BRPI0717363A2 - Imunoglobulina que liga especificamente cd20, composição, polinucleotídeo isolado, vetor, métodos para obter uma célula hospedeira, de produção de uma imunoglobulina que liga especificamente cd20, para inibir o crescimento ou diferenciação de uma célula b humana normal, usos de imonublobulina e de uma quantidade efetiva de imunoglobulina, e composição farmacêutica. - Google Patents

Imunoglobulina que liga especificamente cd20, composição, polinucleotídeo isolado, vetor, métodos para obter uma célula hospedeira, de produção de uma imunoglobulina que liga especificamente cd20, para inibir o crescimento ou diferenciação de uma célula b humana normal, usos de imonublobulina e de uma quantidade efetiva de imunoglobulina, e composição farmacêutica. Download PDF

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Description

IMUNOGLOBULINA QUE LIGA ESPECIFICAMENTE CD20, COMPOSIÇÃO, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, VETOR, MÉTODOS PARA OBTER UMA CÉLULA HOSPEDEIRA, DE PRODUÇÃO DE UMA IMUNOGLOBULINA QUE LIGA ESPECIFICAMENTE CD20, PARA INIBIR O CRESCIMENTO OU DIFERENCIAÇÃO DE UMA CÉLULA B HUMANA NORMAL, USOS DE IMUNOGLOBULINA E DE UMA QUANTIDADE EFETIVA DE IMUNOGLOBULINA, E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA.
CAMPO DA INVENÇÃO
A invenção refere-se a anticorpos capazes de ligar a CD2 0, métodos que utilizam os anticorpos, e métodos para o tratamento de doenças associadas a células que expressam CD2 0 .
15
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
A molécula CD2 0 (também chamada de antígeno de diferenciação restrito a linfócito-B humano ou Bp3 5) é uma proteína transmembrana hidrofóbica com um peso molecular de aproximadamente 3 5 kD localizada em Iinfócitos pré-B e B maduros (Valentine et al. (1989) J. Biol . Chem. 264 (19) :11282-11287; e Einfield et al. (1988) EMBO J. 7 (3) :311- 717). CD20 é encontrada na superfície de mais de 90% das células B do sangue periférico ou órgãos linfóides e é expressa durante o início do desenvolvimento das células pré-B e permanece até diferenciação de células plasmáticas. CD2 0 está presente tanto nas células B normais, quanto nas células B malignas. Em particular, CD20 é expresso em mais de 90% das células B de linfomas não-Hodgkin (NHL) (Anderson et al. (1984) Blood 63 (6):1424-1433), mas não é encontrada em células tronco hematopoiéticas , células pró- Β, células plasmáticas normais, ou outros tecidos normais (Tedder et al. (1985) J. Immunol. 135 (2):973-979).
Os 85 aminoácidos da região carboxi-terminal da proteína CD2 0 estão localizados dentro do citoplasma. 0 comprimento desta região contrasta com a de outras estruturas específicas de células B, como: IgM, IgD, e cadeias pesadas de IgG ou antígenos de histocompatibilidade classe II cadeias α ou β, que têm regiões intracitoplasmáticas relativamente curtas de 3, 3, 28, 15 , e 16 aminoácidos, respectivamente (Komaromy et al. (1983) NAR 11:6775-6785). Dos últimos 61 amino-ácidos carboxi- terminais, 21 são resíduos ácidos, enquanto que apenas 2 são básicos, indicando que esta região tem uma forte carga negativa. 0 número de acesso no GeneBank é NP_690605.
Pensa-se que CD20 pode estar envolvido na regulação de um passo(s) inicial no processo de ativação e diferenciação das células B (Tedder et al. (1986) Eur. J. Immunol. 16:881-887) e pode funcionar como um canal iônico de cálcio (Tedder et al. (1990) J. Cell. Biochem. 14D: 195).
Apesar da incerteza sobre a real função do CD2 0 na promoção da proliferação e/ou diferenciação das células B, ele fornece um importante alvo para a terapia mediada por anticorpo para controlar ou matar células B envolvidas no câncer e doenças autoimunes. Em particular, a expressão de CD2 0 nas células tumorais, por exemplo, NHL, o torna um importante alvo para a terapia mediada por anticorpo para marcar especificamente agentes terapêuticos contra células neoplásicas CD20-positivas. No entanto, enquanto os resultados obtidos até agora claramente estabelecem CD20 como um alvo útil para imunoterapia, eles também mostram que anticorpos murinos e quiméricos disponíveis atualmente não constituem agentes terapêuticos ideais.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
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Composições e métodos são fornecidos para o tratamento de doenças associadas à CD2 0, incluindo Iinfornas, doenças autoimunes, e rejeição à transplante. Composições incluem anticorpos anti-CD2 0 capazes de se ligar a um antígeno CD2 0 humano localizado na superfície de uma célula humana expressando CD2 0, visto que o anticorpo aumenta a citotoxicidade mediada por células dependente de complemento (CDC) em comparação com rituximab. Composições também incluem fragmentos ligados a antígeno, variantes, e derivados dos anticorpos monoclonais, linhagens de células produtoras destas composições de anticorpos, e moléculas isoladas de ácido nucleico codificando as seqüências de aminoácidos dos anticorpos. A invenção também inclui composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos anti- CD2 0 da invenção, ou fragmentos ligados ao antígeno, variantes, ou seus derivados, em um carreador farmaceuticamente aceitável.
Os anticorpos monoclonais divulgados aqui têm uma forte afinidade para CD20 e são caracterizados pela melhora da função CDC em comparação com rituximab. Os anticorpos da invenção medeiam a morte das células expressando CD2 0. Os anticorpos da invenção são capazes de ligar especificamente um antígeno CD2 0 humano expresso na superfície de uma célula humana e são caracterizados por terem, pelo menos, uma região optimizada de determinação da complementaridade (CDR) na cadeia pesada e/ou cadeia leve do anti-CD20. A CDR otimizada foi modificada e compreende uma seqüência apresentada em qualquer um dos SEQ ID NOS: 1-8. Seqüências específicas de anticorpo são divulgadas tendo mudanças em ao menos uma CDR da cadeia pesada do anti-CD20; e na CDR3 da cadeia leve. As composições da invenção incluem anticorpos anti-CD20 e fragmentos do anticorpo de ligação do antígeno, variantes, e seus derivados, incluindo, pelo menos uma CDR otimizada.
Em uma concretização da invenção, métodos de tratamento compreendem administrar a um doente uma dose terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo anticorpos anti-CD2 0 adequados, ou fragmentos ligantes do antígeno, variantes, ou seus derivados. Doenças associadas com células expressando CD2 0 incluem doenças autoimunes, cânceres, e órgãos e rejeições a tecidos enxertados. Os Iinfornas que podem ser prevenidos ou tratados por um método da invenção incluem Iinfomas não- Hodgkin (linfomas de alto grau, grau intermediário, e de baixo grau), doença de Hodgkin, leucemia Iinfoblástica aguda, mielomas, leucemia Iinfocítica crônica e leucemia mieloblástica.
Doenças autoimunes específicas contempladas com tratamento utilizando os métodos da invenção incluem lúpus eritematoso sistêmico (LES), artrite reumatóide, doença de Crohn, psoríase, trombocitopenia púrpura autoimune, esclerose múltipla, espondilite anquilosante, miastenia gravis, e pênfigo vulgar. Tais anticorpos também podem ser utilizados para evitar rejeição de órgãos e tecidos enxertados suprimindo respostas autoimunes, para tratar de linfomas pela marcação e morte de linfócitos B, e conduzir toxinas a células possuidoras de CD2 0 de maneira específica. 10
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS
A Figura 1 apresenta as seqüências de aminoácidos para o domínio pesado variável H12 86 (SEQ ID NO: 29) e domínio leve variável L373 (SEQ ID NO: 10), para o anticorpo monoclonal murino anti-CD20 humanizado original (mAb 1097). Os resíduos que compõem as regiões de determinação da complementaridade (CDRl, CDR2 e CDR3) estão sublinhados para cada domínio variável.
A Figura 2 mostra as substituições efetuadas dentro da CDR3 do domínio variável pesado H1286 do anti-CD20 murino humanizado mAb 1097 (esta CDR3 é designada "271") para produzir a 1236 (SEQ ID NO: 1), 1237 (SEQ ID NO: 2) e 1238 (SEQ ID NO: 3) CDR3s otimizadas (ver Exemplo 1). A seqüência 271 CDR3 (SEQ ID NO: 30) é equivalente àquela para CDR3 do domínio variável dentro da cadeia pesada do anticorpo anti-CD2 0 quimérico murino/humano conhecido como C2B8 (rituximab).
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A Figura 3 apresenta os aminoácidos para os domínios pesados variáveis otimizados H1569 (SEQ ID NO: 12), H1570 (SEQ ID NO: 13), e H1571 (SEQ ID NO: 14). H1569 compreende a CDR3 otimizada 123 6 (SEQ ID NO: 1) ; H157 0 compreende a CDR3 otimizada 1237 (SEQ ID NO: 2), e H1571 compreende a CDR3 otimizada 1238 (SEQ ID NO: 3). Cada um destes domínios pesados variáveis otimizados foi pareado com o domínio leve variável L373 (SEQ ID NO: 10) para a produção mAb 1236, mAb 1237, e mAb 1238 otimizados. Os resíduos que compõem CDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente, para cado domínio variável estão sublinhados. Figura 4 expõe as seqüências codificantes para os domínios pesados variáveis otimizados H1569 (SEQ ID NO: 19), H1570 (SEQ ID NO: 20), e H1571 (SEQ ID NO: 21).
Figura 5 apresenta as seqüências de aminoácidos (SEQ
ID NO: 10) e codificação (SEQ ID NO: 23) para o domínio leve variável L373. Os resíduos e codificação de seqüências CDRl, CDR2, e CDR3, respectivamente, são sublinhados.
Figuras 6A-6D mostram resultados da especificidade de
ligação para mAb 1236, mAbl237, e mAb 1238 humanizados otimizados, em comparação com mAb 271 (com a mesma seqüência para rituximab). A especificidade de ligação destes mAbs otimizados para células CHO expressando CD2 0 (Figura 6A) , células EBl CD20+ (Figura 6B), vetor CHO CD20" (Figura 6C) , e NSO CD20" (Figura 6D) , foi avaliada por Tecnologia de Ensaio Fluorométrico em Microvolume (FMAT). Veja o exemplo 2. NSO é uma linhagem de mieloma celular de camundongo que não expressa CD2 0 humano.
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Figura 7 mostra os resultados de um ensaio de bloqueio de 2H7 murino para determinar o reconhecimento do epítopo nos mAbs otimizados 1236, 1237 e 1238, em comparação com mAb 271. Todos os mAbs otimizados reconhecem o mesmo epítopo mAb 271. Veja o exemplo 2.
Figura 8 mostra os resultados de um ensaio de dissociação CDC-mAb para determinar a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) dos mAbs otimizados 1236, 1237 e 1238, em comparação com mAb 271. Os mAbs otimizados aumentaram a atividade funcional CDC em relação à observada para mAb 271. Veja o exemplo 2. Figura 9 mostra os resultados de um ensaio ADCC para determinar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) dos mAbs otimizados 1236, 1237 e 1238 contra células-alvo Daudi, em comparação com mAb 271. Os mAbs otimizados têm atividade ADCC que é pelo menos equivalente à observada para mAb 271. Veja o exemplo 2.
A Figura 10 mostra os resultados de um ensaio de apoptose direta (independente da atividade CDC e ADCC) para determinar atividade de apoptose dos mAbs otimizados 1236, 1237 e 1238 contra células Ramos (NHL) em comparação com o mAb 271 e 11, que serviu como o isotipo controle. Os mAbs otimizados são tão eficazes na indução da apoptose quanto mAb 271. Veja o exemplo 2.
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Figura 11 apresenta os aminoácidos para o domínio pesado variável H1639 (SEQ ID NO: 16) e o domínio leve variável L373 (SEQ ID NO: 10) para mAb otimizado 1589. Os resíduos que compõem as regiões de determinação da complementaridade (CDRl, CDR2 e CDR3) para cada domínio variável estão sublinhados.
Figura 12 apresenta as seqüências codificantes para o domínio pesado variável H163 9 (SEQ ID NO: 22) e o domínio leve variável L373 (SEQ ID NO: 23) dentro das cadeias pesadas e leves, respectivamente, do mAb otimizado 1589. Códons para a CDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente, dos domínios variáveis pesados e leves estão sublinhados.
Figura 13 mostra os resultados de um ensaio de
bloqueio para 2H7 murino para determinar o reconhecimento do epítopo dos mAbs otimizados 1588, 1589, 1590, 1652 e 1692, em comparação com mAb 271, controle negativo anticorpo mAb 11, mAb otimizado 1237, e rituximab (Rituxan®). Com exceção do controle negativo, todos mAbs testados reconhecem os epítopos idênticos ou sobrepostos. Veja o exemplo 4.
Figura 14 mostra os resultados de um ensaio CDC para
determinar atividade CDC dos mAbs otimizados 1588, 1589, 1590, 1652 e 1692 contra células alvo Daudi (NHL) em comparação ao observado para mAb 271, 11, e mAb otimizado 1237. Todos mAbs otimizados geralmente medeiam maior atividade CDC funcional do que o mAb 271. Veja o exemplo 4.
Figuras 15A e 15B mostram resultados de um ensaio CDC para determinar atividade CDC dos mAbs otimizados 1588, 1589, 1590, 1652 e 1692 contra duas linhagens de células alvo B-CLL, células EHEB (Figura 15A) e células MEC-I (Figura 15B), em comparação ao observado para mAb 271, mAb 11, e mAb otimizado 1237. Todos mAbs otimizados têm atividade CDC funcional aumentada em relação à mAb 271. Veja o exemplo 4.
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Figura 16 mostra os resultados de um ensaio de dissociação CDC-mAb para determinar atividade CDC dos mAbs otimizados 1588, 1590, 1652 e 1692, em comparação com mAb 271 e mAb otimizado 1237. Todos mAbs otimizados têm atividade CDC funcional aumentada em relação à observada para mAb 271. Veja o exemplo 4.
Figuras 17A e 17B mostram resultados de um ensaio CDC não-radioativo para determinar atividade CDC dos mAbs otimizados 1588, 1589, 1590, 1652 e 1692 contra duas linhagens de células-alvo NHL, células Daudi (Figura 17A) e células WIL2-S (Figura 17B), em comparação ao observado para mAb 271, mAb otimizado 1237, e controle negativo mAb 11 (designada "NEG" nestas figuras). Veja o exemplo 4. Figuras 18A e 18B mostram resultados de um ensaio CDC não-radioativo para determinar atividade CDC dos mAbs otimizados 1588, 1589, 1590, 1652 e 1692 contra duas linhagens celulares alvo B-CLL, células EHEB (Figura 18A) e células MEC-I (Figura 18B), em comparação ao observado para mAb 271, mAb otimizado 1237, e controle negativo mAb 11 (designada "NEG" nestas figuras). Veja o exemplo 4.
Figuras 19A e 19B mostram resultados de um ensaio CDC não-radioativo para determinar atividade CDC dos mAbs otimizados 1588, 1589, 1590, 1652 e 1692 contra duas linhagens celulares B transformadas por EBV (células B "normais"), células SS BLCL (Figura 19A) e células Melk BLCL (Figura 19B), em comparação ao observado para mAb 271, mAb otimizado 1237, e controle negativo mAb 11 (designado "NEG" nestas figuras). Veja o exemplo 4.
Figura 2 0 mostra os resultados de um ensaio ADCC para determinar atividade ADCC dos mAbs otimizados 1588, 1589, 1590, 1652 e 1692 contra células Daudi (NHL) em comparação com o mAb 271, mAb otimizado 1237, e IgG controle. Os mAbs otimizados têm atividade ADCC que é semelhante ao observado para mAb 271. Veja o exemplo 4.
Figura 21 mostra os resultados de um ensaio ADCC para
determinar atividade ADCC dos mAbs otimizados 1588, 1589, 1590, 1652 e 1692 contra células MEC-I (B-CLL) em comparação com o mAb 271, mAb otimizado 1237, e IgG controle. Os mAbs otimizados têm atividade ADCC que é semelhante ao observado para mAb 271. Veja o exemplo 4.
Figura 22 mostra um ensaio de apoptose direta (independente de atividade CDC e ADCC) para determinar atividade de apoptose dos mAbs otimizados 1236, 1237 e 1238 contra células Ramos (NHL) em comparação com os mAbs 271 e 11, os quais serviram como o controle de isotipo. Os mAbs otimizados são tão eficazes na indução de apoptose quanto mAb 271. Veja o exemplo 4.
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Figura 23 mostra os resultados de um ensaio de sangue total para determinar atividade de morte celular dos mAbs otimizados 1588, 1589, 1590, 1652 e 1692 contra células Daudi (NHL) em comparação com o mAb 271 e mAb otimizado 1237. Os mAbs otimizado têm equivalente ou melhor Iise contra estas células em comparação com o mAb 271. Veja o exemplo 4.
Figuras 24A e 24B mostram os resultados de um ensaio de sangue total para determinar atividade de morte celular dos mAbs otimizados 1588, 1589, 1590, 1652 e 1692 contra duas linhagens de células alvo B-CLL, células EHEB (Figura 24A) e células MEC-I (Figura 24B), em comparação com mAb 271 e mAb otimizado 1237. Os mAbs otimizados têm equivalente ou melhor Iise contra estas células em comparação com o mAb 271. Veja o exemplo 4.
Figura 2 5 mostra os resultados de um ensaio ADCC em sangue total para determinar atividade ADCC dos mAbs otimizados 1588, 1589, 1590, 1652 e 1692 contra linhagens de células B transformadas por EBV Melk BLCL (células B "normais"), em comparação com mAb 271 e mAb otimizado 1237. Os mAbs otimizados têm equivalente ou melhor Iise contra estas células em comparação com o mAb 271. Veja o exemplo 4.
Figura 26 mostra os resultados de um ensaio in vivo do anticorpo monoclonal otimizado anti-CD20 humanizado 1589 para determinar a atividade do mAb 1589, em modelo de xenoenxerto com célula Daudi. O anticorpo mAb 1589 é eficaz em prolongar a sobrevida de camundongos com xenotransplantes de células humanas Daudi. Veja o exemplo .
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DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. DEFINIÇÕES
É de notar que o termo "uma" entidade refere-se a um
ou mais daquela entidade, por exemplo, "um anticorpo anti- CD2 0" é entendido representar um ou mais anticorpos anti- CD20. Como tal, os termos "um", "uma ou mais", e "pelo menos um" podem ser usados permutavelmente aqui.
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Conforme utilizado aqui, o termo "tumor" refere-se a todas as células neoplásicas do crescimento e proliferação, se malignos ou benignos, e todas as células pré-cancerosas e tecidos.
Os termos "câncer" e "canceroso(a)s" referem-se a descrever a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a linfomas e leucemias.
Conforme utilizado aqui, o termo "polipeptídio" é pretendido a abranger um "polipeptídeo" singular, bem como "polipeptídeos" plurais, e refere-se a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) linearmente ligados por ligações amida (também conhecidas como ligações peptídicas). 0 termo "polipeptídeos" refere-se a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, e não se refere a um comprimento específico do produto. Assim, Peptídeoos, dipeptídeoos, tripeptídeoos, oligopeptídeoos, "proteína", "cadeia de aminoácidos", ou qualquer outro termo utilizado para referir-se a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, estão incluídos na definição de "polipeptídeos", e o termo "polipeptídeo" pode ser utilizado em vez de, ou permutavelmente com qualquer um destes termos. 0 termo "polipeptídeo" é pretendido igualmente para referir a produtos de modificações pós- expressão do polipeptídeo, incluindo glicosilação sem limitação, acetilação, fosforilação, amidação, derivação conhecida por grupos de proteção/bloqueio, clivagem proteolítica, ou modificação, por ocorrência de aminoácidos não-naturais. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzido por tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido a partir de uma designada seqüência de ácido nucleico. Ela pode ser produzida de qualquer forma, inclusive por síntese química.
Um polipeptídeo da invenção pode ser de um tamanho de cerca de 3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 5 0 ou mais, 7 5 ou mais, 100 ou mais, 2 00 ou mais, ou 500 mais, igual ou superior a 1000, ou 2000 ou mais aminoácidos. Polipeptídeos com uma estrutura tridimensional definida não necessariamente têm essa estrutura. Polipeptídeos com uma estrutura tridimensional definida são referidos como dobradas, e polipeptídeos que não possuem uma estrutura tridimensional definida, mas ainda podem adotar um grande número de diferentes conformações, são referidos como desdobradas. Conforme utilizado aqui, o termo glicoproteína refere-se a uma proteína associada a pelo menos uma fração de carboidrato que está ligada à proteína através de um resíduo de aminoácido de cadeia lateral que contem oxigênio ou nitrogênio, por exemplo, um resíduo de serina ou um resíduo de asparagina. Por um polipeptídeo ou um fragmento "isolado", variante, ou derivado dele é pretendido a um polipeptídeo que não está no seu meio natural. Nenhum nível específico de purificação é necessário. Por exemplo, um polipeptídeo isolado pode ser removido de seu ambiente natural ou nativo. Polipeptídeos recombinantemente produzidos e proteínas expressas em células hospedeiras são consideradas isoladas para efeitos da invenção, tal como são nativos ou polipeptídeos recombinantes que foram separados, fracionados, ou substancialmente ou parcialmente purificados por qualquer técnica adequada.
Também incluídos como polipeptídeos da presente invenção são fragmentos, derivados, análogos, ou variantes dos polipeptídeos precedentes, e qualquer combinação destes. Os termos "fragmento", "variante", "derivados", e "análogo" quando se refere a anticorpos anti-CD2 0 ou anticorpos polipeptídeos da presente invenção incluem quaisquer polipeptídeos que mantêm pelo menos algumas das propriedades de ligação a antígeno do anticorpo correspondente ou polipeptídeo anticorpo da invenção. Fragmentos de polipeptídeos da presente invenção incluem fragmentos proteolíticos, bem como a fragmentos de deleção, além de fragmentos de anticorpos específicos discutidos em outras fontes. Variantes de anticorpos anti-CD20 e anticorpos polipeptídeos da presente invenção incluem fragmentos, como descrito acima, e também polipeptídeos alterados devido as seqüências de aminoácidos, substituições de aminoácidos, supressões ou inserções. Variantes podem ocorrer naturalmente ou não. Os variantes de ocorrência de não-natural podem ser produzidom utilizando técnicas de mutagênese conhecidas da técnica. Polipeptídeos variantes podem incluir substituições conservativas ou não-conservativas de aminoácidos, supressões ou adições. Derivados de anticorpos anti-CD20 e anticorpos polipeptídeos da presente invenção, são polipeptideos que têm sido alterados de modo a exibir características adicionais não encontradas no anticorpo referência ou polipeptídeo anticorpo da invenção. Exemplos incluem proteínas de fusão. Polipeptídeos variantes também podem ser aqui referidos como "polipeptídeos analogos". Conforme utilizado aqui um "derivado" de um anticorpo anti- CD2 0 ou anticorpo polipeptídeo se refere a um polipeptídeo tendo um ou mais resíduos quimicamente derivados da reação de um grupo lateral funcional. Também incluídos como "derivados" são os peptídeos que contêm um ou mais aminoácidos naturalmente derivados dos vinte aminoácidos padrões. Por exemplo, 4-hidroxiprolina pode ser substituída por prolina; 5-hidroxilisina pode ser substituída por lisina; 3-metilhistidina pode ser substituída por histidina; homoserina pode ser substituída por serina; ornitina e pode ser substituída por lisina.
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0 termo "polinucleotídeos" é pretendido a abranger ácidos nucléicos singulares, bem como ácidos nucléicos variados, e refere-se a uma molécula de ácido nucleico isolado ou construções de ácido nucléico, por exemplo, RNA mensageiro (RNAm) ou plasmídeo de DNA (pDNA) . Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação fosfodiester convencional ou uma não-convencional (por exemplo, uma ligação amida, tal como encontrada em peptídeos de ácidos nucléicos (PNA)). 0 termo "ácidos nucléicos" refere-se a qualquer um ou mais segmentos do ácido nucleico, por exemplo, fragmentos de DNA ou RNA, presentes em um polinucleotídeo. Por ácido nucleico ou polinucleotídeo "isolados" é pretendida uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA, que foi removida de seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante de codificação um anticorpo anti-CD2 0 contido em um vetor é considerado isoladamente para efeitos da presente invenção. Outros exemplos de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotideos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotideos purificados (parcial ou substancialmente) em solução. RNA isolado inclui moléculas de RNA transcitas in vivo ou in vitro de polinucleotideos da presente invenção. Polinucleotideos ou ácidos nucléicos isolados, de acordo com a presente invenção, além disso, incluem tais moléculas produzidas sinteticamente. Além disso, um polinucleotídeo ou um ácido nucleico pode ser ou pode incluir um elemento regulador, como um promotor, sítio de ligação de ribossoma, ou um terminador de transcrição.
Conforme utilizado aqui, uma "região codificante" é uma porção de ácido nucleico que consiste de códons traduzidos em aminoácidos. Embora um "stop codon" (TAG, TGA, ou TAA), não seja traduzido em um aminoácido, pode ser considerado como parte de uma região codificadora, mas qualquer seqüência flanqueadora, por exemplo, promotores, sítio de ligação de ribossoma, terminadores de transcrição, introns, e similares, não fazem parte de uma região codificadora. Duas ou mais regiões codificantes da presente invenção podem estar presentes em uma única construção polinucleotídica, por exemplo, em um único vetor, ou em construções polinucleotídicas separadas, por exemplo, em vetores separados (diferentes). Além disso, qualquer vetor pode conter uma única região codificadora, ou pode incluir dois ou mais regiões codif icantes, por exemplo, um único vetor pode codificar separadamente imunoglobulina uma cadeia pesada e uma região variável da região de cadeia leve variável da imunoglobulina. Além disso, um vetor, polinucleotídeo, ou ácido nucleico da invenção pode codificar regiões codificantes heterólogas, quer fusionadas ou não a um ácido nucleico codificando um anticorpo anti- CD2 0 ou fragmento, variante, ou derivado deles. Regiões codificantes heterólogas incluem, sem limitação elementos ou motivos especializados, como um peptídeo sinal secretor ou um domínio heterólogo funcional.
Em certas concretizações, o polinucleotídeo ou ácido nucleico é o DNA. No caso do DNA, um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo normalmente pode incluir um promotor e/ou outros elementos de controle de tradução ou transcrição operacionalmente associados a uma ou mais regiões codificantes. Uma associação operacional é quando uma região codificadora de um produto de gene, por exemplo, um polipeptídeo, está associado a uma ou mais seqüências reguladoras de uma forma que coloque a expressão do produto gênico sob a influência ou o controle da seqüência reguladora. Dois fragmentos de DNA (como uma região codificadora de polipeptídeo e um promotor a ela associado) são "operacionalmente associados" se a indução do promotor funcional resulta na transcrição do mRNA que codifica para o produto gênico desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interferir com a capacidade de seqüências reguladoras da expressão comandarem a expressão do produto do gene ou interferir com a habilidade do molde de DNA a ser transcrito. Assim, uma região promotora seria operacionalmente associada com um ácido nucleico codificando um polipeptídeo se o promotor for capaz de efectuar a transcrição do ácido nucleico. 0 promotor pode ser um promotor específico da célula que comanda a transcrição substancial do DNA apenas em células predeterminadas. Outros elementos reguladores de trancrição, além de um promotor, por exemplo, intensificadores, operadores, repressores, e sinais de terminação de transcrição, podem ser associados operacionalmente com o polinucleotídeo para comandar transcrição específica em células. Promotores adequados de controle de transcrição e outras regiões são divulgados aqui .
Uma variedade de regiões de controle transcrição é conhecida por aqueles qualificados na técnica. Estas incluem, sem limitação, regiões de controle de transcrição que funcionam em células de vertebrados, tais como, mas não se limitando a, promotor e intensificador de segmentos de citomegalovirus (o promotor de início precoce, em conjunto com intron-A), vírus 40 de símio (o promotor iniciador), e retrovírus (como Rous sarcoma vírus). Outras regiões de controle de transcrição incluem os genes derivados de animais vertebrados, como a actina, proteínas de choque térmico, hormônio do crescimento de bovinos, β-globina de coelhos, bem como outras seqüências capazes de controlar a expressão gênica em células eucarióticas. Adicionalmente, outras regiões adequadas de controle da transcrição incluem promotores tecido-específicos e intensificadores, bem como promotores induzíveis por linfocinas (por exemplo, promotores induzíveis por interferons ou interleucinas).
Da mesma forma, uma variedade de elementos controladores da tradução é conhecido por aqueles de habilidade na técnica. Estes incluem, mas não estão limitados a, sítios de ligação de ribossoma, códons de início e término de tradução, e os elementos derivados de picornavirus (especificamente o sítio interno de entrada do ribossoma, ou IRES, também referidos como uma seqüência CITE). Em outras concretizações, um polinucleotídeo da presente invenção é RNA, por exemplo, sob a forma de RNA mensageiro (RNAm).
Polinucleotídeos e regiões codificantes de ácidos nucleicos da presente invenção podem estar associados a outras regiões codificantes que codificam peptideos sinais e secretores, que dirigirão a secreção de um polipeptídio codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. De acordo com a hipótese de sinal, proteínas secretadas pelas células de mamíferos têm um sinal peptídeo ou seqüência secretória líder que é clivada da proteína madura, uma vez que a exportação da proteína nascente, por toda a cadeia do retículo endoplasmático rugoso, tenha sido iniciada. Aqueles habilitados na técnica estão cientes de que polipeptídeos secretados por células de vertebrados têm geralmente um peptídeo sinal fusionado ao N-terminal do polipeptídeo, que é clivado a partir da seqüência completa ou "integral" para produzir forma do polipeptídeo secretado ou "maduro". Em certas concretizações, o peptídeo sinal nativo, por exemplo, um peptídeo sinal de uma cadeia pesada ou leve de imunoglobulina é usado, ou um derivado funcional dessa seqüência que mantém a capacidade para dirigir a secreção do polipeptídeo que é operacionalmente a ela associado. Alternativamente, um peptídeo sinal heterólogo de mamíferos, ou um seu derivado funcional, pode ser utilizado. Por exemplo, a seqüência líder do tipo selvagem pode ser substituída pela seqüência líder do ativador do plasminogênio tissular (TPA) humano ou β-glucuronidase de camundongos.
A presente invenção é dirigida a certos anticorpos anti-CD2 0, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou seus derivados. A menos que especificamente referindo-se a anticorpos completos, como anticorpos naturalmente existentes, o termo "anticorpos anti-CD20" engloba todos os anticorpos completos, bem como fragmentos que se ligam a antigenos, variantes, análogos, ou derivados de tais anticorpos, por exemplo, moléculas de anticorpo naturalmente existentes, ou moléculas de imunoglobulina ou moléculas de anticorpos construídas ou fragmentos que se ligam a antígeno de uma forma semelhante as moléculas de anticorpo.
Os termos "anticorpos" e "imunoglobulina" são utilizados alternadamente aqui. Um anticorpo ou imunoglobulina inclui pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada e, em princípio, compreende, pelo menos, os domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve. Estruturas básicas de imunoglobulina em sistemas de vertebrados são relativamente pouco compreendidas. Ver, por exemplo, Harlow et ai. (1988) Antibodies: A Labocamundongory Manual (2 â ed.; Cold Spring Harbor Labocamundongory Press).
Como será discutido com mais detalhe abaixo, a expressão "imunoglobulina" compreende várias grandes classes de polipeptídeos que podem ser distinguidos bioquimicamente. Aqueles qualificados na técnica irão apreciar cadeias pesadas que são classificados como gamma, mi, alpha, delta, ou épsilon, (γ, μ, α, δ, ε), com algumas subclasses entre eles (por exemplo, γ1-γ4). É a natureza desta cadeia que determina a "classe" do anticorpo: IgG, IgM, IgA, IGD, ou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina (Isotipos) , por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, etc, estão bem caracterizadas e são conhecidos por conferir especialização funcional. Versões modificadas de cada uma destas classes e Isotipos são facilmente distinguíveis ao artesão qualificado, tendo em conta a presente revelação e estão, portanto, dentro do âmbito de aplicação da presente invenção. Embora todas as classes imunoglobulina estejam claramente dentro do âmbito da presente invenção, a seguinte discussão será geralmente dirigida para a classe de moléculas de imunoglobulina IgG. No que diz respeito à IgG, uma molécula composta por dois padrões idênticos de cadeia leve de imunoglobulina de polipeptídeos com peso molecular de aproximadamente 23.000 Daltons, e duas cadeias pesadas idênticas polipeptídeos de peso molecular 53000-70000 Daltons. As quatro cadeias são normalmente ligadas por pontes disulfeto em uma configuração de "Y" onde a cadeia leve engata na cadeia pesada começando na dobradiça do "Y" e continuando com a região variável.
Cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda (κ, λ) . Cada classe de cadeia pesada pode ser ligada com uma cadeia leve kappa ou lambda. Em geral, as cadeias leves e pesadas são covalentemente ligadas umas as outras, e porções de "cauda" das duas cadeias pesadas são ligadas entre si por ligações covalentes disulfeto ou ligações não- covalentes quando as imunoglobulinas são geradas quer por hibridomas, Células B, ou de células hospedeiras construídas geneticamente. Na cadeia pesada, as seqüências de aminoácidos seguem de um N-terminal na extremidades bifurcada da configuração do Y para o C-terminal, na parte inferior de cada cadeia.
Ambas as cadeias leves e pesadas são divididas em regiões de homologia estrutural e funcional referidas como a "região constante" e "região variável." Os termos "constante" e "variável" são utilizados funcionalmente. Neste contexto, será apreciado que os domínios variáveis tanto das porções de cadeia leve (VL) e pesada (VH) determinam o reconhecimento antigênico e especificidade. Inversamente, a domínios constantes da cadeia leve (CL) e de cadeia pesada (CHI, CH2, ou CH3) conferem importantes propriedades biológicas tais como a secreção, mobilidade transplacentária, ligação de receptor FC, ligação de complemento, e coisas do gênero. Por convenção, a numeração da região dos domínios constantes aumenta à medida que se tornam mais distais do sítio ligador de antígeno ou amino- terminal do anticorpo. A porção N-terminal é uma região variável e na porção C-terminal é uma região constante; os domínios CH3 e CL realmente compreendem o carboxi-terminal da cadeia leve e pesada, respectivamente.
Como indicado acima, a região variável permite que o
anticorpo reconheça seletivamente e especificamente epítopos ligadores de antígeno. Isto é, os domínios VL e VH ou grupo de regiões determinantes da complementaridade (CDRs) dentro destes domínios variáveis de um anticorpo se combinam para formar a região variável que define um sítio tridimensional de ligação do antígeno. Estas formas quaternárias da estrutua do anticorpo apresentam o sítio ligador de antígeno no final de cada braço do Y. Mais especificamente, o sítio de ligação do antígeno é definido por três em cada uma das cadeias CDRs, VH e VL. Em alguns casos, por exemplo, certas moléculas derivadas de imunoglobulina da espécie dos camelídeos ou imunoglobulinas camelídeos construídas, uma molécula completa de imunoglobulina pode ser constituída por apenas cadeias pesadas, sem cadeias leves. Ver, por exemplo, Hamers Casterman et al. (1993) Nature 363:446 448.
Em anticorpos naturais, as seis "regiões de determinação de complementaridade" ou "CDRs" presentes em cada domínio de ligação de antígeno são curtas, seqüências não contíguas de aminoácidos que são especificamente posicionadas para formar o domínio de ligação de antígeno quando o anticorpo assume a sua configuração tridimensional em um ambiente aquoso. O restante dos aminoácidos do domínio de ligação de antígeno, referidos como regiões "de leitura", mostram menor variabilidade intermolecular. As regiões de leitura adotam largamente conformação de regiões beta pregueadas. Assim, regiões de leitura agem para formar um arcabouço que fornece o posicionamento das CDRs na orientação correta pelas interações entre cadeias, não- covalentes. 0 domínio de ligação de antígeno formado pela posicionamneto das CDRs define uma superfície complementar ao epítopo no antígeno imunorreactivo. Isto promove a superfície ligação complementar nã-covalente do anticorpo ao seu epítopo par. Os aminoácidos que compreendem os CDRs e as regiões de leitura, respectivamente, podem ser facilmente identificado para qualquer dado domínio variável de cadeia leve ou pesada por um proficional de conhecimento ordinário na técnica, uma vez que foram definidos com precisão (ver "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat et al. (1983) US Department of Health and Human Services; e Chothia e Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196:901-917, que são integralmente incorporadas neste documento por referência) .
No caso de existirem duas ou mais definições de um termo que é utilizado e/ou aceito no seio da técnica, a definição do termo, tal como é utilizado neste documento é pretendido a incluir todos esses significados, a menos que explicitamente afirmado o contrário. Um exemplo é a utilização do termo "região de determinação da complementaridade" ("CDR") para descrever sítios de ligação não-contíguos de antígeno encontrado dentro da região variável de ambas cadeias de polipeptídeos, pesada e leve. Esta região foi descrita por Kabat et al. (1983) Departamento Americano de Saúde e Serviços Humanos, Sequences of Proteins of Immunological Interest " e por Chothia e Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, que são incorporados por referência neste documento, em que as definições incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos quando comparados uns contra os outros. No entanto, a aplicação de qualquer definição para se referir a um CDR de um anticorpo ou variantes, é pretendido a estar dentro do âmbito de aplicação do termo, tal como definidos e usados aqui. Os resíduos adequados de aminoácidos que abrangem a CDRs, tal como definido por cada uma das referências acima citadas são apresentadao na Tabela I abaixo como uma comparação. O número exato de resíduos que abrangem um determinado CDR irá variar dependendo da seqüência e tamanho do CDR. Aqueles qualificados na técnica podem rotineiramente determinar que os resíduos compreendem um CDR específico dada a região variável seqüência de aminoácidos do anticorpo.
Tabela 1. Definições de CDRs1
Kabat Chothia Vh CDRl 31-35 26-32 Vh CDR2 50-65 52-58 Vh CDR3 95-102 95-102 Vl CDRl 24-34 26-32 Vl CDR2 50-56 50-52 Vl CDR3 89-97 91-96
A numeração de todas as definições de CDRs na Tabela 1 está de acordo com as convenções de numeração apresentadas por Kabat et ai. (veja abaixo). Kabat et al. igualmente definiram um sistema de numeração para seqüências do domínio variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Um especialista na técnica pode atribuir sem ambigüidade este sistema de "numeração de Kabat" para qualquer seqüência de domínio variável, sem dependência de quaisquer dados experimentais para além da seqüência em si. Conforme utilizado aqui, "Numeração de Kabat" refere-se ao sistema de numeração estabelecido por Kabat et al. (1983) Departamento Americano de Saúde e Serviços Humanos, "Seqüência de Proteínas de Interesse imunológico". Salvo disposição em contrário, as referências à numeração de posições específicas de resíduos de aminoácidos em um anticorpo anti-CD20 ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado destes, da presente invenção, estão de acordo com o sistema de numeração Kabat.
Em espécies camelídeas, a região variável da cadeia pesada, referida como VhH, forma todo o domínio ligador de antígeno. As principais diferenças entre regiões variáveis de camelídeos VhH e os derivados de anticorpos convencionais (Vh) incluem: (a) mais aminoácidos hidrofóbicos na superfície de contato da cadeia leve de Vh, em comparação com a região correspondente no VhH, (b) maior CDR3 em VhH e (c) a ocorrência freqüente de uma ponte disulfeto entre CDRl e CDR3 em VhH.
Anticorpos ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou seus derivados da invenção incluem, mas não estão limitados a, anticorpos policlonais, monoclonais, multiespecíficos, humanos, humanizados, primatizados, ou quiméricos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos de ligação a epítopo, por exemplo, Fab, Fab'e F(ab')2, Fd, Fvs, Fvs de cadeia simples(scFv), anticorpos de cadeia simples, Fvs ligado por disulfeto (sdFv), fragmentos compreendendo quer um domínio VL ou VH, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, e anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id para anticorpos anti-CD20 divulgados aqui). Moléculas ScFv são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, em US Patent No. 5892 019. Imunoglobulina ou moléculas de anticorpo da invenção podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG7 IgE, IgM, IGD, IgA, e IgY), classe (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2, etc), ou subclasse de molécula de imunoglobulina.
Fragmentos de anticorpos, incluindo a anticorpos de cadeia simples, podem incluir a região variável (s), isoladamente ou em combinação com a totalidade ou uma parte do seguinte: região da dobradiça, e domínios CHI, CH2, CH3. Também estão incluídos na invenção fragmentos ligadores de antígenos também compreendendo qualquer combinação de regiões variáveis com uma região da dobradiça, e domínios CHI, CH2, CH3 . Anticorpos ou fragmentos imunoespecíficos destes, para utilização em diagnóstico e métodos terapêuticos divulgados neste documento podem ser provenientes de qualquer origem animal, incluindo aves e mamíferos. Preferivelmente, os anticorpos são provenientes de anticorpos humanos, murinos, de jumento, de coelho, de cabra, de porquinho da índia, de camelo, de lhama, de cavalo, ou de galinhas. Em outra concretização, a região variável pode ser de origem condrictóide (por exemplo, de tubarões). Conforme utilizado aqui, anticorpos "humanos" incluem anticorpos apresentando uma seqüência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulina humana ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endógenas, tal como descrito infra e, por exemplo, em, US Patent No. 5939598 por Kucherlapati et al.
Conforme utilizado aqui, o termo "porção da cadeia pesada" inclui seqüências de aminoácidos derivadas de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Um polipeptídeo compreendendo uma porção de cadeia pesada compreende pelo menos uma porção de: um domínio CHI, um domínio dobradiça (por exemplo, região de dobradiça superior, média e/ou inferior), um domínio CH2, um domínio CH3, ou uma variante ou fragmento desta. Por exemplo, um polipeptídeo ligador para utilização na invenção pode compreender um polipeptídeo compreendendo uma cadeia de domínio CHI; um polipeptídeo compreendendo uma cadeia de domínio CHI, pelo menos uma porção de um domínio dobradiça e um domínio CH2; um polipeptídeo compreendendo uma cadeia Domínio CHl e um domínio CH3; um polipeptídeo compreendendo uma cadeia CHl domínio, pelo menos uma porção de um domínio dobradiça, e um domínio CH3, ou uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CHI, pelo menos uma porção de um domínio dobradiça, um domínio CH2, e um domínio CH3 . Em outra concretização, um polipeptídeo da invenção compreende um polipeptídeo compreendendo uma cadeia de domínio CH3. Além disso, um polipeptídeo ligador para utilização na invenção pode não ter pelo menos uma porção de um domínio CH2 (por exemplo, a totalidade ou parte de um domínio CH2). Conforme estabelecido acima, será entendido por uma pessoa com habilidades comuns na técnica que estes domínios (por exemplo, porções da cadeia pesada) podem ser alterados de modo que eles variem na seqüência de aminoácidos a partir da molécula de imunoglobulina de ocorrência natural.
Em certos anticorpos anti-CD2 0, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou seus derivados divulgados aqui, as porções de cadeia pesada de uma cadeia polipeptidica de um multimero são idênticas aquelas, em uma segunda cadeia de polipeptídeo do multimero. Alternativamente, monômeros contendo porção de cadeia pesada da invenção não são idênticos. Por exemplo, cada monómero pode compreender um sítio alvo de ligação, formando, por exemplo, um anticorpo biespecífico.
As porções de cadeia pesada de um polipeptídeo ligador para utilização em diagnóstico e métodos de tratamento divulgados neste documento podem ser derivadas de diferentes moléculas de imunoglobulina. Por exemplo, uma porção polipeptidica de uma cadeia pesada pode incluir um domínio CHl derivado de uma IgGl e uma molécula derivada de uma região da dobradiça da molécula IgG3. Em outro exemplo, uma cadeia pesada pode representar uma região da dobradiça quimerica derivada, em parte, de uma molécula IgGl e, em parte, de uma molécula IgG3. Em outro exemplo, uma cadeia pesada pode incluir uma porção de dobradiça quimérica derivada, em parte, de uma molécula IgGl e, em parte, de uma molécula IgG4.
Conforme utilizado aqui, o termo "porção de cadeia leve" inclui seqüências de aminoácidos provenientes de uma cadeia leve de imunoglobulina. Preferivelmente, a cadeia leve inclui pelo menos uma porção de um VL ou CL domínio.
Anticorpos anti-CD20, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou seus derivados divulgadas neste documento podem ser descritos ou especificados em termos do epítopo (s) ou parte (s) de um antígeno, por exemplo, uma polipeptídeo alvo (CD2 0) que eles reconhecem ou especificamente se ligam. A porção de um polipeptídeo alvo específico que interage com o domínio de ligação de antígeno de um anticorpo é um "epítopo, " ou um "determinante antigênico" . Um polipeptídeo alvo pode compreender um único epítopo, mas tipicamente inclui pelo menos dois epítopos, e pode incluir qualquer número de epítopos, dependendo do tamanho, conformação, e do tipo de antígeno. Além disso, deve notar-se que um "epítopo" sobre um alvo polipeptídico pode ou não incluir elementos polipeptídicos, por exemplo, um epítopo pode incluir um carboidrato cadeia lateral.
0 tamanho mínimo de um epítopo peptídeo ou polipeptídeo de um anticorpo é pensado para ser de cerca de quatro a cinco aminoácidos. Os peptídeos ou polipeptídeos antigênicos contêm preferivelmente pelo menos sete, mais preverivelmente, pelo menos nove e mais preverivelmente entre pelo menos cerca de 15 para cerca de 3 0 aminoácidos. Uma vez que um CDR pode reconhecer um peptídeo antigênico ou polipepetídeos terciários na sua forma, os aminoácidos compreendendo um epítopo que não precisa ser contíguo e, em alguns casos, pode mesmo não ser na mesma cadeia peptídica. Na presente invenção, peptídeo ou polipeptídeo epítopo reconhecido por anticorpos anti-CD2 0 da presente invenção contém uma seqüência de pelo menos 4, no mínimo, 5, pelo menos, 6, pelo menos 7, mais preverivelmente, pelo menos, 8, pelo menos, 9, em menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, ou entre cerca de 15 para cerca de 3 0 contíguas ou não contíguas aminoácidos de CD2 0.
Por "ligação específica", geralmente significa que um anticorpo se liga a um epítopo via seu domínio de ligação no antígeno, e que a ligação implica em alguma complementaridade entre o domínio de ligação do antígeno e o epítopo. Segundo esta definição, um anticorpo é dito "liga especificamente" a um epítopo quando se liga a esse epítopo, através do seu domínio de ligação ao antígeno mais facilmente do que ligaria ao acaso a um epítopo não relacionado. A expressão "especificidade" é aqui utilizada para qualificar a afinidade relativa com que um determinado anticorpo liga a um determinado epítopo. Por exemplo, anticorpo "A" pode ser considerado como tendo uma maior especificidade para um determinado epítopo que um anticorpo "B", ou anticorpo "A" pode ser dito ligar ao epítopo "C" com uma maior especificidade a que ele tem para epítopo "D" relacionado.
Por "ligar preferivelmente", entende-se que o anticorpo se liga a um epítopo específico mais facilmente do que se ligaria a um relacionado, similares, homólogos ou epítopo análogos. Assim, um anticorpo que "Preferivelmente liga" a um determinado epítopo provavelmente se liga mais a um epítopo do que ao epítopo relacionado, embora tal um anticorpo possa reagir de forma cruzada com o epítopo relacionado.
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A propósito de um exemplo não-limitante, um anticorpo pode ser considerado por ligar a um primeiro epítopo preferivelmente se ele liga ao referido ao primeiro epítopo com uma constante de dissociação (KD) que é inferior a do anticorpo KD para o segundo epítopo. Em outro exemplo, não limitante, um anticorpo pode ser considerado por ligar a um primeiro antígeno preferivelmente, se se liga ao primeiro epítopo com uma afinidade que tem pelo menos uma ordem de magnitude menor do que o anticorpo do KD para o segundo epítopo. Em outro exemplo, não limitante, um anticorpo pode ser considerado por ligar a um primeiro epítopo pref erivelmente, se se liga ao primeiro epítopo com uma afinidade que é, pelo menos, duas ordens de magnitude menor do que o anticorpo do KD para o segundo epítopo. Em outro exemplo, não limitante, um anticorpo pode ser considerado por ligar a um primeiro epítopo pref erivelmente, se se liga ao primeiro epítopo com uma taxa de dissociação (k (off) ) que é inferior taxa de dissociação (K(off)) para o segundo epítopo. Em outro exemplo, não limitante, um anticorpo pode ser considerado por ligar a um primeiro epítopo preferivelmente, se se liga ao primeiro epítopo com uma afinidade que tem pelo menos uma ordem de grandeza inferior a taxa de dissociação (K(off)) para o segundo epítopo. Em outro exemplo, não limitante, um anticorpo pode ser considerado por ligar a um primeiro epítopo preferivelmente se se liga ao primeiro epítopo com uma afinidade que é, pelo menos, duas ordens de grandeza inferior a taxa de dissociação (K(off)) para o segundo epítopo.
Um anticorpo ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado divulgado neste documento podem ser ditos por ligar a um polipeptídeo alvo divulgado aqui ou um fragmento ou variante, com um taxa de dissociação (K(off)) igual ou inferior a 5 X 10 "2 seg"1, IO"2 seg 5 X IO"3 s"1, ou 10~3 sec"1. Mais prever ivelmente, um anticorpo da invenção pode ser dito por ligar a um polipeptídeo alvo divulgado aqui ou um fragmento ou variante, com um taxa de dissociação (K(off) ) inferior ou igual a 5 χ IO"4 seg"1, IO"4 seg"1, 5 X IO"5 seg"1, ou IO"5 seg"1, 5 X IO"6 seg"1, IO"6 seg"1, X IO"7 seg"1, ou IO"7 seg"1.
Um anticorpo ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles divulgados neste documento podem ser referenciados por ligar a um polipeptídeo alvo divulgado aqui ou um fragmento ou variante, com uma taxa relativa (k(on)) igual ou superior a IO3 M"1 seg"1, 5 χ IO3 M"1 seg"1, IO4 M"1 seg"1, ou 5 X IO4 M"1 seg"1. Mais preverivelmente, um anticorpo da invenção pode ser dito por ligar a um polipeptideo alvo divulgado aqui ou um fragmento ou variante, com uma taxa relativa (k(on)) igual ou superior a IO5 M"1 seg~\ 5 χ IO5 M"1 seg"1, IO6 M"1 seg"1, 5 χ IO6 M"1 seg"1, ou IO7 M"1 seg"1.
Diz-se que um anticorpo inibe competitivamente a ligação de um anticorpo referência a um determinado epítopo se ele se liga preferivelmente a aquele epítopo na medida em que bloqueia, em certa medida, a ligação do anticorpo referência ao epítopo. Inibição competitiva pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, o ensaio de competição ELISA. Um anticorpo pode ser dito por inibir competitivamente a ligação do anticorpo referência a um determinado epítopo por pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, ou, pelo menos, 50%.
Conforme utilizado aqui, o termo "afinidade" refere-se a uma medida da força da ligação de um epítopo individual com o CDR de uma molécula de imunoglobulina. Ver, por exemplo, Harlow et al. (1988) Antibodies: A Labocamundongory Manual (Cold Spring Harbor
Labocamundongory Press, 2nd ed.) Páginas 27-28. Conforme utilizado aqui, o termo "avidez" refere-se a estabilidade global do complexo entre uma população de imunoglobulinas e um antígeno, ou seja, a força de combinação funcional de uma mistura de imunoglobulinas com o antígeno. Ver, por exemplo, Harlow em páginas 29-34. Avidez está relacionada com a afinidade de ambas as moléculas de imunoglobulina individuais na população com epítopos específicos, e também a valência das imunoglobulinas e o antígeno. Por exemplo, a interação entre um anticorpo monoclonal bivalente e um antígeno com uma estrutura altamente repetitiva do epítopo, como um polímero, teria uma de alta avidez.
Anticorpos anti-CD20 ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou seus derivados da invenção também pode ser descritos ou especificados em termos da sua reação cruzada. Conforme utilizado aqui, o termo "reatividade cruzada" remete para a capacidade de um anticorpo, específico para um antígeno, de reagir com um segundo antígeno; uma medida de parentesco entre duas diferentes substâncias antigênicas. Assim, um anticorpo é cross reativo se se liga a um epítopo diferente daquele que induziu sua formação. A reação cruzada do epítopo geralmente contém muita das mesmas características estruturais complementares como a indução epítopo e, em alguns casos, pode realmente encaixar melhor do que o original.
Por exemplo, alguns anticorpos têm algum grau de reação cruzada, na medida em que se ligam a relacionados, mas não aos epítopos idênticos, por exemplo, epítopos com pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, em menos 75%, pelo menos 70%, no mínimo, 65%, pelo menos, 60%, pelo menos 55%, e pelo menos 50% identidade (como calculado por meio de métodos conhecidos na técnica e descritos a seguir), para um epítopo referência. Um anticorpo pode-se dizer que têm pouca ou nenhuma reação cruzada se não se ligar a epí topos com menos de 95%, inferior a 90%, inferior a 85%, inferior a 80%, inferior a 75%, inferior a 70%, inferior a 65%, inferior a 60%, inferior a 55%, e inferior a 50% identidade (como calculado por meio de métodos conhecidos na técnica e descritos a seguir), para uma referência epítopo. Um anticorpo pode ser considerado "muito específico" em relação a um determinado epítopo, se ele não se ligar a qualquer outro análogo, ortólogo, ou de epítopo homólogo.
Anticorpos anti-CD20 ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes ou derivados da invenção também pode ser descritos ou especificados em termos da sua afinidade ligadora para um polipeptídeo da invenção. Afinidades preferenciais de ligação incluem uma constante de dissociação Kd ou inferior a 5 χ IO"2 Μ, IO"2 Μ, 5 χ IO"3 Μ, IO"3 Μ, 5 χ IO"4 Μ, IO"4 Μ, 5 M χ IO"5, IO"5 Μ, 5 χ IO"6 Μ, 10" 6 Μ, 5 χ IO"7 Μ, IO"7 Μ, 5 χ IO"8 Μ, IO"8 Μ, 5 χ IO"9 Μ, IO"9 Μ, 5 χ M IO"10, IO"10 Μ, 5 χ M IO"11, IO"11 Μ, 5 χ IO"12 Μ, IO"12 Μ, 5 χ IO"13 Μ, IO"13 Μ, 5 χ IO"14 Μ, IO"14 Μ, 5 χ IO"15 Μ, ou IO"15.
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Anticorpos anti-CD20 ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes ou derivados da invenção podem ser "multiespecíficos", por exemplo, biespecífico,
triespecífico, ou de maior muitiespecificidade, o que significa que reconhece e se liga a dois ou mais diferentes epítopos presentes em um ou mais antígenos diferentes (por exemplo, proteínas), ao mesmo tempo. Assim, se um anticorpo anti-CD20 é "monoespecífico" ou "multiespecíficos", por exemplo, "biespecífico," refere-se ao número de diferentes epítopos com que se liga a um polipeptídeo reagente. Anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para diferentes epítopos de um polipeptídeo alvo descrito aqui ou podem ser específicos para um polipeptídeo alvo, bem como para um epítopo heterólogo, como um polipeptídeo heterólogo ou material do suporte sólido.
Conforme utilizado aqui o termo "valência" refere-se ao número de potenciais domínios de ligação, por exemplo, domínio de ligação de antígeno, presente em um anticorpo anti-CD20, polipeptídeos de ligação, ou anticorpos. Cada domínio ligador especificamente liga um epítopo. Quando um anticorpo anti-CD20, polipeptídeos de ligação, ou anticorpos compreende mais de um domínio de ligação de anticorpo, cada domínio de ligação pode especificamente ligar o mesmo epítopo, para um anticorpo com dois domínios de ligação, denominado "monoespecificidade bivalente", ou a diferentes epítopos, para um anticorpo com dois domínios ligadores, denominado "biespecíficidade bivalente". Um anticorpo pode também ser biespecífico e bivalente para cada especificidade (denominados "anticorpos biespecíficos tetravalentes"). Em outra concretização, podem ser feitos minianticorpos tetravalentes ou anticorpos com domínio deletados.
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Anticorpos biespecíficos bivalentes, e métodos de fazê-los, são descritos, por exemplo, em US Patente η2 5731168; 5807706; 5821333; e US Patent Appl. Publ. N2 2003/020734 e 2002/0155537, as divulgações de todos que são incorporadas por referência neste documento. Anticorpos biespecíficos tetravalente, e métodos de fazê-los são descritos, por exemplo, em WO 02/096948 e WO 00/44788, as informações de ambas as divulgações são incorporadas por referência neste documento. Ver em geral, publicações PCT WO 93/17715, WO 92/08802, WO 91/00360, WO 92/05793; Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69; US Patent η 2 4474893; 4714681; 4925648; 5573920; 5601819; Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148:1547-1553.
Conforme indicado anteriormente, as subunidades
estruturais e a configuração tridimensional das regiões constantes das várias classes de imunoglobulina são bem conhecidas. Conforme utilizado aqui, o termo "domínio VH" inclui o domínio amino terminal variável de uma cadeia pesada de uma imunogIobulina e o termo "domínio CHI" inclui o primeiro domínio (mais amino terminal) da região constante da cadeia pesada de uma imunoglobulina. 0 domínio ChI é adjacente ao domínio Vh e é amino terminal a região da dobradiça da molécula da cadeia pesada de uma imunoglobulina.
Conforme utilizado aqui o termo "Domínio CH2" inclui a parte de uma molécula da cadeia pesada que se estenda, por exemplo, de 244 para cerca de 3 60 resíduos de um anticorpo utilizando os sistemas de numeração convencionais (resíduos 244 a 360, sistema de numeração Kabat; e resíduos 231-340, sistema de numeração EU; ver Kabat EA et ai. op. cit. 0 domínio CH2 é único em que não está intimamente pareado com outro domínio. Pelo contrário, as duas cadeias de carboidratos N-Iigadas ramificadas estão interpostas entre dois domínios CH2 de uma molécula de IgG nativa intacta. Também é bem documentado que o CH3 domínio estende-se desde o domínio CH2 ao C-terminal da molécula IgG e compreende aproximadamente 108 resíduos.
Conforme utilizado aqui, o termo "região da dobradiça" inclui a parte de uma molécula de cadeia pesada que se junta ao domínio ChI pelo domínio CH2. Esta região da dobradiça compreende aproximadamente 2 5 resíduos e é flexível, permitindo assim que as duas regiões N-terminal ligadoras de antígeno se movam de forma independente. As regiões de dobradiça podem ser subdivididas em três domínios distintos: os domínios de dobradiça superior, médio e inferior (Roux et ai. (1998) J. Immunol. 161:4083).
Conforme utilizado aqui o termo "ligação disulfeto" inclui a ligação covalente formada entre dois átomos de enxofre. 0 aminoácido cisteína compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação ou ponte disulfeto com um segundo grupo tiol. Na maioria das moléculas IgG que ocorrem naturalmente, as regiões Cl e ChI estão ligadas por um ligação disulfeto e as duas cadeias pesadas estão ligadas por duas ligações disulfeto nas posições correspondentes a 23 9 e 242 usando o sistema de numeração Kabat (posição 22 6 ou 229, sistema de numeração da EU ).
Conforme utilizado aqui, o termo "anticorpos quiméricos" será utilizado de forma a significar qualquer anticorpo onde região ou sítio imunorreactivo é obtido ou derivado de uma primeira espécie e a região constante (que pode estar intacta, parcial ou modificada de acordo com a invenção) é obtida a partir de uma segunda espécie. Em concretização preferida, a região ou sítio de ligação alvo será de uma fonte não-humana (por exemplo, camundongo ou primata) e a região constante é humana.
Conforme utilizado aqui, o termo "anticorpos quiméricos" refere-se a um anticorpo em que o domínio variável em quaisquer das cadeias leve ou pesada, ou ambas está alterada por, pelo menos, substituição parcial de um ou mais CDRs de um anticorpo de especificidade conhecida, e, se necessário, pela substituição parcial da região de leitura e mudança da seqüência. Embora os CDRs possam ser derivados de um anticorpo da mesma classe ou subclasse como o anticorpo das regiões de leitura é derivado, é previsto que os CDRs serão derivados de um anticorpo de classe diferente e, de preferência a partir de um anticorpo de uma espécie diferente. Um anticorpo construído em que um ou mais CDRs "doador" de um anticorpo não-humano de especificidade conhecida é enxertado em uma região de leitura da cadeia pesada ou leve humana é aqui referido como "um anticorpo humanizado". Pode não ser necessário substituir todos os CDRs pelos CDRs completos do domínio variável doador para transferir a capacidade de ligação ao antígeno de um domínio variável para outro. Pelo contrário, pode ser somente necessário transferir os resíduos daqueles que são necessários para manter a atividade do sítio de ligação alvo.
É ainda reconhecido que as regiões de leitura dentro do domínio variável em uma cadeia leve ou pesada, ou ambas, de um anticorpo humanizado podem compreender apenas resíduos de origem humana, caso em que essas regiões de leitura de anticorpos humanizados são referidas como "regiões de leitura plenamente humanas". Alternativamente, um ou mais resíduos região (s) de leitura do domínio variável doador podem ser manipulados na posição correspondente as região (s) de leitura de um domínio variável das cadeias pesadas ou leves de humano, ou ambas, de um anticorpo humanizado, se necessário, para manter uma ligação apropriada ou para reforçar a ligação com o antígeno CD20. Uma região de leitura humana que foi concebida desta forma compreenderia uma mistura de resíduos de leitura de doador e de humanos, e é aqui referido como "região de leitura parcialmente humana". Dadas as explicações apresentada em, por exemplo, US Patente η 2 5585089, 5693761, 5693762 e 6180370, será do âmbito de competência dos qualificados na técnica, quer através da realização de experimentação rotineira ou por testes tentativa e erro para a obtenção anticorpo quimérico funcionais ou humanizados.
Por exemplo, uma humanização do anticorpo anti-CD2 0 pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321:522- 525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323 -- 327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), substituindo CDRs de roedor ou CDR de roedor mutante ou seqüências de CDR por seqüências correspondentes de um anticorpo anti-CD2 0 humano. Veja também US Patente η 2 5225539; 5585089; 5693761; 5693762; 5859205; aqui incorporadas por referência. 0 anticorpo anti-CD2 0 humanizado resultante compreenderia pelo menos um CDR de roedor ou CDR de roedor mutante dentro da região de leitura completamente humano do domínio variável das cadeias pesadas e/ou leves do anticorpo humanizado. Em alguns casos, os resíduos dentro das regiões de leitura de um ou mais domínios variáveis do anticorpo anti-CD2 0 humanizado, são substituídos pelos resíduos correspondentes não-humanos (por exemplo, roedores) (ver, por exemplo, Patentes US η 2 5585089; 5693761; 5693762 e 6180370), caso em que a anticorpo anti-CD20 humanizado resultante seria constituído regiões de leitura parcialmente humanas posição dentro do domínio da variável das cadeias pesadas e/ou leves.
Além disso, anticorpos humanizados podem compreender
resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para aperfeiçoar o desempenho do anticorpo (por exemplo, para obter a afinidade desejada). Em geral, o anticorpo humanizado será composto substancialmente de todo de, pelo menos, um, e tipicamente dois domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os CDRs correspondem a aquelas imunoglobilina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões de leitura de uma seqüência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado opcionalmente também irá incluir pelo menos uma porção de uma região constante da imunoglobulina (Fe), que geralmente é a de uma imunoglobulina humana. Para mais informações, ver Jones et al. (1986) Nature 331:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; e Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596; aqui incorporadas por referência. Assim, tais anticorpos "humanizados" podem incluir anticorpos onde substancialmente menos do que um domínio variável intacto humano tem sido substituído pela correspondente seqüência de uma espécie não-humana. Na prática, os anticorpos humanizados são geralmente anticorpos humanizados em que alguns resíduos do CDR e, possivelmente, alguns resíduos leitura são substituídos por resíduos provenientes sítios análogos de anticorpos de roedores. Ver, por exemplo, Patentes US η 2 522 553 9; 5585089; 5693761; 5693762; 5859205. Veja também Patente US No. 6180370, e Publicação Internacional No. WO 01/27160, onde anticorpos humanizados e técnicas para a produção de anticorpos humanizados tendo afinidade melhorada para um determinado antígeno são divulgados.
Conforme utilizado aqui, o termo "polipeptídeos devidamente dobrados" inclui polipeptídeos (por exemplo, anticorpos anti-CD2 0), no qual todas as domínios funcionais compreendem os polipeptídeos que são distintamente ativos. Conforme utilizado aqui, o termo "polipeptídeos indevidamente dobrados" inclui polipeptídeos na qual pelo menos um dos domínios funcionais dos polipeptídeos não está ativa. Em uma concretização, um polipeptídeo devidamente dobrado compreende cadeias de polipeptídeos ligadas por pelo menos uma ponte disulfeto e, inversamente, uma polipeptídeos inadequadamente dobrados compreende cadeias polipeptídeos não ligadas por pelo menos uma ponte disulfeto.
Conforme utilizado aqui, o termo "construídas" inclui a manipulação de ácidos nucleicos ou moléculas de polipeptídeos por meios sintéticos (por exemplo, técnicas recombinantes, síntese in vitro de peptídeo, acoplamento químico ou enzimático dos peptídeos ou alguma combinação destas técnicas).
Conforme utilizado aqui, os termos "ligado",
"fusionado", ou "fusão" são utilizados alternadamente. Estes termos referem-se a juntar mais de dois elementos ou componentes, por qualquer meio, incluindo meios de conjugação química ou recombinante. Um "fusão in-frame" refere-se à junção de dois ou mais polinucleotídeos em fase aberta de leitura (ORFS) para formar um contínuo ORF longo, de uma forma que mantém a fase de leitura traducional correta dos ORFS originais. Assim, uma proteína recombinante de fusão é uma única proteína contendo dois ou mais segmentos que correspondem a polipeptídeos codificados pelos ORFS originais (no qual os segmentos não são normalmente tão ligados na natureza). Embora a posição de leitura seja, então, feita continuamente ao longo de todo os segmentos fusionados, os segmentos podem ser fisicamente ou espacialmente separados, por exemplo, pela seqüência ligadora in-frame. Por exemplo, os polinucleotídeos que codficacam os CDRs de uma região variável da imunoglobulina podem ser fusionados, in-frame, mas ser separados por um polinucleotídeo codificando, pelo menos, uma região de leitura de uma imunoglobulina ou de regiões de CDR adicionais, enquanto os CDRs "fusionados" são co-traduzidos como parte de um polipeptídeos contínuo.
No contexto de polipeptídeos, uma "seqüência linear" ou uma "seqüência" é uma ordem de aminoácidos em um polipeptídeo em uma direção amino-carboxi terminal em que os resíduos de cada vizinho na seqüência são contíguos na estrutura primária da polipeptídeos. O termo "expressão", como utilizado neste documento refere-se a um processo pelo qual um gene produz um produto bioquímico, por exemplo, um polipeptídeo. O processo inclui qualquer manifestação da presença do gene funcional dentro da célula, incluindo, sem limitação, gene Knockdownl bem como ambas as expressões transientes e estáveis. Este inclui, sem limitação a transcrição do gene em RNA mensageiro (mRNA) , e a tradução desse mRNA em polipeptídeo(s). Se o produto final pretendido é um produto bioquímico, expressão que inclui a criação de qualquer produto bioquímico e quaisquer precursores. Expressão de um gene produz um "produto gênico." Conforme utilizado aqui, um gene pode ser um produto gênico, por exemplo, um RNA mensageiro produzido pela transcrição de um gene, ou um polipeptídeo, que é traduzido a partir de um transcrito. Produtos gênicos descritos neste documento, além disso, incluem ácidos nucléicos com modificações pós- transcricionais, por exemplo, poliadenilação, ou polipeptídeos com modificações pós traducionais, por exemplo, metilação, glicosilação, a adição de lipídios, associação com outras subunidades protéicas, clivagem proteolítica, e coisas do gênero.
Conforme utilizado aqui, os termos "tratar" ou "tratamento" referem-se tanto a um tratamento terapêutico e profilático ou de medidas preventivas, onde o objetivo é prevenir ou desacelerar (diminuir) uma alteração fisiológica indesejada ou desordem, tais como a progressão da esclerose múltipla. Resultados benéficos ou desejados clínicos incluem, mas não estão limitados a, alívio dos sintomas, diminuição da extensão da doença, (ou seja, não piora) estado estabilizado da doença, atraso ou abrandamento da progressão da doença, melhoria ou paliação da doença estadual, e remissão (parcial ou total), quer seja detectável ou indetectável. "Tratamento" também pode prolongar a sobrevida média, em comparação com expectativa de sobrevida, se não receber tratamento. Aqueles que necessitam de tratamento incluem as que foram já com a condição ou transtorno, bem como aqueles propensos a ter a condição ou desordem ou aqueles em que a doença ou enfermidade, deve ser evitada.
Por "sujeito" ou "indivíduo" ou "animal" ou "paciente" ou "mamífero", entende-se qualquer sujeito, especificamente mamíferos, para quem diagnóstico, prognóstico ou terapia é desejado. Sujeitos mamíferos incluem seres humanos, animais domésticos, animais de campo, de zoológico, de esportes, ou animais de estimação, como cães, gatos, porquinhos da índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, bovinos, vacas, e assim por diante.
Conforme utilizado aqui, frases como "um sujeito que iria se beneficiar da administração de um anticorpo anti- CD2 0" e "um animal em necessidade de tratamento" incluem sujeitos, tais como mamíferos, que se beneficiariam da administração de um anticorpo anti-CD20 utilizado, por exemplo, para a detecção de um anti-CD2 0 polipeptídeos (por exemplo, para um procedimento diagnóstico) e/ou de tratamento, ou seja, paliativo ou prevenção de uma doença, com um anticorpo anti-CD20. Conforme descrito em mais detalhe a seguir, o anticorpo anti-CD20 pode ser usado em forma não conjugada ou podem ser conjugados, por exemplo, a uma droga, pró-drogas, ou um isótopo.
II. DESCRIÇÃO DO PEPTÍDIO ALVO
A molécula Bl (CD20) é uma fosfoproteína de aproximadamente 35.000 Daltons na superfície dos linfócitos 10
B humanos que pode servir um papel central na resposta imune humoral através da proliferação e diferenciação celular Β. A seqüência de DNA que codifica para molécula CD2 0 foi isolada e seqüência de aminoácidos do CD2 0 foi determinada. Ver, Tedder et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 85:208-212. Sinônimos de CD20, tal como reconhecido na técnica, incluem antígeno CD20 de linfócitos B, antígenos de superfície de linfócitos B- Bl, Leu-16, Bp3 5, BM5, e LF5.
Os anticorpos da invenção apresentam especificidade de ligação para o antígeno de superfície CD20 de célula B humana. 0 antígeno é um polipeptídeo ou compreende um polipeptídeo ligado pelo anticorpo monoclonal 2H7 descrito no Clark et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S. A. 82:1766-1770. Este antígeno é uma fosfoproteína designada (Bp35 (CD20)) e só é expressa em células da linhagem de células B. Anticorpos monoclonais murinos para este antígeno foram feitas antes e são descritos em Clark et al. , Supra; ver também Stashenko et al. (1980) J. Immunol. 125:1678-1685.
III. ANTICORPOS ANTI-CD20
Em uma concretização, a presente invenção é dirigida
para anticorpos anti-CD20, incluindo fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou seus derivados. Os anticorpos da invenção são anticorpos anti-CD2 0 que foram otimizados para o aumento da atividade. Conforme utilizado aqui, o termo "anticorpo anti-CD20" é um anticorpo que especificamente reconhece uma fosfoproteína não-glicosilada da superfície célular de aproximadamente 3 5.000 Daltons, normalmente designada como antígeno de restrição de diferenciação de linfócitos B, Bp35, comumente referido como CD20. 0 antígeno é expresso em mais de 90% dos linfomas não-Hodgkin de célula B, mas não é encontrada em células tronco hematopoiéticas, pró-células B, células plasmáticas normais ou de outros tecidos normais. CD2 0 regula um passo inicial no processo de ativação para a proliferação celular e diferenciação. Mais especificamente, os anticorpos da invenção ligam ao mesmo epítopo de ligação do anticorpo monoclonal 2H7 descrito acima.
Os anticorpos da invenção são otimizados baseado no
anticorpo monoclonal (mAb) C2B8, um anticorpo anti-CD20 quimérico murino/humano como divulgado na Patente US No. 5736137 e (Reff et al. (1994) Blood 83:435-445), aqui incorporadas por referência. 0 anticorpo da invenção inclui seqüências CDRs modificadas que quando manipulado nos domínios variáveis das cadeias leves e pesadas de um anticorpo anti-CD2 0 resultam em uma atividade CDC acentuada do anticorpo enquanto mantém a especificidade e capacidade de mediar apoptose em comparação com rituximab.
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Como se observa, os anticorpos anti-CD20 da invenção exibem atividade CDC aumentada em comparação com rituximab. Rituximab é um anticorpo monoclonal quimérico murino/humano anti-CD20 (IDEC-C2B8; IDEC Pharmaceutical Corp, San Diego, Califórnia; disponível comercialmente sob a marca Rituxan®) contendo regiões constantes kappa e IgGl humanas e com regiões variáveis murina isoladas de um anticorpo monoclonal anti-CD20 murino, IDEC-2B8 (Reff et al. (1994) Blood 83:435-445). Rituximab é utilizado para o tratamento da recidiva de baixo grau das células B ou de linfoma folicular não-Hodgkin (LNH). Embora não ligado a qualquer mecanismo de ação, anticorpos anti-CD2 0 ligam ao antígeno CD2 0 e mecanismos de Iise celular incluem citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e de anticorpos dependentes de citotoxicidade celular mediada (ADCC). Por isso, a descoberta de anticorpos anti-CD2 0 com CDC superior e/ou ADCC atividade, e/ou aumento da afinidade ligadora comparado com rituximab (também aqui referidos como Rituxan®) irá potencialmente melhorar os métodos de terapia para Iinfornas de células B, especificamente Iinfoma de células B não-Hodgkin. Os anticorpos são comparados em ensaios, em montantes equivalentes. Por "quantidade equivalente" do anticorpo anti-CD2 0 da invenção e rituximab é definida a mesma dose que é utilizada para cada anticorpo.
Afinidade ligadora desses novos anticorpos anti-CD2 0 ao CD2 0 é aumentada em pelo menos cerca de 5 0%, cerca de 75%, cerca de 100%, cerca de 125% relativamente ao observado para o rituximab usando uma taxa de CDC off- ensaio. Em um ensaio de CDC não-radioativo, pelo menos cerca de 2 vezes, a cerca de 3 vezes, até cerca de 4 vezes mais rituximab é necessária para mediar o mesmo nível de morte célular em três diferentes linhagens NHL do que é necessário utilizar um anticorpo anti-CD2 0 da invenção.
Os anticorpos anti-CD20 da invenção compreendem, pelo menos, uma região de determinação complementaridade optimizada (CDR) . Por "CDR otimizada" entende-se que o CDR teve as seqüências modificadas e otimizadas selecionadas com base na melhoria da afinidade ligadora e/ou na atividade CDC melhorada que é exercida para um anticorpo anti-CD20 compreendendo as CDR otimizadas. As modificações envolvem a substituição de resíduos aminoácidos dentro do CDR tal que um anticorpo anti-CD2 0 mantém especificidade para o antígeno CD20 e melhora afinidade de ligação e/ou atividade CDC. Atividade CDC de um anticorpo anti-CD20 da invenção é melhorada em comparação com rituxamab em um ensaio funcional, tal como descrito na US Application Publication No. 2004/0167319 Al, aqui incorporada por referência. Os novos anti-CD2 0 anticorpos da invenção e os fragmentos ligadores de antígeno adequados, variantes, e seus derivados também exibem ADCC apoptose e atividade que é, pelo menos, semelhante à que foi exibido por rituximab, medido em ensaios normalizados, por exemplo, as descritas na US Application Publication No. 2004/0167319 Al. Os CDRs otimizados da invenção são utilizados nos domínios Vh e Vl das cadeias pesadas e leves, respectivamente, de anticorpos anti-CD20. Anticorpos anti-CD20 exemplares da invenção compreendem um domínio Vh selecionado do grupo constituído pelas SEQ ID NOS: 12-18 (respectivamente designadas H1569, H1570, H1571, H1638, H1639, H1640, H1670) e/ou um domínio Vl seleccionado a partir de SEQ ID NOS: 10 e 11 (respectivamente designadas L373 e L419).
Em concretizações específicas, os anticorpos anti-CD20 da invenção compreendem CDRs otimizadas. Ou seja, os anticorpos anti-CD20 da invenção compreendem, pelo menos, uma seqüência de aminoácidos CDR otimizada selecionada do grupo constituído por SEQ ID NOS: 1-8 ou aminoácidos com, pelo menos, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75 %, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência selecionados a partir do grupo constituído por SEQ ID NOS: 1-8. Ou seja, os CDRs otimizados incluem as seqüências apresentadas na SEQ ID NOS: 1-8 e as seqüências de SEQ ID NOS: 1-8 têm pelo menos um, dois, três, quatro, ou cinco substituições de aminoácidos, dependendo do CDR envolvidos.
Assim, em algumas concretizações, os anticorpos anti- CD2 0 da invenção compreendem um domínio Vh que tenha pelo menos uma CDR otimizada selecionada a partir do grupo constituído por:
(a) CDRl compreendendo uma seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7;
(b) um CDRl compreendendo uma seqüência de
aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID: 7, onde o CDRl compreende um resíduo de fenilalanina (Phe) na posição correspondente ao resíduo 7 de SEQ ID NO : 7 ;
(c) CDR2 compreendendo uma seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6;
(d) um CDR2 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com
a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID: 5 ou SEQ ID NO: 6, onde o CDR2 compreende o resíduo de alanina (Ala) ou resíduo de leucina (Leu) na posição correspondente ao resíduo 8 da SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, respectivamente;
(e) CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, OU seja, SEQ ID NO: 4;
(f) uma CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com
a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1, quando a CDR3 inclui, pelo menos, um resíduo selecionados a partir do grupo constituído de:
(i) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 9 da SEQ ID NO: 1, e
(ii) o resíduo asparagina (Asn) na posição
correspondente ao resíduo 12 da SEQ ID NO: 1;
(g) um CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:
2, quando a CDR3 inclui pelo menos um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) o resíduo alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 5 da SEQ ID NO: 2,
(ii) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 9 da SEQ ID NO: 2, e
(iii) a asparagina (Asn) resíduo na posição correspondente ao resíduo 12 da SEQ ID NO: 2;
(h) um CDR3 compreendendo uma seqüência de
aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:
3, onde a CDR3 inclui, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) o resíduo alanina (Ala) na posição
correspondente ao resíduo 5 da SEQ ID NO: 3,
(ii) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 9 da SEQ ID NO: 3, e
(iii) o resíduo ácido aspártico (Asp) na posição correspondente ao resíduo 12 da SEQ ID
NO: 3 ;
(i) uma CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4, onde a CDR3 inclui, pelo menos, um resíduo selecionado
a partir do grupo constituído de:
(i) o resíduo alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 5 da SEQ ID NO: 4,
(ii) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 9 da SEQ ID NO: 4
(iii) o resíduo glicina (Gly) na posição correspondente ao resíduo 11 da SEQ ID NO: 4; e
(iv) a resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 12 da SEQ ID NO: 4; (j) um CDRl compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID: 7, onde o CDRl compreende a posição correspondente ao resíduo 7 de SEQ ID NO: 7 um resíduo que é uma
substituição conservada do aminoácido fenilalanina (Phe);
(k) um CDR2 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID: 5,
onde o CDR2 compreende a posição correspondente a 8 de resíduo SEQ ID NO: 5 um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido alanina (Ala);
(1) uma CDR2 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com
a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID: 6, onde o CDR2 compreende a posição correspondente a 8 de resíduo SEQ ID NO: 6 um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido leucina (Leu); (m) um CDR3 compreendendo uma seqüência de
aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1, quando a CDR3 inclui, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de: (i) na posição correspondente ao resíduo 9
da SEQ ID NO: 1, um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido asparagina (ASN), e
(ii) na posição correspondente ao resíduo 12 da SEQ ID NO: 1, um resíduo que é uma
substituição conservada do aminoácido asparagina (ASN);
(n) uma CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:
2, quando a CDR3 inclui pelo menos um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) na posição correspondente ao resíduo 5 da SEQ ID NO: 2, um resíduo que é uma
substituição conservada de alanina (Ala), onde o aminoácido conservado não é glicina,
(ii) na posição correspondente ao resíduo 9 da SEQ ID NO: 2, um resíduo que é uma
substituição conservada do aminoácido asparagina
(ASN), e
(iii) na posição correspondente ao resíduo 12 da SEQ ID NO: 2, um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido asparagina
(Asn) ;
(o) a CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:
3, onde a CDR3 inclui, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) na posição correspondente ao resíduo 5 da SEQ ID NO: 3, um resíduo que é uma substituição conservada de alanina (Ala), onde o aminoácido conservado substituído não é glicina, (ii) na posição correspondente ao resíduo 9
da SEQ ID NO: 3, um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido asparagina (ASN), e
(iii) na posição correspondente ao resíduo 12 da SEQ ID NO: 3, um resíduo que é uma
substituição conservada de ácido aspártico (ASP); e
(p) um CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4, onde a CDR3 inclui, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) na posição correspondente ao resíduo 5 da SEQ ID NO: 4, um resíduo que é uma
substituição conservada de alanina (Ala), onde o aminoácido conservado não é glicina,
(ii) na posição correspondente ao resíduo 9 da SEQ ID NO: 4, um resíduo que é uma
substituição conservada do aminoácido asparagina
(ASN),
(iii) na posição correspondente a resíduo 11 da SEQ ID NO: 4, um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido glicina
(Gly) , e
(iv) na posição correspondente ao resíduo 12 da SEQ ID NO: 4, um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido asparagina (ASN).
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Em outras concretizações, os anticorpos anti-CD2 0 da invenção compreendem um domínio Vl que tenha pelo menos uma CDR selecionada a partir do grupo constituído de: (a) CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos apresentada na
SEQ ID NO: 8; (b) um CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, onde o CDR3 compreende um resíduo de glutamina (Gln) na posição correspondente ao resíduo 4 de SEQ ID NO: 8; e (c) um CDR3
compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, onde o CDR3 compreende a posição correspondente ao resíduo 4 da SEQ ID NO: 8 um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido glutamina (Gln) e (d) um CDR2 compreendendo a seqüência apresentada em SEQ ID NO: 9. Em algumas destas concretizações, os anticorpos anti-CD2 0 da invenção compreendem um domínio Vl contendo um CDR2 compreendendo a seqüência apresentada na SEQ ID NO: 9 e um CDR3 selecionados a partir do grupo constituído de:
(a) uma CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8; e
(b) um CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos
que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de
aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, onde o CDR3 compreende um resíduo de glutamina (Gln) na posição correspondente ao resíduo 4 da SEQ ID NO: 8.
Em outras concretizações, os anticorpos anti-CD2 0 da
invenção compreendem um domínio Vh tendo uma CDR otimizada selecionada a partir do grupo citado nos itens (a) a (p) supra; e um domínio Vl que tenha pelo menos uma CDR selecionada a partir do grupo constituído de:
(a) CDR3 compreendendo uma seqüência de
aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8;
(b) um CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:
8, onde o CDR3 compreende o resíduo de glutamina (Gln)
na posição correspondente ao resíduo 4 da SEQ ID NO: 8;
(c) um CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com
a seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:
8, onde o CDR3 compreende na posição correspondente ao resíduo 4 da SEQ ID NO: 8 um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido glutamina (Gln) e (d) um CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos enunciados na SEQ ID NO: 9. Em algumas destas concretizações, os anticorpos anti-CD2 0 da invenção compreendem um domínio VL tendo uma CDR2 compreendendo a seqüência apresentada na SEQ ID NO: 9
e um CDR3 selecionados a partir do grupo constituído de:
(a) uma CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8; e (b) um CDR3 compreendendo uma seqüência de
aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, onde o CDR3 compreende o resíduo de glutamina (Gln) na posição correspondente a do resíduo 4 SEQ ID NO: 8.
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Em outras concretizações, os anticorpos anti-CD2 0 da invenção compreendem um domínio Vh tendo uma CDR otimizada selecionada a partir do grupo recitado nos itens (a) a (p) supra; E um domínio Vl com a seqüência apresentada em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11.
Em algumas concretizações, os anticorpos anti-CD2 0 compreendendo pelo menos um dos CDRs otimizados da invenção são imunoglobulinas IgGl kappa. Nessas concretizações, a imunoglobulina IgGl kappa pode compreender uma região constante da imunoglobulina kappa humana dentro de uma cadeia pesada da imunoglobulina e uma região constante da imunoglobulina kappa humana dentro de uma cadeia leve da imunoglobulina. Em concretizações específicas, a imunoglobulina IgGl kappa compreende totalmente ou parcialmente regiões de leitura de humanos dentro do domínio variável da cadeia pesada e dentro do domínio variável da cadeia leve. Em outras concretizações, a imunoglobulina kappa IgGl compreende regiões de leitura de murinos dentro do domínio variável da cadeia pesada e dentro do domínio variável da cadeia leve.
Em mais concretizações da invenção, os anticorpos anti-CD2 0 da invenção compreendem um domínio Vh tendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por SEQ ID NOS: 12-18 e/ou um domínio Vl tendo uma seqüência de aminoácidos selecionados a partir de SEQ ID NOS: 10 e 11, ou aminoácidos com, pelo menos, cerca de 80%, 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência apresentada na SEQ ID NOS: 10- 18 .
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Ainda em outras concretizações da invenção, os anticorpos anti-CD2 0 da invenção compreende um domínio Vh, onde o domínio Vh é seleccionada a partir do grupo constituído por:
(a) um domínio Vh compreendendo uma seqüência de
aminoácidos que tenha pelo menos 90% de identidade de seqüência para uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por SEQ ID NOS: 12-18;
(b) um domínio Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a
seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 12, onde o domínio Vh compreende, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO: 12, e
(ii) o resíduo asparagina (Asn) na posição
correspondente ao resíduo 110 de SEQ ID NO: 12;
(c) um domínio Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13, onde o domínio Vh inclui, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i), o resíduo alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO: 13,
(ii) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO: 13, e
(iii) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 110 de SEQ ID NO: 13;
(d) um domínio Vh compreendendo uma seqüência de
aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14, onde o domínio Vh inclui, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de: (i) o resíduo alanina (Ala) na posição
correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO: 14,
(ii) a resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO: 14, e
(iii) a resíduo ácido aspártico (ASP) na posição correspondente ao resíduo 110 de SEQ ID NO: 14;
(e) um domínio Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15, onde o domínio Vh inclui, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) a resíduo fenilalanina (Phe) na posição correspondente ao resíduo 31 da SEQ ID NO: 15;
(ii) a resíduo alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO: 15;
(iii) a resíduo asparagina (Asn) na posição
correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO: 15, e
(iv) a resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 110 da SEQ ID NO: 15; (f) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16, onde o domínio VH inclui, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) o resíduo alanina (Ala) na posição correspondente a do resíduo 57 SEQ ID NO: 16,
(ii) o resíduo alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO: 16,
(iii) o resíduo asparagina (Asn) na posição
correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO: 16, e
(iv) a resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 110 da SEQ ID NO: 16;
(g) um domínio λ/Η compreendendo uma seqüência de
aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a
seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17, onde o domínio VH compreende, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) à resíduo leucina (Leu) na posição
correspondente ao resíduo 57 SEQ ID NO: 17,
(ii) a resíduo alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO: 17,
(iii) a resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO: 17, e
(iv) a resíduo asparagina (Asn) na posição
correspondente ao resíduo 110 de SEQ ID NO: 17;
(h) um domínio Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18, onde
o domínio Vh inclui, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i), o resíduo alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO: 18, (ii) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO: 18,
(iii) a resíduo glicina (Gly) na posição correspondente ao resíduo 109 da SEQ ID NO: 18, e
(iv) a resíduo asparagina (Asn) na posição
correspondente ao resíduo 110 da SEQ ID NO: 18; (i) um domínio Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 12, onde o domínio Vh compreende, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO: 12, um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido asparagina (ASN), e (ii) na posição correspondente ao resíduo 110 de
SEQ ID NO: 12, um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido asparagina (ASN); (j) um domínio Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13, onde o domínio Vh inclui, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO: 13, um resíduo que é uma substituição
conservada de alanina (Ala), onde o aminoácido
conservado não é glicina,
(ii) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO: 13, um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido asparagina (ASN), e
(iii) na posição correspondente ao resíduo 110 da
SEQ ID NO: 13, um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido asparagina (Asn); (k) um domínio Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14, onde o domínio Vh inclui, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO: 14, um resíduo que é uma substituição
conservada de alanina (Ala), onde o aminoácido conservado não é glicina,
(ii) na posição correspondente ao resíduo 107 de SEQ ID NO: 14, um resíduo que é uma substituição
conservada do aminoácido asparagina (ASN), e
(iii) na posição correspondente ao resíduo 110 de SEQ ID NO: 14, um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido ácido aspártico (Asp);
(1) um domínio Vh compreendendo uma seqüência de
aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15, onde o domínio Vh inclui, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) na posição correspondente a 31 do resíduo SEQ
ID NO: 15, um resíduo que é uma substituição
conservada do aminoácido fenilalanina (Phe),
(ii) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO: 15, um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido alanina (Ala), onde o
aminoácido conservado não é glicina,
(iii) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO: 15, um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido asparagina (ASN), e (iv) na posição correspondente ao resíduo 110 da SEQ ID NO:
15, um resíduo que é uma substituição conservada do
aminoácido asparagina (ASN); (m) um domínio Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16, onde o domínio Vh inclui, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) na posição correspondente a 57 do resíduo SEQ ID NO: 16, um resíduo que é uma substituição
conservada de alanina (Ala),
(ii) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO: 16, um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido alanina (Ala), onde o aminoácido conservado não é glicina,
(iii) na posição correspondente ao resíduo 107 da
SEQ ID NO: 16, um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido asparagina (ASN), e
(iv) na posição correspondente ao resíduo 110 da SEQ ID NO: 16, um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido asparagina (ASN);
(n) um domínio Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 8 5% identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17, onde o domínio VH compreende, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) na posição correspondente ao resíduo 57 da SEQ ID NO: 17, um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido leucina (Leu),
(ii) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO: 17, um resíduo que é uma substituição
conservada do aminoácido alanina (Ala), onde o aminoácido conservado não é glicina,
(iii) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO: 17, um resíduo que é uma substituição
conservada do aminoácido asparagina (ASN), e
(iv) na posição correspondente ao resíduo 110 da SEQ ID NO: 17, um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido asparagina (ASN), e (o) um domínio Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18, onde o domínio Vh inclui, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO: 18, um resíduo que é uma substituição conservada de alanina (Ala), onde o aminoácido conservado não é glicina,
(ii) na posição correspondente ao resíduo 107 da
SEQ ID NO: 18, um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido asparagina (ASN),
(iii) na posição correspondente ao resíduo 109 da SEQ ID NO: 18, um resíduo que é uma substituição
conservada do aminoácido glicina (Gly), e
(iv) na posição correspondente ao resíduo 110 da SEQ ID NO: 18, um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido asparagina (ASN).
Em algumas destas concretizações, os anticorpos anti-
CD2 0 da invenção compreendem um domínio Vh selecionados a partir do grupo recitado nos itens (a) a (o) supra, e compreende uma leve variável (Vl) domínio, onde o domínio é selecionado VL a partir do grupo constituído por:
(a) um domínio Vl compreendendo a seqüência
apresentada na SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11;
(b) um domínio VL compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 90% identidade de seqüência para a seqüência apresentada na SEQ ID NO: 10 ou
SEQ ID NO: 11;
(c) um domínio VL compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade de seqüência para a seqüência apresentada na SEQ ID NO: 10, onde o domínio VL compreende o CDR2 apresentada na SEQ ID NO : 9 ;
(d) um domínio VL compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade de seqüência para a seqüência apresentada na SEQ ID NO: 11, onde o domínio VL inclui pelo menos um dos seguintes:
(i) a CDR2 apresentada na SEQ ID NO: 9, e
(ii) o resíduo glutamina (Gln) na posição correspondente ao resíduo 91 da SEQ ID NO: 11; e
(e) um domínio Vl compreendendo uma seqüência de
aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade de seqüência para a seqüência apresentada na SEQ ID NO: 11, onde o domínio Vl inclui pelo menos um dos seguintes: (i) a CDR2 apresentada na SEQ ID NO: 9, e (ii) na posição correspondente ao resíduo 91 da
SEQ ID NO: 11, uma substituição conservada do aminoácido glutamina (Gln).
Em algumas destas concretizações, os anticorpos anti- CD2 0 da invenção compreendem um domínio Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 12 e um domínio Vl compreendendo seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 10. Em outras concretizações, os anticorpos anti-CD2 0 da invenção compreendem um domínio Vh compreendendo seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 13 e um domínio Vl que inclua a seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 10. Em algumas outras concretizações, os anticorpos anti-CD2 0 da invenção compreendem um domínio Vh compreendendo seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 14 e um domínio Vl compreendendo seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 10. Em outras concretizações, os anticorpos anti- CD2 0 da invenção compreendem um domínio VH compreendendo seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 15 e um Vl domínio compreendendo seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 10. Ainda noutras concretizações, os anticorpos anti-CD20 da invenção compreendem um domínio Vh compreendendo seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 16 e um domínio Vl que inclua a seqüência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 10. Em mais concretizações, os anticorpos anti-CD20 da invenção compreendem um domínio Vh compreendendo seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 17 e um domínio VL que inclua a seqüência aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 10. Em concretizações ainda mais, o anti-CD20 anticorpos da invenção compreendem um domínio Vh compreendendo seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 18 e um domínio Vl compreendendo seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 10. Em certas concretizações, os anticorpos anti-CD20 da invenção compreendem um domínio Vh compreendendo seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 12 e um domínio Vl compreendendo seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 11. Em outras concretizações, os anticorpos anti- CD2 0 da invenção compreendem um domínio Vh compreendendo seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 13 e um domínio VL que inclua o seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 11. Em algumas outras concretizações, os anticorpos anti-CD2 0 da invenção compreendem um domínio Vh compreendendo seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 14 e um domínio Vl que inclua a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11. Em outras concretizações, os anticorpos anti-CD20 da invenção compreendem um domínio Vh compreendendo seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 15 e um domínio Vl compreendendo seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 11. Ainda noutras concretizações, os anticorpos anti-CD2 0 da invenção compreendem um domínio Vh compreendendo a seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 16 e um domínio Vl compreendendo seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 11. Em mais concretizações, os anticorpos anti-CD2 0 da invenção compreendem um domínio Vh compreendendo a seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 17 e um domínio Vl que inclua a seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 11. Em concretizações ainda mais, os anticorpos anti- CD2 0 da invenção compreendem um domínio Vh compreendendo asequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 18 e um domínio Vl compreendendo seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 11.
Em outras concretizações ainda, os anticorpos anti- CD2 0 da invenção compreendem um domínio Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 90% identidade de seqüência a qualquer uma das seqüências apresentada em s em SEQ ID NOS :12-18. Em algumas destas concretizações, os anticorpos anti-CD2 0 da invenção compreende ainda um domínio Vl compreendendo seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11.
Em outras concretizações, os anticorpos anti-CD2 0 da invenção compreendem o domínio Vh apresentada em SEQ ID NO: 2 9 (designada H1286) ou um domínio Vh ter, pelo menos, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91% , cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou 100% identidade de seqüência para a o domínio Vh estabelecido na SEQ ID NO: 29 . Em alguns destas concretizações, estes anticorpos anti-CD20 também incluem um domínio Vl selecionado da SEQ ID NOS: 10 e 11 (respectivamente designadas L373 e L419). Ainda noutras concretizações, os anticorpos anti-CD20 da invenção compreendem um domínio Vh selecionados a partir do grupo constituído de: (a) o domínio Vh apresentada na SEQ ID NO: 29, e (b) um domínio Vh ter pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou 100% identidade de seqüência ao domínio Vh apresentada em SEQ ID NO: 29; e um domínio Vl que tenha pelo menos uma CDR selecionados a partir do grupo constituído de:
(a) CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos apresentada em s no SEQ ID NO: 8;
(b) um CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com
a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:
8, onde o CDR3 compreende o resíduo de glutamina (Gln) na posição correspondente ao resíduo 4 da SEQ ID NO: 8; e
(c) um CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com
a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, onde o CDR3 compreende a posição correspondente ao resíduo 4 da SEQ ID NO: 8 um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido glutamina (Gln). Esses anticorpos anti-CD20 pode opcionalmente incluir
uma CDR2 compreendendo a seqüência apresentada na SEQ ID NO: 9.
Em outras concretizações, os anticorpos anti-CD2 0 da invenção compreendem um domínio Vh selecionados a partir do grupo constituído de:
(a) o domínio Vh apresentada em SEQ ID NO: 29, e
(b) um domínio Vh ter pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou 100% identidade de seqüência ao domínio Vh apresentada em s na SEQ ID NO: 29; E um domínio VL que tenha pelo menos uma CDR selecionados a partir do grupo constituído de:
(a) CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8;
(b) um CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de
aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, onde o CDR3 compreende o resíduo de glutamina (Gln) na posição correspondente ao resíduo 4 da SEQ ID NO: 8;
(c) um CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de
aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, onde o CDR3 compreende a posição correspondente ao resíduo 4 da SEQ ID NO: 8 um resíduo que é uma substituição conservada do aminoácido glutamina (Gln) e
(d) CDR2 compreendendo uma seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 9.
Em algumas destas concretizações, os anticorpos anti- CD2 0 da invenção compreendem um domínio VH selecionado a partir do grupo constituído de: (a) o domínio VH estabelecido em SEQ ID NO: 29, e
(b) um domínio VH ter pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou 100 % identidade na seqüência para o domínio VH apresentada na SEQ ID NO: 29; e um domínio leve variável (Vl) , onde o domínio Vl é selecionado a partir do grupo constituído de: (a) um domínio Vl compreendendo a seqüência apresentada em SEQ ID NO: 10 OU SEQ ID NO: 11; (b) um domínio VL compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 90% de identidade de seqüência para a seqüência apresentada na SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11;
(c) Um domínio VL que inclui uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade de seqüência para a seqüência apresentada na SEQ ID NO: 10, onde o domínio VL compreende o CDR2 estabelecido no SEQ ID NO: 9;
(d) um domínio VL compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade de
seqüência para a seqüência apresentada na SEQ ID NO: 11, onde o domínio VL inclui pelo menos um dos seguintes:
(i) a CDR2 apresentada na SEQ ID NO: 9, e
(ii) o resíduo de glutamina (Gln) na posição correspondente ao resíduo 91 da SEQ ID NO: 11; e
(e) um domínio VL compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade de seqüência para a seqüência apresentada na SEQ ID NO: 11, onde o domínio VL inclui pelo menos um dos seguintes:
(i) a CDR2 apresentada na SEQ ID NO: 9, e
(ii) na posição correspondente ao resíduo 91 do SEQ ID NO: 11, uma substituição conservada de aminoácido glutamina (Gln).
As seqüências dos anticorpos anti-CD2 0 são conhecidas
na técnica. Ver, por exemplo, as Patentes US η a 5736137; 5776456; 5843439; 5500362; 5677180; 5693493; 5721108; 5736137; 6120767; 5843685; 5576184; 6399061; e, Patente US Application Publication No. 2004/0167319, de todos que estão aqui incorporados por referência. É reconhecido que as modificações aqui descritas podem ser feitas a qualquer um dos anticorpos anti-CD2 0 conhecidos na técnica ou combinações dos mesmos. Assim anticorpos anti-CD2 0 murinos, anticorpos anti-CD20 quimérico, humanizados e anticorpos anti-CD2 0 compreendendo pelo menos um dos CDRs otimizados descritos neste documento são contemplados pela presente invenção. Anticorpos anti-CD2 0 manipulados com estas modificações e combinações podem ser testados para o reforço da atividade em ensaios conhecidos na técnica e descrito a seguir. Métodos de medição da especificidade de ligação do anticorpo anti-CD2 0 incluem, mas não estão limitados a, ensaios padrão de competição de ligação, ensaios de monitoração da secreção de imunoglobulina por células B, ensaios de proliferação das células B, ensaios de proliferação das células B tipo Banchereau, ensaios de células T helper para produção de anticorpos, ensaios de co-estimulação das células B proliferação, ensaios de aumento dos marcadores de ativação de células B. Ver, por exemplo, tais ensaios divulgados em WO 00/75348 e Patente US No. 6087329. Para CDC, ADCC, apoptose e ensaios, ver, por exemplo, Subbramanian et al. (2002) J. Clin. Microbiol. 40:2141-2146; Ahman et al. (1994) J. Immunol. Methods 36:243-254; Brezicka et al. (2000) Câncer Immunol. Immunother. 49:235-242; Gazzano-Santoro et al. (1997) J. Immunol. Methods 202:163-171; Prang et al. (2005) British J. Câncer 92:342-349; Shan et al. (1998) Blood 92:3756- 3771; Ghetie et al. (2001) Blood 97:1392-1398, e Mathas et al. (2000) Câncer Research 60:7170-7176, todos os quais são aqui incorporados por referência.
Anticorpos anti-CD2 0 específicos da invenção incluem um domínio Vh tendo uma seqüência de aminoácido selecionada a partir de uma seqüência de SEQ ID NOS :12-18 ou variantes, pareado com um domínio Vl tendo uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 ou 11 ou variantes destes, em qualquer combinação. Anticorpos anti-CD2 0 da invenção incluem anticorpos compreendendo um domínio Vh com uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo constituído pelas SEQ ID NOS :12-18 e um domínio VL tendo uma seqüência de aminoácidos seleccionada da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11.
Variantes biologicamente ativos adequados dos anticorpos anti-CD2 0 podem ser usados nos métodos da presente invenção. Esses variantes manterão propriedades ligadoras desejadas do anticorpo anti-CD20 original. Métodos para fazer anticorpos variantes são geralmente disponíveis na técnica.
Por exemplo, a seqüência de aminoácidos de variantes de um anticorpo anti-CD20, uma região de anticorpo, por exemplo, os CDRs (NOS SEQ ID :1-8), ou um domínio de um anticorpo variável de cadeia leve ou pesada, por exemplo, o conjunto de domínio VH apresentado em qualquer um dos SEQ ID NOS :12-18 ou a VL domínio apresentada em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11, descrito aqui, pode ser preparado por mutações no DNA clonado que codifica para seqüência de aminoácidos de interesse. Métodos de alteração de seqüência nucleotídica e mutagênese são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Walker e Gaastra, eds. (1983) Técnicas de Biologia Molecular (MacMillan Publishing Company, Nova Iorque); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 82:488- 492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol. 154:367-382; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Labocamundongory Manual (Cold Spring Harbor, Nova Iorque); US Patent No. 4873192, e as referências aí citadas; aqui incorporadas por referência. Orientação quanto à substituição adequada de aminoácido que não afeta a atividade biológica do polipeptídeo de interesse pode ser encontrada no modelo de Dayhoff et al. (1978) no Atlas of Protein Sequence e Estrutura (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC), pp. 345-352, aqui incorporadas por referência na sua totalidade. 0 modelo de Dayhoff et al. utiliza a matriz de semelhança de aminoácido (matriz PAM 250) da Mutação Pontual Aceita(PAM) para determinar a substituição adequada conservadas de aminoácidos. Substituições conservadas, como a troca de um aminoácido com outro de propriedades semelhantes, pode ser preferível. Exemplos de substituições conservadas de aminoácidos como ensinado pelo PAM 250 matriz do modelo de Dayhoff et al. , incluem, mas não estão limitados a Gly<=>Ala, Val^=>Ile<=>Leu, Asp<=>Glu, Lys<=>Arg, Asn<=>Gln, e Phe<=>Trp<=>Tyr.
Nas concretizações de variantes do anticorpo polipeptideo anti-CD20 de interesse, as modificações são feitas tais quais os variantes continuem a possuir as propriedades desejadas, ou seja, sendo capazes de ligação específica para um antígeno CD2 0 humano expresso na superfície de uma célula humana, e de ter melhorado função, especificamente aumento da atividade CDC e/ou aumento da afinidade de ligação para o antígeno CD2 0, conforme descrito a seguir. Obviamente, quaisquer mutações no DNA codificaante do polipeptideo variante não devem colocar a seqüência fora de forma de leitura e, de preferência não irá criar regiões complementares que poderiam produzir estrutura secundária de mRNA. Ver EP Patent Application Publication No. 75.444.
Ademais, a região constante de um anticorpo anti-CD2 0 pode ser mutada para alterar funções efetoras de várias maneiras. Por exemplo, ver US Patent No. 6737056B1 e US Patent Application Publication No. 2004/0132101A1, que divulgará mutações no Fc que otimizam ligação de anticorpo para receptores Fc. Preferivelmente, as variantes de um anticorpo anti- CD2 0 de referência têm aminoácidos que têm pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 88%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, ou cerca de 95% de identidade de seqüência de aminoácidos para a molécula de anticorpo anti-CD2 0 de referência ou a uma menor porção da molécula de anticorpo de referência. Mais de preferível, as moléculas compartilham, pelo menos, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, ou cerca de 99% de identidade de seqüência. Quando discutido aqui, se qualquer polipeptídeo específico, incluindo os CDRs, domínios VH e Domínios VL divulgado aqui, é pelo menos cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou mesmo de cerca de 100% idêntico a outro polipeptídeo que possa ser determinado por meio de métodos e programas de computador/software conhecido na técnica, tais como, mas não se limitando a, o programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Análise Package, Version 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Ciência Drive, Madison, WI 53711) . BESTFIT utiliza o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489, para encontrar o melhor segmento de homologia entre as duas seqüências. Ao utilizar BESTFIT ou qualquer outro programa de alinhamento de seqüências para determinar se uma determinada seqüência, por exemplo, é 95% idêntica a uma seqüência de referência, de acordo com a presente invenção, os parâmetros são definidos, naturalmente, de tal forma que o percentual de identidade é calculado ao longo todo o comprimento da seqüência de referência dos polipeptídeos e que as lacunas na homologia de até 5% do número total de aminoácidos na seqüência referência são permitidos. Para efeitos da presente invenção, percentual de identidade de seqüência é determinada através do algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman usando uma pesquisa fina de lacunas com uma definição de lacuna aberta de 12 e uma definição de extensão de lacuna de 2, matriz BLOSUM de 62. A Smith-Waterman homologia pesquisa algoritmo é ensinado nas Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489. Um variante, por exemplo, podem diferir de referência pelo anticorpo anti-CD2 0 no mínimo 1-15 resíduos de aminoácido, no mínimo 1-10 resíduos aminoácido, tais como 6-10, no mínimo 5, no mínimo 4, 3, 2, ou mesmo 1 aminoácido resíduo.
No que diz respeito ao alinhamento ótimo de duas seqüências de aminoácidos, os segmentos contíguos da seqüência variante de aminoacido pode ter resíduos adicionais de aminoácidos ou resíduos suprimidos de aminoácidos no que diz respeito à seqüência de aminoácidos de referência. 0 segmento contíguo utilizado para comparação com a seqüência de referência de aminoácidos irá incluir, pelo menos, 2 0 resíduos contíguos de aminoácidos, e pode ser 30, 40, 50 ou mais resíduos de aminoácidos. Correções de identidade de seqüência associada com substituições conservadas de aminoácidos ou desvios podem ser feitos (ver algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman).
Quando quaisquer duas seqüências de polipeptídeos são otimamente alinhadas para comparação, é reconhecido que os resíduos que aparecem opostos um ao outro dentro do alinhamento ocupam posições dentro dos respectivos polipeptídeos que correspondem um ao outro. Estas posições são mencionados neste documento como "posições correspondentes" e os resíduos residentes em posições 10
correspondentes são referidos como "resíduos
correspondentes" ou resíduos que "correspondem" a outro. Assim, por exemplo, quando um polipeptídeo de interesse é ideal para um alinhamento de seqüências de polipeptídeos tendo, por exemplo, 10 resíduos, os resíduos dentro do polipeptídeo de interesse aparece oposto ao resíduo 5 da seqüência de referência é referido como o "resíduo na posição correspondente ao resíduo 5" da seqüência de referência.
A exata estrutura química de um polipeptídeo capaz de ligar especificamente CD2 0 e manter o desejado aumento da atividade CDC e/ou aumento da afinidade de ligação para o antígeno CD2 0 depende de vários fatores. Como grupos ionizáveis amino e carboxila estão presentes na molécula, um polipeptídeo específico pode ser obtido como um ácido ou sal, ou de forma neutra. Todas essas preparações que mantêm a sua atividade biológica, quando colocados em condições ambientais adequadas são incluídas na definição de anticorpos anti-CD20 como utilizado neste documento. Além disso, a principal seqüência de aminoácido do polipeptídeo pode ser aumentada por derivação utilizando moléculas de açúcar (glicosilação) ou por outras moléculas complementares, tais como lipídios, fosfato, grupos acetila e similares. Também pode ser aumentada por conjugação com sacarídeos. Certos aspectos desses complementos são conseguidos através de estudos de processamento pos- traducional dos sistemas de produção; outras modificações podem ser introduzidas in vitro. De qualquer forma, essas modificações são incluídas na definição de um anticorpo anti-CD2 0 aqui utilizadas, desde que as propriedades desejadas do anticorpo anti-CD20 não são destruídas. Espera-se que tais modificações possam afetar quantitativa ou qualitativamente a atividade, quer através do reforço ou diminuição da atividade da polipeptideos, nos vários ensaios. Além disso, cada resíduo aminoácido na cadeia pode ser modificado por oxidação, redução, ou outras derivações, e o polipeptídeo pode ser clivado para obter fragmentos que mantenham a atividade. Tais alterações, que não destroem as propriedades desejadas (ou seja, especificidade de ligação para CD2 0, e aumento da atividade CDC e/ou aumento da afinidade de ligação para o antígeno CD2 0) não removem a seqüência de polipeptideo da definição de anticorpos anti- CD20 de interesse, tal como é utilizado aqui.
A técnica proporciona substancial orientação em matéria de preparação e utilização de polipeptideos variantes. Ao preparar o anticorpo anti-CD20 variante, alguém hábil na técnica pode facilmente determinar quais modificações na seqüência nativa de nucleotídeos ou de aminoácidos irá resultar em um variante que é adequado para uso como um componente de um componente terapeuticamente ativo de uma composição farmacêutica utilizada nos métodos da presente invenção.
Em certos anticorpos anti-CD2 0, a porção Fc pode ser mutada para diminuir funções efetoras utilizando técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, a eliminação ou inativacao (através de mutações pontuais ou por outros meios), de uma região de domínio constante poderá reduzir a ligação do receptor Fc modificada dos anticorpos circulantes, aumentando assim a localização tumoral. Em outros casos pode ser que as modificações da região constante consistentes com a invenção iminente invenção moderam ligação ao complemento e, portanto, reduz a meia vida no soro e associação inespecífica de um conjugado de citotoxina. Ainda outras modificações da região constante podem ser utilizadas para modificar ligações disulfeto ou oligossacarídeos que permitem a localização aumentada devido ao aumento da especificidade de antígeno ou flexibilidade do anticorpo. O perfil resultante fisiológico, biodisponibilidade e outros efeitos das alterações bioquímicas, tais como a localização do tumor, biodistribuição e meia-vida no soro, podem ser facilmente medidos e quantificados utilizando técnicas bem conhecidas sem experimentação imunológica.
Anticorpos anti-CD2 0 da invenção também incluem os
derivados que sejam modificados, por exemplo, pela fixação covalente de qualquer tipo de molécula do anticorpo tais que a ligação covalente não impede o anticorpo específico da ligação ao seu epítopo cognato. Por exemplo, mas não por meio de limitação, os anticorpos antifosfolipídeos incluem derivados que tenham sido modificados, por exemplo, glicosilação, acetilação, pegylation, fosforilação, amidação, derivação por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, a ligação a um ligante celular ou outras proteínas, etc. Qualquer das inúmeras modificações químicas podem ser realizadas por conhecidas técnicas, incluindo, mas não limitados a determinados produtos químicos clivagem, acetilação, formilação, sínteses metabólicas de tunicamicina, etc. Adicionalmente, os derivados podem conter um ou mais aminoácidos não clássicos.
A "substituição conservada de aminoácidos" é uma em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral de carga semelhante. Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais com cargas semelhantes foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramifiçados (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
Alternativamente, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de todo ou parte da seqüência codante, como por saturação de mutagênese, e os mutantes resultantes podem ser rastreados por a atividade biológica para identificar mutantes que mantêm atividade (por exemplo, a possibilidade de ligar um polipeptídeos anti- CD2 0).
Por exemplo, é possível introduzir mutações somente na posição CDR apenas em regiões ou regiões de um anticorpo molécula. Introduzido mutações pode ser mutações sem sentido silenciosas ou neutras, ou seja, não têm, ou pouco, efeito sobre a capacidade de ligar o anticorpo ao antígeno. Esses tipos de mutações podem ser úteis para otimizar códon-usage (combinação do código genético), ou melhorar a produção de anticorpos do hibridoma. Alternativamente, mutações sem sentido não neutras podem alterar a capacidade de um anticorpo ligar antígeno. A localização das mutações sem sentido mais silenciosas e neutras é provável que seja dentro das regiões estruturantes, enquanto que a localização das mutações sem sentido não neutras é provável que seja no CDR, embora este não seja um requisito absoluto. Alguém hábil na técnica seria capaz de conceber e testar moléculas mutantes com propriedades desejadas, como nenhuma alteração na atividade ligadora de antígeno ou alteração na atividade ligadora (por exemplo, melhorias na atividade ligadora de antígeno ou mudança da especificidade dos anticorpos). Após mutagênese, as proteínas codificadas podem rotineiramente ser expressas e as características funcionais e/ou atividade biológica da proteína codificada (por exemplo, a capacidade de ligar imunoespecificamente, pelo menos, um epítopo de um polipeptídeo CD2 0) pode ser determinada através de técnicas descritas aqui ou por rotina modificando técnicas conhecidas na técnica.
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IV. POLINUCLEOTÍDEO CODIFICANTE PARA ANTICORPOS ANTI-CD20
A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico codificando os anticorpos anti-CD2 0 da invenção, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou seus derivados.
Em uma concretização, a presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente de, ou consistindo de um ácido nucleico codificando uma imunoglobulina de cadeia pesada do domínio variável (domínio Vh) , onde pelo menos um dos CDRs do Vh domínio tem uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou seja, idêntica a qualquer um dos SEQ ID NOS :1-7 .
Em outras concretizações, a presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente de, ou consistindo de um ácido nucleico codificando um domínio Vh de imunoglobulina, onde pelo menos um dos CDRs do domínio Vh é seleccionado a partir do grupo constituído por: (a) CDRl compreendendo uma seqüência de aminoácidos apresentada em na SEQ ID NO: 7,
(b) um CDRl compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de
aminoácidos apresentada em na SEQ ID: 7, onde o CDRl compreende o resíduo fenilalanina (Phe) na posição correspondente ao resíduo 7 da SEQ ID NO: 7;
(c) CDR2 compreendendo uma seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6;
(d) um CDR2 compreendendo uma seqüência de aminoácidos
que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID: 5 ou SEQ ID NO: 6, onde o CDR2 compreende a alanina (Ala) ou resíduo de leucina (Leu) na posição correspondente a 8 de resíduo SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, respectivamente,
(e) CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 4;
(f) uma CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 8 5% de identidade com a
seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1, quando a CDR3 inclui, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo consistindo em:
(i) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 9 da SEQ ID NO: 1, e
(ii) o resíduo a asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 12 da SEQ ID NO: 1;
(g) um CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de
aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, quando a CDR3 inclui pelo menos um resíduo selecionado a partir do grupo constituído por:
(i) o resíduo alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 5 da SEQ ID NO: 2, (ii) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 9 da SEQ ID NO: 2, e
(iii) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 12 da SEQ ID NO: 2;
(h) um CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos
que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3, que compreende a CDR3 pelo menos um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) o resíduo alanina (Ala) na posição correspondente
ao resíduo 5 da SEQ ID NO: 3,
(ii) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 9 da SEQ ID NO: 3, e
(iii) o resíduo ácido aspártico (Asp) na posição
correspondente ao resíduo 12 da SEQ ID NO: 3; e
(i) uma CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade de seqüência a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4, onde a CDR3 inclui pelo menos um resíduo selecionado
a partir do grupo constituído de:
(i) o resíduo alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 5 da SEQ ID NO: 4,
(ii) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 9 da SEQ ID NO: 4,
(iii) o resíduo glicina (Gly) na posição
correspondente ao resíduo 11 da SEQ ID NO: 4, e
(iv) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 12 da SEQ ID NO: 4, em que um anticorpo anti-CD20 compreendendo as codificados VH domínio
especificamente ou Preferivelmente liga de CD20.
Em algumas concretizações, a presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo essencialmente de, ou consistindo de um ácido nucleico codificando um domínio VH da imunoglobulina, onde pelo menos um dos CDRs do domínio VH é seleccionada a partir do grupo constituído por:
(a) um CDRl compreendendo a seqüência apresentada na SEQ ID NO: 7,
(b) um CDR2 compreendendo a seqüência apresentada na SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, e
(c) um CDR3 compreendendo a seqüência apresentada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, OU seja, SEQ ID
NO: 4. Em concretizações específicas, o polinucleotídeo isolado codificando um domínio VH da imunoglobulina inclui pelo menos uma das seqüências de codificação CDR- selecionados a partir do grupo constituído por SEQ ID NO: 24 (codificação otimizada CDR3 de SEQ ID NO: 1), SEQ ID NO: 25 (codificação otimizada de CDR3 SEQ ID NO: 2), SEQ ID NO: 26 (codificação otimizada de CDR3 SEQ ID NO: 3), e SEQ ID NO: 27 (codificação otimizada CDR2 de SEQ ID NO: 5).
Numa nova concretização, a presente invenção inclui um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente de, ou consistindo de um ácido nucleico codificando um domínio VH que tenha uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou 100% idêntica a uma seqüência polipeptídeos domínio VH referência selecionada a partir do grupo composto de SEQ ID NOS :12-18 e 29, em que um anticorpo anti-CD20 compreendendo os domínio VH codificados especificamente ou Preferivelmente liga ao CD2 0 .
Ainda em outras concretizações, a presente invenção inclui um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente de, ou consistindo de um ácido nucleico que codifica para um domínio VH selecionado a partir do grupo constituído de:
(a) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 9 0 % de identidade de
seqüência de uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por SEQ ID NOS :12-18 e 29,
(b) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a
seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 12, onde o domínio VH compreende, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO: 12, e
(ii) o resíduo asparagina (Asn) na posição
correspondente ao resíduo 110 de SEQ ID NO: 12;
(c) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13, onde
o domínio VH inclui, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) o resíduo alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO: 13,
(ii) o resíduo asparagina (ASN) na posição
correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO: 13, e
(iii) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 110 da SEQ ID NO: 13;
(d) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a
seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14, onde o domínio VH compreende, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) o resíduo alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 103 de SEQ ID NO: 14, (ii) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO: 14, e
(iii) o resíduo ácido aspártico (Asp) na posição correspondente ao resíduo 110 da SEQ ID NO: 14;
(e) um domínio VH compreendendo uma seqüência de
aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15, onde o domínio VH inclui, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo consistindo em: (i) o resíduo fenilalanina (Phe) na posição
correspondente ao resíduo 31 da SEQ ID NO: 15;
(ii) o resíduo alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO: 15;
(iii) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO: 15, e
(iv) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 110 da SEQ ID NO: 15;
(f) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 8 5% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16, onde o domínio VH compreende, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) o resíduo alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 57 da SEQ ID NO: 16, (ii) o resíduo alanina (Ala) na posição correspondente
ao resíduo 103 da SEQ ID NO: 16,
(iii) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO: 16, e
(iv) a resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 110 da SEQ ID NO: 16; (g) um
domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17, onde o domínio VH compreende, pelo menos, um resíduo selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) o resíduo leucina (Leu) na posição correspondente ao resíduo 57 da SEQ ID NO: 17, (ii) o resíduo alanina (Ala) na posição correspondente
ao resíduo 103 da SEQ ID NO: 17,
(iii) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO: 17, e
(iv) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 110 da SEQ ID NO: 17; e
(h) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência aminoácido da seqüência apresentada na SEQ ID NO: 18, onde o domínio VH compreende, pelo menos, um resíduo
selecionado a partir do grupo constituído de:
(i) o resíduo alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO: 18,
(ii) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO: 18, (iii) o resíduo glicina (Gly) na posição
correspondente ao resíduo 109 da SEQ ID NO: 18, e (iv) o resíduo asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 110 de SEQ ID NO: 18.
Numa outra concretização, a presente invenção inclui
um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente de, ou consistindo de um ácido nucleico que codifica para um domínio VH, onde o ácido nucleico tem uma seqüência que tenha pelo menos cerca de 8 0%, cerca de 85%, cerca de 90 %, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou 100% de identidade de seqüência para uma seqüência nucleotídica selecionados a partir do grupo composto de SEQ ID NOS :19-22 e em que um anticorpo anti-CD20 compreendendo a domínio VH codificado especificamente ou Preferivelmente liga ao anti-CD20.
Em outras concretizações, a presente invenção inclui um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente de, ou consistindo de um ácido nucleico codificando uma cadeia leve do domínio variável (domínio VL) da imunoglobulina, onde o domínio VL compreende um CDR com uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou 100% idênticos aos apresentada na CDR seqüência SEQ ID NO: 8.
Em mais concretizações, a presente invenção inclui um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente de, ou consistindo de um ácido nucleico que codifica para um domínio VL de uma cadeia leve de imunoglobulina, onde o domínio VL inclui pelo menos um CDR selecionado a partir do grupo constituído de: (a) CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos
apresentada na SEQ ID NO: 8;
(b) um CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, onde a CDR3
compreende o resíduo de glutamina (Gln) na posição correspondente ao resíduo 4 da SEQ ID NO: 8 e
(c) um CDR2 tendo uma seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9. Em algumas destas concretizações, a presente invenção inclui um
polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente de, ou consistindo de um ácido nucleico que codifica para um domínio VL de uma cadeia leve de imunoglobulina, onde o domínio VL compreende um CDR2 com 84/190
seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9 e um CDR3 selecionados a partir do grupo constituído de:
(a) CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8; e
(b) um CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade de seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8, onde o CDR3 compreende o resíduo de glutamina (Gln) na posição correspondente ao resíduo 4 da SEQ ID NO: 8.
No entanto outra concretização, a presente invenção inclui um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente de, ou consistindo de um ácido nucleico codificando um domínio VL que tenha uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90% , cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou 100% idêntica a uma seqüência polipeptídeos do domínio VL referência apresentada na SEQ ID NO: 11, em que um anticorpo anti-CD20 compreendendo domínio VL codificados se liga especificamente ou Preferivelmente ao CD20.
Em outras concretizações ainda, a presente invenção inclui um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente de, ou consistindo de um ácido nucleico que codifica para um domínio VL selecionado a partir do grupo constituído de:
(a) um domínio VL compreendendo a seqüência apresentada na SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11; (b) um domínio VL compreendendo uma seqüência de
aminoácidos que tenha pelo menos 9 0% de identidade de seqüência para a seqüência apresentada na SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11; (c) um domínio VL compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade de seqüência para a seqüência apresentada na SEQ ID NO: 10, onde o domínio VL compreende o CDR2 apresentado na SEQ ID
NO: 9, e
(d) um domínio VL compreendendo um seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade de seqüência para a seqüência apresentada na SEQ ID NO: 11, onde o domínio VL inclui pelo menos um dos seguintes:
(i) a CDR2 apresentada na SEQ ID NO: 9, e
(ii) o resíduo glutamina (Gln) na posição correspondente ao resíduo 91 da SEQ ID NO: 11.
Qualquer um dos polinucleotídeo descritos acima podem ainda incluir outros ácidos nucléicos, codificando, por exemplo, um peptídeo sinal para secreção direta dos polipeptídeos codificados, regiões constante de anticorpos como descrito aqui, ou outros heterólogos polipeptídeos como descrito a seguir. Também, como descrito em mais detalhe a seguir noutras regiões, a presente invenção inclui composições compreendendo os polinucleotídeo compreendendo uma ou mais dos polinucleotídeos acima descritos. Em uma concretização, a invenção inclui composições compreendendo um primeiro e segundo polinucleotídeo onde o primeiro polinucleotídeo codifica um domínio VH, tal como descrito aqui e onde o segundo polinucleotídeo codifica um domínio VL como descrito a seguir. Especificamente, uma composição que compreende, que consiste essencialmente de, ou consiste de um polinucleotídeo codificador do domínio VH, conforme previsto em qualquer um das SEQ ID NOS :19-22, e um polinucleotídeo codificador domínio VL, por exemplo, um polinucleotídeo codificador do VL domínio, tal como estabelecido na SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11. A presente invenção também inclui fragmentos dos polinucleotídeos da invenção, tal como descrito noutras regiões. Além disso, polinucleotídeo que codificam polipeptídeos de fusão, fragmentos Fab, e outros derivados, como aqui descrito, são também contempladas pela invenção.
Os polinucleotídeos podem ser produzidos ou fabricados por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, se a seqüência nucleotídica do anticorpo é conhecida, um polinucleotídeo codificando o anticorpo pode ser montado a partir de síntese química de oligonucleótidos (por exemplo, conforme descrito na Kutmeier et al. (1994) BioTechniques 17:242), que, resumidamente, envolve o síntese de oligonucleotídeos sobreposição contendo porções da seqüência da codificação dos anticorpos, anelamento e ligação desses oligonucleotídeos e, em seguida, amplificação do oligonucleótidos ligados por PCR.
Alternativamente, um polinucleotídeo de codificação de um anticorpo anti-CD2 0, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, podem ser gerados a partir de ácido nucleico de uma fonte apropriada. Se um clone contendo um ácido nucleico codificando um anticorpo específico não está disponível, mas a seqüência da molécula do anticorpo é conhecida, um ácido nucleico codificando o anticorpo pode ser obtido a partir de síntese química ou uma fonte apropriada (por exemplo, um anticorpo cDNA biblioteca, ou cDNA gerada a partir de uma biblioteca, ou ácido nucléico, de preferência RNA poli A+, isoladas de qualquer tecido ou células expressando o anticorpo anti- CD2 0 ou outro anticorpo, como células hibridomas selecionadas para expressar um anticorpo) por PCR utilizando oligonucleotídeos sintéticos hibridizaveis as extremidades 3 ' e 5' da seqüência ou por clonagem oligonucleótido usando uma sonda específica para o gene específico seqüência para identificar, por exemplo, um clone de cDNA uma biblioteca cDNA que codifica o anticorpo anti-CD2 0 ou outro anticorpo. Os ácidos nucléicos amplificados gerados por PCR podem então ser replicados em vetores de clonagem utilizando qualquer método conhecido na técnica.
Uma vez que a seqüência nucleotídica e seqüência de aminoácidos correspondente ao anticorpo anti-CD2 0, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles é determinado, a sua seqüência nucleotídica pode ser manipulada usando métodos bem conhecidos na técnica para a manipulação de seqüências nucleotídicas, por exemplo, técnicas de DNA recombinante, sítio direcionado mutagênese, PCR, etc (ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al. (1990) Molecular Cloning, A Labocamundongory Manual (2 3 ed.; Cold Spring Harbor Labocamundongory, Cold Spring Harbor , NY) e Ausubel et al. , eds. (1998) Actual protocolos de Biologia Molecular (John Wiley & Sons, Nova Iorque), que estão ambas aqui incorporadas por referência por inteiro), para produzir anticorpos com uma seqüência de aminoácidos diferentes, por exemplo, para criar substituições de aminoácido, supressões e/ou inserções.
O polinucleotídeo de codificação de um anticorpo anti- CD2 0, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, pode ser composto de qualquer poliribonucleotideo ou polideoxribonucleotideo, que pode ser RNA ou DNA inalterado ou RNA ou DNA modificado. Por exemplo, um polinucleotídeo codificação anticorpo anti- CD2 0, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles pode ser composto de um único e fita dupla
30 do DNA, o DNA, que é uma mistura de regiões mono-e dupla fitas, simples e fita dupla RNA, RNA e que se mistura de regiões fita mono-e dupla, moléculas híbrida de DNA e RNA que podem ser filamento simples ou, mais geralmente, fita dupla o u uma mistura de regiões de fitas mono-e dupla. Além disso, um polinucleotídeo de codificação de um anticorpo anti-CD20, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles pode ser composto de regiões tripla fita compreendendo RNA ou DNA ou ambos RNA e DNA. O polinucleotídeo de codificação um anticorpo anti-CD2 0, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, também podem conter uma ou mais bases modificadas ou DNA ou RNA backbones modificados para a estabilidade ou por outras razões. Bases "Modificadas" incluem, por exemplo, bases tritiladas e bases incomuns, como a inosina. Uma variedade de alterações pode ser feita para DNA e RNA, assim, "polinucleotídeo" abraça quimicamente,
enzimaticamente, ou formas modificadas biologicamente.
Um polinucleotídeo isolado de codificação de variante não-naturais de um polipeptídeo derivado de uma imunoglobulina (por exemplo, uma porção da cadeia pesada da imunoglobulina ou porção cadeia leve) pode ser criado através da introdução de uma ou mais substituições nucleotídica, acréscimos ou supressões na seqüência nucleotídica da imunoglobulina tal que uma ou mais substituições de aminoácidos, acréscimos ou supressões são introduzidas na proteína codificada. As mutações podem ser introduzidas por técnicas convencionais, como a mutagênese sítio-dirigida e mutagênese mediada por PCR. Preferivelmente, substituições conservadas de aminoácidos são feitas em um ou mais resíduos de aminoácidos não- essenciais. V. FUSÃO DE PROTEÍNAS E ANTICORPOS CONJUGADOS
Como discutido mais em detalhe noutros pontos aqui, os anticorpos anti-CD2 0 da invenção, ou fragmentos ligadores de antigeno, variantes, ou seus derivados, podem ainda ser recombinantemente fusionados a um polipeptídeo heterólogo no N-ou C-terminal ou quimicamente conjugados (incluindo conjugações covalentes e não covalentes) para polipeptídeos ou outras composições. Por exemplo, anticorpos anti-CD20 podem ser fusionados ou recombinantemente conjugados com moléculas úteis como marcadores na detecção ensaios e moléculas efetoras tais como polipeptídeos heterólogos, drogas, radionuclídeos, ou toxinas. Ver, por exemplo, publicações PCT WO 92/08495, WO 91/14438, WO 89/12624; US Patent No. 5314995, e PE 396.387.
Anticorpos anti-CD2 0 da invenção, ou fragmentos ligadores de antigeno, variantes, ou seus derivados, incluindo derivados que sejam modificados, ou seja, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo tais que a ligação covalente não impede o anticorpo ligar CD20. Por exemplo, mas não por meio de limitação, os anticorpos antifosfolipídeos incluem derivados que tenham sido modificados, por exemplo, glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivação conhecido por grupos de proteção/bloqueio, clivagem proteolítica, a ligação a um ligante celular ou outras proteínas, etc. Qualquer das inúmeras modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitados a determinada clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólicas de tunicamicina, etc. Além disso, os derivados podem conter uma ou mais aminoácidos não-clássicos. Anticorpos anti-CD20 da invenção, ou fragmentos ligadores de antigeno, variantes, ou seus derivados, podem ser compostos de aminoácidos ligados mutuamente por ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas, ou seja, peptídeo isosteres, podendo conter aminoácidos diferente de 20 aminoácidos codificados pelos genes. Anticorpos anti-CD20 podem ser modificados por processos naturais, tais como transformação pos-transducional, ou por técnicas de modificação química que são bem conhecidas na técnica. Tais alterações são bem descritas em textos fundamentais e em mais detalhadas monografias, bem como em uma volumosa literatura de científica. As alterações podem ocorrer em qualquer lugar do anticorpo anti-CD2 0, incluindo o peptídeo backbone, os aminoácidos das cadeias laterais e do terminal amino ou carboxila, ou em moléculas, tais como carboidratos. Será apreciado que o mesmo tipo de alteração pode estar presente no mesmo ou em diferentes graus em diversos sítios em um determinado anticorpo anti-CD20. Além disso, um dado anticorpo anti-CD2 0 pode conter vários tipos de modificações. Anticorpos anti-CD20 podem ser ramificados, por exemplo, como um resultado de ubiquitinação, e eles podem ser cíclicos, com ou sem ramificação. Anticorpos anti-CD2 0 cíclicos, ramificados e cíclicos ramificados podem resultar de processos pos- transdução naturais ou podem ser feitas por métodos sintéticos. As modificações incluem acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente de flavina de um agrupamento heme, ligação covalente de um nucleótido ou nucleotídeo derivado, ligação covalente de um lipídeos ou lipídios derivados, ligação covalente de
fosfotidilinositol, formação de cross-linking , ciclização, formação de pontes de disulfeto, demetilação, formação de ligações covalentes cruzadas, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora GPI, hidroxilação, iodination, metilação, miristoilação, oxidação, peguilação, transformação proteolítica, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfação, transferência de RNA mediada além de aminoácidos de proteínas, como arginilação, e ubiquitinação. (Ver, por exemplo, Proteínas - Estrutura Molecular e Propriedades, TE Creighton, WH Freeman and Company, NY; 2nd ed. (1993); Johnson, ed. (1983) Posttranslational Covalent Modificação de Proteínas (Academic Press, NY), pgs 1-12; Seifter et al. (1990) Meth. Enzymol. 182:626-646; Rattan et al. (1992) Ann. NY. Acad. 663:48-62) .
A presente invenção também fornece proteínas de fusão compreendendo um anticorpo anti-CD2 0, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, e um polipeptídeo heterólogo. 0 polipeptídeo heterólogo para o qual o anticorpo é fusionado pode ser útil para a função ou útil seja para monitorar células expressando os polipeptídeos alvo do anti-CD20. Em uma concretização, uma proteína de fusão da invenção compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácidos de qualquer um ou mais dos domínios VH de um anticorpo da invenção ou seqüência de aminoácidos de qualquer um ou mais dos domínios de VL um anticorpo da invenção ou fragmentos ou variantes, e uma seqüência heteróloga polipeptídeos. Em outra concretização, uma proteína de fusão para uso em diagnóstico e tratamento métodos aqui divulgadas compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácidos de qualquer um, dois, três dos CDRs do domínio VH de um anti anti-CD20, ou fragmentos, variantes, ou seus derivados, ou seqüência de aminoácidos de qualquer um, dois, três dos CDRs de domínio VL de um anticorpo anti- CD2 0, ou fragmentos, variantes, ou seus derivados, e uma heteróloga polipeptideos seqüência. Em uma concretização, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácidos de uma CDR3 do domínio VH de um anti-CD2 0-anticorpo específico da presente invenção, ou fragmento, derivado, ou variante, bem como uma seqüência de polipeptídeo heteróloga, que especificamente se liga à proteína de fusão, pelo menos, um epítopo de CD2 0. Em outra concretização, uma proteína de fusão compreende um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácidos, pelo menos, um domínio VH de um anticorpo anti-CD2 0 da invenção e da seqüência de aminoácidos, pelo menos, um domínio de VL um anticorpo anti-CD2 0 da invenção ou fragmentos, derivados ou variantes, e uma seqüência heteróloga polipeptideos. Preferivelmente, os domínios VH e VL da proteína de fusão correspondem a uma única fonte de anticorpos (ou scFv ou fragmento Fab), que liga especificamente, pelo menos, um epítopo de CD20. Em outra concretização, uma proteína de fusão para uso em diagnóstico e tratamento métodos aqui divulgadas compreende um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácidos de qualquer um, dois, três ou mais dos CDRs do domínio VH de um anticorpo anti-CD2 0 e as seqüências de aminoácidos de qualquer um, dois, três ou mais dos CDRs de domínio VL de um anticorpo anti-CD2 0, ou fragmentos ou variantes, e uma seqüência heteróloga polipeptideos. De preferência, dois, três, quatro, cinco, seis, ou mais do CDR (s) dos domínios VH ou VL corresponde a uma única fonte de anticorpos (ou scFv ou fragmento Fab) da invenção. Moléculas de ácido nucleico codificando estas proteínas de fusão são também abrangidos pela invenção.
Exemplos de proteínas de fusão relatados na literatura incluem fusões dos receptores de células T (Gascoigne et al. (1987) Proc. Natl.. Acad. USA. 84:2936-2940); CD4 (capão et al. (1989) Nature 337: 525-531; Traunecker et al. (1989) Nature 339:68-70; Zettmeissl et al. (1990) DNA Cell Biol. 9:347-353 USA.; e Byrn et al. (1990) Nature 344:667- 670 ), L-selectina (homing receptor) (Watson et al. (1990) J. Cell. Biol. 110:2221-2229; e Watson et al. (1991) Nature 349:164-167); CD44 (Aruffo et al . (1990) Cell 61:1303- 1313); CD28 e B7 (Linsley et al. (1991) J. Exp. Med. 173:721-730); CTLA-4 (Lisley et al. (1991) J. Exp . Med. 174:561-569); CD22 (Stamenkovic et al. (1991) Cell 66:1133- 1144); TNF receptor (ASHKENAZI et al. (1991) Proc. Natl.. Acad. USA. 88:10535 -- 10539; Lesslauer et al. (1991) Eur. J. Immunol. 27:2883-2886; e Peppel et al. (1991) J. Exp. Med. 174:1483-1489), e um receptor IgE (Ridgway e Gorman (1991) J. Cell. Biol. vol. 115, Abstract No. 1448).
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Tal como noutros pontos discutidos aqui, anticorpos anti-CD2 0 da invenção, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou seus derivados, podem ser fusionados a polipeptídeos heteróloga in vivo para aumentar a vida média do polipeptídeos ou para utilização em imunoensaios usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma concretização, PEG pode ser conjugado aos anticorpos anti- CD2 0 da invenção para aumentar a sua meia-vida in vivo. Ver Leong et al. (2001) Cytokine 16:106; Adv. em Drug Deliv. Rev. (2002) 54:531; ou Weir et al. (2002) Biochem. Soe. Transações 30:512.
Além disso, os anticorpos anti-CD2 0 da invenção, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou seus derivados, podem ser fusionados a seqüências marcadoras, como um peptídeo para facilitar a sua purificação ou detecção. Em concretizações preferenciais, o marcador é uma seqüência de aminoácidos é um peptídeo hexa-histidina, tais como a etiqueta prevista no vetor pQE (Qiagen, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Califórnia, 91311), entre outros, muitos dos quais são comercialmente disponíveis. Conforme descrito no Gentz et ai. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 86:821-824, por exemplo, hexa-histidina permite conveniente purificação da proteína de fusão. Outros peptídeo-etiquetas úteis para a purificação incluem, mas não se limitando, a etiqueta "HA", o que corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina do influenza (Wilson et al. (1984) Cell 37:767) e da etiqueta "flag".
Proteínas de fusão podem ser preparadas usando métodos que são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo US Patente η 2 s 5116964 e 5225538) . O local exato em que a fusão é feita pode ser empiricamente selecionado para otimizar a secreção ou características de ligação da proteína de fusão. O DNA que codifica para proteína de fusão é, então, transfectado em uma célula hospedeira para a expressão.
Anticorpos anti-CD2 0 da presente invenção, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou seus derivados, podem ser utilizados na forma não conjugada ou podem ser conjugados com pelo menos uma de uma variedade de moléculas, por exemplo, para melhorar as propriedades terapêuticas da molécula, para facilitar a detecção alvo, ou a imagem ou a terapia do paciente. Anticorpos anti-CD2 0 da invenção, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou seus derivados, podem ser marcados ou conjugados, antes ou depois da purificação, quando a purificação é realizada.
Em particular, anticorpos anti-CD2 0 da invenção, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou seus derivados, podem ser conjugados com agentes terapêuticos, pró-drogas, peptídios, proteínas, enzimas, vírus, lipídios, modificadores de resposta biológica, agentes farmacêuticos, ou PEG.
Aqueles qualificados na técnica irão apreciar que conjugados também podem ser montados usando uma variedade de técnicas, dependendo do agente selecionado para ser conjugado. Por exemplo, conjugados com biotina são preparados, por exemplo, reagindo polipeptídeos de ligação com um éster de biotina ativado, como o és ter N- hidroxisuccinimida da biotina. Do mesmo modo, conjugados com um marcador fluorescente podem ser preparados na presença de um agente acoplador, por exemplo, aqueles listados aqui, ou por reação com um isotiocianato, preferivelmente, isotiocianato de fluoresceina. Conjugados dos anticorpos anti-CD2 0 da invenção, ou fragmentos ligadores de antigeno, variantes, ou seus derivados, são preparadas de maneira análoga.
A presente invenção engloba ainda anticorpos anti-CD2 0 da invenção, ou fragmentos ligadores de antigeno, variantes, ou seus derivados, conjugado com um agente de terapêutico ou de diagnóstico. Os anticorpos anti-CD20, incluindo fragmentos ligadores de antigeno, variantes, e seus derivados, podem ser utilizados diagnosticamente para, por exemplo, acompanhar o desenvolvimento ou progressão de uma doença como parte de um processo de ensaios clínicos, por exemplo, determinar a eficácia de um determinado tratamento e/ou prevenção esquema. A detecção pode ser facilitada pela ligação do anticorpo anti-CD20, ou fragmento ligador de antigeno, variante, ou derivados deles, a uma substância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos prosteticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, materiais radioativos, metais emitindo pósitron usando várias tomografias de emissão de pósitron, e ions metálicos paramagnéticos não-radioativos. Ver, por exemplo, Patente US No. 4741900 para ions metálicos que podem ser conjugados com anticorpos para utilização como diagnósticos de acordo com a presente invenção. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, β-galactosidase, ou
acetilcolinesterase; exemplos de complexos adequadas incluem streptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados inclui-se umbeliferone, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína dichlorotriazinilamina , dansil ou cloreto de ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e aequorina; e exemplos de materiais radioativos adequados incluem 125I, 131I, 111In, 90Y, ou 99Tc.
Um anticorpo anti-CD20, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, pode ser conjugado com uma parte activa terapia, como um citotoxina, um agente terapêutico ou um íon metálico radioativo. Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial para as células. Exemplos incluem selênio, Taxol, citocalasina B, D gramicidina, brometo de etídio, emético, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, diidróxi anthracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos. Agentes terapêuticos incluem, mas não estão limitados a, antialvobolites (p.ex., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-thioguanine, citarabina, 5-fluorouracil decarbazine), agentes alquilantes (por exemplo, mechlorethamine, thioepa clorambucil, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfana, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e diclorodiamina cis-platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, e antramicina (AMC)), e agentes anti-mitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina). Os conjugados da invenção podem ser usados para modificar uma dada resposta biológica. A droga agrupamento não deve ser interpretada como limitada a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a droga pode ser uma proteína ou polipeptídeo possuindo uma desejada atividade biológica. Essas proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina, como Abrina, rícino A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina difterica; uma proteína, como fator de necrose tumoral, interferon-alfa, beta-interferon, fator de crescimento do neuronios, fator de crescimento derivado das plaquetas, tecido plasminogênio ativador, ou modificadores resposta biológica, como por exemplo, linfocinas, interleucina-1 (IL-I), a interleucina- 2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), fator estimulador de colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), fator estimulador de colônia granulocítica (G-CSF), ou outros fatores de crescimento.
Um anticorpo anti-CD2 0, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, também pode ser detectavelmente marcados pela ligação de composto um quimioluminescente. A presença do anticorpo anti-CD2 0 quimioluminescente-marcador, em seguida, é determinada pela detecção da presença de luminescência que surge no decurso de uma reacção química. Exemplos particularmente úteis de marcação quimioluminescente de compostos são luminol, isoluminol, éster teromatic acridinium, imidazólicos, sal acridinium e éster de oxalato.
Uma das maneiras em que um anticorpo anti-CD2 0, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, pode ser detectávelmente marcado é pela ligação entre os mesmos a uma enzima e utilizando o produto de ligação em um ensaio imunoenzimático (EIA) (Võller , A., "O ensaio imunoenzimático (ELISA)" Microbiological Associates publicação trimestral, Walkersville, Md.; Diagnostic Horizons (1978) 2:1-7; Võller et al. (1978) J. Clin. Pathol. 31: 507-520; Butler (1981) Meth. Enzymol. 73:482- 52 3; Maggio, ed. (1980) ensaio imunoenzimático, CRC Press, Boca Camundongon, Flórida, Ishikawa et al., eds. (1981) ensaio imunoenzimático (Kgaku Shoin, Tóquio). A enzima, que é ligada ao anticorpo anti-CD20 irá reagir com um substrato adequado, de preferência um substrato cromogênico, de modo a produzir um agrupamento químico que pode ser detectado, por exemplo, por espectrofotometria , fluorimetria ou por meios visuais. Enzimas que podem ser utilizadas para identificar o anticorpo detectável incluem, mas não estão limitados a, malato desidrogenase, Stafilococcal nuclease, delta-5-esteróides isomerase, álcool desidrogenase de levedura, alfa-glicerofosfato, desidrogenase, triose fosfato isomerase, peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, asparaginase, glicose oxidase, beta- galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose-6- fosfato desidrogenase, glicoamilase e acetilcolinesterase. Além disso, a detecção pode ser realizada por métodos colorimétricos que empregam um substrato cromogênico para a enzima. A detecção também pode ser realizada por comparação visual da extensão da reação enzimática de um substrato, em comparação com padrões similarmente preparados. Detecção também pode ser realizada usando qualquer um de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, por marcação radioativa do anticorpo anti-CD2 0, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, é possível detectar os anticorpos através da utilização de um radioimunoensaio (RIA) (ver, por exemplo, Weintraub (mar, 1986) Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques (The Endocrine Society), que é incorporada por referência aqui). 0 isótopo radioativo pode ser detectado por meios incluindo, mas não limitados a, um contador gama, cintilador, ou autoradiografia.
Um anticorpo anti-CD2 0, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, também podem ser detectavelmente marcados com metais emissores de fluorescência como o 152Eu, ou outros da série lantinídeos. Estes metais podem ser anexados ao anticorpo utilizando esses grupos quelatantes metálicos como ácido dietilenetriaminopentacetico (DTPA) ou ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA).
Técnicas para conjugação de várias moléculas a um anticorpo anti-CD2 0, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, são bem conhecidas, ver, por exemplo, Arnon et al. (1985) "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Câncer Therapy," in Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-56; Hellstrõm et al. (1987) "Antibodies for Drug Delivery" , em Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2 â ed. ; Mareei Dekker, Inc.), pp. 623-53); Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Câncer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinicai 10
Applications, ed. Pinchera et al. , pp. 475-506; "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Câncer Therapy," em Monoclonal Antibodies for Câncer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al., Aeademie Press, pp. 303-16 (1985); e Thorpe et al. (1982) "The Preparation and Cytotoxie Properties of Antibody-Toxin Conjugates," Immunol. Rev. 62:119-58.
VI. EXPRESSÃO DE POLIPEPTÍDEOS DE ANTICORPOS
As seqüências de DNA que codificam as cadeias leves e os pesadas do anticorpo podem ser feitas, simultaneamente ou separadamente, por meio da transcriptase reversa e polimerase DNA em conformidade com métodos bem conhecidos. PCR pode ser iniciado por iniciadores da região constante ou por oligonucleotídeos iniciadores mais específicos baseados nas seqüências de DNA e aminoácidos das cadeias pesadas e leves publicadas. Como discutido acima, a PCR também pode ser utilizada para isolar clones de DNA que codificam as cadeias leves e pesadas do anticorpo. Neste caso, as bibliotecas podem ser rastreadas por iniciadores consenso ou sondas homólogas maiores, tais como o sondas da região constante de camundongo.
DNA, tipicamente de DNA plasmidial, pode ser isolado
das células através de técnicas conhecidas na técnica, mapeados por restrição e seqüenciados em conformidade com as normas, técnicas bem conhecidas apresentadas em detalhes, por exemplo, nas referências precedentes relativas às técnicas de DNA recombinante. Evidentemente, o DNA pode ser sintético, de acordo com a presente invenção, em qualquer ponto durante o processo de isolamento ou posterior análise. Após a manipulação do material genético isolado para fornecer anticorpos anti-CD2 0, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou seus derivados, da invenção, o polinucleotídeo de codificação dos anticorpos anti-CD20 são tipicamente inseridos em um vetor de expressão para a introdução em células hospedeiras que podem ser utilizados para produzir a quantidade desejada de anticorpo anti-CD20.
Expressão recombinante de um anticorpo ou fragmento, derivado ou análogo, por exemplo, uma cadeia leve ou pesada de um anticorpo que se liga a uma molécula-alvo descrita aqui, por exemplo, CD20, exige concretizações de um vetor de expressão contendo o polinucleotídeo que codifica o anticorpo. Quando uma molécula de polinucleotídeo codificando uma molécula de anticorpo ou de uma cadeia leve ou pesada de um anticorpo, ou parte dele (de preferência contendo o domínio variável da cadeia leve ou pesada), da invenção tenha sido obtida, o vetor para a produção da molécula do anticorpo a pode ser produzida por tecnologia de DNA recombinante utilizando técnicas bem conhecidas. Assim, os métodos de preparação de uma proteína, pela expressão de um polinucleotídeo contendo a seqüência nucleotídica de codificação de um anticorpo são aqui descritas. Os métodos que são bem conhecidos para aqueles qualificados na técnica podem ser utilizados para construir vetores de expressão contendo seqüências codificantes de anticorpos e sinais transcricional e traducional adequados. Esses métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas, técnicas de recombinação genética in vivo. A invenção, assim, prevê vetores replicáveis compreendendo uma seqüência nucleotídica que codifica uma molécula do anticorpo da invenção, ou uma cadeia leve ou pesada, ou um domínio variável da cadeia pesada ou leve, operacionalmente ligados a um promotor. Esses vetores podem incluir a seqüência nucleotídica de codificação de uma região constante da molécula do anticorpo (ver, por exemplo, PCT Publicação WO 86/05807; Publicação WO 89/01036, e Patente US No. 5122464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado em um vetor para expressão de toda a cadeia leve ou pesada.
0 termo "vetor" ou "vetor de expressão " é usado aqui no sentido de vetores utilizados em conformidade com a presente invenção como um veículo para a introdução, e expressão de um gene desejado em uma célula hospedeira. Como sabido pelos qualificados na técnica, tais vetores podem ser facilmente selecionados a partir do grupo constituído de plasmídeos, fagos, vírus e retrovírus. Em geral, compatíveis com a invenção os vetores compreenderão um marcador de selecção, sítios de restrição adequados para facilitar a clonagem do gene desejado e a capacidade de entrar e/ou replicar em células procarióticas ou eucarióticas.
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Para efeitos da presente invenção, inúmeros sistemas de vetor de expressão podem ser empregados. Por exemplo, uma classe de vetores de DNA que utiliza elementos que são derivados de animais, como vírus do papiloma bovino, vírus polioma, adenovírus, vírus vaccinia, baculovírus, retrovírus (RSV, MMTV ou MOMLV) ou vírus SV40. Outras envolvem o uso de sistemas com policistronico interno com sítios de ligação ao ribossoma Além disso, as células que tenha integrado o DNA em seus cromossomos podem ser selecionadas através da introdução de um ou mais marcadores que permitam a selecção das células hospedeiras transfectadas. 0 marcador pode prever prototrofico para um hospedeiro auxotrofico, resistência a biocida (por exemplo, antibióticos) ou resistência a metais pesados como o cobre. O gene marcador de seleção pode ser diretamente ligado à seqüências de DNA a ser expressa, ou introduzido na mesma célula por co-transformação. Outros elementos também podem ser necessários para a síntese otimizada de mRNA. Estes elementos podem incluir seqüências sinal, sinais de edição, bem como promotores transcricionais, intensificadores e sinais de terminação.
Em específicas concretizações preferenciais, os genes da região variável clonados são inseridos em um vetor de expressão, juntamente com os genes das regiões constantes das cadeias pesada e leve (Preferivelmente humano) sintetizada como discutido acima. Naturalmente, qualquer vetor de expressão que é capaz de obter expressão em células eucarióticas pode ser utilizado na presente invenção. Exemplos de vetores adequados incluem, mas não estão limitados aos plasmídios pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, ρVAXl, e pZeoSV2 (disponível a partir de Invitrogen, San Diego, CA) , e plásmido PCI (disponível a partir de Promega, Madison, WI) . Em geral, no rastreio de um grande número de células transformantes que expressam adequadamente níveis elevados das cadeias pesadas e leves da imunoglobulina é experimentação de rotina que pode ser levada a cabo, por exemplo, por sistemas robóticos.
Mais genericamente, uma vez que o vetor ou seqüência de DNA codificando uma subunidade monomérica do anticorpo anti-CD2 0 foi elaborado, o vetor de expressão pode ser introduzido em uma célula hospedeira apropriada. A introdução do plasmídio em células hospedeiras pode ser realizada por várias técnicas bem conhecidas para os de habilidade na técnica. Estes incluem, mas não estão limitados a, transfecção (incluindo electroporação), a fusão protoplástica, precipitação de fosfato, fusão de células com DNA envelopado, microinjeção, e infecção com vírus intacto. Ver, Ridgway (1988) "Mammalian Expression Vetors" em Vectors, ed. Rodriguez e Denhardt (Butterworths, Boston, Massachusetts), Capítulo 24.2, pp. 470-472. Normalmente, a introdução do plasmideo no hospedeiro é via eletroporação. As células hospedeiras abrigando a concretizações de expressão são cultivadas sob condições adequadas para a produção das cadeias leves e pesadas correntes, e analisadas a síntese protéica das cadeias pesada e/ou leve. Exemplos de técnicas de análise incluem ensaio enzimático de imnunoabsorção (ELISA),
radioimunoensaio (RIA), ou análise de sorter de célula ativada por fluorescência (FACS), imunohistoquímica e similares.
0 vetor de expressão é transferido para uma célula hospedeira por técnicas convencionais, e as células transfectadas são então cultivadas por técnicas convencionais, para produzir um anticorpo para o uso dos métodos descritos a seguir. Assim, a invenção inclui células hospedeiras contendo um polinucleotídeo de codificação de um anticorpo da invenção, ou uma cadeia leve ou pesada, operacionalmente ligados a um promotor heterólogo. Em concretizações preferidas, para a expressão dos anticorpos de cadeia dupla, vetores codificando ambas as cadeias pesadas e leves podem ser co-expressos na célula hospedeira para a expressão de toda a molécula de imunoglobulina, como detalhado abaixo.
Conforme utilizado aqui, "células hospedeiras" refere- se a células que abrigam vetores construídos com técnicas de DNA recombinante e codificando, pelo menos, um gene heterólogo. Na descrição dos processos para o isolamento de anticorpos hospedeiros recombinantes, os termos "célula" e "cultura celular" são utilizados indiferentemente para designar a fonte de anticorpos, a menos que seja claramente especificado em contrário. Em outras palavras, a recuperação do polipeptídeo das "células" pode significar tanto a partir de toda célula, ou a partir da cultura de células contendo tanto a meio de suspensão das células.
Uma variedade de sistemas de expressão hospedeiro- vetor pode ser utilizada para expressar as moléculas de anticorpos para a utilização dos métodos descritos a seguir. Tais sistemas de expressão-hospedeiro representam veículos, através da qual as seqüências de codificação de interesse podem ser produzidas e posteriormente purificadas, mas também representam as células que podem, quando transformada ou transfectadas com as seqüências nucleotídicas codificantes, expressar uma molécula do anticorpo da invenção in si tu. Estes incluem, mas não estão limitados a, microorganismos, como bactérias (por exemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas com DNA de bacteriofagos recombinante, DNA plasmídial ou DNA cosmidial vetores de expressão contendo as seqüências codificantes dos anticorpos; levedura (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada com vetores recombinantes de expressão em levedura contendo as seqüências codificantes dos anticorpos; sistemas de células de inseto infectadas com vetores de expressão virais recombinantes (por exemplo, baculovírus) contendo as seqüências codificantes dos anticorpos; sistemas de célula vegetal infectadas com vetores de expressão virais recombinantes (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; virus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformada com vetores de expressão plasmidiais recombinantes (por exemplo, plasmídio Ti) contendo seqüências codificantes dos anticorpos, ou sistemas celulares de mamíferos (por exemplo, COS, CHO, BLK, 293, 3T3 células) abrigando construções de expressão recombinante contendo promotores derivados do genoma células de mamíferos (por exemplo, promotor metalotionina) ou vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor tardio de adenovírus; o promotor 7.5K do vírus vaccinia). Preferivelmente, células bacterianas, como a Escherichia coli, e mais preferivelmente, células eucarióticas, especificamente para expressão de toda molécula dos anticorpos recombinantes, são utilizados para a expressão de uma molécula recombinante do anticorpo. Por exemplo, células de mamíferos, tais como células do ovário do hamster chinês (CHO), em conjugação com um vetor, como o principal elemento intermédio inicial do promotor do gene de citomegalovírus humano é um sistema de expressão eficaz de anticorpos (Foecking et al. (1986) Gene 45: 101; Cockett et al. (1990) Bio/Technology 8:2).
A linhagem de célula hospedeira utilizada para expressão de proteína é muitas vezes originária de mamíferos; aqueles qualificados na técnica são habilitados com a capacidade de determinar quais linhagens de células específicas são Preferivelmente mais adequadas para o produto gênico desejado a ser nelas expressas. Exemplos linhagens de célula hospedeira incluem, mas não estão limitados a, CHO (Chinese Hamster Ovary) , DG44 e DUXBll (Chinese Hamster Ovary linhagems, dhfr menos), HeLa (carcinoma cervical humano) , CVI (linhagem de rim de macaco) , COS (um derivado da CVI com antígeno SV40 Τ) , muito, BHK (baby hamster rim), MDCK, 293, WI38, R1610 (hamster chinês fibroblástico) BALBC/3T3 (camundongo fibroblástico) , HAK (linhagem de rim de hamster) , SP2/0 (mieloma de camundongo), P3x63-Ag3.653 (mieloma de camundongo), BFA-lclBPT (bovina células endoteliais), Raji (linfócitos humanos) e 293 (rim humano). Linhagens celulares hospedeiras estão normalmente disponíveis a partir de serviços comerciais, o American Tissue Culture Collection ou da literatura.
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Além disso, uma cepa de célula hospedeira pode ser escolhida daquelas que modulam a expressão das seqüências inseridas, ou modificam e processam os produtos gênicos de uma forma específica desejada. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem), dos produtos proteicos que podem ser importantes para a função da proteína. Diferentes células hospedeiras têm características e mecanismos específicos para o processamento pós-traducional e modificação de proteínas e dos produtos gênicos. Sistemas de linhagems celulares ou de sistemas hospedeiros adequados podem ser escolhidos de modo a garantir a correcta modificação e transformação das proteínas estrangeiras expressas. Para este efeito, células hospedeiras eucarioticas que possuem a maquinaria celular para o correto processamento dos transcritos primários, glicosilação e fosforilação do produto gênico podem ser utilizadas.
Para longo prazo, a produção de alto rendimento de proteínas recombinantes, expressão estável é preferível. Por exemplo, linhagens de células que expressam estavelmente a molécula do anticorpo podem ser construídas. Ao invés de usar vetores de expressão que contêm origens de replicação viral, células hospedeiras podem ser transformadas com DNA controlado por elementos de controle de expressão adequados (por exemplo, promotores, acentuadores, seqüências, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc), e um marcador selecionável. Após a introdução do DNA estrangeiro, as células 10
construídas podem ser permitidas crescer por 1-2 dias em um meio enriquecido e, em seguida, trocadas para um meio seletivo. 0 marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à selecção e permite que células que integraram estavelmente o plasmídeo em seus cromossomos cresçam de forma focos que, por sua vez podem ser clonados e expandidos em linhagems celulares. Este método pode ser vantajoso para linhagens celulares construídas que expressam estavelmente a molécula de anticorpo.
Uma série de sistemas de seleção pode ser utilizada, incluindo, mas não limitados a, os timidina quinase dos vírus herpes simplex (Wigler et al. (1977) Cell 11:223), fosforibosiltransferase de hipoxantina-guanina (Szybalska e Szybalski (1992) Proc. Natl. Acad. USA. 48:202), e fosforibosiltransferase adenina (Lowy et al. (1980) Cell 22:817) genes podem ser utilizadas em células tk-, hgprt- ouAPRT-, respectivamente. Além disso, resistência antimetabólica pode ser usada como a base da seleção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al. (1980) Natl.. Acad. USA. 77:357; O1Hare et al. ( 1981) Proc. Natl.. Acad. USA. 78:1527); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan e Berg (1981) Proc. Natl.. Acad. USA. 78:2072); neo, que confere resistência aminoglicosídicos ao G-418 Clinicai Pharmacy 12:488-505; Wu e Wu (1991) Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev (1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) Science 260:926-932; e Morgan e Anderson (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); TIB TECH 11 (5) :155-215 (May, 1993); e higro, que confere resistência ao higromicina (Santerre et al. (1984) Gene 30:147. Métodos vulgarmente conhecidos na tecnologia do DNA recombinante, que podem ser utilizados são descritos no Ausubel et al. (1993) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY); Kriegler (1990) " Gene Transfer and Expression " em Laboratory Manual (Stockton Press, NY); Dracopoli et al. (eds) (1994) Actual Prolocols in Human Geneties (John Wiley & Sons, NY) Capítulos 12 e 13; Colberre-Garapin et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1, que são incorporados por referência neste documento, em sua integralidade.
A expressão dos níveis de uma molécula de anticorpo pode ser aumentada pela amplificação do vetor (para uma revisão, ver Bebbington e Hentschel (1987) " The Use of Vetors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning " (Academic Press, NY) vol. 3. Quando um marcador em um sistema de vetor expressando anticorpo é amplificado, um aumento no nível de inibidor presente na cultura da célula hospedeira irá aumentar o número de cópias do gene marcador. Dado que a região está associada com gene do anticorpo, a produção dos anticorpos também aumentará (Crouse et al. (19 83) Mol. Cell. Biol. 3 :257) .
A produção in vitro permite programar até dar grandes quantidades de polipeptídeos desejados. AS técnicas de cultura de células de mamíferos sob condições de cultura de tecidos são conhecidas na técnica e incluem cultura de suspensão homogênea, por exemplo, um reator de transporte aéreo ou em um reator de agitação contínua, ou imobilizada ou cultura celular entrapped, por exemplo, de fibras ocas, microcápsulas, em microesferas de agarose ou cartuchos de cerâmica. Se necessário, e/ou desejado, as soluções de polipeptídeos podem ser purificadas pelos métodos usuais de cromatografia, por exemplo, filtração em gel, cromatografia de troca iônica, cromatografia sobre DEAE-celulose ou (imuno-) cromatografia afinidade, por exemplo, após preferencial biossíntese de um polipeptídeo da região da dobradiça sintética, ou antes, ou posteriores a cromatografia HIC.
Genes que codificam anticorpos anti-CD2 0, ou
fragmentos ligadores de antigeno, variantes, ou seus derivados da invenção também podem ser expressos por células não-mamíferos, como bactérias ou leveduras ou células vegetais. As bactérias que facilmente comportam ácidos nucléicos incluem membros do Enterobacteriaceae, como cepas de Escherichia coli e Salmonella; Bacillaceae, tais como Bacillus subtilis; pneumococo; Streptococcus e Haemophilus influenzae. Irá ainda ser apreciado que, quando expresso em bactérias, os polipeptídeos heterólogos normalmente tornam-se parte de corpos de inclusão. Os polipeptídeos heterólogos devem ser isolados, purificados e posteriormente montados em moléculas funcionais. Quando formas tetravalentes de anticorpos são desejadas, as subunidades se reuinirão em anticorpos tetravalentes (WO 02/096948A2).
Em sistemas bacterianos, um número de vetores de expressão pode ser vantajosamente selecionado em função da utilização pretendida para as moléculas anticorpos expressas. Por exemplo, quando uma grande quantidade deste tipo de proteína deve ser produzida, para a geração de composições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, vetores que direcionam a expressão a níveis elevados dos produtos da proteína de fusão que sejam facilmente purificados pode ser desejável. Esses vetores incluem, mas não estão limitados, o vetor de expressão em E. coli pUR278 (Ruther et al. (1983) EMBO J. 2:1791), no qual a seqüência de codificação do anticorpo pode ser ligada individualmente no vetor em fase com a região que codifica o IacZ, para que uma proteína de fusão seja produzida; plN vetores (Inouye e Inouye (1985) Nucleic Aeids Res. 13:3101-3109; Van Heeke e Sehuster (1989) J. Biol. Chem. 24:5503-5509); e similares. Vetores pGEX também podem ser usados para expressar polipeptídeos estrangeiros como proteínas de fusão com a glutationa S-transferase (GST). Em geral, essas proteínas de fusão são solúveis e podem facilmente ser purificada a partir de células lisadas por adsorção e ligação a uma matriz de esferas de glutationa-agarose seguido pela eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são concebidos para incluir a trombina ou sítios clivagem protease do fator Xa de modo que o gene clonado alvo produto pode ser liberada a partir do GST agrupamento.
Além de micróbios procariontes, eucariontes podem
também ser utilizados. A Saccharomyces cerevisiae, ou fermento comum, é o mais comumente utilizado entre os microrganismos eucariotos embora uma série de outras cepas esteja comumente disponível, por exemplo, Pichia pastoris.
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Para a expressão em Saccharomyces, o plasmídeo YRp7, por exemplo, (Stinchcomb et al. (197 9) Nature 282:39; Kingsman et al. (1979) Gene 7:141; Tschemper et al. (1980) Gene 10:157) é comumente utilizado. Este plasmídio já contém o gene TRPl, que prevê um marcador para a selecção de uma estirpe mutante da levedura faltando a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC na 44076 ou PEP4-1 (Jones (1977) Genética 85:12). A presença da lesão trpl como uma característica do genoma da célula hospedeira da levedura, oferece um meio eficaz para detectação da transformação do crescimento, na ausência de triptofano.
Em um sistema de insetos, vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) é normalmente usado como um vetor para expressar genes estranhos. 0 vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A seqüência de codificação do anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não-essenciais (por exemplo, o gene polyhedrin) do vírus e colocados sob controlo de um promotor AcNPV (por exemplo, o promotor polihedrina).
Quando uma molécula do anticorpo da invenção foi recombinantemente expressa, ela pode ser purificada por qualquer método conhecido na técnica para a purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, especificamente por afinidade para o antígeno específico após proteína A, e dimensionamento cromatográfica de coluna), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra norma técnica para a purificação de proteínas. Alternativamente, um método preferido para o aumento da afinidade de anticorpos da invenção é divulgado em Patente Aplication US Publication No. 2002 0123057 Al.
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VII. MÉTODOS DE TRATAMENTO USANDO ANTICORPOS TERAPÊUTICOS ANTI-CD20
Métodos da invenção são direcionados para a utilização de anticorpos anti-CD2 0, incluindo fragmentos ligadores de antígeno, variantes, e seus derivados, para o tratamento de pacientes com uma doença associada a células expressando CD2 0. Por "células expressando CD2 0" entende-se células B expressando antígeno CD2 0 normais e malignas. Métodos de detecção de expressão CD2 0 nas células são bem conhecidas na técnica e incluem, mas não estão limitados a, PCR, imunoistoquímica, citometria de fluxo, Western Blot, ELISA, e coisas do gênero. Por célula B "maligna" entende-se qualquer das células B neoplásicas, incluindo, mas não limitados a células B, incluindo derivados de Iinfornas de baixo, intermediário, e Iinfornas de células B de alto grau, linfomas imunoblástico não-Hodgkin's, doença de Hodgkin, linfomas induzidos por vírus Epstein-Barr (EBV) e linfomas relacionados a AIDS, bem como a leucemia linfoblástica aguda de células B, mielomas, leucemia linfocitica crônica, leucemia mielóide aguda, e coisas do gênero.
Embora a discussão seguinte refira-se aos meios de diagnóstico e tratamento de várias doenças e desordens com um anticorpo anti-CD20 da invenção, os métodos descritos neste documento são igualmente aplicáveis aos fragmentos ligadores de antígeno, variantes e derivados desses anticorpos anti-CD2 0 que manter as propriedades desejadas dos anticorpos anti-CD20 da invenção, ou seja, capaz de ligar especificamente CD20 e tendo aumentado atividade CDCe/ou aumento da afinidade de ligação para o antígeno CD2 0 .
"Tratamento" é aqui definido como a aplicação ou
administração de um anticorpo anti-CD20 a um paciente, ou a aplicação ou administração de um anticorpo anti-CD2 0 isolado para um tecido ou linhagem celular a partir de um paciente, quando o paciente tiver uma doença, um sintoma de uma doença, ou uma predisposição para uma doença, cujo objetivo é a cura, curar, aliviar, alterar, corrigir, melhorar, ou afetar a doença, os sintomas da doença, ou a predisposição para a doença. Por "tratamento" também se destina a aplicação ou administração de uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-CD2 0 a um paciente, ou a aplicação ou a administração de uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-CD2 0 isolado para um tecido ou linhagem celular a partir de um paciente, quem tem uma doença, um sintoma de uma doença, ou uma predisposição para uma doença, cujo objetivo é a cura, curar, aliviar, alterar, corrigir, melhorar, ou afetar a doença, os sintomas da doença, ou a predisposição para a doença.
Por "atividade anti-tumoral" entende-se uma redução na taxa de proliferação e acumulação de células malignas expressando CD2 0 e, portanto, um declínio na taxa de crescimento de um tumor já existente ou em um tumor que surge durante o tratamento, e/ou destruição das células neoplásicas existentes (tumor) ou células neoplásicas recém-formadas e, consequentemente, uma diminuição do tamanho total de um tumor durante o tratamento. Por "atividade anti-inflamatória" entende-se a redução ou prevenção da inflamação. A terapia com pelo menos um anticorpo anti-CD2 0 provoca uma resposta fisiológica que é benéfica no que diz respeito ao tratamento de estados patológicos associados com células expressando CD20 nos seres humano.
Desta forma, os métodos da invenção encontram uso no tratamento dos Iinfornas não-Hodgkin relacionado à anormal, proliferação ou de acumulação incontrolável das células B. Para efeitos da presente invenção, tais Iinfornas serão referidos, de acordo com o sistema de classificação Working Formulation, ou seja, aqueles classificados como linfomas de células B classificados como de baixo grau, grau intermediário e alto grau (ver "The Non-Hodgkin's Lymphoma Pathologic Classification Project " em Câncer 49:2112-2135 (1982)) . Assim, linfomas de células B de baixo grau incluem pequenos Iinfocítos, de pequenas células foliculares clivadas, e misto de pequenas folicular clivadas e linfomas de grandes células; linfomas de grau intermediário incluem grandes células foliculares, células pequenas clivadas difusas, misto células pequenas e grandes difusas, e linfomas de células grandes difusas, e de alto grau incluem Iinfornas de células grandes imunoblástica, Iinfoblásticas, e linfomas de pequenas células não-clivadas de Burkitt e do tipo não Burkitt.
É reconhecido que os métodos da invenção são úteis no tratamento terapêutico de linfomas de células B que são classificados de acordo com o Sistema Europeu e Americano de Classificação de Linfoma (REAL) revisado. Esses linfomas de células B incluem, mas não estão limitados a, classificadas como linfomas de células precursoras B neoplasias, tais como leucemia/linfoma lifoblastico B; neoplasias de células B periféricas, incluindo leucemia linfocítica crônica das células B/linfoma linfocitico pequeno, Iinfoma/imunocitoma Iinfoplasmacitoide, linfoma de célula de manto (MCL), linfoma de centro folicular (folicular) (incluindo pequenas células difusas, misto de células pequenas e grandes difusas, e linfoma difuso de grandes células), a linfoma de zona marginal das células B (incluindo tipos extranodais, nodais, e esplênica), leucemia hairy cell, plasmacitoma/mieloma, linfoma difuso de grandes células B de célula do subtipo primário médiastinal (tímico), linfoma de Burkitt e linfoma de células B de alto grau do tipo Burkitt; leucemia aguda, leucemia Iinfóide aguda, leucemia mielóide; leucemias mielociticas agudas; leucemia promielocítica; leucemia mielomonocítica; leucemia monocítica; eritroleucemia; leucemia granulocítica (leucemia mielocitica crônica), leucemia linfocítica crônica; policitemia vera, mieloma múltiplo; macroglobulinemia de Waldenstrõm; doença da cadeia pesada; linfomas de células B de baixo grau ou alto grau não classificados. É reconhecido que os métodos da invenção podem ser úteis na prevenção do tumor de crescimento que surjam durante o tratamento. Os métodos da invenção são especificamente úteis no tratamento de indivíduos com linfomas de células B de baixo grau, especificamente aqueles indivíduos com recaídas após quimioterapia padrão. Linfomas de células B de baixo grau são mais indolentes do que os linfomas de células B intermediários e de alto grau e são caracterizadas por um curso reincidente/remitente. Assim, o tratamento desses linfomas é melhorado utilizando os métodos da invenção, como episódios de recaída são reduzidas em número e gravidade.
De acordo com os métodos da presente invenção, pelo menos um anticorpo anti-CD2 0, tal como definido aqui é utilizado para promover uma resposta terapêutica positiva com relação a células B malignas humanas. Em "resposta terapêutica positiva" no que diz respeito ao tratamento do câncer é destinado a melhoria da doença, em associação com a atividade anti-tumoral destes anticorpos ou fragmentos, e/ou uma melhoria nos sintomas associados com a doença. Isto é, um efeito anti-proliferativa, a prevenção de novos tumores de crescimento, uma redução no tamanho do tumor, uma redução no número de células cancerosas, e/ou uma diminuição em um ou mais sintomas associados com a doença pode ser observada. Assim, por exemplo, uma melhoria da doença pode ser caracterizada como uma resposta completa. Em "resposta completa" é pretendido a ausência de doença clinicamente detectável com normalização de quaisquer previamente estudos radiográficos anormais, medula óssea, e no líquido cefalorraquidiano (LCR). Essa resposta deve persistir durante, pelo menos, um mês após o tratamento de acordo com os métodos da invenção. Alternativamente, uma melhoria da doença pode ser categorizada como sendo uma resposta parcial. Em "resposta parcial" destina-se, pelo menos, cerca de 50% uma diminuição em todas as cargas mensuráveis de tumor (ou seja, o número de células tumorais presentes no sujeito), na ausência de novas lesões e persistentes durante pelo menos um mês. Essa resposta é aplicável apenas aos tumores mensuráveis.
A resposta tumoral pode ser avaliada pelas alterações na morfologia do tumor (isto é, em geral carga tumoral, tamanho do tumor, e similares) usando técnicas como a análise de scan de ressonância magnética (MRI), imagem de raio x, scan por tomografia computadorizada (TC), imagem por bioluminescencia, por exemplo, imagens por luciferase, imagens densitometria óssea, incluindo amostragem do tumor por biópsia e aspiração da medula óssea (BMA) . Para além destas terapias respostas positivas, o individuo submetido à terapia com o anticorpo anti-CD2 0 pode experimentar os efeitos benéficos de uma melhoria nos sintomas associados com a doença. Assim, para tumores das células Β, o sujeito pode experimentar uma queda nos chamados sintomas B, ou seja, suores noturnos, febre, perda de peso, e/ou urticária.
Os anticorpos anti-CD2 0 aqui descritos também podem encontrar uso no tratamento de doenças inflamatórias e deficiências ou desordens do sistema imunitário que são associados com células expressando CD-2 0, incluindo, mas não limitados a, lúpus eritematoso sistêmico, psoríase, esclerodermia, síndrome CREST, miosítio inflamatória, síndrome de Sjõgren, doença mista do tecido conjuntivo, artrite reumatóide, esclerose múltipla, doença inflamatória do intestino, síndrome de angústia respiratória aguda, inflamação pulmonar, fibrose pulmonar idiopática, a osteoporose, tipo hipersensibilidade retardada, asma, cirrose biliar primária, e púrpura trombocitopênica idiopática.
Doenças inflamatórias são caracterizadas pela inflamação e destruição tecidual, ou uma combinação dos mesmos. "Doença inflamatória" inclui qualquer processo inflamatório imuno-mediado em que o evento inicial ou alvo da resposta imune não envolve um auto-antígeno(s), incluindo, por exemplo, aloantigenos, xenoantigenos, antígenos virais, antígenos bacterianos, antígenos desconhecidos, ou alérgenos.
Além disso, para efeitos da presente invenção, o termo "doença inflamatória (s)" inclui a "doença autoimune (s)". Conforme utilizado aqui, o termo "auto" é geralmente entendido por englobar processos inflamatórios imune- mediados envolvendo "auto" antígenos. Em doenças autoimunes, auto-antígeno(s) do hospedeiro desencadea respostas imunes.
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Também, a presente invenção inclui tratamento da inflamação associada à rejeição dos tecidos transplantados, "rejeição de transplante" ou "rejeição" refere-se a qualquer resposta imune montada pelo hospedeiro contra o enxerto, incluindo mas não limitados a antígenos HLA, antígenos de grupos sangüíneos, e coisas do gênero.
A invenção também pode ser usada para tratar a doença enxerto versus hospedeiro, tais como a associada a transplante de medula óssea, por exemplo. Nessa doença enxerto versus hospedeiro, medula óssea do doador de contém linfócitos e células, que maturam em linfócitos. Linfócitos do doador reconhecem os antígenos do destinatário como não- próprio e montam uma resposta imune inflamatória. Deste modo, tal como utilizados aqui,"doença enxerto versus hospedeiro" ou "reação do hospedeiro versus enxerto refere-se a qualquer resposta imune de células T mediada em que linfócitos do doador reagem a antígenos do hospedeiro.
O anti-CD20 aqui descrito pode ser utilizado em conformidade com os métodos da invenção para tratar a autoimunes e/ou doenças inflamatórias, incluindo, mas não se limitando a, lúpus eritematoso sistêmico (LES), lúpus discóide, nefrite lúpica, sarcoidose, artrite inflamatória, incluindo a artrite juvenil, artrite reumatóide, artrite psoriática, Síndrome de Reiter, espondilite anquilosante e artrite gotosa, a rejeição de órgãos ou tecidos transplantados, hiperacutose, aguda, crônica ou rejeição e/ou doença enxerto versus hospedeiro, esclerose múltipla, síndrome hiper IgE, poliarterite nodosa, cirrose biliar primária, doença inflamatória intestinal, doença de Crohn, a doença celíaca (enteropatia por sensibilidade ao glúten), hepatite autoimune, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoimune, psoríase, esclerodermia, miastenia gravis, púrpura trombocitopênica autoimune, tireoidite autoimune, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto, doença imune complexa, síndrome disfunção imune de fadiga crônica (CFIDS), polimiosítio e dermatomiosítio, crioglobulinemia, trombólise, cardiomiopatia, pênfigo vulgar, fibrose pulmonar intersticial, diabetes mellitus Tipo I e tipo II, hipersensibilidade retardada do tipo 1, 2, 3 e 4, alergias ou doenças alérgicas, respostas imunes
indesejados/involuntárias a proteínas terapias (ver, por exemplo, US Patent Application No. US 2002/0119151 e Koren, et al. (2002) Curr. Pharm . Biotechnol. 3:349-60), asma, síndrome de Churg-Strauss (granulomatose alérgica), dermatite atópica, dermatite alérgica e de contato irritativa, urtecaria, mediadas por IgE alergia, aterosclerose, vasculite idiopática miopatias
inflamatórias, doença hemolítica, a doença de Alzheimer, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, e coisas do gênero. Em algumas outras concretizações, os anticorpos anti-CD20 da invenção são úteis no tratamento da inflamação pulmonar, incluindo, mas não limitados a rejeição do enxerto pulmonar, asma, sarcoidose, enfisema, fibrose cística, fibrose pulmonar idiopática, bronquite crônica, rinite alérgica e doenças alérgicas de o pulmão, como a hipersensibilidade pneumonite, pneumonia eosinofilica, bronquiolite obliterante, devido à medula óssea e/ou de transplante pulmonar ou outras causas, enxerto aterosclerose/enxerto flebosclerosis, bem como a fibrose pulmonar resultante de colágeno, vasculares e doenças autoimunes, como artrite reumatóide e lúpus eritematoso.
De acordo com os métodos da presente invenção, pelo menos um anticorpo anti-CD2 0, tal como definidos noutras aqui é utilizado para promover uma resposta terapêutica positiva com relação ao tratamento ou prevenção de uma doença autoimune e/ou doença inflamatória. Em "resposta terapêutica positiva" no que diz respeito a uma doença autoimune e/ou doença inflamatória se destina a melhoria da doença, em associação com a atividade anti-inflamatória destes anticorpos, e/ou uma melhoria nos sintomas associados com a doença. Isto é, um efeito anti- proliferativo, a prevenção da proliferação das células expressando-CD2 0, uma redução da resposta inflamatória, incluindo, mas não limitados a redução da secreção de citocinas inflamatórias, moléculas aderência, proteases, imunoglobulinas (nos casos em que o CD2 0 tendo célula é uma célula Β) , combinações, e coisas do gênero, o aumento da produção de proteínas antiinflamatórias, uma redução no número de células autoreativas, um aumento de tolerância imunológica, inibição da auto-reatividade da célula de sobrevivência, e/ou uma diminuição na um ou mais sintomas mediados pela estimulação de células expressando CD2 0-podem ser observadas. Essas respostas terapias positivas não estão limitadas à via de administração e pode incluir a administração para o doador, o doador dos tecidos (como por exemplo, órgão perfusão), de acolhimento, qualquer combinação, e coisas do gênero.
A resposta clinica pode ser avaliada utilizando técnicas tais como a triagem de scan por ressonância magnética (MRI), imagem radiológica de raio x, scan por tomografia computadorizada (TC), citometria de fluxo ou análise por sortiador de células ativadas por fluorescencia (FACS), histologia, patologia bruta, e de sangue química, incluindo mas não limitados a mudanças detectáveis pelo ELISA, RIA, cromatografia, e coisas do gênero. Para além destas terapias respostas positivas, o indivíduo submetido à terapia com o anticorpo anti-CD2 0 ou fragmento ligador de antígeno pode experimentar o seu efeito benéfico de uma melhoria nos sintomas associados com a doença.
Por "dose ou quantidade terapeuticamente efetiva" ou " quantidade eficaz " entende-se uma quantidade de anti-CD2 0 que quando administrado traz uma resposta terapêutica positiva no que diz respeito ao tratamento de um paciente com uma doença associada a células expressando CD2 0. Em alguns concretizações da invenção, uma dose terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD2 0 está no intervalo de cerca de 0,01 mg/kg para cerca de 40 mg/kg, provenientes de cerca de 0,01 mg/kg para cerca de 3 0 mg/kg, a partir de cerca de 0,1 mg/kg para cerca de 3 0 mg/kg, provenientes de cerca de 1 mg/kg para cerca de 3 0 mg/kg, provenientes de cerca de 3 mg/kg para cerca de 3 0 mg/kg, provenientes de cerca de 3 mg/kg para cerca de 25 mg/kg, a partir de cerca de 3 mg/kg para cerca de 2 0 mg/kg, provenientes de cerca de 5 mg/kg para cerca de 15 mg/kg, ou seja de cerca de 7 mg/kg para cerca de 12 mg/kg. É reconhecido que o método de tratamento pode incluir uma única administração de uma dose terapeuticamente eficaz ou múltiplas administrações de uma terapia eficaz de dose do anticorpo anti-CD20.
Os anticorpos anti-CD2 0 podem ser utilizados em combinação com quimioterápicos conhecidos e citocinas para o tratamento de estados patológicos compreendendo células expressando CD2 0. Por exemplo, os anticorpos anti-CD2 0 da invenção podem ser usados em combinação com citocinas, como interleucina-2. Em outras concretizações, os anticorpos anti-CD2 0 da invenção pode ser usada em combinação com rituximab (IDEC-C2B8; Rituxan®; IDEC Pharmaceuticals Corporation, San Diego, Califórnia).
Desta forma, os anticorpos anti-CD20 descritos neste documento são administrados em associação com pelo menos uma outra terapia, incluindo mas não limitados a, cirurgia ou procedimentos cirúrgicos (por exemplo, esplenectomia, hepatectomia, linfadenectomia, leucoforesis, transplante de medula óssea, e as similares); radioterapia, quimioterapia, opcionalmente, em combinação com transplante autólogo de medula óssea, quando adequado agentes quimioterápicos incluem, mas não estão limitados a, fludarabina ou fosfato de fludarabina, clorambucil, vincristina, pentostatina, 2- clorodeoxiadenosina (cladribina), ciclofosfamida,
doxorrubicina , prednisona, e suas combinações, por exemplo, contendo antraciclina regimes como o PAC (ciclofosfamida, doxorrubicina, mais prednisona), CHOP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona mais
doxorrubicina), DVA (vincritsina, doxorrubicina, mais dexaalvosona), MP (melfalano plus prednisona), e outros citotóxicos e/ou agentes terapêuticos utilizados na quimioterapia, como mitoxantrona, daunorrubicina,
idarubicin, asparaginase e antialvobolites, incluindo mas não limitados a, citarabina, metotrexato, 5-fluorouracil decarbazine, 6-thioguanine, 6-mercaptopurina, e nelarabine; outra terapia de anticorpo monoclonal (por exemplo, alemtuzumab (Campath®) ou outros anti-CD52 anticorpos CD52 segmentação da célula-superficie glicoproteica sobre células B malignas; rituximab (Rituxan®), o anticorpo totalmente humano Humax-CD20, 1-1594, imu-106, TRU-015, AME-13 3, tositumomab/I-131 tositumomab (Bexxar®) ,
ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), ou qualquer outra terapia com anticorpos anti-CD20 visando o antígeno CD20 em células B malignas; anticorpo anti-CDl9 (por exemplo, MT103, um anticorpo biespecífico); anticorpo anti-CD22 (por exemplo, o anticorpo monoclonal humanizado epratuzumab); bevacizumab (Avastin®) ou outros anti-cancerosos anticorpos para o fator de crescimento endotelial vascular humano; anticorpo anti-CD22 para o antígeno CD22 em células B malignas (por exemplo, o anticorpo monoclonal BL-22, uma toxina alphaCD22); anticorpo α-Μ-CSF para o fator estimulador de colônia macrofágica; anticorpos para o fator ativador do receptor do nuclear-kappaB (RANK) e seu ligante (RANKL), que são superexpressados no mieloma múltiplo; anticorpo anti-CD23 para o antígeno CD23 em células B malignas (por exemplo, IDEC-152); anticorpo anti-CD80 para o antígeno CD80 (por exemplo , IDEC-114); anticorpo anti-CD38 o antígeno CD3 8 em células B malignas; anticorpos para receptores do complexo maior de histocompatibilidade classe II (anticorpos anti-MHC), expressos em células B malignas; anticorpos anti-CD40 (por exemplo, SGN-40) direcionado ao antígeno CD40 em células B malignas e anticorpos para o fator de necrose tumoral-relacionados apoptose induzidos ligante do receptor 1 (Trail-Rl) (por exemplo, o anticorpo monoclonal humano agonístico hgs-ETRl) e R2-Trail expressa sobre um número de tumores sólidos e tumores de origem hematopoéticas); terapia baseada em pequenas moléculas, incluindo mas não limitados a, microtubulo e/ou inibidores da topoisomerase (por exemplo, o inibidor mitótica dolastatina e análogos de dolastatina; a-tubulina aglomerante T900607; XL119 e inibidor da topoisomerase aminocamptotecina), SDX-105 (bendamustina hidrocloridro), ixabepilona (um análogo de epothilone, também designado por BMS-247550), inibidores da proteína quinase C, por exemplo, midostaurina ((PKC-412, CGP 41251, N
benzoilstaurosporina), pixantrone, eloxatina (um agente antineoplásico), ganite (nitrato de gálio), Thalomid® (talidomida), derivados imunomoduladores da talidomida (por exemplo, revlimid (anteriormente revimid)), Affinitak™ (inibidor antisense da proteína quinase C - alfa), SDX-101 (R-Etodolac, induzindo apoptose de Iinfócitos malignos), de segunda geração análogos nucleosídeos purínicos, tais como clofarabine, inibidores da produção das proteínas Bcl-2 de células cancerosas (por exemplo, os agentes antisense oblimersen e Genasense®) , inibidores de proteosoma (por exemplo, Velcade™ (bortezomib)), inibidores cinase de pequenas moléculas (por exemplo, Chir-258), inibidores pequenas moléculas VEGF (por exemplo, ZD-6474), inibidores de pequena molécula de proteínas de choque térmico (HSP) 90 (por exemplo, 17-AAG), inibidores de histona deacetylases (por exemplo, híbridos/polares citodiferentiação HPC), como agentes ácido suberanilohidroxamico (SAHA), e FR-901228) e agentes apoptóticos como Trisenox® (trióxido de arsênio) e Xcytrin® (motexafin gadolínio) ; terapias de câncer à base vacina/imunoterapia, incluindo mas não limitados a, vacina abordagens (por exemplo, Id-KLH, oncofago, vitaletina), imunoterapia personalizada ou imunoterapia idiotipica ativa (por exemplo, MyVax® personalizada imunoterapia, formalmente designado gtop-99), Promune® (CPG 7909, um agonista sintético para toll-like receptor 9 (TLR9)), terapia de interferon-alfa, terapia de interleucina-2 (IL- 2), terapia de IL-12, terapia com IL-15, e terapia com IL- 21; terapia com esteróide; ou outra terapia para câncer, onde a terapia adicional deve ser administrada antes, durante ou posterior ao terapia com anticorpo anti-CD20.
Assim, quando as terapias combinadas compreendem administração de um anticorpo anti-CD2 0 em combinação com a administração de outro agente terapêutico, como a quimioterapia, radioterapia, outra terapia anti-câncer anticorpo, terapia à base de pequenas moléculas, ou terapia a base de vacina/imunoterapia, os métodos da invenção abrangem a co-administração, usando formulações separadas ou uma única formulação farmacêutica, administração consecutiva e em qualquer ordem. Quando os métodos da presente invenção compreendem regimes de terapia combinados, essas terapias podem ser dadas em simultâneo, ou seja, o anticorpo anti-CD20 é administrado concomitantemente, ou no mesmo lapso de tempo que a outra terapia (ou seja, as terapias estão acontecendo simultaneamente, mas o anticorpo anti-CD20 não é administrado com precisão, ao mesmo tempo em que a outra terapia). Alternativamente, o anticorpo anti-CD20 da presente invenção também pode ser administrado antes ou posteriores à outra terapia. Administração seqüencial das diferentes terapias câncer pode ser realizada independentemente do fato de o indivíduo tratado responder ao primeiro curso de tratamento para diminuir a possibilidade de remissão ou recidiva. Quando as terapias combinadas compreendem administração do anticorpo anti-CD20 em combinação com a administração de um agente citotóxico, de preferência o anticorpo anti-CD2 0 é administrado antes da administração do agente citotóxico.
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Em algumas concretizações da invenção, os anticorpos anti-CD2 0 descritos neste documento são administrados em combinação com quimioterapia, e, opcionalmente, em combinação com transplante autólogo de medula óssea, onde os anticorpos e os agente (s) quimioterapêuticos podem ser administrados seqüencialmente, em qualquer ordem, ou simultaneamente (isto é, em simultâneo ou dentro do mesmo prazo). Exemplos de agentes quimioterápicos adequados incluem, mas não estão limitados a, fludarabina ou fosfato de fludarabina, clorambucil, vincristina, pentostatin, 2- chlorodeoxiadenosina (cladribina), ciclofosfamida,
doxorrubicina, prednisona, e suas combinações, por exemplo, contendo regimes de antraciclina, tais como PAC (ciclofosfamida, doxorrubicina, mais prednisona), CHOP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona mais
doxorrubicina), DVA (vincritsine, doxorrubicina, mais dexaalvosona), MP (melfalano mais prednisona), e outros agentes citotóxicos e/ou terapêuticos utilizados em quimioterapia, tais como mi toxantrona, daunorrubicina, idarubicin, asparaginase e antialvobolites, incluindo mas não limitados a, citarabina, metotrexato, 5-fluorouracil decarbazine, 6-thioguanine, 6-mercaptopurina, e nelarabine. Em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD2 0 é administrado antes do tratamento com o agente quimioterápico. Em algumas conscretizações, o anticorpo anti-CD2 0 é administrado após o tratamento com o agente quimioterápico. Ainda em outras concretizações, o agente quimioterápico é administrado em simultâneo com o anticorpo anti-CD20. Assim, por exemplo, em algumas concretizações, o anticorpo anti-CD2 0 é administrado em combinação com fludarabina ou fosfato de fludarabina. Em uma dessas concretizações, o anticorpo anti-CD20 é administrado antes da administração de fosfato de fludarabina ou fludarabina. Em concretização alternativa, o anticorpo anti-CD20 é administrado após o tratamento com fludarabina ou fosfato de fludarabina. Ainda noutras concretizações, o fosfato de fludarabina ou fludarabina é administrado em simultâneo com o anticorpo anti-CD20.
Em outras concretizações da invenção, clorambucil, uma droga alquilante, é administrada em combinação com um anticorpo anti-CD20 descrito aqui. Em uma dessas concretizações, o anticorpo anti-CD20 é administrado antes da administração de clorambucil. Em concretização alternativa, o anticorpo anti-CD20 é administrada após o tratamento com clorambucil. Ainda em outras concretizações, o clorambucil é administrado em simultâneo com o anticorpo anti-CD2 0.
Ainda em outras concretizações, regimes contendo antraciclina como o CAP (ciclofosfamida, doxorrubicina, mais prednisona) e CHOP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona mais doxorrubicina) podem ser combinados com a administração de um anticorpo anti-CD20 descrito aqui. Em uma dessas concretizações, o anticorpo anti-CD2 0 é administrado antes da administração dos regimes contendo antraciclina. Em outras concretizações, o anticorpo anti- CD2 0 é administrado após o tratamento com regimes contendo antraciclina. Ainda noutras concretizações, contendo antraciclina o regime é administrado em simultâneo com o anticorpo anti-CD20. Em concretizações alternativas, um anticorpo anti-CD2 0 aqui descrito é administrado em combinação com alemtuzumab (Campath®; distribuídos por Berlex Labocamundongories, Richmond, Califórnia). Alemtuzumab é um anticorpo monoclonal humanizado recombinante (Campath-lH), que visa o antígeno CD52 expresso em células B malignas. Em uma dessas concretizações, o anticorpo anti-CD20 é administrado antes da administração de alemtuzumab. Em outras concretizações, o anticorpo anti-CD2 0 é administrado após o tratamento com alemtuzumab. Ainda noutras concretizações, o alemtuzumab é administrado em simultâneo com o anticorpo anti-CD20.
Em concretizações alternativas, um anticorpo anti-CD20 aqui descrito é administrado em combinação com outra terapia com anticorpos anti-CD2 0 para o antígeno CD2 0 em células B malignas, por exemplo, rituximab (Rituxan®), o anticorpo totalmente humano Humax-CD2 0,-R 1594, imu-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/I-131 tositumomab (Bexxar®), ou ibritumomab tiuxetan (Zevalin®). Em uma dessas concretizações, o anticorpo anti-CD2 0 da invenção é administrado antes da administração do outro anticorpo anti-CD2 0. Em outras concretizações, o anticorpo anti-CD2 0 da invenção é administrada após o tratamento com o outro anticorpo anti-CD20. Ainda noutras concretizações, o anticorpo anti-CD20 da invenção é administrado simultaneamente com os outros anticorpos anti-CD20.
Em alternativa concretizações, um anticorpo anti-CD2 0 aqui descrito é administrado em combinação com uma terapia para câncer à base de pequenas moléculas, incluindo, mas não limitados a, microtubulos e/ou inibidores da topoisomerase (por exemplo, o inibidor mitótico dolastatina e análogos de dolastatina; o tubulina-aglomerante T900607; XL119; e os inibidores da topoisomerase aminocamptothecin), SDX-I05 (bendamustine cloridcamundongo), ixabepilone (um epothilone análogo, também designado por BMS-247550), inibidores da proteína quinase C, por exemplo, midostaurin ((PKC -412, CGP 41251, N-benzoylstaurosporine), pixantrone, eloxatin (um agente antineoplásico) , ganite (nitcamundongo de gálio), Thalomid® (talidomida), derivados da talidomida imunomoduladores (por exemplo, revlimid (anteriormente revimid)), Affinitak™ (inibidor antisense da proteína quinase C-alfa), SDX-101 (R-Etodolac, induzindo apoptose de linfócitos malignos), de segunda geração de análogos de nucleosídeos purínicos, tais como clofarabina, inibidores da produção das proteínas Bcl-2 de células cancerosas (por exemplo , os agentes antisense oblimersen e Genasense®), inibidores de proteosoma (por exemplo, Velcade™ (bortezomib)), pequenas moléculas inibidoras cinase (por exemplo, Chir-2 58), pequenas moléculas inibidoras VEGF (por exemplo, ZD-6474), pequenas moléculas inibidoras da proteína de choque térmico (HSP) 90 (por exemplo, 17-AAG), pequena molécula inibidora da histona deacetylases (por exemplo, híbridos/polares cytodifferentiation HPC), como agentes ácido suberanilohidroxamico (SAHA), e FR-901228) e apoptótico agentes como ® Trisenox (trióxido de arsênio) e Xcytrin® (motexafin gadolínio). Em uma dessas concretizações, o anticorpo anti-CD20 é administrado antes da administração da terapia à base de pequenas moléculas. Em outras concretizações, o anticorpo anti-CD20 é administrada após o tratamento com a terapia a base de pequena molécula. Em outras concretizações ainda terapia a base de pequena molécula é administrada em simultâneo com o anticorpo anti-CD20.
Ainda noutras concretizações, um anticorpo anti-CD2 0 descritos neste documento podem ser usados em combinação com a terapia de câncer à base de vacina/imunoterapia, incluindo mas não limitados a, vacina abordagens (por exemplo, Id-KLH, oncofago, vitaletina), imunoterapia personalizada ou imunoterapia idiotica ativa (por exemplo, imunoterapia personalizada MyVax®, formalmente designado gtop-99), Promune® (CPG 7909, um agonista sintético para receptor toll-like 9 (TLR9)), terapia interferon-alfa, terapia interleucina-2 (IL-2), terapia IL-12, IL-15 terapia, terapia ou IL-21, ou a terapia com corticosteróides. Em uma dessas concretizações, o anticorpo anti-CD2 0 é administrado antes da administração da imunoterapia à base de vacina/terapia. Em outras concretizações, o anticorpo anti-CD2 0 é administrado após o tratamento com a imunoterapia à base de vacina/terapia. Em outras concretizações ainda, a terapia baseada em vacina/imunoterapia é administrada em simultâneo com o anticorpo anti-CD20.
Em uma dessas concretizações, o anticorpo anti-CD20 descritos neste documento podem ser usados em combinação com a IL-2. IL-2, um conhecido agente de expansão do número de células efetoras natural killer (NK) em doentes tratados, podem ser administrados antes, ou concomitantemente com o anticorpo anti-CD2 0 da invenção. Esta expansão do número de células NK efetoras podem conduzir a uma melhoria da atividade ADCC do anticorpo anti-CD20 administrado. Em outras concretizações, IL-21 serve como o agente imunoterapias para estimular a atividade de células NK, quando administrado em combinação com um anticorpo anti-CD20 descrito aqui. Os anticorpos anti-CD2 0 da invenção podem ser usados
em combinação com qualquer conhecidas terapias para doenças inflamatórias e autoimunes, incluindo qualquer agente ou da combinação de agentes que são conhecidos ser útil, ou que tenha sido utilizados ou estão atualmente em uso, para tratamento de doenças inflamatórias e autoimunes. Essas terapias e agentes terapêuticos incluem, mas não estão limitados a, cirurgia ou procedimentos cirúrgicos (por exemplo, esplenectomia, linfadenectomia, tireoidectomia, plasmaforesis, leucoforesis, células, tecidos, ou transplante de órgãos, procedimentos intestinal, órgão de perfusão, e similares), a terapia de radiação, terapia como a terapia com esteróides e terapia não esteróide, terapia hormonal, terapia com citocina, a terapia com agentes dermatológicos (por exemplo, agentes tópicos utilizados para tratar a pele, como alergias, entre em contato com dermatite e psoríase) , terapia imunossupressora, e outros terapia anti-inflamatórios com anticorpo monoclonal, e coisas do gênero. Desta forma, os anticorpos anti-CD2 0 descritas neste documento são administrados em associação com pelo menos outro tratamento, incluindo, mas não se limitando a, cirurgia, órgão perfusão, radioterapia, terapia esteróide, terapia não-esteróides, terapia antibiótica, a terapia antifúngica, terapia hormonal, terapia com citocina, a terapia com agentes dermatológicos (por exemplo, agentes tópicos utilizados para tratar a pele, como alergias, entre em contato com dermatite e psoríase), terapia imunossupressora, outros medicamentos terapia anti-inflamatórios com anticorpo monoclonal, combinações, e coisas do gênero . Assim, quando as terapias combinadas compreendem administração de um anticorpo anti- CD2 0 em combinação com a administração de outro agente terapêutico, tal como acontece com esteróides como um exemplo, os métodos da invenção abrangem a co- administração, usando formulações farmacêuticas separadas ou uma única formulação, e consecutiva administração em qualquer ordem. Sempre que os métodos da presente invenção compreendem esquema terapêutico combinado, essas terapias podem ser dadas em simultâneo, ou seja, o anticorpo anti-CD20 é administrado concomitantemente, ou no mesmo lapso de tempo que os outros terapia (ou seja, as terapias estão acontecendo simultaneamente, mas o anticorpo anti-CD2 0 não é administrado com precisão, ao mesmo tempo em que as outras terapias). Alternativamente, o anticorpo anti-CD20 da presente invenção também pode ser administrado antes ou posteriores à outra terapia. Administração seqüencial das diferentes terapias pode ser realizada independentemente de o sujeito tratado responder ao primeiro curso de tratamento para diminuir a possibilidade de remissão ou recidiva.
Em algumas concretizações da invenção, os anticorpos
anti-CD20 descritas neste documento são administrados em combinação com medicamentos imunossupressores ou antiinflamatórios, em que o anticorpo e do agente terapêutico (s) pode ser administrada seqüencialmente, em qualquer ordem, ou em simultâneo (ou seja, em simultâneo ou dentro do mesmo prazo). Exemplos de drogas imunossupressoras adequadas que pode ser administrado em combinação com os anticorpos anti-CD2 0 da invenção incluem, mas não estão limitados a, metotrexato, ciclofosfamida, mizoribine, clorambucil, ciclosporina, como, por exemplo, aerossol ciclosporina (ver, US Patent Application Publication No. US20020006901, aqui incorporadas por referência na sua totalidade), tacrolimus (FK506; Prograf ™), micofenolato mofetil, e azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), deoxyspergualin, leflunomida e dos seus análogos malononitriloamide; e imunossupressoras proteínas, incluindo, por exemplo, anticorpos anti CTLA4 e Ig fusionadas, anticorpos anti- estimulador linfócito B (por exemplo, LYMPHOSTAT-B ™) e Ig fusionados (BLyS-Ig), anticorpos anti-CD80 e etanercept (Enbrel ®), como bem como anticorpos anti-células T, como anti-CD3 (0KT3), anti-CD4, e assim por diante. Exemplos de agentes anti-inflamatórios adequados incluem, mas não estão limitados a, corticosteróides, tais como, por exemplo, clobetasol, halobetasol, hidrocortisona, triancinolona, betaalvosona, fluocinole, fluocinonide, prednisona, prednisolona, metilprednisolona; não-esteróides anti-inflamatórios
(AINEs), tais como, por exemplo, sulfasalazina, medicamentos contendo mesalamine (conhecido como 5-ASA agentes), celecoxib, diclofenaco, Etodolac, fenprofen, flurbiprofen, ibuprofeno, cetoprofeno, meclofamate, meloxicam, nabumetona, naproxeno, oxaprozin, piroxicam, rofecoxib, salicilatos, sulindaco, e tolmetin; anti- inflamatórias, tais como anticorpos adalimumab (Humira®, um antagonista TNF-α) e infliximab (Remicade®, um antagonista TNF-a), e similares.
A rejeição a transplante e doença enxerto versus hospedeiro pode ser hiperacute (humoral), aguda (células T mediada), ou crônica (etiologia desconhecida), ou uma combinação dos mesmos. Assim, os anticorpos anti-CD20 da invenção são usados em alguns concretizações para prevenir e/ou melhorar rejeição e/ou os sintomas associados com hyperacute, aguda, e/ou crônica transplante rejeição de qualquer tecido, incluindo mas não limitados a, fígado , rim, pâncreas, células ilhotas pancreáticas, intestino delgado, pulmão, coração, córneas, pele, vasos sangüíneos, ossos, de medula óssea heterólogo ou autólogo, e coisas do gênero. Enxerto de tecidos podem ser obtidos a partir de qualquer doador e transplantadas para qualquer destinatário acolhimento e, consequentemente, o processo de transplante pode incluir transplante de tecidos animais para os seres humanos (por exemplo, xenotransplantes), um transplante de tecido humano para outro humano (por exemplo, aloenxertos), e/ou transplante de tecido de uma parte do corpo humano uma para outra (por exemplo, autografts). 0 tratamento com os anticorpos da invenção também podem reduzir transplante seqüelas, tais como febre, anorexia, anormalidades hemodinâmicas, leucopenia, infiltração de células brancas do órgão transplantado/tecidos, bem como infecções oportunistas.
Em algumas concretizações, os anticorpos anti-CD20 da
invenção pode ser usado sozinho ou em combinação com medicamentos imunossupressores para o tratamento e/ou evitar a rejeição, como transplante hyperacute, aguda, e/ou rejeição crônica e/ou doença enxerto versus hospedeiro. Assim, em algumas concretizações onde o anti-CD20 anticorpos da invenção são usados para tratar a rejeição do enxerto, os anticorpos possam utilizados em combinação com medicamentos imunossupressores adequadas, incluindo, mas não se limitando, ao metotrexato, ciclofosfamida; mizoribine; clorambucil, ciclosporina, tais como, por exemplo, aerossol ciclosporina (ver, US Patent Application Publication No. US20020006901, aqui incorporadas por referência na sua totalidade), tacrolimus (FK506; Prograf™) , micofenolato mofetil, e azatioprina (6- mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), deoxyspergualin, leflunomida e dos seus malononitriloamide análogos; e imunossupressores proteínas, incluindo, por exemplo, anticorpos anti-CTLA Ig e fusões, o anti-linfócito B estimulador anticorpos (por exemplo, LYMPHOSTAT-B™) e Ig fusões (BLyS-Ig) , o anti -anticorpos CD80 e etanercept (Enbrel®) , bem como anticorpos anti-células T, como anti- CD3 (OKT3), anti-CD4, e assim por diante. Como tal, é especificamente contemplado que as composições e os métodos da invenção são usados em combinação com outras drogas para melhorar ainda mais os sintomas e os resultados no transplante destinatários, tais como aqueles que recepoço enxertos pulmão, por exemplo. Assim, em algumas concretizações, o anticorpos anti-CD20 da invenção são usados para tratar a rejeição transplante (como, por exemplo hyperacute, aguda, e/ou rejeição crônica ou doença enxerto versus hospedeiro em transplante pulmonar beneficiários), isoladamente ou em combinação com parentérica e/ou não-administrados parentérica
ciclosporina, incluindo, por exemplo ciclosporina por via oral, injetável ciclosporina, aerossol (por exemplo, inalação) ciclosporina, e suas combinações. Em algumas concretizações onde pelo menos um componente da terapia é aerossol ciclosporina, a ciclosporina é entregue para o pulmão do destinatário por inalação de aerossóis ciclosporina em forma de spray, utilizando, por exemplo, um dispositivo ou pressurizado entrega nebulizador. A ciclosporina pode ser administrado em qualquer forma de pó seco ou molhado.
Em algumas outras concretizações, os anticorpos anti- CD2 0 da invenção podem ser usados sozinhos ou em combinação com medicamentos imunossupressores para o tratamento e/ou impedir a artrite reumatóide. Assim, em algumas concretizações onde os anticorpos anti-CD20 da invenção são usados para tratar a artrite reumatóide, os anticorpos podem ser utilizados em combinação com medicamentos imunossupressores adequados, incluindo, mas não limitados a, metotrexato, ciclofosfamida, mizoribine, clorambucil, ciclosporina, tacrolimus (FK506; Prograf™), micofenolato mofetil, e azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), deoxyspergualin, leflunomida e dos seus análogos malononitriloamide; e proteínas imunossupressoras, incluindo, por exemplo, anticorpos anti-CTLA e Ig fusionada, anticorpos anti estimulador de linfócitos B (por exemplo, LYMPHOSTAT-B ™) e Ig fusões (BLyS-Ig), outros anticorpos anti-CD20 (ex. RITUXAN ®) , o anticorpo totalmente humano Humax-CD2 0, 1-1594, imu-106, TRU-015 , AME-133, tositumomab/1-131, tositumomab (Bexxar ®), ibritumomab tituxetan (Zevalin ®) ; anticorpos anti-CD80, e etanercept (Enbrel ®) , bem como anticorpos anti-células T, como anti-CD3 ( 0KT3), anti-CD4, e assim por diante. Como discutido acima, a eficácia do tratamento pode ser avaliada utilizando qualquer meio, e inclui, mas não está limitado a, a eficácia, tal como medido pela respostas clínicas definidas por critérios do Colégio Americano de Reumatologia, critérios da Liga Européia de Reumatismo, ou quaisquer outros critérios. Ver, por exemplo, Felson et al. (1995) Artrite. Rheum. 38:727-35 e van Gestel et al. (1996) Arthritis Rheum. 39:34-40.
Ainda noutras concretizações, os anticorpos anti-CD20 da invenção podem ser usados sozinho ou em combinação com medicamentos imunossupressores para o tratamento e/ou impedir a esclerose múltipla. Assim, em algumas concretizações onde os anticorpos anti-CD20 da invenção são usados para tratar a esclerose múltipla, os anticorpos podem ser usados em combinação com medicamentos imunossupressores adequados, incluindo, mas não limitados a, metotrexato, ciclofosfamida, mizoribine, clorambucil, ciclosporina, tacrolimus (FK506; Prograf™), micofenolato mofetil, e azatioprina (6-mercaptopurina), sirolimus (rapamicina), deoxyspergualin, leflunomida e dos seus malononitriloamide análogos; e proteínas imunossupressoras, incluindo, por exemplo, anticorpos anti-CTLA e Ig fusões, o anticorpos anti-linfócito B estimulador (por exemplo, LYMPHOSTAT-Β™) e Ig fusões (BLyS-Ig) , outros anticorpos anti-CD2 0 (por exemplo, RITUXAN®), o anticorpo totalmente humano Humax-CD20, 1-1594, imu-106, TRU -015, AME-133, tositumomab/I-131, tositumomab (Bexxar®), ibritumomab tituxetan (Zevalin®); anticorpos anti-CD80, e etanercept (Enbrel®), bem como anticorpos anti-células T, como anti - CD3 (0KT3), anti-CD4, e assim por diante.
Além disso, a terapia combinada com dois ou mais agentes terapêuticos e um anticorpo anti-CD2 0 aqui descrito também pode ser utilizado para o tratamento de estados patológicos associados com células expressando CD2 0, por exemplo, com câncer relacionadas com células B, e doenças autoimunes e/ou inflamatórias. Sem ser limitante, exemplos inclui a combinação tripla terapia, onde dois agentes quimioterápicos são administrados em combinação com um anticorpo anti-CD2 0 descrita aqui, e sempre que um agente quimioterápico e outro anticorpo monoclonal anti-câncer (por exemplo, alemtuzumab, rituximab, ou anti - anticorpos CD23) é administrado em combinação com um anticorpo anti- CD2 0 descrito a seguir. Exemplos dessas combinações incluem, mas não estão limitados a, combinações de fludarabina, ciclofosfamida, eo anticorpo anti-CD20, e combinações de fludarabina, um anticorpo anti-CD20, por exemplo, rituximab (Rituxan ®; IDEC Pharmaceuticals Corporation, San Diego, Califórnia), e um anticorpo anti- CD2 0 da invenção.
Uma concretização da invenção é a utilização de anticorpos anti-CD2 0 para acompanhamento de diagnóstico níveis de proteína no tecido, como parte de um procedimento de ensaio clínico, por exemplo, para determinar a eficácia de um determinado tratamento. A detecção pode ser facilitada por uma ligação do anticorpo a uma substância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais
fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes e substâncias radioativas. Exemplos de enzimas adequadas incluem galactosidase de raiz forte, ou acetilcolinesterase; β-peroxidase, fosfatase alcalina, exemplos de próteses adequadas grupo complexos incluem streptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais adequados fluorescentes incluem umbelliferone, fluoresceína, fluoresceína isotiocianato, rodamina, fluoresceína dichlorotriazinylamine, dansil ou cloreto de ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, Iuciferina, e aequorina; adequadas e exemplos de materiais radioativos incluem 125I, 131I, 35S, ou 3H.
VIII. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODOS DE
ADMINISTRAÇÃO
Métodos de preparação e administração dos anticorpos
anti-CD2 0, antígenos ou fragmentos de ligação, as variantes, ou seus derivados da invenção de um sujeito que necessitam desse são Bem conhecidos, ou são facilmente determinados por aqueles qualificados na técnica. A via de administração do anticorpo anti-CD2 0, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles podem ser, por exemplo, por via oral, parenteral, por inalação ou tópica. O termo parenteral como aqui usado inclui, por exemplo, via intravenosa, intra, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, retal, vaginal ou administração. Embora todas estas formas de administração estejam claramente como sendo contemplada dentro de aplicação da invenção, uma forma de administração seria uma solução injectável, Em particular por via intravenosa ou injeção intra ou gotejamento. Normalmente, uma composição farmacêutica adequada para injeção pode incluir um tampão (por exemplo, acetato, fosfato ou tampão citcamundongo), um surfactante (por exemplo, polissorbato), opcionalmente um estabilizador agente (por exemplo, albumina humana), etc. No entanto, em outros métodos compatíveis com os ensinamentos aqui, anticorpos anti-CD2 0, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou seus derivados da invenção pode ser entregue diretamente ao sítio das diversas populações celulares aumentando assim a exposição do tecido doente para o agente terapêutico.
Como anteriormente discutido, anticorpos anti-CD20, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou seus derivados, da invenção podem ser administrados em uma quantidade farmaceuticamente eficaz para o tratamento in vivo de doenças mediada por células expressando CD2 0 como o LES, PBC, a ITP, esclerose múltipla, psoríase, doença de Cohn, rejeição, e linfoma de célula B. Neste contexto, será apreciado que os anticorpos divulgados serão formulados de modo a facilitar a administração e promover a estabilidade do agente ativo. Preferivelmente, composição farmacêutica, em conformidade com a presente invenção compreende um farmaceuticamente aceitável, não-tóxico, estéril, como soro fisiológico transportadora, não-tóxico tampões,
conservantes e outras coisas do gênero. Para efeitos da aplicação imediata, uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD2 0, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, conjugada ou não conjugada, será realizada a significar uma quantidade suficiente para uma efetiva ligação a uma alvo e para conseguir um benefício, por exemplo, para melhorar os sintomas de uma doença ou enfermidade ou para detetar uma substância ou uma célula. As composições farmacêuticas utilizadas no presente invenção compreendem carreadores farmaceuticamente aceitáveis, incluindo, por exemplo, colunas de troca iónica, alumina, esteato de alumínio, lecitina, proteínas séricas, como a albumina humana, tais como substâncias tampão fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas parciais glicerideos de ácidos graxos saturados vegetais, água, sais e eletrólitos, como o sulfato protamina, dissódio hidrogênio fosfato, potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, magnésio Trissilicato, polivinil pirrolidona, substâncias à base de celulose, polietileno glicol, carboximetilcelulose de sódio, poliacrilatos, ceras, polímeros poli-
polioxipropilene-bloco, polietileno glicol, gorduras de lã.
Preparações para administração parenteral incluem soluções aquosas ou não, estéreis, suspensões e emulsões. Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais, como o azeite, injetável e orgânicos, tais como ésteres etílicos oleato. Carreadores aquosos incluem água, soluções alcoólicas/ aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo salina e meios tamponados. Na invenção, carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, e, de preferência 0,01-0,1 M 0,05 M de tampão fosfato 0,8% ou salina. Outros veículos parenterais comum incluem soluções de fosfato de sódio, Ringer dextrose, dextrose e cloreto de sódio, Iactato de Ringer, ou óleos fixos. Fluidos intravenosos incluem veículos e nutrientes replenishers, eletrólito replenishers, tais como as baseadas em Ringer dextrose, e coisas do gênero. Conservantes e outros aditivos podem também estar presentes, como, por exemplo, os agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, e gases inertes e outros do gênero. Mais especificamente, composições farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas estéreis (hidrossolúvel) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea das soluções estéreis injetáveis ou dispersões. Nesses casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluida, na medida facilita a aplicação. Deve ser estável nas condições de manufatura e de armazenagem e terá preferência, ser preservados contra a ação dos microrganismos contaminantes, tais como bactérias e fungos. 0 carreador pode ser um solvente ou médio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, o poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e líquidos, e similares), e as suas misturas adequadas. A boa fluidez pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, como Iecitina, pela manutenção da necessária dimensão das partículas no caso de dispersão e pela utilização de tensoativos. Formulações adequadas para uso em os métodos terapêuticos descritos neste documento são divulgados na Remington1S Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16. Ed. (1980).
A prevenção da ação de microrganismos pode ser alcançada por diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, thimerosal e similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis, como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada pela inclusão na composição de um agente que atrasa a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.
Em qualquer caso, soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incorporação de um ativo (por exemplo, um anticorpo anti-CD2 0, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, por si só ou em combinação com outros agentes), na quantidade exigida em um solvente adequado com um ou uma combinação de ingredientes mencionados neste documento, conforme exigido, seguido pela esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas pela incorporação do composto ativo em um veículo estéril, que contém um médio de dispersão básico e os outros ingredientes daqueles enumerados acima. No caso do pó estéril para a preparação de soluções injetáveis estéreis, de preferência os métodos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento, o que produz um pó de um ingrediente ativo mais quaisquer ingredientes desejados adicionais a partir de uma solução previamente esterilizada por filtração. As preparações para injecções são processadas, enchidas em recipientes tais como em ampolas, sacos plásticos, garrafas, frascos e seringas, e selados sob condições assépticas, de acordo com métodos conhecidos na técnica. Além disso, a preparação pode ser embalada e vendida na forma de um kit, como as descritas no pedido de Patente pendente US publicado como 09/259337 EUA- 2002-0102208 Al, que é incorporada por referência aqui na íntegra. Esses artigos de manufatura preferêncialmente vão ter rótulos ou serão inseridas em pacotes indicando que as composições associadas são úteis para o tratamento de um indivíduo que sofra de, ou tenha predisposição a uma doença ou desordem.
Formulações parenterais podem ser de dose única, uma infusão ou fornecidas como uma carga de doses seguidas de uma dose de manutenção. Estas composições podem ser administradas em intervalos específicos fixos ou variáveis, como por exemplo, uma vez por dia, ou com no "quando necessário". Algumas composições farmacêuticas utilizadas nesta invenção podem ser administradas por via oral em uma forma de dosagem aceitável, incluindo, por exemplo, cápsulas, comprimidos, suspensões aquosas ou soluções. Algumas composições farmacêuticas também podem ser administradas por aerossol ou inalação nasal. Essas composições podem ser preparadas como em soluções salinas, empregando álcool benzilico ou outro dispositivo adequado conservantes, promotores de absorção para aumentar a biodisponibilidade, e/ou outros solubilizadores convencionais ou agentes dispersantes.
A quantidade de um anticorpo anti-CD2 0, ou fragmento, variante, ou derivado dele que pode ser combinado com materiais carreadores para produzir uma forma de dose única vai variar dependendo do hospedeiro tratado e modo específico de administração. A composição pode ser administrada como uma dose única, doses múltiplas ou mais de um período de tempo em uma infusão. Regimes de dosagem também podem ser ajustados para fornecer a melhor resposta desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profiláctico).
De acordo com o âmbito da presente divulgação, anticorpos anti-CD2 0, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou seus derivados da invenção podem ser administrados a um ser humano ou de outro animal, em conformidade com os referidos métodos de tratamento, em uma quantidade suficiente para produzir um efeito terapêutico. Os anticorpos anti-CD2 0, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou seus derivados da invenção podem ser administrados a estes humanos ou outros animais, em uma dose convencional preparada pela combinação do anticorpo da invenção com um carreador convencional farmaceuticamente aceitável ou diluente de acordo com técnicas conhecidas. Será reconhecido por um habilitado na técnica que a forma e o caráter do carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável é ditada pela quantidade de ingrediente ativo com o qual está a ser combinado, a via de administração e outros Bem conhecidos variáveis. Aqueles qualificados na técnica que irá apreciar uma combinação compreendendo uma ou mais espécies de anticorpos anti-CD2 0, ou fragmentos ligadores de antigeno, variantes, ou seus derivados da invenção que pode revelar-se especificamente eficaz.
Doses efetivas das composições da presente invenção, para o tratamento de doenças mediadas por células expressando CD2 0 como o LES, PBC, a ITP, a esclerose múltipla, psoriase, doença de Crohn, rejeição, e linfoma de célula B pode variar dependendo de diversos fatores, incluindo os meios de administração, o sítio do alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é humano ou um animal, outros medicamentos administrados, e se o tratamento é profilático ou terapêutico. Normalmente, o paciente é um ser humano, mas mamíferos não-humanos, incluindo mamíferos transgênicos também podem ser tratados. Doses terapêuticas podem ser tituladas utilizando métodos de rotina daqueles habilitados na técnica para otimizar a segurança e eficácia.
A quantidade de, pelo menos, um anticorpo anti-CD2 0 a ser administrado é facilmente determinada por um perito ordinário na técnica sem experimentação dado à divulgação do presente invenção. Fatores que influenciam no modo de administração e do respectiva quanitdade de, pelo menos, um anticorpo anti-CD20, fragmento ligador de antigeno, variante ou derivados deles incluem, mas não se limitando, a gravidade da doença, a história da doença, e os idade, altura, peso, saúde e condição física do indivíduo submetido terapia. Do mesmo modo, a quantidade de anticorpos anti-CD20, ou fragmento, variante, ou derivado da mesma a ser administrada será dependente do modo de administração e se o sujeito será submetido a uma dose única ou doses múltiplas deste agente. A dose de anticorpo anti-CD2 0, ou fragmento, ou variante, ou derivados deles está a ser administrado no intervalo de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, 0,003 mg/kg para cerca de 50 mg/kg, ou cerca de 0,01 mg/kg para cerca de 40 mg/kg. Assim, por exemplo, a dose pode ser 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, ou 100 mg/kg.
Em algumas concretizações, para o tratamento de doenças mediadas por células expressando CD2 0 como o LES, PBC, a ITP, a esclerose múltipla, psoríase, doença de Crohn, rejeição, e Iinfoma de células B com um anticorpo anti-CD2 0, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, a dosagem pode variar, por exemplo, de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais geralmente 0,01 a 5 mg/kg (por exemplo, 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc), do peso corporal. Por exemplo, doses pode ser de 1 mg/kg de peso corporal, ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro do intervalo de 1-10 mg/kg, de preferência, pelo menos, 1 mg/kg. Doses intermediárias na faixas acima também se destinam a ser dentro de aplicação da invenção. Podem ser administradas doses diárias, em dias alternativos, semanalmente ou de acordo com qualquer outro horário determinado pela análise empírica. Exemplos de horários de dosagem incluem 1-10 mg/kg ou 15 mg/kg em dias consecutivos, 3 0 mg/kg em dias alternados, ou 60 mg/kg semanalmente. Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com diferentes especificidades obrigatórias são administradas
simultaneamente, caso em que a dosagem de cada anticorpo administrado se enquadra dentro dos intervalos indicados.
Anticorpos anti-CD20, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou seus derivados da invenção podem ser administrado em múltiplas ocasiões. 0 intervalo entre as doses só pode ser diária, semanal, mensal ou anual. 0 intervalo também pode ser irregular, tal como indicado pela medição dos níveis sangüíneos alvo polipeptídeos ou molécula-alvo no doente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para obter uma concentração de plasma de polipeptídeos de 1-1000 ug/ml e em alguns métodos de 25-3 00 ug/ml. Alternativamente, anticorpos anti-CD2 0, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou seus derivados da invenção podem ser administrados como uma formulação de liberação sustentada, caso em que é necessária uma administração menos freqüente. A dosagem e freqüência variam dependendo da consoante meia-vida do anticorpo do doente. A meia-vida de um anticorpo anti-CD2 0 também pode ser prolongado através de uma fusão a polipeptídeos ou molécula, por exemplo, albumina ou PEG. Em geral, anticorpos humanizados revelam uma meia-vida mais longa, seguido por anticorpos quiméricos e anticorpos não humano. Em uma concretização, os anticorpos anti-CD20, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou seus derivados da invenção podem ser administrados na forma não conjugada. Em outra concretização, os anticorpos anti-CD20, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou derivados da invenção podem ser administrados várias vezes na forma conjugada. Em ainda outra concretização, anticorpos anti-CD2 0, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou seus derivados da invenção podem ser administrados na forma não conjugada e, em seguida, na forma conjugada, ou vice-versa.
Em outra concretização da invenção, o método compreende administração de doses múltiplas de anticorpo anti-CD2 0, ou fragmento ligador de antigeno, variante, ou derivado deles. O método pode incluir administração de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou mais doses terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anti anti-CD20, fragmento, variante, ou derivado deles. A freqüência e duração da administração das doses múltiplas de composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos molécula podem ser facilmente determinadas por uma pessoa de competência na técnica sem experimentação dada a divulgação aqui. Além disso, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo pode incluir um tratamento único ou, Preferivelmente, pode incluir uma série de tratamentos. Em um exemplo preferido, um indivíduo é tratado com anticorpo anti-CD20, ou fragmento ligador de antigeno, variante, ou derivados deles no intervalo de entre cerca de 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal, uma vez por semana para entre cerca de 1 a 10 semanas, de preferência entre os cerca de 2 a 8 semanas, mais preverivelmente entre os cerca de 3 a 7 semanas, e mais ainda, de preferência, por cerca de 4, 5 ou 6 semanas. 0 tratamento pode ocorrer anualmente para evitar a recaída ou a indicação de recaída. Também será apreciado que a dosagem eficaz da molécula anticorpos utilizada para o tratamento pode aumentar ou diminuir ao longo de um tratamento específico. Alterações na dosagem podem resultar e tornar-se aparente a partir dos resultados de testes diagnósticos, como descrito a seguir.1 Assim, em uma concretização, o regime de dosagem inclui uma primeira administração de uma dose terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo anti- CD20, ou fragmento ligador de antigeno, variante, ou derivados deles, nos dias 1, 7, 14 e 21 de um período de tratamento. Em outra concretização, o regime de dosagem inclui uma primeira administração de uma dose terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo anti- CD2 0, ou fragmento ligador de antigeno, variante, ou derivados deles, nos dias 1, 2, 3, 4, 5, 6 , e7de uma semana em um período do tratamento. Outras concretizações incluir um regime posológico de uma primeira administração de uma dose terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo anti-CD2 0, ou fragmento ligador de antigeno, variante, ou derivados deles, nos dias 1, 3, 5 e 7 de uma semana em um período de tratamento; um regime posológico incluindo uma primeira administração de uma dose terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo anti- CD2 0, ou fragmento ligador de antigeno, variante, ou derivados deles, nos dias 1 e 3 de uma semana em um período do tratamento; e um regime posológico preferenciais, incluindo uma primeira administração de uma dose terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo anti- CD2 0, ou fragmento ligador de antigeno, variante, ou derivados deles, no Io dia de uma semana em um período do tratamento. 0 período de tratamento podem incluir 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, um mês, 3 meses, 6 meses ou um ano. Tratamento períodos subseqüentes ou podem ser separadas umas das outras por um dia, uma semana, 2 semanas, um mês, 3 meses, 6 meses ou um ano.
Em algumas concretizações, as doses de eficácia terapia de anticorpos anti-CD2 0, ou fragmento ligador de antigeno, variante, ou derivados deles, variam de cerca de 0,0001 mg/kg a aboutlOO mg/kg, provenientes de cerca de 0,003 mg/kg para cerca de 50 mg/kg, de cerca de 0,01 mg/kg para cerca de 40 mg/kg, provenientes de cerca de 0,01 mg/kg para cerca de 3 0 mg/kg, provenientes de cerca de 0,1 mg/kg para cerca de 3 0 mg/kg, provenientes de cerca de 0,5 mg/kg para cerca de 3 0 mg/kg, provenientes de cerca de 1 mg/kg para cerca de 3 0 mg/kg, provenientes de cerca de 3 mg/kg para cerca de 3 0 mg/kg, provenientes de cerca de 3 mg/kg para cerca de 2 5 mg/kg, provenientes de cerca de 3 mg/kg a cerca de 2 0 mg/kg, provenientes de cerca de 5 mg/kg para cerca de 15 mg/kg, ou seja de cerca de 7 mg/kg para cerca de 12 mg/kg. Assim, por exemplo, a dose de qualquer um anticorpo anti-CD2 0, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, pode ser de 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, ou outros, tais doses caem dentro do intervalo de cerca de 0,0001 mg/kg para cerca de 100 mg/kg. A mesma dose terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD2 0, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, pode ser administrada ao longo de cada semana dosagem de anticorpos. Alternativamente, diferentes doses terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD2 0, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, pode ser utilizado ao longo de um período do tratamento.
IX. USO DE ANTICORPOS ANTI-CD20 NA MANUFATURA DE MEDICAMENTOS
A presente invenção também prevê a utilização de um anticorpo anti-CD20 ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles na fabricação de um medicamento para tratar um indivíduo com um câncer neoplásico caracterizada pelo crescimento das células B, onde o medicamento é coordenado com o tratamento com, pelo menos, outra terapia. Canceres neoplásicos caracterizados pelo crescimento das células B incluem, mas não estão limitados a, os cânceres relacionados a células B discutidos acima, por exemplo, linfoma não-Hodgkin, leucemia linfocitica crônica, mieloma múltiplo, linfoma de células B, linfoma de células B de alto grau, linfoma de células B de grau intermediário, linfoma das células B de baixo grau, leucemia linfoblastic células B aguda, leucemia mielóide, doença de Hodgkin, plasmacitoma, linfoma folicular, linfoma folicular pequenas clivadas, linfoma folicular de células grandes, folicular misto pequenas clivadas linfoma, linfoma difuso de células pequenas clivadas, difuso pequenas linfocíticos linfoma, prolinfocítica leucemia, linfoma Iinfoplasmacitico, linfoma zona marginal, linfoma tecido Iinfóide mucosa associado, linfoma de células B monocitoide, linfoma esplénico, leucemia de células hairy, linfoma difuso de grandes células, linfoma médiastínicos grandes células B, granulomatose Iinfomatóide, linfomatosis intravasculares, linfoma difuso de células mistas, linfoma difuso de grandes células, linfoma imunoblástico, linfoma de Burkitt, linfoma relacionado a AIDS, e linfoma célula manto.
Por "coordenado" é entendido o medicamento compreendendo o anticorpo anti-CD2 0 ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles é para ser utilizado quer antes, durante ou após o tratamento do sujeito com pelo menos uma outra terapia. Exemplos de outras terapias câncer incluem, mas não estão limitados a, cirurgia, radioterapia, quimioterapia, opcionalmente, em combinação com transplante autólogo de medula óssea, quando adequado agentes quimioterápicos incluem, mas não estão limitados a, fludarabina ou fosfato de fludarabina, clorambucil, vincristina, pentostatin, 2-chlorodeoxyadenosine
(cladribina), ciclofosfamida, doxorrubicina, prednisona, e suas combinações, por exemplo, contendo regimes de antraciclina como o PAC (ciclofosfamida, doxorrubicina, mais prednisona), CHOP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona mais doxorrubicina), DVA (vincritsine, doxorrubicina, mais dexaalvosona), MP (melfalano acrescido prednisona), e outros agentes citotóxicos e/ou terapêuticos utilizados na quimioterapia, como mitoxantrona, daunorrubicina, idarubicin, asparaginase e antialvobolites, incluindo, mas não limitados a, citarabina, metotrexato, 5- fluorouracil decarbazine, 6-thioguanine, 6-mercaptopurina, e nelarabine; outro anticorpo monoclonal anti-câncer terapia (por exemplo, alemtuzumab (Campath ®) ou outros anti-CD52 anticorpos CD52 segmentação da célula-superfície glicoproteica sobre células B malignas; rituximab (Rituxan ®) , o anticorpo totalmente humano Humax-CD20, 1-1594, imu- 106, TRU-015, AME-133, tositumomab/I-131 tositumomab (Bexxar ®) , ibritumomab tiuxetan (Zevalin ®) , ou qualquer outras terapia de anticorpos anti-CD2 0 visando o antígeno CD2 0, anticorpo anti-CDl9 em células B malignas; (por exemplo, MT103, um anticorpo biespecífico); anticorpo anti- CD22 (por exemplo, o anticorpo monoclonal humanizado epratuzumab); bevacizumab (Avastin ®) ou outros anticorpos anti-cancerosos cujo alvo seja fator de crescimento endotelial vascular humano; anticorpo anti-CD22 visando o antígeno CD22 em células B malignas (por exemplo, o anticorpo monoclonal BL-22, uma toxina alphaCD22); anticorpo α-Μ-CSF para o fator estimulante colônia de macrófagos; anticorpos visando o ativador do receptor nuclear do fator-kappaB (RANK) e seu ligante (RANKL), que são superexpressados no mieloma múltiplo; anticorpo anti- CD2 3 segmentação do antígeno CD2 3 em células B malignas (por exemplo, IDEC-152); anticorpo anti-CD38 segmentação do antígeno CD3 8 em células B malignas; anticorpos dos receptores complexo maior de histocompatibilidade classe II (anticorpos anti-MHC), expresso em células B malignas; anticorpos anti-CD40 (por exemplo, SGN-40) visando o antígeno CD40 malignos em células B e anticorpos para o fator de necrose tumoral-relacionados apoptose de indução ligante do receptor 1 (Trail-Rl) (por exemplo, o anticorpo monoclonal humano agonístico hgs-ETRl) expresso em uma série de tumores sólidos e tumores de origem hematopoéticas); terapia à base de pequenas moléculas, incluindo mas não limitados a, microtubulo e/ou inibidores da topoisomerase (por exemplo, o inibidor dolastatin mitótica e dolastatin análogos; a-tubulina aglomerante T900607; XLl19 e inibidor da topoisomerase aminocamptothecin), SDX -105 (bendamustine
cloridcamundongo), ixabepilone (um epothilone análogo, também designado por BMS-247550), inibidores da proteína quinase C, por exemplo, midostaurin (PKC-412, CGP 41251, N- benzoylstaurosporine) , pixantrone, eloxatin (um agente antineoplásico), ganite (nitcamundongo de gálio), Thalomid ® (talidomida), derivados imunomoduladores da talidomida (por exemplo, revlimid (anteriormente revimid)), Affinitak ™ (antisense inibidor da proteína quinase C-alfa), SDX-101 (R - Etodolac, induzir apoptose de Iinfócitos malignos), de segunda geração análogos nucleosídeos purínicos, tais como clofarabine, inibidores da produção das proteínas Bcl-2 de células cancerosas (por exemplo, os agentes antisense oblimersen e Genasense ®), proteosoma inibidores (por exemplo, ™ Velcade (bortezomib)), pequena molécula inibidoras cinase (por exemplo, Chir-258), pequenas moléculas inibidoras de VEGF (por exemplo, ZD-6474), pequenas moléculas inibidoras de proteínas de choque térmico (HSP) 90 (por exemplo, 17-AAG), pequena molécula inibidoras da histona deacetylases (por exemplo, híbridos/polares cytodifferentiation HPC), agentes como ácido suberanilohidroxamico (SAHA), e FR-901228) e agentes apoptóticos como ® Trisenox (trióxido de arsênio) e Xcytrin® (motexafin gadolínio); terapias de câncer à base de vacina/imunoterapia, incluindo mas não limitados a, vacina abordagens (por exemplo, Id-KLH, oncofage, vitaletina), imunoterapia personalizada ou imunoterapia idiotipica ativa (por exemplo, MyVax ® Personalizou imunoterapia, formalmente designado gtop -99), Promune ® (CPG 7909, um agonista sintético para receptor toll-like 9 (TLR9)), terapia interferon-alfa, terapia interleucina-2 (IL-2), terapia IL-12; terapia IL-15, e terapia IL-21, terapia esteróide; ou outra terapia de câncer, onde o tratamento com a terapia adicional, ou terapias complementares câncer, ocorre antes, durante ou após o tratamento do sujeito com o medicamento compreendendo o anticorpo anti-CD20 ou antigeno -Iigadora fragmento, variante, ou derivados deles, como se referiu acima.
Em algumas concretizações, a presente invenção prevê a utilização do anticorpo anti-CD20 ou fragmento ligador de antigeno, variante, ou derivados deles na fabricação de um medicamento para o tratamento de um Iinfoma de células B, por exemplo, Iinfoma não-Hodgkin, em um sujeito, onde o medicamento é coordenado com o tratamento com, pelo menos, outra terapia selecionada a partir do grupo que consiste de quimioterapia, terapia anti-câncer com anticorpo, terapia à base de pequenas moléculas, e a terapia baseada em vacina/imunoterapia, onde o medicamento é para ser utilizado quer antes, durante ou após o tratamento do sujeito com a outra terapia ou, no caso de múltiplas combinações terapias, quer antes, durante ou após o tratamento do sujeito com as outras terapias de câncer. Assim, por exemplo, em algumas concretizações, a invenção prevê a utilização do anticorpo monoclonal 1589 ou outros anticorpos anti-CD2 0 da invenção, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, na fabricação de um medicamento para o tratamento um linfoma de células B, por exemplo, linfoma não-Hodgkin, em uma matéria, onde o medicamento é coordenado com o tratamento com quimioterapia, quando o agente quimioterápico é selecionado a partir do grupo constituído por cytoxan, doxorrubicina, vincristina, prednisona, e combinações, por exemplo, CHOP. Em outras concretizações, a invenção prevê a utilização do anticorpo monoclonal 1589, ou fragmento ligador de antígeno 2, na fabricação de um medicamento para o tratamento de um linfoma de células B, por exemplo, linfoma não-Hodgkin, em um sujeito, onde o medicamento é coordenado com o tratamento com, pelo menos, outro anticorpo anti-câncer selecionado a partir do grupo constituído de alemtuzumab (Campath ®) ou outros anti-CD52 anticorpos CD52 segmentação da célula-superfície glicoproteica sobre células B malignas; rituximab (Rituxan ®) , o anticorpo totalmente humano Humax-CD20, 1-1594, imu- 106, TRU-015, AME-133, tositumomab/I-131 tositumomab (Bexxar ®) , ibritumomab tiuxetan (Zevalin ®) , ou qualquer outra terapia com anticorpo anti-CD2 0 orientadas para o antígeno CD20 em células B malignas; anticorpo anti-CDl9 (por exemplo, MT103, um anticorpo biespecífico); anticorpo anti-CD22 (por exemplo, o anticorpo monoclonal humanizado epratuzumab); bevacizumab (Avastin ®) ou outro anticorpo anti-cancerosos para fator de crescimento endotelial vascular humano, bem como quaisquer combinações dos mesmos, onde o medicamento é para ser utilizado quer antes, durante ou após o tratamento do sujeito com a outra terapia ou, no caso de múltiplas combinações terapias, quer antes, durante ou após o tratamento do sujeito com as outras terapia de câncer.
Ainda noutras concretizações, a presente invenção prevê a utilização do anticorpo monoclonal 1589, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, na fabricação de um medicamento para o tratamento de um Iinfoma de células B, por exemplo, não-Hodgkin Iinfoma, em um sujeito, onde o medicamento é coordenado com o tratamento com, pelo menos, outra terapia de câncer à base de pequena molécula selecionada a partir do grupo constituído por microtubulo e/ou inibidores da topoisomerase (por exemplo, o inibidor da mitose dolastatin e dolastatin análogos; a tubulina -aglomerante T900607; XLl19; e os inibidores da topoisomerase aminocamptothecin), SDX-105 (bendamustine cloridcamundongo), ixabepilone (um epothilone análogo, também designado por BMS-247550), inibidores da proteína quinase C, por exemplo, midostaurin ((PKC- 412, CGP 41251, N-benzoylstaurosporine), pixantrone, eloxatin (um agente antineoplásico), ganite (nitrato de gálio), Thalomid ® (talidomida), um agente apoptótico, como Xcytrin ® (motexafin gadolínio), inibidores da produção da proteína Bcl -2 pelas células cancerosas (por exemplo, os agentes antisense oblimersen e Genasense ®) , nelarabine, e quaisquer combinações destes elementos, onde o medicamento é para ser utilizado quer antes, durante ou após o tratamento do sujeito com a outra terapia ou , no caso de múltiplas combinações terapias, quer antes, durante ou após o tratamento do sujeito com as outras terapias de câncer.
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Em outras concretizações ainda, a presente invenção prevê a utilização do anticorpo monoclonal 1589 ou outro anticorpo anti-CD2 0 da invenção, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, na fabricação de um medicamento para o tratamento de um Iinfoma de células B, por exemplo, não-Hodgkin Iinfoma, em um sujeito, onde o medicamento é coordenado com o tratamento com, pelo menos, uma outra terapia à base de imunoterapia/vacina selecionada a partir do grupo constituído de vacina abordagens (por exemplo, Id-KLH, oncofage, vitaletina), imunoterapia personalizada ou imunoterapia idiotipica ativa (por exemplo, MyVax ® personalizada imunoterapia, formalmente designado gtop-99), Promune ® (CPG 7909, um agonista sintético para receptor toll-like 9 (TLR9)), terapia com interleucina-2 (IL-2), terapia com IL - 12; terapia com IL- 15, e terapia com IL-21, e quaisquer combinações dos mesmos, onde o medicamento é para ser utilizado quer antes, durante ou após o tratamento do sujeito com a outra terapia ou, no caso de múltiplas combinações terapias, quer antes, durante ou após o tratamento do sujeito com as outras terapias de câncer.
Em algumas concretizações, a presente invenção prevê a utilização do anticorpo anti-CD2 0, por exemplo, o anticorpo monoclonal 1589, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma célula-B relacionadas com leucemia, por exemplo, de células B leucemia linfocítica aguda (B-ALL), em um sujeito, onde o medicamento é coordenado com o tratamento com, pelo menos, outra terapia selecionados do grupo constituído por quimioterapia e terapia anti-metabolica, onde o medicamento é para ser utilizado quer antes, durante ou após o tratamento do sujeito com a outra terapia ou, no caso de múltiplas combinações terapias, quer antes, durante ou após o tratamento do sujeito com as outras terapias do câncer. Exemplos dessas concretizações incluem, mas não estão limitados a, os casos em que o medicamento compreendendo o anticorpo anti-CD2 0, por exemplo, o anticorpo monoclonal 1589, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, é coordenado com o tratamento com um agente quimioterápico ou anti-metabólico selecionado a partir do grupo constituído por cytoxan, doxorrubicina, vincristina, prednisona, citarabina, mitoxantrone, idarubicin, asparaginase, metotrexato, 6-thioguanine, 6- mercaptopurina, e suas combinações, onde o medicamento é para ser usado tanto antes, durante ou após o tratamento do sujeito com a outra terapia ou, no caso de múltiplas combinações terapias, quer antes, durante ou após o tratamento do sujeito com as outras terapias de câncer. Em um exemplo, o medicamento é coordenado com o tratamento com mais citarabina daunorubicina, citarabina mais mitoxantrona e/ou mais citarabina idarubicin; onde o medicamento é para ser utilizado quer antes, durante ou após o tratamento do B-ALL sujeito com a outra terapia ou, no caso de múltiplas combinações terapias, quer antes, durante ou após o tratamento do sujeito com as outras terapias de câncer.
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A invenção também prevê a utilização de um anticorpo anti-CD20, por exemplo, o anticorpo monoclonal 1589 divulgado aqui, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, na fabricação de um medicamento para tratar um sujeito com câncer caracterizada pelo crescimento das células B neoplásicas, incluindo os cânceres relacionados a células B aqui descritod acima, onde o medicamento é usado em um sujeito que tem sido prétratado com, pelo menos, uma outra terapia. Por "prétratado" ou "prétratamento" entende-se o sujeito que recebeu uma ou mais terapias outras de câncer (ou seja, foram tratados com pelo menos uma outra terapia de câncer ) antes de receber o medicamento compreendendo o anticorpo anti-CD2 0 ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado deles. "Pré-tratado" ou "pré-tratamento", inclui sujeitos que foram tratados com pelo menos uma outra terapia dentro de 2 anos, no prazo de 18 meses, no prazo de 1 ano, dentro de 6 meses, dentro de 2 meses, no prazo de 6 semanas, no prazo de 1 mês, dentro de 4 semanas, dentro de 3 semanas, dentro de 2 semanas, dentro de 1 semana, dentro de 6 dias, dentro de 5 dias, dentro de 4 dias, dentro de 3 dias, dentro de 2 dias, ou mesmo dentro de 1 dia antes do início do tratamento com o medicamento compreendendo o anti-CD2 0, por exemplo, o anticorpo monoclonal 1589 divulgado aqui, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado deles. Não é necessário que o sujeito tenha uma resposta ao tratamento prévio com a terapia de câncer prévia, ou antes terapia de câncer. Assim, o sujeito que recebe o medicamento compreendendo o anticorpo anti-CD2 0 ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles poderia ter respondido, ou poderia ter falhado a responder (ou seja, o câncer foi refratário), ao pré-tratamento com a terapia prévia de câncer, ou a um ou mais das terapias de câncer anteriores onde pretratamento compreendia várias terapias de câncer. Exemplos de outras terapias para o câncer pelas quais uma pessoa pode ter recebido pré- tratamento antes de receber o medicamento compreendendo o anticorpo anti-CD2 0 ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles incluem, mas não estão limitados a, cirurgia, radioterapia, quimioterapia, opcionalmente em combinação com transplante autólogo de medula óssea, onde agentes quimioterápicos adequados incluem, mas não estão limitados a, os enumerados acima, outras terapias com anticorpos monoclonais anti-canceres, incluindo mas não limitados a, os anticorpos anti-câncer listados acima; terapia à base de pequenas moléculas, incluindo mas não limitados a, as pequenas moléculas enumeradas acima; terapias à base de vacina/imunoterapia contra câncer, incluindo, mas limitados a, os enumerados acima, a terapia com corticosteróides e outras terapias, ou qualquer combinação.
"Tratamento" no contexto da utilização coordenada de
um medicamento descrito aqui com uma ou mais outras terapias para câncer é aqui definido como a aplicação ou a administração do medicamento ou da terapia para um outro sujeito, ou a aplicação ou a administração do medicamento ou outra terapia para um tecido isolado ou linhagem celular a partir de um sujeito, onde o sujeito tem um câncer caracterizado pelo crescimento das células B neoplásicas, um sintoma associado a tal câncer, ou uma predisposição para desenvolvimento desse câncer, onde a proposta é curar, sarar, aliviar, abrandar, alterar, corrigir, melhorar, remediar, ou afetar o câncer, a qualquer dos sintomas associados ao câncer, ou a predisposição para o desenvolvimento do câncer.
A presente invenção também prevê a utilização de um
anticorpo anti-CD2 0 ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles na fabricação de um medicamento para tratar uma doença autoimune e/ou doença inflamatória em um sujeito, onde o medicamento é coordenado com o tratamento com pelo menos uma outra terapia. Por "coordenado" é pretendido o medicamento ser utilizado quer antes, durante ou após o tratamento do sujeito com pelo menos uma outra terapia para doença autoimune e/ou doença inflamatória. Exemplos de outras terapias incluem, mas não estão limitados a, as descritos acima, ou seja, cirurgia ou procedimentos cirúrgicos (por exemplo, esplenectomia, Iinfadenectomia, tireoidectomia, plasmaforese, leucoforese, transplante de células, tecidos ou órgãos, perfusão de órgãos, procedimentos intestinais, e semelhantes), radioterapia, terapias como a terapia esteróide e não esteróide, terapia hormonal, terapia com citocina, terapia com agentes dermatológicos (por exemplo, agentes tópicos utilizados para tratar a pele, como alergias, dermatite de contato e psoriase), terapia imunossupressora, e outros terapias anti-inflamatórias com anticorpos monoclonais, e coisas do gênero, em que o tratamento com a terapia adicional, ou terapias complementares, ocorre antes, durante ou após o tratamento do sujeito com o medicamento compreendendo o anticorpo anti-CD2 0 ou fragmento ligador do antígeno, variante, ou derivados deles, como se referiu acima. Em uma dessas concretizações, a presente invenção prevê a utilização do anticorpo monoclonal 1589, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, noa fabricação de um medicamento para tratar uma doença autoimune e/ou doença inflamatória em um sujeito, onde o medicamento é coordenado com o tratamento com, pelo menos, uma outra terapia como assinalado acima.
Em algumas concretizações, o medicamento compreendendo
o anticorpo anti-CD2 0, por exemplo, o anticorpo monoclonal 1589 divulgado aqui, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, é coordenada com o tratamento com duas outras terapias. Sempre que o medicamento compreendendo o anticorpo anti-CD2 0 é coordenada com as duas outras terapias, o uso do medicamento pode ser antes, durante ou após o tratamento do sujeito com uma ou ambas as outras terapias.
A invenção também prevê a utilização de um anticorpo
anti-CD2 0, por exemplo, o anticorpo monoclonal 1589 divulgado aqui, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles, na fabricação de um medicamento para tratar uma doença autoimune e/ou doença inflamatória em um sujeito, onde o medicamento é usado em um sujeito que tenha sido pré-tratado com pelo menos uma outra terapia. Por "pré-tratado" ou "pretratamento" é pretendido que o sujeito tenha sido tratado com uma ou mais outras terapias antes de receber o medicamento compreendendo o anticorpo anti-CD20 ou fragmento ligador de antigeno, variante, ou derivado deles. "Pré-tratado" ou "pretratamento" inclui sujeitos que foram tratados com outra terapia, ou outras terapias, dentro de 2 anos, dentro de 18 meses, dentro de 1 ano, dentro de 6 meses, dentro de 2 meses, dentro de 6 semanas, dentro de 1 mês, dentro de 4 semanas, dentro de 3 semanas, dentro de 2 semanas, dentro de 1 semana, dentro de 6 dias, dentro de 5 dias, dentro de 4 dias, dentro de 3 dias, dentro de 2 dias, ou mesmo dentro de 1 dia antes do início do tratamento com o medicamento compreendendo o anticorpo anti-CD20, por exemplo, o anticorpo monoclonal 1589 divulgado aqui, ou fragmento ligador de antigeno, variante, ou derivado deles. Não é necessário que o sujeito foi um respondedor ao tratamento prévio com a terapia prévia, ou terapias prévias. Assim, o sujeito que recebe o medicamento compreendendo o anticorpo anti-CD2 0 ou fragmento ligador de antigeno, variante, ou derivados deles poderia ter respondido, ou poderia ter falhado a responder, para pré- tratamento com a terapia prévia, ou a uma ou mais terapias prévias onde o pretratamento é composto por múltiplas terapias.
"Tratamento", no contexto da utilização coordenada de um medicamento descrito aqui com uma ou mais outras doenças autoimunes e/ou doença inflamatória é aqui definida como a aplicação ou a administração do medicamento ou da terapia para um outro sujeito, ou a aplicação ou administração do medicamento ou outras terapias para uma linhagem de células ou tecidos isolados a partir de um sujeito, onde o sujeito tem uma doença autoimune e/ou doença inflamatória associada com células expressando-CD20, um sintoma associado a essa doença, ou uma predisposição para desenvolvimento de uma tal doença, onde o objetivo é curar, sarar, aliviar, abrandar, alterar, corrigir, melhorar, remediar, ou afetar a doença, os sintomas associados da doença, ou a predisposição para o desenvolvimento da doença.
X. DIAGNÓSTICOS
A invenção prevê ainda um método diagnóstico útil no diagnóstico de células expressando CD2 0-mediada por doenças como o LES, PBC, ITP, esclerose múltipla, psoriase, doença de Crohn, rejeição a transplante, e linfoma de células B, que envolve a medição do nível de expressão CD2 0 proteínas ou transcrição em células ou tecidos ou outros fluidos corporais de um indivíduo e comparar o nível medido expressão com um padrão CD2 0 nível de expressão tecido normal ou fluido corporais, em que um aumento na expressão nível comparado ao padrão é indicativo de uma desordem.
Os anticorpos anti-CD20 da invenção e fragmentos ligadores de antígenos, variantes, e seus derivados, pode ser utilizado para análise dos níveis da proteína CD2 0 em uma amostra biológica usando métodos imunohistológicos clássicos conhecidos para os de habilidade na técnica (por exemplo, ver Jalkanen, et al. (1985) J. Cell. Biol. 101:976-985; Jalkanen et al. (1987) J. Cell Biol. 105:3087- 3096). Outros métodos baseados em anticorpos úteis para detectar a expressão da proteína CD2 0 incluem imunoensaios, como o ensaio imunoenzimático (ELISA), imunoprecipitação, ou western blotting. Ensaios adequados são descritos em mais detalhes em outro lugar neste documento. Por "ensaio do nível da expressão do polipeptídeo CD2 0" é pretendido medir ou estimar qualitativamente ou quantitativamente o nível de polipeptídeos CD20 em uma primeira amostra biológica ou diretamente (por exemplo, pela determinação ou estimativa absoluta do nível da proteína) ou relativamente (por exemplo, comparando com o nível de polipeptídeos assiciados à doença numa segunda amostra biológica). Preferivelmente, o nível de expressão do polipeptídeo CD20 na primeira amostra biológica é medido ou estimado e comparado com um nível padrão do polipeptídeo CD2 0, o padrão a ser tomado de uma segunda amostra biológica obtida a partir de um indivíduo não tendo a desordem ou sendo determinado pelo nível médio de uma população de indivíduos sem a desordem. Como será apreciado na técnica, uma vez que o nível "padrão" de polipeptídeos CD2 0 é conhecido, ele pode ser usado várias vezes como um padrão para comparação.
Por "amostra biológica" é pretendido qualquer amostra biológica obtida a partir de um indivíduo, linhagem celular, cultura de tecidos, ou outra fonte potencial de células expressando CD20. Métodos para a obtenção de biópsias dos tecidos e fluidos corporais de mamíferos são bem conhecidas na técnica.
XI. IMUNOENSAIOS
Anticorpos anti-CD20, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou seus derivados da invenção podem ser analisados para ligação imunoespecífica por qualquer método conhecido na técnica. Os imunoensaios que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a ensaios competitivos e não-competitivos utilizando técnicas tais como western blot, radioimmunoensaios, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), imunoensaios "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, reações de precipitina, reações de precipitina em gel difusão, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação de complemento, ensaios immunoradiometricos, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios de proteína A, para citar apenas alguns. Esses ensaios são rotineiros e Bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Ausubel et ai. , Eds, (1994) Actual protocolos de Biologia Molecular (João Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1, que são incorporados por referência neste documento na íntegra). Imunoensaios exemplares são descritos resumidamente a seguir (mas não é pretendido o caminho da limitação).
Protocolos de Imunoprecipitação geralmente compreendem a Iise de uma população de células, como tampão RIPA (1% NP-40 ou Triton X-100, desoxicolato de sódio 1%, 0,1% SDS, 0,15 M NaCl, 0,01 M de fosfato de sódio, a pH 7.2, 1% Trasylol) suplementado com proteína fosfatase e/ou inibidores da protease (por exemplo, EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato de sódio), adicionando o anticorpo de interesse para a lisado celular, incubando por um período de tempo (por exemplo, 1-4 horas) a 4°C, acrescentando uma proteína e/ou esferas proteína G Sefarose para a lisado celular, incubando durante cerca de uma hora ou mais de 4°C, lavar as esferas em tampão de Iise e ressuspender as esferas em tampão de SDS/amostra. A capacidade do anticorpo de interesse para um determinado antígeno imunoprecipitado pode ser avaliada através, por exemplo, western blot análise. Alguém de habilidade na técnica seria versado para os parâmetros que podem ser modificados para aumentar a ligação do anticorpo ao antígeno e uma diminuição do fundo (por exemplo, pré-limpeza da lisado celular com esferas de Sefarose). Para uma discussão mais aprofundada em relação a protocolos de imunoprecipitação ver, por exemplo, Ausubel et al., Eds, (1994) Actual Protocolos em Biologia Molecular (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1 pelo 10.16.1.
Análise em Western blot geralmente inclui preparar amostras de proteína, eletroforese de amostras de proteínas em gel de poliacrilamida (por exemplo, 8% -20% SDS-PAGE, dependendo do peso molecular do antígeno), transferir a amostra da proteína poliacrilamida gel para uma membrana tais como nitrocelulose, PVDF ou nylon, o bloqueio da membrana na solução de bloqueio (por exemplo, com PBS 3% BSA ou leite sem gordura), lavagem da membrana em tampão de lavagem (por exemplo, PBS-Tween 20), incubar a membrana com anticorpo primário (o anticorpo de interesse), diluído em tampão de bloqueio, a lavagem da membrana em tampão de lavagem, incubando a membrana com um anticorpo secundário (que reconhece o anticorpo primário, por exemplo, um anticorpo anti-humano) , conjugada com um substrato enzimático (por exemplo, de raiz forte peroxidase ou fosfatase alcalina) ou moléculas radioativas (por exemplo, 32p ou 12 51), diluído em tampão de bloqueio, a lavagem da membrana em lavagem tampão, e detectar a presença do antígeno. Alguém de habilidade na técnica seria versado para os parâmetros que podem ser modificados para aumentar o sinal detectado e para reduzir o ruído de fundo. Para uma discussão mais aprofundada em relação Western Blot protocolos ver, por exemplo, Ausubel et al. , Eds, (1994) Actual Protocolos em Biologia Molecular (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1 no 10.8.1.
ELISA inclui preparação antígeno, revestimento do poço de uma placa 96-poços poço com o antígeno, adicionando o anticorpo conjugado com um dos juros compostos detectáveis, como um substrato enzimático (por exemplo, de raiz forte peroxidase ou fosfatase alcalina) para o poço e para incubando uma período de tempo, e detectar a presença do antígeno. No ELISA o anticorpo de interesse não tem de ser conjugado com um composto detectável; em vez disso, um segundo anticorpo (que reconhece o anticorpo de interesse), conjugada com uma detectável compostos podem ser adicionados para o poço. Além disso, em vez de revestimento do poço com o antígeno, o anticorpo pode ser revestido para o poço. Neste caso, um segundo anticorpo conjugado com compostos detectáveis podem ser adicionados após a adição do antígeno de interesse para recuperação. Alguém de habilidade na técnica seria versado para os parâmetros que podem ser modificados para aumentar o sinal detectado, bem como de outras variações de ELISA conhecido na técnica. Para uma discussão mais aprofundada em relação ELISA ver, por exemplo, Ausubel et al., Eds, (1994) Actual protocolos de Biologia Molecular (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1 no 11.2.1.
A afinidade de ligação de um anticorpo para o antígeno
e a taxa de dissociação de uma interação antígeno-anticorpo pode ser determinada pelo ensaio de ligação competitiva. Um exemplo de um ensaio de ligação competitiva é o radioimunoensaio compreendendo a incubação de antígeno marcado (por exemplo, 3H ou 1251) , com o anticorpo de interesse na presença de quantidades crescentes de antígeno marcadas, bem como a detecção do anticorpo ligado ao antígeno marcado. A afinidade do anticorpo de interesse para um determinado antígenoe desligar a ligação com cargas pode ser determinada a partir dos dados por análise Scatchard parcela. Competição com um segundo anticorpo também pode ser determinada utilizando radioimmunoassays. Neste caso, o antígeno é incubado com o anticorpo conjugado com um dos juros compostos marcados (por exemplo, 3H ou 12 51), na presença de quantidades crescentes de um segundo anticorpo marcado.
Anticorpos anti-CD20, ou fragmentos ligadores de antigeno, variantes, ou seus derivados da invenção, além disso, podem ser empregadas histologicamente, como na imunofluorescência, ensaios de microscopia immunoeletrônica ou não imunológicos, in situ para detecção de produtos de genes antígenos de câncer ou variantes conservados ou fragmentos de peptídeo deste. In situ detecção pode ser realizada através da remoção de um campo histológico a partir de um paciente, e mesmo aplicando um anticorpo anti- CD20 marcado, ou fragmento ligador de antigeno, variante, ou derivados deles, de preferência aplicada por sufocação marcado o anticorpo (ou fragmento) para um amostra biológica. Através da utilização de tal procedimento, é possível determinar não só a presença de CD20, proteína ou conservados variantes ou peptídeo fragmentos, mas também a sua distribuição no tecido examinado. Utilizando a presente invenção, aqueles de habilidade ordinária perceberão prontamente que qualquer um de uma grande variedade de métodos histológicos (tais como a coloração processos) podem ser modificados, a fim de alcançar tais detecções in situ.
Imunoensaios e não imunoensaios para produtos do gene CD2 0 ou variantes conservados ou fragmentos desse peptídeo irá tipicamente incluem incubando uma amostra, tal como um fluido biológico, um tecido extcamundongo, recém colhidas células, ou lisados de células que foram incubadas em cultura celular, em a presença de um anticorpo detectável marcada capaz de ligação a CD2 0 ou variantes conservados ou fragmentos do peptídeo, bem como a detecção de anticorpos ligados por qualquer de uma série de técnicas bem conhecidas na técnica.
A amostra biológica pode ser levada em contato com e imobilizada em uma fase sólida de suporte ou carreador tais como nitrocelulose, ou outro suporte sólido que é capaz de imobilizar células, de células ou partículas de proteínas solúveis. O suporte pode então ser lavadas com tampão adequado seguido de tratamento com os anti-CD2 0 marcado detectável anticorpo ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado deles. A fase sólida suporte pode então ser lavadas com o tampão uma segunda vez para remover anticorpo não ligado. Opcionalmente o anticorpo é posteriormente rotulado. A quantidade de marcação ligada ao sólido suporte podem então ser detectadas por meios convencionais.
Em "suporte de fase sólida ou carreador" qualquer suporte é pretendido ser capaz de se ligar um antígeno ou um anticorpo. Bem conhecido suportes ou carreadores incluem o vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextram, nylon, amilases, celulose natural e modificada, polyacrylamides, basalto, e magnetita. A natureza do carreador pode ser solúvel ou insolúvel em certa medida, para efeitos da presente invenção. 0 material de suporte pode ter praticamente qualquer configuração estrutural possível, desde que associada a molécula é capaz de se ligar a um antígenoou anticorpo. Assim, o suporte configuração pode ser esférico, como em uma pérola, ou cilíndrico, como no interior da superfície de um tubo de ensaio, ou da superfície externa de uma vareta. Alternativamente, pode ser a superfície plana como uma folha, fita de teste, etc. Suportes preferidos incluem esferas de poliestireno. Aqueles peritos na técnica saberão muitos outros carreadores adequados para ligação anticorpo ou antígeno, ou será capaz de determinar o mesmo através da utilização de rotina experimentação.
A atividade de ligação de um determinado lote de anticorpo anti-CD20, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados deles pode ser determinada de acordo com métodos Bem conhecidos. Aqueles qualificados na técnica serão capazes de determinar as condições operativas e ótimo ensaio para cada determinação, empregando rotina experimentação.
Há uma variedade de métodos disponíveis para medir a afinidade de um anticorpo-antígenointeração, mas relativamente pouca taxa de determinação constantes. A maioria dos métodos depende quer marcação anticorpo ou antígeno, o que inevitavelmente rotina complica medições e introduz incertezas na medida quantidades.
Ressonância de plasma na superfície (SPR) , como realizado em BIAcore oferece uma série de vantagens sobre os métodos convencionais de medir a afinidade da interação anticorpo-antígeno incluindo: (i) nenhuma exigência para marcar qualquer anticorpo ou antígeno, (ii) anticorpos não precisam de ser purificada de antecedência, o sobrenadante da cultura celular pode ser usado diretamente, (iii) as medições em tempo real, permitindo uma rápida comparação dos semi-quantitativa de anticorpos monoclonais diferentes interações, são ativados e são suficientes para muitos fins avaliação, (iv) biospecific superfície podem ser regenerados para que uma série de diferentes anticorpos monoclonais podem ser facilmente comparados em condições idênticas; (v) procedimentos analíticos são totalmente automatizados, e extensa série de medições pode ser realizada sem a intervenção do usuário. BlAapplications Handbook, versão AB (reprinted 1998), No. BIACORE código BR-I001-86; BlAtechnology Handbook, versão AB (reprinted 1998), No. BIACORE código BR-1001-84.
Estudos de ligação baseados em SPR requerem que um membro de um par ligador seja imobilizado em um sensor de superfície. A ligação de par imobilizado é referido como o ligante. A ligação de par na solução é referido como o analito. Em alguns casos, o ligante é anexado à superfície indiretamente através de ligação a uma outra molécula imobilizada, o que é referido como a captura molécula. SPR resposta reflete uma mudança na concentração em massa no detector superfície analitos como ligar ou dissociar.
Baseada em SPR, medições em tempo real BIAcore monitoram interações diretamente como elas acontecem. A técnica é bem adequada para determinação de parâmetros cinéticos. Ranking afinidade comparativo é extremamente simples de executar, e ambas as constantes cinéticas e afinidade podem ser obtidas a partir de dados dos sensores.
Quando o analito é injetado em um discreto pulso através de um ligante de superfície, o sensorgram resultante pode ser dividido em três fases essenciais: (i) associação de analito com ligante durante injecção amostra, (ii) equilíbrio ou estado estacionário durante injeção da amostra, onde a taxa do analito ligador é equilibrado pela dissociação do complexo, (iii) Dissociação do analito a partir da superfície durante tampão fluxo.
A associação e dissociação fases fornecer informações sobre a cinética da interação analito-ligante (ka e kd, as cargas de complexa formação e dissociação, kd/ka = KD) . 0 equilíbrio fase fornece informações sobre a afinidade do interação analito-ligante (KD).
0 software BIAevaluation fornece facilidades completas para montagem curva usando tanto numérica integração global e montagem algoritmos. Com a adequada análise dos dados, taxa separada e afinidade constantes de interação podem ser obtidas a partir de simples BIAcore investigações. A gama de afinidades mensuráveis por esta técnica é muito ampla, variando de mM a PM.
Especificidade de epitopo é uma característica importante de um anticorpo monoclonal. Epitope mapeamento com BIAcore, em contraste com as técnicas convencionais, utilizando radioimunoensaio, ELISA ou outra superfície adsorção métodos, não exige rotulagem ou purificada anticorpos, e permite testes de especificidade milti-sitio usando uma seqüência de vários anticorpos monoclonais. Além disso, um grande número de análises pode ser processado automaticamente.
Experimentos de pareamento de ligadores testam a capacidade de dois mAbs para ligar simultaneamente ao mesmo antígeno. mAbs dirigidas contra epítopos separado irá ligar independente, que mAbs dirigidas contra idênticos ou estreitamente relacionada epítopos irá interferir uns com os outros é ligadora. Estes experimentos com BIAcore são de ligaçãos simples de realizar.
Por exemplo, um pode usar uma molécula capturar o
efeito de ligar a primeira Mab, seguido pela adição de antígeno e segundo mAb sequêncialmente. 0 sensorgrams irá revelar: 1. quanto do antígenoliga-se à primeira Mab, 2. em que medida a segunda mAb liga à superfície-inscritos antígeno, 3. se o segundo mAb não liga, se inverter a ordem dos pares no ensaio altera os resultados.
Inibição de peptídeo é outra técnica utilizada para mapeamento de epítopo. Este método pode complementar oz pares de ligação de anticorpo estudados, e podem relacionar epítopos funcionais de características estruturais, quando a principal seqüência do antígeno é conhecido. Peptídeos ou antígeno fragmentos são testados para a inibição da ligação de diferentes mAbs ao antígeno imobilizado. Peptídeos que interferem com a ligação de um determinado mAb são supostos para ser estruturalmente relacionada ao epítopo definido por esse mAb.
A prática da presente invenção vai empregar, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia celular, cultura celular, biologia molecular, biologia transgénicos, microbiologia, DNA recombinante, e imunologia, que estão dentro da competência da técnica. Tais técnicas são explicadas totalmente na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook et al. , Ed. (1989) Molecular Cloning A Labocamundongory Manual (2 a ed.; Cold Spring Harbor Labocamundongory Press); Sambrook et al. , Ed. (1992) Molecular Cloning: A Labocamundongory Manual, (Cold Springs Harbor Labocamundongory, NY); DN Glover ed. , (1985) DNA Clonagem, volumes I e II; Gait, ed. (19 84) oligonucleótidos Synthesis; Mullis et al. US Patent No. 4683195; Hames e Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hibridação; Hames e Higgins, eds. (1984) Transcrição e Tradução; Freshney (1987) Cultura de células animais (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells e enzimas (IRL Press) (1986); Perbal (1984) Um Guia Prático Para Molecular Cloning; a treatise , Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., NY); Miller e Calos eds. (1987) a transferência de vetores gênicos de células de mamífero (Cold Spring Harbor Labocamundongory) , Wu et al. , Eds., Methods in Enzymology, Vols. 154 e 155; Mayer e Walker, eds. (1987) Métodos imunoquímico Em biologia celular e molecular (Academic Press, London); Weir e Blackwell, eds., (1986) Handbook of Experimental Immunology, volumes I-IV; Manipular o Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Labocamundongory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1986); e em Ausubel et al. (1989) Actual protocolos de Biologia Molecular (John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland) .
princípios gerais de anticorpos construídos são apresentados em Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engeneering (2 3 ed.; Oxford Univ. Press). Princípios gerais de proteínas construídas são apresentados em Rickwood et al. , Eds. (1995) Protein Engineering, a practice approach (IRL Press em Oxford Univ. Press, Oxford, Inglaterra.). Os princípios gerais e de anticorpos anti-hapteno ligador são apresentada em: Nisonoff (1984) Imunologia Molecular (2a ed.; Sinauer Associates, Sunderland, MA) e Steward (1984) Anticorpos, sua estrutura e função (Chapman and Hall, New York, NY) . Além disso, métodos normalizados em imunologia conhecida na técnica e não especificamente descritos são geralmente seguidas como nos actuais protocolos de Imunologia, John Wiley & Sons, Nova Iorque; Stites et al., Eds. (1994) Basic and Clinicai Immunology (8a ed, Appleton Sc Lange, Norwalk, CT) e Mishell e Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (WH Freeman and Co., NY).
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Trabalhos de referência padrão que apresentam princípios gerais de imunologia incluem Atual Protocolos em Imunologia, John Wiley & Sons, Nova Iorque; Klein (1982) J., Imunologia: The Science of Self-nonself Discriminação (John Wiley & Sons, NY); Kennett et al. , eds. (1980) os anticorpos monoclonais, hibridomas: uma nova dimensão em Análises Biológicas (Plenum Press, NY), Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology", em técnicas
labocamundongoriais em Bioquímica e Biologia Molecular, ed. Burden et al., (Elsevere, Amesterdão); Goldsby et al., Eds. (2000) Kuby Immunnology (4th ed.; Freemand H. & Co.); Roitt et al. (2001) Imunologia (6 a ed.; London: Mosby); Abbas et al. (2005) Imunologia Celular e Molecular (5 a ed. ; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann e Dubel (2 001) Antibody Engineering (Springer Verlan); Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Labocamundongory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall2003); Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Labocamundongory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach e Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press).
Todas as referências citadas acima, bem como todas as referências citadas neste documento, são incorporadas neste documento por referência em suas entireties.
Os exemplos seguintes são oferecidos a título de ilustração e não por meio de limitação.
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EXPERIMENTAL
Exemplo 1: Otimização do anticorpo murino anti-CD20 humanizado
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Um anticorpo murino humanizado monoclonal anti-CD20, mAb 1097, foi projetada dentro de uma ou mais das regiões determinação de complementaridade (CDRs) da seus domínios variáveis pesados (VH; ver SEQ ID NO: 29) e variáveis leve
(VK; ver SEQ ID NO : 10) para produzir mAbs otimizados tendo função CDC aumentada. O anti-CD2 0 mAb inicial humanizado murino é uma forma anticorpo quimérico murino/humano anti-CD20 conhecido como rituximab (ou seja, mAb C2B8; ver US Patent No. 573 6137) . Os três CDRs do domínio VH original (designado H12 86) e domínio VK original (designado L373), dentro do anti-CD20 mAb murino humanizado são mostrados na Figura 1. 0 CDR2 de L373 (mostrada em SEQ ID NO: 9) foi obtido a partir de um VK humano e não um VK murino.
Passos iniciais de otimização incluíram modificações para a partida CDR3 (designada como "271" na Figura 1; SEQ ID NO: 30) do H12 86 domínio VH (ver Figura 2) . 271 CDR3 A seqüência é equivalente aquele para o domínio variável CDR3 dentro da cadeia pesada da mAb C2B8. As primeiras alterações a 271 CDR3 incluíram:
1) substituição de uma tirosina para asparagina (Y -<· N) na posição 9 do início CDR3 e substituição de uma valina
para asparagina (V N) na posição 12 da partida CDR3 para produzir o "1236" CDR otimizada3 (SEQ ID NO: 1);
2) substituição de uma glicina a alanina (G -> A) na posição 5 da inicial CDR3 além da substituição de Y N e V
-> N nas posições 9 e 12, respectivamente, para produzir a "1237" CDR3 otimizada (SEQ ID NO: 2); ou
3) substituição de uma valina para ácido aspártico (V D) na posição 12 da inicial CDR3 em adição a substituição
de G A e Y N nas posições 5 e 9, respectivamente, para produzir a "123 8" CDR3 otimizada (SEQ ID NO: 3).
As sequencias codificantes individuais para CDR3s otimizadas são apresentadas em SEQ ID NO: 24 (codificação 1236 CDR3 otimizada), SEQ ID NO: 25 (codificação CDR3 otimizada 1237), e SEQ ID NO: 26 (codificação 1238 CDR3 otimizada).
Estas foram, então, CDR3s otimizadas construídas para a estrutura do domínio VH original humanizado H1286 para produzir para os seguintes domínios VH otimizados: H1569 (SEQ ID NO: 12), compreendendo o 1236 optimizado CDR3 SEQ ID NO: 1; H1570 (SEQ ID NO: 13), compreendendo o 1237 optimizado CDR3 SEQ ID NO: 2; e H1571 (SEQ ID NO: 14), compreendendo o 1238 optimizado CDR3 SEQ ID NO: 3) (ver Figura 3). A codificação seqüências VH otimizadas para estes domínios são mostrados na Figura 4, e apresentada em SEQ ID NO: 19 (codificação H1569), SEQ ID NO: 20 (codificação H1570), e SEQ ID NO: 21 (codificação H1571). Cada um destes domínios VH otimizados foi então pareado com o domínio VK original (L373) (ver Figura 5, SEQ ID NO: 10; codificação seqüência apresentada na SEQ ID NO: 23) para produzir os seguintes mAbs humanos otimizados: mAb 123 6, mAb 1237, e mAb 1238.
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Exemplo 2: Ligação e características funcionais de anticorpos anti-CD20 murinos humanizados otimizados
mAbs humanos otimizados 1236, mAb 1237, 1238 e mAb descritos no Exemplo 1, foram assessadospara suas respectivas características funcionais e de ligação. Para cada ensaio, mAb 271, tendo a mesma seqüência para rituximab (IDEC-C2B8; Rituxan®; IDEC Pharmaceuticals Corporation, San Diego, Califórnia), serviu como controle positivo.
A especificidade de ligação foi avaliada por fluorométrico Microvolume Composição Tecnologia (FMAT, Applied Biosystems 8200 Cellular Detection System) e de citometria de fluxo, que tabula Mean Fluorescence Intensidades (IFM) da marcação em CD2 0 positivo (CD2 0 +) e CD20 negativos linhagems celulares. FMAT análise demonstrou especificidade ligadora para CD2 0 (Figuras 6A-6D). Análise de Citometria de fluxo demonstrou a ligação dos mAbs humanizados otimizados anti-CD2 0+ mAbs de células Daudi e EBl (Tabela 2).
Tabela 2. Ligação a linhagens celulares negativas e positivas para CD20. Resultados de citometria de fluxo (media das intesidades de fluorescencia).
Daudi EBl K562 U266 mAb CD20 Positiva CD20 Positiva CD20 Negativa CD20 Negativa 271 145 429 10 9 1236 145 409 12 11 1237 132 395 14 11 1238 114 389 11 10 11 (controle negatico) 8 8 6 5
Com intuito de assessar o epítopo reconhecido por mAbl23 6, mAb 1237, mAb 1238, células e anticorpos 2H7 de camundongo específico para CD2 0 (ou camundongo ISO) @ 3 mg/ml foram adicionados à placa FMAT seguido de incubação em temperatura ambiente por 2 horas . 0 teste mab (3 0 ng/ml) e um anti-humano IgFc Alexa-647 foram, então, acrespercentualu, e fluorescência sinal detectado por FMAT. Uma diminuição no sinal, com o camundongo 2H7 (m2H7) indica epítopo bloqueio. Como pode ser visto na Figura 7, e como esperado, mAb 1236, mAb 1237, 1238 e mAb todos reconhecem o mesmo epítopo mAb 271 (anticorpo rituximab-seqüência).
Citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e
citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) foram avaliados. Pelo CDC, uma taxa de anticorpos off- ensaio foi utilizado. Desta forma, alvo células CD20 + Daudi foram carregados com 5lCr, 2 00 mCi de 2 horas, e em seguida lavadas. As células foram lavadas Daudi incubadas com 10 mg/ml dos respectivos mAb durante 15 minutos a 25 2 C. Alvo Células DAUDI foram então cuidadosamente lavados e incubados a 37 sC. Após 0, 1, 2, 4 e 6 horas incubações a 37 2 C, as células foram incubadas com 6% de soro humano (fonte complementar) por 45 minutos. Controles incluídos espontânea e máximo 5ICr liberação, mAb com células Daudi sozinho, e soro com células Daudi isoladamente em todas as concentrações. Sobrenadantes foram, então, processada e liberada 51Cr contadas através gama balcão. Anticorpos específicos de CDC foi determinada subtraindo as mAb e soro sozinho contribuições para a Iise.
Como pode ser visto na Figura 8, mAb 1236, mAb 1237 e 1238 têm mAb CDC atividade funcional significativamente melhor do que mAb 271 (anticorpo rituximab-sequência).
Atividade ADCC foi analisada com células-alvo DAUDI carregadas com 51Cr, 2 00 mCi de 2 horas, e seguindo com uma lavagem. As células Daudi foram lavadas incubadas com titulação das respectivas concentrações e mAbs preparado PBMCs (fonte NK) em 50:1, para 4 horas. Controles incluíram liberação espontânea e máximo 51Cr, mAb com células Daudi sozinho, e PBMC com células Daudi isoladamente em todas as concentrações. Sobrenadantes foram, então, processados e liberada 51Cr contadas através gama balcão. Anticorpos específicos de ADCC foi determinada subtraindo as PBMC contribuição para Iise.
Como pode ser visto na figura 9, ADCC atividade
aumentada com o aumento da concentração de todos os mAb mAbs testados. Em todo o mAb concentrações, o mAb 123 6, mAb 1237, ADCC e mAbl238 têm atividade que é equivalente ao observado para o controle mAb 271 (anticorpo rituximab- seqüência) .
Atividade de apoptose também foi avaliada utilizando um ensaio de apoptose direta que é independente de CDC e ADCC. Desta forma, células Ramos (NHL), foram incubadas com 10, 2, 0.4, ou 0,08 mg/ml dos respectivos mAb na presença de cross-linking anticorpo (5 mg/ml de cabra anti-IgG humana Fc) por 18 horas a 37 2 C. mAb 11 atuou como o isotipo controle. As células foram colhidas e lavadas após 18 horas e incubadas com Annexin V-APC e propídio Iodide durante 15 minutos a 25 2 C. As células foram analisadas por citometria de fluxo para a presença de Annexin V positivo/negativo e células com PI.
Como pode ser visto na Figura 10, os mAbs otimizados humanizado 1236, 1237 e 1238 são tão eficazes para induzir apoptose como o mAb 271 (seqüência do anticorpo rituximab).
Exemplo 3: Mais otimização de mAb 1237
Células de Leucemia linfocítica crônica B (LLC-B)
expressam níveis mais baixos de CD2 0 que células LNH (Linfoma não-Hodgkins). Testes mostraram que mAb 1236, mAb 1237 e mAb 123 8 demonstram fraco CDC em células B-CLL. Como próximo passo, o mAb 1237 foi selecionado e submetido a mutagênese para buscar melhorias na afinidade e, portanto, melhorias na Iise das células B-LLC. A estratégia de melhoria na afinidade compreendeu randomização de posições específicas nos domínios VH e VK, selecionando mutantes VH com L373, selecionando mutantes VK com H1570, combinando distintas mutações benéficas em qualquer VH ou VK, e combinando com mutantes VH e VK. Os novos mutantes identificados são apresentados na Tabela 3.
Tabela 3. Novos mutantes identificados. Posições dos residuos dentro dos domínios Vh e Vk estão com referência ao sistema de numeração de KABAT.
mAb Vh Vk 1588 H1638 (H1570 S31F) L373 1589 H1639 (H1570 D56A) L373 1590 H1640 (H1570 D56L) L373 1652 H1639 (H1570 D56A) L419 (L373 T92Q) 1692 H1670 (H1570 N101G) L373
15
0 mAb otimizado 1588 compreende o H1638 VH domínio (SEQ ID NO: 15) (que é o domínio com um H157 0 VH S - F substituição na numeração Kabat-31 da posição H1570, o que corresponde ao resíduo 31 da sequencia de aminoácido H1570 apresentada em SEQ ID NO: 13) e da L373 VL domínio (SEQ ID NO: 10) . Esta substituição S^F resultou em uma CDRl optimizada (ver SEQ ID NO: 7) dentro do H1638 VH domínio.
0 mAb otimizada 1589 compreende o H1639 VH domínio (SEQ ID NO: 16) (que é o domínio com um H1570 VH D -> A substituição na posição numeração Kabat-56 da H1570, que corresponde ao resíduo 57 da seqüência de aminoácidos H1570 apresentada em SEQ ID NO: 13) e da L37 3 VL domínio (SEQ ID NO: 10). Este D-A substituição resulta em uma optimizada CDR2 (ver SEQ ID NO: 5; codificadas por SEQ ID NO: 27) dentro do H1639 VH domínio.
O mAbl590 otimizado compreende o Hl640 VH domínio (SEQ
ID NO: 17) (que é o domínio com um Hl57 0 VH D - L Kabat- numeração substituição na posição 56 do H1570, o que corresponde a 57 do resíduo H1570 aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 13) e da L373 VL domínio (SEQ ID NO: 10). Este D-L substituição resulta em uma optimizada CDR2 (ver SEQ ID NO: 6), dentro do domínio VH H1640.
O mAb otimizado 1652 compreende o Hl639 VH domínio (SEQ ID NO: 16) e da L419 VL domínio (SEQ ID NO: 11) (que é o domínio com uma L373 VL T - Q Kabat-numeração substituição na posição 92 da L373, o que corresponde ao resíduo 91 da L3 73 aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10). Esta T-Q substituição resulta em uma optimizada CDR3 (ver SEQ ID NO: 8) dentro da L419 VL domínio.
20
O mAb otimizada 1692 compreende o H1670 VH domínio (SEQ ID NO: 18) (que é o domínio com um H1570 VH N - G Kabat-numeração substituição na posição 101 da H1570, que corresponde ao resíduo 109 da seqüência de aminoácidos H1570 apresentada em SEQ ID NO: 13). Este -NG substituição resulta em uma optimizada CDR3 (ver SEQ ID NO: 4), dentro do H1670 VH domínio.
As seqüências de aminoácidos para o domínio Hl639 VH (SEQ ID NO: 16) e domínio L373 VL (SEQ ID NO: 10) do mAb 1589 são mostrados na Figura 11, e as respectivas seqüências codificantes são mostrados na Figura 12, ver também SEQ ID NO: 22 (código da seqüência de H1639) e SEQ ID NO: 23 (código da seqüência para L373). Exemplo 4: Ligação e características funcionais dos anticorpos monoclonais anti-CD20 murinos humanizados otimizados
5
0 mAb otimizado humanizado Exemplo 1 de 1237, e mais mAbs humanizados otimizados 1588, 1589, 1590, 1652 e 1692 descritas no Exemplo 3 foram avaliados e de ligação para as suas respectivas características funcionais. Para cada ensaio, mAb 271, tendo a mesma seqüência para rituximab (IDEC-C2B8; Rituxan®; IDEC Pharmaceuticals Corporation, San Diego, Califórnia), serviu como controlo positivo. De ligaçãos especificidade foi avaliada por citometria de fluxo, que tabula Média de intensidade de fluorescencia (IFM), de marcação das linhagens celulares CD2 0 positivo (CD20 +) e CD20 negativos. Análise de Citometria de fluxo demonstrou a ligação destas otimizada humanizado anti-CD20 mAbs para CD2 0, como pode ser visto na Tabela 4.
Tabela 4. Ligação de linhagens celulares positivas e negativas para CD20. Flow Cytometry Results (Mean Fluorescence Intensities) .
Daudi EHEB CHO.CD20 HL60 K562 CHO Vetor mAb CD20 Positiva CD20 Positiva CD20 Positiva CD20 Negativa CD20 Negativa CD20 Negativa 271 941 130 81 6 3 4 1237 1373 161 106 8 9 6 1588 2068 338 140 9 6 4 1589 1029 345 140 8 6 5 1590 1627 429 135 8 7 6 1652 1422 529 135 6 6 5 1692 1671 450 137 7 4 5 11 (Negativa Control) 6 8 5 7 4 6
Conservação do epítopo foi avaliada através da análise da capacidade da mAb 2H7 a bloquear de ligação. Desta forma, camundongo 2H7 (ou isotipo Ig como controle) foi adicionado ao EBl células, então candidato mAbs humano e anti-humano Ig Alexa 647 foram adicionados. De ligaçãos foi detectada pela FMAT. Uma diminuição do sinal indica bloqueio e epítopo comum utilização.
Como pode ser visto na Figura 13, todos os anticorpos
testados reconheram epítopos idênticos ou sobrepostos.
Citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) foram avaliados. Pelo CDC, vários ensaios foram utilizados. 0 primeiro ensaio composto radioativo carregamento células- alvo com 51Cr, 200mCi por 2 horas. Lavado células alvo (Daudi (NHL) e B-CLL linhagems) foram incubadas com titulação mAb e concentrações de soro humano (fonte complementar) por 4 horas. Controles incluíram liberação espontânea e máxima 51Cr, mAb com células sozinho, e soro com células isoladamente em todas as concentrações. Sobrenadantes foram processados e 51Cr liberado foi contado com um contador gama. CDC com Anticorpo específico foi determinada pó contribuições da subtração de mAb e soro sozinho para a Iise. Resultados de Daudi e duas linhagens de células B-LLC são mostrados na Figura 14 e Figuras 15A e 15B, respectivamente. Para Daudi células, os mAbs otimizados geralmente mediado CDC função maior do que mAb 271 (anticorpo rituximab-sequência), especificamente em baixas concentrações. Para B-CLL células, o otimizada mAbs apresentaram aumento CDC função durante o mAb 271 (anticorpo rituximab-seqüência).
Função CDC também foi avaliada com uma taxa de
anticorpos off-ensaio. Desta forma, alvo células CD20 + Daudi foram carregados com 5lCr, 2 00 mCi de 2 horas, e em seguida lavadas. As células foram lavadas Daudi incubadas com 10 mg/ml dos respectivos mAb durante 15 minutos a 25 2 C. Alvo Células DAUDI foram então cuidadosamente lavadas e incubadas com 6% de soro humano (fonte complementar) de 45 'após 0, 1, 2, 4 e 6 horas incubações a 37 aC. Controles incluídos espontânea e máximo 51Cr liberação, mAb com células Daudi sozinho, e soro com células Daudi isoladamente em todas as concentrações. Sobrenadantes foram, então, processada e liberada 5lCr contadas através gama balcão. Anticorpos específicos de CDC foi determinada subtraindo as mAb e soro sozinho contribuições para a Iise. Como pode ser visto na Figura 16, todos têm otimizado mAbs CDC atividade funcional significativamente melhor do que mAb 271 (anticorpo rituximab-seqüência). CDC função também foi avaliada com um não-radioativo (Alamar Blue ™) CDC ensaio. Desta forma, células-alvo (dois de cada NHL, B-CLL, e linhagens de células B normais) foram lavados com titulação mAb e concentrações de soro humano (fonte complementar). Controles incluídos células-alvo e sem anticorpos de soro humano (espontâneo morte celular), células-alvo e sem anticorpos séricos (fundo lise) e poços de células-alvo, com 10% de SDS (ou 5% Triton xlOO em água), que substitui os anticorpos e soro (para o máximo de morte celular) . Alamar Blue foi adicionado a cada poço 2 horas mais tarde, e após ler uma fluorescência incubação overnight. Neste ensaio, mais fluorescência indica mais células vivas e menos citotoxicidade devido ao CDC. AlamarBlue™ oxidação-redução é um indicador que fluoresce em resposta às atividades metabólicas em células proliferam. AlamarBlue™ é semelhante ao sais tetrazólio (MTT), em que tanto pode detectar mudanças no alvobolismo da célula, mas AlamarBlue™ é menos tóxico e mais sensível que MTT. Os resultados obtidos na avaliação da citotoxicidade celular mediada comparando o uso de AlamarBlue™ com 51Cr liberação ensaios indicam que o AamarBlue ™ método é tão específico quanto determinação de 5lCr liberação. Os resultados são mostrados nas Figuras 17A (Daudi NHL linhagem celular) e 17B (WIL2-S NHL linhagem celular), figuras 18A (EHEB B-CLL linhagem celular) e 18B (Mec-I B-CLL linhagem celular), e figuras 19A (SS BLCL "normal" células B) e 19B (Mel K BLCL "normal" Células B). 0 ensaio é um radioativos 4 horas, enquanto o ensaio não radioativos ensaio é um ensaio 18-20 horas. 0 mAb otimizada candidatos geralmente dá maior Iise em ensaios não- radioativos, em comparação aos controles. Ensaios não- radioativos podem representar uma situação mais parecida com a in-vivo, que fixa, como a droga poderia estar presente em concentrações elevadas por muito mais tempo do que 4 horas em um in-vivo definição. Para resumir os resultados, a atividade do CDC otimizada mAbs seja pelo menos igual ao mAb 271 (anticorpo rituximab-seqüência) sobre Daudi NHL células. 0 otimizado mAbs são melhores do que mAb 271 no off-taxa CDC ensaio. A menor taxa off-indica que a afinidade do otimizada mAbs é maior do que a afinidade do mAb 271. Finalmente, o otimizada mAbs mAb 271 são melhores do que no B-Iise CMI linhagens celulares normais e células B alvos. ADCC atividade foi analisada pela carga células alvo (Daudi e B-CLL) com 51Cr, 200 mCi de 2 horas, e segue com uma lavagem. As células alvo foram lavadas e incubadas com titulação das respectivas concentrações e mAbs preparado PBMCs (fonte NK) em 50:1, para 4 horas. Controles incluídos espontânea e máximo 51Cr liberação, mAb com células-alvo sozinho, e PBMC com células-alvo isoladamente em todas as concentrações. Sobrenadantes foram, então, processada e liberada 51Cr contadas através gama balcão. Anticorpos específicos de ADCC foi determinada subtraindo as PBMC contribuição para Iise.
Como pode ser visto na Figura 2 0 (Daudi NHL células) e Figura 21 (MEC-1 B-CLL células), ADCC atividade aumentada com o aumento da concentração de todos os mAb mAbs testados. O otimizado mAbs tinha ADCC atividade que é semelhante ao observado para o controle mAb 271 (anticorpo rituximab-sequência). Apoptosis atividade também foi avaliada utilizando um ensaio que está diretamente apoptose CDC e ADCC independente. Desta forma, células Ramos (NHL), foram incubadas com 2, 0,4, ou 0,08 mg/ml dos respectivos otimizada mAb ou controle mAb 271, na presença de cross- linking anticorpo (5 mg/ml de cabra anti-IgG humana Fc) durante 18 horas a 37eC. As células foram colhidas e lavadas após 18 horas e incubadas com Annexin V-APC e propídio Iodide durante 15 minutos a 25eC. As células foram analisados por citometria de fluxo para a presença de Annexin V positivo/negativo PI células.
25
Como pode ser visto na Figura 22, a otimizada mAbs são tão eficazes como a induzir apoptose mAb 271 (anticorpo rituximab-sequência).
Atividade de morte celular também foi avaliada
utilizando uma análise de sangue total. 0 protocolo foi semelhante ao CDC ou ADCC ensaios, excepto o sangue total é utilizado em vez de soro (CDC) ou purificado PBMCs (ADCC). Neste ensaio, a Iise de células alvo é devido à atividade acumulado do CDC, ADCC, e apoptose. Os resultados desta análise de sangue total são mostrados na Figura 23 (Daudi NHL células), figuras 24A (EHEB B-CLL células) e 24B (MEC-1 B-CLL células), e Figura 25 (Mel K "normal" células B) . Como pode ser visto nestes valores, a otimizada mAbs têm equivalente ou melhor Iise contra estas respectivas células-alvo como mAb 271 (anticorpo rituximab-sequência).
Exemplo 5: Administração do anticorpo murino monoclonal optimizado Hiimanizado anti-CD20 1589 prolonga sobrevivência em um modelo de camundongo de xenoenxerto com células Daudi
Células Daudi NHL humanas são linfomas de células B linfoma de células que crescem de forma sistemática em camundongos SCID. Crescimento de Células DAUDI resulta em paralisia em camundongos (Ghetie et al. (1990) Int J Câncer 45:481-485). Estudos foram realizados para determinar se os anticorpos anti-CD2 0 da invenção efeito a sobrevivência de camundongos com células Daudi xenotransplantes. SCID camundongos foram criados e mantidos sob condições pathogen-free. Daudi NHL células (8 χ 106) foram injetados intravenosamente na veia caudal dos três grupos de cinco camundongos SCID (15 camundongos total) . Nos dias 7 e 9 pós-injeção tumor, os camundongos foram injetados pela mesma via com PBS, 50 mg ou 50 mg IgGl humana mAb 1589. Os animais foram observados três vezes por semana, e sacrificados após os primeiros sinais de paralisia hind limbo. Conforme mostrado na figura 26, o anticorpo monoclonal 1589 prolongou a sobrevivência dos camundongos com xenoenxerto das células humanas Daudi.
Exemplo 6: Esquema de seqüências e desenho do anticorpo As seqüências identificadores para os diversos CDRs otimizados, domínios variáveis pesados e leves compreendendo estas CDRs otimizadas, seqüências codificantes para esses elementos, e domínios variáveis pesados original humanizado para o anticorpo anti-CD2 0 estão resumidos a seguir. Tabela 5 abaixo apresenta a concepção anticorpo anti-CD20.
Identificadores das seqüências:
10
15
20
25
30
1. CDR3 of H1569 - a. a . 2 . CDR3 of H1570 - a. a . 3 . CDR3 of H1571 - a. a. 4 . CDR3 of H1670 - a. a. . CDR2 of H1639 - a.a. 6 . CDR2 of H1640 - a. a. 7 . CDRl of H1638 - a. a. 8 . CDR3 of L419 - a. a. 9 . CDR2 of L373 - a. a. • L373 - a . a. 11 • L419 - a . a. 12 H1569 - a. a. 13 H1570 - a. a. 14 H1571 - a. a. • H1638 - a. a. 16 H1639 - a. a. 17 ■ H1640 - a. a. 18 H1670 - a. a. 19 • H1569 - nt seq • H1570 - nt seq 21 • H1571 - nt seq 22 H1639 - nt seq 23 • L373 - nt seq 24 • CDR3 of H1569 - CDR3 of H1570 - 26. CDR3 of
27. CDR2 of
28. CDR2 of
29. Η1286 -
30. CDR3 of
Tabela 5. Desenho
H1571 - nt seq H1639 - nt seq L373 - nt seq a. a.
H1286 - a.a. do anticorpo.
Nome do Anticorpo Domínio Vh Domínio Vl Anti-CD2 0 murino humanizado original H1286 (SEQ ID NO:2 9) L373 (SEQ ID NO:10) 1236 H1569 (SEQ ID NO:12) L373 (SEQ ID N0:10) 1237 H1570 (SEQ ID NO:13) L373 (SEQ ID NO:10) 1238 H1571 (SEQ ID NO:14) L373 (SEQ ID NO:10) 1588 H1638 (SEQ ID NO:15) L373 (SEQ ID NO:10) 1589 H1639 (SEQ ID NO:16) L373 (SEQ ID N0:10) 1590 H1640 (SEQ ID NO:17) L373 (SEQ ID N0:10) 1593 H1570 (SEQ ID NO:13) L419 (SEQ ID NO:11) 1652 H1639 (SEQ ID NO:16) L419 (SEQ ID NO:11) 1692 H1670 (SEQ ID NO:18) L373 (SEQ ID NO:10) Muitas modificações e outras concretizações das invenções aqui apresentadas virão a mente para um perito na matéria a que essas invenções relacionadas com o benefício dos ensinamentos apresentados nas descrições precedentes e os respectivos desenhos. Portanto, é para ser entendido que as invenções não são para ser limitadas às concretizações específicas divulgadas e que as modificações e outras concretizações se destinem a ser incluídas dentro da lista de reivindicações e anexadas as concretizações aqui divulgadas. Embora os termos específicos sejam empregados aqui, eles são usados em um sentido genérico e descritivo, e não para efeitos de limitação.
Todas as publicações e os pedidos de patentes mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível de tais qualificações na técnica à qual pertence esta invenção. Todas as publicações e os pedidos de patentes são aqui incorporados por referência à mesma medida, como se cada publicação ou pedido de patente foi expressamente indicado e individualmente a ser incorporados por referência. LISTAGEM DE SEQÜENCIAS
<110> Depositante: Ernest S. Smith Terrence L. Fisher, Jr.
<12 0> Título da Invenção: IMUNOGLOBULINA QUE LIGA ESPECIFICAMENTE CD20, COMPOSIÇÃO, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA IMUNOGLOBULINA QUE LIGA ESPECIFICAMENTE CD20, MÉTODO PARA TRATAR UM CÂNCER EM UM INDIVÍDUO, MÉTODO PARA INIBIR O CRESCIMENTO OU DIFERENCIAÇÃO DE UMA CÉLULA B HUMANA NORMAL, MÉTODO PARA INIBIR O CRESCIMENTO DAS CÉLULAS CANCEROSAS DA LINHAGEM DAS CÉLULAS B, MÉTODO PARA TRATAR TJMA DOENÇA AUTO- IMUNE OU DOENÇA INFLAMATÓRIA EM UM INDIVÍDUO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA.
20
30
35
<130> Referência do documento: 050827/333624
<150> Número do Documento de Prioridade: 11/869,170
<151> Data de Depósito do Documento de Prioridade: 09/10/2007
<150> Número do Documento de Prioridade: 60/850,604 <151> Data de Depósito do Documento de Prioridade: 10/10/2006
<160> Quantidade de SEQ ID NOs.: 30
<170> Sdetware: FastSEQ para Windows Version 4.0
<210> SEQ ID NO: 1 <211> Comprimento: 12 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:
<223> Outras Informações: CDR3 de H1569
<400> Seqüência: 1 40 Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn 10
<210> SEQ ID NO: 2 45 <211> Comprimento: 12 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características: 50 <223> Outras Informações: CDR3 de H1570
<400> Seqüência: 2
Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn 10
55
<210> SEQ ID NO: 3 <211> Comprimento: 12 <212> Tipo: PRT <213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:
<223> Outras Informações: CDR3 de H1571 <400> Seqüência: 3
Sér Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asp 10
<210> SEQ ID NO: 4 <211> Comprimento: 12 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:
<223> Outras Informações: CDR3 de H1670 <400> Seqüência: 4
Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Gly Asn 10
<210> SEQ ID NO: 5 <211> Comprimento: 17 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüencia Artificial <220> Características:
<223> Outras Informações: CDR2 de H1639 <400> Seqüência: 5
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
10 15
Gly
<210> SEQ ID NO: 6 <211> Comprimento: 17 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:
<223> Outras Informações: CDR2 de H1640 <400> Seqüência: 6
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Leu Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
10 15
Gly
<210> SEQ ID NO: 7 <211> Comprimento: 11 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:
<223> Outras Informações: CDRl de H1638 <400> Seqüência: 7
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Phe Tyr Asn Met His 10
<210> SEQ ID NO: 8 <211> Comprimento: 9 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:
<223> Outras Informações: CDR3 de L419 <400> Seqüência: 8
Gln Gln Trp Gln Ser Asn Pro Pro Thr 1 5
<210> SEQ ID NO: 9 <211> Comprimento: 7 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:
<223> Outras Informações: CDR2 de L373
<400> Seqüência: 9 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5
<210> SEQ ID NO: 10 <211> Comprimento: 106 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras Informações: L373 - cadeia leve anti-CD20 de murino humanizado
<400> Seqüência: 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr
40 45
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> SEQ ID NO: 11 <211> Comprimento: 106 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:
<223> Outras Informações: L419 - variante de cadeia leve anti-CD20 light
<400> Seqüência: 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr
40 45
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Gln Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> SEQ ID NO: 12 <211> Comprimento: 121 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:
<223> Outras Informações: H1569 - variante de cadeia pesada anti-CD20 <400> Seqüência: 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> SEQ ID NO: 13 <211> Comprimento: 121 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:
<223> Outras Informações: H1570 - variante de cadeia pesada anti-CD20 <400> Seqüência: 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Gln Gly Leu 45 Glu Trp. ILe Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser 85 Leu Arg Ser Asp Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Ser Thr 100 Tyr Tyr Ala Gly Asp 105 Trp Asn Phe Asn Asn 110 Trp Gly Gln Gly Thr 115 Leu Val Thr Val Ser 120 Ser
15
20
50
<210> SEQ ID NO: 14 <211> Comprimento: 121 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:
<223> Outras Informações: H1571 - variante de cadeia pesada anti-CD20
<400> Seqüência: : 14 Gln 1 Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ser Ser Val Lys Val 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Thr 30 Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala 50 Ile Tyr Pro Gly Asn 55 Gly Asp Thr Ser Tyr 60 Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser 85 Leu Arg Ser Asp Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Ser Thr 100 Tyr Tyr Ala Gly Asp 105 Trp Asn Phe Asn Asp 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 40 115 120
<210> SEQ ID NO: 15 <211> Comprimento: 121 45 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras Informações: H1638 - variante de cadeia pesada anti-CD20
<400> Seqüência: 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Phe Tyr
55 2 0 2 5 3 0
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60
60 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 β/12 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> SEQ ID NO: 16 <211> Comprimento: 121
<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características: <223> Outras Informações: H1639 - variante de cadeia pesada anti-CD20
<400> Seqüência : 16 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Tyr Thr Phe Thr 30 Ser Tyr Asn Met His 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Gln Gly Leu 45 Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr 100 Tyr Tyr Ala Gly Asp 105 Trp Asn Phe Asn Asn 110 Trp Gly Gln Gly Thr 115 Leu Val Thr Val Ser 120 Ser
40
35
<210> SEQ ID NO: 17 <211> Comprimento: 121 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:
<223> Outras Informações: H1640 - variante de cadeia pesada anti-CD20
<400> Seqüência: 17 45 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 50 35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Leu Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
55 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 60 115 120 <210> SEQ ID NO: 18 <211> Comprimento: 121 <212> Tipo: PRT <213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras Informações: H1670 - variante de cadeia pesada anti-CD20
<400> Seqüência: 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Gly Asn Trp Gly 100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> SEQ ID NO: 19 <211> Comprimento: 363 <212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características: <223> Outras Informações: H1569 - variante de cadeia pesada anti-CD20
<221> Nome/Chave: CDS
<222> Localização: (1)...(363)
40 <400> Seqüência: 19
cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 10 15
45 tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct ggg tac acc ttc acc agt tac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 30
aat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg cta gag tgg att 144 50 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 40 45
gga gct att tat ccc gga aat ggt gat act tcc tac aat cag aag ttc 192 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 55 50 55 60
aaa ggc aag gcc aca ata act gca gac aaa tcc acg age aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
60
atg gag ctc age age ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt 2 88 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
gca aga tcg act tac tac ggc ggt gac tgg aac ttc aat aac tgg ggc 336 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn Trp Gly
100 105 110
cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 363
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> SEQ ID NO: 20
<211> Comprimento: 363
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras Informações: H1570 - variante de cadeia pesada anti-CD20
<221> Nome/Chave: CDS
<222> Localização: (1)...(363)
20
<400> Seqüência: 20
cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
10 15
tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct ggg tac acc ttc acc agt tac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
25 30
aat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg cta gag tgg att 144 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
gga gct att tat ccc gga aat ggt gat act tcc tac aat cag aag ttc 192 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60
40
aaa ggc aag gcc aca ata act gca gac aaa tcc acg age aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
45 atg gag ctc age age ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt 2 88 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
gca aga tcg act tac tac gcc ggt gac tgg aac ttc aat aac tgg ggc 336 50 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn Trp Gly 100 105 110
cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 363
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
55 115 120
<210> SEQ ID NO: 21 <211> Comprimento: 363 60 <212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:
<223> Outras Informações: H1571 - variante de cadeia pesada anti-CD20
<221> Nome/Chave: CDS
<222> Localização: (1)...(363)
<400> Seqüência: 21
cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 10 15
tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct ggg tac acc ttc acc agt tac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
aat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg cta gag tgg att 144 Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 40 45
20
gga gct att tat ccc gga aat ggt gat act tcc tac aat cag aag ttc 192 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60
aaa ggc aag gcc aca ata act gca gac aaa tcc acg age aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
atg gag ctc age age ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gca aga tcg act tac tac gcc ggt gac tgg aac ttc aat gac tgg ggc 33 6 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asp Trp Gly
100 105 110
cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 363
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
40
<210> SEQ ID NO: 22 <211> Comprimento: 3 63 <212> Tipo: DNA 45 <213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras Informações: H1639 - variante de cadeia pesada anti-CD20
50 <221> Nome/Chave: CDS
<222> Localização: (1)...(363)
<400> Seqüência: 22
cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc 48
55 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
10 15
tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct ggg tac acc ttc acc agt tac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 60 20 25 30 aat atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg cta gag tgg att 144
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
40 45
gga gct att tat ccc gga aat ggt gct act tcc tac aat cag aag ttc 192
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
aaa ggc aag gcc aca ata act gca gac aaa tcc acg age aca gcc tac 240
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
atg gag ctc age age ctg aga tet gac gac acg gcc gtg tat tac tgt 288
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gca aga tcg act tac tac gcc ggt gac tgg aac ttc aat aac tgg ggc 336
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Ala Gly Asp Trp Asn Phe Asn Asn Trp Gly
100 105 110
20
25
30
cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 363
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> SEQ ID NO: 23 <211> Comprimento: 318 <212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:
<223> Outras Informações: L373 - cadeia leve anti-CD20
<221> Nome/Chave: CDS <222> Localização: (1)...(318)
<400> Seqüência: 23
gac ate cag atg acc cag tet cca tcc tcc ctg tet gca tet gta gga 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
40 1 5 10 15
gac aga gtc acc ate act tgc cgg gca agt tcg age gtt agt tat ata 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 25 30
45
cat tgg ttt cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aaa ccc ctg ate tat 144
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr 40 45
50 gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc agt 192 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
gga tet ggg aca gat tac act ctc acc ate age agt ctg caa cct gag 240 55 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80
gat ttc gca act tac tac tgt caa cag tgg act tcc aac ccg ccc act 2 88 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 60 85 90 95 10
35
ttc ggc gga ggg acc aag ctc gag ate aaa 318
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> SEQ ID NO: 24 <211> Comprimento: 36 <212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:
<223> Outras Informações: CDR3 de H1569
<400> Seqüência: 24 tcgacttact acggcggtga ctggaacttc aataac 36
<210> SEQ ID NO: 25 <211> Comprimento: 36 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras Informações: CDR3 de H1570
<400> Seqüência: 25
tcgacttact acgccggtga ctggaacttc aataac 3 6
<210> SEQ ID NO: 26 <211> Comprimento: 3 6 <212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras Informações: CDR3 de H1571 <400> Seqüência: 26
tcgacttact acgccggtga ctggaacttc aatgac 3 6
<210> SEQ ID NO: 27 40 <211> Comprimento: 51 <212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características: 45 <223> Outras Informações: CDR2 de H1639
<400> Seqüência: 27
gctatttatc ccggaaatgg tgctacttcc tacaatcaga agttcaaagg c 51
50 <210> SEQ ID NO: 28
<211> Comprimento: 21 <212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial
55 <220> Características:
<223> Outras Informações: CDR2 de L373
<400> Seqüência: 28
gctgcatcca gtttgcaaag t 21
<210> SEQ ID NO: 29
60 <211> Comprimento: 121 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras Informações: H1286 - cadeia pesada anti-CD20
<400> Seqüência: 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
25
<210> SEQ ID NO: 30 <211> Comprimento: 12 <212> Tipo: PRT <213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras Informações: CDR3 de H1286
<400> Seqüência: 30
Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val 10

Claims (75)

1. Imunoglobulina que liga especificamente CD20, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina compreende pelo menos uma região de determinação da complementaridade (CDR) otimizada, onde dita região CDR é selecionada do grupo constituído pela SEQ ID SOE :1-8.
2. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina que compreende um domínio variável cuja CDR compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo constituído pela SEQ ID SOE :1-7.
3. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina compreende uma cadeia leve de imunoglobulina que compreende um domínio variável cuja CDR compreende uma seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:8.
4. Imunoglobulina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina é uma IgGl kappa.
5. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina compreende uma região constante da IgGl humana dentro de uma cadeia pesada da dita imunoglobulina e uma região constante kappa humana dentro de uma cadeia leve da dita imunoglobulina.
6. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina compreende totalmente ou parcialmente as regiões de estrutura humana dentro do domínio variável da dita cadeia pesada e dentro do domínio variável da dita cadeia leve.
7. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina compreende regiões de estrutura murina dentro do domínio variável da dita cadeia pesada e dentro do domínio variável da dita cadeia leve.
8. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina exibe citotoxicidade dependente do complemento (CDC) aumentada em comparação a Rituximab.
9. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a imunoglobulina compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:11.
10. imunoglobulina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por SEQ ID SOE :12-18.
11. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina compreende uma cadeia pesada que compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por seqüências estabelecidas no SEQ ID NO :12-18 e uma cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:10 OU SEQ ID NO:11.
12. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que dita cadeia pesada compreende a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:12 e dita cadeia leve compreende a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:10.
13. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que dita cadeia pesada compreende a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:13 e dita cadeia leve compreende a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:10.
14. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que dita cadeia pesada compreende a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:14 e dita cadeia leve compreende a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:10.
15. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que dita cadeia pesada compreende a seqüência estabelecida na SEQ ID NO: 15 e dita cadeia leve compreende a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:10.
16. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que dita cadeia pesada compreende a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:16 e dita cadeia leve compreende a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:10.
17 Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que dita cadeia pesada compreende a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:17 e dita cadeia leve compreende a seqüência estabelecida na SEQ ID NO : 10 .
18. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que dita cadeia pesada compreende a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:18 e dita cadeia leve compreende a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:10.
19. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que dita cadeia pesada compreende a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:13 e dita cadeia leve compreende a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:11.
20. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que dita cadeia pesada compreende a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:16 e dita cadeia leve compreende a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:11.
21. Imunoglobulina que liga especificamente CD20, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina compreende um domínio variável pesado (VH) , onde dito domínio VH inclui pelo menos uma região de determinação da complementaridade (CDR), selecionado a partir do grupo constituído por: a) uma CDRl compreendendo uma seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7; b) uma CDRl compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID: 7, onde dita CDRl compreende o resíduo de fenilalanina (Phe) na posição correspondente ao resíduo 7 da SEQ ID NO : 7; c) uma CDR2 compreendendo uma seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:6; d) uma CDR2 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID: 5 ou SEQ ID NO: 6, onde dita CDR2 compreende o resíduo de alanina (Ala) ou leucina (Leu) na posição correspondente ao resíduo 8 da SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:6, respectivamente; e) uma CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO:4; f) uma CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N0:1, onde dita CDR3 compreende pelo menos um resíduo selecionado do grupo constituído por: i) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 9 da SEQ ID NO:l; ii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 12 da SEQ ID N0:1; g) uma CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2, onde dita CDR3 compreende pelo menos um resíduo selecionado do grupo constituído por: i) o resíduo de alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 5 da SEQ ID NO:2; ii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 9 da SEQ ID NO: 2; iii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 12 da SEQ ID NO: 2; h) uma CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3, onde dita CDR3 compreende pelo menos um resíduo selecionado do grupo constituído por: i) o resíduo de alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 5 da SEQ ID NO: 3; ii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 9 da SEQ ID NO:3; e iii) o resíduo de ácido aspártico (Asp) na posição correspondente ao resíduo 12 da SEQ ID NO:3; e i) uma CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4, onde dita CDR3 compreende pelo menos um resíduo selecionado do grupo constituído por: i) o resíduo de alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 5 da SEQ ID NO: 4; ii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 9 da SEQ ID NO:4; iii) o resíduo de glicina (Gly) na posição correspondente ao resíduo 11 da SEQ ID NO:4; e iv) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 12 da SEQ ID NO:4.
22. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a imunoglobulina compreende uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo um domínio variável que tenha pelo menos uma CDR selecionada do grupo constituído por: a) uma CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 8; b) uma CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 8, onde dita CDR3 compreende o resíduo de glutamina (Gln) na posição correspondente ao resíduo 4 da SEQ ID NO:8, e c) uma CDR2 compreendendo uma seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:9.
23. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o domínio variável da dita cadeia leve compreende a CDR2 estabelecida na SEQ ID NO:9 e a CDR3 estabelecida na SEQ ID NO:8.
24. Imunoglobulina que liga especificamente CD20, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina compreende uma cadeia leve de imunoglobulina, dita cadeia leve de imunoglobulina compreendendo um domínio variável que tem uma região de determinação da complementaridade 3 (CDR3) selecionada do grupo constituído por: a) uma CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:8, e b) uma CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 8, onde dita CDR3 compreende o resíduo de glutamina (Gln) na posição correspondente ao resíduo 4 da SEQ ID NO:8.
25. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o domínio variável da dita cadeia leve compreende uma região de determinação da complementaridade 2 (CDR2) que contém a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:9.
26. Imunoglobulina de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina é uma imunoglobulina IgGl kappa.
27. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina compreende uma região constante IgGl humana dentro de uma cadeia pesada da dita imunoglobulina e uma região constante kappa humana dentro da uma cadeia leve da dita imunoglobulina.
28. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina compreende as regiões de estrutura humana totalmente ou parcialmente dentro do domínio variável da dita cadeia pesada e dentro do domínio variável da dita cadeia leve.
29. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina compreende as regiões de estrutura murina dentro do domínio variável da dita cadeia pesada e dentro do domínio variável da dita cadeia leve.
30. Uma imunoglobulina que liga especificamente CD2 0, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina compreende um domínio variável pesado (VH), onde dito domínio VH é selecionado do grupo constituído por: a) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 90% seqüência identidade para uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por SEQ ID SOE:12-18; b) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:12, onde dito domínio VH compreende pelo menos um resíduo selecionado do grupo constituído por: i) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO:12; e ii) o resíduo da asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 110 da SEQ ID NO:12; c) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:13, onde dito domínio VH compreende pelo menos um resíduo selecionado do grupo constituído por: i) o resíduo de alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO:13; ii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO:13; e iii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 110 da SEQ ID NO:13; d) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:14, onde dito domínio VH compreende pelo menos um resíduo selecionado do grupo constituído por: i) o resíduo de alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO:14; ii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO:14; e iii) o resíduo de ácido aspártico (Asp) na posição correspondente ao resíduo 110 de SEQ ID NO:14; e) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:15, onde dito domínio λ/Ή compreende pelo menos um resíduo selecionado a partir do grupo constituído por: i) o resíduo de fenilalanina (Phe) na posição correspondente ao resíduo 31 da SEQ ID NO:15; ii) o resíduo de alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO:15; iii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO:15; e iv) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 110 de SEQ ID NO:15; f) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:16, onde dito domínio λ/Η compreende pelo menos um resíduo selecionado do grupo constituído por: i) o resíduo de alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 57 da SEQ ID NO:16; ii) o resíduo de alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO:16; iii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO:16; e iv) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 110 de SEQ ID NO:16; g) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:17, onde dito domínio VH compreende pelo menos um resíduo selecionado do grupo constituído por: i) o resíduo de leucina (Leu) na posição correspondente ao resíduo 57 da SEQ ID NO:17; ii) o resíduo de alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO:17; iii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO:17; e iv) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 110 da SEQ ID NO:17; e h) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO-.18, onde dito domínio VH compreende pelo menos um resíduo selecionado do grupo constituído por: i) o resíduo de alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO:18; ii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO:18; iii) o resíduo de glicina (Gly) na posição correspondente ao resíduo 109 da SEQ ID NO:18; e iv) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 110 de SEQ ID NO:18.
31. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina compreende um domínio variável leve (VL), onde dito domínio VL é selecionado do grupo constituído por: a) um domínio VL compreendendo a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:11; b) um domínio VL compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 9 0% de identidade para a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:11; c) um domínio VL compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade para a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:10, onde dito domínio VL compreende a região de determinação da complementaridade2 (CDR2) estabelecida na SEQ ID NO:9; e d) um domínio VL compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade para a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:11, onde dito domínio VL compreende pelo menos um de: i) a região de determinação da complementaridade 2 (CDR2) estabelecida na SEQ ID NO:9; e ii) o resíduo de glutamina (Gln) na posição correspondente ao resíduo 91 da SEQ ID NO:11.
32. Imunoglobulina caracterizada por compreender um domínio variável pesado (VH) e um domínio variável leve (VL), onde dito domínio VH compreende um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos pelo menos 9 0% idêntica a uma seqüência selecionada do grupo que consiste das seqüências estabelecidas em SEQ ID SOE :12-18, e onde dita imunoglobulina se liga especificamente a CD20.
33. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que dito domínio VL compreende a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:11.
34. imunoglobulina caracterizada por compreender um domínio variável pesado (VH) e um domínio variável leve (VL), onde dito domínio VL compreende um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos pelo menos 9 0% idêntica a estabelecida na seqüência SEQ ID NO: 11, e onde dita imunoglobulina se liga especificamente a CD20.
35. Imunoglobulina caracterizada por compreender um domínio variável pesado (VH) e um domínio variável leve (VL) , onde dito domínio VH compreende um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por SEQ SOE :12-18, e onde dito domínio VL inclui um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:11.
36. Imunoglobulina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 35 e 67, caracterizada por incluir ainda um polipeptideo heterólogo fundido à mesma.
37. Imunoglobulina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 35 e 67, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina é conjugada a um agente selecionado do grupo constituído por um agente terapêutico, uma Prodroga, um peptídeo, uma proteína, uma enzima, um vírus, um lipídio, um modificador de resposta biológica, um agente farmacêutico, e PEG.
38. Composição caracterizada por compreender a imunoglobulina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 37, e um transportador.
39. Polinucleotídeo isolado caracterizado por compreender um ácido nucleico que codifica para um domínio variável pesado (VH) de uma cadeia pesada de imunoglobulina, onde dito domínio VH inclui pelo menos uma região de determinação da complementaridade (CDR) selecionada do grupo constituído por: a) uma CDRl compreendendo uma seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 7; b) uma CDRl compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID: 7, onde dita CDRl compreende o resíduo de fenilalanina (Phe) na posição correspondente ao resíduo 7 da SEQ ID NO : 7; c) uma CDR2 compreendendo uma seqüência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO: 6; d) uma CDR2 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID: 5 ou SEQ ID NO: 6, onde dita CDR2 compreende o resíduo de alanina (Ala) ou de leucina (Leu) na posição correspondente ao resíduo 8 da SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:6, respectivamente; e) uma CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, ou , SEQ ID NO:4; f) uma CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID N0:1, onde dita CDR3 compreende pelo menos um resíduo selecionado do grupo constituído por: i) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 9 de SEQ ID NO:1; ii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 12 da SEQ ID NO:1; g) uma CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2, onde dita CDR3 compreende pelo menos um resíduo selecionado do grupo constituído por: i) o resíduo de alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 5 de SEQ ID NO: 2; ii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 9 da SEQ ID NO:2; e iii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 12 da SEQ ID NO: 2; h) uma CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3, onde dita CDR3 compreende pelo menos um resíduo selecionado do grupo constituído por: i) o resíduo de alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 5 da SEQ ID NO:3; ii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 9 da SEQ ID NO:3; e iii) o resíduo de ácido aspártico (Asp) na posição correspondente ao resíduo 12 da SEQ ID NO:3; e i) uma CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 4, onde dita CDR3 compreende pelo menos um resíduo selecionado do grupo constituído por: i) o resíduo de alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 5 de SEQ ID NO:4; ii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 9 da SEQ ID NO: 4; iii) o resíduo de glicina (Gly) na posição correspondente ao resíduo 11 da SEQ ID NO:4; e iv) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente a 12 do resíduo SEQ ID NO:4; e onde uma imunoglobulina compreendendo o dito domínio VH se liga especificamente a CD20.
40. Polinucleotídeo isolado caracterizado por compreender um ácido nucleico que codifica para um domínio variável leve (VL) de uma cadeia leve de imunoglobulina, onde dito domínio VL compreende uma região de determinação da complementaridade 3 (CDR3) selecionada do grupo constituído por: a) uma CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:8, e b) uma CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 8, onde dita CDR3 compreende o resíduo de glutamina (Gln) na posição correspondente ao resíduo 4 da SEQ ID NO: 8; onde uma imunoglobulina compreendendo o dito domínio VL se liga especificamente a CD20.
41. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 40, caracterizados pelo fato de que dito domínio VL compreende uma CDR2 com seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:9.
42. Polinucleotídeo isolado caracterizado por compreender um ácido nucleico que codifica para um domínio variável pesado (VH) de uma cadeia de imunoglobulina, onde dito domínio VH é selecionado do grupo constituído por: a) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 90% de identidade com uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo constituído por SEQ ID SOE :12-18; b) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:12, onde dito domínio VH compreende pelo menos um resíduo selecionado do grupo constituído por: i) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO:12; e ii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 110 de SEQ ID NO:12; c) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:13, onde dito domínio VH compreende pelo menos um resíduo selecionado do grupo constituído por: i) o resíduo de alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO:13; ii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO:13; e iii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 110 de SEQ ID NO:13; d) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:14, onde dito domínio VH compreende pelo menos um resíduo selecionado do grupo constituído por: i) o resíduo de alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO:14; ii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO:14; e iii) o resíduo de ácido aspártico (Asp) na posição de resíduos correspondentes ao resíduo 110 de SEQ ID NO:14; e) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:15, onde dito domínio VH compreende pelo menos um resíduo selecionado do grupo constituído por: i) o resíduo de fenilalanina (Phe) na posição correspondente ao resíduo 31 da SEQ ID NO:15; ii) o resíduo de alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO:15; iii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO:15; e iv) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 110 de SEQ ID NO:15; f) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:16, onde dito domínio VH compreende pelo menos um resíduo selecionado do grupo constituído por: i) o resíduo de alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 57 da SEQ ID NO:16; ii) o resíduo de alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO:16; iii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO:16; e iv) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 110 de SEQ ID NO:16; g) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:17, onde dito domínio VH compreende pelo menos um resíduo selecionado do grupo constituído por: i) o resíduo de leucina (Leu) na posição correspondente ao resíduo 57 da SEQ ID NO:17; ii) o resíduo de alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO:17; iii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO:17; e iv) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 110 de SEQ ID NO:17; e h) um domínio VH compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:18, onde dito domínio VH compreende pelo menos um resíduo selecionado do grupo constituído por: i) o resíduo de alanina (Ala) na posição correspondente ao resíduo 103 da SEQ ID NO:18; ii) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 107 da SEQ ID NO:18; e iii) o resíduo de glicina (Gly) na posição correspondente ao resíduo 109 de SEQ ID NO:18; e iv) o resíduo de asparagina (Asn) na posição correspondente ao resíduo 110 de SEQ ID NO:18; onde uma imunoglobulina compreendendo o dito domínio VH se liga especificamente a CD20.
43. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que dito domínio VH compreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste da SEQ ID SOE :19-22.
44. Polinucleotídeo isolado caracterizado por compreender um ácido nucleico que codifica para um domínio variável leve (VL) de uma cadeia leve de imunoglobulina, onde dito domínio VL é selecionado do grupo constituído por: a) um domínio VL compreendendo a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:11; b) um domínio VL compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 90% de identidade com a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:11; c) um domínio VL compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência estabelecida no SEQ ID NO:10, onde dito domínio VL compreende a região de determinação da complementaridade 2 (CDR2) estabelecida na SEQ ID NO:9; e d) um domínio VL compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade para a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:11, onde dito domínio VL compreende pelo menos um de: i) a região de determinação da complementaridade 2 (CDR2) estabelecida na SEQ ID NO:9; e ii) o resíduo de glutamina (Gln) na posição correspondente ao resíduo 91 do SEQ ID NO:11; onde uma imunoglobulina compreendendo o dito domínio VL se liga especificamente a CD20.
45. Composição caracterizada por compreender o polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 44.
46. Vetor caracterizado por compreender o polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 44.
47. Vetor de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que dito polinucleotídeo está operacionalmente associado a um promotor.
48. Vetor caracterizado por compreender o polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 39, 42 e 43, e um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico que codifica para um domínio variável leve (VL) de uma cadeia leve de imunoglobulina.
49. Vetor de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que dito domínio VL compreende uma região de determinação da complementaridade 3 (CDR3) com a seqüência aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:8.
50. Vetor de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que dito domínio VL compreende uma região de determinação da complementaridade 2 (CDR2) com a seqüência aminoácido estabelecida na SEQ ID NO:9.
51. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 50, caracterizado pelo fato de que dito polinucleotideo codificador do dito domínio VH e o dito polinucleotídeo codificador do dito domínio VL são fundidos na mesma matriz de leitura, são co-transcritos a partir de um único promotor operacionalmente associado a ele, e são cotraduzidos em uma única cadeia de anticorpo ou fragmento ligador de antígeno.
52. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 50, caracterizado pelo fato de que dito polinucleotídeo codificador do dito domínio VH e o dito polinucleotídeo codificador do dito domínio VL são co- transcritos a partir de um único promotor operacionalmente associado a ele, mas que são traduzidos em separado.
53. Vetor de acordo com a reivindicação 52, caracterizado por incluir ainda uma seqüência IRES disposta entre o dito polinucleotídeo codificador do dito domínio VH e o dito polinucleotídeo codificador do dito domínio VL.
54. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 50, caracterizado pelo fato de que dito polinucleotídeo codificador do dito domínio VH e o dito polinucleotídeo codificador do dito domínio VL são transcritos separadamente, cada um deles sendo operacionalmente associado com um promotor separado.
55. Vetor de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que ditos promotores separados são cópias do mesmo promotor.
56. Vetor de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que ditos promotores separados não são idênticos.
57. Composição caracterizada por compreender o vetor de qualquer uma das reivindicações 46 através 56.
58. Composição caracterizada por compreender a imunoglobulina de acordo com a reivindicação 1.
59. Método para obter uma célula hospedeira caracterizado por compreender as seguintes etapas: (i) transfectar a referida célula hospedeira com o polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 3 9 a 44, e (ii) cultivar a referida célula hospedeira transfectada sob condições convencionais.
60. Método para obter uma célula hospedeira caracterizado por compreender as seguintes etapas: (i) transfectar a referida célula hospedeira com o vetor de qualquer uma das reivindicações 46 a 56, e (ii) cultivar a referida célula hospedeira transfectada sob condições convencionais.
61. Método de produção de uma i muno g Iobu li na que liga especificamente CD2 0, caracterizado por compreender cultivo da célula hospedeira da reivindicação 59 ou 60, e recuperação da dita imunoglobulina.
62. Imunoglobulina caracterizada por ser produzida pelo método da reivindicação 61.
63. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina é uma imunoglobulina IgGl kappa.
64. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 63, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina compreende uma região constante da IgGl humana dentro da cadeia pesada da dita imunoglobulina e uma região constante kappa humana dentro da cadeia leve da dita imunoglobulina.
65. Imunoglobulina de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina humana inclui total ou parcialmente regiões de estrutura humana dentro do domínio VH da referida cadeia pesada e dentro do domínio VL da dita cadeia leve.
66. Imunoglobulina de açodo com a reivindicação 64, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina compreende as regiões de estrutura murina dentro do domínio VH da dita cadeia pesada e dentro do domínio VL da dita cadeia leve.
67. Imunoglobulina que liga especificamente CD20, caracterizada pelo fato de que dita imunoglobulina compreende um domínio variável leve (VL), onde dito domínio VL é selecionado do grupo constituído por: a) um domínio VL compreendendo a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:11; b) um domínio VL compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 90% de identidade com a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:11; c) um domínio VL compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:10, onde dito domínio VL compreende os CDR2 estabelecidos na SEQ ID NO:9; e d) um domínio VL compreendendo uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 85% de identidade com a seqüência estabelecida na SEQ ID NO:11, onde dito domínio VL compreende pelo menos um de: i) uma CDR2 estabelecida na SEQ ID NO:9; e ii) o resíduo de glutamina (Gln) na posição correspondente ao resíduo 91 da SEQ ID NO:11.
68. Uso de imunoglobulina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37 e 67 caracterizado por ser para a produção de uma composição para tratar um câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que o câncer está associado com células expressando CD2 0 no dito indivíduo.
69. Uso de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que dito câncer é selecionado a partir do grupo constituído por um Iinfoma não-Hodgkins, leucemia linfocítica crônica, mieloma múltiplo, Iinfoma de células B de alto grau, linfoma das células B de intermediário grau, linfoma das células B de baixo grau, leucemia linfóide aguda de células B, leucemia mielóide, e doença de Hodgkin.
70. Método para inibir o crescimento ou diferenciação de uma célula B humana normal, caracterizado por compreender contato da dita célula B com uma quantidade efetiva da imunoglobulina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 37 e 67.
71. Uso da imunoglobulina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 37 e 67, caracterizado por ser para a produção de uma composição compreendendo uma quantidade efetiva das referidas imunoglobulinas para inibir o crescimento das células cancerosas da linhagem das células B.
72. Uso de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que as células cancerosas são provenientes de um câncer selecionado a partir do grupo constituído de linfoma não-Hodgkin, leucemia linfocítica crônica, mieloma múltiplo, linfoma de células B de alto grau, linfoma de células B com grau intermediário, Iinforna de células B baixo grau, leucemia Iinfóide aguda de células B, leucemia mielóide, e doença de Hodgkin.
73. Uso de uma quantidade efetiva de imunoglobulina de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 37 e 67 caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratar uma doença auto-imune ou doença inflamatória em um indivíduo, em que dita doença é associada a células expressando CD2 0 no referido indivíduo.
74. Uso de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que dita doença auto-imune ou doença inflamatória é selecionada a partir do grupo constituído de lúpus eritematoso sistêmico (LES), lúpus discóide, nefrite lúpica, sarcoidose, artrite juvenil, artrite reumatóide, artrite psoriática, Síndrome de Reiter, anquilosantes espondilite, artrite gotosa, a rejeição de órgãos ou tecidos transplantados, doença enxerto versus hospedeiro, esclerose múltipla, síndrome de hiper IgE, poliarterite nodosa, cirrose biliar primária, doença inflamatória intestinal, doença de Crohn, a doença celíaca (enteropatia por sensibilidade ao glúten) , hepatite autoimune, anemia perniciosa, anemia hemolítica auto-imune, psoríase, esclerodermia, miastenia gravis, púrpura trombocitopênica autoimune, tiroidite autoimune, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto, doença complexa imune, síndrome de fadiga crônica disfunção imune (CFIDS), polimiosite e dermatomiosite, crioglobulinemia, trombólise, cardiomiopatia, pênfigo vulgar, fibrose pulmonar intersticial, sarcoidose, diabetes mellitus tipo I e tipo II, hipersensibilidade retardada tipo 1, 2, 3 e 4, alergias ou doenças alérgicas, a asma, síndrome de Churg-Strauss (granulomatose alérgica) , dermatite atópica, dermatite alérgica e de contato irritativa, urtecaria, alergias mediadas por IgE, aterosclerose, vasculite, miopatias inflamatórias idiopáticas, doença hemolítica, doença de Alzheimer, e polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica.
75. Composição farmacêutica caracterizada por compreender a imunoglobulina, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 37 e 67.
BRPI0717363A 2006-10-10 2007-10-10 imunoglobina humanizada que liga especificamente cd20, composição, vetor recombinante, métodos para obter uma célula hospedeira, de produção de uma imunoglobina que liga especificamente cd20, in viro para inibir o crescimento ou diferenciação de uma célula b humana normal e usos de imunoglobina e de uma quantidade efetiva de imunoglobina BRPI0717363B8 (pt)

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