KR101197542B1 - 항-ｃｄ20 항체 및 이용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 림프종, 자가면역 질환 및 이식 거부 등의 CD20과 관련있는 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 조성물은 인간 CE20-발현성 세포의 표면에 위치한 인간 CD20 항원에 결합할 수 있는 항-CD20 항체를 포함하며, 상기 항체는 항체의 가변 영역내에서 조작된 하나 이상의 최적화된 CDR을 가짐으로써 달성되는 증가된 보체 의존적인 세포 매개 세포독성(CDC)을 갖는다. 또한, 조성물은 단일클론 항체의 항원-결합성 단편, 변이체 및 유도체와, 이들 항체 조성물을 생산하는 세포주 및 이들 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함한다. 또한, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 중에 본 발명의 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 약학 조성물과 이들 항-CD20 항체의 사용 방법을 포함한다.

Description

항-ＣＤ20 항체 및 이용 방법{ANTI-CD20 ANTIBODIES AND METHODS OF USE}
본 발명은 CD20에 결합가능한 항체, 상기 항체의 이용 방법, 및 상기 CD20-발현성 세포와 관련 있는 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
CD20 분자(또한, 인간 B 림프구-제한성 분화 항원 또는 Bp35라고도 함)는 프리-B 림프구와 성숙형 B 림프구 상에 위치하며, 약 35 kd의 분자량을 가진, 소수성의 막관통(transmembrane) 단백질이다(Valentine et al. (1989) J. Biol . Chem . 264(19):11282-11287; and Einfield et al. (1988) EMBO J. 7(3):311-717). CD20은 90% 이상의 말초 혈액의 B 세포나 림프 기관의 표면에서 발견되며, 초기 pre-B 세포가 발생하는 동안에 발현되어 혈장 세포가 분화될 때까지 유지된다. CD20은 정상적인 B 세포 뿐만 아니라 악성 B 세포에도 있다. 특히 CD20은 비-호지킨 림프종(MHL)의 B 세포들의 90% 이상에서 발현되지만(Anderson et al. (1984) Blood 63(6):1424-1433), 조혈 줄기세포, 프로-B 세포, 정상적인 혈장 세포 또는 그외 정상 조직들에서는 발견되지 않는다(Tedder et al. (1985) J. Immunol . 135(2):973-979).
CD20의 85개의 아미노산으로 이루어진 카르복시 말단 영역은 세포질내에 존재한다. 이러한 영역의 길이는, 각각 3, 3, 28, 15 및 16개의 아미노산으로 이루 어져 있어 세포질내 영역이 비교적 짧은, IgM, IgD, 및 IgG 중쇄나 조직적합성 항체 클래스 II 알파 또는 베타 쇄 등의 다른 B 세포 특이적인 표면 구조체들과는, 대조적이다(Komaromy et al. (1983) NAR 11:6775-6785). 말단의 64개의 카르복시 말단 아미노산들 중에서, 21개는 산성 잔기이고, 2개만 염기성 잔기인데, 이는, 이 영역이 강한 음전하를 띄고 있음을 의미한다. 유전자은행 등재번호는 NP_690605이다.
CD20은 B 세포의 활성화 및 분화 공정의 초기 단계(들)을 조절하는데 관여하며(Tedder et al. (1986) Eur . J. Immunol . 16:881-887), 칼슘 이온 채널로서 기능할 수 있는 것(Tedder et al. (1990) J. Cell . Biochem . 14D:195)으로 생각된다.
B 세포의 증식 및/또는 분화를 촉진시키는 CD20의 실제 기능에 대해서 불확실하지만, 암 및 자가면역 장애에 관여하는 B 세포를 통제하거나 사멸하기 위한 항체-매개 요법에 중요한 타겟으로 제공되고 있다. 특히, 종양 세포, 예컨대 NHL에서의 CD20의 발현은 치료제가 CD20-양성 종양성 세포를 특이적으로 표적화하는 항체-매개 요법에 중요한 타겟이 된다. 그러나, 지금까지 수득한 결과들은 CD20이 면역요법에 이용가능한 타겟이라는 것을 명백하게 나타내고 있지만, 또한 현재 이용가능한 뮤라인 항체 및 키메라 항체는 이상적인 치료제가 아닌 것으로 보인다.
발명의 개요
림프종, 자가면역 질환 및 이식 거부 반응 등의 CD20과 관련있는 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 조성물은 인간 CD20-발현 세포의 표면에 위치한 인간 CD20 항원에 결합할 수 있는 항-CD20 항체를 포함하며, 상기 항체는 리툭시맵(rituximap)에 비해 증가된 보체-의존적인 세포-매개 세포독성(CDC)을 가진다. 또한, 조성물은 단일클론 항체의 항원-결합성 단편, 변이체 및 유도체, 이들 항체 조성물을 생산하는 세포주, 및 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 분리된 핵산 분자를 포함한다. 또한, 본 발명은, 본 발명의 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체를 약학적으로 허용가능한 담체 중에 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
본원에 기술된 단일클론 항체는 CD20에 대해 강한 친화성을 가지며, 리툭시맵과 비교하여 향상된 CDC 기능을 가지는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 항체는 CD20을 발현하는 세포의 사멸을 매개한다. 본 발명은 인간 세포의 표면에서 발현되는 인간 CD20 항원에 특이적으로 결합할 수 있으며, 항-CD20 중쇄 및/또는 항-CD20 경쇄 부분에서 하나 이상의 최적화된 상보성 결정 영역(CDR)을 가지는 것을 특징으로 한다. 최적화된 CDR은 변형되었으며, 서열번호 1-8 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함한다. 특정한 항체 서열은 항-CD20 경쇄의 하나 이상의 CDR과 경쇄의 CDR3에 변화를 포함하는 것으로 설명된다. 본 발명의 조성물은 항-CD20 항체와, 하나 이상의 최적화된 CDR을 포함하는 항원-결합성 항체 단편, 변이체 및 유도체를 포함한다.
본 발명의 일 예에서, 치료 방법은 적합한 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 약학 조성물을 치료학적 유효량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. CD20-발현 세포와 관련있는 질병으로는 자가면역 질환, 암 및 장기와 조직의 이식 거부 반응을 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 치료 또는 예방할 수 있는 림프종으로는, 비-호지킨 림프종(고등급 림프종, 중등급의 림프종, 및 저등급의 림프종), 호지킨 질환, 급성 림프모구성 백혈병, 골수종, 만성 림프성 백혈병 및 골수모구성 백혈병을 포함한다.
본 발명의 방법을 이용하여 치료하는 것으로 고려되는 특정한 자가면역 질환으로는, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 류마티스 관절염, 크론 질환, 건선, 자가면역 혈소판 감소성 자반증, 다발성 경화증, 강직성 척추염, 근무력증 및 심상성 천포창을 포함한다. 또한, 상기 항체는, 자가면역 반응 억제에 의해 장기 및 조직의 거부 반응을 예방하고, B 림프종을 표적화해서 사멸시킴으로써 백혈병을 치료하고, 특이적인 방식으로 CD20-을 가진 세포에 독소를 전달하는데 사용할 수 있다.
발명의 상세한 설명
I. 정의
용어 "하나(a)" 또는 "하나(an)"의 물질은 하나 이상의 물질을 지칭하며, 예컨대 "항-CD20 항체"는 하나 이상의 항-CD20 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 이처럼, "하나(또는 "하나")", "하나 이상" 및 "하나 이상"은 본원에서 상호호환적으로 사용될 수 있다.
본원에서, 용어 "종양"은 악성 또는 양성인 모든 종양 세포의 생장 및 증식과 모든 전-암성 세포 및 조직을 지칭한다.
용어 "암" 및 "암성"은 규제받지 않은 세포 증식이 전형적인 특징인, 포유류에서의 생리 상태를 설명하는 것을 의미한다. 암의 예로는 림프종 및 백혈병이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본원에서, 용어 "폴리펩타이드"는 하나의 "폴리펩타이드" 뿐만 아니라 복수의 "폴리펩타이드"를 포괄하는 것으로 의도되며, 아미드 결합(또한, 펩타이드 결합이라고도 함)으로 선형 연결된 단량체(아미노산)로 구성된 분자를 의미한다. 용어 "폴리펩타이드"는 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 모든 체인 또는 체인들을 의미하며, 특정 길이의 산물을 의미하는 것은 아니다. 따라서, 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 올리고펩타이드, "단백질", "아미노산 체인" 또는 2개 이상의 아미노산으로 구성된 체인 또는 체인을 지칭하는데 사용되는 그외 용어들은, "폴리펩타이드"의 정의에 포함되며, 용어 "폴리펩타이드"는 이러한 모든 용어들 대신에 또는 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 또한, 용어 "폴리펩타이드"는 비제한적으로 당화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해성 절단 또는 비천연 아미노산에 의한 변형 등의 폴리펩타이드의 발현 후 수정된 산물을 의미한다. 폴리펩타이드는 재조합 기법에 의해 제조되거나 또는 천연 생물학적 소스로부터 유래될 수 있지만, 지정된 핵산 서열에서 반드시 번역되는 것으로 아니다. 화학 합성 등의 임의 방식으로 제조할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 약 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 500개 이상, 1000개 이상, 20000개 이상의 아미노산 크기일 수 있다. 폴리펩타이드는 반드시 그러한 구조를 가질 필요는 없지만, 정의된(defined) 3차 구조를 가질 수 있다. 정의된 3차 구조를 가진 폴리펩타이드는 접힌 것(folded)으로서 언급하며, 정의된 3차 구조를 가지진 않지만 여러가지 다수의 구조를 채택할 수 있는 폴리펩타이드는 접히지 않은 것(unfolded)으로 언급한다. 본원에서, 용어 당단백질은 아미노산 잔기, 예컨대 세린 잔기 또는 아스파라긴 잔기의 산소-함유성 측쇄 또는 질소-함유성 측쇄를 통해 단백질에 부착된 하나 이상의 탄수화물 모이어티에 커플링된 단백질을 의미한다.
"분리된" 폴리펩타이드, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체는 이의 본래 환경이 아닌 상태의 폴리펩타이드를 의미한다. 특별한 수준의 정제가 필요한 것은 아니다. 예컨대, 분리된 폴리펩타이드는 선천적인 환경 또는 천연 환경으로부터 이동될 수 있다. "숙주 세포에서 발현된 재조합으로 제조된 폴리펩타이드 및 단백질"은 모든 적합한 기법에 의해 부분적으로 또는 실질적으로 정제되거나, 분리되거나 또는 분획화된, 천연 또는 재조합 폴리펩타이드로서, 본 발명의 목적으로 정제된 것으로 간주된다.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드로서, 전술한 폴리펩타이드의 단편, 유도체, 유사체 또는 변이체 및 이의 조합을 포함한다. 본 발명의 항-CD20 항체들 또는 항체를 언급할 때, 용어 "단편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 해당 항체 또는 항체 폴리펩타이드의 항원-결합 특성의 적어도 일부분을 가지고 있는 임의 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드의 단편은, 본원에 기술된 특이적인 항체 단편 외에도 단백질분해성 단편 뿐만 아니라 절단 단편을 포함한다. 본 발명의 항-CD20 항체 및 항체 폴리펩타이드의 변이체는, 전술한 바와 같이 단편을 포함하며, 또한, 아미노산 치환, 결손 또는 삽입으로 인해 아미노산 서열이 변이된 폴리펩타이드도 포함한다. 변이체는 비-천연적으로 또는 천연적으로 형성될 수 있다. 비-천연 변이체는 당업계에 공지된 돌연변이 유발 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 변이체 폴리펩타이드는 보존적인 또는 비-보존적인 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 포함할 수 있다. 본 발명의 항-CD20 항체 및 항체 폴리펩타이드의 유도체는, 본 발명의 기준 항체 또는 항체 폴리펩타이드에서는 발견되지 않는 부가적인 특성을 나타내도록 변이된 폴리펩타이드이다. 예로는, 융합 단백질을 포함한다. 또한, 변이체 폴리펩타이드는 본원에서 "폴리펩타이드 유사체"라고 한다. 본원에서, 항-CD20 항체 또는 항체 폴리펩타이드의 "유도체"는 기능성 측쇄의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 잔기를 가지고 있는 대상 폴리펩타이드를 의미한다. 또한, "유도체"는 20개의 표준 아미노산 중 하나 이상의 천연 아미노산 유도체를 포함하는 펩타이드이다. 예컨대, 프롤린을 4-하이드록시프롤린으로 치환할 수 있으며, 라이신은 하이드록시라이신으로 치환할 수 있으며, 히스티딘은 3-메틸히스티딘으로 치환할 수 있으며, 세린은 호모세린으로 치환할 수 있으며, 라이신은 오르니틴으로 치환할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오타이드"는 하나의 핵산과 복수의 핵산을 포괄하는 것으로 의도되며, 분리된 핵산 분자 또는 구조체, 예컨대 메신저 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 통상적인 폴리다이에스테르 결합 또는 비-통상적인 결합(예, 펩타이드 핵산(PNA)에서 발현되는 것과 같은 아미드 결합)을 포함할 수 있다. "용어" 핵산은 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 세그먼트, 예컨대, DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다. "분리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드는, 이의 천연 환경으로부터 이동된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미한다. 예컨대, 벡터에 포함된 항-CD20 항체를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 목적으로 분리된 것으로 간주된다. 분리된 폴리뉴클레오타이드의 추가적인 예로는, 이종의 숙주 세포에 유지된 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 용액 형태의 정제된(부분 또는 실질적으로 정제된) 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 분리된 RNA 분자는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체를 포함한다. 본 발명에 따른 분리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 합성으로 제조한 이러한 분자를 또한 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 프로모터, 리보좀 결합 부위 또는 전사 종결자 등의 조절 요소를 포함하거나 또는 포함할 수 있다.
본원에서, "코딩 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈들로 이루어진 핵산 영역이다. "정지 코돈(TAG, TGA, 또는 TAA)"은 아미노산으로 번역되진 않지만 코딩 영역의 일부분으로 간주될 수 있지만, 모든 측면 존재 서열(flanking sequence) 예컨대 프로모터, 리보좀 결합 부위, 전사 종결자, 인트론 등은 코딩 서열의 일부분은 아니다. 본 발명의 2 이상의 코딩 영역들은 하나의 벡터 상에 하나의 폴리뉴클레오타이드 구조체로 또는 분리된(상이한) 벡터 상에 개별 폴리뉴클레오타이드 구조체로 존재할 수 있다. 또한, 모든 벡터는 하나의 코딩 영역을 포함할 수 있으며, 또는 2개 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있으며, 예컨대 단일 벡터는 면역글로불린 중쇄 가변 영역과 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 각각 분리된 상태로 코딩할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 항-CD20 항체, 또는 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 핵산에 융합되거나 융합되지 않은, 이종의 코딩 영역을 코딩할 수 있다. 이종의 코딩 영역은 분비 신호 펩타이드나 이종의 기능성 도메인과 같은 특수 요소나 모티브의 제한 없이 포함한다.
특정 예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 DNA이다. DNA의 경우, 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 정상적으로 하나 이상의 코딩 영역과 작동가능하게 조립된 전사 또는 번역 조절 요소 및/또는 프로모터를 포함할 수 있다. 작동가능한 조립은, 유전자 산물에 대한 코딩 영역이 유전자 산물의 발현을 조절 서열(들)의 조절 또는 영향 하에 있도록 하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 조립되는 경우이다. 만약 프로모터의 작용 유도로 원하는 유전자 산물을 코딩하는 mRNA의 전사가 이루어지고 2개의 DNA 단편 간에 연결 특성이 DNA 주형이 전사될 능력을 간섭하거나 또는 유전자 산물의 발견을 지시하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않는다면, 2개의 DNA 단편(예, 폴리펩타이드 코딩 영역 및 이와 조립된 프로모터)은 "작동가능하게 조합"된 것이다. 따라서, 프로모터가 핵산의 전사에 영향을 미칠 수 있다면 프로모터 영역은 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산과 작동가능하게 조립된 것일 것이다. 프로모터는 미리 결정된 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 지시하는 세포-특이 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외에도, 그외 전사 조절 인자, 예컨대 인핸서, 오퍼레이터, 억제자 및 전사 종결 신호가 폴리뉴클레오타이드와 작동가능하게 조립되어, 세포-특이적인 전사를 지시할 수 있다. 적합한 프로모터 및 그외 전사 조절 영역들은 본원에 기술되어 있다.
당업자들에게 다양한 전사 조절 영역들이 알려져 있다. 그러한 것으로는, 척추동물 세포에서 기능하는, 비제한적으로, 사이토메갈로바이러스(인트론-A와 동시에 즉시 초기 프로모터), 시미안 바이러스 40(초기 프로모터) 및 레트로바이러스(예, 로우스 사르코마 바이러스) 유래의 프로모터 및 인핸서 세그먼트 등의 전사 조절 영역을 포함한다. 그외 전사 조절 영역은 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 베타-글로빈 등의 척추동물 유전자 뿐만 아니라 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 그외 서열로부터 유래된 것을 포함한다. 추가적인 적합한 전사 조절 영역으로는 조직-특이적인 프로모터 및 인핸서와 림포카인-유발성 프로모터(예, 인터페론 또는 인터루킨에 의해 유도가능한 프로모터)를 포함한다.
마찬가지로, 당업자들에게는 다양한 번역 조절 인자가 알려져 있다. 그러한 것으로는, 리보좀 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈 및 피코르나바이러스 유래의 요소(특히 내부 리보좀 도입 부위, 즉 IRES(internal ribosomal entry site), 또한 CITE 서열이라고도 함)를 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
다른 예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 RNA 예컨대 메신저 RNA(mRNA) 형태의 RNA이다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 핵산 코딩 영역은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 폴리펩타이드의 분비를 지시하는, 분비 또는 신호 펩타이드를 코딩하는 추가적인 코딩 영역과 조립될 수 있다. 신호 가설에 있어, 포유류 세포에 의해 분비되는 단백질은 조면 소포체를 통과하여 성장하는 단백질 체인의 유출이 일단 개시되면, 성숙형 단백질로부터 절단되는 신호 펩타이드 또는 분비성 리드 서열을 가진다. 당업자들은, 척추동물 세포에 의해 분비되는 폴리펩타이드가 일반적으로 폴리펩타이드의 N-말단에 융합된 신호 펩타이드를 가지고 있으며, 이것은 완전한 또는 "전장"의 폴리펩타이드로부터 절단되어 폴리펩타이드의 분비형 또는 "성숙"형이 제조된다는 것을 인지하고 있다. 특정 예에서, 천연 신호 펩타이드, 예컨대, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩타이드가 사용되거나, 또는 이와 작동가능하게 조립된 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 능력을 보유한 서열의 기능적 유도체가 사용된다. 또한 다른 예로, 이종의 포유류 신호 펩타이드나 이의 기능적 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 리더 서열을 인간 조직 플라스미노겐 활성자(TPA) 또는 마우스 베타-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환할 수 있다.
본 발명은 임의의 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체에 관한 것이다. 천연 항체와 같은 전장 크기의 항체를 구체적으로 언급하고 있지 않은 한, 용어 "항-CD20 항체"는 전장 크기의 항체 뿐만 아니라 이러한 항체의 항원-결합성 단편, 변이체, 유사체 또는 유도체, 예컨대, 천연 항체나 면역글로불린 분자 또는 항체 분자와 유사한 방식으로 항원에 결합하는 조작된 항체 분자 또는 단편를 포괄하는 것이다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원에서 상호 호환적으로 사용된다. 항체나 면역글로불린은 중쇄의 가변 도메인 하나 이상을 포함하며, 정상적으로는 중쇄 및 경쇄의 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 척추 동물 시스템에서의 기본적인 면역글로불린의 구조는 비교적 잘 알려져 있다. 예컨대, Harlow et al. (1988) Antibodies : A Laboratory Manual(2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)를 참조한다.
아래에서 보다 상세하게 논의되는 내용에서와 같이, 용어 "면역글로불린"은 생화학적으로 구별할 수 있는 매우 다양한 폴리펩타이드 클래스를 포함한다. 당업자라면, 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론(γ, μ, α, δ, ε)으로 분류되며, 이들은 일부 서브클래스(예, γ1 - γ4)로 분류됨을 이해할 것이다. 이러한 체인의 특성은 항체의 "클래스"를 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE로 결정한다. 면역글로불린 서브클래스(이소타입), 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등은 그 특징이 잘 파악되어 있으며, 기능적인 특수성을 부여하는 것으로 알려져 있다. 이들 클래스와 이소타입 각각의 변형 버전은 본 발명의 내용에 비추어 당업자라면 쉽게 구별가능하며, 따라서 본 발명의 범위내에 포함된다. 모든 면역글로불린 클래스는 명백하게 본 발명의 범위내이지만, 아래의 논의들은 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 클래스에 관한 것일 것이다. IgG와 관련하여, 표준 면역글로불린 분자는 대략 23,000 달톤의 분자량을 가지는 2개의 상동한 경쇄 폴리펩타이드와 분자량이 53,000-70,000 달톤인 2개의 상동한 중쇄 폴리펩타이드를 포함하고 있다. 이러한 4개의 체인은 전형적으로 "Y" 형태로 이황화 결합에 의해 연결되어 있으며, 경쇄는 "Y"의 입구에서 시작해서 가변부까지 연결되는 중쇄에 묶여있다.
경쇄는 카파 또는 람다(κ, λ) 중 어느 하나로 분류된다. 각 중쇄 클래스는 카파 또는 람다 경쇄 중 어느 하나와 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄와 중쇄는 서로 공유 결합으로 결합되어 있으며, 2개의 중쇄의 "꼬리" 부분은 하이브리도마, B 세포 또는 유전자 조작된 숙주 세포에서 면역글로불린이 제조될 때 이황화 공유 결합이나 비-공유성 결합에 의해 서로 결합된다. 중쇄의 경우, 아미노산 서열은 Y 구조의 분기한 끝쪽이 N-말단인 부분에서 시작하여 각 체인의 아래의 C-말단까지 이어진다.
경쇄와 중쇄 모두 "불변 영역" 및 "가변 영역"이라고 하는 구조적 및 기능적 상동성인 영역으로 나뉘어진다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 부분 모두의 가변 도메인은 항원 인지 및 특이성을 결정하는 것으로 이해될 것이다. 반대로, 경쇄(CL) 및 중쇄(CH1, CH2, 또는 CH3)의 불변 도메인은 분비, 경태반 이동성, Fc 수용체 결합성, 보체 결합성 등과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. 학회에 따른, 불변 도메인의 번호 매김에서, 항원 결합 부위나 항체의 아미노-말단으로부터 점점 멀어질수록 번호는 증가한다. N-말단 부분은 가변 영역이고, C-말단 영역은 불변 영역이며, CH3 및 CL 도메인은 실제 각각 중쇄와 경쇄의 카르복시-말단을 포함한다.
전술한 바와 같이, 가변 영역은 항체가 항원상의 에피토프를 선택적으로 인지하여 특이적으로 결합가능하게 한다. 즉, 항체의, VL 도메인과 VH 도메인, 또는 이들 가변 도메인내 상보성 결정 영역(CDR)의 서브세트는, 연합하여 3차 구조의 항원 결합 부위를 정하는 가변 영역을 형성한다. 이러한 4차 항체 구조는 Y의 각 팔 끝에 존재하는 항원 결합 부위를 만든다. 보다 구체적으로는, 항체 결합 부위는 VH 및 VL 체인 각각의 3개의 CDR에 의해 정해진다. 일부 예에서, 예컨대 카멜리드(camelid) 종으로부터 유래되거나 또는 카멜리드 면역글로불린을 기초로 조작된, 특정 면역글로불린 분자, 완전한 면역글로불린 분자는 경쇄없이 중쇄로만 구성될 수 있다. 예컨대, Hamers-Casterman et al. (1993) Nature 363:446-448을 참조한다.
천연 항체에서, 각 항원 결합 도메인에 존재하는 6개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은, 특이적으로 위치를 잡아 항체가 수계 환경에서 이의 3차 구조를 취하여 항원 결합성 도메인을 형성하는, 짧은, 비-연속적인 아미노산 서열이다. 항원 결합 도메인에서 나머지 아미노산은 "프래임워크"라고 하는데, 분자간 가변성은 거의 없다. 프래임워크 영역은 대개 베타-시트 구조를 취하고 있으며, CDR은 베타-시트 구조와 연결되는 루프를 형성하며, 어떤 경우에는 베타-시트 구조의 일부분을 형성한다. 따라서, 프래임워크 영역은 체인간, 비-공유성 상호작용에 의해 정확한 방향으로 CDR이 자리잡도록 하는 스캐폴드를 형성하도록 작용한다. 자리잡은 CDR에 의해 형성된 항원 결합 도메인은 면역반응성 항원 상의 에피토프에 대한 표면 상보성을 규정한다. 이러한 상보성 표면은 이의 동계 에피토프(cognate epitope)에 대한 항체의 비-공유성 결합을 촉진시킨다. CDR과 프래임워크 영역을 각각 포함하는 아미노산은, 정확하게 규명되어 있으므로, 당업자라면 모든 해당 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 쉽게 식별할 수 있다("Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat et al. (1983) U.S. Department of Health and Human Services; and Chothia and Lesk(1987) J. Mol . Biol., 196:901-917을 참조하며, 이는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
당업계에서 사용되거나 및/또는 허용되는 용어에 대한 2 이상의 정의가 존재하는 경우, 본원에서 사용된 용어의 정의는 정반대로 예시되어 있지 않은 한 이러한 의미를 모두 포함하는 것으로 의도된다. 구체적인 예는, 용어 "상보성 결정 영역"("CDR")이 중쇄 및 경쇄의 폴리펩타이드의 가변 영역내에서 발견되는 비-연속적인 항원 결합 부위를 설명하는 것으로 사용한 경우이다. 이러한 구체적인 영역은 Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" 및 Chothia and Lesk(1987) J. Mol . Biol. 196:901-917에 의해 언급되었으며, 원용에 의해 본 명세서에 포함되는데, 여기에서 정의는 서로 비교하였을 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 서브세트를 포함한다. 그렇지만, 항체의 CDR 또는 그의 변이체를 언급하는 2가지 정의 중 어느 하나의 정의의 적용은, 본원에서 정의되고 사용된 용어의 범위내에 속하는 것으로 의도된다. 전술한 참조문헌들 각각에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 포괄하는 적절한 아미노산 잔기는 비교로서 하기 표 1에 나타내었다. 특정 CDR을 망라하는 실제 잔기의 수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당업자라면, 주어진 항체의 가변 영역 아미노산 서열로, 어느 잔기가 특정 CDR을 포함하는지를 통상적으로 결정할 수 있을 것이다.
표 1. CDR 규정1
Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1표 1의 모든 CDR 규정에서 번호는 Kabat et al.(하기 참조)에 따라 매겼다.
또한, Kabat 등은 모든 항체에 적용가능한 가변 도메인 서열에 대한 번호 매김 시스템을 정하였다. 당업자는 이러한 "Kabat 넘버링" 시스템을 서열 자체 이외의 어떠한 실험 데이타에 의존하지 않고도 모든 가변 도메인 서열에 명확하게 할당할 수 있다. 본원에서, "Kabat 넘버링"은 Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest."에서 기술된 번호 매김 시스템을 의미한다. 구체적으로 언급되어 있지 않은 한, 본 발명의 항-CD20 항체 또는 항체-결합 단편, 변이체 또는 유도체에서의 특정 아미노산 잔기 위치의 번호에 대한 언급은 Kabat 넘버링 시스템에 따른다.
카멜리드 종에서, VHH로 지칭되는 중쇄 가변 영역이 전체 항체-결합 도메인을 형성한다. 카멜리드 VHH 가변 영역과 통상적인 항체(VH)로부터 유래된 가변 영역들 간의 주된 차이는, (a) VHH에서 대응되는 부분과 비교하여 VH의 경쇄 접촉 표면에 더욱 소수성인 아미노산을 포함하고 있으며, (b) VHH에서 CDR3가 더 길고, 및 (c) VHH에서 CDR1 및 CDR3 간의 이황화 결합이 더 높은 빈도로 이루어진다는 것이다.
본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유사체는, 다클론 항체, 단일클론 항체, 다중특이 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 영장류화 항체 또는 키메라 항체, 단쇄 항체, 에피토프-결합 단편, 예컨대, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fvs, 단쇄 Fvs(scFv), 단쇄 항체, 이황화 연결된 Fvs(sdFv), VL 또는 VH 도메인 중 어느 하나를 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에서 제조된 단편, 및 항-이디오타입(항-Id) 항체(예, 본원에 기술된 항-CD20 항체에 대한 항-Id 항체 포함)를 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. ScFv 분자는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 미국 특허 5,892,019에 언급되어 있다. 본 발명의 면역글로불린 또는 항체 분자는 면역글로불린 분자의 임의 타입(예, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2, 등) 또는 서브클래스일 수 있다.
단쇄 항체를 포함하여 항체 단편은, 가변 영역(들)을 단독으로 또한 다음의 영역이나 전체와 조합하여 포함할 수 있다: 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인. 또한, 가변 영역(들)과 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인과의 임의 조합을 포함하는 항원-결합 단편도 본 발명에 포함된다. 본원에 기술된 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 항체 또는 그의 면역특이적 단편은 조류 및 포유류 등의 모든 동물 기원으로부터 유래될 수 있다. 바람직하기로는, 항체는, 인간, 뮤라인, 원숭이, 토끼, 염소, 기니아 피그, 카멜, 라마, 말, 또는 닭 항체로부터 유래된다. 다른 예에서, 가변 영역은 기원내(예, 상어 유래) 콘드릭토이드(condricthoid)일 수 있다. 본원에서, "인간" 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 가지는 항체를 포함하며, 전술한 문헌과 예컨대 미국 특허 5,939,598 by Kucherlapati et al.에 개시된 바와 같이, 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는, 1종 이상의 인간 면역글로불린에 대한 형질전환 동물이나 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 분리한 항체를 포함한다.
본원에서, 용어 "중쇄 부분"은 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 중쇄 부분을 포함하는 폴리펩타이드는 CH1 도메인, 힌지(예, 상, 중 및/또는 하위 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 그의 변이체 또는 단편 중 하나 이상을 포함한다. 예컨대, 본 발명에 사용하기 위한 결합 폴리펩타이드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 체인; CH1 도메인, 힌지 도메인의 한 곳 이상의 부분 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 체인; CH1 도메인과 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 체인; CH1 도메인, 힌지 영역 중 하나 이상의 부분 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 체인, 또는 CH1 도메인, 힌지 영역 중 하나 이상의 부분, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 체인를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 체인을 포함한다. 아울러, 본 발명에 사용하기 위한 결합성 폴리펩타이드는 CH2 도메인 중 한 부분 이상(예, CH2 도메인의 전체나 일부)이 없을 수 있다. 전술한 바와 같이, 당업자라면, 이들 도메인(예, 중쇄 영역)이, 천연 면역글로불린 분자에서 아미노산 서열을 변경하도록 변형시킬 수 있다.
본원에 기술된 임의 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 있어서, 다량체 중 하나의 폴리펩타이드 체인의 중쇄 부분은 다량체의 제2 폴리펩타이드 체인의 중쇄 부분과 동일하다. 또는, 본 발명의 중쇄 부분-함유성 단량체들은 동일하지 않다. 예컨대, 각 단량체는 예컨대 2중 특이적 항체를 형성하는, 여러가지 타겟 결합 부위를 포함할 수 있다.
본 발명에 기술된 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 결합성 폴리펩타이드의 중쇄 부분은 상이한 면역 분자들로부터 유래될 수 있다. 예컨대, 폴리펩타이드의 중쇄 부분은 IgG1 분자로부터 유래된 CH1 도메인과 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 예로, 중쇄 부분은 일부는 IgG1 분자로부터, 일부는 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 예로, 중쇄 부분은 일부는 IgG1 분자로부터 일부는 IgG4 분자로부터 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.
본원에서, 용어 "경쇄 부분"은 면역글로불린 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하기로는, 경쇄 부분은 VL 또는 CL 도메인 중 하나 이상을 포함한다.
본원에 기술된 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 항원, 예컨대 인지하여 특이적으로 결합하는 타겟 폴리펩타이드(CD20)의 에피토프(들) 또는 일부분(들)이라는 측면으로 기술되거나 구체적으로 명시될 수 있다. 항체의 항원 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 타겟 폴리펩타이드의 부분은 "에피토프" 또는 "항원 결정기"이다. 타겟 폴리펩타이드는 하나의 에피토프를 포함할 수 있지만, 전형적으로는 2개 이상의 에피토프를 포함하며, 항원의 크기, 구조 및 타입에 따라 임의 갯수의 에피토프를 포함할 수 있다. 아울러, 타겟 폴리펩타이드 상의 "에피토프"는 비-폴리펩타이드 요소이거나 이를 포함할 수 있으며, 예컨대 에피토프는 탄수화물 측쇄를 포함할 수 있다.
항체의 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프의 최소 크기는 약 4 내지 5개의 아미노산인 것으로 생각된다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프는 바람직하기로는 적어도 7개, 더 바람직하기로는 적어도 9개, 가장 바람직하게는 적어도 약 15개 내지 약 30개의 아미노산을 포함한다. CDR은 이의 3차 구조에서 항원성 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인지할 수 있기 때문에, 에피토프를 포함하는 아미노산은 연속적일 필요가 없으며, 어떤 경우에는 동일한 펩타이드 체인 상에 있지 않을 수 있다. 본 발명에서, 본 발명의 항-CD20 항체에 의해 인지되는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프는, CD20의 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 더 바람직하기로는 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 또는 약 15개 내지 약 30개의 연속적이거나 또는 비연속적인 아미노산의 서열을 포함한다.
"특이적으로 결합한다"는 것은 일반적으로 항체가 그것의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하며, 결합은 항체 결합 도메인과 에피토프 간에 일부 상보성을 수반함을 의미한다. 이에 대한 정의에 따라, 항체는 무작위적이고 관련없는 에피토프에 결합하는 것 보다는 훨씬 용이하게 이의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합할 때, 에피토프에 "특이적으로 결합한다"라고 한다. 용어 "특이성"은 본원에서 특정 에피토프에 특정 항체가 결합하는 상대적인 친화성을 나타내는 것이다. 예컨대, 항체 "A"는 항체 "B" 보다 해당 에피토프에 대해 보다 높은 특이성을 가지는 것으로 판단할 수 있거나, 또는 항체 "A"는 관련있는 에피토프 "D" 보다 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합할 수 있다고 할 수 있다.
"선호적으로 결합한다"는, 항체가 관련있거나, 유사하거나, 동종이거나 또는 유사한 에피토프에 결합하는 것 보다 훨씬 용이하게 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 따라서, 해당 에피토프에 "선호적으로 결합하는" 항체는 이러한 항체가 관련있는 에피토프과 교차-반응할 수 있더라도, 관련 에피토프 보다 상기 에피토프에 결합할 가능성이 더 높을 것이다.
비제한적인 예로서, 항체의 해리 상수(KD)가 제2 에피토프의 항체 KD 보다 낮다면 제1 에피토프에 선호적으로 결합할 것으로 생각할 수 있다. 다른 비제한적인 예로, 항체가 제2 에피토프의 항체 KD 보다 적어도 1승 크기 미만의 친화성으로 제1 에피토프에 결합한다면, 항체는 제1 항원에 선호적으로 결합하는 것으로 생각할 수 있다. 다른 비제한적인 예로, 항체가 제2 에피토프의 항체 KD 보다 적어도 2승 크기 미만의 친화성으로 제1 에피토프에 결합한다면, 항체는 제1 항원에 선호적으로 결합하는 것으로 생각할 수 있다.
다른 비제한적인 예로, 항체가 제2 에피토프에 대한 항체 오프율(off rate, k(off)) 보다 낮은 오프율로 제1 에피토프와 결합한다면, 항체는 제1 에피토프와 선호적으로 결합하는 것으로 생각할 수 있다. 다른 비제한적인 예로, 항체가 제2 에피토프의 항체 k(off) 보다 적어도 1승 크기 미만의 친화성으로 제1 에피토프에 결합한다면, 항체는 제1 항원에 선호적으로 결합하는 것으로 생각할 수 있다. 다른 비제한적인 예로, 항체가 제2 에피토프의 항체 k(off) 보다 적어도 2승 크기 미만의 친화성으로 제1 에피토프에 결합한다면, 항체는 제1 항원에 선호적으로 결합하는 것으로 생각할 수 있다.
본원에 기술된 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 5 X 10-2 sec-1, 10-2 sec-1, 5 X l0-3 sec-1, 또는 l0-3 sec- 1으로 또는 그 보다 낮은 오프율(k(off))로, 본원에 기술된 타겟 폴리펩타이드, 또는 그의 단편이나 변이체에 결합하다고 할 수 있다. 더 바람직하기로는, 본 발명의 항체는 5 X 10-4 sec-1, 10-4 sec-1, 5 X 10-5 sec-1, 10-5 sec-1, 5 X 10-6 sec-1, 10-6 sec-1, 5 X 10-7 sec-1, 또는 10-7 sec- 1으로 또는 그 보다 낮은 오프율(k(off))로, 본원에 기술된 타겟 폴리펩타이드, 또는 그의 단편이나 변이체에 결합하다고 할 수 있다.
본원에 기술된 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는, 103 M-1 sec-1, 5 X 103 M-1 sec-1, 104 M-1 sec-1, 또는 5 X 104 M-1 sec-1이나 그 보다 높은 온율(k(on))로 본원에 기술된 타겟 폴리펩타이드, 또는 그의 단편이나 변이체에 결합하다고 할 수 있다. 더 바람직하기로는, 본 발명의 항체는, 105 M-1 sec-1, 5 X 105 M-1 sec-1, 106 M-1 sec-1, 5 X 106 M-1 sec-1 또는 107 M-1 sec-1이나 그 보다 높은 온율(k(on))로 본원에 기술된 타겟 폴리펩타이드나 또는 그의 단편이나 변이체에 결합하다고 할 수 있다.
항체가, 기준(reference) 항체가 에피토프에 결합하는 것을 어느 정도로 차단하는 수준으로 상기 에피토프에 선호적으로 결합한다면, 항체는 주어진 에피토프에 대한 기준 항체의 결합을 경쟁적으로 저해한다고 한다. 경쟁적인 저해는 당업계에 공지된 모든 방법, 예컨대 경쟁적인 ELISA 분석으로 측정할 수 있다. 해당 에피토프에 대한 기준 항체의 결합을 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50%로 경쟁적으로 저해한다고 할 수 있다.
본원에서, 용어 "친화성"은 면역글로불린 분자의 CDR과 각 에피토프의 결합 세기의 측정치이다. 예컨대, Harlow et al. (1988) Antibodies : A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.) pages 27-28을 참조한다. 본원에서, 용어 "화합성(avidity)"은 면역글로불린 집단과 항원 간 복합체의 전체적인 안정성을 나타내는 것으로, 즉, 면역글로불린 혼합물의 항원과의 기능적 조합 세기를 의미한다. 예로, Harlow at pages 29-34를 참조한다. 화합성은 특이적인 에피토프를 가진 집단에서의 개별 면역글로불린 분자의 친화성과, 또한 면역글로불린과 항원의 결합가(valency) 모두와 관련있다. 예를 들면, 이가 단일클론 항체와 반복성이 높은 에피토프 구조를 가진 항원, 예컨대 폴리머 사이의 상호작용은 높은 화합성일 것이다.
본원의 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 그것의 교차-반응성 측면에서 기술되거나 또는 명시될 수 있다. 본원에서, 용어 "교차-반응성"은 하나의 항원에 특이적인 항체가 제2 항원과 반응하는 능력을 의미하며, 2종의 상이한 항원성 물질들 간의 관련성의 척도이다. 따라서, 항체가 이의 형성을 유도하는 것이 아닌 다른 에피토프에 결합한다면 항체는 교차 반응성인 것이다. 교차 반응성 에피토프는 일반적으로 유도성 에피토프와 동일한 상보적인 구조적 특징들 여러가지를 가지고 있으며, 어떤 경우에는 오리지날 보다 실제 더 잘 맞을 수 있다.
예컨대, 어떤 항체는 관련있지만 동일하지 않은 에피토프, 예컨대 기준 에피토프에 대해 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55%, 및 적어도 50% 이상의 동일성(당업계에 공지된 방법과 본원에 기술된 방법을 이용하여 계산함)을 가진 에피토프 에 결합하는, 약간의 교차-반응성을 가진다. 항체가 기준 에피토프에 대해 95% 미만, 90%% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만의 동일성을 가진 에피토프에 결합하지 않는다면, 항체는 교차-반응성이 거의 또는 전혀 없다고 할 수 있다. 항체가 특정 에피토프의 다른 모든 유사체, 동계체(ortholog) 또는 상동체에 결합하지 않는다면, 항체는 특정 에피토프에 "고특이적인" 것으로 간주될 수 있다.
본 발명의 항-CD20 항체나 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 그것의 결합 친화성 측면에서 기술되거나 또는 명시될 수 있다. 바람직한 결합 친화성은 해리 상수 또는 Kd가 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, 또는 10-15 M 이하인 것을 포함한다.
본 발명의 항-CD20 항체나 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 "다중 특이적", 예컨대 2중 특이적, 3중 특이적 또는 그 이상의 다중 특이적일 수 있으며, 이는 동시에 1종 이상의 상이한 항원(예, 단백질)에 존재하는 2종 이상의 상이한 에피토프를 인지하고 결합하는 것을 의미한다. 따라서, 항-CD20 항체가 "단일 특이적"이거나 또는 "다중 특이적", 예컨대 "2중 특이적"인지는, 결합 폴리펩타이드와 반응하는 상이한 에피토프의 수를 나타낸다. 다중 특이적인 항체는 본원에 기술된 타겟 폴리펩타이드의 여러가지 에피토프에 대해 특이적일 수 있으며, 또는 이는 타겟 폴리펩타이드 뿐만 아니라 이종의 폴리펩타이드나 또는 고형 지지체 물질 등의 이종의 에피토프에 대해 특이적일 수 있다.
본원에서, 용어 "결합가"는 항-CD20 항체, 결합성 폴리펩타이드 또는 항체에 존재하는 잠재적인 결합 도메인, 예컨대 항원 결합 도메인의 수를 나타낸다. 각 결합 도메인은 하나의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 항-CD20 항체, 결합성 폴리펩타이드 또는 항체가 하나 보다 많은 수의 도메인을 포함한다면, 각 결합 도메인이 2개의 결합 도메인을 가진 "2가 단일 특이적"인 항체의 경우에는 동일한 에피토프에, 또는 2개의 결합 도메인을 가진 "2가 이중 특이적"인 항체의 경우에는 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, 항체는 각 특이성에 대해 2중 특이적이며 2가일 수 있다("2중 특이적인 4가 항체"라 함). 다른 예에서, 4가 미니바디(minibody) 또는 도메인이 삭제된 항체를 만들 수 있다.
2중 특이적인 2가 항체, 이의 제조 방법은 예컨대 미국 특허 5,731,168; 5,807,706; 5,821,333; 및 미국 출원 공개번호 2003/020734와 2002/0155537에 설명되어 있으며, 이들 문헌 모두 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 2중 특이적인 4가 항체 및 이의 제조 방법은 예컨대 WO 02/096948과 WO 00/44788에 설명되어 있으며, 이들 문헌 모두 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 일반적으로, PCT 공개공보 WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt et al. (1991) J. Immunol . 147:60-69; 미국 특허 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; Kostelny et al. (1992) J. Immunol . 148:1547-1553을 참조한다.
전술한 바와 같이, 다양한 면역글로불린 클래스의 서브유닛 구조와 불변 영역의 3차 구조는 잘 알려져 있다. 본원에서, 용어 "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함하며, 용어 "CH1 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 첫번째 (아미노 말단 최말단) 불변 영역 도메인을 포함한다. CH1 도메인은 VH 도메인과 인접하여 있으며, 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 아미노 말단이다.
본원에서, 용어 "CH2 도메인"은 예컨대 통상적인 넘버링 방법을 이용하여 항체의 약 244번 잔기에서 360번 잔기까지의 중쇄 분자의 부분(잔기 244 - 360, Kabat numbering system; 및 잔기 231-340, EU numbering system; Kabat EA et al. op. cit.참조)을 포함한다. CH2 도메인은 다른 도메인과 밀접하게 관련되지 않은 독특한 도메인이다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 체인이 온전한 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인들 사이에 개입되어 있다. CH3 도메인이 CH2 도메인에서 IgG 분자의 C-말단까지 연장되고 약 108개의 잔기를 포함하는 것으로 잘 알려져 있다.
본원에서, 용어 "힌지 영역"은 CH1 도메인과 CH2 도메인을 연결하는 중쇄 분자의 일부분이다. 힌지 영역은 약 25개의 잔기를 포함하며, 가요성이므로, 따라서 2개의 N-말단 항원 결합 영역을 독립적으로 움직일 수 있도록 해 준다. 힌지 영역은 3가지 구별되는 도메인, 상위, 중위 및 하위 힌지 도메인으로 다시 나눌 수 있다(Roux et al. (1998) J. Immunol. 161:4083).
본원에서, 용어 "이황화 결합"은 2개의 황 원자 사이에 형성된 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 2번째 티올기와 연결하거나 또는 이황화 결합을 형성할 수 있는 티올기를 포함하고 있다. 대부분의 천연 IgG 분자들에서, CH1과 CL 영역들은 이황화 결합에 의현 연결되어 있으며, 2개의 중쇄는 Kabat numbering 시스템에 따르면 239 - 242에 대응되는 위치(226 또는 229번 위치, EU numbering system)에서 이황화 결합에 의해 연결되어 있다.
본원에서, 용어 "키메라 항체"는 면역반응성 영역이나 부위는 제1 종으로부터 수득 또는 유래되었고, 불변 영역(본 발명에 있어서 온전한, 부분적인 또는 변형될 수 있음)은 제2 종으로부터 수득된, 모든 항체를 의미한다. 바람직한 예에서, 타겟 결합 영역이나 부위는 인간을 제외한 소스(예, 마우스나 영장류)로부터 유래될 수 있으며, 불변 영역은 인간 유래이다.
본원에서, 용어 "조작된 항체"는, 중쇄, 경쇄 또는 이 둘다 중 어느 하나에 있는 가변 도메인이 공지된 특이성의 항체로부터 일정 부분 이상의 하나 이상의 CDR 치환에 의해, 필요에 따라서는 프래임워크 영역 일부분의 치환 및 서열 변동에 의해, 변이된, 항체를 의미한다. CDR은 프래임워크 영역이 유래된 항체와 동일한 클래스 또는 심지어는 서브클래스의 항체로부터 유래될 수 있음에도 불구하고, CDR은 상이한 클래스의 항체로부터, 바람직하게는 상이한 종으로부터 유래된 항체로부터 유래될 수 있다. 공지된 특이성의 인간 이외의 종에 대한 항체로부터 유래된 하나 이상의 "공여" CDR이 인간 중쇄 또는 경쇄의 프래임워크 영역에 그래프트된 조작된 항체는, 본원에서 "인간화 항체"라고 한다. 반드시, 모든 CDR을 공여 가변 도메인 유래의 완전한 CDR로 치환하여, 하나의 가변 도메인이 다른 것에 항원 결합하는 능력을 전달할 필요는 없을 수 있다. 오히려, 타겟 결합 부위의 활성을 유지하는데 필요한 잔기를 전달하는 것만 필요할 수 있다.
인간화 항체의 프래임워크 영역을 "전체 인간 프래임워크 영역"이라고 칭하는 경우에, 인간화 항체의, 경쇄, 중쇄 또는 이 둘다에서 가변 도메인내 프래임워크 영역은 인간 기원의 잔기만 포함할 수 있다는 것으로 이해된다. 또는, 공여 가변 도메인의 프래임워크 영역(들)의 하나 이상의 잔기는, 필요에 따라 CD20 항원에 대한 결합성을 강화하거나 또는 적절한 결합성을 유지하기 위해, 인간화 항체의 중쇄, 경쇄 또는 이 둘다의 가변 도메인의 인간 프래임워크 영역(들)의 해당 위치내에서 조작될 수 있다. 이러한 방식으로 조작된 인간 프래임워크 영역은 따라서 인간과 공여체의 프래임워크 잔기의 혼합을 포함할 것이며, 이를 본원에서는 "부분적인 인간 프래임워크 영역"이라고 한다. 이러한 설명은 예컨대, 미국 특허 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762, 및 6,180,370에 언급되어 있으며, 일반적인 실험을 수행하거나 또는 기능적으로 조작되거나 인간화된 항체를 수득하기 위한 시도 및 에러 테스트에 의해, 당업자의 능력내에서 자명할 것이다.
예컨대, 항-CD20 항체의 인간화는 윈터 및 동료에 의해 기술된 방법(Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536)으로, 설치류나 돌연변이 설치류의 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항-CD 20 항체의 대응되는 서열로 치환하여 필수적으로 수행할 수 있다. 예로, 미국 특허 5,225,539; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 5,859,205를 참조하며, 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 제조되는 인간화 항-CD20 항체는 인간화 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인의 전체 인간 프래임워크 영역내에 하나 이상의 설치류 또는 돌연변이 설치류의 CDR을 포함하게 될 것이다. 어떤 경우에는, 인간화 항-CD20 항체의 하나 이상의 가변 도메인의 프래임워크 영역내 잔기를 대응되는 비-인간계(예, 설치류) 잔기로 치환하며(예, 미국 특허 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 및 6,180,370), 이 경우, 제조되는 인간화 항-CD20 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인내에 부분적인 인간 프래임워크 영역을 포함할 수 있다.
아울러, 인간화 항체는 수여체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 수행성(예, 원하는 친화성을 얻기 위해)을 추가적으로 다듬는다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나 이상 및 전형적으로 2개의 가변 도메인 전체를 실질적으로 포함할 것이며, 전체 또는 실질적으로 전체 CDR은 비-인간 면역글로불린의 것에 대응되며, 전체 또는 실질적으로 전체 프래임워크 영역은 인간 면역글로불린 서열의 프래임워크 영역이다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)을 일정 부분 이상, 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변 영역(Fc)을 일정 부분 이상 포함할 것이다. 추가적인 내용은, Jones et al. (1986) Nature 331:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; 및 Presta(1992) Curr. Op . Struct . Biol . 2:593-596을 참조하며, 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 비-인간 종 유래의 대응 서열로 실질적으로 온전한 인간 가변 도메인이 안되게 치환된, 항체를 포함할 수 있다. 실제, 인간화 항체는 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 프래임워크 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터 유래된 잔기로 치환된, 전형적인 인간 항체이다. 예로, 미국 특허 5,225,539; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 5,859,205를 참조한다. 또한, 미국 특허 6,180,370 및 국제 공개번호 WO 01/27160을 참조하며, 여기에는 미리 결정된 항원에 대해 향상된 친화성을 가진 인간화 항체를 제조하기 위한 기법과 인간화 항체가 기술되어 있다.
본원에서, 용어 "적합하게 접힌 폴리펩타이드"는 폴리펩타이드를 포함하는 기능적 도메인 전체가 확실하게 활성인, 폴리펩타이드(예, 항-CD20 항체)를 포함한다. 본원에서, 용어 "부적합하게 접힌 폴리펩타이드"는 폴리펩타이드이 기능적 도메인들 중 하나 이상이 활성이 아닌 폴리펩타이드를 포함한다. 일 예로, 적합하게 접힌 폴리펩타이드는 하나 이상의 이황화 결합으로 연결된 폴리펩타이드 체인을 포함하며, 역으로 부적합하게 접힌 폴리펩타이드는 하나 이상의 이황화 결합으로 연결되지 않은 폴리펩타이드 체인을 포함한다.
본원에서, 용어 "조작된"은 합성 기법(예, 재조합 기법, 시험관내 펩타이드 합성, 효소적 또는 화학적 펩타이드 커플링 또는 이들 기법의 조합에 의한)에 의한, 핵산 또는 폴리펩타이드 분자의 조작을 포함한다.
본원에서, 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합"은 상호 호환적으로 사용된다. 이들 용어는 화학적 접합 또는 재조합 수단 등의 어떠한 수단에 의해 2 이상의 요소나 구성을 함께 연결하는 것을 의미한다. "프래임 내 융합(in-frame fusion)"은 오리지날 ORF의 정확한 번역 리딩 프래임을 유지하는 방식으로 연속적으로 보다 긴 ORF를 형성하는 2 이상의 폴리펩타이드 오픈 리딩 프래임(ORF)의 연결을 의미한다. 따라서, 재조합 융합 단백질은 (세그먼트가 정상적으로는 본래 연결되어 있지 않은) 오리지날 ORF에 의해 코딩되는 폴리펩타이드에 대응되는 2 이상의 세그먼트를 포함하는 단일 단백질이다. 따라서, 리딩 프래임은 융합된 세그먼트 전체에서 연속적으로 만들어지지만, 세그먼트는 예컨대 프래임 내 링커 서열에 의해 물리적으로 또는 구조적으로 분리될 수 있다. 예컨대, 면역글로불린 가변 영역의 CDR을 코딩하고 있는 폴리뉴클레오타이드는 프래임 내로 융합될 수 있지만, "융합된" CDR이 연속적인 폴리펩타이드의 일부분으로서 함께 번역되는 한, 하나 이상의 면역글로불린 프래임워크 영역 또는 추가적인 CDR 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 떨어져 있을 수 있다.
폴리펩타이드와 관련하여, "선형 서열" 또는 "서열"은 서열이 서로 이웃하는 잔기가 폴리펩타이드의 1차 구조로 연속되는, 아미노에서 카르복시 말단 방향의 폴리펩타이드의 아미노산 순서이다.
용어 "발현"은 본원에서, 유전자가 생화학 물질, 예컨대 폴리펩타이드를 제조하는 과정을 나타낸다. 과정은 유전자 낫다운 뿐만 아니라 일시적인 발현 및 안정적인 발현 등을 비제한적으로 포함하며, 세포내 유전자의 모든 기능적 존재 표명을 포함한다. 유전자의 메신저 RNA(mRNA)로의 전사와 이러한 mRNA의 폴리펩타이드(들)로의 번역을 비제한적으로 포함한다. 최종 원하는 산물이 생화학적 산물인 경우, 발현은 그러한 생화학적 산물과 모든 전구체의 형성을 포함한다. 유전자의 발현은 "유전자 산물"을 생산한다. 본원에서, 유전자 산물은 핵산, 예컨대 유전자의 전사에 의해 제조되는 메신저 RNA, 또는 전사체로부터 번역된 폴리펩타이드 중 어느 하나일 수 있다. 본원에 기술된 유전자 산물은 추가적으로 전사 후 변형, 예컨대 폴리아데닐화된 핵산, 또는 번역 후 변형, 예컨대 메틸화, 당화, 지질의 부가, 그외 단백질 서브유닛의 조립, 단백질분해성 절단 등이 실시된 폴리펩타이드를 포함한다.
본원에서, 용어 "치료한다" 또는 "치료"는 치료학적 치료 및 예방학적 또는 예방적 조치 모두를 의미하며, 그 목적은 다발성 경화증의 진행과 같은, 바람직하지 않은 생리학적 변화나 장애를 예방하거나 감퇴(약화)시키고자 하는 것이다. 유익하거나 또는 바람직한 임상 결과로는, 검출가능하거나 또는 검출불가능하던지 간에, 증상의 완화, 질병의 범위 축소, 질병의 안정기 (즉, 악화되지 않음) 상태, 질병 진행의 지연 또는 서행, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 (부분적으로 또는 전반적으로) 진정을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. "치료"는 또한 치료를 시술받지 않은 경우에 예상되는 생존성과 비교하여 생존성 연장을 의미할 수 있다. 치료가 필요한 개체는 병태나 장애를 이미 가진 개체 뿐만 아니라 병태나 장애에 걸리기 쉬운 개체, 또는 병태나 장애가 예방되어야 할 개체를 포함한다.
"개체" 또는 "개개인" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유류"는, 진단, 예후 또는 치료가 바람직한 모든 개체, 특히 포유류 개체를 의미한다. 포유류 개체로는 인간, 가축 동물, 농장 동물, 및 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 랫, 마우스, 말, 소, 황소 등의 동물원, 스포츠 또는 애완 동물을 포함한다.
본원에서, "항-CD20 항체의 투여가 유익할 개체" 및 "치료가 필요한 동물" 등의 표현은, 예컨대 항-CD20 폴리펩타이드의 검출, 및/또는 치료, 즉 항-CD20 항체로 질병의 완화 또는 예방에 사용되는 항-CD20 항체의 투여시 유익할, 포유류 개체와 같은 개체를 포함한다. 본원에 보다 상세하게 기술된 바와 같이, 항-CD20 항체를 예컨대 약물, 프로드럭 또는 동위 원소에 접합되지 않은 상태로 사용할 수 있으며, 또는 접합할 수 있다.
II. 타겟 폴리펩타이드의 설명
B1(CD20) 분자는 B 세포 증식 및 분화 조절에 의해 체액성 면역 반응에서 중요한 역할을 제공할 수 있는 인간 B 림프구의 표면상에 있는 약 35,000 달톤의 인단백질(phosphoprotein)이다. CD20 분자를 코딩하는 DNA 서열은 분리되었고, CD20의 아미노산 서열이 결정되었다. Tedder et al. (1988) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 85:208-212를 참조한다. 당업계에 인지되어 있는 바와 같이, CD20의 동의어로는, B-림프구 항원 CD 20, B-림프구 표면 항원 B1, Leu-16, Bp35, BM5 및 LF5를 포함한다.
본 발명의 항체는 CD20 인간 B 세포 표면 항원에 결합 특이성을 가진다. 항원은 폴리펩타이드이거나, Clark et al. (1985) Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 82:1766-1770에 기술된 2H7 단일클론 항체에 의해 결합된 폴리펩타이드를 포함한다. 이 항원은 Bp35(CD20)로 명명된 인단백질이며, B 세포 계통의 세포 상에서만 발현된다. 이러한 항원에 대한 뮤라인의 단일클론 항체가 이전에 제조되었으며, 전술한 Clark et al.에 기술되어 있으며, 또한, Stashenko et al. (1980) J. Immunol . 125:1678-1685를 참조한다.
III. 항-CD20 항체
일 예에서, 본 발명은 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는, 항-CD20 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 활성 증가를 위해 최적화된 항-CD20 항체이다. 본원에서, 용어 "항-CD20 항체"는 약 35,000 달톤의 전형적으로 인간 B-림프구 제한성 분화 항원 Bp35, 일반적으로 CD20이라고 일컫는, 세포 표면의 비-당화된 인단백질을 특이적으로 인지하는 항체이다. 상기 항원은 조혈 줄기 세포, pro-B 세포, 정상적인 혈장 세포나 그외 정상 조직들에서는 발견되지 않지만 비-호지킨 림프종의 B 세포의 90% 이상에서 발현된다. CD20은 세포 증식과 분화의 활성화 과정에서 초기 단계를 조절한다. 더 구체적으로는, 본 발명의 항체는 전술한 2H7 단일클론 항체에 의해 결합되는 것과 동일한 에피토프에 결합한다.
본 발명의 항체는 미국 특허 5,736,137 및 (Reff et al. (1994) Blood 83:435-445)에 기술된 바와 같은, 키메라 뮤라인/인간 항-CD20 항체인 단일클론 항체 (mAb) C2B8, 키메라 뮤라인/인간 항-CD20 항체를 기초로 최적화되며, 상기 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 발명의 항체 서열은, 항CD20 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인으로 조작되었을 때, 결합 특이성과 리툭시맵과 비교하여 세포 자살을 매개하는 능력을 유지하면서, 항체의 CDC 활성 강화를 나타내는, 변형된 CDR을 포함한다.
언급된 바와 같이, 본 발명의 항-CD20 항체는 리툭시맵과 비교하여 강화된 CDC 활성을 보인다. 리툭시맵은 인간 IgG1 및 카파 불변 영역과 뮤라인의 항-CD20 단일클론 항체인 IDEC-2B8(Reff et al. (1994) Blood 83:435-445)로부터 분리된 뮤라인 가변 영역을 포함하고 있는, 뮤라인/인간 항-CD20 키메라 단일클론 항체(IDEC-C2B8; IDEC Pharmaceutical Corp., San Diego, California; 상표 Rituxan®)이다. 리툭시맵은 재발성 B 세포 저등급 또는 여포성 비-호지킨 림프종(NHL)의 치료에 사용된다. 어떠한 작용 기작에 결부되지 않으면서, 항-CD20 항체는 CD20 항원에 결합하며, 세포 용혈 기작은 보체-의존성 세포독성(CDC) 및 항체-의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)를 포함한다. 따라서, 우수한 CDC 및/또는 ADCC 활성을 가진 항-CD20 항체의 발견, 및/또는 리툭시맵(또한 Rituxan®라고도 함)과 비교하여 결합 친화성이 증가된 항-CD20 항체의 발견은, B 세포 림프종, 특히 B 세포 비-호지킨 림프종에 대한 암 치료법을 향상시킬 가능성이 있다. 항체는 동량으로 분석하여 비교한다. 본 발명의 항-CD20 항체 및 리툭시맵의 "동량"은 각 항체에 사용되는 것과 동량을 의미한다.
CD20에 대한 이러한 신규한 항-CD20 항체의 결합 친화성은 CDC 오프율 분석을 이용하여 리툭시맵에서 관찰되는 결과에 비해 적어도 약 50%, 약 75%, 약 100%, 약 125% 높다. 비-방사성 CDC 분석에서는, 3가지 상이한 NHL 주에 대한 동일한 세포 사멸을 매개하는데 요구되는 리툭시맵은, 본 발명의 항-CD20 항체를 이용할 경우 필요한 것 보다 적어도 약 2 배, 약 3 배, 최대 약 4배 높다.
본 발명의 항-CD20 항체는 하나 이상의 최적화된 보체-결정 영역(CDR)을 포함한다. "최적화된 CDR"은, CDR이 최적화된 CDR을 포함하는 항-CD20 항체에 부여되는 결합 친화성 향상 및/또는 CDC 활성 향상을 기초로 선별된 서열로 변형되고 최적화된 것을 의미한다. 변형에는, 항-CD20 항체가 CD20 항원에 대한 특이성을 보유하도록 하는 CDR 내에서의 아미노산 잔기의 치환을 포함하며, 결합 친화성 및/또는 CDC 활성 증가를 보인다. 본 발명의 항-CD20 항체의 CDC 활성은, 미국 출원 공개번호 2004/0167319 A1에 언급된 바와 같이, 기능 분석에서는 리툭시맵에 비해 높으며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 발명의 신규한 항-CD20 항체와 그의 적합한 항원-결합 단편, 변이체 및 유도체는 표준적인 분석으로 측정시, 예컨대 미국 출원번호 2004/0167319 A1에 언급된 방법으로 측정시, 리툭시맵에 의해 나타나는 결과와 일정 부분 이상이 유사한 ADCC 및 세포자살 활성을 나타낸다. 본 발명의 최적화된 CDR은 항-CD20 항체의 각 중쇄 및 경쇄의 VH 및 VL 도메인에 이용된다. 본 발명의 항-CD20 항체의 예로는, 서열번호 12-18(각각 H1569, H1570, H1571, H1638, H1639, H1640, H1670로 명기됨)로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH 도메인 및/또는 서열번호 10 및 11(각각 L373 및 L419로 명기됨) 중에서 선택된 VL 도메인을 포함한다.
특정 예에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 최적화된 CDR을 포함한다. 즉, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 1-8로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 최적화된 CDR 아미노산 또는 서열번호 1-8로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 즉, 최적화된 CDR은 서열번호 1-8에 기재된 서열과 관여한 CDR에 따라 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환을 가지고 있는 서열번호 1-8의 서열을 포함한다.
따라서, 일부 예들에서, 본 발명의 항-CD 항체는 하기 군으로부터 선택되는 하나 이상의 최적화된 CDR을 가진 VH 도메인을 포함한다:
(a) 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
(b) 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 동일성을 가진 아미노산을 포함하며, 서열번호 7의 7번 잔기에 대응되는 위치에 페닐알라닌(Phe) 잔기를 포함하는 CDR1;
(c) 서열번호 5 또는 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2;
(d) 서열번호 5 또는 6에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 5 또는 6 각각의 8번 잔기에 대응되는 위치에 알라닌(Ala) 또는 루신(Leu) 잔기를 포함하는, CDR2;
(e) 서열번호 1, 2, 3 또는 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3;
(f) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 1의 9번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기 및 (ii) 서열번호 1의 12번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, CDR3;
(g) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 2의 5번 잔기에 대응되는 위치에 알라닌(Ala) 잔기, (ii) 서열번호 2의 9번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기 및 (iii) 서열번호 2의 12번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, CDR3;
(h) 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 3의 5번 잔기에 대응되는 위치에 알라닌(Ala) 잔기, (ii) 서열번호 3의 9번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기 및 (iii) 서열번호 3의 12번 잔기에 대응되는 위치에 아스파르트산(Asp) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, CDR3;
(i) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 4의 5번 잔기에 대응되는 위치에 알라닌(Ala) 잔기, (ii) 서열번호 4의 9번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기, (iii) 서열번호 4의 11번 잔기에 대응되는 위치에 글리신(Gly) 잔기 및 (iv) 서열번호 4의 12번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn)잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, CDR3;
(j) 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, 페닐알라닌(Phe)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기를 서열번호 7의 7번 잔기에 대응되는 위치에 포함하는, CDR1;
(k) 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, 알라닌(Ala)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기를 서열번호 5의 8번 잔기에 대응되는 위치에 포함하는, CDR2;
(l) 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, 루신(Leu)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기를 서열번호 6의 8번 잔기에 대응되는 위치에 포함하는, CDR2;
(m) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 1의 9번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기 및 (ii) 서열번호 1의 12번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, CDR3;
(n) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 2의 5번 잔기에 대응되는 위치에 알라닌(Ala)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기, (ii) 서열번호 2의 9번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기 및 (iii) 서열번호 2의 12번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, CDR3;
(o) 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 3의 5번 잔기에 대응되는 위치에 알라닌(Ala)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기, (ii) 서열번호 3의 9번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기 및 (iii) 서열번호 3의 12번 잔기에 대응되는 위치에 아스파르트산(Asp)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, CDR3; 및
(p) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 4의 5번 잔기에 대응되는 위치에 알라닌(Ala)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기, (ii) 서열번호 4의 9번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기, (iii) 서열번호 4의 11번 잔기에 대응되는 위치에 글리신(Gly)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기 및 (iv) 서열번호 4의 12번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, CDR3.
다른 예로, 본 발명의 항-CD20 항체는 (a) 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (b) 서열번호 8에 기재된 아미노산과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산을 포함하며, 서열번호 8의 4번 위치에 대응되는 위치에 글루타민(Gln) 잔기를 포함하는, CDR3; 및 (c) 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, 글루타민(Gln)에 대해 보존적인 아미노산 치환인 잔기를 서열번호 8의 4번 잔기에 대응되는 위치에 포함하는, CDR3, 및 (d) 서열번호 9에 기재된 서열을 포함하는 CDR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR를 가진 VL 도메인을 포함한다. 이러한 예 중 일부 예에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 9에 기재된 서열을 포함하는 CDR2와, (a) 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 및 (b) 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 8의 4번 잔기에 대응되는 위치에 글루타민(Gln) 잔기를 포함하는, CDR3로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3을 가진 VL 도메인을 포함한다.
또다른 예에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 전술한 (a) 내지 (p)의 언급된 군으로부터 선택되는 최적화된 CDR을 가진 VH 도메인; 및 (a) 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (b) 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 8의 4번 잔기에 대응되는 위치에 글루타민(Gln) 잔기를 포함하는, CDR3; (c) 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 8의 4번 잔기에 대응되는 위치에, 글루타민(Gln)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기를 포함하는, CDR3; 및 (d) 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR를 가진 VL 도메인을 포함한다. 이러한 예 중 일부 예로, 본 발명의 항-CD20 항체는, 서열번호 9에 기재된 서열을 포함하는 CDR2와, (a) 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및 (b) 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 8의 4번 잔기에 대응되는 위치에 글루타민(Gln) 잔기를 포함하는 CDR3로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3을 가진 VL 도메인을 포함한다.
또다른 예에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 전술한 (a) 내지 (p)에 언급된 군으로부터 선택된 최적화된 CDR을 가진 VH 도메인과, 서열번호 10 및 11에 기재된 서열을 가진 VL 도메인을 포함한다.
일부 예들에서, 본 발명의 최적화된 CDR 중 하나 이상을 포함하는 항-CD 항체는 IgG1 카파 면역글로불린이다. 이러한 예에서, IgG1 카파 면역글로불린은 면역글로불린의 중쇄내에 인간 IgG1 불변 영역과 면역글로불린의 경쇄내에 인간 카파 불변 영역을 포함할 수 있다. 특정 예에서, IgG1 카파 면역글로불린은 중쇄의 가변 도메인 내, 그리고 경쇄의 가변 도메인 내에, 전체 또는 부분적인 인간 프래임워크 영역을 포함한다. 다른 예에서, IgG1 카파 면역글로불린은 중쇄의 가변 도메인 내에 그리고 경쇄의 가변 도메인 내에, 뮤라인 프래임워크 영역을 포함한다.
본 발명의 다른 예에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 12-18로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가진 VH 도메인 및/또는 서열번호 10 및 11 중에서 선택된 아미노산 서열을 가진 VL 도메인, 또는 서열번호 10-18에 기재된 서열과 적어도 약 80%, 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또다른 예에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 하기 군으로부터 선택되는 VH 도메인을 포함한다:
(a) 서열번호 12-18로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인;
(b) 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 12의 107번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기 및 (ii) 서열번호 12의 110 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, VH 도메인;
(c) 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 13의 103번 잔기에 대응되는 위치에 알라닌(Ala) 잔기, (ii) 서열번호 13의 107번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기, 및 (iii) 서열번호 13의 110번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, VH 도메인;
(d) 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 14의 103번 잔기에 대응되는 위치에 알라닌(Ala) 잔기, (ii) 서열번호 14의 107번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기, 및 (iii) 서열번호 14의 110번 잔기에 대응되는 위치에 아스파르트산(Asp)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, VH 도메인;
(e) 서열번호 15에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 15의 31번 잔기에 대응되는 위치에 페닐알라닌(Phe) 잔기; (ii) 서열번호 15의 103번 잔기에 대응되는 위치에 알라닌(Ala) 잔기 103; (iii) 서열번호 15의 107번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기, 및 (iv) 서열번호 15의 110번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, VH 도메인;
(f) 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 16의 57번 잔기에 대응되는 위치에 알라닌(Ala) 잔기, (ii) 서열번호 16의 103번 잔기에 대응되는 위치에 알라닌(Ala) 잔기, (iii) 서열번호 16의 107번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기, 및 (iv) 서열번호 16의 110번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, VH 도메인;
(g) 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 17의 57번 잔기에 대응되는 위치에 루신(Leu) 잔기, (ii) 서열번호 17의 103번 잔기에 대응되는 위치에 알라닌(Ala) 잔기, (iii) 서열번호 17의 107번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기, 및 (iv) 서열번호 17의 110번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, VH 도메인;
(h) 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 18의 103번 잔기에 대응되는 위치에 알라닌(Ala) 잔기, (ii) 서열번호 18의 107번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기, (iii) 서열번호 18의 109번 잔기에 대응되는 위치에 글리신(Gly) 잔기, 및 (iv) 서열번호 18의 110번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, VH 도메인;
(i) 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 12의 107번 잔기에 대응되는 위치에, 아스파라긴(Asn)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기, 및 (ii) 서열번호 12의 110번 잔기에 대응되는 위치에, 아스파라긴(Asn)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, VH 도메인;
(j) 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 13의 103번 잔기에 대응되는 위치에, 알라닌(Ala)에 대한 보존적인 아미노산 치환이나 글리신은 아닌 잔기, (ii) 서열번호 13의 107번 잔기에 대응되는 위치에, 아스파라긴(Asn)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기, 및 (iii) 서열번호 13의 110번 잔기에 대응되는 위치에, 아스파라긴(Asn)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, VH 도메인;
(k) 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 14의 103번 잔기에 대응되는 위치에, 알라닌(Ala)에 대한 보존적인 아미노산 치환이나 글리신은 아닌 잔기, (ii) 서열번호 14의 107번 잔기에 대응되는 위치에, 아스파라긴(Asn)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기, 및 (iii) 서열번호 14의 110번 잔기에 대응되는 위치에, 아스파르트산(Asp)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, VH 도메인;
(l) 서열번호 15에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 15의 31번 잔기에 대응되는 위치에, 페닐알라닌(Phe)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기, (ii) 서열번호 15의 103번 잔기에 대응되는 위치에, 알라닌(Ala)에 대한 보존적인 아미노산 치환이지만 글리신은 아닌 잔기, (iii) 서열번호 15의 107번 잔기에 대응되는 위치에, 아스파라긴(Asn)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기, 및 (iv) 서열번호 15의 110번 잔기에 대응되는 위치에, 아스파라긴(Asn)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, VH 도메인;
(m) 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 16의 57번 잔기에 대응되는 위치에, 알라닌(Ala)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기, (ii) 서열번호 16의 103번 잔기에 대응되는 위치에, 알라닌(Ala)에 대한 보존적인 아미노산 치환이나 글리신은 아닌 잔기, (iii) 서열번호 16의 107번 잔기에 대응되는 위치에, 아스파라긴(Asn)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기, 및 (iv) 서열번호 16의 110번 잔기에 대응되는 위치에, 아스파라긴(Asn)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, VH 도메인;
(n) 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 17의 57번 잔기에 대응되는 위치에, 루신(Leu)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기, (ii) 서열번호 17의 103번 잔기에 대응되는 위치에, 알라닌(Ala)에 대한 보존적인 아미노산 치환이나 글리신은 아닌 잔기, (iii) 서열번호 17의 107번 잔기에 대응되는 위치에, 아스파라긴(Asn)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기, 및 (iv) 서열번호 17의 110번 잔기에 대응되는 위치에, 아스파라긴(Asn)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, VH 도메인; 및
(o) 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 18의 103번 잔기에 대응되는 위치에, 알라닌(Ala)에 대한 보존적인 아미노산 치환이나 글리신은 아닌 잔기, (ii) 서열번호 18의 107번 잔기에 대응되는 위치에, 아스파라긴(Asn)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기, (iii) 서열번호 18의 109번 잔기에 대응되는 위치에, 글리신(Gly)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기, 및 (iv) 서열번호 18의 110번 잔기에 대응되는 위치에, 아스파라긴(Asn)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, VH 도메인.
이러한 예에 대한 일부 예에서는, 본 발명의 항-CD20 항체는 전술한 (a) - (o)에 언급된 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH 도메인을 포함하며, 하기 도메인으로 이루어진 군으로 선택되는 가변성 경쇄(VL) 도메인을 포함한다:
(a) 서열번호 10 또는 서열번호 11에 기재된 서열을 포함하는 VL 도메인;
(b) 서열번호 10 또는 서열번호 11에 기재된 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
(c) 서열번호 10에 기재된 서열과 적어도 85%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 9에 기재된 CDR2를 포함하는, VL 도메인;
(d) 서열번호 11에 기재된 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 9에 기재된 CDR2 및 (ii) 서열번호 11의 91번 잔기에 대응되는 위치에 글루타민(Gln) 잔기 중에서 하나 이상을 포함하는, VL 도메인; 및
(e) 서열번호 11에 기재된 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 9에 기재된 CDR2, 및 (ii) 서열번호 11의 91번 잔기에 대응되는 위치에, 글루타민(Gln)에 대한 보존적인 아미노산 치환 중 어느 하나를 포함하는, VL 도메인.
이들 예들 중 일부 예에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인과 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 다른 예로, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인과 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 특정한 다른 예로, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인과 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 또다른 예로, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인과 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 다른 예로,본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인과 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 다른 예로, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인과 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 또다른 예로, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인과 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 특정 예로, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인과 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 다른 예로, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인과 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 특정한 다른 예로, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인과 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 또다른 예로, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인과 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 그외 또다른 예로, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인과 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 추가적인 예로, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인과 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 다른 추가적인 예로, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인과 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
그외 다른 예로, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 12-18에 기재된 서열들 중 어느 하나와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 이러한 예 중 일부 예에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 10 또는 서열번호 11에 기재된 VL 도메인을 더 포함한다.
다른 예에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 29(H1286로 명기)에 기재된 VH 도메인, 또는 서열번호 29에 기재된 VH 도메인과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 가진 VH 도메인을 포함한다. 이들 일부 예에서, 이들 항-CD20 항체는 또한 서열번호 10 및 11(각각 L373 및 L419로 명기함) 중에서 선택된 VL 도메인을 포함한다.
또다른 예에서, 본 발명의 항-CD20 항체는, (a) 서열번호 29에 기재된 VH 도메인, (b) 서열번호 29에 기재된 VH 도메인과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH 도메인; 및 (a) 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및 (b) 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 8의 4번 잔기에 대응되는 위치에 글루타민(Gln) 잔기를 포함하는 CDR3, 및 (c) 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 8의 4번 잔기에 대응되는 위치에 글루타민(Gln)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기를 포함하는 CDR3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR를 갖는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 예로, 본 발명의 항-CD20 항체는, (a) 서열번호 29에 기재된 VH 도메인 및 (b) 서열번호 29에 기재된 VH 도메인과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 가진 VH 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH 도메인; 및 (a) 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (b) 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 8의 4번 잔기에 대응되는 위치에 글루타민(Gln) 잔기를 포함하는 CDR3; (c) 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 8의 4번 위치에 대응되는 위치에 글루타민(Gln)에 대한 보존적인 아미노산 치환인 잔기를 포함하는 CDR3, 및 (d) 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR를 갖는 VL 도메인을 포함한다.
이들 일부 예에서, 본 발명의 항-CD20 항체는, (a) 서열번호 29에 기재된 VH 도메인 및 (b) 서열번호 29에 기재된 VH 도메인과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 VH 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH 도메인; 및 (a) 서열번호 10 또는 11에 기재된 서열을 포함하는 VL 도메인; (b) 서열번호 10 또는 11에 기재된 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; (c) 서열번호 10에 기재된 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 9에 기재된 CDR2를 포함하는 VL 도메인; (d) 서열번호 11에 기재된 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 9에 기재된 CDR2 및 (ii) 서열번호 11의 91번 잔기에 대응되는 위치에 글루타민(Gln) 잔기 중에서 하나 이상을 포함하는 VL 도메인; (e) 서열번호 11에 기재된 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 9에 기재된 CDR2 및 (ii) 서열번호 11의 91번 잔기에 대응되는 위치에, 글루타민(Gln)에 대한 보존적인 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함하는 VL 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 가변성 경쇄(VL) 도메인을 포함한다.
항-CD20 항체 서열은 당업계에 공지되어 있다. 예로, 미국 특허 5,736,137; 5,776,456; 5,843,439; 5,500,362; 5,677,180; 5,693,493; 5,721,108; 5,736,137; 6,120,767; 5,843,685; 5,576,184; 6,399,061; 및 미국 특허 공개번호 2004/0167319를 참조하며, 이들 모두 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본원에 기술된 변형을 당업계에 공지된 항-CD 항체들 중 임의의 것이나 이들의 조합에 대해 가할 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 본원에 기술된 최적화된 CDR 중 하나 이상을 포함하는, 뮤라인 항-CD20 항체, 키메라 항-CD20 항체, 및 인간화 항-CD20 항체가 본 발명에서 고려된다. 이러한 변형으로 조작된 항-CD20 항체 및 조합을 본원에 기술되어 있으며 당업계에 공지된 분석에 의해 활성 강화에 대해 조사할 수 있다. 항-CD20 항체 결합 특이성을 측정하는 방법으로는, 표준 경쟁적인 결합 분석, B 세포에 의한 면역글로불린 분비을 모니터링하기 위한 분석, B 세포 증식 분석, 방쉬로(Banchereau) 유사 B 세포 증식 분석, 항체 생산에 대한 T 세포 헬퍼 분석, B 세포 증식 분석의 공동-자극, 및 B 세포 활성화 마커의 상향-조절에 대한 분석을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 예로, 이러한 분석들은 WO 00/75348 및 미국 특허 6,087,329에 기재되어 있다. CDC, ADCC 및 세포자살 분석은, 예컨대 Subbramanian et al. (2002) J. Clin . Microbiol . 40:2141-2146; Ahman et al. (1994) J. Immunol . Methods 36:243-254; Brezicka et al. (2000) Cancer Immunol . Immunother . 49:235-242; Gazzano-Santoro et al. (1997) J. Immunol . Methods 202:163-171; Prang et al. (2005) British J. Cancer 92:342-349; Shan et al. (1998) Blood 92:3756-3771; Ghetie et al. (2001) Blood 97:1392-1398; 및 Mathas et al. (2000) Cancer Research 60:7170-7176을 참조하며, 이들 모두 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 특정 항-CD20 항체는 서열번호 12-18 중 어느 하나로 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인, 또는 임의 조합으로, 서열번호 10 또는 11의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인 또는 그의 변이체와 페어와이즈을 이룬 그것의 변이체를 포함한다. 본 발명의 항-CD20 항체는 서열번호 12-18로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인과, 서열번호 10 또는 11 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다.
항-CD20 항체의 생물학적으로 활성인 적합한 변이체를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 이러한 변이체는 모체 항-CD20 항체의 바람직한 결합 특성을 보유할 것이다. 항체 변이체의 제조 방법은 당업계에서 일반적으로 이용가능하다.
예를 들어, 본원에 기술된, 항-CD20 항체, 항체 영역, 예컨대 CDR(서열번호 1-8) 또는 중쇄나 경쇄의 항체 가변 도메인, 예컨대 서열번호 12-18 중 어느 하나에 기재된 VH 도메인 또는 서열번호 10 또는 11에 기재된 VL 도메인에 대한 아미노산 변이체는, 대상 아미노산 서열을 코딩하는 클로닝한 DNA 서열의 돌연변이에 의해 제조할 수 있다. 돌연변이 유발 및 뉴클레오타이드 서열 변이는 당업계에 잘 알려져 있다. 예로, Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol . 154:367-382; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York); 미국 특허 4,873,192; 및 이에 언급된 참고문헌을 참조하며, 이들 모두 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 대상 폴리펩타이드의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 가이드는 Dayhoff et al. (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), pp. 345-352에 기재된 모델에서 확인할 수 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. Dayhoff 등의 모델에서는, PAM(Point Accepted Mutation) 아미노산 유사성 매트릭스(PAM 250 matrix)를 사용하여, 적합한 보존적인 아미노산 치환을 정한다. 하나의 아미노산을 특성이 유사한 다른 아미노산으로 교체하는 등의 보존적인 치환이 바람직할 수 있다. Dayhoff 등의 PAM 250 매트릭스에 의해 기술된 보존적인 아미노산 치환의 예로는 Gly ↔ Ala, Val ↔ Ile ↔ Leu, Asp ↔ Glu, Lys ↔ Arg, Asn ↔ Gln, 및 Phe ↔ Trp ↔ Tyr이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
대상 항-CD20 항체 폴리펩타이드의 변이체 구축에 있어, 본원에 기술된 바와 같이, 원하는 특성을 변이체가 계속 가지도록, 즉 인간 세포의 표면 상에 발현되는 인간 CD20 항원에 대한 특이적인 결합을 할 수 있으며, 기능 강화, 특히 CD20 항원에 대한 결합 친화성 증가 및/또는 CDC 활성 증가 특성을 가지도록 변형한다. 명백하게는, 변이체 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA에 행해진 모든 돌연변이는 리딩 프래임 이외의 서열에 위치되어서는 안되며, 바람직하기로는 mRNA의 이차 구조를 형성할 수 있는 상보적인 영역을 만들어서는 안될 것이다. 유럽 특허 공개번호 75,444를 참조한다.
아울러, 항-CD20 항체의 불변 영역은 여러가지 방식으로 작용자 기능을 변이시키도록 변형을 가할 수 있다. 예로, 미국 특허 6,737,056B1 및 미국 특허 공개번호 2004/0132101A1을 참조하며, 이들은 Fc 수용체에 대한 항체 결합을 최적화하는 Fc 돌연변이를 개시하고 있다.
바람직하기로는, 기준 항-CD20 항체의 변이체는 기준 항-CD20 항체에 대한 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 88%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 또는 약 95%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가지거나, 또는 기준 항체 분자의 짧은 일부를 가진다. 더 바람직하기로는, 분자는 적어도 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 공유한다. 본원에 언급시, 본원에 기술된 CDR, VH 도메인 및 VL 도메인 등의, 임의의 특정 폴리펩타이드가 다른 폴리펩타이드와 적어도 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 심지어 약 100%의 동일성을 보이는 지의 여부는, 비제한적으로, BESTFIT 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) 등과 같은 당업계에 공지된 방법 및 컴퓨터 프로그램/소프트웨어를 이용하여 결정할 수 있다. BESTFIT는 Smith 및 Waterman (1981)(Adv . Appl . Math . 2:482-489)의 국소 상동성 알고리즘을 이용하여, 2개의 서열 간의 최상의 상동성 세그먼트를 찾는다. BESTFIT 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 이용하여 특정 서열이 본 발명에 따른 기준 서열과 예컨대 95% 상동한지를 결정할 때, 파라미터는 물론 동일성%가 기준 폴리펩타이드 서열의 전장에 대해 계산되고, 기준 서열에서 아미노산 총 수의 최대 5% 상동성에서 갭을 허용하도록, 설정된다.
본 발명의 목적에서, 동일성%는 갭 오픈 패널티 12, 갭 연장 패널티 2, BLOSUM 매트릭스 62의 어파인 갭 검색(affine gap search)을 이용한 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘으로 결정한다. Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘은 Smith 및 Waterman (1981) Adv. Appl . Math . 2:482-489에 기재되어 있다. 예컨대, 변이체는 기준 항-CD20 항체와, 적게는 1-15개의 아미노산 잔기가, 적게는 1-10개의 아미노산 잔기가, 예컨대 6-10, 적게는 5개, 적게는 4, 3, 2 또는 심지어 1개의 아미노산 잔기가 다를 수 있다.
2개의 아미노산 서열의 최적 정렬과 관련하여, 변이체 아미노산 서열의 연속적인 세그먼트는 기준 아미노산 서열에 대해 부가적인 아미노산 잔기 또는 아미노산 잔기 결손이 있을 수 있다. 기준 아미노산 서열과의 비교에 사용되는 연속적인 세그먼트는 적어도 20개의 연속적인 아미노산 잔기를 포함할 것이며, 30, 40, 50 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 보존적인 잔기 치환 또는 갭과 관련있는 서열 동일성에 대한 보정을 실시할 수 있다(Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘 참조).
임의의 2종의 폴리펩타이드 서열이 비교를 위해 최적으로 정렬시켰을 때, 정렬에서 다른 것에 반대쪽에 위치한 잔기는 다른 것에 대응되는 그것의 각 폴리펩타이드내 위치를 차지하는 것으로 인식된다. 그러한 위치를 "대응 위치"라고 본원에서 칭하며, 대응 위치에 있는 잔기를 "대응 잔기" 또는 다른 것에 "대응되는" 잔기라고 한다. 따라서, 대상 폴리펩타이드가 예컨대 잔기 10개를 가지는 기준 폴리펩타이드 서열과 최적으로 정렬된 경우, 기준 서열의 반대쪽 5번 잔기에 있는 대상 폴리펩타이드의 잔기는 기준 서열의 "5번 잔기에 대응되는 위치에 잔기"라고 한다.
CD20에 특이적으로 결합할 수 있으며 바람직한 CDC 활성 증가 및/또는 CD20에 대한 결합 친화성 증가를 보유하고 있는, 폴리펩타이드의 정확한 화학 구조는, 여러가지 인자에 의존된다. 이온화가능한 아미노 및 카르복시기가 분자에 존재하기 때문에, 특정 폴리펩타이드는 산성 염 또는 염기성염, 또는 중성 형태로서 수득할 수 있다. 적정 환경 조건에 위치되었을 때 그것의 생물학적 활성을 유지하는 그러한 모든 조제물은, 본원에 기술된 바와 같이 항-CD20 항체의 정의에 포함된다. 아울러, 폴리펩타이드의 1차 아미노산 서열은 당 모이어티를 이용한 유도체화에 의해(당화) 또는 그외 지질, 인산, 아세틸기 등의 추가적인 분자에 의해 증가될 수 있다. 또한, 사카라이드와의 접합에 의해서도 증가될 수 있다. 이러한 증가의 임의 측면은 생산 숙주의 번역 후 프로세싱 시스템을 통하여 달성되며, 그외 그러한 변형은 시험관내에서 도입될 수 있다. 임의 경우에, 그러한 변형은 항-CD20 항체의 바람직한 특성이 파괴되지 않는 한 본원에 사용된 항-CD20 항체의 정의에 포함된다. 이러한 변형은 다양한 분석에서 폴리펩타이드의 활성을 강화 또는 약화함으로써, 활성에 정량적으로 또는 질적으로 영향을 미칠 수 있을 것으로 예상된다. 또한, 체인내 개개 아미노산 잔기들은 산화, 환원 또는 그외 유도체화에 의해 변형될 수 있으며, 폴리펩타이드를 잘라 활성을 가진 단편을 수득할 수 있다. 원하는 활성(즉, CD20에 대한 결합 특이성, CDC 활성 증가 및/또는 CD20 항원에 대한 결합 친화성 증가)을 파괴하지 않는 이러한 변이는, 본원에 기술된 바와 같이, 대상 항-CD20 항체의 정의로부터 폴리펩타이드 서열을 배제하지 않는다.
당업계는 폴리펩타이드 변이체의 제조 및 이용에 대한 실질적인 지침을 제공한다. 항-CD20 항체 변이체의 제조에 있어, 당업자는 천연 단백질, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에 대한 변형으로 본 발명의 방법에 사용되는 약학 조성물의 치료학적 활성 성분으로서 사용하기 적합한 변이체를 발생시킬 수 있을지를 쉽게 결정할 수 있다.
임의의 항-CD20 항체에서, Fc 부분은 당업계에 공지된 기법으로 작용자 기능이 감소되도록 돌연변이시킬 수 있다. 예컨대, 불변 영역 도메인의 결손 또는 불활성화(점 돌연변이나 그외 수단을 통해)는 변형된 순환성 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시켜, 따라서 종양 국부화를 증가시킬 수 있다. 다른 경우에, 본 발명에 상응하는 불변 영역 변형은 보체 결합을 가감하여 따라서 혈청 반감기와 접합된 세포독소의 비특이적 조합을 감소시킬 수 있다. 불변 영역의 또다른 변형을 사용하여, 항원 특이성 또는 항체 가용성 증가로 인해 국부화 증가를 허용하는 이황화 결합 또는 올리고사카라이드 모이어티를 변형시킬 수 있다. 종양 국부화, 생물분포(biodistribution) 및 혈청 반감기 등의 수득되는 생리 프로파일, 생체이용성 및 그외 변형이 생화학적 효과들은 쉽게 측정할 수 있으며, 과도한 실험없이도 잘 알려져 있는 면역학적 기법을 이용하여 정량할 수 있다.
본 발명의 항-CD20 항체는 또한 예컨대 공유 부착이 항체가 이의 동족 에피토프(cognate epitope)에 대해 특이적으로 결합하지 못하도록 방지하는, 항체에 임의 타입의 분자의 공유 부착에 의해 변형된, 유도체를 포함한다. 예컨대, 비제한적으로, 항체 유도체는, 예컨대 당화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해성 절단, 세포 리간드 또는 그외 단백질에 연결 등에 의해 변형된 항체를 포함한다. 모든 수많은 화학적 변형은, 비제한적으로, 특이적인 화학 절단, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신(tunicamycin)의 대사적 합성 등의 공지된 기법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 유도체는 하나 이상의 비-고전적인 아미노산을 포함할 수 있다.
"보존적인 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 전하를 띄고 있는 측쇄를 가진 아미노산 잔기로의 치환이다. 유사한 전하를 띄는 측쇄를 가진 아미노산 잔기 패밀리는 당업계에 명시되어 있다. 이러한 패밀리는, 염기성 측쇄를 가진 아미노산(예, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가진 아미노산(예, 아스파르트산, 글루탐산), 무전하 극성 측쇄를 가진 아미노산(예, 글리신, 아사프라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 무극성 측쇄를 가진 아미노산(예, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄를 가진 아미노산(예, 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향족 측쇄를 가진 아미노산(예, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 다른 예로, 포화 돌연변이 유발(saturation mutagenesis) 등에 의해 코딩 서열의 전체 또는 일부에 무작위로 돌연변이를 도입할 수 있으며, 제조되는 돌연변이는 생물학적 활성에 대해 스크리닝하여, 활성(즉, 항-CD20 폴리펩타이드에 결합하는 능력)을 가진 돌연변이를 동정할 수 있다.
예컨대, 돌연변이는 항체 분자의 프래임워크 영역에만 또는 CDR 영역에만 도입하는 것도 가능한다. 도입된 돌연변이는 침묵 또는 중립의 미스센스 돌연변이, 즉 항체의 항원 결합력에 효과가 없거나 또는 거의 없을 수 있다. 이러한 타입의 돌연변이는 코돈 사용빈도(codon usage)를 최적화하거나 또는 하이브리도마의 항체 생산을 향상시킬 수 있다. 또는, 비-중립의 미스센스(non-neutral missense) 돌연변이는 항체의 항원 결합력을 변이시킬 수 있다. 대부분이 침묵 및 중립의 미스센스 돌연변이의 위치는 프래임워크 영역내일 가능성이 있지만, 대부분의 비중립의 미스센스 돌연변이는 절대적인 요건은 아니지만 CDR내 있을 수 있다. 당업자는, 항원 결합 활성에 대한 무변이 또는 결합 활성에 대한 무변이(예, 항원 결합 활성 개선 또는 항체 특이성 변화) 등의 바람직한 특성을 가진 돌연변이 분자를 제작 및 테스트할 수 있을 것이다. 돌연변이 유발 후, 코딩되는 단백질을 통상적으로 발현시킬 수 있으며, 코딩된 단백질의 기능적 및/또는 생물학적 활성(예, CD20 폴리펩타이드의 하나 이상에 면역특이적으로 결합하는 능력)을 본원에 기술된 기법 또는 당업계에 공지된 기법을 통상적으로 변형시켜, 결정할 수 있다.
IV. 항-CD20 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드
본 발명은 또한 본 발명의 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
일 예에서, 본 발명은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)을 코딩하는 핵산을 포함하는, 이로 필수적으로 구성된 또는 이로 구성된 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 상기 VH 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 서열번호 1-7 중 어느 하나와 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% , 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가진다.
다른 예에서, 본 발명은 면역글로불린 VH 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는, 이로 필수적으로 구성된 또는 이로 구성된 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 상기 VH 도메인의 CDR 중 적어도 하나는 (a) 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열번호 7에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 7의 7번 잔기에 대응되는 위치에 페닐알라닌(Phe) 잔기를 포함하는 CDR1; (c) 서열번호 5 또는 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; (d) 서열번호 5 또는 6에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 5 또는 서열번호 6의 8번 잔기에 대응되는 위치에 각각 알라닌(Ala) 또는 루신(Leu)을 포함하는 CDR2; (e) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (f) CDR3 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며,(i) 서열번호 1의 9번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기 및 (ii) 서열번호 1의 12번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, CDR3; (g) 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 2의 5번 잔기에 해당하는 위치에 알라닌(Ala) 잔기 및 (ii) 서열번호 2의 9번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기 및 (iii) 서열번호 2의 12번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 잔기를 포함하는, CDR3; (h) 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 3의 5번 잔기에 해당하는 위치에 알라닌(Ala) 잔기 (ii) 서열번호 3의 9번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기 및 (iii) 서열번호 3의 12번 잔기에 대응되는 위치에 아스파르트산(Asp) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, CDR3; 및 (i) 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 4의 5번 잔기에 해당하는 위치에 알라닌(Ala) 잔기, (ii) 서열번호 4의 9번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기, (iii) 서열번호 4의 11번 잔기에 대응되는 위치에 글리신(Gly) 잔기 및 (iv) 서열번호 4의 12번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는 CDR3로 이루어진 군으로부터 선택되며, 코딩된 VH 도메인을 포함하는 항-CD20 항체는 CD20에 특이적으로 또는 선호적으로 결합한다.
일부 예들에서, 본 발명은 면역글로불린 VH 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는, 이로 필수적으로 구성된 또는 이로 구성된 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 상기 VH 도메인의 CDR 중 적어도 하나는, (a) 서열번호 7에 기재된 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열번호 5 또는 6에 기재된 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4에 기재된 서열을 포함하는 CDR3로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 예에서, 면역글로불린 VH 도메인을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 24(서열번호 1의 최적화된 CDR3를 코딩), 서열번호 25(서열번호 2의 최적화된 CDR3를 코딩), 서열번호 26(서열번호 3의 최적화된 CDR3를 코딩), 및 서열번호 27(서열번호 5의 최적화된 CDR2를 코딩)로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR-코딩 서열 중 하나 이상을 포함한다.
추가적인 예로, 본 발명은, 서열번호 12-18 및 29로 이루어진 군으로부터 선택되는 기준 VH 도메인 폴리펩타이드 서열에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100%로 동일한 아미노산 서열을 갖는, VH 도메인을 코딩하는 핵산을, 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나 또는 이로 구성되는, 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 코딩된 VH 도메인을 포함하는 항-CD20 항체는 특이적으로 또는 선호적으로 CD20에 결합한다.
또다른 예에서, 본 발명은, (a) 서열번호 12-18 및 29로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; (b) 서열번호 12에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 12의 107번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기 및 (ii) 서열번호 12의 110번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는 VH; (c) 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 13의 103번 잔기에 해당하는 위치에 알라닌(Ala) 잔기, (ii) 서열번호 13의 107번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기 및 (iii) 서열번호 13의 110번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, VH; (d) 서열번호 14에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 14의 103번 잔기에 해당하는 위치에 알라닌(Ala) 잔기, (ii) 서열번호 14의 107번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기 및 (iii) 서열번호 14의 110번 잔기에 대응되는 위치에 아스파르트산(Asp) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, VH; (e) 서열번호 15에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 15의 31번 잔기에 대응되는 위치에 페닐알라닌(Phe) 잔기; (ii) 서열번호 15의 103번 잔기에 해당하는 위치에 알라닌(Ala) 잔기; (iii) 서열번호 15의 107번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기 및 (iv) 서열번호 15의 110번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, VH 도메인; (f) 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 16의 57번 잔기에 해당하는 위치에 알라닌(Ala) 잔기, (ii) 서열번호 16의 103번 잔기에 해당하는 위치에 알라닌(Ala) 잔기, (iii) 서열번호 16의 107번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기 및 (iv) 서열번호 16의 110번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, VH 도메인; (g) 서열번호 17에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 17의 57번 잔기에 대응되는 위치에 루신(Leu) 잔기, (ii) 서열번호 17의 103번 잔기에 해당하는 위치에 알라닌(Ala) 잔기, (iii) 서열번호 17의 107번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기 및 (iv) 서열번호 17의 110번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, VH 도메인; 및 (h) 서열번호 18에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 18의 103번 잔기에 해당하는 위치에 알라닌(Ala) 잔기, (ii) 서열번호 18의 107번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기, (iii) 서열번호 18의 109번 잔기에 대응되는 위치에 글리신(Gly) 잔기 및 (iv) 서열번호 18의 110번 잔기에 대응되는 위치에 아스파라긴(Asn) 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 잔기를 포함하는, VH 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH 도메인을 포함하는 핵산을, 포함하거나 이로 필수적으로 구성되거나 또는 이로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
추가적인 예로, 본 발명은, 핵산이 서열번호 19-22로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 가진 서열을 가지는, VH 도메인을 코딩하는 핵산을, 포함하거나 이로 필수적으로 구성되거나 또는 이로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
다른 예에서, 본 발명은, VL 도메인이 서열번호 8에 기재된 CDR 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가진 CDR을 포함하는, 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 코딩하는 핵산을, 포함하거나 이로 필수적으로 구성되거나 또는 이로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
추가적인 예로, 본 발명은, VL 도메인이, (a) 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; (b) 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 8의 4번 잔기에 대응되는 위치에 글루타민(Gln) 잔기를 포함하는 CDR3 및 (c) 서열번호 9에 기재된 서열을 포함하는 CDR2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR을 포함하는, 면역글로불린 경쇄의 VL 도메인을 코딩하는 핵산을, 포함하거나 이로 필수적으로 구성되거나 또는 이로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이들 일부 예에서, 본 발명은, VL 도메인이, 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 가진 CDR2와, (a) 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 및 (b) 서열번호 8에 기재된 아미노산 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 8의 4번 잔기에 대응되는 위치에 글루타민(Gln) 잔기를 포함하는 CDR3를 포함하는, 면역글로불린 경쇄의 VL 도메인을 코딩하는 핵산을, 포함하거나 이로 필수적으로 구성되거나 또는 이로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
다른 추가적인 예에서, 본 발명은, 서열번호 11에 기재된 기준 VL 도메인 폴리펩타이드 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가진, VL 도메인을 코딩하는 핵산을, 포함하거나 이로 필수적으로 구성되거나 또는 이로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 코팅된 VL 도메인을 포함하는 항-CD20 항체는 CD20에 특이적으로 또는 선호적으로 결합한다.
또다른 예에서, 본 발명은, (a) 서열번호 10 또는 11에 기재된 서열을 포함하는 VL 도메인; (b) 서열번호 10 또는 11에 기재된 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; (c) 서열번호 10에 기재된 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열번호 9에 기재된 CDR2를 포함하는, VL 도메인; 및 (d) 서열번호 11에 기재된 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, (i) 서열번호 9에 기재된 CDR2 및 (ii) 서열번호 11의 91번 잔기에 대응되는 위치에 글루타민(Gln) 잔기 중 어느 하나를 포함하는 VL 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL 도메인을 코딩하는 핵산을, 포함하거나 이로 필수적으로 구성되거나 또는 이로 구성되는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
전술한 폴리뉴클레오타이드 모두 예컨대, 본원에 기술된 바와 같이 코딩된 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 신호 펩타이드, 항체 불변 영역, 또는 본원에 기술된 그외 이종의 폴리펩타이드를 코딩하는 추가적인 핵산을 더 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 보다 상세하게 기술된 바와 같이, 본 발명은 전술한 폴리뉴클레오타이드 중 1종 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 포함한다. 일 예에서, 본 발명은 제1 폴리뉴클레오타이드가 전술한 바와 같이 VH 도메인을 포함하며 제2 폴리뉴클레오타이드를 본원에 기술된 VL 도메인을 포함하는, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 포함한다. 구체적으로, 조성물은, 서열번호 19-22 중 어느 하나에 기재된, VH 도메인-코딩 폴리뉴클레오타이드와 VL 도메인-코딩 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 서열번호 10 또는 11에 기재된 VL 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 필수적으로 구성되거나 또는 이로 구성된다.
또한, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같이 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 단편을 포함한다. 추가적으로, 융합 폴리펩타이드, Fab 단편 및 그의 유도체를 본원에 기술된 바와 같이 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 역시 본 발명에 고려된다.
폴리뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 모든 방법에 의해 제조 또는 생산할 수 있다. 예컨대, 항체의 뉴클레오타이드 서열이 공지된 경우, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 화학 합성한 올리고뉴클레오타이드로부터 조립할 수 있으며(예, Kutmeier et al. (1994) BioTechniques 17:242), 간략하게는, 항체를 코딩하는 서열의 부분들을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 중첩하고, 어닐링하고, 이들 올리고뉴클레오타이드를 연결한 다음, 연결된 올리고뉴클레오타이드를 PCR로 증폭시켜 합성하는 것을 포함한다.
또는 다른 예로, 항-CD20 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 적합한 소스로부터 유래된 핵산으로부터 제조할 수 있다. 특정 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 클론을 이용할 수 없지만 항체 분자의 서열은 공지되어 있다면, 항체를 코딩하는 핵산은, 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성화가능한 합성 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해, 또는 예컨대 항체 또는 다른 항-CD20 항체를 코딩하는 cDNA 라이브러리로부터 cDNA 클론을 동정하기 위해 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용한 클로닝에 의해, 적정 소스(예, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 항체를 발현하기 위해 선택된 하이브리도마 세포 등의 항체 또는 그외 항-CD20 항체를 발현하는 임의 조직 또는 세포로부터, 제조된 cDNA 라이브러리, 또는 분리된 핵산, 바람직하기로는 폴리 A+RNA)로부터 화학 합성 또는 수득할 수 있다. PCR로 제조한 증폭시킨 핵산은 그 후 당업계에 공지된 임의 방법을 이용하여 복제가능한 클로닝 벡터에 클로닝할 수 있다.
항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의, 뉴클레오타이드 서열과 대응되는 아미노산 서열이 일단 결정되면, 이의 뉴클레오타이드 서열을 당업계에 잘 알려져 있는 뉴클레오타이드 서열 조작 방법으로, 예컨대 재조합 DNA 기법, 부위 특이적 돌연변이 유발, PCR 등등(예, Sambrook et al. (1990) Molecular Cloning , A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) 및 Ausubel et al. , eds.(1998) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY, 상기 문헌들은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨)의 방법으로 조작하여, 상이한 아미노산 서열을 가진 항체를 제조할 수 있으며, 예컨대 아미노산 치환, 결손 및/또는 삽입을 수행할 수 있다.
항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는, 비변형 RNA 또는 DNA나 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는, 모든 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 예컨대, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 단일- 및 이중 가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일 가닥일 수 있거나 또는 보다 전형적으로는 이중 가닥인, 또는 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는, DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 구성될 수 있다. 아울러, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA 둘다를 포함하는 3중 가닥 영역으로 구성될 수 있다. 또한, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 안정성이나 또는 다른 이유로 변형된 1종 이상의 변형된 염기, DNA 또는 RNA 벡본을 포함할 수 있다. "변형된" 염기는, 예컨대 트리틸이 도입된 염기와 이노신 등의 특이한 염기를 포함한다. 다양한 변형을 DNA 및 RNA에 가하여, 따라서 "폴리뉴클레오타이드"는 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태를 포함한다.
면역글로불린으로부터 유래된 폴리펩타이드의 비-천연 변이체를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드(예, 면역글로불린 중쇄 부분 또는 경쇄 부분)를, 하나 이상의 아미노산의 치환, 부가 또는 결손이 코딩된 단백질에 도입되도록 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 부가 또는 결손을 면역글로불린의 뉴클레오타이드 서열에 도입함으로써 만들 수 있다. 부위 특이적인 돌연변이 및 PCR 매개 돌연변이 등의 표준 기법에 의해 돌연변이를 도입할 수 있다. 바람직하기로는, 보존적인 아미노산 치환을 하나 이상의 비-필수 아미노산 잔기에 만든다.
V. 융합 단백질 및 항체 접합체
본원에 보다 상세하게 논의되어 있는 바와 같이, 본 발명의 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를, 추가로 N-또는 C- 말단에 이종의 폴리펩타이드가 재조합으로 융합하거나, 또는 폴리펩타이드나 그외 조성물에 화학적으로 접합(공유 및 비-공유 접합 포함)할 수 있다. 예컨대, 항-CD20 항체를 검출 분석에서 표지물질로 이용가능한 분자 및 이종의 폴리펩타이드, 약물, 방사성 핵종 또는 독소 등의 작용자 분자에 재조합으로 융합 또는 접합시킬 수 있다. 예컨대, PCT 공개공보 WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; 미국 특허 5,314,995; 및 EP 396,387을 참조한다.
본 발명의 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는, 즉 공유 부착이 CD20의 항체 결합성을 방해하지 않도록 항체에 모든 타입의 분자를 공유 부착함으로써, 변형된 유도체를 포함한다. 예컨대, 비제한적으로, 항체 유도체는 예컨대 당화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해성 절단, 세포 리간드나 다른 단백질에 연결 등에 의해, 변형된 항체를 포함한다. 임의의 수많은 화학 변형을 공지된 기법으로 수행할 수 있으며, 그 예로는 비제한적으로 특이적인 화학 절단, 아세틸화, 포르밀화, 대사성 투니카마이신 합성 등을 포함한다. 부가적으로, 유도체는 하나 이상의 비-고전적인 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명의 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 펩타이드 결합 또는 변형된 펩타이드 결합, 즉 펩타이드 이소스테르(peptide isostere)에 의해 서로 연결시킨 아미노산으로 구성될 수 있으며, 20개의 유전자-코딩 아미노산 이외의 아미노산을 포함할 수 있다. 항-CD20 항체는 번역후 프로세싱 등의 자연적인 프로세스, 또는 당업계에 잘 알려져 있는 화학 변형 기법에 의해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형은, 기초 문헌에 잘 기술되어 있으며, 전공 논문과 다양한 연구 논문에 상세하게 기재되어 있다. 변형은, 펩타이드 벡본, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복시 말단이나 탄화수소 등의 모이어티 등의 항-CD20 항체의 모든 부위에서도 이루어질 수 있다. 동일한 타입의 변형이 주어진 항-CD20 항체의 여러 부위에 동일하거나 다양한 수준으로 존재할 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 주어진 항-CD20 항체는 수많은 타입의 변형을 포함할 수 있다. 항-CD20 항체는 예컨대 유비퀴닌화의 결과로서 분지될 수 있으며, 이는 분지가 있거나 없는 사이클일 수 있다. 사이클, 분지형 및 분지형의 사이클 항-CD20 항체가 번역 후 천연 프로세스로부터 만들어질 수 있거나, 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 변형은, 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 교차 연결, 사이클화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유 교차 연결 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복시화, 당화, GPI 앵커 형성, 수산화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화, 단백질분해 과정, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 설페이트화, 단백질에 수송-RNA 매개 아미노산 부가, 예컨대 아르지닐화 및 유비퀴틴화를 포함한다(예, Proteins - Structure and Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, NY; 2nd ed. (1993); Johnson, ed. (1983) Posttranslational Covalent Modification of Proteins(Academic Press, NY), pgs. 1-12; Seifter et al. (1990) Meth . Enzymol . 182:626-646; Rattan et al. (1992) Ann . NY Acad . Sci. 663:48-62).
또한, 본 발명은 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체, 및 이종의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 항체가 융합된 이종의 폴리펩타이드는, 기능적으로 유용할 수 있으며, 또는 항-CD20 항체 폴리펩타이드를 발현하는 세포에 타겟하는데 유용하다. 일 예로, 본 발명의 융합 단백질은, 본 발명의 항체의 VH 도메인 중 임의의 하나 이상의 아미노산 서열 또는 본 발명의 항체의 VL 도메인 중 임의의 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 또는 그의 단편이나 변이체, 및 이종의 폴리펩타이드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 다른 예로, 본원에 기술된 진단 및 치료 방법에서 사용하기 위한 융합 단백질은, 항-CD20 항체의 VH 도메인의 CDR 중 임의의 1, 2, 3 개의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체, 또는 항-CD20 항체의 VL 도메인의 CDR 중 임의의 1, 2, 3 개의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체, 및 이종의 폴리펩타이드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일 예에서, 융합 단백질은 본 발명의 항-CD20-특이적인 항체의 VH 도메인의 CDR3의 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드, 또는 그의 단편, 유도체 또는 변이체와, 이종의 폴리펩타이드 서열을 포함하며, 융합 단백질은 시피20의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 다른 예에서, 융합 단백질은 본 발명의 항-CD20 항체의 하나 이상의 VH 도메인의 아미노산 서열 및 본 발명의 항-CD20 항체의 하나 이상의 VL 도메인의 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드, 또는 그의 단편, 유도체 또는 변이체와, 이종의 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 융합 단백질의 VL 도메인 및 VH 도메인은, CD20의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일 소스의 항체(또는 scFv 또는 Fab 단편)에 부합된다. 또다른 예에서, 본원에 기술된 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 융합 단백질은 항-CD20 항체의 VH 도메인의 CDR 중 임의의 1, 2, 3개 이상의 아미노산 서열 및 항-CD20 항체의 VL 도메인의 CDR 중 임의의 1, 2, 3개 이상의 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드, 또는 그의 단편, 변이체와, 이종의 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 바람직하기로는, VH 도메인 또는 VL 도메인의 CDR(들) 중 2, 3, 4, 5개 이상은 본 발명의 단일 소스의 항체(또는 scFv 또는 Fab 단편)에 부합된다. 또한, 이들 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자도 본 발명에 포함된다.
문헌에 보고된 융합 단백질의 예로는, T 세포 수용체의 융합(Gascoigne et al. (1987) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84:2936-2940); CD4(Capon et al. (1989) Nature 337:525-531; Traunecker et al. (1989) Nature 339:68-70; Zettmeissl et al. (1990) DNA Cell Biol . USA 9:347-353; 및 Byrn et al. (1990) Nature 344:667-670); L-셀렉틴(homing receptor)(Watson et al. (1990) J. Cell . Biol . 110:2221-2229; 및 Watson et al. (1991) Nature 349:164-167); CD44(Aruffo et al. (1990) Cell 61:1303-1313); CD28 및 B7(Linsley et al. (1991) J. Exp . Med . 173:721-730); CTLA-4(Lisley et al. (1991) J. Exp . Med . 174:561-569); CD22(Stamenkovic et al. (1991) Cell 66:1133-1144); TNF 수용체(Ashkenazi et al. (1991) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:10535-10539; Lesslauer et al. (1991) Eur. J. Immunol . 27:2883-2886; 및 Peppel et al. (1991) J. Exp . Med . 174:1483-1489); 및 IgE 수용체 a(Ridgway and Gorman(1991) J. Cell . Biol . Vol. 115, Abstract No. 1448)를 포함한다.
본원에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 이종의 폴리펩타이드에 융합시켜, 폴리펩타이드의 생체내 반감기를 증가시키거나, 또는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 면역 분석에 사용할 수 있다. 예컨대, 일 예로, PEG를 본 발명의 항-CD20 항체에 접합시켜, 이의 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다. Leong et al. (2001) Cytokine 16:106; Adv . in Drug Deliv . Rev.(2002) 54:531; 또는 Weir et al. (2002) Biochem . Soc . Transactions 30:512를 참조한다.
아울러, 본 발명의 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를, 이의 정제 또는 검출을 용이하게 하는 펩타이드 등의 마커 서열에 융합시킬 수 있다. 바람직한 예에서, 마커 아미노산 서열은 상업적으로 구입가능한 다수의 물질 중에서, pQE 벡터(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311)에 제시된 텍 등의 헥사-히스티딘 펩타이드이다. 예컨대, Gentz et al. (1989) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86:821-824에 기재된 바와 같이, 헥사-히스티딘이 융합 단백질의 용이한 정제를 제공한다. 정제에 사용가능한 그외 펩타이드 텍으로는, 인플루엔자 헴어글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 해당하는 "HA" 텍(Wilson et al. (1984) Cell 37:767) 및 "flag"텍이 있으나, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
융합 단백질은 당업계에 잘 공지되어 있는 방법으로 제조할 수 있다(예, 미국 특허 5,116,964 및 5,225,538). 융합이 이루어지는 정확한 부위는 융합 단백질의 분비 또는 결합 특성을 최적화하기 위해 실험을 통해 선정될 수 있다. 그런 후, 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 발현용 숙주 세포에 형질감염시킨다.
본 발명의 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 비-접합 형태로 사용할 수 있으며, 또는 예컨대 분자의 치료 특성을 향상시키기 위해, 타겟 검출을 용이하게 하기 위해, 또는 환자에서의 영상화 또는 치료를 위해, 다양한 분자들 중 적어도 하나에 접합시킬 수 있다. 본 발명의 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는, 정제 전, 후, 또는 정제할 때 표지 또는 접합시킬 수 있다.
특히, 본 발명의 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를, 치료 물질, 프로드럭, 펩타이드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 변형제, 약학적 물질 또는 PEG에 접합시킬 수 있다.
당업자는, 접합체는, 접합되는 선택 물질에 따라 다양한 기법을 이용하여 조립할 수 있다. 예컨대, 결합성 폴리펩타이드를 바이오틴 N-하이드록시숙신이미드 에스테르 등의 바이오틴의 활성화된 에스테르와 반응시켜, 바이오틴이 접합된 접합체를 제조한다. 이와 유사하게, 플루오레센트 마커가 있는 접합체는, 커플링제, 예컨대 본원에 기재된 물질의 존재하에 또는 이소티오시아네이트, 바람직하기로는 플루오레세인-이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 접합체는 유사한 방식으로 제조한다.
본 발명은, 진단 또는 치료 물질이 접합된, 본 발명의 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 추가로 포함한다. 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 포함한 항-CD20 항체는, 예컨대, 임상 테스트 과정의 일부로서 질환의 발병 또는 진행을 모니터링하는데, 예컨대 주어진 치료 및/또는 예방 용법의 효능을 결정하는데 진단학적으로 이용할 수 있다. 검출은 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 검출가능한 물질과 커플링함으로써 용이하게 할 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는, 다양한 효소, 보결기(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생발광 물질, 방사성 물질, 다양한 양전자 방출 토모그래피를 이용한 양전자 방출성 금속 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함한다. 예컨대, 본 발명에 따른 치료제로서의 용도로서, 항체에 접합시킬 수 있는 금속 이온에 대한 미국 특허 4,741,900을 참조한다. 적합한 효소의 예로는, 호르세라디시 페록시다제, 알카리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제가 있으며, 적합한 보결기 복합체의 예로는 스트렙트아미딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴이 있으며, 적합한 형광 물질의 예로는 윰벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 있으며, 적합한 발광 물질의 예로는 루미놀이 있으며, 생발광 물질의 예로는 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿠오린이 있으며, 적합한 방사성 물질의 예로는 125I, 131I, 111In, 90Y, 또는 99Tc가 있다.
항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를, 세포독소, 치료성 물질 또는 방사성 금속 이온과 같은 치료적 모이어티에 접합시킬 수 있다. 세포독소 또는 세포독성 물질로는 세포에 유해한 모든 물질을 포함한다. 예로, 셀레늄, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 이메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포사이드(etoposide), 테노포사이드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜치신(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 도노루비신(daunorubicin), 디하이드록시 안트락신 디온(dihydroxy anthracin dione), 미톡산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 액티노마이신(actinomycin) D, 1-데하이드로테스토스테론(1-dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoid), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로프라놀롤(propranolol) 및 퓨로마이신(puromycin), 및 그의 유사체나 상동체를 포함한다. 치료성 물질로는, 항대사산물(antimetabolite)(예, 메톡트렉세이트(methotrexate), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 6-티오구아닌(6-thioguanine), 사이트라빈(cytarabine), 6-플루오로우라실 데카르바진(5-fluorouracil decarbazine)), 알킬화제(alkylating agent)(예, 메클로레타민(mechlorethamine), 티오에파 클로람부실(thioepa chlorambucil), 멜팔란(melphalan), 카르무스틴(carmustine)(BSNU) 및 로무스틴(lomustine)(CCNU), 사이클로토스파미드(cyclothosphamide), 부설판(busulfan), 디브로모만니톨(dibromomannitol), 스트렙토조톡신(streptozotocin), 미토마이신 C(mitomycin C) 및 시스-디클로로디아민 플라티늄(cis-dichlorodiamine platinum)(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(anthracycline)(예, 도노루비신(예전에는 다노마이신(daunomycin)) 및 독소루비신), 항생제(예, 닥티노마이신(dactinomycin)(예전에는 액티노마이신), 블레오마이신(bleomycin), 미트라마이신(mithramycin) 및 안트라마이신(anthramycin)(AMC)), 및 항-유사분열제(anti-mitotic agent)(예, 빈크리스틴(vincristine) 및 빈블라스틴(vinblastine))이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 접합체는 주어진 생물학적 반응을 수정하는데 이용할 수 있다. 약물 모이어티는 고전적인 화학적 치료 물질로 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 예컨대, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 소유한 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 그러한 단백질은, 예컨대 아브린(abrin), 리신 A, 슈도모나스 엑소톡신(pseudomonas exotoxin) 또는 디프테리아 독소 등의 독소; 종양 괴사 인자, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성자 등의 단백질; 또는 예컨대 림포카인, 인터루킨-1("IL-1"), 인터루킨-2("IL-2"), 인터루킨-6("IL-6"), 과리비구 대식세포 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF"), 또는 그외 성장 인자 등의 생물학적 반응 수정제를 포함할 수 있다.
또한, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를, 화학발광 화합물과 이를 커플링시켜, 검출가능하게 표지할 수 있다. 화학발광체가 테깅된 항-CD20 항체의 존재는 이후에, 화학 반응을 수행하는 동안에 발생하는 발광의 존재를 검출함으로써 검출한다. 특히 이용가능한 화학발광체 표지성 화합물로는 루미놀, 이소루미놀, 테로마틱 아크리디늄 에스테르(theromatic acridinium ester), 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르가 있다.
항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 검출가능하게 표지할 수 있는 한가지 방법은, 효소에 이를 연결하고, 효소 면역분석(EIA)에서 연결된 산물을 이용하는 것에 의한 것이다(Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)" Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md.; Diagnostic Horizons(1978) 2:1-7; Voller et al. (1978) J. Clin . Pathol . 31:507-520; Butler(1981) Meth . Enzymol . 73:482-523; Maggio, ed.(1980) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla.; Ishikawa et al. , eds.(1981) Enzyme Immunoassay(Kgaku Shoin, Tokyo). 항-CD20 항체에 결합된 효소는, 예컨대 분광광도계, 형광측정 또는 가시적 수단에 의해 검출할 수 있는 화학 모이어티를 생성시키기 위한 방식으로, 적합한 기질, 바람직하기로는 발색성 물질과 반응시킨다. 항체를 검출가능하게 표지하기 위해 사용할 수 있는 효소로는, 말레이트 탈수소 효소, 스타필로코코스 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라제, 효소 알코올 탈수소 효소, 알파-글리세로포스페이트 탈수소 효소, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 호르세라디시 페록시다제, 알카리 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 유레아제, 카탈라제, 글루코스-6-포스페이트 탈수소 효소, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린에스테라제가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 부가적으로, 검출은 효소에 대한 발색성 기질을 사용하는 색도계 방법에 의해 달성할 수 있다. 또한, 검출은 유사하게 준비한 표준 물질과 비교하여, 기줄의 효소 반응 정도를 가시적으로 비교함으로써 달성할 수 있다.
또한, 검출은 그외 다양한 면역분석 방법들 중 임의의 방법을 이용하여 달성할 수 있다. 예로, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 방사능으로 표지함으로써, 방사면역분석(RIA)을 통한 항체 검출이 가능하다(예, Weintraub(March, 1986) Principles of Radioimmunoassays , Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques (The Endocrine Society), 본 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 비제한적으로, 감마 카운터, 신틸레이션 카운터 또는 오토라디오그래피 등의 수단으로 방사성 동위원소를 검출할 수 있다.
또한, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 152Eu 또는 그외 란탄족 원소 등의 플루오레센스 방출 금속들을 이용하여 검출가능하게 표지할 수 있다. 이들 금속들은 디에틸렌트리아민펜트아세트산(DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로서 이러한 금속 킬레이트화 그룹을 이용하여 항체에 부착시킬 수 있다.
항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 다양한 모이어틸를 접합하는 기법들은 잘 공지되어 있으며, 예컨대, Arnon et al. (1985) "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-56; Hellstrom et al. (1987) "Antibodies for Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2nd ed.; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623-53); Thorpe(1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies ' 84 : Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al. , pp. 475-506; "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al. , Academic Press, pp. 303-16(1985); and Thorpe et al. (1982) "The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates," Immunol . Rev . 62:119-58을 참조한다.
VI. 항체 폴리펩타이드의 발현
항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 서열은, 역전사효소와 DNA 중합효소를 이용하여 잘 알려져 있는 방법에 따라 동시에 또는 각각 제조할 수 있다. PCR은 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA와 아미노산 서열을 기초로 보다 특이적인 프라임에 의해 또는 콘센서스 불변 영역 프라이머에 의해 개시할 수 있다. 전술한 바와 같이, 또한, PCR은 항체 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 분리하기 위해 사용할 수도 있다. 이럴 경우, 콘센서스 프라이머나 마우스 불변 영역 프로브와 같이 더 큰 상동성 프로브에 의해 라이브러리를 스크리닝할 수 있다.
DNA, 전형적으로 플라스미드 DNA는 당업계에 공지된 기법을 이용하여 세포로부터 분리할 수 있으며, 예컨대 재조합 DNA 기법과 관련있는 전술한 참조문헌에 상세하게 기재된 잘 알려져 있는 기법의 표준 방법에 따라 제한 맵핑 및 서열 분석을 수행할 수 있다. 또한, 분리 과정이나 이후의 분석 과정 중에 임의 시점에 본 발명에 따라 DNA를 합성할 수 있다.
본 발명의 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 제공하기 위한 분리한 유전자 물질의 조작 이후에, 항-CD20 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 통상 항-CD20 항체의 바람직한 양을 제조하기 위해 사용할 수 있는 숙주 세포로 도입하기 위한 발현 벡터에 삽입한다.
항체, 또는 그의 단편, 유도체 또는 유사체, 예컨대 본원에 기술된 타겟 분자, 예컨대 CD20에 결합하는 항체의 중쇄나 경쇄의 재조합 발현에는, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터의 구축이 필요하다. 본 발명의, 항체 분자나 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 그의 일부분(바람직하기로는 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인 포함)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 일단 수득되면, 항체 분자를 생산하기 위한 벡터는 당업계에 잘 공지되어 있는 기법을 이용하여 재조합 DNA 기법에 의해 제조할 수 있다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열을 코딩하는 항체를 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 발현에 의해 단백질을 제조하는 방법은 본원에 기술되어 있다. 당업자들에게 잘 알려져 있는 방법들을 이용하여 항체 코딩 서열과 적절한 전사 및 번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이러한 방법으로는, 예컨대, 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체 분자, 그의 중쇄나 경쇄, 또는 중쇄나 경쇄의 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 프로모터에 작동가능하게 연결되게 포함하는, 복제가능한 벡터를 제공한다. 이러한 벡터들은 항체 분자의 불변 영역과 항체의 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있으며, 항체의 가변 도메인을 경쇄 또는 중쇄 전체를 발현하기 위한 벡터에 클로닝할 수 있다(예컨대, PCT Publication WO 86/05807; PCT Publication WO 89/01036; 및 미국 특허 5,122,464).
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 본원에서는 숙주 세포에 원하는 유전자를 도입하여 발현시키기 위한 비히클로서 본 발명에서 사용되는 벡터를 의미한다. 당업자들에게 공지된 바와 같이, 이러한 벡터들은 플라스미드, 파지, 바이러스 및 레트로바이러스로 이루어진 군으로부터 쉽게 선택할 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 사용가능한 벡터는 선별 마커, 원하는 유전자의 클로닝을 용이하게 하기 위한 적절한 제한 부위 및 진핵 또는 원핵 생물의 세포에 도입 및/또는 복제할 수 있는 능력을 포함할 것이다.
본 발명의 목적에서, 수많은 발현 벡터 시스템들을 사용할 수 있다. 어떤 클래스의 벡터는, 예컨대, 소 파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 백시나 바일스, 베큘로바이러스, 레트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바일스 등의 동물 바이러스로부터 유래한 DNA 요소를 이용한다. 그외에, 내부 리보좀 결합 부위를 가진 폴리시스트론 시스템을 이용한다. 부가적으로, DNA가 세포의 염색체에 삽입되는 세포는, 형질감염된 숙주 세포의 선별이 가능한 하나 이상의 마커 도입에 의해 선별할 수 있다. 마커는 영양 요구성 숙주에 대한 원용양성(prototrophy), 살생물제 내성(예, 항생제) 또는 구리 등의 중금속 내성을 제공할 수 있다. 선별 마커 유전자는 발현할 DNA 서열에 직접 연결되거나, 또는 공동-형질전환에 의해 동일한 세포에 도입될 수 있다. 또한, mRNA의 최적 합성을 위해 추가적인 요소들이 필요할 수 있다. 이러한 요소들로는, 신호 서열, 스플라이스 신호 뿐만 아니라 전사 프로모터, 인핸서 및 종결 신호를 포함할 수 있다.
특히 바람직한 예에서, 클로닝한 가변 영역 유전자를 전술한 바와 같이 합성한 중쇄 및 경쇄의 불변 영역 유전자(바람직하기로는 인간)와 함께 발현 벡터에 삽입한다. 물론, 진핵생물의 세포에서 발현을 도출할 수 있는 모든 발현 벡터를 본 발명에 사용할 수 있다. 적합한 벡터의 예로는, 플라스미드 pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, 및 pZeoSV2(Invitrogen, San Diego, CA)과, 플라스미드 pCI(available from Promega, Madison, WI)가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 일반적으로, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 적정하게 높은 수준으로 발현하는 벡터에 대해 다수의 형질전환된 세포를 스크리닝하는 것은 예컨대 로봇 시스템에 의해 수행할 수 있는 통상적인 실험이다.
보다 일반적으로, 항-CD20 항체의 단량체 서브유닛을 코딩하는 벡터 또는 DNA 서열이 일단 제조되면, 발현 벡터를 적정 숙주 세포에 도입할 수 있다. 숙주 세포에 플라스미드 도입은, 당업자들에게 잘 알려져 있는 다양한 기법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 방법으로는, 형질감염(전기천공 포함), 원형질체 융합, 칼슘 포스페이트 침강, 외피로 둘러싸인 DNA와 세포 융합, 미세주입 및 무손상 바이러스의 감염이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. Ridgway(1988) "Mammalian Expression Vectors" in Vectors, ed. Rodriguez and Denhardt(Butterworths, Boston, Mass.), Chapter 24.2, pp. 470-472를 참조한다. 전형적으로, 숙주에 플라스미드 도입은 전기천공을 통해 이루어진다. 발현 벡터를 가지고 있는 숙주 세포는 경쇄 및 중쇄의 제조에 적합한 조건 하에서 키우고, 경쇄 및/또는 중쇄 단백질 합성에 대해 분석한다. 분석 기법의 예로는, 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA), 방사면역분석(RIA) 또는 형광-활성화된 세포 분류 분석(FACS), 면역조직화학방법 등이 있다.
발현 벡터는 통상적인 기법에 의해 숙주 세포에 전달되며, 형질감염된 세포는 통상적인 기법으로 배양하여 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 항체를 생산한다. 즉, 본 발명은 본 발명의 항체, 또는 그의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를, 이종의 프로모터에 작동가능하게 연결되게 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 이중-체인을 형성하는 항체 발현에 있어 바람직한 예로, 중쇄 및 경쇄 둘다를 코딩하는 벡터를 전체 면역글로불린 분자를 발현하기 위한 숙주 세포에서 하기에서 상세히 기술되는 바와 같이, 공동-발현시킬 수 있다.
본원에서, "숙주 세포"는 재조합 DNA 기법으로 구축되었으며 하나 이상의 이종의 유전자를 코딩하는, 벡터를 가지고 있는 세포를 지칭한다. 재조합 숙주로부터 항체를 분리하기 위한 과정에 대한 설명에서, "세포" 및 "세포 배양물"은 명확하게 명시되어 있지 않은 한, 항체의 소스를 나타내기 위해 상호호환적으로 사용된다. 다른 말로, "세포"로부터 폴리펩타이드의 회수는 스핀 다운한 전체 세포 또는 배지와 현탁된 세포 둘다를 포함하는 세포 배양물로부터의 회수를 의미할 수 있다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 이용하여 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 항체 분자를 발현시킬 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 대상 코딩 서열을 제조한 다음 정제하는 비히클을 의미하며, 또한 적절한 뉴클레오타이드 코딩 서열이 형질전환 또는 형질감염되었을 때 정 위치(in situ)에서 본 발명의 항체 분자를 발현할 수 있는 세포를 의미한다. 이러한 것으로는, 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터가 형질전환된 박테리아(예, E. coli, B. subtilis); 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예, 사카로마이세스, 피키아); 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예, 베쿨로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체 코딩 서열을 포함하는, 재조합 바이러스 발현 벡터(예, cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV) 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예, Ti plasmid)로 감염된 식물 세포 시스템; 포유류 세포의 게놈(예, 메탈로티온인 프로모터(metallothionein promoter)) 또는 포유류 바이러스(예, 아데노바이러스 후기 프로모터, 벡시나 바이러스 7.5K 프로모터)로부터 유래된 프로모터를 포함하는 재조합 발현 구조체를 가지고 있는 포유류 세포 시스템(예, COS, CHO, BLK, 293, 3T3 세포) 등의 미생물이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현에는, 바람직하기로는, 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) 등의 박테리아 세포, 더 바람직하기로는 진핵 세포가 재조합 항체 분자 발현을 위해 사용된다. 예로, 중국 햄스터 난소 세포(CHO) 등의 포유류 세포는, 인간 사이토메갈로바이러스 유래의 주요 즉시 초기 유전자 프로모터 인자 등의 벡터와 함께, 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이다(Foecking et al. (1986) Gene 45:101; Cockett et al. (1990) Bio / Technology 8:2).
단백질 발현에 사용되는 숙주 세포주는 흔히 포유류 기원이며, 당업자는 발현시킬 원하는 유전자 산물에 가장 적합한 특정 숙주 세포주를 선호적으로 결정할 수 있는 능력이 있는 것으로 간주된다. 숙주 세포주의 예로는, CHO(중국 햄스터 난소), DG44 및 DUXB11(중국 햄스터 난소 세포주, DHFR minus), HELA(인간 경부 종양), CVI(원숭이 신장 세포주), COS(SV40 T 항원을 가진 CVI 유도체), VERY, BHK(베이비 햄스터 신장), MDCK, 293, WI38, R1610(중국 햄스터 섬유모세포) BALBC/3T3(마우스 섬유모세포), HAK(햄스터 신장 세포주), SP2/O(마우스 골수종), P3x63-Ag3.653(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소 내피세포), RAJI(인간 림프구) 및 293(인간 신장)이 있으나 이들로 한정되는 것은 아니다. 숙주 세포주는 전형적으로 상업적인 서비스, 미국 조직 배양 콜렉션 또는 공개된 문헌으로부터 이용가능한다.
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 바람직한 특이적인 양상으로 유전자 산물을 변형 및 가공하는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 단백질 산물의 이러한 변형(예, 당화) 및 가공(예, 절단)은 단백질 기능에 중요할 수 있다. 여러가지 숙주 세포들은 단백질 및 유전자 산물의 번역 후 가공 및 변형에 있어 특징적으로 특이적인 기작을 가지고 있다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택하여 발현되는 외래 단백질의 정확한 변형과 가공을 보장할 수 있다. 이를 위해, 유전자 산물의 일차 전사, 당화 및 인산화에 대한 합당한 과정 진행을 위한 세포 장치를 가지고 있는 진핵 숙주 세포를 사용할 수 있다.
재조합 단백질의 장기간 고수율의 생산을 위해서는, 안정적인 발현이 바람직하다. 예를 들면, 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주를 조작할 수 있다. 바이러스 복제 기원을 가지고 있는 발현 벡터를 이용하기 보다는, 숙주 세포에, 적절한 발현 조절 요소(예, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선별 마터에 의해 조절된 DNA를 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA를 도입한 다음, 조작한 세포를 농화 배지에서 1-2일간 생장하게 한 다음 선별 배지로 교체한다. 재조합 플라스미드에 포함된 선별 마커는 선택에 대한 내성을 부여하여, 세포에서 플라스미드가 안정적으로 염색체내로 삽입되어 포시(foci)를 형성하며 증식가능하게 해 주며, 이후 클로닝하여 세포주로 증식시키게 해준다. 이러한 방법은 안정적으로 항체 분자를 발현하는 세포주를 조작하는데 이롭게 사용할 수 있다.
비제한적으로, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(Wigler et al. (1977) Cell 11:223), 하이폭산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Szybalska and Szybalski(1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 48:202), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy et al. (1980) Cell 22:817) 유전자 등의 다수의 선별 시스템을 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에 사용할 수 있다. 또한, 항대사산물 내성을 하기 유전자들의 선별 토대로 이용할 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(Wigler et al. (1980) Natl . Acad . Sci . USA 77:357; O'Hare et al. (1981) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:1527); 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(Mulligan and Berg(1981) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:2072); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu(1991) Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev(1993) Ann . Rev . Pharmacol . Toxicol . 32:573-596; Mulligan(1993) Science 260:926-932; 및 Morgan and Anderson(1993) Ann. Rev . Biochem . 62:191-217(1993); TIB TECH 11(5):155-215(May, 1993); 및 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro(Santerre et al. (1984) Gene 30:147). 이용가능한 재조합 DNA 기법 분야에 통상적으로 알려져 있는 방법들은 Ausubel et al. (1993) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY); Kriegler(1990) "Gene Transfer and Expression" in A Laboratory Manual(Stockton Press, NY); Dracopoli et al. (eds)(1994) Current Prolocols in Human Genetics(John Wiley & Sons, NY) Chapters 12 and 13; Colberre-Garapin et al. (1981) J. Mol . Biol . 150:1에 기술되어 있으며, 이들 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가시킬 수 있다(Bebbington and Hentschel(1987) "The Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning"(Academic Press, NY) Vol. 3 참조). 항체를 발현하는 벡터 시스템에서 마커가 증폭가능한 경우, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 저해제의 수준 증가는 마커 유전의 카피 수를 증가시킬 것이다. 증폭되는 영역이 항체 유전자와 조립되어 있기 때문에, 항체의 제조 역시 증가할 것이다(Crouse et al. (1983) Mol . Cell . Biol . 3:257).
시험관내 생산은 원하는 폴리펩타이드를 대량으로 제공하는 규모의 확대가 가능하다. 조직 배양 조건하에서의 포유류 세포 배양 기법들은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 공중 반응기나 연속 교반기 반응기에서 균질적인 현탁 배양이나 예컨대 중공사, 마이크로캡슐, 아가로즈 마이크로비드나 세라믹 카트리지에서의 고정 또는 포획성 세포 배양이 있다. 필요 및/또는 희망에 따라, 폴리펩타이드의 용액을 일반적인 크로마토그래피 방법, 예컨대, 젤 여과, 이온 교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로즈 에서의 크로마토그래피, 또는 (면역-)친화성 크로마토그래피에 의해, 합성 힌지 영역 폴리펩타이드의 우선적인 합성 이후에, 또는 HIC 크로마토그래피 전이나 후에 정제할 수 있다
본 발명의 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 유전자는 또한 박테리아, 효모 또는 식물 세포 등의 포유류 이외의 종의 세포에서 발현시킬 수 있다. 핵산을 쉽게 받아들이는 박테리아로는, 에셔리키아 콜리 또는 살모넬라(Salmonella) 균주 등의 엔테로박테리아과(enterobacteriaceae); 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 등의 바실러스과; 뉴모코커스(Pneumococcus); 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)에 속하는 균주를 포함한다. 박테리아에서 발현시켰을때, 이종의 폴리펩타이드는 전형적으로 봉입체(inclusion body) 일부로 됨을 추가적으로 인지할 것이다. 이종의 폴리펩타이드는 분리 및 정제한 다음 기능성 분자로 조립되어야 한다. 3가 형태의 항체가 바람직한 경우, 서브유닛들을 3가 항체로 자가-조립시킨다(WO　02/096948A2).
박테리아 시스템에서, 발현되는 항체 분자의 의도한 용도에 따라 다수의 벡터를 적합하게 선택할 수 있다. 예컨대, 항체 분자의 약학 조성물 제조를 위해 다량의 단백질을 제조하여야 하는 경우, 쉽게 정제되는 융합 단백질 산물을 고수준으로 발현시키는 벡터가 바람직할 수 있다. 그러한 벡터로는, 항체 코딩 서열이 lacZ 코딩 영역의 프래임 내로 각각 벡터에 삽입되어 융합 단백질이 제조될 수 있는, E. coli 발현 벡터 pUR278(Ruther et al. (1983) EMBO J. 2:1791); pIN 벡터(Inouye and Inouye(1985) Nucleic Acids Res . 13:3101-3109; Van Heeke and Schuster(1989) J. Biol . Chem . 24:5503-5509) 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 pGEX 벡터를 사용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 매트릭스 글루타티온-아가로스 비드에 흡착 및 결합시킨 다음 유리 글루타티온의 존재하에 용리시킴으로써 용혈된 세포로부터 쉽게 정제할 수 있다. pGEX 벡터는, 트롬빈 또는 팩터 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 제작되어, 클로닝한 타겟 유전자 산물을 GST 모이어티로부터 분리시킬 수 있다.
원핵 외에도, 진핵 미생물을 사용할 수도 있다. 다수의 균주들, 예컨대 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 일반적으로 사용할 수 있지만, 진핵 미생물들 중에서도 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)나 일반적인 빵 효모가 가장 흔히 사용된다.
사카로마이세스에서의 발현을 위해, 예로, 플라스미드 YRp7(Stinchcomb et al. (1979) Nature 282:39; Kingsman et al. (1979) Gene 7:141; Tschemper et al. (1980) Gene 10:157)가 가장 일반적으로 사용된다. 이 플라스미드에는 이미 트립토판에서 증식하는 능력이 결핍된 돌연변이 효모, 예 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1(Jones(1977) Genetics 85:12)에 대한 선별 마터를 제공하는, TRP1 유전자가 포함되어 있다. 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서 trpl 부위의 존재는 트립토판 부재에서 증식시켜 형질전환을 검출하기 위한 유효한 환경을 제공한다.
곤충 시스템의 경우, 오토그라파 캘리포르니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcNPV)가 외래 유전자 발현을 위한 벡터로 통상적으로 사용되고 있다. 이 바이러스는 스포돕테라 프루기페라드(Spodoptera frugiperda) 세포에서 증식한다. 항체 코딩 서열을 바이러스의 비-필수 영역(예, 폴리헤드린 유전자)에 각각 클로닝하여, AcNPV 프로모터(예, 폴리헤드린 프로모터)의 통제 하에 위치시킬 수 있다.
본 발명의 항체 분자가 재조합으로 발현되면, 면역글로불린 분자 정제와 관련하여 당업계에 공지된 모든 방법에 의해, 예컨대 크로마토그래피(예, 이온 교환, 친화성, 특히 특이적인 항원과 이후의 단백질 A에 대한 친화성 및 크기차 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 용해도 차이(differential solubility), 또는 그외 표준적인 단백질 정제 기법에 의해 정제할 수 있다. 다른 예로, 본 발명의 항체 친화성을 증가시키기 위한 바람직한 방법들이 미국 특허 공개번호 2002 0123057 A1에 기재되어 있다.
VII. 치료적 항-CD20 항체를 이용한 치료 방법
본 발명의 방법은, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 및 유도체의, CD20-발현성 세포와 관련있는 질환을 가진 환자를 치료하기 위한 용도에 관한 것이다. "CD-발현성 세포"는 CD20 항원을 발현하는 정상 및 악성 B 세포를 의미한다. 세포에서 CD20 발현을 검출하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, PCR 기법, 면역조직화학, 유세포측정, 웨스턴 블롯, ELISA 등을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. "악성" B 세포는 모든 종양성 B 세포를 의미하며, 저등급, 중등급, 및 고등급의 B 세포 림프종 등의 림프종, 면역모구성 림프종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 질환, 엡스타입 바르 바이러스(EBV) 유발성 림프종 및 AIDS 관련 림프종 뿐만 아니라 B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 골수종, 만성 림프성 백혈병, 급성 골수모구성 백혈병 등으로부터 유래된 B 세포가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
하기 내용은 본 발명의 항-CD20 항체를 이용한 다양한 질병 및 장애의 진단법 및 치료법에 관한 것이지만, 본원에 기술된 방법들은 또한 본 발명의 항-CD20 항체의 바람직한 특성, 즉 CD 20에 대한 특이적인 결합력, CDC 활성 증가 및/또는 CD20 항원에 대한 결합 친화성 증가를 유지하는 이들 항-CD20 항체의 항원-결합 단편, 변이체 및 유도체에도 적용가능한다.
"치료"는 본원에서 화자에게 항-CD20 항체의 적용 또는 투여, 또는 환자로부터 분리한 조직 또는 세포주에 항-CD20 항체의 적용 또는 투여로서 정의되며, 상기 환자는 질환, 질환 증상 또는 질환에 걸릴 경향이 있으며, 목적은 질환, 질환의 증상 또는 질환에 걸릴 경향의 치유, 해소, 완화, 경감, 변화, 구제, 개선, 향상 또는 영향을 미치는 것이다. "치료"는 또한 항-CD20 항체를 포함하는 약학 조성물의 환자에 적용 또는 투여, 또는 환자로부터 분리한 조직 또는 세포주에 항-CD20 항체를 포함하는 약학 조성물의 적용 또는 투여로 의도되며, 환자는 질환, 질환 증상 또는 질환에 걸릴 경향이 있으며, 목적은 질환, 질환의 증상 또는 질환에 걸릴 경향의 치유, 해소, 완화, 경감, 변화, 구제, 개선, 향상 또는 영향을 미치는 것이다.
"항-종양 활성"은 악성 CD20-발현성 세포의 증식율 또는 축적율 감소와 그에 따른 기존 종양이나 치료하는 동안에 발생하는 종양의 증식율 감소, 및/또는 기존 신생물(종양) 세포나 새로 생긴 신생물 세포의 파괴, 및 그에 따른 치료중이 종양의 총 크기 감소를 의미한다. "항-염증 활성"은 염증의 감소 또는 예방을 의미한다. 하나 이상의 항-CD20 항체를 이용한 치료는 인간에서 CD20-발현성 세포와 관련있는 질병 상태의 치료에 이로운 생리 반응을 초래한다.
이러한 방식으로, 본 발명의 방법은 비정상적이고 통제불가능한 B 세포의 증식 또는 축적과 관련있는 비-호지킨 림프종의 치료에 이용한다. 본 발명의 목적에 있어, 이러한 림프종은 실용 공식(Working Formulation) 분류 체계에 따라 지칭되며, B 세포 림프종은 저등급, 중등급 및 고등급으로 분류된다("The Non-Hodgkin's Lymphoma Pathologic Classification Project" in Cancer 49:2112-2135(1982)). 따라서, 저등급의 B 세포 림프종은 작은 림프성, 여포성 소분할 세포(small lymphocytic, follicular small-cleaved cell) 및 여포성 소분할 및 대세포 혼합(follicular mixed small-cleaved and large cell lymphoma)을 포함하며, 중등급 림프종은 여포성 대세포, 미만성 소분할 세포(diffuse small cleaved cell), 미만성 소세포 및 대세포 혼합, 및 미만성 대세포 림프종을 포함하며, 고등급 림프종은 버킷 및 비-버킷 타입의 대세포 면역모구성, 림프모구성 및 소 비분할 세포 림프종을 포함한다.
본 발명의 방법은 REAL(Revised European and American Lymphoma Classification) 시스템에 따라 분류되는 B 세포 림프종의 치료학적 치료에 이용가능한 것으로 보인다. 이러한 B 세포 림프종으로는, B 림프모구성 백혈병/림프종과 같은 전구 B 세포 종양; B 세포 만성 림프성 백혈병/소 림프성 림프종, 림프형질세포성(lymphoplasmacytoid) 림프종/면역종(immunocytoma), 멘틀 세포 림프종(MCL), 여포 중심 림프종(여포형)(미만성 소세포, 미만성 소세포 및 대세포 혼합 및 미만성 대세포 림프종 포함), 변연대(marginal zone) B 세포 림프종(림프절외, 절의 및 비장형 포함), 모발형 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 형질세포종(plasmacytoma)/골수종, 서브타입 원발성 종격동(primary mediastinal)(흉선)의 미만성 대세포 B 세포 림프종, 버킷 림프종 및 버킷 유사 고등급의 B 세포 림프종 등의 말초 B 세포 종양; 급성 림프성 백혈병; 골수모구성 백혈병; 급성 골수구성 백혈병; 전골수성 백혈병; 골수단핵구성 백혈병; 단핵구성 백혈병; 적백혈병; 과립구성 백혈병(만성 골수성 백혈병); 만성 림프성 백혈병; 적혈구 증가증(polycythemia vera); 다발성 골수종; 발덴스트롬의 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia); 중쇄 질환(heavy chain disease); 및 분류가 불가능한 저등급 또는 고등급 B 세포 림프종이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 치료하는 중에 발생하는 추가적인 종양 생장을 예방하는데 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 본 발명의 방법은 저등급 B 세포 림프종을 가진 개체, 특히 표준적인 화학요법 후에 재발생한 개체를 치료하는데 특히 유용하다. 저등급 B 세포 림프종은 중등급 및 고등급의 B 세포 림프종 보다 더 느리며, 재발/재현 코스가 특징적이다. 따라서, 이러한 림프종의 치료는 재발 현상이 횟수와 중증도에서 감소되기 때문에, 본 발명의 방법을 이용하여 개선된다.
본 발명의 방법에 있어서, 본원에서 정의된, 하나 이상의 항-CD20 항체를 이용하여 악성 인간 B 세포에 대한 긍정적인 치료 반응을 촉진시킨다. 암 치료에서 "긍정적인 치료 반응"은 이들 항체 또는 그 단편의 항-종양 활성이 관련있는 질병의 개선 및/또는 질병 관련 증상의 개선을 의미한다. 즉, 항-증식 작용, 추가적인 종양 생장 예방, 종양 크기 감소, 암세포 수 감소 및/또는 질병과 관련있는 한가지 이상의 증상 감소를 관찰할 수 있다. 따라서, 예컨대 질병 개선은 완전 관해(complete response)로서 특정화할 수 있다. "완전 관해"는 임상적으로 검출할 수 있는 질환이 없으며, 기존의 모든 비정상적인 방사선촬영 연구, 골수 및 뇌척수액(CSF)의 정상화를 의미한다. 이러한 관해는 본 발명의 방법에 따라 치료한 지 적어도 1달 동안 지속되어야 한다. 다른 예로, 질환 개선은 부분 관해로서 분류될 수 있다. "부분 관해"는 새로운 병소 없이 적어도 1달간 지속되는, 모든 측정가능한 종양 부하(즉, 개체에 존재하는 종양 세포의 수)의 적어도 약 50% 감소를 의미한다. 이러한 관해는 측정가능한 종양에만 적용가능하다.
종양 반응은 자기 공명 영상화(MRI) 스캔, X-방사선촬용 영상화, 컴퓨터 토모그래프(CT) 스캔, 생발광 영상화, 예컨대 루시퍼라제 영상화, 골 스캔 영상화 및 골수 흡입(BNA) 등의 종양 생검 샘플링 방법을 이용하여 종양의 형태적(즉, 총 종양 부하, 종양 크기 등) 변화로 평가할 수 있다. 이러한 긍정적인 치료 반응 뿐만 아니라, 항-CD20 항체를 이용한 치료법을 받고 있는 개체는 질병 관련 증상 개선에 이로운 효과를 경험할 수 있다. 따라서, B 세포 종양의 경우, 개체는 이른바 B 증상, 즉 야간 발한, 열, 체중 감소 및/또는 두드러기 감소를 경험할 수 있다.
또한, 본원에 기술된 항-CD20 항체는, 비제한적으로 전신 홍반성 루푸스, 건선, 경피증, CREST 증후군, 염증성 근염, 쇼그렌 증후군, 혼성 결합 조직 질환, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 염증성 잘 질환, 급성 호흡 곤란 증후군, 폐 염증, 특발성 폐 섬유증, 골다공증, 지연형 과민증, 천식, 원발성 담도 경화증, 및 특발성 혈소판감소성 자반증 등의, 염증 질환의 치료 및 CD-20 발현 세포와 관련있는 면역 시스템의 결핍 또는 장애 치료에서 이용을 찾을 수 있다.
염증 질환은 염증 및 조직 파괴 또는 이의 조합이 특징적이다. "염증 질환"은 면역 반응의 개시 현상 또는 타겟이 예컨대 동종항원, 이종항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 미확인 항원 또는 알레르기 유발원 등의 비-자가 항원(들)인, 모든 염증성 면역-매개 과정을 포함한다.
아울러, 본 발명의 목적에서, 용어 "염증 질환(들)"은 "자가면역 질환(들)"을 포함한다. 본원에서, 용어 "자가면역"은 일반적으로 "자기" 항원이 관여하는 염증성 면역-매개 과정을 망라하는 것으로 이해된다. 자가면역 질환에서, 자기항원(들)은 숙주 면역 반응을 촉발시킨다.
또한, 본 발명은 조직 이식 거부 반응과 관련있는 염증의 치료를 포함한다. "이식 거부 반응" 또는 "그래프트 거부(graft rejection)"는 비제한적으로, HLA 항원, 혈액 그룹 항원 등의 그래프트에 대한 모든 숙주에 나타난 면역 반응(host-mounted immune response)을 의미한다.
또한, 본 발명을 이용하여 예컨대 골수 이식과 관련있는 질환 등의 이식 편대 숙주 질환을 치료할 수 있다. 이러한 이식 편대 숙주 질환에서, 공여 골수는 림프구와 림프구로 성숙되는 세포를 포함한다. 공여체의 림프구는 수여체의 항운을 비-자기로 인지하여, 염증성 면역 반응을 발생시킨다. 그래서, 본원에서, "이식 편대 숙주 질환" 또는 "이식 편대 숙주 반응"은 공여 림프구가 숙주의 항운에 반응하는 모든 T 세포 매개의 면역 반응을 의미한다.
본원에 기술된 항-CD20은 본 발명의 방법에 따라 사용하여, 비제한적으로 전신성 홍반 루푸스(SLE), 원판성 루푸스(discoid lupus), 루푸스 신염, 유육종증 등의 자가면역 및/또는 염증 장애, 청소년 관절염, 류마티스 관절염, 건선 관절염, 라이터 증후군, 강직성 척추염 및 통풍성 관절염 등의 염증성 관절염, 장기 또는 조직 이식 거부, 최급성, 급성 또는 만성 거부 및/또는 이식 편대 숙주 질환, 다발성 경화증, 과다 IgE 증후군, 결절성 다발동맥염(polyarteritis nodosa), 원발성 담증성 경변, 염증성 장 질환, 크론 질환, 셀리악병(글루텐-민감성 장질환), 자가면역 간염, 악성 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈, 건선, 경피증, 근무력증, 자가면역 혈소판감소성 자반증, 자가면역 갑상선염, 그레이브 질환, 하시모토 갑상선염, 면역 복합 질환, 만성 피로 기능부전 증후군(CFIDS), 다발성 근염, 피부근염, 한랭 글로불린혈증, 혈전 용해, 심근증, 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 폐 사이질조직 섬유증, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 1, 2, 3 및 4형 지연성 과민증, 알레르기 또는 알레르기 장애, 치료 단백질에 대한 원치 않은/의도하지 않은 면역 반응(예, 미국 특허 출원번호 US 2002/0119151 및 Koren, et al. (2002) Curr . Pharm . Biotechnol . 3:349-60), 천식, 처그-스트라우스 증후군(알레르기 육아종증), 아토피 피부염, 알레르기 및 자극제 접촉 피부염, 두드러기, IgE-매개 알레르기, 죽상동맥경화, 혈관염, 특발성 염증 근질환, 용혈성 질환, 알츠하이머 질환, 만성 염증성 탈수초 다발성 신경병증 등을 치료할 수 있다. 일부 다른 예에서, 본 발명의 항-CD20 항체는, 비제한적으로, 폐 이식 거부, 천식, 유육종증, 폐기종, 낭성 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 만성 기관지염, 알레르기 비염 및 과민감성 폐렴, 호산성 폐렴, 골수 및/또는 폐 이식 또는 그외 원인으로 인한 폐쇄성 세기관지염, 그래프트 죽상동맥경화/그래프트 정맥 경화증 뿐만 아니라 콜라겐으로 발생하는 폐 섬유증, 혈관성 및 자가면역 질환, 예컨대 류마티스 관절염 및 홍반성 루푸스 등의, 폐 염증 치료에 이용가능하다.
본 발명의 방법에 있어서, 본원에서 정의된 항-CD20 항체 하나 이상을 사용하여, 자가면역 질환 및/또는 염증 질환의 치료 또는 예방에 대한 긍정적인 치료 반응을 촉진시킨다. 자가면역 질환 및/또는 염증 질환과 관련하여 "긍정적인 치료 반응"은, 이들 항체의 항염증 활성과 관련있는 질환의 개선 및/또는 질병과 관련있는 증상 개선을 의미한다. 즉, 항-증식 효과, CD20-발현성 세포의 추가적인 증식 예방, 비제한적으로 염증성 사이토카인, 유착 분자, 프로테아제, 면역글로불린(예컨대 CD20을 가지고 있는 세포가 B 세포인 경우), 이들의 조합 등의 면역 반응 감소, 항염증 단백질의 생산 증가, 자가반응성 세포의 수 감소, 면역 허용성 증가, 자가반응성 세포 생존 저해 및/또는 CD-발현성 세포의 자극에 의해 매개되는 하나 이상의 증상 감소를 관찰할 수 있다. 이러한 긍정적인 치료 반응은, 투여 경로에 국한되지 않으며, 공여체, 공여체 조직(예, 장기 관류), 숙주, 이들의 조합 등에 대한 투여를 포함한다.
임상 반응들은 자기 공명 영상화(MRI) 스캔, X-방사선촬용 영상화, 컴퓨터 토모그래프(CT) 스캔, 유세포 측정 또는 형광-활성화된 세포 분류(FACS) 분석, 조직, 육안 병리 소견 및 혈액 화학법 등의 스크리닝 기법으로 평가할 수 있으며, 비제한적으로 ELISA, RIA, 크로마토그래피 등을 포함한다. 이러한 긍정적인 치료 반응 외에도, 항-CD20 항체나 그의 항원-결합 단편을 이용한 치료를 받고 있는 개체는 질환과 관련된 증상 개선의 유익한 효과를 경험할 수 있다.
"치료적 유효 용량 또는 치료적 유효량" 또는 "유효량"은 CD20-발현성 세포와 관련있는 질환을 가지고 있는 환자 치료에 있어, 투여하였을 때 긍정적인 치료 방응을 불러일으키는 항-CD20 항체의 함량이다. 본 발명의 일부 예들에서, 항-CD20 항체의 치료적 유효량은 약 0.01 mg/kg - 약 40 mg/kg, 약 0.01 mg/kg - 약 30 mg/kg, 약 0.1 mg/kg - 약 30 mg/kg, 약 1 mg/kg - 약 30 mg/kg, 약 3 mg/kg - 약 30 mg/kg, 약 3 mg/kg - 약 25 mg/kg, 약 3 mg/kg - 약 20 mg/kg, 약 5 mg/kg - 약 15 mg/kg, 또는 약 7 mg/kg - 약 12 mg/kg의 범위이다. 치료 방법은 항-CD20 항체의 치료적 유효 용량의 다중 투여 또는 치료적 유효량의 1회 투여를 포함할 수 있는 것으로 생각된다.
항-CD20 항체는 공지의 화학치료제 및 사이토카인과 조합하여 CD20-발현성 세포를 포함하는 질환 상태의 치료에 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 항-CD20 항체는 인터루킨-2 등의 사이토카인과의 조합으로 사용할 수 있다. 다른 예로, 본 발명의 항-CD20 항체는 리툭시맵(IDEC-C2B8; Rituxan® IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, California)과 조합하여 사용할 수 있다.
이러한 방식으로, 본원에 기술된 항-CD20 항체는 비제한적으로 외과 또는 외과적 시술(예, 비장 절제술, 간 절제술, 림프절 절제술, 루코포레시스(leukophoresis), 골수 이식 등); 방사선 치료; 선택적으로 자가 골수 이식과 조합한 화학치료로서, 적합한 화학치료 물질로는, 플루다라빈(fludarabine) 또는 플루다라빈 포스페이트, 클로람부실, 빈크리스틴, 펜토스타틴, 2-클로로데옥시아데노신(cladribine), 사이클로포스파미드, 독소루비신, 프레드니손 및 이의 조합, 예컨대, CAP(사이클로포스파미드, 독소루비신 + 프레드니손), CHOP(사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손 + 독소루비신), VAD(빈크리스틴, 독소루비신 + 덱사메타손), MP(멜팔란 + 프레드니손) 등의 안트라사이클린-함유성 요법, 및 미톡산트론, 다우노루비신, 이다루비신, 아스파라기나제 및 항대사산물 등의 화학치료에 사용되는 그외 세포독성 및/또는 치료 물질, 예컨대, 사이타라빈, 메톡트렉세이트, 5-플루오로우라실, 데카르바진, 6-티오구아닌, 6-머캅토퓨린 및 넬라라빈을 포함하는, 화학 치료; 그외 항암 단일클론 항체 요법(예, 알렘투주맵(alemtuzumab)(Campath®) 또는 그외 악성 B 세포상의 CD52 세포-표면 당단백질을 타겟으로 하는 항-CD52 항체; rituximab(Rituxan®), 전체 인간 항체 HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, 토시투모맵(tositumomab)/I-131 토시투모맵(Bexxar®), 이브리투모맵(ibritumomab) 티욱세탄(tiuxetan)(Zevalin®), 또는 악성 B 세포 상의 CD20항원을 타겟으로 하는 그외 모든 치료적 항-CD20 항체; 항-CD19 항체(예, MT103, 2중 특이 항체); 항-CD22 항체(예, 인간화 단일클론 항체, 에프라투주맵(epratuzumab)); 베바시주맵(bevacizumab)(Avastin®) 또는 인간 혈관 내피 성장 인자를 타겟으로 하는 그외 항암 항체; 악성 B 세포 상의 CD22를 타겟으로 하는 항-CD22 항체(예, 단일클론 항체 BL-22, alphaCD22 톡신); 대식세포 콜로니 자극 인자를 타겟으로 하는 알파-M-CSF 항체; 다발성 골수종에서 과다 발현되는, 핵 인자-kappaB(RANK)의 수용체 및 그것의 리간드(RANKL)에 대한 활성자를 타겟으로 하는 항체; 악성 B 세포 상의 CD23 항원을 타겟으로 하는 항-CD23 항체(예, IDEC-152); CD38 항원을 타겟으로 하는 항-CD80 항체(예, IDEC-114); 악성 B 세포 상의 CD38 항원을 타겟으로 하는 항-CD38 항체; 악성 B 세포에서 발현된 주조직적합성 복합체 클래스 II 수용체를 타겟으로 하는 항체(항-MHC 항체); 악성 B 세포 상의 CD40 항원을 타겟으로 하는 항-CD40 항체(예, SGN-40); 및 종양 괴사 인자-관련 세포자살-유발성 리간드 수용체 1(TRAIL-R1)을 타겟으로 하는 항체(예, 작용자성 인간 단일클론 항체 HGS-ETR1) 및 다수의 고형암과 조혈 기원의 종양에서 발현되는 TRAIL-R2를 타겟으로 하는 항체); 소분자-근간의 암 치료, 예컨대 비제한적으로, 마이크로튜불 및/또는 토포이소머라제 저해제(예, 유사세포분열 저해자인 돌라스타틴과 돌라스타틴 유사체; 투불린-결합성 물질 T900607; XL119; 및 토포이소머라제 저해자인 아미노캄토테신), SDX-105(벤다무스틴 하이드로클로라이드(bendamustine hydrochloride)), 이사베필론(ixabepilone)(에포틸론(epothilone) 유사체, 또한 BMS-247550이라 함), 단백질 키나제 C 저해자, 예컨대 미도스타우린(midostaurin)((PKC-412, CGP 41251, N-벤조일스타우로스포린(benzoylstaurosporine)), 픽산트론(pixantrone), 엘로사틴(eloxatin)(항-신생물제), 가니트(ganite)(갈륨 니트레이트), 탈로미드(Thalomid)®(thalidomide), 탈리도미드의 면역조절 유도체(예, 레블리미드(revlimid)(옛 명칭 레비미드(revimid))), Affinitak™(단백질 키나제 C-알파의 안티센스 저해제), SDX-101(R-에토돌락(etodolac), 악성 림프구의 세포자살 유도), 2세대 퓨린 뉴클레오사이드 유사체, 예컨대 클로파라빈(clofarabine), 암 세포에 의한 단백질 Bcl-2의 생산 저해제(예, 안티센스 물질 오블리메르센(oblimersen) 및 Genasense®), 프로테오좀 저해제(예, Velcade™(bortezomib)), 소분자 키나제 저해제(예, CHIR-258), 소분자 VEGF 저해제(예, ZD-6474), 열 충격 단백질(HSP) 90의 소분자 저해제(예, 17-AAG), 히스톤 탈아세틸라제의 소분자 저해제(예, 하이브리드/극성 세포분화(cytodifferentiation) HPC) 물질, 예컨대 서베라닐로하이드록삼산(suberanilohydroxamic acid: SAHA), 및 FR-901228) 및 세포자살 물질, 예컨대 Trisenox®(3산화 비소) 및 Xcytrin®(모테사핀 가돌리늄(motexafin gadolinium)); 백신/면역치료적 암 치료, 예컨대 비제한적으로 백신 접종(예, Id-KLH, 오코파지(oncophage), 비탈레틴(vitalethine)), 개인화된 면역치료 또는 활성 개별 면역치료(active idiotype immunotherapy)(예, MyVax® Personalized Immunotherapy, 옛 명칭 GTOP-99), Promune®(CpG 7909, toll 유사 수용체 9(TLR9)에 대한 합성 작용자), 인터페론-알파 치료, 인터루킨-2(IL-2) 치료, IL-12 치료, IL-15 치료, 및 IL-21 치료; 스테로이드 치료; 또는 그외 암 치료 등을 비제한적으로 포함하는, 한가지 이상의 암 치료와 조합하여 투여하며, 부가적인 암 치료는 항-CD20 항체 치료 전, 치료 중, 치료 후에 투여된다.
따라서, 항-CD20 항체를 다른 치료 물질의 투여와 조합하여 투여하는 것을 포함하는 경우, 화학치료, 방사선 치료, 그외 항암 항체 치료, 소분자-근간으로한 암 치료 또는 백신/면역치료를 기초로한 암 치료와 같이, 본 발명의 방법은 분리 제형 또는 하나의 약학 제형을 이용하여 2가지 순서로 연속 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법이 조합된 치료 요법을 포함하는 경우, 이들 치료는 동시에, 즉 항-CD20 항체를 다른 암 치료제와 동시에 또는 동일한 시간대(즉, 치료들은 동시에 진행되지만, 항-CD20 항체는 다른 암 치료제와 정확히 동시에 투여되진 않음)에 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 항-CD20 항체는 다른 암 치료 전에 또는 이후에 투여할 수 있다. 여러가지 암 치료의 순서적 투여는 치료받은 개체가 1차 치료 코스에 반응하여 재발 또는 재현 가능성을 감소시키는지와는 관계없이, 수행할 수 있다. 조합 치료가 항-CD20 항체와 세포독성 물질의 투여와 조합한 투여를 포함할 때, 바람직하기로는, 항-CD20 항체는 세포독성 물질을 투여하기 전에 투여한다.
본 발명의 일부 예에서, 본원에 기술된 항-CD20 항체는 화학치료와 조합하여 투여되며, 선택적으로는 자가 골수 이식과 조합하며, 여기에서 항체와 화학치료 물질(들)은 2가지 순서로 순서대로, 또는 동시에(즉, 동시 또는 동일한 시간대에) 투여할 수 있다. 적합한 화학치료 물질의 예로는, 플루다라빈 또는 플루다라빈 포스페이트, 클로람부실, 빈크리스틴, 펜토스타틴, 2-클로로데옥시아데노신(cladribine), 사이클로포스파미드, 독소루비신, 프레드니손 및 이의 조합, 예컨대, CAP(사이클로포스파미드, 독소루비신 + 프레드니손), CHOP(사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손 + 독소루비신), VAD(빈크리스틴, 독소루비신 + 덱사메타손), MP(멜팔란 + 프레드니손) 등의 안트라사이클린-함유성 요법, 및 미톡산트론, 다우노루비신, 이다루비신, 아스파라기나제 및 항대사산물 등의 화학치료에 사용되는 그외 세포독성 및/또는 치료 물질, 예컨대, 사이타라빈, 메톡트렉세이트, 5-플루오로우라실, 데카르바진, 6-티오구아닌, 6-머캅토퓨린 및 넬라라빈을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 일부 예에서, 항-CD20 항체는 화학치료 물질로 치료하기 전에 투여된다. 다른 예로, 항-CD20 항체는 화학치료 물질로 치료한 후에 투여된다. 또다른 예로, 화학치료 물질은 항-CD20 항체와 동시에 투여된다.
따라서, 예컨대, 일부 예들에서, 항-CD20 항체는 플루다라빈이나 플루아다빈 포스페이트와 조합하여 투여된다. 이러한 일 예에서, 항-CD20 항체는 플루다라빈이나 플루아다빈 포스페이트의 투여 전에 투여된다. 다른 예로, 항-CD20 항체는 플루다라빈이나 플루아다빈 포스페이트로 치료한 후에 투여된다. 또다른 예에서, 플루다라빈이나 플루아다빈 포스페이트는 항-CD20 항체와 동시에 투여된다.
본 발명의 다른 예에서, 알킬화 약물이 클로람부실은 본원에 기재된 항-CD20 항체와 조합 투여된다. 이러한 일 예에서, 항-CD20 항체는 클로람부실 투여 전에 투여된다. 다른 예에서, 항-CD20 항체는 클로람부실로 치료한 후에 투여된다. 또다른 예에서, 항-CD20 항체는 클로람부실과 동시에 투여된다.
또다른 예에서, CAP(사이클로포스파미드, 독소루비신 + 프레드니손) 및 CHOP(사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손 + 독소루비신)와 같은 안트라사이클린-함유성 요법은 본 발명에 기술된 항-CD20 항체의 투여와 조합할 수 있다. 이러한 일 예에서, 항-CD20 항체는 안트라사이클린-함유성 요법으로 치료하기 전에 투여된다. 다른 예에서, 항-CD20 항체는 안트라사이클린-함유성 요법으로 치료한 후에 투여된다. 또다른 예에서, 안트라사이클린-함유성 요법은 항-CD20 항체와 동시에 투여된다.
다른 예에서, 본원에 기술된 항-CD20 항체는, 알렘투주맵(Campath® Berlex Laboratories, Richmond, California)과 조합하여 투여된다. 알렘투주맵은 악성 B 세포 상에서 발현되는 CD52 항체를 타겟으로 하는 재조합 인간화 단일클론 항체(Campath-1H)이다. 이러한 일 예에서, 항-CD20 항체는 알렘투주맵의 투여 전에 투여된다. 다른 예로, 항-CD20 항체는 알렘투주맵으로 치료한 후에 투여된다. 또다른 예에서, 알렘투주맵은 항-CD20 항체와 동시에 투여된다.
다른 예로, 본원에 기술된 항-CD20 항체는, 악성 B 세포 상의 CD20 항원을 타겟으로 하는 다른 치료적 항-CD20 항체, 예컨대, 리투시맵(Rituxan®), 완전한 인간 항체 HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, 토시투모맵(tositumomab)/I-131 토시투모맵(Bexxar®), 또는 이브리투모맵 티우세탄(Zevalin®)과 조합하여 투여된다. 이러한 일 예에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 다른 항-CD20 항체의 투여 전에 투여된다. 다른 예로, 항-CD20 항체는 다른 항-CD20 항체로 치료한 후에 투여된다. 또다른 예에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 다른 항-CD20 항체와 동시에 투여된다.
다른 예로, 본원에 기술된 항-CD20 항체는, 비제한적으로, 마이크로튜불 및/또는 토포이소모라제 저해제(예, 유사분열 저해제인 돌라스타틴 및 돌라스타틴 유사체; 튜물린-결합성 물질 T900607; XL119; 및 토포이소머라제 저해자인 아미노캄토테신), SDX-105(벤다무스틴 하이드로클로라이드), 이사베필론(에포틸론 유사체, 또한 BMS-247550이라 함), 단백질 키나제 C 저해자, 예컨대 미도스타우린((PKC-412, CGP 41251, N-벤조일스타우로스포린), 픽산트론, 엘로사틴(항-신생물제), 가니트(갈륨 니트레이트), 탈로미드®(thalidomide), 탈리도미드의 면역조절 유도체(예, 레블리미드(옛 명칭 레비미드)), Affinitak™(단백질 키나제 C-알파의 안티센스 저해제), SDX-101(R-에토돌락, 악성 림프구의 세포자살 유도), 2세대 퓨린 뉴클레오사이드 유사체, 예컨대 클로파라빈, 암 세포에 의한 단백질 Bcl-2의 생산 저해제(예, 안티센스 물질 오블리메르센 및 Genasense®), 프로테오좀 저해제(예, Velcade™(bortezomib)), 소분자 키나제 저해제(예, CHIR-258), 소분자 VEGF 저해제(예, ZD-6474), 열 충격 단백질(HSP) 90의 소분자 저해제(예, 17-AAG), 히스톤 탈아세틸라제의 소분자 저해제(예, 하이브리드/극성 세포분화 HPC) 물질, 예컨대 서베라닐로하이드록삼산(SAHA), 및 FR-901228) 및 세포자살 물질, 예컨대 Trisenox®(3산화 비소) 및 Xcytrin®(모테사핀 가돌리늄) 등의, 소분자-근간의 암 치료와 조합하여 투여된다. 이러한 일 예에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 소분자-근간의 암 치료의 투여 전에 투여된다. 다른 예로, 항-CD20 항체는 소분자-근간의 암 치료로 치료한 후에 투여된다. 또다른 예에서, 소분자-근간의 암 치료는 항-CD20 항체와 동시에 투여된다.
또다른 예에서, 본원에 기술된 항-CD20 항체는, 비제한적으로 백신 접종(예, Id-KLH, 오코파지(oncophage), 비탈레틴(vitalethine)), 개인화된 면역치료 또는 활성 개별 면역치료(active idiotype immunotherapy)(예, MyVax® Personalized Immunotherapy, 옛 명칭 GTOP-99), Promune®(CpG 7909, toll 유사 수용체 9(TLR9)에 대한 합성 작용자), 인터페론-알파 치료, 인터루킨-2(IL-2) 치료, IL-12 치료, IL-15 치료, 및 IL-21 치료, 또는 스테로이드 치료를 포함하는, 백신/면역치료-기반의 암 치료와 조합하여 투여된다. 이러한 일 예에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 백신/면역치료-기반의 암 치료의 투여 전에 투여된다. 다른 예로, 항-CD20 항체는 백신/면역치료-기반의 암 치료로 치료한 후에 투여된다. 또다른 예에서, 백신/면역치료-기반의 암 치료는 항-CD20 항체와 동시에 투여된다.
이러한 일 예에서, 본원에 기술된 항-CD20 항체는 IL-2와 조합하여 사용될 수 있다. IL-2는 처리한 환자들에서 많은 수의 천연 살상자(NK) 작용자 세포를 증폭시키는 것으로 알려져 있는 물질로서, 본 발명의 항-CD20 항체 전에 또는 동시에 투여할 수 있다. 증폭된 다수의 NK 작용자 세포들은 투여한 항-CD20 항체의 ADCC 활성 강화를 유도할 수 있다. 다른 예에서, IL-21은 본원에 기술된 항-CD20 항체와 조합 투여시, NK 세포 활성을 자극하기 위한 면역치료 물질로서 제공된다.
본 발명의 항-CD20 항체는 자가면역 및 염증 질환에 사용가능한 것으로 알려져 있거나, 자가면역 및 염증 질환의 치료를 위해 사용되었거나 현재 사용중인, 모든 물질, 또는 이의 조합 등을 비제한적으로 포함하는, 모든 공지된 자가면역 및 염증 질환 치료와 조합하여 사용할 수 있다. 그러한 치료 및 치료 물질로는, 외과 또는 외과적 시술(예, 비장 절제술, 림프절 절제술, 갑상선 절제술, 플라즈마포레시스, 루코포레시스, 세포, 조직 또는 장기의 이식, 장 시술, 장기 관류 등), 방사선 치료, 스테로이드 치료 및 비-스테로이드 치료 등의 치료, 호르몬 치료, 사이토카인 치료, 피부작용성 물질을 이용한 치료(예, 알레르기, 접촉성 피부염 및 건성 등의 피부 병태를 치료하기 위해 사용되는 국소제), 면역억제 치료 및 그외 항염증성 단일클론 항체 치료 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이러한 방식에 있어, 본원에 기술된 항-CD20 항체는, 비제한적으로, 수술, 장기 관류, 방사선 치료, 스테로이드 치료, 비-스테로이드 치료, 항생제 치료, 항진균성 치료, 호르몬 치료, 사이토카인 치료, 피부작용 물질을 이용한 치료(예, 알레르기, 접촉성 피부염 및 건선 등의 피부 병태를 치료하기 위해 사용하는 국소제), 면역억제성 치료, 그외 항-염증성 단일클론 항체 치료, 이들의 조합 등의, 한가지 이상의 다른 요법과 조합하여 투여된다. 따라서, 항-CD20 항체를 다른 치료 물질, 예컨대 스테로이드의 투여와 조합하여 투여하는 것을 포함하는 경우, 본 발명의 방법은 개별 제형 또는 하나의 약학적 제형을 이용한 공동-투여 및 2가지 순서의 연속 투여를 포함한다.
본 발명의 방법이 치료 조합 요법을 포함하는 경우, 이러한 치료는 동시에 제공될 수 있으며, 즉, 항-CD20 항체를 다른 치료와 동시에 또는 동일 시간대(즉, 치료가 동시에 이루어지지만 항-CD20 항체가 다른 치료와 정확하게 동시에 투여되는 것은 아님)에 투여한다. 또는, 본 발명의 항-CD20 항체는 다른 치료 전에 또는 이후에 투여할 수 있다. 처리받은 개체가 제1 치료 코스에 반응하여 재발 또는 재현 가능성이 낮아지는지와는 무관하게, 여러가지 치료의 순차적 투여를 수행할 수 있다.
본 발명의 일부 예들에서, 본원에 기술된 항-CD20 항체는 면역억제 약물이나 항염증 약물과 조합하여 투여되며, 항체 및 치료 물질(들)은 2가지 순서로 순차적으로 또는 동시에(즉, 동시이거나 동일 시간대) 투여할 수 있다. 본 발명의 항-CD20 항체와 조합하여 투여할 수 있는 적합한 면역억제 약물의 예로는, 메톡트리세이트, 사이클로포스파미드, 미조리빈, 클로람부실, 사이클로스포린, 예컨대 에어로졸화된 사이클로스포린(미국 특허 공개번호 US20020006901, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨), 타클로리무스(tacrolimus)(FK506; ProGraf™, 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil) 및 아자티오프린(6-머캅토퓨린), 시롤리무스(라파마이신), 데옥시스페르구알린, 레플루노마이드 및 그것의 말로노니트릴로아미드 유사체; 및 면역억제 단백질, 예컨대, 항-CTLA4 항체 및 Ig 융합체, 항-B 림프구 자극자 항체(예, LYMPHOSTAT-B™) 및 Ig 융합체(BLyS-Ig), 항-CD80 항체 및 에타네르셉트(etanercept)(Enbrel®), 뿐만 아니라 항-CD3(OKT3), 항-CD4 등의 항-T 세포 항체가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 적합한 항염증 물질의 예로는, 예컨대 클로베타졸, 할로베타졸, 하이드로코르티손, 트리암시놀론, 베타메타존, 플루오시놀, 플루로시노니드, 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론과 같은 코르티코스테로이드; 설파살라진, 메살라민(5-ASA 물질이라고 함), 셀렉콕십, 디클로페낙, 에토돌락, 펜프로펜, 플루르비프로펜, 이부프로펜, 케토프로펜, 메클로파메이트, 멜록시캄, 나부메톤, 나프록센, 옥사프로진, 피록시캄, 로펙콕십, 살리실레이트, 술린닥 및 톨메틴과 같은 비스테로이드계 항염증성 약물(NSAID); 아달리무맵(HUMIRA®, TNF-알파 길항제) 및 인플릭시맵(Remicade®, TNF-알파 길항제) 등과 같은 항염증성 항체가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
이식 거부 및 이식 편대 숙주 질환은, 초급성(전신성), 급성(T 세포 매개), 또는 만성(병인 미확인), 또는 이의 조합일 수 있다. 따라서, 본 발명의 항-CD20 항체는 일부 예에서는 간, 신장, 췌장, 췌장 섬세포, 소장, 폐, 심장, 각막, 피부, 혈관, 뼈, 이종 또는 자신의 골수 등을 비제한적으로 포함하는 모든 조직에 대한 초급성, 급성 및/또는 만성적인 이식 거부와 관련있는 증상 및/또는 거부를 예방 및/또는 완화시키기 위해 사용한다. 이식 조직은 모든 공여체에서 취하여 모든 수여체 숙주에 이식할 수 있으며, 따라서 이식 과정은 동물 조직의 인간에게 이식(예, 이종이식), 한 사람의 조직으로부터 다른 사람에게로 이식(예, 동종이식) 및/또는 인간 신체의 한 부분에서 다른 부분으로의 이식(예, 자가이식)을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체를 이용한 치료는, 열, 식욕 부진, 혈역학적 이상, 백혈구 감소증, 이식된 장기/조직의 백세포 침윤 뿐만 아니라 기회 감염 등의 이식 후유증을 낮추 수 있다.
일부 예들에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 초급성, 급성 및/또는 만성 거부 및/또는 이식 편대 숙주 질환과 같은 이식 거부를 치료 및/또는 예방하기 위해 단독으로 또는 면역억제 약물과 조합하여 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항-CD20 항체를 이용하여 이식 거부를 치료하는 일부 예에서, 항체는, 메톡트렉세이트; 사이클로포스파미드; 미조리빈; 클로람부실; 사이클로스포린, 예컨대 에어로졸화된 사이클로스포린미국 특허 공개번호 US20020006901, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨), 타클로리무스(FK506; ProGraf™, 미코페놀레이트 모페틸 및 아자티오프린(6-머캅토퓨린), 시롤리무스(라파마이신), 데옥시스페르구알린, 레플루노미드 및 그것의 말로노니트릴로아미드 유사체 등을 비제한적으로 포함하는 적합한 면역억제 약물; 및 예컨대, 항-CTLA 항체 및 Ig 융합체, 항-B 림프구 자극자 항체(예, LYMPHOSTAT-B™ 및 Ig 융합체(BLyS-Ig), 항-CD80 항체 및 에타네르셉트(Enbrel®), 뿐만 아니라 항-T 세포 항체, 예컨대 항-CD3(OKT3), 항-CD4, 등을 비제한적으로 포함하는 적합한 면역억제 단백질과 조합하여 사용할 수 있다.
이처럼, 본 발명의 조성물 및 방법은 다른 약물과 조합 사용하여, 예컨대 폐 이식편을 받은 개체와 같은 이식 수여체에서 증상 및 결과를 더욱 향상시키는 것을 특히 고려한다. 따라서, 일부 예들에서, 본 발명의 항-CD20 항체를 사용하여, 단독으로, 또는 예컨대 경구 사이클로스포린, 주입가능한 사이클로스포린, 에오로졸화된(예, 흡입성) 사이클로스포린 및 그의 조합을 포함하여, 경구 및/또는 비경구 투여되는 사이클로스포린과 조합하여, 이식 거부(예, 폐 이식 수여체에서 초급성, 급성 및/또는 만성 거부 또는 이식 편대 숙주 질환)을 치료한다. 한가지 이상의 치료 성분이 에어로졸화된 사이클로스포린인 경우에, 사이클로스포린은 예컨대 가압성 절단 장치나 분사기를 이용하여 에어로졸 스프레이 형태로 사이클로스포린의 흡입에 의해 수여체의 폐에 전달한다. 사이클로스포린은 건조 분말이나 수분 함유 형태로 투여할 수 있다.
다른 일부 예에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 단독으로 또는 면역억제성 약물과 조합하여 사용하여, 류마티스 관절염을 치료 및/또는 예방할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항-CD20 항체가 류마티스 관절염 치료에 사용되는 일부 경우들에서, 항체는, 메톡트렉세이트, 사이클로포스파미드, 미조리빈, 클로람부실, 사이클로스포린, 타클로리무스(FK506; ProGraf™, 미코페놀레이트 모페틸 및 아자티오프린(6-머캅토퓨린), 시롤리무스(라파마이신), 데옥시스페르구알린, 레플루노미드 및 그것의 말로노니트릴로아미드 유사체 등을 비제한적으로 포함하는 적합한 면역억제 약물; 및 예컨대, 항-CTLA 항체 및 Ig 융합체, 항-B 림프구 자극자 항체(예, LYMPHOSTAT-B™ 및 Ig 융합체(BLyS-Ig), 항-CD20 항체(예, RITUXAN®); 완전 인간 항체 HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, 토시투모맵/I-131, 토시투모맵(Bexxar®), 이브리투모맵 티툭세탄(Zevalin®); 항-CD80 항체, 및 에타네르셉트(ENBREL®), 뿐만 아니라 항-CD3(OKT3), 항-CD4 등의 항-T 세포 항체를 비제한적으로 포함하는 면역억제 단백질과 조합하여 사용할 수 있다. 상기에서 논의된 바와 같이, 치료 효능은 모든 수단을 이용하여 측정할 수 있으며, 미국 류마티스 기준 컬리지, 유럽 류마티스 기준 단체 또는 그외 모든 기준에 따라 정의된 임상 반응에 의해 측정한 효능 등을 비제한적으로 포함한다. 예로, Felson et al. (1995) Arthritis . Rheum . 38:727-35 and van Gestel et al. (1996) Arthritis Rheum . 39:34-40을 참조한다.
또다른 예에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 단독으로 또는 면역억제 약물과 조합 사용하여, 다발성 경화증을 치료 및/또는 예방할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항-CD20 항체가 다발성 경화증 치료에 사용되는 일부 경우들에서, 항체는, 메톡트렉세이트, 사이클로포스파미드, 미조리빈, 클로람부실, 사이클로스포린, 타클로리무스(FK506; ProGraf™, 미코페놀레이트 모페틸 및 아자티오프린(6-머캅토퓨린), 시롤리무스(라파마이신), 데옥시스페르구알린, 레플루노미드 및 그것의 말로노니트릴로아미드 유사체 등을 비제한적으로 포함하는 적합한 면역억제 약물; 및 예컨대, 항-CTLA 항체 및 Ig 융합체, 항-B 림프구 자극자 항체(예, LYMPHOSTAT-B™ 및 Ig 융합체(BLyS-Ig), 그외 항-CD20 항체(예, RITUXAN®); 완전 인간 항체 HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, 토시투모맵/I-131, 토시투모맵(Bexxar®), 이브리투모맵 티툭세탄(Zevalin®); 항-CD80 항체, 및 에타네르셉트(ENBREL®), 뿐만 아니라 항-CD3(OKT3), 항-CD4 등의 항-T 세포 항체를 비제한적으로 포함하는 면역억제 단백질과 조합하여 사용할 수 있다.
나아가, 2종 이상의 치료 물질 및 본원에 기술된 항-CD20 항체를 이용한 조합 치료는 또한 CD20-발현성 세포와 관련있는 질환 상태, 예컨대 B 세포성 암 및 자가면역 및/또는 염증 장애의 치료에 사용할 수 있다. 비제한적으로, 그 예로는, 2가지 치료제를 본원에 기술된 항-CD20 항체와 조합하여 치료하는 트리플 조합 치료, 화학칠료제와 다른 항암 단일클론 항체(예, 알렘투주맵, 리툭시맵 또는 항-CD23 항체)를 본원에 기술된 항-CD20 항체와 조합하여 투여하는 트리플 조합 치료가 있다. 이러한 조합의 예로는, 플루다라빈, 사이클로포스파미드 및 항-CD20 항체의 조합과, 플루다라빈, 다른 항-CD20 항체, 예컨대 리툭시맵(Rituxan® IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, California) 및 본 발명의 항-CD20 항체의 조합이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 예는, 임상 테스트 과정의 일부분으로서, 예컨대 해당 치료 요법의 효능 결정을 위해, 조직내 단백질 수준을 진단학적으로 모니터링함에 있어 항-CD20 항체의 사용이다. 검출은 검출가능한 물질을 항체에 커플링시켜 용이하게 할 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는, 다양한 효소, 보결기, 형광물질, 발광 물질, 생발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예로는, 호르세라디시 페록시다제, 알카리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제가 있으며, 적합한 보결기 복합체로는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴이 있으며, 적합한 형광 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 있으며; 생발광 물질의 예로는 루미놀이 있으며; 생발광 물질의 예로는 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿠오린이 있으며, 적합한 방사성 물질로는 125I, 131I, 35S, 또는 3H가 있다.
VIII. 약학 조성물 및 투여 방법
본 발명의, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 제조 방법 및 필요한 개체에 투여하는 방법은 당업자에 잘 알려져 있거나 또는 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 투여 경로는, 예컨대, 구강, 경구, 흡입 또는 국소일 수 있다. 본원에서 용어 "경구"는 예컨대, 정맥내, 동맥내, 복막내, 근육내, 피하, 직장, 또는 질 투여를 포함한다. 이들 모든 형태의 투여는 본 발명의 범위내인 것으로 명백하게 인지되지만, 투여 형태는 주사용, 특히 정맥내 또는 동맥내 주사용 용액, 또는 드립(drip) 용액일 수 있다. 통상, 주사하기에 적합한 약학 조성물은 완충제(예, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충제), 계면활성제(예, 폴리소르베이트), 선택적으로 안정화제 물질(예, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 기술된 방법과 상용가능한 다른 방법에서, 본 발명의, 항-CD20 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 직접 나쁜 세포 집단 부위에 전달하여, 병에 걸린 조직을 치료 물질에 노출되는 것을 증가시킬 수 있다.
종래에 언급한 바와 같이, 발명의, 항-CD20 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는, SLE, PBC, ITP, 다발성 경화증, 건선, 크론 질환, 이식 거부 및 B-세포 림프종과 같은 CD-발현성 세포-매개 질환의 생체내 치료를 위한 약학적으로 유효량으로 투여할 수 있다. 이런 점에서, 기술된 항체는 활성 물질의 투여를 용이하게 하고 안정성을 촉진시키도록 제형화될 것이다. 바람직하기로는, 본 발명에 따른 약학 조성물은 생리 식염수, 무독성 완충제, 보존제 등의 약학적으로 허용가능하며, 무독성의, 멸균 담체를 포함한다. 본 발명의 목적에서, 접합되거나 접합되지 않은, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 약학적 유효량은, 타겟에 대한 효과적인 결합을 달성하여 이로운 효과를 성취, 예컨대 질병이나 장애의 증상을 완화시키거나 또는 물질이나 세포를 검출하는데 충분한 함량을 의미하는 것으로 사용될 것이다.
본 발명에 사용되는 약학 조성물은, 예컨대, 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질, 포스페이트와 같은 완충제 물질, 글리신, 소르브산, 포타슘 소르베이트, 포화 식물성 지방상의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 포타민 설페이트와 같인 전해직, 디소듐 하이드로겐 포스페이트, 포타슘 하이드로겐 포스페이트, 소듐 클로라이드, 아연 염, 콜로이달 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스계 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 폴리머, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 등을 포함하여, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
비경구 투여용 조제물은 멸균 수계 또는 비수계 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수계 용매의 예로는, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸 올레이트와 같은 주사용 유기 에스테르가 있다. 수계 담체로는, 물, 알콜성/수계 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함하며, 염수 및 완충화된 매질을 포함한다. 본 발명에서, 약학적으로 허용가능한 담체로는, 0.01-0.1　M의, 바람직하게는 0.05　M의 포스페이트 완충액 또는 0.8% 염수가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 그외 통상적인 경구 비히클로는, 소듐 포스페이트 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 소듐 클로라이드, 락테이트화된 링거 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클로는, 유액 및 영양 보충제, 전해질 보충제, 예컨대 링거 덱스트로스를 기본으로 한 비히클 등을 포함한다. 예컨대 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제, 및 불활성 가스 등과 같은 보존제 및 그외 첨가제도 존재할 수 있다.
보다 구체적으로는, 주사용도로 적합한 약학 조성물은 멸균된 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사용액이나 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 그러한 경우에서, 조성물은 멸균되어야 하며, 용이한 주사성이 가능한 범위로 유동적이어야 한다. 제조 및 저장 조건 하에서 안정적이어야 하며, 바람직하게는 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보호될 것이다. 담체는, 예컨대 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 용액 등), 및 이들의 적정 혼합물을 포함하고 있는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예컨대, 레시틴과 같은 코팅제의 이용에 의해, 분산액의 경우 필수 입자 크기의 유지에 의해 적절한 유동성 및 계면활성제의 사용에 의해, 적절한 유동성을 유지시킬 수 있다. 본원에 기술된 치료 방법에 사용하기에 적합한 제형들은 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed.(1980)에 기재되어 있다.
미생물의 작용 예방은, 다양한 항박테리아 및 항진균성 물질, 예컨대, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성할 수 있다. 많은 경우에, 등장성 물질, 예컨대 당, 만니톨과 같은 폴리알코올, 소르비톨 또는 소듐 클로라이드를 조성물내에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 장기 흡수는, 조성물에 흡수를 지연시키는 물질, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써, 이룰 수 있다.
어떤든 경우에, 멸균성의 주사용액은 활성 화합물(예, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체, 그 자체나 또는 다른 활성 물질과의 조합)을 적절한 용매 중에 필요한 함량으로, 본원에 기재된 하나의 성분이나 성분들의 조합과 함께 병합하고, 필요에 따라 다음 단계로 여과 멸균화함으로써, 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은, 활성 화합물을, 염기성의 분산액 매질과 전술한 성분들 중 그외 필요한 성분이 포함된, 멸균 비히클에 병합함으로써, 제조한다. 멸균 주사용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조이며, 이러한 방법으로 활성 성분과 미리 멸균-여과한 용액으로부터 나온 임의의 추가적인 바람직한 성분들로 구성된 분말이 만들어진다. 당업계에 공지된 방법에 따라, 주사용 조제물은 가공되어 앰플, 백, 병, 주사기 또는 바이얼 등의 용기에 충진된 다음, 무균 조건하에서 밀봉된다. 아울러, 조제물은 포장되어 계류중인 미국 특허 출원번호 09/259,337로 공개번호 US-2002-0102208 A1에 개시된 바와 같이, 키트 형태로 판매할 수 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 이러한 제조 물품에는, 바람직하게는, 들어 있는 조성물이 질병 또는 장애를 앓고 있거나 소인이 있는 개체를 치료하는데 유용하다는 것이 기재된, 라벨 또는 패키지 삽입물이 들어 있을 것이다.
경구 제형은 1회 볼루스 투약, 주입 또는 부하 볼루스 투약(loading bolus dose)하여 유지 용량을 유지하는 것일 수 있다. 이러한 조성물은 특정한 고정된 또는 가변적인 간격으로, 예컨대 하루에 1회 또는 "필요할 때" 투여할 수 있다.
본 발명에 사용되는 임의의 약학 조성물은 예컨대 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 수용액 등의 허용가능한 투약 형태로 경구 투여될 수 있다. 또한, 임의의 약학 조성물은 코 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 생체이용성을 증진시키기 위해 벤질 알코올 또는 그외 적합한 보존제, 흡수 촉매제 및/또는 그외 통상적인 가용화제 또는 분산제를 사용하여, 염수 중의 용액으로서 제조할 수 있다.
담체 물질과 조합하여 단일 투약 형태로 제조할 수 있는, 항-CD20 항체, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체의 함량은, 치료되는 숙주와 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 조성물은 단회 용량, 다중 용량으로 투여하거나, 또는 주입시 정해진 기간동안 투여될 수 있다. 또한, 투약 요법은 바람직한 최적 반응(예, 치료 반응 또는 예방 반응)을 제공하도록 조정할 수 있다.
본 명세서의 범위내에서, 본 발명의, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체는 치료 효과를 형성하는데 충분한 함량으로 전술한 치료 방법에 따라 인간이나 그외 동물에 투여할 수 있다. 본 발명의, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체는 공지된 기법에 따라 통상적인 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 본 발명의 항체와 조합하여 제조한 통상적인 투약 형태로, 인간이나 그외 동물에게 투여할 수 있다. 당업자라면, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제의 형태 및 특징은 투여되는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 그외 잘 알려져 있는 변수에 따라 영향을 받는다는 것을 인지할 것이다. 당업자는, 본 발명의, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체 중 하나 이상을 포함하는 칵테일이 특히 효과적인 것으로 입증될 수 있다는 것을 더 인지할 것이다.
SLE, PBC, ITP, 다발성 경화증, 건선, 크론 질환, 이식 거부 및 B 세포 림프종과 같은 CD20-발현성 세포-매개의 질환의 치료에 있어, 본 발명의 조성물의 유효량은, 환자가 인간이거나 동물이거나, 다른 약물이 투여되거나, 치료가 예방 또는 치료학적 치료이던지, 투여, 타겟 부위, 환자의 생리학적 상태 등의 수단들을 포함하여, 다수의 여러가지 인자에 따라 다르다. 통상적으로, 환자는 인간이지만, 형질전환 포유류 등의 인간을 제외한 포유류에도 처리할 수 있다. 치료량은 당업자에게 공지된 일반적인 방법을 이용하여 적정함으로써, 안전성 및 효능을 최적화할 수 있다.
투여할 1종 이상의 항-CD20 항체의 양은 본 발명의 명세서에 제시된 내용을 참조하여 과도한 실험없이도 당업자라면 쉽게 결정한다. 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체의, 투여 모드 및 각 함량에 영향을 주는 인자로는, 질병의 중증도, 병력 및 요법을 받고 있는 개체의 연령, 키, 체중, 건강 및 신체 상태가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 유사하게는, 투여할 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체의 함량은 투여 모드에 따라, 개체가 이 제제를 1회 투약받을 것이나 또는 여러번 투여받을 것인지에 따라 결정될 것이다. 투여할, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체의, 투여량은, 약 0.0001 - 100 mg/kg, 0.003 mg/kg - 약 50 mg/kg, 또는 약 0.01 mg/kg - 약 40 mg/kg이다. 따라서, 예컨대, 투여량은 0.01 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 또는 100 mg/kg일 수 있다.
일부 예에서, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 이용한, SLE, PBC, ITP, 다발성 경화증, 건선, 크론 질환, 이식 거부 및 B 세포 림프종과 같은 CD-발현성 세포-매개 질환의 치료에 있어, 투여량은 예컨대 약 0.0001 - 100 mg/kg일 수 있으며, 보다 통상적으로는, 숙주의 체중의 0.01 - 5 mg/kg(예, 0.02 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 등)일 수 있다. 예컨대, 투여량은 1 mg/kg(체중) 또는 10 mg/kg(체중)일 수 있거나, 또는 1-10 mg/kg의 범위, 바람직하기로는 1 mg/kg 이상일 수 있다. 또한, 전술한 범위 사이의 투여량도 본 발명의 범위내인 것으로 의도된다. 개체에 상기한 투여량을 매일, 이틀마다, 주마다 또는 실험 분석에 의해 결정된 모든 그외 계획에 따라 투여할 수 있다. 예시적인 투여량 스케줄은, 계속 1-10 mg/kg, 또는 이틀마다 15 mg/kg, 또는 주마다 60 mg/kg을 포함한다. 어떤 방법들에서는, 투여하는 각 항체의 투여량이 기술된 범위내인 경우에, 상이한 결합 특이성을 가진 2종 이상의 단일클론 항체는 동시에 투여된다.
본 발명의, 항-CD20 항체 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체를 여러번 투여할 수 있다. 1회 투여 사이의 간격은 매일, 매주, 매달 또는 매년일 수 있다. 또한, 간격은 타겟 폴리펩타이드 또는 타겟 분자의 환자에서의 혈중 농도를 측정하여 나타난 바와 같이, 불규칙적일 수 있다. 일부 방법들에서는, 투여량은 혈장 폴리펩타이드의 농도 1-1000 ㎍/ml, 일부 방법들에서는 25-300 ㎍/ml를 달성하도록 조정한다. 다른 예로, 본 발명의, 항-CD20 항체 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체는, 적은 빈도로 투여할 필요가 있는 경우에, 서방형 제형으로서 투여할 수 있다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체 반감기에 따라 달라진다. 또한, 항-CD20 항체의 반감기는 안정적인 폴리펩타이드 또는 모이어티, 예컨대 알부민 또는 PEG에 융합을 통해 연장시킬 수 있다. 통상, 인간화 항체는 가장 긴 반감기를 보이며, 그 다음으로는 키메라 항체 및 비-인간 항체이다. 일 예에서, 본 발명의, 항-CD20 항체 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체는 접합되지 않은 형태로 투여할 수 있으며, 다른 예로, 본 발명의 항-CD20 항체 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체를 접합된 형태로 여러번 투여할 수 있다. 또다른 예에서, 본 발명의, 항-CD20 항체 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체를 접합되지 않은 형태로 투여한 다음 접합된 형태로 투여할 수 있으며, 그 역순으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 예에서, 상기 방법은, 항-CD20 항체 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체의 다중 투여량의 투여를 포함한다. 상기 방법은, 항-CD20 항체 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 약학 조성물의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40회 또는 그 이상의 치료학적 유효량의 투여를 포함할 수 있다. 항체 분자를 포함하는 약학 조성물의 다중 투여량의 투여 빈도 및 기간은 본 명세서에 기재된 바에 따라 과도한 실험없이도 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 아울러, 치료학적 유효량의 항체를 이용한 개체 치료는 1회 치료를 포함할 수 있으며, 또는 바람직하게는 연속적인 치료를 포함할 수 있다. 바람직한 예에서, 개체는 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 이용하여, 약 0.1 - 20 mg/kg(체중)의 범위로, 약 1-10주 동안, 바람직하기로는 약 2 - 9주간, 더 바람직하기로는 약 3-7주간, 보다 더 바람직하기로는 약 4, 5 또는 6주간 매주에 한번 치료한다. 치료는 재발을 예방하기 위해 매년 또는 재발시에 이루어질 수 있다. 또한, 치료에 사용되는 항체 분자의 유효량은 특정 치료의 기간동안 증가 또는 감소할 수 있는 것으로 인지될 것이다. 투여량의 변화가 나타날 수 있으며, 본원에 기재된 진단 분석의 결과로부터 명확해질 수 있다.
따라서, 일 예에서, 투약 요법은 치료 기간의 1일, 7일 14일 및 21일에 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 치료학적 유효량으로 1차 투여하는 것을 포함한다. 다른 예에서, 투약 요법은 치료 기간에서 1주일의 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 및 7일에 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 치료학적 유효량으로 1차 투여하는 것을 포함한다. 다른 예는, 투약 요법은 치료 기간에서 1주일의 1일, 3일, 5일 및 7일에 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 치료학적 유효량으로 1차 투여하는 것을 포함하며; 투약 요법은 치료 기간에서 1주일의 1일 및 3일에 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 치료학적 유효량으로 1차 투여하는 것을 포함하며; 바람직한 투약 요법은 치료 기간에서 1주일의 1일에 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 치료학적 유효량으로 1차 투여하는 것을 포함한다. 치료 기간은 1주일, 2주일, 3주일, 1달, 3달, 6달 또는 1년을 포함할 수 있다. 치료 기간은 계속되거나, 또는 1일, 1주, 2주, 1달, 3달, 6달 또는 1년의 기간으로 분리되어 있을 수 있다.
일부 예들에서, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 치료학적 유효량은 약 0.0001 mg/kg - 약 100 mg/kg, 약 0.003 mg/kg - 약 50 mg/kg, 약 0.01 mg/kg - 약 40 mg/kg, 약 0.01 mg/kg - 약 30 mg/kg, 약 0.1 mg/kg - 약 30 mg/kg, 약 0.5 mg/kg - 약 30 mg/kg, 약 1 mg/kg - 약 30 mg/kg, 약 3 mg/kg - 약 30 mg/kg, 약 3 mg/kg - 약 25 mg/kg, 약 3 mg/kg - 약 20 mg/kg, 약 5 mg/kg - 약 15 mg/kg, 또는 약 7 mg/kg - 약 12 mg/kg의 범위이다. 따라서, 예컨대, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 치료학적 유효량 중 어떤 하나의 투여량은 0.003 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg 또는 약 0.0001 mg/kg - 약 100 mg/kg의 범위내의 그외 용량일 수 있다. 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 동일한 치료학적 유효량으로, 항체를 투약하는 각 일주일 동안 투여할 수 있다. 또한, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 상이한 치료학적 유효량으로 치료 기간 동안 사용할 수 있다.
IX. 약제 제조에 있어 항-CD20 항체의 용도
또한, 본 발명은 신생물성 B 세포 증식이 특징인 암에 대해 개체를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체의 용도를 제공하며, 상기 약제는 한가지 이상의 다른 암 치료를 이용한 치료와 병행(coordinated)된다. 신생물성 B 세포 증식이 특징인 암으로는, 전술한 B 세포성 암, 예컨대 비-호지킨 림프종, 만성 림프성 백혈병, 다방성 골수종, B 세포 림프종, 고등급의 B 세포 림프종, 중등급의 B 세포 림프종, 저등급의 B 세포 림프종, B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 골수모구성 백혈병, 호지킨병, 형질세포종, 여포성 림프종, 여포성 소분할 림프종, 여포성 대세포 림프종, 여포성 혼성 소분할 림프종, 미만성 소분할 세포 림프종, 미만성 소림프성 림프종, 전림프구성 백혈병, 림프형질세포종 림프종, 변연부 림프종, 점막 연관성 림프조직 림프종, 단구성 B 세포 림프종, 비장 림프종, 모상 세포 백혈병, 미만성 대세포 림프종, 종격동 대 B세포 림프종, 림프종양 육아종증(lymphomatoid granulomatosis,), 혈관내 림프종증, 미만성 혼성 세포 림프종, 미만성 대세포 림프종, 면역모구성 림프종, 버킷 림프종, AIDS 연관성 림프종 및 멘틀 세포 림프종이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
"병행(coordinated)"은 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 약제가 한가지 이상의 암 치료를 받고 있는 개체의 치료 전, 치료 중, 또는 치료 후에 사용되는 것으로 의도된다. 다른 암 치료의 예로는, 선택적으로 자가 골수 이식과 조합하여, 수술; 방사선 치료; 화학치료를 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니며, 적합한 화학치료 물질로는, 플루다라빈(fludarabine) 또는 플루다라빈 포스페이트, 클로람부실, 빈크리스틴, 펜토스타틴, 2-클로로데옥시아데노신(cladribine), 사이클로포스파미드, 독소루비신, 프레드니손 및 이의 조합, 예컨대, CAP(사이클로포스파미드, 독소루비신 + 프레드니손), CHOP(사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손 + 독소루비신), VAD(빈크리스틴, 독소루비신 + 덱사메타손), MP(멜팔란 + 프레드니손) 등의 안트라사이클린-함유성 요법, 및 미톡산트론, 다우노루비신, 이다루비신, 아스파라기나제 및 항대사산물 등의 화학치료에 사용되는 그외 세포독성 및/또는 치료 물질, 예컨대, 비제한적으로 사이타라빈, 메톡트렉세이트, 5-플루오로우라실, 데카르바진, 6-티오구아닌, 6-머캅토퓨린 및 넬라라빈을 포함하는, 화학 치료; 그외 항암 단일클론 항체 요법(예, 알렘투주맵(Campath®) 또는 그외 악성 B 세포상의 CD52 세포-표면 당단백질을 타겟으로 하는 항-CD52 항체; rituximab(Rituxan®), 전체 인간 항체 HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, 토시투모맵/I-131 토시투모맵(Bexxar®), 이브리투모맵 티욱세탄(Zevalin®), 또는 악성 B 세포 상의 CD20항원을 타겟으로 하는 그외 모든 치료적 항-CD20 항체; 항-CD19 항체(예, MT103, 2중 특이 항체); 항-CD22 항체(예, 인간화 단일클론 항체, 에프라투주맵(epratuzumab)); 베바시주맵(bevacizumab)(Avastin®) 또는 인간 혈관 내피 성장 인자를 타겟으로 하는 그외 항암 항체; 악성 B 세포 상의 CD22를 타겟으로 하는 항-CD22 항체(예, 단일클론 항체 BL-22, alphaCD22 톡신); 대식세포 콜로니 자극 인자를 타겟으로 하는 알파-M-CSF 항체; 다발성 골수종에서 과다 발현되는, 핵 인자-kappaB(RANK)의 수용체 및 그것의 리간드(RANKL)에 대한 활성자를 타겟으로 하는 항체; 악성 B 세포 상의 CD23 항원을 타겟으로 하는 항-CD23 항체(예, IDEC-152); 악성 B 세포 상의 CD38 항원을 타겟으로 하는 항-CD38 항체; 악성 B 세포에서 발현된 주조직적합성 복합체 클래스 II 수용체를 타겟으로 하는 항체(항-MHC 항체); 악성 B 세포 상의 CD40 항원을 타겟으로 하는 항-CD40 항체(예, SGN-40); 및 다수의 고형암과 조혈 기원의 종양에서 발현되는 종양 괴사 인자-관련 세포자살-유발성 리간드 수용체 1(TRAIL-R1)을 타겟으로 하는 항체(예, 작용자성 인간 단일클론 항체 HGS-ETR1); 소분자-근간의 암 치료, 예컨대 비제한적으로, 마이크로튜불 및/또는 토포이소머라제 저해제(예, 유사세포분열 저해자인 돌라스타틴과 돌라스타틴 유사체; 투불린-결합성 물질 T900607; XL119; 및 토포이소머라제 저해자인 아미노캄토테신), SDX-105(벤다무스틴 하이드로클로라이드), 이사베필론(에포틸론 유사체, 또한 BMS-247550이라 함), 단백질 키나제 C 저해자, 예컨대 미도스타우린((PKC-412, CGP 41251, N-벤조일스타우로스포린), 픽산트론, 엘로사틴(항-신생물제), 가니트(갈륨 니트레이트), 탈로미드®(thalidomide), 탈리도미드의 면역조절 유도체(예, 레블리미드(옛 명칭 레비미드)), Affinitak™(단백질 키나제 C-알파의 안티센스 저해제), SDX-101(R-에토돌락, 악성 림프구의 세포자살 유도), 2세대 퓨린 뉴클레오사이드 유사체, 예컨대 클로파라빈, 암 세포에 의한 단백질 Bcl-2의 생산 저해제(예, 안티센스 물질 오블리메르센 및 Genasense®), 프로테오좀 저해제(예, Velcade™(bortezomib)), 소분자 키나제 저해제(예, CHIR-258), 소분자 VEGF 저해제(예, ZD-6474), 열 충격 단백질(HSP) 90의 소분자 저해제(예, 17-AAG), 히스톤 탈아세틸라제의 소분자 저해제(예, 하이브리드/극성 세포분화 HPC) 물질, 예컨대 서베라닐로하이드록삼산(SAHA), 및 FR-901228) 및 세포자살 물질, 예컨대 Trisenox®(3산화 비소) 및 Xcytrin®(모테사핀 가돌리); 백신/면역치료적 암 치료, 예컨대 비제한적으로 백신 접종(예, Id-KLH, 오코파지, 비탈레틴), 개인화된 면역치료 또는 활성 개별 면역치료(예, MyVax® Personalized Immunotherapy, 옛 명칭 GTOP-99), Promune®(CpG 7909, toll 유사 수용체 9(TLR9)에 대한 합성 작용자), 인터페론-알파 치료, 인터루킨-2(IL-2) 치료, IL-12 치료, IL-15 치료, 및 IL-21 치료; 스테로이드 치료; 또는 그외 암 치료 등을 비제한적으로 포함하며, 부가적인 암 치료 또는 부가적인 암 치료들을 이용한 치료는, 전술한 바와 같이, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 약제를 이용한 개체 치료 전에, 치료 중에 또는 치료 후에 이루어진다.
일부 예들에서, 본 발명은, 개체에서 B 세포 림프종, 예컨대 호지킨 림프종을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어, 항-CD20 항체 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체의 용도를 제공하며, 상기 약제는 화학치료, 항암 항체 치료, 소분자 기반의 암치료 및 백신/면역치료성 암 치료로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 다른 암 치료를 이용한 치료와 병행되며, 약제는 다른 암 치료로 개체를 치료하기 전에, 치료하는 중에 또는 치료한 후에, 또는 다중 조합 치료의 경우에는 다른 암 치료들로 개체의 치료 전, 치료 중 또는 치료 후에 사용되어야 한다.
따라서, 일부 예들에서, 본 발명은, 개체에서 B 세포 림프종, 예컨대 호지킨 림프종을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어, 본 발명의 단일클론 항체 1589 또는 그외 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체의 용도를 제공하며, 상기 약제는 화학치료를 이용한 치료와 병행되며, 화학치료 물질은 사이토산, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터, 예컨대 CHOP로부터 선택된다. 다른 예에서, 본 발명은, 개체에서 B 세포 림프종, 예컨대 비-호지킨 림프종을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어, 단일클론 항체 1589, 또는 그의 항원-결합성 단편의 용도를 제공하며, 상기 약제는 알렘투주맵(Campath®) 또는 그외 악성 B 세포상의 CD52 세포-표면 당단백질을 타겟으로 하는 항-CD52 항체; rituximab(Rituxan®), 전체 인간 항체 HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, 토시투모맵/I-131 토시투모맵(Bexxar®), 이브리투모맵 티욱세탄(Zevalin®), 또는 악성 B 세포 상의 CD20항원을 타겟으로 하는 그외 모든 치료적 항-CD20 항체; 항-CD19 항체(예, MT103, 2중 특이 항체); 항-CD22 항체(예, 인간화 단일클론 항체, 에프라투주맵(epratuzumab)); 베바시주맵(bevacizumab)(Avastin®) 또는 인간 혈관 내피 성장 인자를 타겟으로 하는 그외 항암 항체 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 한가지 이상의 다른 항암 항체를 이용한 치료와 병행되며; 약제는 다른 암 치료로 개체를 치료하기 전에, 치료하는 중에 또는 치료한 후에, 또는 다중 조합 치료의 경우에는 다른 암 치료들로 개체의 치료 전, 치료 중 또는 치료 후에 사용되어야 한다.
또다른 예에서, 본 발명은, 개체에서 B 세포 림프종, 예컨대 비-호지킨 림프종을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어, 단일클론 항체 1589, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체의 용도를 제공하며, 상기 약제는 마이크로튜불 및/또는 토포이소머라제 저해제(예, 유사세포분열 저해자인 돌라스타틴과 돌라스타틴 유사체; 투불린-결합성 물질 T900607; XL119; 및 토포이소머라제 저해자인 아미노캄토테신), SDX-105(벤다무스틴 하이드로클로라이드), 이사베필론(에포틸론 유사체, 또한 BMS-247550이라 함), 단백질 키나제 C 저해자, 예컨대 미도스타우린((PKC-412, CGP 41251, N-벤조일스타우로스포린), 픽산트론, 엘로사틴(항-신생물제), 가니트(갈륨 니트레이트), 탈로미드®(thalidomide), Xcytrin®(모텍사핀 가돌리늄)과 같은 세포자살 물질, 암세포에 의한 단백질 Bcl-2의 생산 저해자(예, 안티센스 물질 오블리메르센 및 Genasense®), 멜라라빈 및 이의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 한가지 이상의 소분자-기반의 암 치료를 이용한 치료와 병행되며; 약제는 다른 암 치료로 개체를 치료하기 전에, 치료하는 중에 또는 치료한 후에, 또는 다중 조합 치료의 경우에는 다른 암 치료들로 개체의 치료 전, 치료 중 또는 치료 후에 사용되어야 한다.
또다른 예에서, 본 발명은, 개체에서 B 세포 림프종, 예컨대 비-호지킨 림프종을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어, 본 발명의 단일클론 항체 1589, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체의 용도를 제공하며, 상기 약제는 백신 접종(예, Id-KLH, 오코파지, 비탈레틴), 개인화된 면역치료 또는 활성 개별 면역치료(예, MyVax® Personalized Immunotherapy, 옛 명칭 GTOP-99), Promune®(CpG 7909, toll 유사 수용체 9(TLR9)에 대한 합성 작용자), 인터루킨-2(IL-2) 치료, IL-12 치료, IL-15 치료, 및 IL-21 치료로 이루어진 군으로부터 선택되는 한가지 이상의 다른 백신/면역치료적 암 치료, 및 이의 임의 조합을 이용한 치료와 병행되며; 약제는 다른 암 치료로 개체를 치료하기 전에, 치료하는 중에 또는 치료한 후에, 또는 다중 조합 치료의 경우에는 다른 암 치료들로 개체의 치료 전, 치료 중 또는 치료 후에 사용되어야 한다.
일부 예들에서는, 본 발명은, 개체에서 B 세포성 백혈병, 예컨대 B 세포 급성 림프성 백혈병(B-ALL)을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어, 항-CD20 항체, 예컨대, 단일클론 항체 1589, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체의 용도를 제공하며, 상기 약제는 화학치료 및 항-대사산물 치료로 이루어진 군으로부터 선택되는 한가지 이상의 다른 암치료를 이용한 치료와 병행되며, 약제는 다른 암 치료로 개체를 치료하기 전에, 치료하는 중에 또는 치료한 후에, 또는 다중 조합 치료의 경우에는 다른 암 치료들로 개체의 치료 전, 치료 중 또는 치료 후에 사용되어야 한다. 이러한 구현예의 예로는, 항-CD20 항체, 예컨대 단일클론 항체 1589, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 약제는 사이토산, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손, 사이타라빈, 미톡산트론, 이다루비신, 아스파라기나제, 메톡트렉세이트, 6-티오구아닌, 6-머캅토퓨린 및 이의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학치료 물질 또는 항-대사산물을 이용한 치료와 병행되며; 약제는 다른 암 치료로 개체를 치료하기 전에, 치료하는 중에 또는 치료한 후에, 또는 다중 조합 치료의 경우에는 다른 암 치료들로 개체의 치료 전, 치료 중 또는 치료 후에 사용되어야 한다. 이러한 일 예에서, 약제는 사이타라빈 + 다우노루비신, 사이타라빈 + 미톡산트론, 및/또는 사이타라빈 + 이다루비신을 이용한 치료와 병행되며; 약제는 다른 암 치료로 B-ALL 개체를 치료하기 전에, 치료하는 중에 또는 치료한 후에, 또는 다중 조합 치료의 경우에는 다른 암 치료들로 개체의 치료 전, 치료 중 또는 치료 후에 사용되어야 한다.,
또한, 본 발명은, 개체에서 전술한 B 세포성 암 등의 신생물성 B 세포 증식이 특징인 암을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어, 항-CD20 항체, 예컨대, 단일클론 항체 1589, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체의 용도를 제공하며, 상기 약제는 한가지 이상의 다른 암치료로 미리 치료한 개체에게 사용된다. "미리 치료한" 또는 "선치료"는, 개체가 항-CD20 항체 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 약제를 투여받기 전에 1종 이상의 다른 암 치료를 받았음(즉, 한가지 이상의 다른 암 치료로 치료됨)을 의미한다. "미리 치료한" 또는 "선치료"는, 항-CD20 항체, 예컨대, 본원에 기재된 단일 클론 항체 1589, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 약제를 이용한 치료 개시 전, 2년 이내, 18개월 이내, 1년 이내, 6달 이내, 2달 이내, 6주 이내, 1달 이내, 4주 이내, 3주 이내, 2주 이내, 1주 이내 6일 이내, 5주 이내, 4일 이내, 3일 이내, 2일 이내 또는 심지어 1일 내에, 한가지 이상의 다른 암 치료로 치료받은 개체를 포함한다. 개체가 암 치료 또는 암 치료들을 이용한 선치료에 반응자였을 필요는 없다. 따라서, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 약제를 투여받은 개체는, 이전의 암 치료를 이용한 선치료에, 또는 선치료가 다수의 암 치료를 포함하는 이전의 암 치료들 중 한가지 이상에, 반응하거나, 반응하지 못할(즉, 암에 불응) 수 있다. 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 약제를 투여하기 전에 개체에 선치료를 투여할 수 있는 다른 암 치료들로는, 선택적으로 자가 골수 이식과 조합한 수술; 방사선 치료; 화학치료가 있으나, 이들로 한정되지 않으며, 적합한 화학치료 물질로는, 전술한 물질; 비제한적으로 전술한 항암 항체를 포함하는 그외 항암 단일클론 항체 치료; 비제한적으로 전술한 소분자 등의 소분자-기반의 암 치료; 비제한적으로 전술한 것 등의 백신/면역치료-기반의 암 치료; 스테로이드 치료; 그외 암 치료; 또는 그의 임의 조합이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본원에 기술된 약제의 병행 사용과 관련한 문장에서의 한가지 이상의 다른 암 치료를 이용한 "치료"는, 본원에서, 개체에 약제 또는 다른 암 치료의 적용 또는 투여, 또는 개체로부터 분리한 조직 또는 세포주 에 약제 또는 다른 암 치료의 적용 또는 투여로서 정의되며, 개체는 신생물 B 세포 증식이 특징적인 암, 그러한 암과 관련있는 증상 또는 그러한 암의 발병 소인이 있으며, 목적은 암, 암 증상 또는 암에 걸릴 경향의 치유, 해소, 완화, 경감, 변화, 구제, 개선, 향상 또는 영향을 미치는 것이다.
또한, 본 발명은 개체에서 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체의 용도를 제공하며, 상기 약제는 한가지 이상의 다른 치료를 이용한 치료와 병행된다. "병행(coordinated)"은 약제가 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환을 위한 한가지 이상의 다른 치료로 개체를 치료하기 전, 치료하는 중, 또는 치료한 후에 사용되는 것을 의미한다. 다른 치료의 예로는, 비제한적으로 전술한 치료, 즉 수술 또는 외과적 시술(예, 비장 절제술, 림프절 절제술, 갑상선 절제술, 플라즈마포레시스, 루코포레시스, 세포, 조직 또는 장기의 이식, 장 시술, 장기 관류 등), 방사선 치료, 스테로이드 치료 및 비-스테로이드 치료 등의 치료, 호르몬 치료, 사이토카인 치료, 피부작용성 물질을 이용한 치료(예, 알레르기, 접촉성 피부염 및 건성 등의 피부 병태를 치료하기 위해 사용되는 국소제), 면역억제 치료 및 그외 항염증성 단일클론 항체 치료 등이 있으나, 이들로 한정되지 않으며, 부가적인 치료 또는 부가적인 치료들을 이용한 치료는, 전술한 바와 같이, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 약제를 이용한 개체의 치료 전에, 치료 중에 또는 치료한 다음에 이루어진다. 그러한 일예로, 본 발명은, 개체에서 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환을 치료하기 위한 약제 제조에 있어, 단일클론 항체 1589, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체의 용도를 제공하며, 약제는 전술한 바와 같이 다른 1종 이상의 치료와 병행된다.
일부 예에서, 항-CD20 항체, 예컨대 본 발명의 단일클론 항체 1589, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 약제는 2종의 다른 치료와 병행된다. 항-CD20 항체를 포함하는 약제가 2종 이상의 다른 치료와 병행되는 경우, 약제의 사용은 치료들 중 어느 하나 또는 둘다를 이용하여 개체를 치료하기 전에, 치료하는 중에 또는 치료한 후일 수 있다.
또한, 본 발명은, 개체에서 자가면역 질환 및/또는 염증성 질환을 치료하기 위한 약제 제조에 있어, 항-CD20 항체, 예컨대 본원에 기술된 단일클론 항체 1589, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체의 용도를 제공하며, 약제는 한가지 이상의 다른 치료로 선치료를 받은 개체에 사용된다. "미리 치료한" 또는 "선치료"는, 개체가 항-CD20 항체 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 약제를 투여받기 전에 1종 이상의 다른 치료를 받았음을 의미한다. "미리 치료한" 또는 "선치료"는, 항-CD20 항체, 예컨대, 본원에 기재된 단일 클론 항체 1589, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 약제를 이용한 치료 개시 전, 2년 이내, 18개월 이내, 1년 이내, 6달 이내, 2달 이내, 6주 이내, 1달 이내, 4주 이내, 3주 이내, 2주 이내, 1주 이내 6일 이내, 5주 이내, 4일 이내, 3일 이내, 2일 이내 또는 심지어 1일 내에, 다른 치료 또는 다른 치료들로 치료받은 개체를 포함한다. 개체가 암 치료 또는 암 치료들을 이용한 선치료에 반응자였을 필요는 없다. 따라서, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체를 포함하는 약제를 투여받은 개체는, 이전의 암 치료를 이용한 선치료에, 또는 선치료가 다수의 암 치료를 포함하는 이전의 암 치료들 중 한가지 이상에, 반응하거나, 반응하지 못할 수 있다.
본원에 기술된 약제의 병행 사용과 관련한 문장에서의 한가지 이상의 다른 자가면역 질환 및/또는 감염성 질환 치료를 이용한 "치료"는, 본원에서, 개체에 약제 또는 다른 암 치료의 적용 또는 투여, 또는 개체로부터 분리한 조직 또는 세포주에 약제 또는 다른 암 치료의 적용 또는 투여로서 정의되며, 개체는 CD20-발현성 세포와 관련있는 자가면역 질환 및/또는 감염성 질환, 상기 질환 관련있는 증상 또는 상기 질환으로의 발병 소인이 있으며, 목적은 상기 질환, 상기 질환의 증상 또는 상기 질환에 걸릴 경향의 치유, 해소, 완화, 경감, 변화, 구제, 개선, 향상 또는 영향을 미치는 것이다.
X. 진단
본 발명은 추가적으로 개인 유래의 조직이나 그외 세포 또는 체액에서의 CD 단백질 또는 전사체의 발현 수준을 측정하는 단계 및 정상 조직이나 체액에서의 표준적인 CD20 발현 수준과 상기 측정한 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하며, 표준에 비해 발현 수준이 증가된 것은 장애를 나타내는 것인, SLE, PBC, ITP, 다발성 경화증, 건선, 크론 질환, 이식 거부 및 B 세포 림프종과 같은 CD20-발현성 세포-매개 질환의 진단시에 유용한 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 항-CD20 항체, 및 그의 항원-결합성 단편, 변이체 및 유도체를 사용하여, 당업자들에게 공지된 고전적인 면역조직학적 방법으로 생물학적 샘플에서의 CD20 단백질 수준을 분석할 수 있다(예, Jalkanen, et al. (1985) J. Cell . Biol . 101:976-985; Jalkanen et al. (1987) J. Cell Biol . 105:3087-3096 참조). CD20 단백질 발현 검출에 사용가능한 그외 항체-기반의 방법으로는, 효소 결합된 면역흡착 분석(ELISA), 면역침강 또는 웨스턴 블롯팅과 같은 면역분석법을 포함한다. 적합한 분석법은 본원에 보다 상세하게 기재되어 있다.
"CD20 폴리펩타이드의 발현 수준을 분석하는 단계"는 제1 생물학적 샘플에서 CD20 폴리펩타이드의 수준을 직접(예, 단백질의 절대 수치를 결정 또는 추정함으로써) 또는 상대적으로(예, 제2 생물학적 샘플에서의 질병과 연관된 폴리펩타이드의 수준을 비교함으로써) 정량 또는 정성 측정 또는 추정하는 것을 의미한다. 바람직하기로는, 제1 생물학적 샘플에서의 CD2- 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정 또는 추정하고, 장애가 없는 개체 집단으로부터 수치를 평균화하여 결정되거나, 또는 장애가 없는 개체로부터 수득한 제2 생물학적 샘플로부터 취한 표준인, 표준 CD20 폴리펩타이드 수치와 비교한다. 당업계에 자명한 바와 같이, "표준" CD20 폴리펩타이드 수준이 구해지면, 이를 비교시 표준으로서 반복적으로 사용할 수 있다.
"생물학적 샘플"은 개체로부터 수득한 모든 생물학적 샘플, 세포주, 조직 배양물 또는 CD20을 발현할 가능성이 있는 그외 세포 소스를 의미한다. 포유류로부터 조직 생검 및 체액을 수득하는 방법들은 당업계에 잘 알려져 있다.
XI. 면역분석
본 발명의, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체를 당업계에 공지된 임의 방법에 의해 면역특이적 결합을 분석할 수 있다. 사용할 수 있는 면역분석법으로는, 웨스턴 블롯, 방사면역분석, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), "샌드위치" 면역분석, 면역침강 분석, 침강소 반응, 겔 확산 침강 반응, 면역확산 분석, 어글루틴화 분석, 보체-고정 분석, 면역방사측정 분석, 형광성 면역분석, 단백질 A 면역분석 등과 같은 기법을 이용한 경쟁적 및 비-경쟁적 분석 시스템이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이러한 분석법은 통상적이며, 당업계에 잘 알려져 있다(예컨대, Ausubel et al., eds,(1994) Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1을 참조하며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 면역분석의 예는 하기에 간략하게 기재되어 있다(그러나 한정하고자하는 것은 아님).
면역침강 프로토콜은 일반적으로 단백질 포스파타제 및/또는 프로테아제 저해제(예, EDTA, PMSF, 어프로티닌, 소듐 바나데이트)가 보충된 RIPA 완충액(1% NP-40 또는 Triton X-100, 1% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 0.15 M NaCl, 0.01 M 소듐 포스페이트, pH 7.2, 1% Trasylol)과 같은 세포 용혈 완충액 중에서 세포 집단을 용혈시키는 단계, 상기 세포 용혈물에 대상 항체를 첨가하는 단계, 4℃에서 일정 기간(예, 1-4 시간) 인큐베이션하는 단계, 세포 용혈물에 단백질 A 및/또는 단백질 G 세파로즈 비드를 첨가하는 단계, 4 ℃에서 약 1시간 이상 인큐베이션하는 단계, 비드를 세포용혈 완충액으로 세정하는 단계, 및 비드를 SDS/샘플 완충액에 재현탁하는 단계를 포함한다. 대상 항체의 특정 항원을 면역침강시키는 능력은, 예컨대 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석할 수 있다. 당업자는, 항체의 항원 결합성을 증가시키고 백그라운드를 낮추기 위해(예, 세파로스 비드를 이용한 세포 용혈물의 사전-세정(pre-clearing)) 변형할 수 있는 파라미터에 대해 지식이 있을 것이다. 면역침강 프로토콜에 대한 추가적인 논의는, 예컨대, Ausubel et al. , eds,(1994) Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1, 10.16.1을 참조한다.
웨스턴 블롯 분석은 일반적으로 단백질 샘플을 제조하는 단계, 상기 단백질 샘플을 폴리아크릴아미드 겔(예, 항원의 분자량에 따라 8%-20% SDS-PAGE)에서 전기영동하는 단계, 단백질 샘플을 폴리아크릴아미드 겔에서 니트로셀룰로서, PVDF 또는 나일론과 같은 멤브레인에 이동시키는 단계, 멤브레인을 블롯킹 용액(예, 3% BSA 또는 탈지유가 첨가된 PBS)으로 블롯킹하는 단계, 멤브레인을 세정 완충액(예, PBS-Tween 20)으로 세정하는 단계, 멤브레인을 블록킹 완충액에 희석한 1차 항체(대상 항체)와 인큐베이션하는 단계, 멤브레인을 세정 완충액에 세정하는 단계, 블롯킹 완충액에 희석한 효소 기질(호르세라디시 페록시다제 또는 알카리 포스파타제)이나 방사능 분자(32P 또는 125I)(1차 항체를 인지함, 예컨대 항-인간 항체)가 접합된 2차 항체를 멤브레인과 인큐베이션하는 단계, 세정 완충액으로 멤브레인을 세정하는 단계, 및 항원의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 당업자는, 검출되는 신호를 높이고, 백그라운드 노이즈를 감소시키기 위해 변형시킬 수 있는 파라미터에 대한 지식을 가지고 있을 것이다. 웨스턴 블롯 프로토콜에 대한 추가적인 논의로, 예컨대, Ausubel et al., eds,(1994) Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1 at 10.8.1을 참조한다.
ELISA는, 항원을 준비하는 단계, 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰을 항원으로 코팅하는 단계, 효소 기질(예, 호르세라디시 페록시다제 또는 알카리 포스파타제)과 같은 검출가능한 화합물이 접합된 대상 항체를 상기 웰에 첨가하는 단계, 일정 기간 인큐베이션하는 단계, 및 항원의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. ELISA에서, 대상 항체는 검출가능한 화합물에 접합되지 않고, 대신 검출가능한 화합물이 접합된 2차 항체(대상 항체를 인지함)를 웰에 첨가할 수 있다. 아울러, 웰을 항원으로 코딩하는 대신, 항체로 웰을 코딩할 수 있다. 이 경우, 검출가능한 화합물에 접합된 2차 항체를 첨가한 다음, 대상 항원을 코팅한 웰에 첨가할 수 있다. 당업자는, 당업계에 공지된 ELISA의 그외 변형 뿐만 아니라 검출되는 신호를 증가시키기 위해 변형시킬 수 있는 파라미터에 대한 지식을 가지고 있을 것이다. ELISA에 대한 추가적인 논의는, 예컨대, Ausubel et al. , eds,(1994) Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1 at 11.2.1을 참조한다.
경쟁적인 결합 분석에 의해 항체의 항원 결합 친화성 및 항체-항원 상호작용의 오프율을 측정할 수 있다. 경쟁적인 결합 분석의 일 예는, 표지되지 않은 항원의 양이 증가된 시리즈로 있는 존재 하에 표지된 항원(예, 3H 또는 125I)을 대상 항체와 인큐베이션하는 단계 및 표지된 항원에 결합된 항체를 검출하는 단계를 포함한다. 대상 항체의 특정 항원에 대한 친화성 및 결합 오프율은 스케차드 플롯 분석(scatchard plot analysis)에 의해 데이타로부터 결정할 수 있다. 또한, 2차 항체와의 경쟁은 방사면역분석을 이용하여 결정할 수 있다. 이 경우, 항원은 표지되지 않은 2차 항체의 양이 증가된 시리즈 하에, 표지된 화합물(예, 3H 또는 125I)이 접합된 대상 항체와 인큐베이션한다.
부가적으로, 본 발명의, 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체는, 암 항원의 유전자 산물이나, 그의 보존적인 변이체 또는 펩타이드 단편의 인시츄(in situ) 검출을 위해, 면역형광, 면역전자 현미경 또는 비-면역학적 분석과 같이 조직학적으로 사용할 수 있다. 인 시츄 검출은 환자로부터 조직학적 표본을 취하는 단계, 및 이를 표지된 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 적용, 바람직하게는 표지된 항체(또는 단편)을 생물학적 샘플 위에 적층함으로써 적용하는 단계에 의해 달성될 수 있다. 이러한 과정을 이용함으로써, CD20 단백질, 또는 그의 보존적인 변이체 또는 펩타이드 단편의 존재 뿐만 아니라 조사한 조직에서의 이의 분포를 결정하는 것이 가능하다. 본 발명을 이용하여, 당업자는 매우 다양한 조직학적 방법(예, 염색 방법) 들중 임의의 방법을 이러한 인 시츄 검출을 달성하기 위해 변형시킬 수 있음을 쉽게 인지할 것이다.
CD20 유전자 산물 또는 그의 보존적인 변이체나 펩타이드 단편에 대한 면역분석 및 비-면역분석은, 전형적으로, 생물학적 유액, 조직 추출물, 막 회수한 세포, 또는 세포 배양으로 배양한 세포의 용혈물과 같은 샘플을, CD 20 또는 그의 보존적인 변이체나 펩타이드 단편에 결합할 수 있는 검출가능하게 표지된 항체의 존재하에 인큐베이션하는 단계, 및 다수의 당업계에 잘 알려져 있는 기법들 중 임의 기법에 의해 결합된 항체를 검출하는 단계를 포함할 것이다.
생물학적 샘플은 니트로셀룰로스와 같은 고상 지지체나 담체, 또는 세포, 세포 입자 또는 가용성 단백질을 고정화시킬 수 있는 그외 고형 지지체와 접촉시켜, 그 위에 고정시킬 수 있다. 그런 후, 지지체는 적절한 완충액으로 세정한 다음, 검출가능하게 표지된 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체로 처리할 수 있다. 그후, 고상 지지체는 완충액으로 2번 세정하여, 결합되지 않은 항체를 제거할 수 있다. 그런 후, 선택적으로, 항체를 표지한다. 고체 지지체 상에 결합된 표지물의 양을 통상적인 방법에 의해 검출할 수 있다.
"고상 지지체 또는 담체"는 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 모든 지지체를 의미한다. 잘 알려져 있는 지지체 또는 담체로는, 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 천연 및 변형 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 반려암(gabbro) 및 자철광을 포함한다. 담체의 성질은, 본 발명의 목적에 따라 어느 정도 가용성이거나 불용성일 수 있다. 지지체 물질은 커플링된 분자가 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 한, 실제 모든 가능한 구조적 형태를 가질 수 있다. 따라서, 지지체 형태는 비드와 같이 구형, 또는 시험관의 내표면이나 막대의 외표면과 같은 실린더형일 수 있다. 다른 예로, 표면은 시트, 테스트 스트립 등과 같이 편평할 수 있다. 바람직한 지지체로 폴리스피렌 비드를 포함한다. 당업자들은 항체 또는 항원에 결합하기에 적합한 그외 다수의 담체를 인지하거나, 또는 통상적인 실험을 수행함으로써 이를 확인할 수 있을 것이다.
주어진 세트(lot)의 항-CD20 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 결합 활성을 잘 알려져 있는 방법들에 따라 결정할 수 있다. 당업자라면, 통상적인 실험을 수행함으로써 각 결정에 대해 유효하며 최적의 분석 조건을 결정할 수 있을 것이다.
항체-항원 상호작용의 친화성을 측정하기 위해 이용가능한 다양한 방법들이 있지만, 속도 상수(rate constant)를 결정하는 방법은 비교적 소수이다. 대부분의 방법들은, 불가피하게 통상적인 측정을 어렵게 하고, 측정된 수치에 불확실성을 도입하는, 항체 또는 항원의 표지 방법들 중 어느 한가지 방법에 의존한다.
BIAcore에서 수행되는 바와 같은 표면 플라스몬 공명(SPR)은 항체-항원 상호작용의 친화성을 측정하는 기존의 방법 이상의 많은 장점을 가지며, 그 예로는, (i) 항원 또는 항체를 표지할 필요가 없으며, (ii) 항체를 미리 정제할 필요가 없으며, 세포 배양 상층액을 직접 사용할 수 있으며, (iii) 여러가지 단일클론 항체 상호작용의 신속한 반-정량적 분석을 가능하게 하는 실시간 측정을 실시할 수 있으며, 많은 평가 목적에 충분하며, (iv) 생물특이적인 표면을 재생할 수 있어, 여러가지 단일클론 항체 시리즈를 동일한 조건하에서 쉽게 비교할 수 있으며, (v) 분석 과정 전체가 자동화되어 있고, 광범위한 시리즈의 측정을 사용자의 개입없이 수행할 수 있다. BIAapplications Handbook, version AB(reprinted 1998), BIACORE code No. BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, version AB(reprinted 1998), BIACORE code No. BR-1001-84.
SPR을 기초로한 결합 연구에는, 센서 표면 상에 결합 페어와이즈 중 하나의 성분이 고정되어야 한다. 고정된 결합 파트너를 리간드라고 한다. 용액 중의 결합 파트너를 분석물이라고 한다. 어떤 경우들에서, 리간드는 포획 분자라고 하는 다른 고정화된 분자에 결합을 통해 표면에 간접적으로 부착된다. SPR 반응은 분석물이 결합 또는 해리됨에 따라 검출기 표면에 되며, 질량 농도(mass concentration)의 변화를 반영한다.
SPR을 기초로, 실시간 BIAcore 측정은 발생함에 따라 직접적으로 상호작용을 모니터한다. 기법은 역학적 파라미터의 결정에 매우 적합하다. 상대적인 친화성 랭킹은 수행하기 매우 간단하며, 역학 상수 및 친화성 상수 모두 센서그람(sensorgram) 데이타로부터 추출할 수 있다.
분석물을 리간드 표면을 통해 이산 펄스(discrete pulse)로 주입하였을 때, 수득되는 센서그람을 3단계의 필연적인 단계(essential phase)로 나뉠 수 있다: (i) 샘플을 주입하는 동안에 분석물과 리간드의 조립; (ii) 샘플을 주입하는 동안에 평형 또는 정상 상태(steady state)로, 분석물의 결합 속도는 복합체로부터 해리에 의해 안정되는 상태; (iii) 완충액이 흐르는 동안에 표면으로부터 분석물의 해리.
조립 단계 및 해리 단계에서는, 분석물-리간드 상호작용의 친화성(ka 및 kd, 복합체 형성 및 해리 속도, kd/ka = KD)에 대한 정보가 제공된다. 평형 단계에서는 분석물-리간드 상호작용의 친화성(KD)에 대한 정보가 제공된다.
BIA평가 소프트웨어는, 수치 적분 및 전체적인 피팅 알고리즘(global fitting algorithm) 둘다를 이용하여, 곡선 피팅을 위한 포괄적인 수단을 제공한다. 데이타의 적절한 분석으로, 분리 속도 및 상호작용에 있어 친화성 상수를 간단한 BIAcore 조사로부터 구할 수 있다. 이러한 기법에 의해 측정가능한 친화성 범위는 mM 내지 pM으로 매우 넓다.
에피토프 특이성은 단일클론 항체의 주된 특징이다. 방사면역분석, ELISA 또는 그외 표면 흡착 방법을 이용한 통상적인 기법과는 대조적으로, BIAcore를 이용한 에피토프 맵핑에는 항체를 표지 또는 정제할 필요가 없으며, 일련의 수개의 단일클론 항체를 이용한 다중-부위 특이성 테스트가 가능하다. 부가하여, 대규모의 분석을 자동적으로 처리할 수 있다.
페어와이즈(Pair-wise) 결합 실험들은 2개의 MAb가 동시에 동이러한 항원에 결합할 수 있는 능력을 조사한다. 개별 에피토프에 대한 MAb는 독립적으로 결합하겠지만, 동일하거나 또는 밀접하게 관련있는 에피토프에 대한 MAb는 각 다른 결합을 간섭할 것이다. BIAcore를 이용한 이러한 결합 실험은 직접 수행한다.
예를 들면, 포획 분자를 이용하여 1차 Mab에 결합한 다음 항원과 2차 MAb를 순차적으로 첨가할 수 있다. 센서그람으로, 1. 1차 Mab에 몇개의 항원에 결합하는지, 2. 2차 MAb가 표면-부착된 항원에 결합하는 정도, 3. 2차 Mab가 결합하지 않는다면, 페어와이즈 테스트의 순서 반전이 결과를 변화시키는 지를, 알 수 있을 것이다.
펩타이드 저해는 에피토프 맵핑에 사용되는 다른 기법이다. 이러한 방법은 페어-와이즈 항체 결합 연구를 보완할 수 있으며, 항원의 일차 서열을 알고 있을 때 기능성 에피토프를 구조 특징과 연관시킬 수 있다. 펩타이드 또는 항원 단편은 고정화된 항원에 대한 여러가지 MAb의 결합성 저해에 대해 테스트한다. 주어진 MAb의 결합성을 방해하는 펩타이드는 상기 Mab로 규정된 에피토프와 구조적으로 관련성이 있는 것으로 추측된다.
본 발명의 실시는, 별도의 언급이 없는 한, 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학 등의, 당업계의 기술내에 있는 통상적인 기술을 이용할 것이다. 이러한 기법들은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예로, Sambrook et al. , ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al. , ed. (1992) Molecular Cloning : A Laboratory Manual , (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. 미국 특허 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al. , eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); and in Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland)을 참조한다.
항체 조작의 일반적인 원칙은 Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2nd ed.; Oxford Univ. Press)에 기술되어 있다. 단백질 조작에 대한 일반적인 원칙은 Rickwood et al. , eds. (1995) Protein Engineering , A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.)에 기술되어 있다. 항체 및 항체-헵텐 결합에 대한 일반적인 원칙은 Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2nd ed.; Sinauer Associates, Sunderland, MA); 및 Steward (1984) Antibodies , Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, NY)에 기술되어 있다. 또한, 당업계에 공지되어 있으며 특정적으로 기술되어 있지 않은, 면역학과 관련된 표준 방법들은, 일반적으로, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al. , eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8th ed; Appleton & Lange, Norwalk, CT) 및 Mishell and Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY)을 따른다.
면역학의 일반적인 원칙이 기재되어 있는 표준 참조 문헌으로는 Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein (1982) J., Immunology : The Science of Self - Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett et al. , eds. (1980) Monoclonal Antibodies , Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) "단일클론 항체 Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al. , (Elsevere, Amsterdam); Goldsby et al. , eds. (2000) Kuby Immunnology (4th ed.; H. Freemand & Co.); Roitt et al. (2001) Immunology (6th ed.; London: Mosby); Abbas et al. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5th ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann and Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlan); Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall2003); Harlow and Lane (1988) Antibodies : A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach and Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press)가 있다.
상기에서 인용한 문헌들과 문헌에 원용된 참고문헌들 모두 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
하기 실시예들은 예시로서 제공되며, 제한하는 것은 아니다.
도 1은 오리지날 인간화 뮤라인 항-CD20 단일클론 항체(mAb 1097)에 대한 H1286 가변 중쇄 도메인(서열번호 29) 및 L373 가변성 경쇄 도메인(서열번호 10)의 아미노산 서열은 나타낸 것이다. 각 가변성 도메인에 대한 상보성-결정 영역(CDR1, CDR2, 및 CDR3)을 이루는 잔기는 밑줄로 표시되어 있다.
도 2는 1236(서열번호 1), 1237(서열번호 2), 및 1238(서열번호 3) 최적화된 CDR3을 제조하기 위해(실시예 1 참조) 인간화 뮤라인 항-CD20 mAb 1097(CDR3는 "271"으로 명시됨)의 H1286 가변성 중쇄 도메인의 CDR3내에서 이루어진 치환을 나타낸 것이다. 271 CDR3 서열(서열번호 30)은 C2B8(rituximab)로 알려져 있는 뮤라인/인간 키메라 항-CD20 항체의 중쇄내 가변성 도메인의 CDR3 서열과 동일하다.
도 3은 최적화된 H1569(서열번호 12), H1570(서열번호 13) 및 H1571(서열번호 14) 가변성 중쇄 도메인의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. H1569는 최적화된 1236 CDR3(서열번호 1)을 포함하며; H1570은 최적화된 1237 CDR3(서열번호 2)을 포함하며, H1571은 최적화된 1238 CDR3(서열번호 3)을 포함한다. 이들 최적화된 각 가변성 중쇄 도메인을 L373 가변성 경쇄 도메인(서열번호 10)과 쌍을 지워, 최적화된 mAb 1236, mAb 1237 및 mAb 1238을 만들었다. 각 가변성 도메인에 있어 CDR1, CDR2 및 CDR3을 이루는 잔기들은 밑줄로 표시한다.
도 4는 최적화된 H1569(서열번호 19), H1570(서열번호 20), 및 H1571(서열번호 21) 가변성 중쇄 도메인에 대한 코딩 서열을 나타낸 것이다.
도 5는 L373 가변성 경쇄 도메인의 아미노산 서열(서열번호 10) 및 코딩 서 열(서열번호 23)을 나타낸 것이다. CDR1, CDR2 및 CDR3 각각에 대한 잔기 및 코딩 서열은 밑줄로 표시한다.
도 6A-6D는 최적화된 인간화 mAb 1236, mAb1237, 및 mAb 1238에 대한 결합 특이성 결과를 mAb 271(리툭시맵과 동일한 서열을 가짐)과 비교하여 나타낸 것이다. CD20을 발현하는 CHO 세포(도 6A), CD20+ EB1 세포(도 6B), CD20- CHO 벡터(도 6C), 및 CD20- NSO(도 6D)에 대한 최적화된 mAb의 결합 특이성은 FMAT(Flurometric Microvolume Assay Technology)에 의해 분석하였다. 실시예 2를 참조한다. NSO는 인간 CD20을 발현하지 않는 마우스 골수종 세포주이다.
도 7은 최적화된 mAb 1236, 1237 및 1238의 에피토프 인지를 결정하기 위한 뮤라인 2H7 블록킹 분석의 결과를 mAb 271과 비교하여 나타난 것이다. 최적화된 mAb는 모두 mAb 271과 동일한 에피토프를 인지한다. 실시예 2를 참조한다.
도 8은 최적화된 mAb 1236, 1237 및 1238의 보체 의존적인 세포독성(CDC: complement dependent cytotoxicity)을 결정하기 위한, CDC-mAb 오프율 분석의 결과를 mAb 271과 비교하여 나타낸 것이다. 최적화된 mAb는 mAb 271에서 관찰되는 결과에 비해 상대적으로 증가된 CDC 기능성 활성을 가지고 있다. 실시예 2를 참조한다.
도 9는 Daudi 타겟 세포에 대한 최적화된 mAb 1236, 1237 및 1238의 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC: antibody-dependent cellular cytotoxicity)을 결정하기 위한 ADCC 분석의 결과를 mAb 271과 비교하여 나타낸 것이다. 최적화된 mAb는 mAb 271에서 관찰되는 결과와 적어도 비슷한 ADCC 활성을 가지고 있다. 실시예 2를 참조한다.
도 10은 Ramos(NHL) 세포에 대한 최적화된 mAb 1236, 1237 및 1238의 세포자살 활성을 결정하기 위한 직접 세포자살 분석(CDC 및 ADCC 활성과 독립적임)의 결과를, 이소타입 대조군으로 제공된 mAb 271 및 mAb11과 비교하여 나타낸 것이다. 최적화된 mAb는 mAb 271만큼 세포자살을 유도하는데 유효하다. 실시예 2를 참조한다
도 11은 최적화된 mAb 1589에 대한 H1639 가변성 중쇄 도메인(서열번호 16) 및 L373 가변성 경쇄 도메인(서열번호 10)의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 각 가변성도메인에서 상보성 결정 영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)을 이루는 잔기는 밑줄로 표시한다.
도 12는 최적화된 mAb 1589의 각 중쇄 및 경쇄에서의 H1639 가변성 중쇄 도메인(서열번호 22) 및 L373 가변성 경쇄 도메인(서열번호 23)의 코딩 서열을 나타낸 것이다. 가변성 중쇄 및 가변성 경쇄 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 각각에 대한 코돈은 밑줄로 표시한다.
도 13은 최적화된 mAb 1588, 1589, 1590, 1652 및 1692의 에피토프 인지를 결정하기 위한 뮤라인 2H7 블록킹 분석의 결과를, mAb 271, 음성 대조군 항체 mAb 11, 최적화된 mAb 1237 및 리툭시맵(Rituxan®)과 비교하여 나타낸 것이다. 음성 대조군을 제외한 모든 테스트한 mAb는 동일하거는 중복되는 에피토프를 인지한다. 실시예 4를 참조한다.
도 14는 타겟 Daudi(NHL) 세포에 대한 최적화된 mAb 1588, 1589, 1590, 1652 및 1692의 CDC 활성을 결정하기 위한 CDC 분석의 결과를, mAb 271, 11 및 최적화된 mAb 1237에서 관찰되는 결과와 비교하여 나타낸 것이다. 최적화된 mAb 모두 mAb 271 보다 높은 CDC 기능성 활성을 일반적으로 매개한다. 실시예 4를 참조한다.
도 15A 및 15B는 2개의 타겟 B-CLL 세포주인 EHEB 세포(도 15A) 및 MEC-1 세포(도 15B)에 대한 최적화된 mAb 1588, 1589, 1590, 1652 및 1692의 CDC 활성을 결정하기 위한 CDC 분석의 결과를, mAb 271, mAb 11 및 최적화된 mAb 1237에서 관찰되는 결과와 비교하여 나타낸 것이다. 최적화된 mAb 모두 mAb 271에 비해 상대적으로 증가된 CDC 기능성 활성을 가진다. 실시예 4를 참조한다.
도 16은 최적화된 mAb 1588, 1590, 1652 및 1692의 CDC 활성을 결정하기 위한 CDC-mAb 오프율 분석의 결과를, mAb 271 및 최적화된 mAb 1237에서 관찰되는 결과와 비교하여 나타낸 것이다. 최적화된 mAb 모두 mAb 271에 비해 상대적으로 증가된 CDC 기능성 활성을 가진다. 실시예 4를 참조한다.
도 17A 및 17B는 2종의 타겟 NHL 세포주인 Daudi 세포(도 17A) 및 WIL2-S 세포(도 17B)에 대한 최적화된 mAb 1588, 1590, 1652 및 1692의 CDC 활성을 결정하기 위한 비-방사성 CDC 분석의 결과를, mAb 271, 최적화된 mAb 1237 및 음성 대조군 mAb11(본 도면에서 "NEG"로 표시함)에서 관찰되는 결과와 비교하여 나타낸 것이다. 실시예 4를 참조한다.
도 18A 및 18B는 2개의 타겟 B-CLL 세포주인 EHEB 세포(도 18A) 및 MEC-1 세 포(도 18B)에 대한 최적화된 mAb 1588, 1589, 1590, 1652 및 1692의 CDC 활성을 결정하기 위한 비-방사성 CDC 분석의 결과를, mAb 271, 최적화된 mAb 1237 및 음성 대조군 mAb11(본 도면에서 "NEG"로 표시함)에서 관찰되는 결과와 비교하여 나타낸 것이다. 실시예 4를 참조한다.
도 19A 및 19B는 2종의 EBV-형질전환된 B 세포주("정상" B 세포), SS BLCL 세포(도 19A) 및 MelK BLCL 세포(도 19B)에 대한 최적화된 mAb 1588, 1589, 1590, 1652 및 1692의 CDC 활성을 결정하기 위한 비-방사성 CDC 분석의 결과를, mAb 271, 최적화된 mAb 1237 및 음성 대조군 mAb11(본 도면에서 "NEG"로 표시함)에서 관찰되는 결과와 비교하여 나타낸 것이다. 실시예 4를 참조한다.
도 20은 Daudi (NHL) 세포에 대한 최적화된 mAb 1588, 1589, 1590, 1652 및 1692의 ADCC 활성을 결정하기 위한 ADCC 분석의 결과를, mAb 271, 최적화된 mAb 1237 및 대조군 IgG와 비교하여 나타낸 것이다. 실시예 4를 참조한다.
도 21은 MEC-1(B-CLL) 세포에 대한 최적화된 mAb 1588, 1589, 1590, 1652 및 1692의 ADCC 활성을 결정하기 위한 ADCC 분석의 결과를, mAb 271, 최적화된 mAb 1237 및 대조군 IgG와 비교하여 나타낸 것이다. 최적화된 mAb는 mAb271에서 관찰되는 결과와 비슷한 ADCC 활성을 가진다. 실시예 4를 참조한다.
도 22는 Ramos (NHL) 세포에 대한 최적화된 mAb 1236, 1237 및 1238의 세포자살 활성을 결정하기 위한 직접 세포자살 분석(CDC 및 ADCC 활성과는 독립적으로)을, mAb 271 및 이소타입 대조군으로서 제공되는 mAb11과 비교하여 나타낸 것이다. 최적화된 mAb는 mAb271에서처럼 세포자살을 유도하는데 유효하다. 실시예 4를 참 조한다.
도 23은 Daudi (NHL) 세포에 대한 최적화된 mAb 1588, 1589, 1590, 1652 및 1692의 전-혈액 분석의 결과를 mAb 271 및 최적화된 mAb 1237과 비교하여 나타낸 것이다. 최적화된 mAb는 mAb271과 비교하여, 이들 세포에 대한 동일하거나 또는 우수한 용혈성을 가진다. 실시예 4를 참조한다.
도 24A 및 24B는 2종의 타겟 B-CLL 세포주인 EHEB 세포(도 24A) 및 MEC-1 세포(도 24B)에 대한 최적화된 mAb 1588, 1589, 1590, 1652 및 1692의 세포 사멸 활성을 결정하기 위한 전-혈액 분석의 결과를 mAb 271 및 최적화된 mAb 1237과 비교하여 나타낸 것이다. 최적화된 mAb는 mAb271과 비교하여, 이들 세포에 대한 동일하거나 또는 우수한 용혈성을 가진다. 실시예 4를 참조한다.
도 25는 EBV-형질전환된 B 세포주 MelK BLCL ("정상" B 세포)의 ADCC 활성을 결정하기 위한 ADCC 전-혈액 분석의 결과를 mAb 271 및 최적화된 mAb 1237과 비교하여 나타낸 것이다. 최적화된 mAb는 mAb271과 비교하여, 이들 세포에 대한 동일하거나 또는 우수한 용혈성을 가진다. 실시예 4를 참조한다.
도 26은 Daudi 세포 이종이식 모델에서 mAb 1589의 활성을 결정하기 위한 최적화된 인간화 항-마우스 CD20 단일클론 항체 1589의 생체내 테스트의 결과를 나타낸 것이다. mAb 1589 항체는 인간 Daudi 세포 이종 이식을 이용한 마우스의 생존을 연장시키는데 유효하다. 실시예 5를 참조한다.
실시예 1: 인간화 뮤라인 항- CD20 항체의 최적화
인간화된 뮤라인 항-CD20 단일클론 항체를 가변성 중쇄(VH; 서열번호 29) 및 가변성 경쇄(VK; 서열번호 10) 도메인의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 조작하여, CDC 기능이 증가된 최적화된 mAb를 제조하였다. 초기 인간화 뮤라인 항-CD20 mAb는 리툭시맵(즉, mAb C2B8; 미국 특허 5,736,137)이라고 하는 뮤라인/인간 키메라 항-CD20 항체의 인간화된 형태이다. 인간화된 뮤라인 항-CD20 mAb내 오리지날 VH 도메인(H1286) 및 오리지날 VK 도메인(L373)의 3가지 CDR을 도 1에 나타내었다. L373(서열번호 9)의 CDR2는 뮤라인 VK가 아닌 인간 VK로부터 유래되었다.
처음 최적화 단계는, H1286 VH 도메인(도 2)의 처음 CDR3(도 1에서 "271"; 서열번호 30)의 변형을 포함한다. 271 CDR3 서열은 mAb C2B8의 중쇄내 가변성 도메인의 CDR3의 서열과 동일하다. 271 CDR3에 처음 변형은 하기를 포함한다:
1) 처음 CDR3의 9번 위치에서의 타이로신에서 아스파라긴(Y -> N)으로의 치환 및 처음 CDR3의 12번 위치에서의 발린에서의 아스파라긴(V -> N)으로의 치환으로, "1236" 최적화된 CDR3(서열번호 1) 제조;
2) 처음 CDR3의 5번 위치에서의 글리신에서의 알라닌(G -> A)으로의 치환 및 처음 CDR3의 9번 및 12번 위치에서의 각각 Y -> N 및 V -> N 치환으로, "1237" 최적화된 CDR3(서열번호 2) 제조; 또는
3) 처음 CDR3의 12번 위치에서의 발린에서의 아스파르트산(V -> D)으로의 치환 및 처음 CDR3의 5번 및 9번 위치에서의 각각 G -> A 및 Y -> N 치환으로, "1238" 최적화된 CDR3(서열번호 2) 제조.
최적화된 CDR3에 대한 각 코딩 서열들은 서열번호 24(1236 최적화된 CDR3 코딩), 서열번호 25(1237 최적화된 CDR3 코딩), 및 서열번호 26(1238 최적화된 CDR3 코딩)에 기재되어 있다.
그런 후, 이들 최적화된 CDR3는 H1286의 오리지날 인간화된 VH 도메인 프래임워크 내로 조작하여, 다음과 같은 최적화된 VH 도메인을 제조하였다: 서열번호 1의 1236 최적화된 CDR3을 포함하는 H1569(서열번호 12); 서열번호 2의 1237 최적화된 CDR3을 포함하는 H1570(서열번호 13); 및 서열번호 3의 1238 최적화된 CDR3을 포함하는 H1571(서열번호 14)(도 3 참조). 이들 최적화된 VH 도메인에 대한 코딩 서열들은 도 4와, 서열번호 19(H1569), 서열번호 20(H1570), 및 서열번호 21(H1571)에 기재되어 있다. 이들 각각의 최적화된 VH 도메인들은 오리지날(L373) VK 도메인(도 5 참조; 서열번호 10; 서열번호 23에 기재된 코딩 서열)과 쌍을 지워, 다음과 같은 최적화된 인간화 mAb를 제조하였다: mAb 1236, mAb 1237, 및 mAb 1238.
실시예 2: 최적화된 인간화 뮤라인 항- CD20 단일클론 항체의 결합 및 기능적 특성
실시예 1에 언급된 최적화된 인간화 mAb 1236, mAb 1237, 및 mAb 1238을 이들 각각의 결합 및 기능적 특성에 대해 평가하였다. 각 분석에서, 리툭시맵(IDEC- C2B8; Rituxan® IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, California)과 서열이 동일한 mAb 271을 양성 대조군으로 사용하였다.
결합 특이성은 FMAT(Fluorometric Microvolume Assay Technolog, Applied Biosystems 8200 Cellular Detection System) 및 유세포측정기로 평가하고, CD20 양성 (CD20+) 및 CD20 음성 세포주에 대한 평균 염색 형광 강도(MFI)를 도표화하였다. FMAT 분석으로 CD20(도 6A-6D)에 대한 결합 특이성이 확인되었다. 유세포 측정에서는 이들 최적화된 인간화항-CD20 mAb의 CD20+ Daudi 및 EB1 세포에 대한 결합성이 확인되었다(표 2).
표 2. CD20 양성 및 음성 세포주에 대한 결합성
유세포 측정 결과(평균 형광 강도)
　 Daudi EB1 K562 U266
MAb CD20 양성 CD20 양성 CD20 음성 CD20 음성
271 145 429 10 9
1236 145 409 12 11
1237 132 395 14 11
1238 114 389 11 10
11
(음성 대조군)		 8 8 6 5
mAb1236, mAb 1237 및 mAb 1238에 의해 인지되는 에피토프를 분석하기 위해, 세포와 CD20-특이적인 마우스 2H7 항체(또는 마우스 ISO) @ 3 ㎍/ml을 FMAT 플레이트에 첨가한 다음, 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 테스트 mAb(30 ng/ml) 및 항-인간 IgFc-Alexa 647을 여기에 첨가하고, FMAT에 의해 형광 신호를 검출하였다. 마우스 2H7(m2H7)에서의 신호 감소는 에피토프의 블록킹을 의미한다.
도 7에서 알 수 있는 바와 같이, mAb 1236, mAb 1237 및 mAb 1238 모두 mAb 271(리툭시맵-서열 항체)과 동일한 에피토프를 인지한다.
보체 의존적인 세포독성(CDC) 및 항체-의존적인 세포성 세포독성(ADCC)를 평가하였다. CDC에서, 항체 오프율 분석을 사용하였다. 이러한 방식으로, 타겟 CD20+ Daudi 세포에 51Cr, 200 μCi를 2시간 동안 부하한 다음, 세정하였다. 세정한 Daudi 세포는 각각의 mAb 10 ㎍/ml과 15분간 25 ℃에서 인큐베이션하였다. 그런 후, 타겟 Daudi 세포를 충분히 세정하고, 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 37 ℃에서 0, 1, 2, 4 및 6 시간 인큐베이션한 다음, 세포는 45분간 6% 인간 혈청(보체(complement) 소스)과 함께 인큐베이션하였다. 대조군에는 자발적인 최대 51Cr 방출, mAb + Daudi 세포 단독 및 혈청 + Daudi 세포 단독이 모든 농도에서 포함되었다. 그 후, 상층액을 처리하여, 감마 카운터로 방출되는 51Cr를 계측하였다. 항체-특이적인 CDC는 용혈에서의 mAb 및 혈청 단독 기여를 제하여 결정하였다.
도 8에서 알 수 있는 바와 같이, mAb 1236, mAb 1237 및 mAb 1238은 mAb 271 (리툭시맵-서열 항체) 보다 현저하게 우수한 CDC 기능성 활성을 가진다.
ADCC 활성은 타겟 Daudi 세포에 51Cr, 200 μCi를 2시간 동안 부하한 다음, 세정하여 분석하였다. 세정한 Daudi 세포를 적정화한 농도의 각 mAb 및 50:1로 신선하게 준비한 PBMC(NK 소스)와 함께 4시간 인큐베이션하였다. 대조군에는 자발적인 최대 51Cr 방출, mAb + Daudi 세포 단독 및 PBMC + Daudi 세포 단독이 모든 농도 에서 포함되었다. 그 후, 상층액을 처리하여, 감마 카운터로 방출되는 51Cr를 계측하였다. 항체-특이적인 ADCC는 용혈에서의 PBMC 기여를 제하여 결정하였다.
도 9에서 알 수 있는 바와 같이, ADCC 활성은 테스트한 모든 mAb에서 mAb의 농도가 증가할수록 증가하였다. 모든 mAb 농도에서, Ab 1236, mAb 1237 및 mAb1238은 대조군 mAb 271 (리툭시맵-서열 항체)에서 관찰되는 결과와 동일한 ADCC 활성을 가진다.
세포자살 활성도 CDC 및 ADCC 독립적인 직접 세포자살 분석으로 평가하였다. 이 방식에서, Ramos 세포(NHL)를, 교차 항체(5 ㎍/ml 염소 항-인간 IgG Fc)의 존재하에, 각각의 mAb 10, 2, 0.4, 또는 0.08 ㎍/ml과 37 ℃에서 18시간 인큐베이션하였다. mAb 11은 이소타입 대조군으로 사용하였다. 18 시간 후 세포를 회수하여 세정한 다음, Annexin V-APC 및 Propidium Iodide와 25 ℃에서 15분간 인큐베이션하였다. 세포는 Annexin V 양성/PI 음성 세포의 존재에 대해 유세포 측정으로 분석하였다.
도 10에서 알 수 있는 바와 같이, 최적화된 인간화 mAb 1236, 1237 및 1238은 mAb 271 (리툭시맵-서열 항체)과 같이 세포자살을 유도하는데 효과적이다.
실시예 3: mAb 1237에 대한 추가적인 최적화
B-세포 만성 림프구성 백혈병(B-CLL) 세포는 NHL(비-호지킨 림프종) 세포 보다 CD20을 적게 발현한다. 테스트를 통해, 최적화된 mAb 1236, mAb 1237 및 mAb 1238이 B-CLL 세포에 대해 약한 CDC를 보인다는 것이 확인되었다. 다음 단계로서, mAb 1237을 선택하여, 돌연변이를 유발하고 B-CLL 세포에 대한 친화성 향상 및 그로 인한 B-CLL 세포의 용혈 향상을 스크리닝하였다. 친화성 개성 전략은, VH 및 VK 도메인에서 특정 위치를 무작위화하는 단계, L373을 가진 돌연변이 VH 도메인을 선별하는 단계, H1570을 가진 돌연변이 VK 도메인을 선별하는 단계, VH 또는 VK 중 어느 하나에서 각각의 유익한 돌연변이들을 조합하는 단계, 및 돌연변이 VH 도메인을 돌연변이 VK 도메인과 조합하는 단계로 이루어진다. 동정된 새로운 돌연변이들은 표 3에 나타낸다.
표 3. 동정한 새로운 돌연변이들. VH 및 VK 도메인내 잔기 위치는 Kabat 넘버링 체계에 따른다.
mAb VH VK
1588 H1638 (H1570 S31F) L373
1589 H1639 (H1570 D56A) L373
1590 H1640 (H1570 D56L) L373
1652 H1639 (H1570 D56A) L419 (L373 T92Q)
1692 H1670 (H1570 N101G) L373
최적화된 mAb 1588은 H1638 VH 도메인(서열번호 15)(이것은, H1570의 Kabat 넘버링 체계에 따른 31번 위치에서 S -> F 치환이 있는 H1570 VH 도메인이며, 상기 31번 위치는 서열번호 13에 기재되어 있는 H1570 아미노산 서열의 31번 잔기에 해당됨) 및 L373 VL 도메인(서열번호 10)을 포함한다. 이러한 S -> F 치환으로, H1638 VH 도메인내에 최적화된 CDR1(서열번호 7 참조)가 형성된다.
최적화된 mAb 1589는 H1639 VH 도메인(서열번호 16)(이것은, H1570의 Kabat 넘버링 체계에 따른 56번 위치에서 D -> A 치환이 있는 H1570 VH 도메인이며, 상기 56번 위치는 서열번호 13에 기재되어 있는 H1570 아미노산 서열의 57번 잔기에 해당됨) 및 L373 VL 도메인(서열번호 10)을 포함한다. 이러한 D -> A 치환으로, H1639 VH 도메인내에 최적화된 CDR2(서열번호 5 참조; 서열번호 27에 의해 코딩됨)가 형성된다.
최적화된 mAb 1590은 H1640 VH 도메인(서열번호 17)(이것은, H1570의 Kabat 넘버링 체계에 따른 56번 위치에서 D -> L 치환이 있는 H1570 VH 도메인이며, 상기 56번 위치는 서열번호 13에 기재되어 있는 H1570 아미노산 서열의 57번 잔기에 해당됨) 및 L373 VL 도메인(서열번호 10)을 포함한다. 이러한 D -> L 치환으로, H1640 VH 도메인내에 최적화된 CDR2(서열번호 6)가 형성된다.
최적화된 mAb 1652는 H1639 VH 도메인(서열번호 16) 및 L419 VL 도메인(서열번호 11)(이것은, L373의 Kabat 넘버링 체계에 따른 92번 위치에서 T -> Q 치환이 있는 L373 VL 도메인이며, 상기 92번 위치는 서열번호 10에 기재되어 있는 L373 아미노산 서열의 91번 잔기에 해당됨)을 포함한다. 이러한 T -> Q 치환으로, L419 VL 도메인내에 최적화된 CDR3(서열번호 8)이 형성된다.
최적화된 mAb 1692는 H1670 VH 도메인(서열번호 18)(이것은, H1570의 Kabat 넘버링 체계에 따른 101번 위치에서 N -> G 치환이 있는 H1570 VH 도메인이며, 상기 101번 위치는 서열번호 13에 기재되어 있는 H1570 아미노산 서열의 109번 잔기에 해당됨)을 포함한다. 이러한 N -> G 치환으로, H1670 VH 도메인내에 최적화된 CDR3(서열번호 4)이 형성된다.
mAb 1589의 H1639 VH 도메인(서열번호 16) 및 L373 VL 도메인(서열번호 10)의 아미노산 서열은 도 11에 나타내며, 각각의 코딩 서열은 도 12에 나타내며, 또는 서열번호 22(H1639에 대한 코딩 서열) 및 서열번호 23(L373에 대한 코딩 서열)을 참조한다.
실시예 4: 추가적으로 최적화된 인간화 뮤라인 항- CD20 단일클론 항체의 결합 및 기능적 특성
실시예 1의 최적화된 인간화 mAb 1237과, 실시예 3에 언급된 또다른 최적화된 인간화 mAb 1588, 1589, 1590, 1652 및 1692를, 각각의 결합 및 기능적 특성에 대해 분석하였다. 각 분석에서, 리툭시맵(IDEC-C2B8; Rituxan® IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, California)과 서열이 동일한 mAb 271을 양성 대조군으로 사용하였다.
결합 특이성은 유세포 측정기로 평가하고, CD20 양성 (CD20+) 및 CD20 음성 세포주에 대한 평균 염색 형광 강도(MFI)를 도표화하였다. 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 유세포 측정에서 이들 최적화된 인간화 항-CD20 mAb의 CD20에 대한 결합성이 확인되었다.
표 4. CD20 양성 및 음성 세포주에 대한 결합성
유세포 측정 결과(평균 형광 강도)
Daudi EHEB CHO.CD20 HL60 K562 CHO 벡터
mAb CD20양성 CD20양성 CD20양성 CD20 음성 CD20 음성 CD20 음성
271 941 130 81 6 3 4
1237 1373 161 106 8 9 6
1588 2068 338 140 9 6 4
1589 1029 345 140 8 6 5
1590 1627 429 135 8 7 6
1652 1422 529 135 6 6 5
1692 1671 450 137 7 4 5
11 (음성 대조군 6 8 5 7 4 6
mAb 2H7 이 결합을 차단하는 능력을 조사함으로써, 에피토프 보존성을 평가하였다. 이 방법에서, 마우스 2H7(또는 대조군으로서 이소타입 Ig)을 EB1 세포에 넣은 다음, 후보물질인 인간 mAbs 및 항-인간 Ig Alexa 647을 첨가하였다. 결합은 FMAT에 의해 검출하였다. 신호의 감소는 차단 및 공통적인 에피토프 사용(common epitope usage)을 의미한다.
도 13에서 알 수 있는 바와 같이, 테스트한 항체들 모두 동일하거나 또는 중첩되는 에피토프들을 인지하였다.
보체 의존적인 세포독성(CDC) 및 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)를 조사 하였다. CDC를 위해 몇가지 분석을 사용하였다. 1차 방사능 분석은 타겟 세포에 51Cr, 200 μCi를 2시간동안 부하하는 단계를 포함한다. 세정한 타겟 세포(Daudi (NHL) 및 B-CLL 세포주)를 적정한 농도의 mAb 및 인간 혈청(보체 소스)와 4시간 동안 인큐베이션한다. 대조군에는 자발적인 최대 51Cr 방출, mAb + 세포 단독 및 혈청 + 세포 단독이 모든 농도에서 포함되었다. 항체 특이적인 CDC를 용혈로부터 mAb 및 혈청 단독 기여로부터 제하여, 결정하였다. Daudi와 2종의 B-CLL 세포에 대한 결과는 각각 도 14, 15A 및 15B에 나타내었다. Daudi 세포의 경우, 최적화된 mAb는 특히 저농도에서 일반적으로 mAb 271 (리툭시맵-서열 항체) 보다 높은 CDC 기능을 매개하였다. B-CLL 세포의 경우, 최적화된 mAb는 mAb 271 (리툭시맵-서열 항체) 이상의 증가된 CDC 기능을 보였다.
또한, 항체 오프율 분석으로 CDC 기능을 평가하였다. 이러한 분석에서, 타겟 CD20+ Daudi 세포에 51Cr, 200 μCi를 2시간 동안 부하한 다음, 세정하였다. 세정한 Daudi 세포는 각각의 mAb 10 ㎍/ml과 15분간 25 ℃에서 인큐베이션하였다. 그런 후, 타겟 Daudi 세포를 충분히 세정하고, 6% 인간 혈청(보체 소스)와 45' 동안 37 ℃에서 인큐베이션한 다음 37 ℃에서 0, 1, 2, 4 및 6 시간 인큐베이션하였다. 대조군에는 자발적인 최대 51Cr 방출, mAb + Daudi 세포 단독 및 혈청 + Daudi 세포 단독이 모든 농도에서 포함되었다. 그 후, 상층액을 처리하여, 감마 카운터로 방출되는 51Cr를 계측하였다. 항체-특이적인 CDC는 용혈에서의 mAb 및 혈청 단독 기여를 제하여 결정하였다.
도 16에서 알 수 있는 바와 같이, 최적화된 mAb 모두 mAb 271 (리툭시맵-서열 항체) 보다 현저하게 우수한 CDC 기능적 활성을 가진다.
또한, CDC 기능을 비-방사능(Alamar Blue™) CDC 분석으로 분석하였다. 이러한 분석에서는, 타겟 세포(각 2종의 NHL, B-CLL, 및 정상적인 B 세포주)를 적정화한 농도의 mAb와 인간 혈청(보체 소스)로 세정하였다. 대조군에는, 인간 혈청(자발적인 세포 사멸)이 무첨가된 타겟 세포 + 혈청, 항체가 무첨가된 타겟 세포 + 혈청(백그라운드 세포 용혈), 및 항체 및 혈청을 대체하는 100% SDS + 타겟 세포 웰(최대 세포 사멸용)이 포함되었다. 2시간 후에 각 웰에 Alamar Blue를 첨가한 다음, 하룻밤 인큐베인션 한 후 형광을 판독하였다. 본 분석에서, 형광이 강할수록, 살아있는 세포의 수가 많으며 CDC로 인한 세포독성이 낮음을 의미한다.
AlamarBlue™은 증식하고 있는 세포에서의 대사성 활성에 대한 반응으로 형광을 발하는 산화-환원 표시체(oxidation-reduction indicator)이다. AlamarBlue™은 테트라졸륨 염(MTT)와 비슷하게, 둘다 세포의 대사 변화를 검출할 수 있지만, AlamarBlue™가 MTT 보다 독성이 낮고 더 민감하다. AlamarBlue™ 및 51Cr 방출 분석을 이용하여 비교한, 세포 매개 세포독성 측정으로 수득한 결과는, AlamarBlue™ 방법이 51Cr 방출의 결정인자처럼 특이적임을 나타낸다. 결과들은 도 17A(Daudi NHL 세포주) 및 17B WIL2-S NHL 세포주), 도 18A(EHEB B-CLL 세포주), 도 18B (Mec-1 B-CLL 세포주), 도 19A(SS BLCL "정상" B 세포) 및 도 19B(Mel K BLCL "정 상" B 세포)에 나타내었다.
방사능분석은 4시간이 소요되는 분석이지만, 비-방사능 분석은 18-20 시간이 소요되는 분석이다. 후보물질인 최적화된 mAb는 통상 비-방사능 분석에서 대조군에 비해 높은 세포 용혈성을 나타내었다. 비-방사능 분석은, 약물이 생체내 조건에서 4 시간 보다 오랜 시간 동안 고농도로 존재하게 되므로, 생체내 조건에 보다 유사한 상황을 나타낼 수 있다.
결과들을 종합하면, 최적화된 mAb의 CDC 활성은 Daudi NHL 세포에서 mAb 271 (리툭시맵-서열 항체)과 일정 부분 이상 동일하다. 오프율 CDC 분석에서 최적화된 mAb는 mAb 271 보다 우수하다. 오프율이 낮을 수록, 최적화된 mAb의 친화성이 mAb 271의 친화성 보다 높다는 것을 의미한다. 마지막으로, 최적화된 mAb는 B-CLL 세포주와 정상 B 세포 타겟을 용혈시키는데, mAb 271 보다 더 효과적이다.
ADCC 활성은 타겟 세포(Daudi 및 B-CLL)에 51Cr, 200 μCi를 2시간 동안 부하한 다음, 세정하여 분석하였다. 세정한 타겟 세포를 적정화한 농도의 각 mAb와, 50:1로 신선하게 준비한 PBMC(NK 소스)와 함께 4시간 인큐베이션하였다. 대조군에는 자발적인 최대 51Cr 방출, mAb + 타겟 세포 단독 및 PBMC + 세포 단독이 모든 농도에서 포함되었다. 그 후, 상층액을 처리하여, 감마 카운터로 방출되는 51Cr를 계측하였다. 항체-특이적인 ADCC는 용혈에서의 PBMC 기여를 제하여 결정하였다.
도 20(Daudi NHL 세포) 및 도 21(MEC-1 B-CLL)에서 알 수 있는 바와 같이, ADCC 활성은 테스트한 모든 mAb에서 mAb의 농도가 증가할수록 증가하였다. 최적화 된 mAb는 대조군 mAb 271(리툭시맵-서열 항체)에서 관찰되는 결과와 유사한 ADCC 활성을 가진다.
세포자살 활성 역시 CDC 및 ADCC 독립적인 직접 세포자살 분석으로 평가하였다. 이 방식에서, Ramos 세포(NHL)를, 교차 항체(5 ㎍/ml 염소 항-인간 IgG Fc)의 존재하에, 각각의 최적화된 mAb 10, 2, 0.4, 또는 0.08 ㎍/ml 또는 대조군 mAb 271과 37 ℃에서 18시간 인큐베이션하였다. 18 시간 후 세포를 회수하여 세정한 다음, Annexin V-APC 및 Propidium Iodide와 25 ℃에서 15분간 인큐베이션하였다. 세포는 Annexin V 양성/PI 음성 세포의 존재에 대해 유세포 측정으로 분석하였다.
도 22에서 알 수 있는 바와 같이, 최적화된 mAb는 mAb 271(리툭시맵-서열 항체)과 같이 세포자살을 유도하는데 효과적이다.
또한, 세포 사멸 활성을 전-혈액 분석을 이용하여 평가하였다. 프로토콜은 CDC 또는 ADCC 분석과 동일하며, 단지 전-혈액을 혈청(CDC) 또는 정제한 PBMC(ADCC) 대신 사용한다. 본 분석에서, 타겟 세포의 용혈은 CDC, ADCC 및 세포자살의 누적 활성으로 인한 것이다.
이러한 전-혈액 분석의 결과는 도 23(Daudi NHL 세포), 도 24A(EHEB B-CLL 세포), 도 24B(MEC-1 B-CLL 세포), 및 도 25 (Mel K "정상" B 세포)에 나타내었다. 상기 도면들에서 알 수 있는 바와 같이, 최적화된 mAb는 mAb 271(리툭시맵-서열 항체)처럼 각각의 타겟 세포에 대해 동일하거나 보다 우수한 용혈성을 가진다.
실시예 5: 최적화된 인간화 뮤라인 항- CD20 단일클론 항체 1589의 투여는 Dauci 세 포의 이종이식 마우스 모델에서의 생존성을 연장시킨다 .
Daudi NHL 세포는 SCID 마우스에서 전신에서 증식하는 인간 B 세포 림프종 세포주이다. Daudi 세포의 증식으로 인해 마우스가 마비된다(Ghetie et al. (1990) Int J Cancer 45:481-485). 본 발명의 항-CD20 항체가 Daudi 세포 이종 이식을 수행한 마우스의 생존에 영향을 미치는 지를 결정하기 위한, 실험들을 수행하였다.
SCID 마우스를 교배하여, 병원체-무균 조건에서 사육하였다. Daudi NHL 세포(8 x 106)를 5마리의 SCID 마우스(총 15마리)로 이루어진 군들 총 3군에 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 종양 주사 후 7일 및 9일째에, 마우스에 PBS, 50 ㎍ 인간 IgG1 또는 50 ㎍ mAb 1589를 동일한 경로로 주사하였다. 동물은 1주일에 3번 관찰하였고, 하지 마비 신호가 처음 나타났을 때 희생시켰다. 도 26에서 알 수 있는 바와 같이, 단일클론 항체 1589는 인간 Daudi 세포 이종 이식을 받은 마우스의 생존성을 연장시켰다.
실시예 6: 개략적인 서열 및 항체 설계
여러가지 최적화된 CDR, 이들 최적화된 CDR을 포함하는 가변성 중쇄 및 경쇄 도메인, 이들 요소들의 코딩 서열, 및 오리지날 인간화된 항-CD20 항체에 대한 가변성 중쇄 도메인의 서열 식별을 아래에 개괄하여 나타내었다. 하기 표 5는 항-CD20 항체 설계를 개괄한 것이다.
서열 식별:
1. H1569의 CDR3 - 아미노산
2. H1570의 CDR3 - 아미노산
3. H1571의 CDR3 - 아미노산
4. H1670의 CDR3 - 아미노산
5. H1639의 CDR2 - 아미노산
6. H1640의 CDR2 - 아미노산
7. H1638의 CDR1 - 아미노산
8. L419의 CDR3 - 아미노산
9. L373의 CDR3 - 아미노산
10. L373 - 아미노산
11. L419 - 아미노산
12. H1569 - 아미노산
13. H1570 - 아미노산
14. H1571 - 아미노산
15. H1638 - 아미노산
16. H1639 - 아미노산
17. H1640 - 아미노산
18. H1670 - 아미노산
19. H1569 - 뉴클레오타이드 서열
20. H1570 - 뉴클레오타이드 서열
21. H1571 - 뉴클레오타이드 서열
22. H1639 - 뉴클레오타이드 서열
23. L373 - 뉴클레오타이드 서열
24. H1569의 CDR3 - 뉴클레오타이드 서열
25. H1570의 CDR3 - 뉴클레오타이드 서열
26. H1571의 CDR3 - 뉴클레오타이드 서열
27. H1639의 CDR2 - 뉴클레오타이드 서열
28. L373의 CDR2 - 뉴클레오타이드 서열
29. H1286 - 아미노산
30. H1286의 CDR3 - 아미노산
표 5. 아미노산 설계
항체 명칭 V H 도메인 V L 도메인
모체 인간화된 뮤라인 항-CD20 H1286(서열번호 29) L373(서열번호 10)
1236 H1569 (서열번호 12) L373 (서열번호 10)
1237 H1570 (서열번호 13) L373 (서열번호 10)
1238 H1571 (서열번호 14) L373 (서열번호 10)
1588 H1638 (서열번호 15) L373 (서열번호 10)
1589 H1639 (서열번호 16) L373 (서열번호 10)
1590 H1640 (서열번호 17) L373 (서열번호 10)
1593 H1570 (서열번호 13) L419 (서열번호 11)
1652 H1639 (서열번호 16) L419 (서열번호 11)
1692 H1670 (서열번호 18) L373 (서열번호 10)
전술한 설명과 첨부된 도면에 제시된 내용이 유익한 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면, 본원에 기술된 본 발명에 대한 많은 변형과 다른 구현예를 생 각할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 구체적으로 기술된 예들로 한정되지 않으며, 변형과 다른 예들이 본원에 기술된 예들과 첨부된 청구범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서는 구체적인 용어를 사용하고 있지만, 이는 단지 포괄적이고 설명하고자 하는 의미로 사용된 것일 뿐 한정하기 위한 것은 아니다.
본 명세서에 언급된 모든 공개물 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자의 수준을 나타낸다. 모든 공개물 및 특허 출원은, 각각의 공개물 또는 특허 출원이 원용에 의해 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 제시되어 있는 것과 동일한 수준으로 원용에 의해 본원에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Ernest S. Smith Terrence L. Fisher, Jr. <120> Anti-CD20 Antibodies and Methods of Use <130> 050827/333624 <150> 11/869,170 <151> 2007-10-09 <150> 60/850,604 <151> 2006-10-10 <160> 30 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of H1569 <400> 1 Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of H1570 <400> 2 Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of H1571 <400> 3 Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asp 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of H1670 <400> 4 Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Gly Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of H1639 <400> 5 Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of H1640 <400> 6 Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Leu Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of H1638 <400> 7 Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Phe Tyr Asn Met His 1 5 10 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of L419 <400> 8 Gln Gln Trp Gln Ser Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of L373 <400> 9 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 10 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L373 - humanized murine anti-CD20 light chain <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 11 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L419 - anti-CD20 light chain variant <400> 11 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Gln Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 12 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1569 - 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anti-CD20 heavy chain variant <400> 14 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asp Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1638 - anti-CD20 heavy chain variant <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Phe Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1639 - anti-CD20 heavy chain variant <400> 16 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1640 - anti-CD20 heavy chain variant <400> 17 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Leu Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1670 - anti-CD20 heavy chain variant <400> 18 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Gly Asn Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1569 - anti-CD20 heavy chain variant <221> CDS <222> (1)...(363) <400> 19 cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct ggg tac acc ttc acc agt tac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 aat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg cta gag tgg att 144 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gct att tat ccc gga aat ggt gat act tcc tac aat cag aag ttc 192 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aaa ggc aag gcc aca ata act gca gac aaa tcc acg agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctc agc agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga tcg act tac tac ggc ggt gac tgg aac ttc aat aac tgg ggc 336 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn Trp Gly 100 105 110 cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 20 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1570 - anti-CD20 heavy chain variant <221> CDS <222> (1)...(363) <400> 20 cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct ggg tac acc ttc acc agt tac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 aat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg cta gag tgg att 144 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gct att tat ccc gga aat ggt gat act tcc tac aat cag aag ttc 192 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aaa ggc aag gcc aca ata act gca gac aaa tcc acg agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctc agc agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga tcg act tac tac gcc ggt gac tgg aac ttc aat aac tgg ggc 336 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn Trp Gly 100 105 110 cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1571 - anti-CD20 heavy chain variant <221> CDS <222> (1)...(363) <400> 21 cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct ggg tac acc ttc acc agt tac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 aat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg cta gag tgg att 144 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gct att tat ccc gga aat ggt gat act tcc tac aat cag aag ttc 192 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aaa ggc aag gcc aca ata act gca gac aaa tcc acg agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctc agc agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga tcg act tac tac gcc ggt gac tgg aac ttc aat gac tgg ggc 336 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asp Trp Gly 100 105 110 cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 22 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1639 - anti-CD20 heavy chain variant <221> CDS <222> (1)...(363) <400> 22 cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct ggg tac acc ttc acc agt tac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 aat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg cta gag tgg att 144 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gct att tat ccc gga aat ggt gct act tcc tac aat cag aag ttc 192 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 aaa ggc aag gcc aca ata act gca gac aaa tcc acg agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctc agc agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga tcg act tac tac gcc ggt gac tgg aac ttc aat aac tgg ggc 336 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn Trp Gly 100 105 110 cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 23 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L373 - anti-CD20 light chain <221> CDS <222> (1)...(318) <400> 23 gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt tcg agc gtt agt tat ata 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 cat tgg ttt cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aaa ccc ctg atc tat 144 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr 35 40 45 gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc agt 192 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 gga tct ggg aca gat tac act ctc acc atc agc agt ctg caa cct gag 240 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 gat ttc gca act tac tac tgt caa cag tgg act tcc aac ccg ccc act 288 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 ttc ggc gga ggg acc aag ctc gag atc aaa 318 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of H1569 <400> 24 tcgacttact acggcggtga ctggaacttc aataac 36 <210> 25 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of H1570 <400> 25 tcgacttact acgccggtga ctggaacttc aataac 36 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of H1571 <400> 26 tcgacttact acgccggtga ctggaacttc aatgac 36 <210> 27 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of H1639 <400> 27 gctatttatc ccggaaatgg tgctacttcc tacaatcaga agttcaaagg c 51 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of L373 <400> 28 gctgcatcca gtttgcaaag t 21 <210> 29 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1286 - anti-CD20 heavy chain <400> 29 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of H1286 <400> 30 Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val 1 5 10

Claims (75)

  1. 삭제
  2. CD20에 특이적으로 결합하며, 리툭시맵(rituximab)에 비해 증가된 보체 의존적 세포독성(CDC: complement-dependent cytotoxicity)을 보이는 면역글로불린으로서, 하기 (A)~(H)로 구성되는 군으로부터 선택되는 면역글로불린:
    (A) 하기 (i)의 가변성 중쇄(VH) 도메인 및 하기 (ii)의 가변성 경쇄(VL) 도메인을 포함하는 면역 글로불린:
    (i) 하기 (a)~(c)를 포함하는 가변성 중쇄(VH) 도메인:
    (a) 서열번호 12의 아미노산 잔기 25 번부터 35 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 12의 아미노산 잔기 50 번부터 66 번까지를 포함하는 CDR2;
    (c) 서열번호 1로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및
    (ii) 하기 (a)~(c)를 포함하는 가변성 경쇄(VL) 도메인:
    (a) 서열번호 10의 아미노산 잔기 24 번부터 33 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 9로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 10의 아미노산 잔기 88 번부터 96 번까지를 포함하는 CDR3;
    (B) 하기 (i)의 가변성 중쇄(VH) 도메인 및 하기 (ii)의 가변성 경쇄(VL) 도메인을 포함하는 면역 글로불린:
    (i) 하기 (a)~(c)를 포함하는 가변성 중쇄(VH) 도메인:
    (a) 서열번호 12의 아미노산 잔기 25 번부터 35 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 12의 아미노산 잔기 50 번부터 66 번까지를 포함하는 CDR2;
    (c) 서열번호 2로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및
    (ii) 하기 (a)~(c)를 포함하는 가변성 경쇄(VL) 도메인:
    (a) 서열번호 10의 아미노산 잔기 24 번부터 33 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 9로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 10의 아미노산 잔기 88 번부터 96 번까지를 포함하는 CDR3;
    (C) 하기 (i)의 가변성 중쇄(VH) 도메인 및 하기 (ii)의 가변성 경쇄(VL) 도메인을 포함하는 면역 글로불린:
    (i) 하기 (a)~(c)를 포함하는 가변성 중쇄(VH) 도메인:
    (a) 서열번호 12의 아미노산 잔기 25 번부터 35 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 12의 아미노산 잔기 50 번부터 66 번까지를 포함하는 CDR2;
    (c) 서열번호 3으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및
    (ii) 하기 (a)~(c)를 포함하는 가변성 경쇄(VL) 도메인:
    (a) 서열번호 10의 아미노산 잔기 24 번부터 33 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 9로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 10의 아미노산 잔기 88 번부터 96 번까지를 포함하는 CDR3;
    (D) 하기 (i)의 가변성 중쇄(VH) 도메인 및 하기 (ii)의 가변성 경쇄(VL) 도메인을 포함하는 면역 글로불린:
    (i) 하기 (a)~(c)를 포함하는 가변성 중쇄(VH) 도메인:
    (a) 서열번호 7로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 12의 아미노산 잔기 50 번부터 66 번까지를 포함하는 CDR2;
    (c) 서열번호 2로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및
    (ii) 하기 (a)~(c)를 포함하는 가변성 경쇄(VL) 도메인:
    (a) 서열번호 10의 아미노산 잔기 24 번부터 33 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 9로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 10의 아미노산 잔기 88 번부터 96 번까지를 포함하는 CDR3;
    (E) 하기 (i)의 가변성 중쇄(VH) 도메인 및 하기 (ii)의 가변성 경쇄(VL) 도메인을 포함하는 면역 글로불린:
    (i) 하기 (a)~(c)를 포함하는 가변성 중쇄(VH) 도메인:
    (a) 서열번호 12의 아미노산 잔기 25 번부터 35 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 5로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2;
    (c) 서열번호 2로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및
    (ii) 하기 (a)~(c)를 포함하는 가변성 경쇄(VL) 도메인:
    (a) 서열번호 10의 아미노산 잔기 24 번부터 33 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 9로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 10의 아미노산 잔기 88 번부터 96 번까지를 포함하는 CDR3;
    (F) 하기 (i)의 가변성 중쇄(VH) 도메인 및 하기 (ii)의 가변성 경쇄(VL) 도메인을 포함하는 면역 글로불린:
    (i) 하기 (a)~(c)를 포함하는 가변성 중쇄(VH) 도메인:
    (a) 서열번호 12의 아미노산 잔기 25 번부터 35 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 6으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2;
    (c) 서열번호 2로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및
    (ii) 하기 (a)~(c)를 포함하는 가변성 경쇄(VL) 도메인:
    (a) 서열번호 10의 아미노산 잔기 24 번부터 33 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 9로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 10의 아미노산 잔기 88 번부터 96 번까지를 포함하는 CDR3;
    (G) 하기 (i)의 가변성 중쇄(VH) 도메인 및 하기 (ii)의 가변성 경쇄(VL) 도메인을 포함하는 면역 글로불린:
    (i) 하기 (a)~(c)를 포함하는 가변성 중쇄(VH) 도메인:
    (a) 서열번호 12의 아미노산 잔기 25 번부터 35 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 5로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2;
    (c) 서열번호 2로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및
    (ii) 하기 (a)~(c)를 포함하는 가변성 경쇄(VL) 도메인:
    (a) 서열번호 10의 아미노산 잔기 24 번부터 33 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 9로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 8로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및
    (H) 하기 (i)의 가변성 중쇄(VH) 도메인 및 하기 (ii)의 가변성 경쇄(VL) 도메인을 포함하는 면역 글로불린:
    (i) 하기 (a)~(c)를 포함하는 가변성 중쇄(VH) 도메인:
    (a) 서열번호 12의 아미노산 잔기 25 번부터 35 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 12의 아미노산 잔기 50 번부터 66 번까지를 포함하는 CDR2;
    (c) 서열번호 4로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및
    (ii) 하기 (a)~(c)를 포함하는 가변성 경쇄(VL) 도메인:
    (a) 서열번호 10의 아미노산 잔기 24 번부터 33 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 9로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 10의 아미노산 잔기 88 번부터 96 번까지를 포함하는 CDR3.
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서, 상기 면역글로불린은 IgG1 카파 면역글로불린인 면역글로불린.
  5. 제4항에 있어서, 상기 면역글로불린은 상기 면역글로불린의 중쇄 내에 인간 IgG1 불변 영역과 상기 면역글로불린의 경쇄 내에 인간 κ 불변 영역을 포함하는 면역글로불린.
  6. 제5항에 있어서, 상기 면역글로불린은 상기 중쇄의 가변 도메인과 상기 경쇄의 가변 도메인 내에 인간 프래임워크(framework) 영역을 전체적 또는 부분적으로 포함하는 면역글로불린.
  7. 제5항에 있어서, 상기 면역글로불린은 상기 중쇄의 가변 도메인과 상기 경쇄의 가변 도메인 내에 뮤라인 프래임워크 영역을 포함하는 면역글로불린.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제2항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 12에 기재된 서열을 포함하며, 상기 경쇄는 서열번호 10에 기재된 서열을 포함하는 면역글로불린.
  13. 제2항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 13에 기재된 서열을 포함하며, 상기 경쇄는 서열번호 10에 기재된 서열을 포함하는 면역글로불린.
  14. 제2항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 14에 기재된 서열을 포함하며, 상기 경쇄는 서열번호 10에 기재된 서열을 포함하는 면역글로불린.
  15. 제2항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 15에 기재된 서열을 포함하며, 상기 경쇄는 서열번호 10에 기재된 서열을 포함하는 면역글로불린.
  16. 제2항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 16에 기재된 서열을 포함하며, 상기 경쇄는 서열번호 10에 기재된 서열을 포함하는 면역글로불린.
  17. 제2항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 17에 기재된 서열을 포함하며, 상기 경쇄는 서열번호 10에 기재된 서열을 포함하는 면역글로불린.
  18. 제2항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 18에 기재된 서열을 포함하며, 상기 경쇄는 서열번호 10에 기재된 서열을 포함하는 면역글로불린.
  19. 제2항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 13에 기재된 서열을 포함하며, 상기 경쇄는 서열번호 11에 기재된 서열을 포함하는 면역글로불린.
  20. 제2항에 있어서, 상기 중쇄는 서열번호 16에 기재된 서열을 포함하며, 상기 경쇄는 서열번호 11에 기재된 서열을 포함하는 면역글로불린.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
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  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
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  30. 삭제
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  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 제2항, 제4항 내지 제7항, 및 제12항 내지 20항 중 어느 한 항에 있어서, 융합된 이종의 폴리펩타이드를 더 포함하는 면역글로불린.
  37. 제2항, 제4항 내지 제7항, 및 제12항 내지 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린은 치료 물질, 프로드럭, 펩타이드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 변형제, 약학적 물질, 및 PEG로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질에 접합되는 면역글로불린.
  38. 제2항, 제4항 내지 제7항, 및 제12항 내지 20항 중 어느 한 항에 따른 면역글로불린을 포함하는, 정상 인간 B 세포 또는 B 세포 계통 암세포의 성장 또는 분화를 저해하거나, 또는 개체 내 자가면역질환, 염증성 질환, 또는 암을 치료하기 위한 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 조성물.
  40. 제38항에 있어서, 상기 암 세포 또는 상기 암은 비-호지킨 림프종, 만성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, B 세포 림프종, 고등급의 B 세포 림프종, 중등급의 B 세포 림프종, 저등급의 B 세포 림프종, B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 골수모구성 백혈병 및 호지킨 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  41. 제38항에 있어서, 상기 자가면역 질환 또는 염증성 질환은 전신성 홍반 루푸스(SLE), 원판성 루푸스(discoid lupus), 루푸스 신염, 유육종, 청소년 관절염, 류마티스 관절염, 건선 관절염, 라이터 증후군, 강직성 척추염, 통풍성 관절염, 장기 또는 조직 이식 거부, 이식 편대 숙주 질환, 다발성 경화증, 과다 IgE 증후군, 결절성 다발동맥염(polyarteritis nodosa), 원발성 담증성 경변, 염증성 장 질환, 크론 질환, 셀리악병(글루텐-민감성 장질환), 자가면역 간염, 악성 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈, 건선, 경피증, 근무력증, 자가면역 혈소판감소성 자반증, 자가면역 갑상선염, 그레이브 질환, 하시모토 갑상선염, 면역 복합 질환, 만성 피로 기능부전 증후군(CFIDS), 다발성 근염, 피부근염, 한랭 글로불린혈증, 혈전 용해, 심근증, 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 폐 사이질조직 섬유증, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 1, 2, 3 및 4형 지연성 과민증, 알레르기 또는 알레르기 장애, 천식, 처그-스트라우스 증후군(알레르기 육아종증), 아토피 피부염, 알레르기 및 자극제 접촉 피부염, 두드러기, IgE-매개 알레르기, 죽상동맥경화, 혈관염, 특발성 염증 근질환, 용혈성 질환, 알츠하이머 질환, 및 만성 염증성 탈수초 다발성 신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  42. 삭제
  43. 면역글로불린 중쇄의 가변성 중쇄(VH) 도메인을 코딩하는 제1 핵산(A)과, 면역글로불린 경쇄의 가변성 경쇄(VL) 도메인을 코딩하는 제2 핵산(B)을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드로서,
    상기 VH 도메인 및 상기 VL 도메인을 포함하는 면역글로불린은 CD20에 특이적으로 결합하며, 리툭시맵(rituximab)에 비해 증가된 보체-의존적 세포독성(CDC)을 보이는 것을 특징으로 하며,
    하기 (A)~(H)로 이루어진 군으로부터 선택되는 분리된 폴리뉴클레오타이드:
    (A) 하기 (i)의 제1 핵산 및 하기 (ii)의 제2 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    (i) 하기 (a)~(c)를 포함하는 VH 도메인을 코딩하는 제1 핵산:
    (a) 서열번호 12의 아미노산 잔기 25 번부터 35 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 12의 아미노산 잔기 50 번부터 66 번까지를 포함하는 CDR2;
    (c) 서열번호 1로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및
    (ii) 하기 (a)~(c)를 포함하는 VL 도메인을 코딩하는 제2 핵산:
    (a) 서열번호 10의 아미노산 잔기 24 번부터 33 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 9로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 10의 아미노산 잔기 88 번부터 96 번까지를 포함하는 CDR3;
    (B) 하기 (i)의 제1 핵산 및 하기 (ii)의 제2 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    (i) 하기 (a)~(c)를 포함하는 VH 도메인을 코딩하는 제1 핵산:
    (a) 서열번호 12의 아미노산 잔기 25 번부터 35 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 12의 아미노산 잔기 50 번부터 66 번까지를 포함하는 CDR2;
    (c) 서열번호 2로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및
    (ii) 하기 (a)~(c)를 포함하는 VL 도메인을 코딩하는 제2 핵산:
    (a) 서열번호 10의 아미노산 잔기 24 번부터 33 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 9로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 10의 아미노산 잔기 88 번부터 96 번까지를 포함하는 CDR3;
    (C) 하기 (i)의 제1 핵산 및 하기 (ii)의 제2 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    (i) 하기 (a)~(c)를 포함하는 VH 도메인을 코딩하는 제1 핵산:
    (a) 서열번호 12의 아미노산 잔기 25 번부터 35 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 12의 아미노산 잔기 50 번부터 66 번까지를 포함하는 CDR2;
    (c) 서열번호 3으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및
    (ii) 하기 (a)~(c)를 포함하는 VL 도메인을 코딩하는 제2 핵산:
    (a) 서열번호 10의 아미노산 잔기 24 번부터 33 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 9로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 10의 아미노산 잔기 88 번부터 96 번까지를 포함하는 CDR3;
    (D) 하기 (i)의 제1 핵산 및 하기 (ii)의 제2 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    (i) 하기 (a)~(c)를 포함하는 VH 도메인을 코딩하는 제1 핵산:
    (a) 서열번호 7로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 12의 아미노산 잔기 50 번부터 66 번까지를 포함하는 CDR2;
    (c) 서열번호 2로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및
    (ii) 하기 (a)~(c)를 포함하는 VL 도메인을 코딩하는 제2 핵산:
    (a) 서열번호 10의 아미노산 잔기 24 번부터 33 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 9로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 10의 아미노산 잔기 88 번부터 96 번까지를 포함하는 CDR3;
    (E) 하기 (i)의 제1 핵산 및 하기 (ii)의 제2 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    (i) 하기 (a)~(c)를 포함하는 VH 도메인을 코딩하는 제1 핵산:
    (a) 서열번호 12의 아미노산 잔기 25 번부터 35 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 5로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2;
    (c) 서열번호 2로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및
    (ii) 하기 (a)~(c)를 포함하는 VL 도메인을 코딩하는 제2 핵산:
    (a) 서열번호 10의 아미노산 잔기 24 번부터 33 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 9로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 10의 아미노산 잔기 88 번부터 96 번까지를 포함하는 CDR3;
    (F) 하기 (i)의 제1 핵산 및 하기 (ii)의 제2 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    (i) 하기 (a)~(c)를 포함하는 VH 도메인을 코딩하는 제1 핵산:
    (a) 서열번호 12의 아미노산 잔기 25 번부터 35 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 6으로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2;
    (c) 서열번호 2로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및
    (ii) 하기 (a)~(c)를 포함하는 VL 도메인을 코딩하는 제2 핵산:
    (a) 서열번호 10의 아미노산 잔기 24 번부터 33 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 9로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 10의 아미노산 잔기 88 번부터 96 번까지를 포함하는 CDR3;
    (G) 하기 (i)의 제1 핵산 및 하기 (ii)의 제2 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    (i) 하기 (a)~(c)를 포함하는 VH 도메인을 코딩하는 제1 핵산:
    (a) 서열번호 12의 아미노산 잔기 25 번부터 35 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 5로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2;
    (c) 서열번호 2로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및
    (ii) 하기 (a)~(c)를 포함하는 VL 도메인을 코딩하는 제2 핵산:
    (a) 서열번호 10의 아미노산 잔기 24 번부터 33 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 9로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 8로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및
    (H) 하기 (i)의 제1 핵산 및 하기 (ii)의 제2 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    (i) 하기 (a)~(c)를 포함하는 VH 도메인을 코딩하는 제1 핵산:
    (a) 서열번호 12의 아미노산 잔기 25 번부터 35 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 12의 아미노산 잔기 50 번부터 66 번까지를 포함하는 CDR2;
    (c) 서열번호 4로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및
    (ii) 하기 (a)~(c)를 포함하는 VL 도메인을 코딩하는 제2 핵산:
    (a) 서열번호 10의 아미노산 잔기 24 번부터 33 번까지를 포함하는 CDR1;
    (b) 서열번호 9로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및
    (c) 서열번호 10의 아미노산 잔기 88 번부터 96 번까지를 포함하는 CDR3.
  44. 면역글로불린 중쇄의 가변성 중쇄(VH) 도메인을 코딩하는 제1 핵산(A)과, 면역글로불린 경쇄의 가변성 경쇄(VL) 도메인을 코딩하는 제2 핵산(B)을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드로서,
    상기 VH 도메인 및 상기 VL 도메인을 포함하는 면역글로불린은 CD20에 특이적으로 결합하며, 리툭시맵(rituximab)에 비해 증가된 보체-의존적 세포독성(CDC)을 보이는 것을 특징으로 하며,
    하기 (A)~(I)로 이루어진 군으로부터 선택되는 분리된 폴리뉴클레오타이드:
    (A) 하기 (i)의 제1 핵산 및 하기 (ii)의 제2 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    (i) 면역글로불린 중쇄의 가변성 중쇄(VH) 도메인을 코딩하는 제1 핵산, 여기서 상기 VH 도메인은 서열번호 12의 서열을 가짐:
    (ii) 면역글로불린 경쇄의 가변성 경쇄(VL) 도메인을 코딩하는 제2 핵산, 여기서 상기 VL 도메인은 서열번호 10의 서열을 가짐;
    (B) 하기 (i)의 제1 핵산 및 하기 (ii)의 제2 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    (i) 면역글로불린 중쇄의 가변성 중쇄(VH) 도메인을 코딩하는 제1 핵산, 여기서 상기 VH 도메인은 서열번호 13의 서열을 가짐:
    (ii) 면역글로불린 경쇄의 가변성 경쇄(VL) 도메인을 코딩하는 제2 핵산, 여기서 상기 VL 도메인은 서열번호 10의 서열을 가짐;
    (C) 하기 (i)의 제1 핵산 및 하기 (ii)의 제2 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    (i) 면역글로불린 중쇄의 가변성 중쇄(VH) 도메인을 코딩하는 제1 핵산, 여기서 상기 VH 도메인은 서열번호 14의 서열을 가짐:
    (ii) 면역글로불린 경쇄의 가변성 경쇄(VL) 도메인을 코딩하는 제2 핵산, 여기서 상기 VL 도메인은 서열번호 10의 서열을 가짐;
    (D) 하기 (i)의 제1 핵산 및 하기 (ii)의 제2 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    (i) 면역글로불린 중쇄의 가변성 중쇄(VH) 도메인을 코딩하는 제1 핵산, 여기서 상기 VH 도메인은 서열번호 15의 서열을 가짐:
    (ii) 면역글로불린 경쇄의 가변성 경쇄(VL) 도메인을 코딩하는 제2 핵산, 여기서 상기 VL 도메인은 서열번호 10의 서열을 가짐;
    (E) 하기 (i)의 제1 핵산 및 하기 (ii)의 제2 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    (i) 면역글로불린 중쇄의 가변성 중쇄(VH) 도메인을 코딩하는 제1 핵산, 여기서 상기 VH 도메인은 서열번호 16의 서열을 가짐:
    (ii) 면역글로불린 경쇄의 가변성 경쇄(VL) 도메인을 코딩하는 제2 핵산, 여기서 상기 VL 도메인은 서열번호 10의 서열을 가짐;
    (F) 하기 (i)의 제1 핵산 및 하기 (ii)의 제2 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    (i) 면역글로불린 중쇄의 가변성 중쇄(VH) 도메인을 코딩하는 제1 핵산, 여기서 상기 VH 도메인은 서열번호 17의 서열을 가짐:
    (ii) 면역글로불린 경쇄의 가변성 경쇄(VL) 도메인을 코딩하는 제2 핵산, 여기서 상기 VL 도메인은 서열번호 10의 서열을 가짐;
    (G) 하기 (i)의 제1 핵산 및 하기 (ii)의 제2 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    (i) 면역글로불린 중쇄의 가변성 중쇄(VH) 도메인을 코딩하는 제1 핵산, 여기서 상기 VH 도메인은 서열번호 18의 서열을 가짐:
    (ii) 면역글로불린 경쇄의 가변성 경쇄(VL) 도메인을 코딩하는 제2 핵산, 여기서 상기 VL 도메인은 서열번호 10의 서열을 가짐;
    (H) 하기 (i)의 제1 핵산 및 하기 (ii)의 제2 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    (i) 면역글로불린 중쇄의 가변성 중쇄(VH) 도메인을 코딩하는 제1 핵산, 여기서 상기 VH 도메인은 서열번호 13의 서열을 가짐:
    (ii) 면역글로불린 경쇄의 가변성 경쇄(VL) 도메인을 코딩하는 제2 핵산, 여기서 상기 VL 도메인은 서열번호 11의 서열을 가짐; 및
    (I) 하기 (i)의 제1 핵산 및 하기 (ii)의 제2 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    (i) 면역글로불린 중쇄의 가변성 중쇄(VH) 도메인을 코딩하는 제1 핵산, 여기서 상기 VH 도메인은 서열번호 16의 서열을 가짐:
    (ii) 면역글로불린 경쇄의 가변성 경쇄(VL) 도메인을 코딩하는 제2 핵산, 여기서 상기 VL 도메인은 서열번호 11의 서열을 가짐.
  45. 삭제
  46. 제44항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 정상 인간 B 세포 또는 B 세포 계통 암세포의 성장 또는 분화를 저해하거나, 또는 개체 내 자가면역질환, 염증성 질환, 또는 암을 치료하기 위한 조성물로서, 상기 암은 CD20-발현 세포와 관련되는 것인 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는 조성물.
  48. 제46항에 있어서, 상기 암 세포 또는 상기 암은 비-호지킨 림프종, 만성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, B 세포 림프종, 고등급의 B 세포 림프종, 중등급의 B 세포 림프종, 저등급의 B 세포 림프종, B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 골수모구성 백혈병, 및 호지킨 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  49. 제46항에 있어서, 상기 자가면역 질환 또는 염증성 질환은 전신성 홍반 루푸스(SLE), 원판성 루푸스(discoid lupus), 루푸스 신염, 유육종, 청소년 관절염, 류마티스 관절염, 건선 관절염, 라이터 증후군, 강직성 척추염, 통풍성 관절염, 장기 또는 조직 이식 거부, 이식 편대 숙주 질환, 다발성 경화증, 과다 IgE 증후군, 결절성 다발동맥염(polyarteritis nodosa), 원발성 담증성 경변, 염증성 장 질환, 크론 질환, 셀리악병(글루텐-민감성 장질환), 자가면역 간염, 악성 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈, 건선, 경피증, 근무력증, 자가면역 혈소판감소성 자반증, 자가면역 갑상선염, 그레이브 질환, 하시모토 갑상선염, 면역 복합 질환, 만성 피로 기능부전 증후군(CFIDS), 다발성 근염, 피부근염, 한랭 글로불린혈증, 혈전 용해, 심근증, 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 폐 사이질조직 섬유증, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 1, 2, 3 및 4형 지연성 과민증, 알레르기 또는 알레르기 장애, 천식, 처그-스트라우스 증후군(알레르기 육아종증), 아토피 피부염, 알레르기 및 자극제 접촉 피부염, 두드러기, IgE-매개 알레르기, 죽상동맥경화, 혈관염, 특발성 염증 근질환, 용혈성 질환, 알츠하이머 질환, 및 만성 염증성 탈수초 다발성 신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  50. 제43항 내지 제44항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  51. 제50항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 벡터.
  52. 제50항에 있어서, VH 도메인을 코딩하는 상기 제1 핵산과 VL 도메인을 코딩하는 상기 제2 핵산은 프레임 내에 융합되어, 작동가능하게 연결된 하나의 프로모터로부터 함께 전사되고, 단쇄 항체 또는 그의 항원-결합성 단편으로 함께 번역되는 것인 벡터.
  53. 제50항에 있어서, VH 도메인을 코딩하는 상기 제1 핵산과 VL 도메인을 코딩하는 상기 제2 핵산은 작동가능하게 연결된 하나의 프로모터로부터 함께 전사되지만, 분리되어 번역되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  54. 제53항에 있어서, VH 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 VL 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 사이에 위치하는 IRES(internal ribosomal entry site) 서열을 더 포함하는 벡터.
  55. 제50항에 있어서, VH 도메인을 코딩하는 상기 제1 핵산과 VL 도메인을 코딩하는 상기 제2 핵산은, 각각 분리된 프로모터들에 작동가능하게 연결되어 있으며, 서로 별도로 전사되는 벡터.
  56. 제55항에 있어서, 상기 분리된 프로모터는 동일한 프로모터의 카피본인 벡터.
  57. 제55항에 있어서, 상기 분리된 프로모터들은 서로 동일하지 않은 것을 특징으로 하는 벡터.
  58. 제50항의 벡터를 포함하는, 정상 인간 B 세포 또는 B 세포 계통 암세포의 성장 또는 분화를 저해하거나, 또는 개체 내 자가면역질환, 염증성 질환, 또는 암을 치료하기 위한 조성물로서, 상기 암은 CD20-발현 세포와 관련되는 것인 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 조성물.
  60. 제58항에 있어서, 상기 암 세포 또는 상기 암은 비-호지킨 림프종, 만성 림프성 백혈병, 다발성 골수종, B 세포 림프종, 고등급의 B 세포 림프종, 중등급의 B 세포 림프종, 저등급의 B 세포 림프종, B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 골수모구성 백혈병, 및 호지킨 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  61. 제58항에 있어서, 상기 자가면역 질환 또는 염증성 질환은 전신성 홍반 루푸스(SLE), 원판성 루푸스(discoid lupus), 루푸스 신염, 유육종, 청소년 관절염, 류마티스 관절염, 건선 관절염, 라이터 증후군, 강직성 척추염, 통풍성 관절염, 장기 또는 조직 이식 거부, 이식 편대 숙주 질환, 다발성 경화증, 과다 IgE 증후군, 결절성 다발동맥염(polyarteritis nodosa), 원발성 담증성 경변, 염증성 장 질환, 크론 질환, 셀리악병(글루텐-민감성 장질환), 자가면역 간염, 악성 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈, 건선, 경피증, 근무력증, 자가면역 혈소판감소성 자반증, 자가면역 갑상선염, 그레이브 질환, 하시모토 갑상선염, 면역 복합 질환, 만성 피로 기능부전 증후군(CFIDS), 다발성 근염, 피부근염, 한랭 글로불린혈증, 혈전 용해, 심근증, 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 폐 사이질조직 섬유증, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 1, 2, 3 및 4형 지연성 과민증, 알레르기 또는 알레르기 장애, 천식, 처그-스트라우스 증후군(알레르기 육아종증), 아토피 피부염, 알레르기 및 자극제 접촉 피부염, 두드러기, IgE-매개 알레르기, 죽상동맥경화, 혈관염, 특발성 염증 근질환, 용혈성 질환, 알츠하이머 질환, 및 만성 염증성 탈수초 다발성 신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  62. 제43항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
  63. 제50항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  64. 제62항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 면역글로불린을 회수하는 단계를 포함하는, CD20에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 제조 방법.
  65. 제64항의 방법에 의해 제조된 면역글로불린.
  66. 제65항에 있어서, 상기 면역글로불린은 IgG1 카파 면역글로불린인 면역글로불린.
  67. 제66항에 있어서, 상기 면역글로불린은 상기 면역글로불린의 중쇄 내에 인간 IgG1 불변 영역과 상기 면역글로불린의 경쇄 내에 인간 카파 불변 영역을 포함하는 면역글로불린.
  68. 제67항에 있어서, 상기 면역글로불린은 상기 중쇄의 VH 도메인과 상기 경쇄의 VL 도메인 내에 인간 프래임워크 영역을 전체적 또는 부분적으로 포함하는 면역글로불린.
  69. 제67항에 있어서, 상기 면역글로불린은 상기 중쇄의 VH 도메인과 상기 경쇄의 VL 도메인 내에 뮤라인 프래임워크 영역을 포함하는 면역글로불린.
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