性聚合物例如聚乙二醇、聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物、羧基甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸的共价附接进行修饰。在另一实施方式中，静脉注射后，修饰的化合物在血液中的半衰期明显长于相应的未修饰的化合物。在一个实施方式中，修饰还增加了化合物在水溶液中的溶解度，消除了聚集，增强了化合物的物理和化学稳定性，并大大降低了化合物的免疫原性和反应性。在另一实施方式中，所需的体内生物活性是通过与未修饰的化合物相比较不频繁地或以更低的剂量施用此类聚合物-化合物外展物(abduct)来实现的。
在一些实施方式中，可根据体外测定初始估计有效量或剂量的制品。在一个实施方式中，可以在动物模型中配置剂量，并且这些信息可用于更准确地确定人体中的有用剂量。
在一个实施方式中，本文描述的活性成分的毒性和治疗功效可以通过体外、细胞培养或实验动物的标准制药程序来确定。在一个实施方式中，从这些体外和细胞培养测定以及动物研究中获得的数据可用于配制人中使用的剂量范围。在一个实施方式中，剂量根据所采用的剂型和利用的施用途径而改变。在一个实施方式中，确切的制剂、施用途径和剂量可由个体医师根据患者的状况来选择。[参见，如，Fingl,et al.,(1975)"ThePharmacological Basis of Therapeutics",Ch.1p.1]。
在一个实施方式中，根据待治疗病症的严重性和反应性，给药可以是单次或多次施用，治疗过程持续数天至数周或直至实现治愈或达到疾病状态的减轻。
在一个实施方式中，当然，待施用的组合物的量将取决于所治疗的对象、病痛的严重程度、施用方式、处方医师的判断等。
在一个实施方式中，还制备包括配制在相容药物载体中的本发明制品的组合物，将其置于合适的容器中，并标记用于治疗指定病症。
在一个实施方式中，本发明的组合物存在于包装或分配器装置中，例如FDA批准的试剂盒，其包含一个或多个含有活性成分的单位剂型。在一个实施方式中，包装例如包含金属或塑料箔，诸如泡罩包装。在一个实施方式中，包装或分配器装置附有施用说明。在一个实施方式中，包装或分配器附有以监管药品制造、使用或销售的政府机构规定的形式与容器相关联的通知，该通知反映了该机构对组合物形式或人类或兽医施用的批准。在一个实施方式中，这样的通知是美国食品和药物管理局批准的处方药标签或批准的产品插页。
在一个实施方式中，应当理解，本发明的多肽可以与额外的活性剂一起提供给个体，以实现与单独使用每种试剂的治疗相比改善的治疗效果。在另一实施方式中，对与联合疗法相关联的不良副作用采取措施(例如，给药和选择补充剂)。
如本文所用，单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数形式，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一种治疗剂”包括提及一种以上的治疗剂。
除非特别说明或从上下文显而易见，如本文所用，术语“或”被理解为是包括性的。
术语“包括”在本文中用于表示短语“包括但不限于”，并且可以与短语“包括但不限于”互换使用。
如本文所用，术语“包含”、“含有”“具有”等可以具有美国专利法中赋予它们的含义并且可以表示“包括”等；“基本上由……组成”同样具有美国专利法中赋予的含义，并且该术语是开放式的，允许存在比所陈述内容更多的内容，只要所陈述的基本的或新颖的特征不因存在超过所陈述的内容而改变，但排除现有技术实施方式。在另一实施方式中，术语“包括”包含术语“由……组成”。
除非特别说明或从上下文显而易见，如本文所用，术语“约”被理解为在本领域的正常容差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约可以理解为在规定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％以内。除非上下文另有明确说明，否则本文提供的所有数值均由术语约修饰。
本发明的其他目的、优点和新颖特征在检查以下实施例后对本领域普通技术人员将变得显而易见，这些实施例并非旨在是限制性的。此外，如上文所述以及如所附权利要求部分所要求保护的本发明的各个实施方式和方面中的每一个在以下实施例中找到实验支持。
实施例
通常，本文使用的命名法和本发明使用的实验室程序包括分子、生化、微生物和重组DNA技术。这些技术在文献中有详尽的解释。参见，例如，"Molecular Cloning:Alaboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"Current Protocols in MolecularBiology"Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel et al.,"CurrentProtocols in Molecular Biology",John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"A Practical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson et al.,"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York；Birren et al.(eds)"Genome Analysis:A Laboratory Manual Series",Vols.1-4,ColdSpring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；methodologies as set forth inU.S.Pat.Nos.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659and 5,272,057；"CellBiology:A Laboratory Handbook",Volumes I-III Cellis,J.E.,ed.(1994)；"Cultureof Animal Cells-A Manual of Basic Technique"by Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),Third Edition；"Current Protocols in Immunology"Volumes I-III ColiganJ.E.,ed.(1994)；Stites et al.(eds),"Basic and Clinical Immunology"(8thEdition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),"Strategiesfor Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual"CSHLPress(1996)；所有这些都以引用方式并入。本文档中提供了其他一般参考资料。
材料和方法
研究设计-行为研究-活动箱
在第-3天，将小鼠置于活动箱中10分钟(min)以适应。2小时(h)后，所有小鼠都接受了0.25ml盐水的IP注射并开始了10分钟的适应。
在第-2天，小鼠IP接受0.25ml盐水，返回它们家笼，并在10分钟后，在活动箱中评估它们的自主活动(locomotor activity)30分钟。该个体基线测量用于与治疗后的行为进行比较。
在第1天，在活动箱中测试前20分钟用载体、ADH或注射用水(WFI)IV处理小鼠。测试前10分钟，小鼠IP接受0.5g/kg的EtOH或盐水。
一般活动箱(开放场地)程序：
30min测试；30min基线。计算每个个体小鼠的测试和基线之间的差异百分比。测量行进距离作为主要变量。
实施例1：EtOH剂量(0.05g/ml-0.2g/ml)对开放场地活动(活动箱)的影响
如图1所示，施用的酒精-EtOH的量与处理的小鼠的表现降低之间存在直接相关性。EtOH IP施用(10ml/kg溶液)后10分钟，测量30分钟的行进距离，并与单个小鼠基线进行比较。
实施例2：通过酒精脱氢酶(KRED)猝灭EtOH对开放场地活动(活动箱)的影响
图2进一步说明了在活动箱测试中30min行进的距离。具体地，EtOH(0.5g/kg)和ADH(10、100和500mg/kg)(周期1&2)的影响。在30分钟的试验期间测量在活动箱测试中行进的距离。使用的ADH：500mg/kg：KRED-P1-A04；100/10mg/kg：KRED-P1-A12。如图2清楚地说明，EtOH对活动的影响被KRED抑制和/或猝灭。
实施例3：如在开放场地活动(活动箱)中所测量的酒精脱氢酶(KRED)对EtOH施用 的猝灭作用和酒精脱氢酶(KRED)对稍后EtOH施用的阻止作用的持续时间。
表1，以下，概括了实验方案，其显示了本文描述的KRED抑制和/或猝灭对CNS的EtOH影响并且KRED可以阻止在消耗酒精之前EtOH施用时的破坏性影响。
表1
Figure BDA0003132404110000261
Figure BDA0003132404110000271
图3进一步说明了，本发明的KRED不仅拯救EtOH破坏性CNS影响，还具有对EtOH破坏性CNS影响的预防-保护作用。具体地，使用的ADH是KRED-P1-B05 ADH(I)和KRED-P1-B10(ADH II)。活动箱测试显示了行进的总距离(15min)。重要地是提醒，在图3中，值与清醒相关(对CNS较少影响)。
因此，根据本结果，0.5g/kg EtOH的剂量导致小鼠在活动箱中移动的距离(速度)的轻度但不剧烈的增加。1g/kg EtOH的剂量导致移动的显著增加。用于施用ADH的载体(培养基)本身完全没有影响。有趣的是，ADH以剂量依赖性方式相当大地降低了小鼠的移动，100mg/kg剂量呈现平台值。
在EtOH滥用之前/之后的ADH施用都导致测量距离的类似减少。
实施例4：EtOH拯救和横梁测试
横梁行走测试被设计用来评估EtOH施用后的运动协调缺陷。所用横梁为：1厘米扁木，长80厘米，离地1米。
至少30分钟的驯化。小鼠适应目标箱2分钟，然后放置在距目标箱10厘米的距离处，并允许穿过横梁到达目标箱。
在成功穿越横梁到目标箱后，小鼠被放置在30、50和80厘米的增加距离处，并训练穿过横梁两天。能够在60秒内穿过整个80厘米长度到达目标箱的小鼠被认为适合该研究。
基线测量：训练2天后，对小鼠进行测试以获得个体“基线值”。每只动物连续进行3次试验，直到它设法穿过整个横梁。记录在3次试验期间到达家笼所用的时间。
图4说明了在横梁上行进的距离与小鼠的乙醇消耗之间的负相关。图5说明了本发明的KRED，诸如KRED-P1-B10，拯救立即从横梁上掉下来的小鼠和/或替代地使小鼠在EtOH消耗(如50mg/kg ADH)后能够移动更远的距离。使用的ADH：
此外，所进行的实验还显示，ADH I(KRED-P1-B05)具有更高的保护活性，并且发现在施用EtOH之前和之后均能有效抑制EtOH影响(图6，柱值与清醒相关)。
实施例5：人体内研究：ADH对人血浆中EtOH浓度的影响的评估
在该研究中，3名志愿者在消耗EtOH 30分钟后测试了KRED-ADH的效果。消耗KRED的总量：在第一个实验中，向每280μl的血浆样品中加入10μl酶原液，并在约1分钟后，将10μl EtOH原液添加到血浆/酶溶液中。在第二个实验中，向每130μl的血浆样品中加入5μl酶原液，并在1分钟后，将5μl EtOH原液加入到血浆/酶溶液中。
使用Analox AM1 EtOH分析仪在30分钟时间点(EtOH消耗后)进行分析。
与对照处理组相比，使用中等和高ADH浓度在高EtOH溶液(2mg/ml)中观察到EtOH浓度显著降低(图7)。在中等EtOH溶液(1mg/ml)中观察到显著减少，但仅在使用高ADH浓度时才如此(图7)。针对对照参考，结合两种ADH浓度对最佳EtOH剂量进行了评估和测试。
此外，ADH对人血浆中EtOH浓度(3名志愿者在添加ADH后30分钟)的影响的评估揭示本发明的KRED在施用低EtOH施用(0.5mg/mL)后降低了血液EtOH水平。具体而言，记录到使用1mg/ml的ADH减少37％(图8)。
本发明的KRED在施用中等EtOH施用(1mg/mL)后也降低了血液EtOH水平。具体而言，记录到使用1mg/ml的ADH减少44％(图9)。
本发明的KRED在施用高EtOH施用(2mg/mL)后也降低了血液EtOH水平。具体而言，记录到使用2mg/ml的ADH减少42％(图10)。
实施例7：ADH对小鼠中不同剂量的急性EtOH中毒的影响的评估
在本研究中，高剂量EtOH的致死作用被猝灭拯救。具体地，如图11A-D所示，本发明的KRED拯救了在急性施用EtOH后急剧的生理恶化。体重不受ADH处理(混合P(50mg/kg的ADH)的影响。
所有EtOH处理的动物都表现出EtOH中毒的迹象，例如DMA(自主活动减少)、呼吸困难(呼吸急促)和共济失调(肌肉运动缺乏自主协调)。
在EtOH血液分析中，在7和7.5g/kg的两个较低EtOH剂量下，ADH治疗组表现出降低EtOH浓度的趋势。然而，在8和9g/kg的两个较高EtOH剂量下，ADH治疗组表现出较高的EtOH浓度。人ADH与血液中的内源性小鼠因子之间的相互作用可以解释这种现象。
传统观点认为酒精代谢是由肝脏中的ADH1进行的。然而，有人提出另一种途径在酒精代谢中起重要作用，特别是当血液乙醇水平高或长期饮酒时。
在小鼠中，一般来说，肝脏ADH活性的变化取决于剂量和时间二者。
然而，I类ADH(ADH1)含量的变化仅取决于剂量，而III类ADH(ADH3)含量的变化取决于剂量和时间二者。
序列表
<110> T.巴尔
<120> 用于生物降解酒精的组合物和方法
<130> TBR-P-004-PCT
<150> US 62/750,862
<151> 2018-10-26
<150> US 62/758,722
<151> 2018-11-12
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 283
<212> PRT
<213> 粟酒裂殖酵母
<220>
<221> 肽
<222> (1)..(283)
<400> 1
Met Ala Lys Asn Phe Ser Asn Val Glu Tyr Pro Ala Pro Pro Pro Ala
1 5 10 15
His Thr Lys Asn Glu Ser Leu Gln Val Leu Asp Leu Phe Lys Leu Asn
20 25 30
Gly Lys Val Ala Ser Ile Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ile Gly Tyr Ala
35 40 45
Leu Ala Glu Ala Phe Ala Gln Val Gly Ala Asp Val Ala Ile Trp Tyr
50 55 60
Asn Ser His Asp Ala Thr Gly Lys Ala Glu Ala Leu Ala Lys Lys Tyr
65 70 75 80
Gly Val Lys Val Lys Ala Tyr Lys Ala Asn Val Ser Ser Ser Asp Ala
85 90 95
Val Lys Gln Thr Ile Glu Gln Gln Ile Lys Asp Phe Gly His Leu Asp
100 105 110
Ile Val Val Ala Asn Ala Gly Ile Pro Trp Thr Lys Gly Ala Tyr Ile
115 120 125
Asp Gln Asp Asp Asp Lys His Phe Asp Gln Val Val Asp Val Asp Leu
130 135 140
Lys Gly Val Gly Tyr Val Ala Lys His Ala Gly Arg His Phe Arg Glu
145 150 155 160
Arg Phe Glu Lys Glu Gly Lys Lys Gly Ala Leu Val Phe Thr Ala Ser
165 170 175
Met Ser Gly His Ile Val Asn Val Pro Gln Phe Gln Ala Thr Tyr Asn
180 185 190
Ala Ala Lys Ala Gly Val Arg His Phe Ala Lys Ser Leu Ala Val Glu
195 200 205
Phe Ala Pro Phe Ala Arg Val Asn Ser Val Ser Pro Gly Tyr Ile Asn
210 215 220
Thr Glu Ile Ser Asp Phe Val Pro Gln Glu Thr Gln Asn Lys Trp Trp
225 230 235 240
Ser Leu Val Pro Leu Gly Arg Gly Gly Glu Thr Ala Glu Leu Val Gly
245 250 255
Ala Tyr Leu Phe Leu Ala Ser Asp Ala Gly Ser Tyr Ala Thr Gly Thr
260 265 270
Asp Ile Ile Val Asp Gly Gly Tyr Thr Leu Pro
275 280

Claims (60)

1.包括与至少一种长效分子结合的编码ADH/KRED的氨基酸序列的蛋白。
2.根据权利要求1所述的蛋白，其中所述至少一种长效分子结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的氨基末端。
3.根据权利要求1所述的蛋白，其中所述至少一种长效分子结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的羧基末端。
4.根据权利要求1所述的蛋白，其中所述至少一种长效分子结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的羧基末端和至少一种长效分子结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的氨基末端。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白，其中所述至少一种长效分子是至少两种长效分子。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白，其中所述至少一种长效分子是结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的羧基末端的至少两种长效分子和至少一种长效分子结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的氨基末端。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白，其中所述至少一种长效分子是结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的氨基末端的至少两种长效分子和至少一种长效分子结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的羧基末端。
8.药物组合物，其包括根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白和药学上可接受的载体。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其包括10mg至100g的所述蛋白。
10.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述组合物是可注射的药物组合物。
11.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述组合物是口服药物组合物。
12.根据权利要求8所述的药物组合物，其包括50mg至1g的所述蛋白。
13.降低有需要的受试者中的血液酒精的方法，其包括向所述受试者施用包括有效量的包括与至少一种长效分子结合的编码ADH/KRED的氨基酸序列的蛋白的组合物，从而降低有需要的受试者中的血液酒精。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述有效量是1至5000mg/kg(体重)。
15.根据权利要求13和14中任一项所述的方法，其中所述有效量是1至500mg/kg(体重)。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述有需要的受试者具有按血液体积计0.001％以上的血液EtOH浓度。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中所述降低血液酒精包括诱导酒精解毒。
18.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中所述降低血液酒精是减少与酒精消耗有关的风险。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其中所述至少一种长效分子结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的氨基末端。
20.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其中所述至少一种长效分子结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的羧基末端。
21.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其中所述至少一种长效分子是复合分子。
22.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其中所述至少一种长效分子结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的羧基末端和至少一种长效分子结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的氨基末端。
23.根据权利要求13至22中任一项所述的方法，其中所述至少一种长效分子是至少两种长效分子。
24.根据权利要求13至22中任一项所述的方法，其中所述至少一种长效分子是结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的羧基末端的至少两种长效分子和至少一种长效分子结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的氨基末端。
25.根据权利要求13至22中任一项所述的方法，其中所述至少一种长效分子是结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的氨基末端的至少两种长效分子和至少一种长效分子结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的羧基末端。
26.预防有需要的受试者中由酒精消耗引起的症状或风险的方法，其包括向所述受试者施用包括有效量的KRED-P1-A04、KRED-P1-A12、KRED-P1-B05、KRED-P1-B10或其任意组合的组合物，从而预防有需要的受试者中由酒精消耗引起的症状或风险。
27.根据权利10要求所述的方法，其中所述有需要的受试者是注定要消耗酒精的受试者。
28.根据权利要求10或12中任一项所述的方法，其中所述有需要的受试者是注定要在1至90分钟内消耗酒精的受试者。
29.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述有效量是1至5000mg/kg(体重)。
30.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述有效量是1至500mg/kg(体重)。
31.治疗患有酒精中毒的受试者的方法，其包括向所述受试者施用包括有效量的包括与至少一种长效分子结合的编码ADH/KRED的氨基酸序列的蛋白的组合物，从而治疗患有酒精中毒的受试者。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述施用是在酒精消耗之前、酒精消耗之后、或酒精消耗之前和之后二者的施用。
33.根据权利要求31或32中任一项所述的方法，其中之前、之后、或二者包括1至90分钟。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述有效量是1至5000mg/kg(体重)。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中所述有效量是1至500mg/kg(体重)。
36.根据权利要求31至35中任一项所述的方法，其中所述至少一种长效分子结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的氨基末端。
37.根据权利要求31至35中任一项所述的方法，其中所述至少一种长效分子结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的羧基末端。
38.根据权利要求31至35中任一项所述的方法，其中所述至少一种长效分子结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的羧基末端和至少一种长效分子结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的氨基末端。
39.根据权利要求31至38中任一项所述的方法，其中所述至少一种长效分子是至少两种长效分子。
40.根据权利要求31至38中任一项所述的方法，其中所述至少一种长效分子是结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的羧基末端的至少两种长效分子和至少一种长效分子结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的氨基末端。
41.根据权利要求31至38中任一项所述的方法，其中所述至少一种长效分子是结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的氨基末端的至少两种长效分子和至少一种长效分子结合至所述编码ADH/KRED的氨基酸序列的羧基末端。
42.药物组合物，其包括10mg至100g的KRED-P1-A04、KRED-P1-A12、KRED-P1-B05、KRED-P1-B10或其任意组合，以及药学上可接受的载体。
43.根据权利要求42所述的药物组合物，其中所述药物组合物是可注射的药物组合物。
44.根据权利要求42或43中任一项所述的药物组合物，其包括50mg至1g的KRED-P1-A04、KRED-P1-A12、KRED-P1-B05、KRED-P1-B10或其任意组合。
45.降低有需要的受试者中的血液酒精的方法，其包括向所述受试者施用包括有效量的KRED-P1-A04、KRED-P1-A12、KRED-P1-B05、KRED-P1-B10或其任意组合的组合物，从而降低有需要的受试者中的血液酒精。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述有效量是1至5000mg/kg(体重)。
47.根据权利要求45和46中任一项所述的方法，其中所述有效量是1至500mg/kg(体重)。
48.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，其中所述有需要的受试者具有按血液体积计0.001％以上的血液乙醇浓度。
49.根据权利要求45至48中任一项所述的方法，其中所述降低血液酒精是酒精解毒。
50.根据权利要求45至48中任一项所述的方法，其中所述降低血液酒精是减少与酒精消耗有关的风险。
51.预防有需要的受试者中由酒精消耗引起的症状或风险的方法，其包括向所述受试者施用包括有效量的KRED-P1-A04、KRED-P1-A12、KRED-P1-B05、KRED-P1-B10或其任意组合的组合物，从而预防有需要的受试者中由酒精消耗引起的症状或风险。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述有需要的受试者是注定要消耗酒精的受试者。
53.根据权利要求51和52中任一项所述的方法，其中所述有需要的受试者是注定要在1至90分钟内消耗酒精的受试者。
54.根据权利要求51至53中任一项所述的方法，其中所述有效量是1至5000mg/kg(体重)。
55.根据权利要求51至53中任一项所述的方法，其中所述有效量是1至500mg/kg(体重)。
56.治疗患有酒精中毒的受试者的方法，其包括向所述受试者施用包括有效量的KRED-P1-A04、KRED-P1-A12、KRED-P1-B05、KRED-P1-B10或其任意组合的组合物，从而治疗有酒精中毒的受试者。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述施用是在酒精消耗之前、酒精消耗之后、或酒精消耗之前和之后二者的施用。
58.根据权利要求56和57中任一项所述的方法，其中之前、之后、或二者包括1至90分钟。
59.根据权利要求56至58中任一项所述的方法，其中所述有效量是1至5000mg/kg(体重)。
60.根据权利要求56至59中任一项所述的方法，其中所述有效量是1至500mg/kg(体重)。
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