BRPI1012216B1 - Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao cd100, composições que compreendem os mesmos, polinucleotídeo e uso do dito anticorpo ou fragmento para tratar uma doença autoimune,doença inflamatória ou câncer - Google Patents

Abstract

anticorpos anti-cd100 e métodos para usar os mesmos. são providas composições e métodos para tratar doenças associadas com cd100, incluindo certas doenças autoimunes, doenças inflamatórias e cânceres. em particular, foram desenvolvidos anticorpos monoclonais anti-cd100 para neutralizar cd100.

Description

Antecedentes da Invenção

[001] CD100, também conhecido como semaforina 4D (SEMA4D), é uma proteína transmembrana (por exemplo, SEQ ID NO: 1 (humano); SEQ ID NO: 2 (murino)) que pertence à família do gene de semaforina. CD100 é expressa na superfície celular como um homodímero, mas, mediante ativação de célula CD100, pode ser liberada da superfície celular por meio de clivagem proteolítica para gerar sCD100 ativa, uma forma solúvel da proteína. Vide Suzuki et al., Nature Rev. Immunol. 3:159-167 (2003); Kukutani et al., Nature Immunol. 9:17-23 (2008).

[002] CD100 foi primeiro identificada gerando dois anticorpos monoclonais de camundongo, BD 16 e BB 18, contra clones de célula T humana ativada (Herold et al., Int. Immunol. 7:1-8 (1994)). CD100 foi o primeiro exemplo de uma semaforina expressa no sistema imune. CD100 é expressa abundantemente na superfície de células T em repouso, e fracamente nas células B em repouso, monócitos e células que apresentam antígeno profissional, tais como células dendríticas (DCs). A ativação de célula pode estimular suprarregulação de expressão de superfície de CD100 nas células B e DCs, bem como a geração de sCD100. Considera-se que CD100 funcione tanto como um receptor, cujos sinais atravessam seu domínio citoplasmático, quanto como um ligante (Hall et al., PNAS 93:11780-11785 (1996)). Um dos receptores identificados para CD100 é Plexina-B1. Plexina-B1 é expressa em tecidos não linfóides e é um receptor de alta afinidade (1 nM) para CD100 (Tamagnone et al., Cell 99:71-80 (1999)).

[003] CD100 é um importante mediador de ativação de célula T e célula B. Camundongos CD100 knockout (CD100-/-) têm respostas do anticorpo reduzidas para antígenos dependentes de T e sensibilização célula T prejudicada. Ambas as funções são restauradas mediante a administração de sCD100 (Shi et al., Immunity 13:633642 (2000)).

[004] Além dos efeitos demonstrados de CD100 nas células imunes, CD100 também parece desempenhar um papel direto na desmielinização e degeneração axonal observadas em doenças neuroinflamatórias. A patogênese de doenças inflamatórias desmielinizantes, tal como MS, inclui tanto uma fase inflamatória envolvendo células imunes bem como fases de desmielinização seletiva quanto neurodegeneração. CD100 é expressa em oligodendrócitos do sistema nervoso central (CNS) e é um inibidor de regeneração axonal. A expressão de CD100 é suprarregulada em oligoden- drócitos na periferia de lesões da medula espinhal (Moreau-Fauvarque et al., J. Neuroscience 23:9229-9239 (2003)). A cultura de células T cronicamente ativadas que expressam sCD100 com precursores neurais multipotentes humanos ou oligodendró- citos primários de cérebro de rato induz apoptose e colapso de extensão do processo (Giraudon et al., J. Immunol. 172:1246-1255 (2004); Giraudon et al., NeuroMolecular Med. 7:207-216 (2005)). Apoptose induzida por CD100 de precursores neurais pode ser inibida pelo anticorpo BD 16 anti-CD100.

[005] Camundongos knockout CD100 são resistentes o desenvolvimento de encefalomielite alérgica experimental (EAE), que é um modelo de camundongo para esclerose múltipla de humano (MS) (Kumanogoh et al, J. Immunol. 759:1175-1181 (2002)).

[006] Inúmeros outros estudos demonstraram que CD100 induz colapso do cone de crescimento em neurônios, e, adicionalmente em suporte da relevância funcional de CD100 em neuroinflamação, reportou-se que existem níveis altamente elevados de sCD100 em fluido cerebroespinhal (CSF) de pacientes de mielopatia/para- paresia espástica tropical (HAM/TSP) associado ao HTLV-1. Assim, existe um efeito deletério direto de sCD100 em oligodendrócito e integridade do precursor neural e CD100 pode desempenhar um papel patogênico em desmielinização. Como um mediador importante tanto de respostas inflamatórias quanto desmielinização direta, existe uma necessidade na técnica de moléculas neutralizantes de CD100, por exemplo, anticorpos de anti-CD100, para tratamento de doenças inflamatórias e desmieli- nizantes.

[007] CD100 é também uma molécula pró-angiogênica potente. A ativação de Plexina-B1 através da ligação de CD100 transativa c-Met e promove a capacidade invasiva de células tumorais e promove angiogênese tanto in vitro quanto in vivo. Análise imunohistoquímica de CD100 em uma grande coleção de amostras de tumor revelou que sobre-expressão de CD100 é um evento muito frequente em cânceres de cabeça e pescoço, próstata, cólon, mama e pulmão.

[008] Sinalização de CD100/Plexina B1 também mostrou induzir migração de células endoteliais e promover migração de células tumorais (Conrotto et al., Blood 705:4321-4329 (2005); Giordano et al., Nature Cell Biology 4:720-724 (2002)). Migração de célula endotelial induzida por CD100 é prevenida por anticorpos de bloqueio de CD100 e por CD100 nocaute. Expressão de CD100 nocaute em células de carci- oma de célula escamosa da cabeça e pescoço (HNSCC) com RNA tipo alça curta de CD100 (shRNA) antes do enxerto nos camundongos nude causou uma redução drástica em vascularidade do tumor e crescimento do tumor (Basile et al., PNAS 103:90179022 (2006)). Relatórios apontaram recentemente para uma alta correlação entre infiltração inflamatória do estroma tumoral e um alto grau vascular. CD100 é produzido por células inflamatórias presentes no microambiente tumoral. Em um ambiente que não tem CD100, a capacidade de células cancerígenas da mama de camundongo originar massas e metástases tumorais foi severamente prejudicada, e a fonte de CD100 foram macrófagos associados ao tumor (Sierra et al., JEM 205: 1673-1685 (2008)). Assim, existe adicionalmente uma necessidade na técnica para moléculas neutralizantes de CD100, por exemplo, anticorpos de anti-CD100, para o tratamento de câncer de CD100.

Campo da Invenção

[009] A invenção diz respeito a anticorpos neutralizantes de CD100, por exemplo, anticorpos monoclonais humanizados, métodos de usar os anticorpos, e métodos para tratamento de condições e doenças associadas com células que expressam CD100.

Sumário da Invenção

[010] São providos composições e métodos para tratar doenças associadas com CD100, incluindo tais como certos tipos de doenças autoimunes, doenças inflamatórias, cânceres e angiogênese invasivas. Em particular, anticorpos monoclonais anti-CD100 foram desenvolvidos para neutralizar CD100. Camundongo MAb 67 de-monstraram a capacidade de bloquear atividade de CD100 in vitro, e reduzir a severidade de sinais clínicos de encefalomielite alérgica experimental (EAE), artrite induzida por colágeno (CIA), e câncer em modelo de camundongos. MAb 2503 é uma versão humanizada de MAb 67 que demonstrou maior afinidade com CD100 de humano e murino e atividade de bloqueio de CD100 similar como 67 MAb.

[011] Em uma modalidade, a invenção diz respeito a uma molécula de ligação isolada que liga especificamente ao mesmo epítopo de CD100 como um anticorpo monoclonal de referência selecionado do grupo que consiste em 2503, 67, ou 76.

[012] Em uma outra modalidade, a invenção diz respeito a uma molécula de ligação isolada que liga especificamente a CD100, em que a dita molécula de ligação inibe competitivamente um anticorpo monoclonal de referência selecionado do grupo que consiste em 2503, 67, ou 76 a partir de ligação especificamente em CD100.

[013] Em uma outra modalidade, a invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antígeno que liga especificamente a CD100, em que o dito anticorpo ou fragmento deste é anticorpo monoclonal 2503, 67, ou 76.

[014] Em certas modalidades, o anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antígeno, da invenção que liga especificamente a CD100, compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 25. Em um outro aspecto da invenção, a VH do dito anticorpo ou fragmento deste compreende uma sequência de aminoácidos idêntica, exceto por 20 ou menos substituições de amino- ácido conservativas, à SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 25. Ainda em um outro aspecto da invenção, a VH do dito anticorpo ou fragmento deste compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 25.

[015] Em certas modalidades, o anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antígeno, da invenção que liga especificamente a CD100, compreende uma região variável de cadeia leve (VL) que tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, ou SEQ ID NO: 29. Em um outro aspecto da invenção, a VL do dito anticorpo ou fragmento deste compreende uma sequência de aminoácidos idêntica, exceto por 20 ou menos substituições de aminoácido con- servativas, à SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, ou SEQ ID NO: 29. Ainda em um outro aspecto da invenção, a VL do dito anticorpo ou fragmento deste compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, ou SEQ ID NO: 29.

[016] Em uma outra modalidade, a invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antígeno que liga especificamente a CD100, em que a VH do dito anticorpo ou fragmento deste compreende pelo menos uma das seguintes CDRs: uma sequência de aminoácidos da região-1 determinante de com- plementariedade de cadeia pesada Chothia- Kabat (VH-CDR1) idêntica, exceto por duas ou mais substituições de aminoácido, à SEQ ID NO: 6, uma sequência de ami- noácidos da região-2 determinante de complementariedade de cadeia pesada Kabat (VH-CDR2) idêntica, exceto por quatro ou mais substituições de aminoácido, à SEQ ID NO: 7, ou uma sequência de aminoácidos da região-3 determinante de comple- mentariedade de cadeia pesada Kabat (VH-CDR3) idêntica, exceto por duas ou mais substituições de aminoácido, à SEQ ID NO: 8.

[017] Em uma outra modalidade, a invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antígeno que liga especificamente a CD100, em que a VL do dito anticorpo ou fragmento deste compreende pelo menos uma das seguintes CDRs: uma sequência de aminoácidos da região-1 determinante de comple- mentariedade de cadeia leve Kabat (VL-CDR1) idêntica, exceto por quatro ou mais substituições de aminoácido, à SEQ ID NO: 14, uma sequência de aminoácidos da região-2 determinante de complementariedade de cadeia leve Kabat (VL-CDR2) idêntica, exceto por duas ou mais substituições de aminoácido, à SEQ ID NO: 15, ou uma sequência de aminoácidos da região-3 determinante de complementariedade de ca-deia leve Kabat (VL-CDR3) idêntica, exceto por duas ou mais substituições de amino- ácido, à SEQ ID NO: 16.

[018] Em um outro aspecto, a VH de um anticorpo ou fragmento deste da invenção compreende sequências de aminoácidos VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 compreendendo SEQ ID NOs: 6, 7, e 8, respectivamente, exceto por quatro ou mais substituições de aminoácido em uma ou mais das ditas VH-CDRs. Em um aspecto adicional, as sequências de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2 e VH- CDR3 são SEQ ID NOs: 6, 7 e 8, respectivamente.

[019] Em um outro aspecto, a VL de um anticorpo ou fragmento deste da invenção compreende sequências de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 compreendendo SEQ ID NOs: 14, 15, e 16, respectivamente, exceto por quatro ou mais substituições de aminoácido em uma ou mais das ditas VL-CDRs. Em um aspecto adicional, as sequências de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2, e VL- CDR3 são SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente.

[020] Em uma outra modalidade, a invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antígeno que liga especificamente a CD100, em que a VH do dito anticorpo ou fragmento deste compreende pelo menos uma das seguintes CDRs: uma sequência de aminoácidos da região-1 determinante de com- plementariedade de cadeia pesada Kabat (VH-CDR1) idêntica, exceto por duas ou mais substituições de aminoácido, à SEQ ID NO: 26, uma sequência de aminoácidos da região-2 determinante de complementariedade de cadeia pesada Kabat (VH- CDR2) idêntica, exceto por quatro ou mais substituições de aminoácido, à SEQ ID NO: 27, ou uma sequência de aminoácidos da região-3 determinante de complemen- tariedade de cadeia pesada Kabat (VH-CDR3) idêntica, exceto por duas ou mais substituições de aminoácido, à SEQ ID NO: 28.

[021] Em uma outra modalidade, a invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antígeno que liga especificamente a CD100, em que a VL do dito anticorpo ou fragmento deste compreende pelo menos uma das seguintes CDRs: uma sequência de aminoácidos da região-1 determinante de comple- mentariedade de cadeia leve Kabat (VL-CDR1) idêntica, exceto por quatro ou mais substituições de aminoácido, à SEQ ID NO: 30, uma sequência de aminoácidos da região-2 determinante de complementariedade de cadeia leve Kabat (VL-CDR2) idêntica, exceto por duas ou mais substituições de aminoácido, à SEQ ID NO: 31, ou uma sequência de aminoácidos da região-3 determinante de complementariedade de ca-deia leve Kabat (VL-CDR3) idêntica, exceto por duas ou mais substituições de amino- ácido, à SEQ ID NO: 32.

[022] Em um outro aspecto, a VH de um anticorpo ou fragmento deste da invenção compreende sequências de aminoácidos VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 compreendendo SEQ ID NOs: 26, 27, e 28, respectivamente, exceto por quatro ou mais substituições de aminoácido em uma ou mais das ditas VH-CDRs. Em um aspecto adicional, as sequências de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2 e VH- CDR3 são SEQ ID NOs: 26, 27, e 28, respectivamente.

[023] Em um outro aspecto, a VL de um anticorpo ou fragmento deste da invenção compreende sequências de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 compreendendo SEQ ID NOs: 30, 31, e 32, respectivamente, exceto por quatro ou mais substituições de aminoácido em uma ou mais das ditas VL-CDRs. Em um aspecto adicional, as sequências de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2 e VL- CDR3 são SEQ ID NOs: 30, 31, e 32, respectivamente.

[024] Em um outro aspecto, um anticorpo ou fragmento deste da invenção liga a CD100 de humano e murino. Em um outro aspecto, o anticorpo ou fragmento deste da invenção liga especificamente a um polipeptídeo de CD100 ou seu fragmento, ou um polipeptídeo variante de CD100 com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação (KD) não maior que 5x10-2 M, 10-2 M, 5x10-3M, 10-3M, 5x10-4 M, 10-4 M, 5x10-5 M, 10-5 M, 5x10-6 M, 10-6 M, 5x10-7 M, 10-7 M, 5x10-8 M, 10-8 M, 5x10-9 M, 10-9 M, 5x10-10 M, 10-10 M, 5x10-11 M, 10-11 M, 5x10-12 M, 5,7x10-12 M, 8,4x10-12 M, 10-12 M, 5x10-13 M, 10-13 M, 5x10- 14 M, 10-14 M, 5x10-15 M, ou 10-15 M. Em certos aspectos, o polipeptídeo de CD100 ou seu fragmento, ou um polipeptídeo variante de CD100 é humano ou murino. Em aspectos adicionais, um polipeptídeo de CD100 ou seu fragmento, ou um polipeptídeo variante de CD100 é humano e a dita KD é cerca de 5x10-9 M a cerca de 6x10-9 M. Ainda em um outro aspecto, um polipeptídeo de CD100 ou seu fragmento, ou um polipeptídeo variante de CD100 é murino e o dita KD é cerca de 1x10-9 M a cerca de 2x10-9 M.

[025] Em um outro aspecto, o anticorpo ou fragmento deste da invenção é humanizado, primatizado ou quimérico.

[026] Em uma outra modalidade, a invenção diz respeito a uma composição compreendendo um anticorpo ou fragmento deste da invenção, e um carreador.

[027] Em uma outra modalidade, a invenção diz respeito a um polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo da VH ou VL de anticorpo da invenção. Em um outro aspecto, o polinucleotídeo da invenção compreende ou consiste em um ácido nucléico que codifica um anticorpo ou fragmento deste da invenção. Ainda em um outro aspecto, a invenção diz respeito a um vetor compreendendo um polinucleotídeo da invenção. Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a uma célula hospedeira compreendendo o vetor da invenção. Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a um método de produzir um anticorpo da invenção.

[028] Em uma outra modalidade, a invenção diz respeito a um método para tratar uma doença autoimune ou uma doença inflamatória em um animal que necessita de tratamento, compreendendo administrar ao dito animal uma composição compreendendo: o anticorpo isolado ou seu fragmento da invenção e um carreador farma- ceuticamente aceitável. Em modalidades adicionais, a doença autoimune ou doença inflamatória é esclerose múltipla ou artrite.

[029] Em uma outra modalidade, a invenção diz respeito a um método para tratar um câncer em um animal que necessita de tratamento, compreendendo administrar ao dito animal uma composição compreendendo: o anticorpo isolado ou seu fragmento da invenção e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[030] Em uma outra modalidade, a invenção diz respeito a um método para inibir angiogênese em um animal que necessita de tratamento para câncer, compreendendo administrar ao dito animal uma composição compreendendo: o anticorpo isolado ou seu fragmento da invenção e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[031] Em um aspecto adicional, o anticorpo ou fragmento deste da invenção inibe ligação de CD100 em um receptor de CD100. Ainda em um outro aspecto da invenção, o receptor de CD100 é Plexina-B1.

Descrição Resumida dos Desenhos/Figuras

[032] Figura 1. Diagrama de ensaio de bloqueio de CD100. CD100-His mostrado ligando em Plexina B1 na superfície celular de uma Plexina B1 que expressa linhagem celular estável (293/Plexina). O CD100-His que é ligado na Plexina B1 é detectado usando um anticorpo monoclonal específico anti-His tag biotina conjugado e estreptavidina-APC. MAbs anti-CD100 que são capazes de bloquear ligação de CD100-His em Plexina B1 resultam em baixa fluorescência associada com as células 293/Plexina as medidas por citometria de fluxo.

[033] Figura 2. Estão mostrados resultados de citometria de fluxo para coelho anti-His + estreptavidina-APC (Rb anti- his +sAPC), CD100 de camundongo(somente muCD100), CD100 de camundongo+ 0,625 μg/mL MAb (67 MAb, MAb 76, e isótipo mIgG), e CD100 de camundongo+ 0,156 μg/mL MAb (67 MAb, MAb 76, e isótipo mIgG) testados no ensaio de bloqueio de CD100 descrito na figura 1. Anticorpos mo- noclonais 67 e 76 bloqueiam ligação de CD100 de camundongo no receptor de Ple- xina B1.

[034] Figura 3. Anticorpos monoclonais 67 e 76 bloqueiam desanexação mediada por CD100 de camundongo de células 293/Plexina B a partir de uma placa revestida com fibronectina, conforme mostrado por um aumento em absorbância tanto para MAbs 67 (67-2) quanto 76 (76-1) comparado com controle de isótipo.

[035] Figura 4. Tratamento com 30 mg/kg de MAb anti-CD100 76 (1x/semana ou 2x/semana) ou MAb 67 (1x/semana ou 2x/semana) atenua EAE recorrente remi- tente em camundongos SJL comparado com tratamento com controle de IgG de camundongo conforme mostrado por redução na pontuação clínica (4A). Os resultados são adicionalmente ilustrados comparando a redução de porcentagem Média de Pontuação do Grupo (GMS) para cada tratamento com MAb entre o dia 21 e o final do estudo (4B).

[036] Figura 5. Tratamento com 30 mg/kg de MAb anti-CD100 76 (1x/semana) ou MAb 67 (1x/semana) atenua EAE recorrente remitente em camundongos SJL comparado com tratamento com controle de IgG de camundongo conforme mostrado por redução na pontuação clínica (5A). Os resultados são adicionalmente ilustrados comparando a redução de porcentagem em Média de Pontuação do Grupo (GMS) tanto para tratamentos com MAb entre o dia 18 quanto final do estudo (5B).

[037] Figura 6. Tratamento com 30 mg/kg de MAb anti-CD100 67 começando no dia 7 pós-imunização (1x/semana) atenua EAE recorrente remitente em camundongos SJL comparado com tratamento com controle de IgG de camundongo conforme mostrado por redução em pontuação clínica.

[038] Figura 7. Resultados ELISA mostrando porcentagem de bloqueio (%) de ligação 67 biotinilada no CD100 de humano (7A) ou CD100 de camundongo (7B) devido a ligação de MAb competitiva 2503, 67 MAb, ou controle de IgG.

[039] Figura 8. Estão mostrados resultados de citometria de fluxo para estrep- tavidina-APC (sAPC somente), CD100 de humano (huCD100), CD100 de sagui (mar- mCD100), CD100 de camundongo (muCD100), 1,0 μg de isótipo, e 1,0 μg de MAb (67 ou 2503) testados no ensaio de bloqueio de CD100 descrito na figura 1. MAb 67 e MAb 2503 bloqueiam CD100 de humano (8A), CD100 de sagui (8B), ou camundongo (8C) a partir de ligação no receptor de Plexina B1.

[040] Figura 9. É mostrada uma redução bloqueada em absorbância causada por CD100 devido a neutralização de CD100 por 67 MAb, MAb 2503, e controle de IgG. MAb anti-CD100 67 e MAb 2503 bloqueiam desanexação mediada de CD100 de humano (9A) e CD100 de sagui (9B) de células 293/Plexina a partir de uma placa revestida com fibronectina.

[041] Figura 10. É mostrada a mudança no volume do tumor (mm3) para camundongos Balb/c e camundongos CD100-/- tipo selvagem depois de 50.000 células tumorais do cólon CT26 terem sido injetadas no músculo da perna dos camundongos.

[042] Figura 11. É mostrada a mudança no volume médio da perna (mm3) para camundongos Balb/c tipo selvagem tratados com 1 mg de MAb 67 ou 1 mg controle de IgG de camundongo e camundongos CD100-/- ("KO") depois de 50.000 células tumorais CT26 terem sido injetadas no músculo da perna dos camundongos.

[043] Figura 12. Um esquema mostrando uma estratégia de tratamento geral para Artrite Induzida por Colágeno (CIA)

[044] Figura 13. Foi mostrada redução no desenvolvimento na doença de artrite em modelo de CIA para grupos tratados com 600 μg de 67 MAb. Índice artrítico (AI) em camundongos tratados com 600 μg de MAb 67 foi comparado com AI em camundongos tratados com 600 μg controle negativo (IgG1) e 600 μg etanercepte de controle positivo (Enbrel®) quando tratamento começou no dia 20 (13A). Resultados de índice artrítico (AI) para tratamento com MAb 67 foram comparados com tratamento com um controle negativo (IgG1) e etanercepte de controle positivo (Enbrel®) quando o tratamento foi iniciado tanto no dia 20 quanto quando o AI foi >3 (13B).

[045] Figura 14. Em camundongos Balb/c imunizados com (4-hidróxi-3-nitro- fenil) gama globulina de galinha conjugada com acetila precipitada com tratamento de alume (hidróxido de alumínio-/magnésio) ("NP-CGG"), com 600 μg de MAb 67 diminuiu o número de células B do centro germinal (GC) ("B220+CD38lowPNA+") no baço (SP) e linfonódulos (LN) tanto depois da imunização primária (14A) quanto imunização secundária (14B). Resultados são também mostrados para camundongos CD100 -/e camundongos Balb/c com e sem imunização NP-CGG.

[046] Figura 15. É mostrada a mudança no volume do tumor (mm3) para camundongos Balb/c tipo selvagem depois de 50.000 células tumorais do cólon CT26 terem sido injetadas no músculo da perna dos camundongos. Resultados estão mostrados para camundongos injetados com 1 mg de MAb 67 começando semanalmente no dia 1 comparados com camundongos injetados com controle de IgG. O estudo foi realizado até um ponto final de atraso do crescimento do tumor.

[047] Figura 16. É mostrada a mudança no volume do tumor (mm3) para camundongos Balb/c e camundongos CD100-/- tipo selvagem ("SEMA4D-/-") depois de 50.000 células tumorais fibroblásticas BCA34 foram s.c. injetadas na região abdominal dos camundongos (16A). A mudança no volume médio da coxa (mm3) está mostrada para camundongos Balb/c tipo selvagem tratados com 1 mg MAb 67 ou 1 mg de controle de IgG de camundongo depois de 50.000 células tumorais fibroblásticas BCA34 terem sido injetadas no músculo da perna dos camundongos (16B).

[048] Figura 17. É mostrada a mudança no volume do tumor (mm3) para camundongos Balb/c e camundongos CD100-/- tipo selvagem ("SEMA4D-/-") depois de 50.000 células tumorais de carcinoma mamário de camundongo EMT6 terem sido injetadas no músculo da perna dos camundongos.

[049] Figura 18. É mostrada a mudança no volume do tumor (mm3) para camundongos nude atímico depois de dois tumores da cabeça e pescoço HN12/camundongo terem sido injetados s.c. no músculo do flanco dos camundongos. Resultados estão mostrados para camundongos injetados com 1 mg de MAb 2503 começando semanalmente no dia 1 pós enxerto comparado com camundongos injetados com controle de IgG4.

[050] Figura 19. É mostrada a mudança no volume do tumor (mm3) para camundongos nude atímico depois de dois tumores da cabeça e pescoço HN6 HIF1a mODD terem sido injetados s.c. no músculo da perna dos camundongos. Resultados estão mostrados para camundongos injetados com 1 mg de MAb 2503 começando semanalmente no dia 1 pós enxerto comparado com camundongos injetados com controle de IgG4 (19A). Estão mostradas figuras de tumores representativos de con-trole de IgG4 e MAb 2503 tratados camundongos (19B).

[051] Figura 20. Resultados de saturação de porcentagem de análise a partir de saturação de injeção intravenosa única de MAb 2503 em rato. Ratos Sprague- Dawley foram administrados com uma injeção intravenosa única de MAb 2503 em doses de 0, 0,01, 0,1, 1,0, 10, e 100 mg/kg. Um ensaio de saturação a base de cito- metria de fluxo foi realizado no sangue total lisado em vários pontos de tempo para determinar a porcentagem do alvo celular (SEMA4D) que foi saturado com MAb 2503 em ratos machos (20A) e fêmeas (20B).

[052] Figura 21. Resultados de saturação de porcentagem a partir da análise de saturação de injeção intravenosa única de MAb 2503 em macaco cinomolgo. Macacos cinomolgos foram administrados com uma injeção intravenosa única de MAb 2503 em doses de 0, 0,01, 0,1, 1,0, 10 e 100 mg/kg. Um ensaio de saturação a base de citometria de fluxo foi realizado no sangue total lisado em vários pontos de tempo para determinar a porcentagem do alvo celular (SEMA4D) que foi saturado com MAb 2503 (dados de macho e fêmea foram combinados).

Descrição Detalhada da Invenção I. Definições

[053] Deve-se notar que os termos "um ou "uma" entidade referem-se a uma ou mais desta entidade; por exemplo, entende-se que "um anticorpo anti-CD100" representa um ou mais anticorpos anti-CD100. Como tal, os termos "um (ou "uma"), "um ou mais," e "pelo menos um”- podem ser usados indiferentemente aqui.

[054] Da maneira aqui usada, o termo "tumor" refere-se a todo crescimento e proliferação de célula neoplástica, quer maligna ou benigna, e todas as células e tecidos cancerosos e pré-cancerosos.

[055] "Angiogênese invasiva" refere-se à formação de vasos sanguíneos para o suporte de condições patológicas, incluindo tumores malignos e não malignos bem como a formação anormal de novos vasos sanguíneos em degeneração macular.

[056] Os termos, "câncer" e "cancerosas" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular não regulado. Exemplos de câncer incluem, mas sem limitações, carcinomas, linfomas e leucemias.

[057] Da maneira aqui usada, o termo "polipeptídeo" visa englobar um "poli- peptídeo" singular bem como "polipeptídeos" plurais e refere-se a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) linearmente ligada por ligações de amida (também conhecidas como ligações de peptídeo). O termo "polipeptídeo" refere-se a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, e não se refere a um comprimento específico do produto. Assim, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopep- tídeos, "proteína," "cadeia de aminoácido," ou qualquer outro termo usado para referir- se a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, estão incluídos na definição de "polipeptídeo," e o termo "polipeptídeo" pode ser usado em vez de qualquer desses termos ou indiferentemente deles. O termo "polipeptídeo" visa também referir-se aos produtos de modificações de pós-expressão do polipeptídeo, incluindo sem limitação glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de prote- ção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ou modificação por aminoácidos de ocorrência não natural. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzido por tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido de uma sequência de ácido nucléico designada. Ele pode ser gerado de qualquer maneira, incluindo por síntese química.

[058] Um polipeptídeo da invenção pode ser de um tamanho de cerca de 3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 50 ou mais, 75 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, 1.000 ou mais, ou 2.000 ou mais aminoácidos. Poli- peptídeos podem ter uma estrutura tridimensional definida, embora eles não tenham necessariamente tal estrutura. Polipeptídeos com uma estrutura tridimensional definida são referidos como dobrados, e polipeptídeos que não possuem uma estrutura tridimensional definida, mas quiçá podem adotar um grande número de diferentes conformações, são referidos como não dobrados. Da maneira aqui usada, o termo glicoproteína refere-se a uma proteína acoplada pelo menos a uma fração de carboidrato que é anexada na proteína por meio de uma cadeia lateral contendo oxigênio ou uma contendo nitrogênio de um resíduo de aminoácido, por exemplo, um resíduo de serina ou um resíduo de asparagina.

[059] Por um polipeptídeo "isolado" ou um fragmento, variante, ou derivado destes entende-se um polipeptídeo que não está em seu ambiente natural. Não é exigido nenhum nível particular de purificação. Por exemplo, um polipeptídeo isolado pode ser removido de seu ambiente nativo ou natural. Polipeptídeos e proteínas re- combinantemente produzidos expressos em célula hospedeiras são considerados isolados com propósito da invenção, uma vez que são polipeptídeos nativos ou recombi- nantes que foram separados, fracionados, ou parcialmente ou substancialmente purificados por qualquer técnica adequada.

[060] Também incluídos como polipeptídeos da presente invenção são fragmentos, derivados, análogos, ou variantes dos polipeptídeos antecedentes, e qualquer combinação destes. Os termos "fragmento," "variante," "derivado," e "análogo" quando se referindo a anticorpos de anti-CD100 ou polipeptídeos do anticorpo da presente invenção incluem qualquer polipeptídeos que retenha pelo menos algumas das propriedades de ligação de antígeno do anticorpo correspondente ou polipeptídeo do anticorpo da invenção. Fragmentos de polipeptídeos da presente invenção incluem fragmentos proteolíticos, bem como fragmentos de deleção, além dos fragmentos do anticorpo específico discutido em outra parte aqui. Variantes de anticorpos de anti- CD100 e polipeptídeos do anticorpo da presente invenção incluem fragmentos conforme supradescrito, e também polipeptídeos com sequências de aminoácidos alteradas devido às substituições de aminoácido, deleções, ou inserções. Variantes podem ocorrer naturalmente ou ser de ocorrência não natural. Variantes de ocorrência não natural podem ser produzidos usando técnicas de mutagênese conhecidas na tecnologia. Polipeptídeos variantes podem compreender substituições de aminoácido con- servativas ou não conservativas, deleções, ou adições. Polipeptídeos variantes podem também ser referidos aqui como "análogos de polipeptídeo". Da maneira aqui usada um "derivado" de um anticorpo anti-CD100 ou polipeptídeo do anticorpo refere- se a um polipeptídeo em questão tendo um ou mais resíduos quimicamente derivati- zados por reação de um grupo lateral funcional. Também incluídos como "derivados" são os peptídeos que contêm um ou mais aminoácido de ocorrência natural derivados dos vinte aminoácidos padrões. Por exemplo, 4- hidroxiprolina pode ser usada em substituição a prolina; 5-hidroxilisina pode ser usada em substituição a lisina; 3-meti- listidina pode ser usada em substituição a histidina; homoserina pode ser usada em substituição a serina; e ornitina pode ser usada em substituição a lisina. Derivados de anticorpos de anti-CD100 e polipeptídeos do anticorpo da presente invenção, podem incluir polipeptídeos que foram alterados de maneira a exibir recursos adicionais não encontrados no anticorpo de referência ou polipeptídeo do anticorpo da invenção.

[061] O termo "polinucleotídeo" visa englobar um ácido nucléico singular bem como ácidos nucléicos plurais, e refere-se a uma molécula ou construto de ácido nu- cléico isolado, por exemplo, RNA mensageiro (RNAm) ou DNA de plasmídeo (DNAp). Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação de fosfodiéster convencional ou uma ligação não convencional (por exemplo, uma ligação não amida, tal como encontrado em ácidos nucléicos de peptídeo (PNA)). O termo "ácido nucléico" refere-se a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucléico, por exemplo, fragmentos de DNA ou RNA, presentes em um polinucleotídeo. Por ácido nucléico ou polinucleotídeo "isolado" entende-se uma molécula de ácido nucléico, DNA ou RNA, que foi removido de seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica uma molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, um anticorpo ou fragmento deste de ligação de antígeno, contido em um vetor é considerado isolado com o propósito da presente invenção. Exemplos adicionais de um polinucleotídeo isolado incluem poli- nucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinu- cleotídeos purificados (parcialmente ou substancialmente) em solução. Moléculas de RNA Isoladas incluem transcrições de RNA in vivo ou in vitro de polinucleotídeos da presente invenção. Polinucleotídeos ou ácidos nucléicos isolados de acordo com a presente invenção adicionalmente incluem tais moléculas produzidas sinteticamente. Além disso, um polinucleotídeo ou um ácido nucléico pode ser ou pode incluir um elemento regulatório tais como um promotor, sítio de ligação de ribossomo, ou um terminador de transcrição.

[062] Da maneira aqui usada, uma "região de codificação" é uma porção de ácido nucléico que consiste em códons traduzidos nos aminoácidos. Embora um "có- don de parada" (TAG, TGA, ou TAA) não seja traduzido em um aminoácido, ele pode ser considerado parte de uma região de codificação, mas qualquer sequência de flan- queamento, por exemplo promotores, sítios de ligação de ribossomo, terminadores transcricionais, íntrons, e similares, não são parte de uma região de codificação. Duas ou mais regiões de codificação da presente invenção podem estar presentes em um construto de polinucleotídeo único, por exemplo, em um vetor único, ou em construtos de polinucleotídeo separados, por exemplo, em vetores separados (diferentes). Além disso, qualquer vetor pode conter uma região de codificação única, ou pode compreender duas ou mais regiões de codificação, por exemplo, um vetor único pode codificar separadamente uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina. Além disso, um vetor, polinucleotí- deo, ou ácido nucléico da invenção podem codificar regiões de codificação heterólo- gas, tanto fundidas quanto não fundidas para um ácido nucléico que codifica um anticorpo anti-CD100 ou fragmento, variante, ou derivado destes. Regiões de codificação heterólogas incluem, sem limitação, elementos ou motivos especializados, tais como um peptídeo sinal secretório ou um domínio funcional heterólogo.

[063] Em certas modalidades, o polinucleotídeo ou ácido nucléico é DNA. No caso de DNA, um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo normalmente pode incluir um promotor e/ou outros elementos de controle de transcrição ou tradução operacionalmente associados com uma ou mais regiões de codificação. Uma associação operável é quando uma região de codificação para um produto genético, por exemplo, um polipeptídeo, é associada com uma ou mais sequências regulatórias de uma tal maneira a colocar expressão do produto genético sob a influência ou controle da(s) sequência(s) regulatória(s). Dois fragmentos de DNA (tais como uma região de codificação de polipeptídeo e um promotor associado com ela) são "operacionalmente associados" se indução de função do promotor resultar na transcrição de RNAm que codifica o produto genético desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interferir com a capacidade de as sequências regulatórias da expressão de dirigir a expressão do produto genético ou interferir com a capacidade do gabarito de DNA ser transcrito. Assim, uma região promotora seria operacionalmente associada com um ácido nucléico que codifica um po- lipeptídeo se o promotor tiver sido capaz de efetuar transcrição deste ácido nucléico. O promotor pode ser um promotor específico da célula que direciona transcrição substancial do DNA somente em células predeterminadas. Outros elementos de controle de transcrição, além de um promotor, por exemplo, melhoradores, operadores, repres- sores, e sinais de terminação de transcrição, podem ser operacionalmente associados com o polinucleotídeo para direcionar transcrição específica da célula. Promotores adequados e outras regiões de controle de transcrição são revelados aqui.

[064] Uma variedade de regiões de controle de transcrição é conhecida pelos versados na técnica. Essas incluem, sem limitação, regiões de controle de transcrição que funcionam em células vertebradas, tais como, mas sem limitações, segmentos de promotor e melhorador de citomegalovírus (o promotor antecipado imediato, junto com íntron-A), vírus simian 40 (o promotor antecipado), e retrovírus (tal como vírus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controle de transcrição incluem aquelas derivadas de genes vertebrados tais como actina, proteína de choque térmico, hormônio do crescimento bovino e β-globina de coelho, bem como outras sequências capazes de controlar expressão genética em células eucarióticas. Regiões de controle de transcrição adequadas adicionais incluem promotores e melhoradores específicos de tecido bem como promotores indutíveis de linfocina, por exemplo, promotores indutíveis por interferons ou interleucinas).

[065] Similarmente, uma variedade de elementos de controle de tradução é conhecida pelos versados na tecnologia. Esses incluem, mas sem limitações, sítios de ligação de ribossomo, iniciação de tradução e códons de terminação, e elementos derivados de picornavírus (particularmente um sítio de entrada de ribossomo interno, ou IRES, também referido como uma sequência CITE).

[066] Em outras modalidades, um polinucleotídeo da presente invenção é RNA, por exemplo, na forma de RNA mensageiro (RNAm).

[067] Regiões de codificação de polinucleotídeo e ácido nucléico da presente invenção podem ser associadas com regiões de codificação adicionais que codificam sinais secretórios ou peptídeo, que direcionam a secreção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. De acordo com a hipótese de sinal, proteínas secretadas por células de mamífero têm um peptídeo sinal ou sequência líder secretória que é clivada a partir da proteína madura uma vez que exportação da cadeia de proteína de crescimento através do retículo endoplásmico grosseiro foi iniciada. Versados na tecnologia estão informados que polipeptídeos secretados por células vertebradas geralmente têm um peptídeo sinal fundido no terminal N do polipep- tídeo, que é clivado a partir do polipeptídeo completo ou "comprimento total" para produzir uma forma secretada ou "madura" do polipeptídeo. Em certas modalidades, o peptídeo sinal nativo, por exemplo, uma cadeia pesada de imunoglobulina ou peptídeo sinal de cadeia leve é usada, ou um derivado funcional desta sequência que retém a capacidade de direcionar a secreção do polipeptídeo que está operacionalmente associado com ela. Alternativamente, um peptídeo sinal de mamífero heterólogo, ou um derivado funcional deste, pode ser usado. Por exemplo, a sequência líder tipo selvagem pode ser substituída com a sequência líder de ativador plasminogênio de tecido humano (TPA) ou β-glucuronidase de camundongo.

[068] Uma "molécula de ligação" ou "molécula de ligação de antígeno" da presente invenção refere-se no seu sentido mais amplo a uma molécula que se liga especificamente um determinante antigênico. Em uma modalidade, a molécula de ligação se liga especificamente a CD100, por exemplo, um polipeptídeo de CD100 de transmembrana de cerca de 150 kDa ou um polipeptídeo de CD100 solúvel de cerca de 120 kDa (comumente referido como sCD100). Em uma outra modalidade, uma molécula de ligação da invenção é um anticorpo ou um fragmento de ligação de antí- geno deste. Em uma outra modalidade, uma molécula de ligação da invenção compreende pelo menos um CDR de cadeia pesada ou leve de uma molécula do anticorpo. Em uma outra modalidade, uma molécula de ligação da invenção compreende pelo menos dois CDRs de uma ou mais moléculas do anticorpo. Em uma outra modalidade, uma molécula de ligação da invenção compreende pelo menos três CDRs de uma ou mais moléculas do anticorpo. Em uma outra modalidade, uma molécula de ligação da invenção compreende pelo menos quatro CDRs de uma ou mais moléculas do anticorpo. Em uma outra modalidade, uma molécula de ligação da invenção compreende pelo menos cinco CDRs de uma ou mais moléculas do anticorpo. Em uma outra modalidade, uma molécula de ligação da invenção compreende pelo menos seis CDRs de uma ou mais moléculas do anticorpo.

[069] A presente invenção é direcionada a certos anticorpos de anti-CD100, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes. A menos que referindo-se especificamente a anticorpos totalmente dimensionados tais como anticorpos de ocorrência natural, o termo "anticorpos totalmente dimensionados englobam anticorpos de anti-CD100 bem como fragmentos de ligação de antígeno, variantes, análogos, ou derivados de tais anticorpos, por exemplo, anticorpo ou moléculas de imunoglobulina de ocorrência natural ou moléculas do anticorpo ou fragmentos modificados por engenharia que ligam antígeno de uma maneira similar às moléculas do anticorpo.

[070] Da maneira aqui usada, anticorpos "humanos" ou "totalmente humanos" incluem anticorpos tendo a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina de humano e incluem anticorpos isolados de imunoglobulina de bibliotecas humanas ou a partir de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas de humano e que não expressam imunoglobulinas endógenas, conforme descrito a seguir e, por exemplo, na patente U.S No. 5.939,598 por Kucherlapati et al. Anticorpos "humanos" ou "totalmente humanos" também incluem anticorpos compreendendo pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada, ou pelo menos os domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve, onde o(s) domínio(s) variável(s) têm a sequência de aminoácidos de domínio(s) variável(s) de imunoglobulina de humano.

[071] Anticorpos "humanos" ou "totalmente humanos" também incluem anticorpos "humanos" ou "totalmente humanos", conforme supradescrito, que compreendem, consistem essencialmente em, ou consistem em, variantes (incluindo derivados) de moléculas do anticorpo (por exemplo, as regiões de VH e/ou regiões de VL) des-critos aqui, cujos anticorpos ou fragmentos destes se ligam imunoespecificamente a um polipeptídeo de CD100 ou fragmento ou variante destes. Técnicas padrões conhecidas pelos versados na tecnologia podem ser usadas para introduzir mutações na sequência de nucleotídeo que codifica um anticorpo anti-CD100 de humano, incluindo, mas sem limitações, mutagênese direcionada ao sítio e mutagênese mediada por PCR que resultam em substituições de aminoácido. Preferivelmente, as variantes (incluindo derivados) codificam menos que 50 substituições de aminoácido, menos que 40 substituições de aminoácido, menos que 30 substituições de aminoácido, menos que 25 substituições de aminoácido, menos que 20 substituições de aminoácido, menos que 15 substituições de aminoácido, menos que 10 substituições de aminoácido, menos que 5 substituições de aminoácido, menos que 4 substituições de aminoácido, menos que 3 substituições de aminoácido, ou menos que 2 substituições de aminoá- cido com relação à região de VH de referência, região VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VL, VLCDR1, VLCDR2, ou VLCDR3.

[072] Em certas modalidades, as substituições de aminoácido são substituições de aminoácido conservativo, discutidas adicionalmente a seguir. Alternativamente, as mutações podem ser introduzidas aleatoriamente por toda ou parte da sequência de codificação, tal como por mutagênese de saturação, e os mu- tantes resultantes podem ser classificados para atividade biológica para identificar mutantes que retêm atividade (por exemplo, a capacidade de ligar um polipeptídeo de CD100, por exemplo, humano, murino, ou tanto CD100 de humano quanto de murino). Tais variantes (ou derivados destas) de anticorpos "humanos" ou "totalmente humanos" podem também ser ditas como anticorpos humanos ou totalmente humanos que são "otimizados" ou "otimizados para ligação de antígeno" e incluem anticorpos que têm maior afinidade com o antígeno.

[073] Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são usados indiferentemente aqui. Um anticorpo ou imunoglobulina compreende pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada, e normalmente compreendem pelo menos os domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve. Estruturas de imunoglobulina básicas em sistemas de vertebrados são relativamente bem entendidas. Vide, por exemplo, Harlow et al. (1988) Antibodies A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press).

[074] Conforme será discutido com mais detalhes a seguir, o termo "imuno- globulina" compreende várias classes amplas de polipeptídeos que podem ser distinguidas bioquimicamente. Versados na técnica perceberão que cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, (Y, μ, α, δ, ε) com algumas sub-classes entre elas (por exemplo, Yl-Y4). É a natureza desta cadeia que determina a "classe" do anticorpo como IgG, IgM, IgA IgG, ou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina (isótipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc. são bem caracterizadas e são conhecidas para conferir especialização funcional. Versões modificadas de cada qual dessas classes e isótipos são facilmente discerníveis pelos versados na tecnologia em vista da presente revelação e, dessa maneira, estão no escopo da presente invenção. Todas as classes de imunoglobulina estão inteiramente no escopo da presente invenção, a discussão seguinte será geralmente direcionada à classe IgG de moléculas de imunoglobulina. Com relação à IgG, uma molécula de imunoglobulina padrão compreende dois polipeptídeos de cadeia leve idênticos de peso molecular de aproximadamente 23.000 Daltons, e dois polipeptídeos de cadeia pesada idênticos de peso molecular de 53.000 - 70.000. As quatro cadeias são tipicamente unidas por ligações de dissulfeto em uma configuração "Y" em que as cadeias leves suportam as cadeias pesadas começando na boca do "Y" e continuando através da região variável.

[075] Cadeias leves são classificadas tanto como kappa quanto como lambda (K, À). Cada classe de cadeia pesada pode ser ligada tanto com uma cadeia leve kappa quanto lambda. Em geral, as cadeias leves e pesadas são covalentemente ligadas umas nas outras, e as porções da "cauda" das duas cadeias pesadas são ligadas umas nas outras por ligações de dissulfeto covalentes ou ligações não covalentes quando as imunoglobulinas são geradas tanto por hibridomas, células B quanto células hospedeiras geneticamente modificadas por engenharia. Na cadeia pesada, as sequências de aminoácidos correm a partir de um terminal N nas extremidades bifurcadas da configuração Y para o terminal C na base de cada cadeia.

[076] Tanto as cadeias leves quanto pesadas são divididas nas regiões de homologia estrutural e funcional. Os termos "constante" e "variável" são usados funcionalmente. Com relação a isso, será percebido que os domínios variáveis tanto das porções da cadeia leve (VL ou VK) quanto pesada (VH) determinam o reconhecimento e especificidade do antígeno. Ao contrário, os domínios constantes da cadeia leve (CL) e da cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) conferem propriedades biológicas importantes tais como secreção, mobilidade transplacental, ligação do receptor de Fc, ligação do complemento, e similares. Por convenção a numeração dos domínios da região constante aumenta à medida que eles se torna mais distal do sítio de ligação de antígeno ou terminal amino do anticorpo. A porção do terminal N é uma região variável e na porção do terminal C é uma região constante; os domínios CH3 e CL compreendem verdadeiramente o terminal carbóxi da cadeia pesada e leve, respectivamente.

[077] Conforme indicado anteriormente, a região variável permite que o anticorpo reconheça seletivamente e ligue especificamente epítopos nos antígenos. Ou seja, a domínio VL e domínio VH, ou subconjunto das regiões determinantes de com- plementariedade (CDRs) nesses domínios variáveis, de um anticorpo combinam para formar a região variável que define um sítio de ligação de antígeno tridimensional. Esta estrutura de anticorpo quaternário forma o sítio de ligação de antígeno presente na extremidade de cada braço do Y. Mais especificamente, o sítio de ligação de antí- geno é definido por três CDRs em cada qual das cadeias VH e VL. Em alguns exemplos, por exemplo, certas moléculas de imunoglobulina derivadas de espécie camelídeas ou modificadas por engenharia com base em imunoglobulinas de camelídeo, uma molécula de imunoglobulina completa pode consistir em cadeias pesadas somente, sem nenhuma cadeia leve. Vide, por exemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993).

[078] Em anticorpos de ocorrência natural, as seis "regiões determinantes de complementariedade" ou "CDRs" presentes em cada domínio de ligação de antígeno são curtas, sequências de aminoácidos não contínuas que são especificamente posicionadas para formar o domínio de ligação de antígeno uma vez que o anticorpo as-sume sua configuração tridimensional em um ambiente aquoso. O restante dos ami- noácidos no domínio de ligação de antígenos, referido como regiões "framework", mostra menos variabilidade intermolecular. As regiões framework adotam amplamente uma conformação folha β e as CDRs formam laços que conectam a estrutura da folha β, e em alguns casos formam parte desta. Assim, regiões framework agem para formar um andaime que fornece posicionamento para as CDRs em orientação correta por inter-cadeia, interações não covalentes. O domínio de ligação de antígeno formado pelos CDRs posicionados define uma superfície complementar ao epítopo no antígeno imunoreativo. Esta superfície complementar promove a ligação não covalente do anticorpo no seu epítopo cognato. Os aminoácidos compreendendo as CDRs e as regiões framework, respectivamente, podem ser facilmente identificados para qualquer dado domínio variável de cadeia pesada ou leve pelos versados na tecnologia, uma vez que eles foram precisamente definidos (vide a seguir).

[079] No caso onde existem duas ou mais definições de um termo que é usado e/ou aceito na técnica, entende-se que a definição do termo da maneira aqui usada inclui todos tais significados a menos que explicitamente declarado ao contrário. Um exemplo específico é o uso do termo "região determinante de complementariedade" ("CDR") para descrever o antígeno não contínuo que combina sítios encontrados na região variável de polipeptídeos tanto de cadeia pesada quanto leve. Esta região particular foi descrita por Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" e por Chothia and Lesk, J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987), que estão incorporados aqui pela referência, onde as definições incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácido quando comparados um com o outro. Todavia, entende-se que aplicação tanto de definição para referir-se a uma CDR de um anticorpo quanto variantes deste esteja no escopo do termo como definido e usado aqui. Os resíduos de aminoácido apropriados que englobam as CDRs da maneira definida por cada qual das referências citadas anteriormente são apresentados a seguir na tabela 1 como uma comparação. Os números exatos de resíduo que englobam uma CDR particular variarão dependendo da sequência e tamanho da CDR. Versados na técnica podem determinar rotineiramente que resíduos compreendem um CDR particular dada a sequência de aminoácidos da região variável do anticorpo. Tabela 1. Definições de CDR1

[080] A numeração de todas as definições de CDR na tabela 1 é de acordo com a convenções da numeração apresentada por Kabat et al. (vide a seguir).

[081] Kabat et al. também definiram um sistema de numeração para sequências de domínio variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Versados na tecnologia podem claramente determinar este sistema de "Numeração Kabat" para qualquer sequência de domínio variável, sem depender de qualquer dado experimental além da própria sequência. Da maneira aqui usada, "Numeração Kabat" refere-se ao sistema de numeração apresentado por Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest". A menos que de outra forma especificada, referências à numeração de posições de resíduo de aminoácido específico em um anticorpo anti-CD100 ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes da presente invenção são de acordo com o sistema de numeração de Kabat.

[082] Anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes da invenção incluem, mas sem limitações, anticorpos policlonais, mono- clonais, multiespecíficos, humanos, humanizados, primatizados, ou quiméricos, anticorpos de cadeia única, fragmentos de ligação de epítopo, por exemplo, Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs, Fvs de cadeia única (scFv), Fvs ligado a dissulfeto (sdFv), fragmentos compreendendo tanto um domínio VL quanto VH, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, e anticorpos anti-idiotípico (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id para anticorpos de anti-CD100 revelados aqui). Moléculas de ScFv são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, na patente U.S No. 5.892.019. Imunoglobulina ou moléculas do anticorpo da invenção podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e Ig A2, etc.), ou subclasse de molécula de imunoglobulina.

[083] Da maneira aqui usada, o termo "porção de cadeia pesada" inclui sequências de aminoácidos derivadas de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Um polipeptídeo compreendendo uma porção de cadeia pesada compreende pelo menos um de: um domínio CH1, um domínio de articulação (por exemplo, região de articulação superior, média e/ou inferior), um domínio de CH2, um domínio de CH3, ou uma variante ou seu fragmento. Por exemplo, um polipeptídeo de ligação para uso na invenção pode compreender uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH1; uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de articulação, e um domínio de CH2; uma cadeia de polipep- tídeo compreendendo um domínio CH1 e um domínio de CH3; uma cadeia de poli- peptídeo compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de articulação, e um domínio de CH3, ou uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de articulação, um domínio de CH2, e um domínio de CH3. Em uma outra modalidade, um polipeptídeo da invenção compreende uma cadeia de polipeptídeo compreendendo um domínio de CH3. Adicionalmente, um polipeptídeo de ligação para uso na invenção pode não ter pelo menos uma porção de um domínio de CH2 (por exemplo, todo ou parte de um domínio de CH2). Conforme apresentado anteriormente, versados na tecnologia entenderão que esses domínios (por exemplo, as porções de cadeia pesada) podem ser modificados de maneira tal que eles variam em sequência de aminoácidos a partir da molécula de imunoglobulina de ocorrência natural.

[084] Em certos anticorpos de anti-CD100, ou fragmentos de ligação de antí- geno, variantes, ou derivados destes revelados aqui, as porções de cadeia pesada de uma cadeia de polipeptídeo de um multímero são idênticas àquelas em uma segunda cadeia de polipeptídeo do multímero. Alternativamente, monômeros contendo porção de cadeia pesada da invenção são não idênticos. Por exemplo, cada monômero pode compreender um diferente sítio de ligação alvo, que forma, por exemplo, um anticorpo biespecífico.

[085] As porções de cadeia pesada de uma molécula de ligação para uso nos métodos de diagnóstico e tratamento revelados aqui podem ser derivadas de diferentes moléculas de imunoglobulina. Por exemplo, uma porção de cadeia pesada de um polipeptídeo pode compreender um domínio CH1 derivado de uma molécula de IgG1 e uma região de articulação derivada de uma molécula de IgG3. Em um outro exemplo, uma porção de cadeia pesada pode compreender uma região de articulação derivada, em parte, de uma molécula de IgG1 e, em parte, de uma molécula de IgG3. Em um outro exemplo, uma porção de cadeia pesada pode compreender uma articulação quimérica derivada, em parte, de uma molécula de IgG1 e, em parte, de uma molécula de IgG4.

[086] Da maneira aqui usada, o termo "porção de cadeia leve" inclui sequências de aminoácidos derivadas de uma cadeia leve de imunoglobulina, por exemplo, uma cadeia leve kappa ou lambda. Preferivelmente, a porção de cadeia leve compreende pelo menos um de um domínio de VL ou CL.

[087] Anticorpos de anti-CD100, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes revelados aqui podem ser descritos ou especificados nos termos do(s) epítopo(s) ou porção(s) de um antígeno, por exemplo, um polipeptídeo alvo revelado aqui (por exemplo, CD100) que eles reconhecem ou especificamente se ligam. A porção de um polipeptídeo alvo que especificamente interage com o domínio de ligação de antígeno de um anticorpo é um "epítopo," ou um "determinante antigênico". Um polipeptídeo alvo pode compreender um epítopo único, mas tipicamente compreende pelo menos dois epítopos, e pode incluir qualquer número de epí- topos, dependendo do tamanho, conformação, e tipo de antígeno. Além disso, deve- se notar que um "epítopo" em um polipeptídeo alvo pode ser ou pode incluir elementos não polipeptídeos, por exemplo, um epítopo pode incluir uma cadeia lateral de carboidrato.

[088] O tamanho mínimo de um epítopo do peptídeo ou polipeptídeo para um anticorpo é considerado cerca de quatro a cinco aminoácidos. Epítopo do peptídeo ou polipeptídeos preferivelmente contém pelo menos sete, mais preferivelmente pelo menos nove e acima de tudo preferivelmente entre pelo menos cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos. Uma vez que uma CDR pode reconhecer um peptídeo ou polipeptí- deo antigênico na sua forma terciária, os aminoácidos compreendendo um epítopo não precisam ser contínuos, e em alguns casos, podem nem mesmo ser as mesmas cadeias de peptídeo. Um epítopo do peptídeo ou polipeptídeo reconhecido por anticorpos de anti-CD100 da presente invenção, pode conter uma sequência de pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, mais preferivelmente pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, ou entre cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos de CD100 contínuos ou não contínuos.

[089] Por "se liga especificamente" no geral entende-se que um anticorpo se liga a um epítopo por meio de seu domínio de ligação de antígeno, e que a ligação vincula alguma complementariedade entre o domínio de ligação de antígeno e o epí- topo. De acordo com esta definição, um anticorpo é o dito se "ligar especificamente" a um epítopo quando ele liga a este epítopo, por meio de seu domínio de ligação de antígeno mais facilmente do que ele se ligaria a um epítopo aleatório, não relacionado. O termo "especificidade" é usado aqui para qualificar a afinidade relativa pela qual um certo anticorpo se liga a um certo epítopo. Por exemplo, anticorpo "A" pode ser considerado ter uma especificidade maior para um dado epítopo do que o anticorpo "B," ou anticorpo "A" pode ser dito se ligar ao epítopo "C" com uma especificidade maior do que ele tem para epítopo "D” relacionado".

[090] Por "se liga preferencialmente," entende-se que o anticorpo se liga especificamente a um epítopo mais facilmente do que ele se ligaria a um epítopo relacionado, similar, homólogo, ou análogo. Assim, um anticorpo que "se liga preferencialmente" a um dado epítopo mais provavelmente se ligaria a este epítopo do que a um epítopo relacionado, ainda assim um anticorpo como esse pode reagir cruzado com o epítopo relacionado.

[091] A título de exemplo não limitante, um anticorpo pode ser considerado ligar um primeiro epítopo preferencialmente se ele ligar o dito primeiro epítopo com uma constante de dissociação (KD) que é menos que o KD do anticorpo para o segundo epítopo. Em um outro exemplo não limitante, pode-se considerar que um anticorpo se liga a um primeiro antígeno preferencialmente se ele ligar o primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos uma ordem de magnitude menor que o KD do anticorpo no segundo epítopo. Em um outro exemplo não limitante, pode-se considerar que um anticorpo se liga em um primeiro epítopo preferencialmente se ele ligar o primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos duas ordens de magnitude menor que o KD do anticorpo para o segundo epítopo.

[092] Em um outro exemplo não limitante, um anticorpo pode ser considerado ligar um primeiro epítopo preferencialmente se ele ligar o primeiro epítopo com um constante de dissociação (k(off)) que é menor que a k(off) do anticorpo para o segundo epítopo. Em um outro exemplo não limitante, um anticorpo pode ser considerado ligar um primeiro epítopo preferencialmente se ele ligar o primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos uma ordem de magnitude menor que a k(off) do anticorpo para o segundo epítopo. Em um outro exemplo não limitante, um anticorpo pode ser considerado ligar um primeiro epítopo preferencialmente se ele ligar o primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos duas ordens de magnitude menor que a k(off) do anticorpo para o segundo epítopo. Um anticorpo ou fragmento de ligação de antí- geno, variante, ou derivado revelado aqui pode ser dito se ligar um polipeptídeo alvo revelado aqui (por exemplo, CD100, por exemplo, CD100 de humano, murino, ou tanto de humano quanto de murino) ou um fragmento ou variante destes com uma constante de dissociação (k(off)) menor que igual a 5x10-2 s-1, 10-2 s-1, 5x10-3 s-1 ou 10-3 s-1. Mais preferivelmente, um anticorpo da invenção pode ser dito se ligar a um polipeptídeo alvo revelado aqui (por exemplo, CD100, por exemplo, CD100 de humano, murino, ou tanto de humano quanto de murino) ou um fragmento ou variante deste com uma constante de dissociação (k(off)) menor que ou igual a 5x10-4 s-1, 10-4 s-1, 5x10-5 s-1, ou 10-5 s-1, 5x10-6 s-1, 10-6 s-1, 5x10-7 s-1 ou 10-7 s-1.

[093] Um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado revelado aqui pode ser dito se ligar a um polipeptídeo alvo revelado aqui (por exemplo, CD100, por exemplo, CD100 de humano, murino, ou tanto de humano quanto de mu- rino) ou um fragmento ou variante deste com uma constante de associação (k(on)) de maior ou igual a 103 M-1 s-1, 5x103 M-1 s-1, 104 M-1 s-1 ou 5x104 M-1 s-1. Mais preferivelmente, um anticorpo da invenção pode ser dito se ligar a um polipeptídeo alvo revelado aqui (por exemplo, CD100, por exemplo, CD100 de humano, murino, ou tanto de humano quanto de murino) ou um fragmento ou variante deste com uma constante de associação (k(on)) maior ou igual a 105 M-1 s-1, 5x105 M-1 s-1, 106 M-1 s-1, ou 5x106 M1 s-1 ou 107 M-1 s-1.

[094] Um anticorpo é dito inibir competitivamente a ligação de um anticorpo de referência a um dado epítopo se ele preferencialmente se ligar a que epítopo até o ponto em que ele bloqueia, até algum grau, ligação do anticorpo de referência com o epítopo. Inibição competitiva pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, ensaios ELISA de competição. Um anticorpo pode ser dito inibir competitivamente a ligação do anticorpo de referência com um dado epítopo por pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, ou pelo menos 50%.

[095] Da maneira aqui usada, o termo "afinidade" refere-se a uma medida da intensidade da ligação de um epítopo individual com a CDR de uma molécula de imu- noglobulina. Vide, por exemplo, Harlow et al. (1988) Antibodies A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.) páginas 27-28. Da maneira aqui usada, o termo "avidez" refere-se à estabilidade geral do complexo entre uma população de imunoglobulinas e um antígeno, ou seja, o funcional que combina intensidade de uma imunoglobulina mistura com o antígeno. Vide, por exemplo, Harlow nas páginas 29-34. Avidez está relacionada tanto com a afinidade de moléculas individuais de imunoglobulina na população com epítopos específicos, quanto também com as valências das imunoglobulinas e do antígeno. Por exemplo, a interação entre um anticorpo monoclonal bivalente e um antígeno com uma estrutura do epítopo altamente de repetição, tal como um polímero, seria um de alta avidez.

[096] Anticorpos anti-CD100 ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes da invenção, podem também ser descritos ou especificados em termos de sua reatividade cruzada. Da maneira aqui usada, o termo "reatividade cruzada" refere-se à capacidade de um anticorpo, específico para um antígeno, reagir com um segundo antígeno; uma medida de relacionamento entre duas diferentes substâncias antigênicas. Assim, um anticorpo é reativo cruzado se ele ligar a um epí- topo sem ser o que induziu sua formação. O epítopo reativo cruzado geralmente contém muitos dos mesmos recursos estruturais complementares do epítopo de indução e, em alguns casos, pode verdadeiramente se ajustar melhor que o original.

[097] Por exemplo, certos anticorpos têm algum grau de reatividade cruzada, em que ele liga epítopos relacionado, mas não idênticos, por exemplo, epítopos com pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55%, e pelo menos 50% de identidade (conforme calculado usando métodos conhecidos na técnica e descritos aqui) com um epítopo de referência. Um anticorpo pode ser dito ter pouca ou nenhuma reatividade cruzada se ele não ligar epítopos com menos que 95%, menos que 90%, menos que 85%, menos que 80%, menos que 75%, menos que 70%, menos que 65%, menos que 60%, menos que 55%, e menos que 50% de identidade (conforme calculado usando métodos conhecidos na técnica e descritos aqui) com um epítopo de referência. Um anticorpo pode ser considerado "altamente específico" para um certo epítopo, se ele não se ligar a qualquer outro análogo, ortólogo, ou homólogo deste epítopo.

[098] Moléculas de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes ou derivados destes, da invenção podem também ser descritas ou especificadas em termos de sua afinidade de ligação com um polipeptídeo da invenção, por exemplo, CD100, por exemplo, CD100 de humano, murino, ou tanto de humano quanto de murino. Afinidades de ligação preferidas incluem aquelas com uma constante de dissociação ou Kd menor que 5x10-2 M, 10-2 M, 5x10-3M, 10-3 M, 5x10- 4 M, 10-4 M, 5x10-5 M, 10-5 M, 5x10-6 M, 10-6 M, 5x10-7 M, 10-7 M, 5x10-8 M, 10-8 M, 5x10-9 M, 10-9 M, 5x10-10 M, 10-10 M, 5x10-11 M, 10-11 M, 5x10-12 M, 10-12 M, 5x10-13 M, 10-13 M, 5x10-14 M, 10-14 M, 5x10-15 M, ou 10-15 M. Em certas modalidades, a molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste, da invenção liga CD100 de humano com uma Kd de cerca de 5x10-9 a cerca de 6x10-9. Em uma outra modalidade, a molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antí- geno deste, da invenção liga murino CD100 com uma Kd de cerca de 1x10-9 a cerca de 2x10-9.

[099] Anticorpos anti-CD100 ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes ou derivados destes da invenção podem ser "multiespecíficos," por exemplo, biespe- cífico, triespecífico, ou de maior multiespecificidade, significando que eles reconhecem e ligam a dois ou mais diferentes epítopos presentes em um ou mais diferentes antígenos (por exemplo, proteínas) ao mesmo tempo. Assim, quer um anticorpo anti- CD100 seja "monoespecífico" quer "multiespecífico", por exemplo, "biespecífico," refere-se ao número de diferentes epítopos com o qual um polipeptídeo de ligação reage. Anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para diferentes epítopos de um polipeptídeo alvo descrito aqui, ou podem ser específicos para um polipeptídeo alvo bem como para um epítopo heterólogo, tais como um polipeptídeo heterólogo ou material de suporte sólido.

[0100] Da maneira aqui usada, o termo "valência" refere-se ao número de domínios de ligação potencial, por exemplo, domínio de ligação de antígenos presente em um polipeptídeo de ligação ou molécula de ligação de CD100, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste. Cada domínio de ligação liga especificamente um epítopo. Quando um polipeptídeo de ligação ou molécula de ligação de CD100 compreende mais que um domínio de ligação, cada domínio de ligação pode especificamente ligar o mesmo epítopo, para um anticorpo com dois domínios de ligação, denominado "monoespecífico bivalente," ou para diferentes epítopos, para um anticorpo com dois domínios de ligação, denominado "biespecífico bivalente". Um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste pode também ser biespecífico e bivalente para cada especificidade (denominado "anticorpos tetravalentes biespecífi- cos"). Em uma outra modalidade, minicorpos tetravalentes ou anticorpos deletados do domínio podem ser feitos.

[0101] Anticorpos bivalentes biespecíficos, e métodos de fabricá-los, são descritos, por exemplo, na patente U.S Nos. 5.73.168, 5.807.706, 5.821.333 e Publicações de pedido de patente U.S.. Nos. 2003/020734 e 2002/0155537, as revelações de todos os quais estão incorporadas pela referência aqui. Anticorpos tetravalentes biespecíficos, e métodos de fabricá-los são descritos, por exemplo, em WO 02/096948 e WO 00/44788, as revelações de ambos os quais estão incorporadas aqui pela refe-rência. Vide geralmente, publicações de PCT WO 93/17715, WO 92/08802, WO 91/00360, WO 92/05793, Tutt et al., J. Immunol. 147:60- 69 (1991); Patente U.S Nos. 4.474.893, 4.714.681, 4.925.648, 5.573.920, 5.601.819, Kostelny et al., J. Immunol 148: 1547-1553 (1992).

[0102] Conforme previamente indicado, as estruturas da subunidade e configuração tridimensional das regiões constantes das várias classes de imunoglobulina são bem conhecidas. Da maneira aqui usada, o termo "domínio VH" inclui o domínio variável do terminal amino de uma cadeia pesada de imunoglobulina e o termo "domínio CH1" inclui o primeiro domínio de região constante (terminal mais amino) de uma cadeia pesada de imunoglobulina. O domínio CH1 é adjacente ao domínio VH e é terminal amino com a região de articulação de uma cadeia pesada de molécula de imunoglobulina.

[0103] Da maneira aqui usada, o termo "domínio de CH2" inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada que se estende, por exemplo, de cerca de 244 resíduos a 360 resíduos de um anticorpo usando esquemas de numeração convencional (244 a 360 resíduos, sistema de numeração Kabat; e 231-340 resíduos, sistema de numeração EU; vide Kabat EA et al.). O domínio de CH2 é exclusivo em que não está rigorosamente pareado com um outro domínio. Por outro lado, duas cadeias de carboidrato ramificadas Ligadas ao N são interpostas entre os dois domínios de CH2 de uma molécula de IgG nativa intacta. É também bem documentado que o domínio de CH3 estende-se a partir do domínio de CH2 até o terminal C da molécula de IgG e compreende aproximadamente 108 resíduos.

[0104] Da maneira aqui usada, o termo "região de articulação" inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada que une o domínio CH1 ao domínio de CH2. Esta região de articulação compreende aproximadamente 25 resíduos e é flexível, permitindo assim que as duas regiões ligação de antígeno terminal N movam independentemente. Regiões de articulação podem ser subdivididas em três domínios distintos: domínios de articulação superior, médio, e inferior (Roux et al., J. Immunol. 767:4083 (1998)).

[0105] Da maneira aqui usada, o termo "ligação de dissulfeto" inclui a ligação covalente formada entre dois átomos de enxofre. A cisteína do aminoácido compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação de dissulfeto ou ligação com um segundo grupo tiol. Na maioria das moléculas de IgG de ocorrência natural, as regiões CH1 e CL são ligadas por uma ligação de dissulfeto e as duas cadeias pesadas são ligadas por duas ligações de dissulfeto nas posições correspondentes a 239 e 242 usando o sistema de numeração Kabat (posição 226 ou 229, sistema de numeração EU).

[0106] Da maneira aqui usada, o termo "anticorpo quimérico" será mantido para significar qualquer anticorpo em que a região ou sítio imunoreativo é obtido ou derivado de uma primeira espécie e a região constante (que pode ser intacta, parcial ou modificada de acordo com a presente invenção) é obtida a partir de uma segunda espécie. Em modalidades preferidas, a região de ligação ou sítio alvo será de uma fonte não humana (por exemplo, camundongo ou primata) e a região constante é humana (por exemplo, anticorpo monoclonal (MAb) 2368 descrito aqui).

[0107] Da maneira aqui usada, o termo "anticorpo modificado por engenharia" refere-se a um anticorpo em que o domínio variável tanto na cadeia pesada quanto leve, ou em ambas, é alterado por pelo menos substituição parcial de um ou mais CDRs de um anticorpo de especificidade conhecida e, se necessário, por substituição da região framework parcial e troca de sequência. Embora as CDRs possam ser derivadas de um anticorpo da mesma classe ou mesmo subclasse como o anticorpo do qual as regiões framework são derivadas, considera-se que as CDRs serão derivadas de um anticorpo de diferente classe e preferivelmente de um anticorpo de uma diferente espécie. Um anticorpo modificado por engenharia em que um ou mais CDRs de "doador" de um anticorpo não humano de especificidade conhecida é enxertado em uma região framework de cadeia pesada ou leve humana é referido aqui como um "anticorpo humanizado". Pode não ser necessário substituir todas as CDRs com as CDRs completas do domínio variável do doador para transferir a capacidade de ligação de antígeno de um domínio variável para outro. Por outro lado, pode-se ser necessário somente transferir aqueles resíduos que são necessários para manter a atividade do sítio de ligação alvo.

[0108] É adicionalmente reconhecido que as regiões framework no domínio variável em uma cadeia pesada ou leve, ou ambas, de um anticorpo humanizado podem compreender somente resíduos de origem humana, em cujo caso essas regiões framework do anticorpo humanizado são referidas como "regiões framework totalmente humanas" (por exemplo, MAb 2503). Alternativamente, um ou mais resíduos da(s) região(s) framework(s) do domínio variável do doador pode ser modificados por engenharia na posição correspondente da(s) região(s) framework humana(s) de um domínio variável em uma cadeia pesada ou leve, ou ambas, de um anticorpo humanizado se necessário para manter ligação adequada ou para melhorar a ligação no CD100 antígeno. Uma região framework humana que foi modificada por engenharia desta maneira compreenderiam assim uma mistura de resíduos framework de humano e doador, e é referida aqui como um "região framework parcialmente humana".

[0109] Por exemplo, humanização de um anticorpo anti-CD100 pode ser essencialmente realizado seguindo o método de Winter e co-autores (Jones et al., Nature 321:522- 525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)), substituindo sequências de CDRs ou CDR de roedor ou roedor mutante para as sequências correspondentes de um anticorpo anti- CD100 de humano. Vide também Patente U.S Nos. 5.225.539, 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762, 5.859.205; aqui incorporadas por referência. O anticorpo humanizado anti- CD100 resultante compreenderia pelo menos um CDR de roedor ou roedor mutante nas regiões framework totalmente humanas do domínio variável da cadeia leve e/ou pesada do anticorpo humanizado. Em alguns exemplos, resíduos nas regiões framework de um ou mais domínios variáveis do anticorpo humanizado anti-CD100 são substituídos por resíduos não humanos correspondentes (por exemplo, roedor) (vide, por exemplo, Patente U.S Nos. 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762, e 6.180.370), em cujo caso o anticorpo humanizado anti-CD100 resultante compreenderia regiões framework parcialmente humanas no domínio variável da cadeia pesada e/ou leve.

[0110] Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo do recipiente ou no anticorpo do doador. Essas modificações são feitas para refinar adicionalmente o desempenho do anticorpo (por exemplo, para obter afinidade desejada). Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas das CDRs correspondem àquelas de uma imunoglobulina de não humano e todas ou substancialmente todas das regiões framework são aquelas de uma sequência de imunoglobulina de humano. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina de humano. Para detalhes adicionais vide Jones et al., Nature 331:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593- 596 (1992); aqui incorporados pela referência. Dessa maneira, tais anticorpos "humanizados" podem incluir anticorpos em que substancialmente menos que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos framework são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedor. Vide, por exemplo, Patentes U.S Nos. 5.225.539, 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762, 5.859.205. Vide também Patente U.S No. 6.180.370, e publicação internacional No. WO 01/27160, onde anticorpos humanizados e técnicas para produzir anticorpos humanizados tendo maior afinidade para um predeterminado antígeno são revelados.

[0111] Da maneira aqui usada, os termos "ligado", "fundido" ou "fusão" são usados indiferentemente. Esses termos referem-se à união de dois mais elementos ou componentes, por qualquer meio incluindo conjugação química ou meios recombinantes. Uma "fusão em alinhamento" refere-se à união de dois ou mais quadros de leitura abertos de polinucleotídeo (ORFs) para formar um ORF maior contínuo, de uma maneira que mantenha o quadro de leitura translacional correto do ORFs original. Assim, uma proteína de fusão recombinante é uma proteína única contendo dois ou mais segmentos que correspondem a polipeptídeos codificados pelo ORFs original (cujos segmentos não são normalmente assim unidos por natureza). Embora o quadro de leitura tenha assim tornado completamente contínuos os segmentos fundidos, os segmentos podem ser fisicamente ou espacialmente separados, por exemplo, em sequência ligante de alinhamento. Por exemplo, polinucleotídeos que codificam as CDRs de uma região variável de imunoglobulina podem ser fundidos, em alinhamento, mas ser separados por um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma região framework de imunoglobulina ou regiões de CDR adicionais, desde que as CDRs "fundidas" sejam cotraduzidas como parte de um polipeptídeo contínuo.

[0112] No contexto de polipeptídeos, uma "sequência linear" ou uma "sequência" é uma ordem de aminoácidos em um polipeptídeo em um amino para direcionar terminal carboxila em cujos resíduos este vizinho um com o outro na sequência são contínuos na estrutura primária do polipeptídeo.

[0113] O termo "expressão" da maneira aqui usada refere-se a um processo pelo qual um gene produz um produto bioquímico, por exemplo, um polipeptídeo. O processo inclui qualquer manifestação da presença funcional do gene na célula incluindo, sem limitação, gene nocaute bem como tanto expressão quanto e expressão estável. Ele inclui, sem limitação, transcrição do gene no RNA mensageiro (RNAm), e a tradução de tal RNAm no(s) polipeptídeo(s). Se o produto final desejado for um produto bioquímico, a expressão inclui a criação deste produto bioquímico e qualquer precursor. Expressão de um gene produz um "produto genético". Da maneira aqui usada, um produto genético pode ser tanto um ácido nucléico, por exemplo, um RNA mensageiro produzido por transcrição de um gene, quanto um polipeptídeo que é traduzido a partir de uma transcrição. Produtos genéticos descritos aqui adicionalmente incluem ácidos nucléicos com l modificações pós-transcricionais, por exemplo, poliadenilação, ou polipeptídeos com modificações pós-translacionais, por exemplo, metilação, glicosilação, a adição de lipídios, associação com outras subunidades de proteína, clivagem proteolítica e similares.

[0114] Da maneira aqui usada, os termos "tratar" ou "tratamento" referem-se tanto a tratamento terapêutico e profilático quanto preventivo, em que o objetivo é prevenir ou diminuir (reduzir) uma mudança fisiológica ou distúrbio indesejado, tais como a progressão de esclerose múltipla, artrite, ou câncer. Resultados clínicos desejados ou benéficos incluem, mas sem limitações, alívio de sintomas, diminuição da extensão da doença, estado de doença estabilizado (isto é, não piorado), atraso ou redução de progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença, e remissão (quer parcial ou total), quer detectável ou não detectável. "Tratamento" pode também significar prolongamento da sobrevivência comparado com a sobrevivência esperada se não receber tratamento. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles já com a condição ou distúrbio bem como aqueles propensos a ter a condição ou distúrbio ou aqueles em que a condição ou distúrbio deve ser prevenido.

[0115] Por "sujeito" ou "indivíduo" ou "animal" ou "paciente" ou "mamífero," entende-se qualquer sujeito, particularmente um sujeito mamífero, para quem diagnose, prognose, ou terapia são desejados. Sujeitos mamíferos incluem humanos, animais domésticos, animais fazenda, e zoo, esportes, ou animais de estimação tais como cães, gatos, porquinho-da-índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, gado, vacas, e assim por diante.

[0116] Da maneira aqui usada, frases tais como "um sujeito que se beneficiaria da administração de um anticorpo anti-CD100" e "um animal que necessita de tratamento" inclui sujeitos, tais como sujeitos mamíferos, que se beneficiariam da administração de um anticorpo anti-CD100 usado, por exemplo, para detecção de um polipeptídeo de anti-CD100 (por exemplo, para um procedimento de diagnóstico) e/ou de tratamento, isto é, paliação ou prevenção de uma doença, com um anticorpo anti-CD100. Conforme descrito com mais detalhes aqui, um anticorpo anti-CD100 pode ser usado de forma não conjugada ou pode ser conjugado, por exemplo, com um medicamento, promedicamento, ou um isótopo.

II. Descrição do Polipeptídeo Alvo

[0117] Da maneira aqui usada, os termos "CD100" e "polipeptídeo de CD100" são usados indiferentemente. Em certas modalidades, CD100 é expressa na superfície de uma célula ou secretada por ela. Em uma outra modalidade, CD100 é ligado na membrana. Em uma outra modalidade, CD100 é solúvel, por exemplo, sCD100. Em uma outra modalidade, CD100 pode incluir um CD100 de tamanho total ou um fragmento deste, ou um polipeptídeo variante de CD100, em que o fragmento de CD100 ou polipeptídeo variante de CD100 retém alguma ou todas as propriedades funcionais do CD100 totalmente dimensionados.

[0118] O CD100 totalmente dimensionado de proteína humana é uma proteína transmembrana homodimérica que consiste em duas cadeia de polipeptídeos de 150 kDa. CD100 pertence à família de semaforina de receptores da superfície celular e é também referido como SEM A4D. Tanto Sema4D/CD100 de humano quanto de camundongo são proteoliticamente clivada de sua forma transmembrana para gerar formas solúveis 120-kDa, indicando a existência de duas isoformas de Sema4D (Kumanogoh et al., J. Cell Science 116(7):3464 (2003)). Semaforinas consiste em proteínas solúveis e ligadas a membrana que foram originalmente definidas como fatores de diretriz axonal que desempenha um papel importante em estabelecer conexões precisas entre neurônios e seu alvo apropriado. Estruturalmente considerado uma semaforina classe IV, CD100 consiste em uma sequência de sinal do terminal amino seguido por um domínio 'Sema' característico, que contém 17 resíduos de cisteína conservados, um domínio tipo Ig, um estiramento rico em lisina, uma região de transmembrana hidrofóbica, e uma cauda citoplásmica.

[0119] Cada cadeia de polipeptídeo de CD100 inclui uma sequência de sinal de cerca de 13 aminoácidos seguido por uma domínio de semaforina de cerca de 512 aminoácidos, um domínio tipo imunoglobulina (tipo Ig) de cerca de 65 aminoácidos, um estiramento rico em lisina de 104 aminoácidos, uma região de transmembrana hidrofóbica de cerca de 19 aminoácidos, e um cauda citoplásmica de 110 aminoácidos. Um sítio de consenso para fosforilação de tirosina na cauda citoplásmica suporta a associação de CD100 predita com uma tirosina quinase (Schlossman, et al., Eds. (1995) Leucocyte Typing V (Oxford University Press, Oxford).

[0120] Dois tipos de receptores foram identificados para CD100. Um dos receptores, Plexina-B1, é expresso em tecidos não linfóides e mostrou ser um receptor de alta afinidade (1 nM) para CD100 (Tamagnone et al., Cell 99:71-80 (1999)). Estímulo de CD100 de sinalização de Plexina B1 foi mostrado para induzir colapso do cone de crescimento de neurônios, e para induzir colapso de extensão do processo e apoptose de oligodendrócitos (Giraudon et al., J. Immunol. 772:1246-1255 (2004); Giraudon et al., NeuroMolecular Med. 7:207-216 (2005)). Depois da ligação no CD100, sinalização de Plexina B1 média a inativação de R-Ras, levando a uma diminuição na anexação mediada por integrina para a Matriz extracelular, bem como para ativação de Rho, levando ao colapso celular por reorganização do citoesqueleto. Vide Kruger et al., Nature Rev. MoI. Cell Biol 6:789-800 (2005); Pasterkamp, TRENDS in Cell Biology 75:61-64 (2005)).

[0121] Em tecidos linfóides CD72 é utilizado como um receptor de baixa afinidade (300 nM) de CD100 (Kumanogoh et al., Immunity 73:621-631 (2000)). Células B e APCs expressam CD72, e anticorpos anti-CD72 têm muitos dos mesmos efeitos como sCD100, tais como intensificação de respostas de célula B induzida por CD40 e derramamento de célula B de CD23. Considera-se que CD72 é aja como um regulador negativo de respostas cd célula B recrutando a SHP-1 de tirosina fosfatase, que pode associar com muitos receptores inibitórios. Interação de CD100 com CD72 resultou na dissociação de SHP-1, e a perda deste sinal de ativação negativo. CD100 foi mostrado para promover estímulo de célula T e agregação de célula B e sobrevivência in vitro. A adição de células que expressam CD100 ou sCD100 aumenta proliferação de célula B induzida por CD40 e produção de imunoglobulina in vitro, e acelera respostas do anticorpo in vivo (Ishida et al., Inter. Immunol 75:1027-1034 (2003); Kumanogoh e H. Kukutani, Trends in Immunol. 22:670-676 (2001)). sCD100 melhora a maturação induzida por CD40 de DCs, incluindo suprarregulação de moléculas costimulatórias e aumenta a secreção de IL- 12. Além disso, sCD100 pode inibir migração celular imune, que pode ser revertida por adição de anticorpos de camundongo anti-CD100 de bloqueio (Elhabazi et al., J. Immunol. 166:4341-4347 (2001); Delaire et al., J. Immunol. 166:4348-4354 (2001)).

[0122] Sema4D é expresso em altos níveis em órgãos linfóides, incluindo o baço, timo, e linfonódulos, e em órgãos não linfóides, tais como o cérebro, coração, e rim. Em órgãos linfóides, Sema4D é abundantemente expresso nas células T em repouso, mas apenas fracamente expresso nas células B em repouso e células que apresentam antígeno (APCs), tais como células dendríticas (DCs).

[0123] Ativação de célula aumenta a expressão de superfície de CD100 bem como a geração de CD100 solúvel (sCD100). O padrão de expressão de CD100 sugere que ele desempenha um papel fisiológico importante bem como patológico no sistema imune. CD100 mostrou promover ativação de célula B, agregação e sobrevivência; melhorar a proliferação induzida por CD40 e produção de anticorpo; melhorar a resposta do anticorpo para antígenos dependentes de célula T; aumentar a proliferação de célula T; melhorar maturação de célula dendrítica e capacidade para estimular células T; e estar diretamente implicada em desmielinização e degeneração axonal (Shi et al., Immunity 73:633-642 (2000); Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175-1181 (2002); e Watanabe et al., J Immunol 767:4321-4328 (2001)).

[0124] Camundongos knock out CD100 (CD100-/-) têm provido evidência adicional de que CD100 desempenha um papel importante tanto em respostas imunes humoral quanto celular. Não existe nenhuma anormalidade conhecida de tecidos não linfóides em camundongos CD100-/-. Células dendríticas (DCs) dos camundongos CD100-/- têm fraca capacidade aloestimulatória e mostram defeitos na expressão de moléculas costimulatórias, que podem ser resgatadas pela adição de sCD100. Camundongos deficiente em CD100 (CD100-/-) não desenvolvem encefalomielite autoimune experimental induzida por oligodendrócito de mielina peptídeo de glicoproteína, devido a oligodendrócito de mielina de células T específicas de glicoproteína não serem gerado na ausência de CD100 (Kumanogoh et al., J Immunol 7(59:1175-1181 (2002)). Uma quantidade significativa de CD100 solúvel é também detectada no soro de camundongos MRL/lpr propensos a autoimunidade (modelo de doenças autoimunes sistêmicas tais como SLE), mas não em camundongos normais. Adicionalmente, os níveis de sCD100 correlacionam com níveis de auto-anticorpos e aumentam com a idade (Wang et al., Blood 97:3498-3504 (2001)). CD100 solúvel também mostrou acumular no cerebral espinal fluido e soro de pacientes com doença desmielinizantes, e sCD100 induzem apoptose de precursores neurais pluripotentes de humano (células Dev), e tanto inibem extensão do processo quanto induzem apoptose de rato oligodendrócitos in vitro (Giraudon et al., J Immunol 772(2): 1246-1255 (2004)). Esta apoptose foi bloqueada por um MAb anti-CD100.

III. Anticorpos anti-CD100

[0125] Anticorpos que ligam CD100 foram descritos na técnica. Vide, por exemplo, publicação US No. 2008/0219971 A1, pedido de patente internacional WO 93/14125 e Herold et al., Int. Immunol. 7(1): 1-8 (1995), cada qual dos quais está aqui incorporado na sua íntegra pela referência.

[0126] Os anticorpos da invenção compreendem anticorpos de anti-CD100 ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes que ligam a CD100, por exemplo, MAb 2503, 67 MAb, e MAb 76. Em certas modalidades os anticorpos de anti-CD100 ligam CD100 de humano, murino, ou tanto de humano quanto de murino. Em outras modalidades, os anticorpos de anti-CD100 bloqueiam ligação de CD100 no seu receptor, por exemplo, Plexina-B.

[0127] Em uma modalidade, a presente invenção diz respeito a uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste, que se liga especificamente ao mesmo epítopo de CD100 as anticorpo monoclonal 2503, 67 ou 76. Em uma outra modalidade, a presente invenção diz respeito a uma molécula de ligação isolada, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste, que se liga especificamente a CD100, e inibe competitivamente anticorpo monoclonal 2503, 67 ou 76 a partir de ligação especificamente com CD100, por exemplo, CD100 de humano, murino, ou tanto de humano quanto de murino.

[0128] Em certas modalidades, a molécula de ligação da invenção tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, ou cerca de 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos para a molécula do anticorpo anti-CD100 de referência. Em uma modalidade adicional, a molécula de ligação compartilha pelo menos cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou 100% de identidade de sequência com o anticorpo de referência.

[0129] Em uma outra modalidade, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno deste compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste em um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (domínio VH), onde pelo menos uma das CDRs do domínio VH tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou idêntica à CDR1, CDR2 ou CDR3 de SEQ ID NO: 9 ou 10.

[0130] Em uma outra modalidade, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antígeno compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste em um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (domínio VH), onde pelo menos uma das CDRs do domínio VH tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou idêntica à SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 8.

[0131] Em uma outra modalidade, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno deste compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste em uma domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (domínio VH), onde pelo menos uma das CDRs do domínio VH tem uma sequência de aminoácidos idêntica, exceto por 1, 2, 3, 4, ou 5 substituições de aminoácido conservativas, à SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 8.

[0132] Em uma outra modalidade, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno deste compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste em um domínio VH que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10, em que um anticorpo anti-CD100 compreendendo o domínio VH codificado especificamente ou preferencialmente se liga a CD100.

[0133] Em uma outra modalidade, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno deste compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste em uma cadeia leve de domínio variável de imunoglobulina (domínio VL), onde pelo menos uma das CDRs do domínio VL tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou idêntica à CDR1, CDR2 ou CDR3 de SEQ ID NO: 17 ou 18.

[0134] Em uma outra modalidade, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno deste compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste em uma cadeia leve de domínio variável de imunoglobulina (domínio VL), onde pelo menos uma das CDRs do domínio VL tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou idêntica à SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, ou SEQ ID NO: 16.

[0135] Em uma outra modalidade, a presente invenção diz respeito a um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação de antígeno compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste em uma cadeia leve de domínio variável de imunoglobulina (domínio VL), onde pelo menos uma das CDRs do domínio VL tem uma sequência de aminoácidos idêntica, exceto por 1, 2, 3, 4, ou 5 substituições de aminoácido conservativas, à SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, ou SEQ ID NO: 16.

[0136] Em uma modalidade adicional, a presente invenção inclui um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno deste compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste em um domínio VL que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 18, em que um anticorpo anti-CD100 compreendendo o domínio VL codificado especificamente ou preferencialmente se liga a CD100.

[0137] Variantes biologicamente ativas adequadas dos anticorpos de anti- CD100 da invenção podem ser usadas nos métodos da presente invenção. Tais variantes reterão as propriedades de ligação desejadas do anticorpo anti-CD100 pai. Métodos para fazer anticorpos variantes estão geralmente na técnica.

[0138] Métodos para mutagênese e alterações de sequência de nucleotídeo são bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 52:488-492 (1985); Kunkel et al., Metods Enzymol. 154:367-382 (1987); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y.); Patente U.S No. 4.873.192; e as referências aqui citadas; aqui incorporadas pela referência. Diretriz como para substituições de aminoácido apropriadas que não afetam a atividade biológica do polipeptídeo de interesse pode ser encontrada no modelo de Dayhoff et al. (1978) em Atlas of Protein Sequence and Estruture (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C), pp. 345-352, aqui incorporado pela referência na sua íntegra. O modelo de Dayhoff et al. usa o Ponto de Mutação Aceita (PAM) matriz de similaridade de aminoácido (matrix PAM 250) para determinar substituições de aminoácido conservativas adequadas. Pode-se preferir substituições conservativas, tais como troca de um aminoácido com um outro com propriedades similares. Exemplos de substituições de aminoácido conservativas como mostrado pela matrix PAM 250 do modelo Dayhoff et al. incluem, mas sem limitações,

.

[0139] Em variantes de construção da molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste, polipeptídeos de interesse, modificações são feitas de maneira tal que as variantes continuem a ter as propriedades desejadas, por exemplo, sendo capaz de ligar especificamente a um CD100, por exemplo, CD100 de humano, murino, ou tanto de humano quanto de murino, por exemplo, expresso na superfície de uma célula ou secretado nela tendo atividade de bloqueio de CD100, conforme descrito aqui. Obviamente, quaisquer mutações feitas na DNA que codifica o polipeptídeo variante não deve colocar a sequência fora de quadro de leitura e preferivelmente não criará regiões complementares que produziriam estrutura RNAm secundária. Vide EP Publicação do pedido de patente No. 75.444.

[0140] Métodos para medir molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste, especificidade de ligação incluem, mas sem limitações, ensaios de ligação competitiva padrões, ensaios para monitorar secreção de imunoglobulina por células T ou células B, ensaios de proliferação de célula T, ensaios de apoptose, ensaios ELISA, e similares. Vide, por exemplo, tais como ensaios revelados em WO 93/14125; Shi et al., Immunity 75:633642 (2000); Kumanogoh et al., J Immunol 769:1175-1181 (2002); Watanabe et al., J Immunol 767:4321-4328 (2001); Wang et al., Blood 97:3498-3504 (2001); e Giraudon et al., J Immunol 772(2): 1246-1255 (2004), todos os quais estão aqui incorporados pela referência.

[0141] Quando discutido aqui se qualquer polipeptídeo particular, incluindo as regiões constantes, CDRs, domínios VH, ou domínios VL revelados aqui, é pelo menos cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou ainda cerca de 100% idêntico à um outro polipeptídeo, o % de identidade pode ser determinado usando métodos e programas/software de computador conhecidos na técnica tais como, mas sem limitações, o programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computador Grupo, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711). BESTFIT usa o algorítimo de homologia local de Smith and Wateman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489, para encontrar o melhor segmento de homologia entre duas sequências. Quando usando BESTFIT ou qualquer outro programa alinhamento de sequência para determinar se uma sequência particular é, por exemplo, 95% idêntica a uma sequência de referência de acordo com a presente invenção, os parâmetros são ajustados, é claro, de maneira tal que a porcentagem de identidade seja calculada com relação ao comprimento total da sequência de polipeptídeo de referência e que folgas em homologia de até 5% do número total de aminoácidos na sequência de referência são permitidas.

[0142] Com propósito da presente invenção, identidade de porcentagem de sequência pode ser determinada usando o algoritmo de pesquisa de homologia SmithWaterman usando uma pesquisa de folga de afinidade com uma penalidade de abertura de folga de 12 e uma penalidade de extensão de folga de 2, matriz BLOSUM de 62. O algoritmo de pesquisa de homologia Smith-Waterman preceituado em Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489. Uma variante pode, por exemplo, diferir de um anticorpo de referência anti-CD100 (por exemplo, MAb 2503, 67 ou 76) tal como apenas 1 a 15 resíduos de aminoácido, tal como apenas 1 a 10 resíduos de aminoácido, tais como 6-10, tal como apenas 5, tal como apenas 4, 3, 2, ou ainda 1 resíduo de aminoácido.

[0143] A estrutura química precisa de um polipeptídeo capaz de ligar especificamente CD100 e reter a atividade de bloqueio de CD100 desejada depende de inúmeros fatores. Uma vez que grupos amino e carboxila ionizável estão presentes na molécula, um polipeptídeo particular pode ser obtido como um sal ácido ou básico, ou de forma neutra. Todas tais preparações que retêm sua atividade biológica quando colocadas em condições ambientais adequadas estão incluídas na definição de anticorpos de anti-CD100 da maneira aqui usada. Adicionalmente, a sequência de aminoácidos primária do polipeptídeo pode ser aumentada por derivatização usando frações de açúcar (glicosilação) ou por outras moléculas suplementares tais como lipídios, fosfato, grupos acetila e similares. Pode também ser aumentada por conjugação com sacarídeos. Certos aspectos de tal aumento são realizados através de sistemas de processamento pós-translacional do hospedeiro de produção; outras tais modificações podem ser introduzidas in vitro. De qualquer maneira, tais modificações estão incluídas na definição de um anticorpo anti-CD100 usado aqui desde que as propriedades desejadas do anticorpo anti-CD100 não sejam destruídas. Espera-se que tais modificações possam quantitativamente ou qualitativamente afetar a atividade, tanto aumentando quanto diminuindo a atividade do polipeptídeo, nos vários ensaios. Adicionalmente, resíduos de aminoácido individuais na cadeia podem ser modificados por oxidação, redução, ou outra derivatização, e o polipeptídeo pode ser clivado para obter fragmentos que retêm a atividade. Tais alterações que não destroem as propriedades desejadas (por exemplo, especificidade de ligação para CD100, afinidade de ligação, e atividade de bloqueio de CD100) não removem a sequência de polipeptídeo da definição de anticorpos de anti-CD100 de interesse da maneira aqui usada.

[0144] A técnica provê diretriz substancial com relação à preparação e uso de polipeptídeos variantes. Na preparação da molécula de ligação anti-CD100, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste, variantes, versados na tecnologia podem facilmente determinar quais modificações para o nucleotídeo da proteína nativa ou sequência de aminoácidos resultarão em uma variante que é adequada para uso como um componente terapeuticamente ativo de uma composição farmacêutica usada nos métodos da presente invenção.

[0145] A região constante de um anticorpo anti-CD100 pode ser mutada para alterar a função efetora de inúmeras maneiras. Por exemplo, vide Patente U.S No. 6.737.056Bl e Publicação do pedido de patente U.S. No. 2004/0132101A1, que revelam mutações de Fc que otimizam ligação do anticorpo nos receptores de Fc.

[0146] Em certos anticorpos de anti-CD100, a porção Fc pode ser mutada para diminuir a função efetora usando técnicas conhecidas na tecnologia. Por exemplo, a deleção ou inativação (através das mutações do ponto ou outros meios) de um domínio de região constante pode reduzir ligação do receptor de Fc do anticorpo modificado circulante aumentando assim a localização do tumor. Em outros casos, pode ser que as modificações da região constante consistentes com a presente invenção moderem a ligação do complemento e redução assim a meia vida do soro e associação não específica de um citotoxina conjugada. Ainda outras modificações da região constante podem ser usadas para modificar ligações de dissulfeto ou frações de oligossacarídeo que permitem melhor localização devido ao aumento da especificidade do antígeno ou flexibilidade do anticorpo. O perfil fisiológico resultante, biodisponibilidade e outros efeitos bioquímicos das modificações, tais como localização do tumor, biodistribuição e meia vida do soro, pode facilmente ser medidos e quantificados usando técnicas imunológicas bem conhecidas sem experimentação demasiada.

[0147] Anticorpos anti-CD100 da invenção também incluem derivados que são modificados, por exemplo, pela anexação covalente de qualquer tipo de molécula no anticorpo de maneira tal que a anexação covalente não impeça o anticorpo de se ligar especificamente no seu epítopo cognato. Por exemplo, mas não a título de limitação, os derivados do anticorpo incluem anticorpos que foram modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, pegilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação em um ligante celular ou outra proteína, etc. Qualquer uma das inúmeras modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, mas sem limitações, clivagem química específica, acetilação, formilação, etc. Adicionalmente, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos.

[0148] Uma "substituição de aminoácido conservativo" é uma em que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral com uma carga similar. Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais com cargas similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta- ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Alternativamente, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente por toda ou parte da sequência de codificação, tal como por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser classificados para atividade biológica para identificar mutantes que retêm atividade (por exemplo, a capacidade de ligar um polipeptídeo de anti-CD100).

[0149] Por exemplo, é possível introduzir mutações somente em regiões framework ou somente em regiões de CDR de uma molécula do anticorpo. As mutações introduzidas podem ser mutações silenciosas ou de sentido incorreto neutro, isto é, com nenhum ou pouco efeito em uma capacidade do anticorpo de ligar antígeno. Esses tipos de mutações podem ser usados para otimizar uso de códon, ou melhorar uma produção de anticorpo do hibridoma. Alternativamente, mutações de sentido incorreto não neutro podem alterar uma capacidade do anticorpo de ligar antígeno. A localização das mutações mais silenciosas e de sentido incorreto neutro deve provavelmente estar nas regiões framework, enquanto a localização das mutações de sentido mais incorreto não neutro deve provavelmente estar em CDR, apesar disto não ser uma exigência absoluta. Versados na tecnologia poderiam projetar e moléculas mutantes teste com propriedades desejadas tais como nenhuma alteração em atividade de ligação de antígeno ou alteração em atividade de ligação (por exemplo, melhorias em atividade de ligação de antígeno ou mudança na especificidade do anticorpo). Após a mutagênese, a proteína codificada pode rotineiramente ser expressa e e/ou a atividade biológica funcional da proteína codificada, (por exemplo, capacidade de ligar imunoespecificamente pelo menos um epítopo de um polipeptídeo de CD100) pode ser determinada usando técnicas conforme descrito aqui ou modificando rotineiramente técnicas conhecidas na tecnologia.

[0150] Em certas modalidades, os anticorpos de anti-CD100 da invenção compreendem pelo menos uma região determinante de complementariedade otimizada (CDR). Por "CDR otimizada" entende-se que a CDR foi modificada e sequências otimizadas selecionadas com base na afinidade de ligação e/ou atividade de anti-CD100 sustentada ou melhorada que é concedida a um anticorpo anti-CD100 compreendendo a CDR otimizada. "Atividade de anti-CD100 ou "atividade de bloqueio de CD100 pode incluir atividade que modula uma ou mais das seguintes atividades associadas com CD100: ativação de célula B, agregação e sobrevivência; proliferação e produção de anticorpo induzida por CD40; resposta do anticorpo a antígenos dependentes de célula T; célula T ou outra proliferação celular imune; maturação de célula dendrítica; desmielinização e degeneração axonal; apoptose de precursores neurais pluripotentes e/ou oligodendrócitos; indução de migração de célula endotelial; inibição de migração de monócito espontânea; ligação na plexina B1 da superfície celular; ou qualquer outra associação de atividade com CD100 solúvel ou CD100 que é expressa na superfície de células CD100+. Atividade de anti-CD100 pode também ser atribuída a uma diminuição na incidência ou severidade de doenças associada com expressão de CD100, incluindo, mas sem limitações, certos tipos de linfomas, doenças autoimune, doenças inflamatórias incluindo sistema nervoso central (CNS) e sistema nervoso periférico (PNS) doenças inflamatórias, rejeição a transplante, e angiogênese invasiva. Exemplos de anticorpos otimizados com base em MAbs anti- CD100 BD16 de murino e BB18, foram descritos na publicação US No. 2008/0219971 A1, pedido de patente internacional WO 93/14125 and Herold et al., Int. Immunol. 7(1): 1-8 (1995), cada um dos quais está aqui incorporado pela referência na sua íntegra. As modificações podem envolver substituição de resíduos de aminoácido na CDR de maneira tal que um anticorpo anti-CD100 retenha especificidade para o antígeno de CD100 e tenha maior afinidade de ligação e/ou maior atividade de anti-CD100.

IV. Polinucleotídeos Que codificam Anticorpos anti-CD100

[0151] A presente invenção também diz respeito a moléculas de ácido nucléico que codificam anticorpos de anti-CD100 da invenção, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes.

[0152] Em uma modalidade, a presente invenção diz respeito a um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste em um ácido nucléico que codifica um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (domínio VH), onde pelo menos uma das CDRs do domínio VH tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou idêntica à uma sequência de polinucleotídeo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, ou SEQ ID NO: 5.

[0153] Em outras modalidades, a presente invenção diz respeito a um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste em um ácido nucléico que codifica uma imunoglobulina domínio VH, onde pelo menos uma das CDRs do domínio VH é selecionada do grupo que consiste em: (a) um CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 6; (b) uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 7; e (c) uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 8.

[0154] Em uma modalidade adicional, a presente invenção inclui um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste em um ácido nucléico que codifica um domínio VH que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou 100% idêntica à uma sequência de polipeptídeo do domínio VH de referência compreendendo SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10, em que um anticorpo anti-CD100 compreendendo o domínio VH codificado especificamente ou preferencialmente se liga a CD100.

[0155] Em uma modalidade, a presente invenção diz respeito a um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste em um ácido nucléico que codifica uma cadeia leve de domínio variável de imunoglobulina (domínio VL), onde pelo menos uma das CDRs do domínio VL tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou idêntica a uma sequência de polinucleotídeo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, e SEQ ID NO: 13.

[0156] Em outras modalidades, a presente invenção diz respeito a um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste em um ácido nucléico que codifica uma imunoglobulina domínio VL, onde pelo menos uma das CDRs do domínio VL é selecionada do grupo que consiste em: (a) uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 14; (b) uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 15; e (c) uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 16.

[0157] Em uma modalidade adicional, a presente invenção inclui um polinucleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em, ou que consiste em um ácido nucléico que codifica um domínio VL que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou 100% idêntica à uma sequência de polipeptídeo do domínio VL de referência compreendendo SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 18, em que um anticorpo anti-CD100 compreendendo o domínio VL codificado especificamente ou preferencialmente se liga a CD100.

[0158] Qualquer um dos polinucleotídeos supradescritos pode adicionalmente incluir ácidos nucléicos adicionais, que codificam, por exemplo, um peptídeo sinal para direcionar a secreção do polipeptídeo codificado, regiões constantes do anticorpo conforme descrito aqui, ou outros polipeptídeo heterólogos conforme descrito aqui. Também, conforme descrito com mais detalhes em outra parte aqui, a presente invenção inclui composições compreendendo um ou mais dos polinucleotídeos supradescritos.

[0159] Em uma modalidade, a invenção inclui composições compreendendo um primeiro polinucleotídeo e segundo polinucleotídeo em que o dito primeiro polinucleotídeo codifica um domínio VH conforme descrito aqui e em que o dito segundo polinucleotídeo codifica um domínio VL conforme descrito aqui. Especificamente, uma composição que compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em um polinucleotídeo que codifica o domínio VH, conforme apresentado em SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 20, e um polinucleotídeo que codifica o domínio VL, por exemplo, um polinucleotídeo que codifica o domínio VL conforme apresentado em SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 22.

[0160] A presente invenção também inclui fragmentos dos polinucleotídeos da invenção, conforme descrito em outra parte. Adicionalmente, polinucleotídeos que codificam polipolipeptídeos de fusão, fragmentos Fab, e outros derivados, conforme descrito aqui, são também contemplados pela invenção.

[0161] Os polinucleotídeos podem ser produzidos ou fabricados por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, se a sequência de nucleotídeo do anticorpo for conhecida, um polinucleotídeo que codifica o anticorpo pode ser montado a partir de oligonucleotídeos quimicamente sintetizados (por exemplo, conforme descrito em Kutmeier et al., Bio Techniques 77:242 (1994)), que, resumidamente, envolve a síntese de oligonucleotídeos de sobreposição contendo porções da sequência que codifica o anticorpo, anelamento e ligação daqueles oligonucleotídeos, e então amplificação do oligonucleotídeos ligado por PCR.

[0162] Alternativamente, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo anti- CD100, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes da invenção, pode ser gerado a partir de ácido nucléico de uma fonte adequada. Se um clone contendo um ácido nucléico que codifica um anticorpo particular não estiver disponível, mas a sequência da molécula do anticorpo for conhecida, um ácido nucléico que codifica o anticorpo pode ser quimicamente sintetizado ou obtido de uma fonte adequada (por exemplo, uma biblioteca DNAc do anticorpo, ou uma biblioteca DNAc gerada de, ou ácido nucléico, preferivelmente poli A+RNA, isolado de, qualquer tecido ou células que expressam o anticorpo ou outro anticorpo anti-CD100, tais como células hibridomas selecionadas para expressar um anticorpo) por amplificação de PCR usando iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos hibridizável nas extremidades 3' e 5' da sequência ou por clonagem usando uma sonda de oligonucleotídeo específica para a sequência genética particular para identificar, por exemplo, um clone DNAc de uma biblioteca de DNAc que codifica o anticorpo ou outro anticorpo anti- CD100. Ácidos nucléicos amplificados gerado por PCR podem então ser clonados nos vetores de clonagem replicáveis usando qualquer método bem conhecido na técnica.

[0163] Uma vez que a sequência de nucleotídeo e sequência correspondente de aminoácido do anticorpo anti-CD100, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes são determinados, sua sequência de nucleotídeo pode ser manipulada usando métodos bem conhecidos na técnica para a manipulação de sequência de nucleotídeos, por exemplo, técnicas de DNA recombinante, mutagênese direcionada ao sítio, PCR, etc. (vide, por exemplo, as técnicas conforme descrito em Sambrook et al. (1990) Molecular Cloning, a Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.) and Ausubel et al., eds. (1998) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY), que estão ambos incorporados aqui pela referência na sua íntegra), para gerar anticorpos tendo uma diferente sequência de aminoácidos, por exemplo, para criar substituições de aminoácido, deleções, e/ou inserções.

[0164] Um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação de anti- CD100, por exemplo, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes, pode ser composto de qualquer polirribonucleotídeo ou polideoxiribonucleotídeo, que pode ser não RNA ou DNA modificado ou RNA ou DNA modificado. Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica anticorpo anti-CD100, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes pode ser composto de DNA de fita única e dupla, DNA que é uma mistura de regiões de fita única e dupla, RNA de fita única e dupla, e RNA que é mistura de regiões de fita única e dupla, moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA que podem ser de fita única ou, mais tipicamente, de fita dupla ou uma mistura de regiões de fita única e dupla. Além disso, um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes pode ser composta de regiões de fita tripla compreendendo RNA ou DNA ou tanto RNA quanto DNA. Um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes, pode também conter uma ou mais bases modificadas de DNA ou RNA ou espinhas dorsais modificadas para estabilidade ou por outros motivos. Bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tritiladas e bases incomuns tal como inosina. Uma variedade de modificações pode ser feita em DNA e RNA; assim, "polinucleotídeo" abrange formas modificadas quimicamente, enzimaticamente, ou metabolicamente.

[0165] Um polinucleotídeo isolado que codifica uma variante não natural de um polipeptídeo derivado de uma imunoglobulina (por exemplo, uma porção de cadeia pesada de imunoglobulina ou porção de cadeia leve) pode ser criado introduzindo uma ou mais substituições de nucleotídeo, adições ou deleções na sequência de nucleotídeo da imunoglobulina de maneira tal que uma ou mais substituições de aminoácido, adições ou deleções sejam introduzidas na proteína codificada. Mutações podem ser introduzidas por técnicas padrões, tais como mutagênese direcionada ao sítio e mutagênese mediada por PCR. Preferivelmente, substituições de aminoácido conservativas são feitas em um ou mais resíduos de aminoácido não essenciais.

V. Proteínas de fusão e Conjugados do Anticorpo

[0166] Conforme discutido com mais detalhes em outra parte aqui, moléculas de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpos da invenção, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes, podem adicionalmente ser recombinantemente fundidas com um polipeptídeo heterólogo no terminal N ou C ou quimicamente conjugado (incluindo conjugações covalentes e não covalentes) com polipeptídeos ou outras composições. Por exemplo, anticorpos de anti-CD100 podem ser recombinantemente fundidos ou conjugados com moléculas usadas como marcadoras em ensaios de detecção e moléculas efetoras tais como polipeptídeos heterólogos, medicamentos, radionucleotídeos, ou toxinas. Vide, por exemplo, publicações PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; Patente U.S No. 5.314.995; e EP 396.387.

[0167] Anticorpos anti-CD100 da invenção, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes, podem incluir derivados que são modificados, isto é, pela anexação covalente de qualquer tipo de molécula no anticorpo de maneira tal que a anexação covalente não impeça a ligação do anticorpo anti-CD100. Por exemplo, mas não a título de limitação, os derivados do anticorpo incluem anticorpos que foram modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação em um ligante celular ou outra proteína, etc. Qualquer uma das numerosas modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, mas sem limitações, clivagem química específica, acetilação, formilação, etc. Adicionalmente, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos. Moléculas de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpos da invenção, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes, pode ser composto de aminoácidos unidos uns nos outros por ligações de peptídeo ou ligações de peptídeo modificadas, isto é, isósteres de peptídeo, e podem conter aminoácidos sem ser os 20 aminoácidos codificados pelo gene. Por exemplo, anticorpos de anti- CD100 podem ser modificados por processos naturais, tais como processamento pós- translacional, ou por técnicas de modificação química que são bem conhecidas na tecnologia. Tais modificações estão bem descritas em textos básicos e em monográficos mais detalhados, bem como em uma literatura de pesquisa volumosa. Modificações podem ocorrer em qualquer parte na molécula de ligação de anti-CD100, incluindo a espinha dorsal do peptídeo, as cadeias laterais de aminoácido e os terminais amino ou carboxila, ou nas frações tais como carboidratos. Será percebido que o mesmo tipo de modificação pode estar presente no mesmo ou em graus variados em diversos sítios em uma dada molécula de ligação de anti-CD100. Também, uma dada molécula de ligação de anti-CD100 pode conter muitos tipos de modificações. Moléculas de ligação de anti-CD100 pode ser ramificada, por exemplo, em decorrência de ubiquitinação, e Elas podem ser cíclicas, com ou sem ramificações. Molécula de ligação de anti-CD100 cíclicas, ramificada, e cíclica ramificada pode resultar de processos naturais pós-translação ou pode ser feita por métodos sintéticos. Modificações incluem acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, anexação covalente de flavina, anexação covalente de uma fração heme, anexação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, anexação covalente de um lipídio ou derivado de lipídio, anexação covalente de fosfotidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligação de dissulfeto, demetilação, formação de reticulação covalente, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodinação, metilação, miristoilação, oxidação, peguilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, adição de aminoácidos mediada por RNA de transferência nas proteínas tais como arginilação, e ubiquitinação. (Vide, por exemplo, Proteins— Structure and Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, NY; 2nd ed. (1993); Johnson, ed. (1983) Posttranslacional Covalent Modification of Proteins (Academic Press, NY), pgs. 1-12; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann. NY Acad. Sci 553:48-62 (1992)).

[0168] A presente invenção também diz respeito a proteínas de fusão compreendendo um anticorpo anti-CD100, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes, e um polipeptídeo heterólogo. O polipeptídeo heterólogo no qual o anticorpo é fundido pode ser usado para funcionar ou ser usado para alvejar as células que expressam o polipeptídeo de anti-CD100.

[0169] Em uma modalidade, uma proteína de fusão da invenção compreende, consiste essencialmente, ou consiste em um polipeptídeo com a sequência de aminoácidos de qualquer um ou mais dos domínios VH de um anticorpo da invenção ou a sequência de aminoácidos de qualquer um ou mais dos domínios VL de um anticorpo da invenção ou fragmentos ou variantes deste, e um polipeptídeo heterólogo sequência.

[0170] Em uma outra modalidade, uma proteína de fusão para uso nos métodos de diagnóstico e tratamento revelados aqui compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma, duas, três das CDRs do domínio VH de um anticorpo anti-CD100, ou fragmentos, variantes, ou derivados destes, ou a sequência de aminoácidos de qualquer uma, duas, três das CDRs do domínio VL de um anticorpo anti-CD100, ou fragmentos, variantes, ou derivados destes, e uma sequência de polipeptídeo heteróloga. Em uma modalidade, uma proteína de fusão compreende um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de pelo menos um domínio VH de um anticorpo anti-CD100 da invenção e a sequência de aminoácidos de pelo menos um domínio VL de um anticorpo anti-CD100 da invenção ou fragmentos, derivados ou variantes deste, e uma sequência de polipeptídeo heteróloga. Preferivelmente, o domínios de VH e VL da proteína de fusão corresponde a um anticorpo de fonte única (ou fragmento de scFv ou Fab) que liga especificamente pelo menos um epítopo de CD100. Ainda em uma outra modalidade, uma proteína de fusão para uso nos métodos de diagnóstico e tratamento revelados aqui compreende um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de qualquer uma, duas, três ou mais das CDRs do domínio VH de um anticorpo anti-CD100 e a sequência de aminoácidos de qualquer uma, duas, três ou mais das CDRs do domínio VL de um anticorpo anti-CD100, ou fragmentos ou variantes deste, e uma sequência de polipeptídeo heteróloga. Preferivelmente, dois, três, quatro, cinco, seis, ou mais da CDR(s) do domínio VH ou domínio VL correspondem ao anticorpo de fonte única (ou fragmento de scFv ou Fab) da invenção. Moléculas de ácido nucléico que codificam essas proteínas de fusão são também englobadas pela invenção.

[0171] Proteínas de fusão exemplares reportadas na literatura incluem fusões do receptor de célula T (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 54:2936-2940 (1987)); CD4 (Capon et al., Nature 337:525-531 (1989); Traunecker et al., Nature 339:68-70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9:347-353 (1990); and Byrn et al., Nature 344:661- 670(1990)); L-selectina (receptor hospedeiro) (Watson et al., J. Cell. Biol. 110:2221-2229 (1990); e Watson et al., Nature 349:164-167 (1991)); CD44 (Aruffo et al., Cell 57:1303-1313 (1990)); CD28 e B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173:721-730 (1991)); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174:561-569 (1991)); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66:1133-1144 (1991)); receptor de TNF (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:10535-10539 (1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27:2883-2886 (1991); and Peppel et al., J. Exp. Med. 774:1483-1489 (1991)); e um receptor de IgE (Ridgway and Gorman, J. Cell. Biol. Vol. 115, Abstract No. 1448 (1991)).

[0172] Conforme discutido em outra parte aqui, moléculas de ligação de anti- CD100, por exemplo, anticorpos da invenção, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes, podem ser fundidos nos polipeptídeos heterólogos para aumentar a meia vida in vivo dos polipeptídeos ou para uso em imunoensaios usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade, PEG pode ser conjugado com os anticorpos de anti-CD100 da invenção para aumentar sua meia vida in vivo. Vide Leong et al., Citokine 7(5:106 (2001); Adv. in Drug. Deliv. Rev. 54:531 (2002); or Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30:512 (2002).

[0173] Além do mais, moléculas de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpos da invenção, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes, podem ser fundidas para marcar sequências, tais como um peptídeo para facilitar sua purificação ou detecção. Em modalidade preferidas, o marcador de sequência de aminoácidos é um peptídeo hexa-histidina, tal como o marcador provido em um vetor pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre outros, muitos dos quais são comercialmente disponíveis. Conforme descrito em Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 5(5:821-824 (1989), por exemplo, hexa- histidina provê purificação conveniente da proteína de fusão. Outras etiquetas de peptídeo usadas para purificação incluem, mas sem limitações, o marcador "HA", que corresponda a um derivado de epítopo da proteína influenza hemaglutinina (Wilson et al., Cell 37:161 (1984)) e o marcador "flag".

[0174] Proteínas de fusão podem ser preparadas usando métodos que são bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Patente U.S Nos. 5.116.964 e 5.225.538). O sítio preciso no qual a fusão é feita pode ser selecionado empiricamente para otimizar a secreção ou características de ligação da proteína de fusão. DNA que codifica a proteína de fusão é então transfectado em uma célula hospedeira para expressão.

[0175] Moléculas de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpos da presente invenção, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes, podem ser usados em forma não conjugada ou podem ser conjugados com pelo menos um de uma variedade de moléculas, por exemplo, para melhorar as propriedades terapêuticas da molécula, para facilitar a detecção alvo, ou para imageamento ou terapia do paciente. Moléculas de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpos da invenção, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes, podem ser marcados ou conjugados tanto antes quanto depois da purificação, ou quando a purificação é realizada.

[0176] Em particular, anticorpos de anti-CD100 da invenção, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes, podem ser conjugados com agentes terapêuticos, promedicamentos, peptídeos, proteínas, enzimas, vírus, lipídios, modificadores de resposta biológica, agentes farmacêuticos, ou PEG.

[0177] Versados na técnica perceberão que conjugados podem também ser montados usando uma variedade de técnicas dependendo do agente selecionado para ser conjugado. Por exemplo, conjugados com biotina são preparados, por exemplo, reagindo um polipeptídeo de ligação com um éster ativado de biotina tal como a biotina N-hidroxisuccinimida éster. Similarmente, conjugado com um marcador fluorescente pode ser preparado na presença de um agente de acoplamento, por exemplo, aqueles listados aqui, ou por reação com um isotiocianato, preferivelmente fluoresceína-isotiocianato. Conjugado dos anticorpos de anti-CD100 da invenção, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes, são preparados de uma maneira análoga.

[0178] A presente invenção adicionalmente engloba moléculas de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpos da invenção, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes, conjugados como um diagnóstico ou agente terapêutico. Os anticorpos de anti-CD100, incluindo fragmentos de ligação de antígeno, variantes, e derivados destes, podem ser usados diagnosticamente, por exemplo, para monitorar o desenvolvimento ou progressão de uma doença como parte de um procedimento de teste clínico, por exemplo, para determinar a eficácia de um dado tratamento e/ou regime de prevenção. Por exemplo, detecção pode ser facilitada acoplando o anticorpo anti-CD100, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes, em uma substância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, materiais radioativos, metais de emissão de pósitron usando várias tomografias de emissão de pósitron, e íons metálicos paramagnéticos não reativos. Vide, por exemplo, Patente U.S No. 4.741.900 para íons metálicos que podem ser conjugados com anticorpos para uso como diagnósticos de acordo com a presente invenção. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, β- galactosidase, ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupo protético adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, fluoresceína isotiocianato, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e aequorina; e exemplos de adequado material radioativo incluem 125I, 131I, 111In, 90Y, ou 99Tc.

[0179] Uma molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes, pode ser conjugada com uma fração terapêutica tal como uma citotoxina, um agente terapêutico ou um íon metálico radioativo. Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja detrimental para células.

[0180] Uma molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes, também pode ser marcada detectavelmente acoplando-a com um composto quimiluminescente. A presença da molécula de ligação de anti-CD100 quimiluminescente-marcada é então determinada detectando a presença de luminescência que surge durante o curso de uma reação química. Exemplos de compostos quimiluminescente marcados particularmente usados são luminol, isoluminol, éster de acridínio teromático, imidazol, sal de acridínio e éster de oxalato.

[0181] Uma das maneiras nas quais um anticorpo anti-CD100, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes, podem ser detectavelmente marcados é ligando os mesmos a uma enzima e usando o produto ligado em um imunoensaio da enzima (EIA) (Voller, A., "The Enzyme Linked Imunosorbent Assay (ELISA)" Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md.; Diagnostic Horizons 2:1-7 (1978); Voller et al., J. CHn. Pathol. 37:507-520 (1978); Butler, Meth. Enzymol. 73:482-523 (1981); Maggio, ed. (1980) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FIa.; Ishikawa et al., eds. (1981) Enzyme Immunoassay (Kgaku Shoin, Tokyo). A enzima, que é ligada no anticorpo anti-CD100 reagirá com um substrato apropriado, preferivelmente um substrato cromogênico, de uma tal maneira para produzir uma fração química que pode ser detectada, por exemplo, por meios espectrofotométricos, fluorimétricos ou por meios visuais. Enzimas que pode ser usadas para marcar detectavelmente o anticorpo incluem, mas sem limitações, malato deidrogenase, estafilococo nuclease, delta-5-esteróide isomerase, levedura álcool deidrogenase, alfa-glicerofosfato, deidrogenase, triose fosfato isomerase, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, asparaginase, glicose oxidase, beta- galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose-6-fosfato deidrogenase, glicoamilase e acetilcolinesterase. Adicionalmente, a detecção pode ser realizada por métodos colorimétricos que empregam um substrato cromogênico para a enzima. Detecção pode também ser realizada por comparação visual da extensão da reação enzimática de um substrato em comparação com padrões similarmente preparados.

[0182] Detecção pode também ser realizada usando qualquer de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, marcando radioativamente a molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes, é possível detectar a molécula de ligação através do uso de um radioimunoensaio (RIA) (vide, por exemplo, Weintraub (March, 1986) Principles of Radioimunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assays Techniques (The Endocrine Society), que está incorporado aqui pela referência). O isótopo radioativo pode ser detectado por dispositivos incluindo, mas sem limitações, um contador gama, um contador ciantilação, ou autoradiografia.

[0183] Uma molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes, pode também ser detectavelmente marcada usando metais de emissão de fluorescência tais como 152Eu, ou outra série do lantanida. Esses metais podem ser anexados na molécula de ligação usando tais grupos quelantes de metal como ácido dietilenotriaminapentacético (DTPA) ou ácido etilenediaminatetra-acético (EDTA).

[0184] Técnicas para conjugar várias frações com um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-CD100), ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes, são bem conhecidas, vide, por exemplo, Amon et al. (1985) "Monoclonal Antibodies for Imunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-56; Hellstrom et al. (1987) "Antibodies for Drugs Delivery," in Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2nd ed.; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623- 53); Thorpe (1985) "Antibodies Carriers of Citotoxic Agent in Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Cancer '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al., pp. 475-506; "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Cancer in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al., Academic Press, pp. 303-16 (1985); and Thorpe et al. (1982) "The Preparation and Citotoxic Properties of Antibody -Toxin Conjugates," Immunol. Rev. 62:119-58.

VI. Expressão de Polipeptídeos de Anticorpo

[0185] Sequências de DNA que codificam as cadeias leves e as pesadas do anticorpo podem ser feitas, tanto simultaneamente quanto separadamente, usando transcriptase reversa e DNA polimerase de acordo com métodos bem conhecidos. PCR pode ser iniciado por iniciadores de oligonucleotídeo da região constante de consenso ou por iniciadores de oligonucleotídeo mais específicos com base em o DNA da cadeia pesada e leve e sequências de aminoácidos publicadas. Conforme discutido anteriormente, PCR também pode ser usado para isolar clones de DNA que codificam as cadeias leves e pesadas do anticorpo. Neste caso as bibliotecas podem ser classificadas por iniciadores de oligonucleotídeo de consenso ou sondas homólogas grandes, tais como sondas da região constante de camundongo.

[0186] DNA, tipicamente DNA de plasmídeo, pode ser isolado das células usando técnicas conhecidas na tecnologia, restrição mapeada e sequenciada de acordo com padrão, técnicas bem conhecidas, apresentado com detalhes, por exemplo, nas referências anteriores com relação às técnicas de DNA recombinante. Certamente, o DNA pode ser sintético de acordo com a presente invenção em qualquer ponto durante o processo de isolação ou análise subsequente.

[0187] Depois da manipulação do material genético isolado para prover anticorpos de anti-CD100, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes, da invenção, os polinucleotídeos que codificam os anticorpos de anti-CD100 são tipicamente inseridos em um vetor de expressão para introdução nas células hospedeiras que podem ser usadas para produzir a quantidade desejada de anticorpo anti-CD100.

[0188] Expressão recombinante de um anticorpo, ou fragmento, derivado ou análogo destes, por exemplo, uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo que se liga a uma molécula alvo descrita aqui, por exemplo, CD100, exige construção de um vetor de expressão contendo um polinucleotídeo que codifica o anticorpo. Uma vez que foi obtido um polinucleotídeo que codifica uma molécula do anticorpo ou uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, ou porção desta (preferivelmente contendo o domínio variável de cadeia pesada ou leve), da invenção, o vetor para a produção da molécula do anticorpo pode ser produzido por tecnologia de DNA recombinante usando técnicas bem conhecidas na tecnologia. Assim, métodos para preparar uma proteína porque expressam um polinucleotídeo contendo um anticorpo que codifica sequência de nucleotídeo são descrito aqui. Métodos que são bem conhecidos pelos versados na técnica podem ser usados para construir vetores de expressão contendo sequências de codificação de anticorpo e sinais de controle transcripcional e translacional apropriados. Esses métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vivo. A invenção, assim, diz respeito a vetores replicáveis compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica uma molécula do anticorpo da invenção, ou uma cadeia pesada ou leve desta, ou um domínio variável de cadeia pesada ou leve, operacionalmente ligada a um promotor. Tais vetores podem incluir a sequência de nucleotídeo que codifica a região constante da molécula do anticorpo (vide, por exemplo, Publicação de PCT WO 86/05807; Publicação de PCT WO 89/01036; e Patente U.S No. 5.122.464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado em um vetor como esse para expressão da cadeia pesada ou leve completa.

[0189] O termo "vetor" ou "vetor de expressão" é usado aqui para significar vetores usados de acordo com a presente invenção como um veículo para introduzir e expressar um gene desejado em uma célula hospedeira. Conforme conhecido pelos versados na técnica, tais vetores podem facilmente ser selecionados do grupo que consiste em plasmídeos, fagos, vírus e retrovírus. Em geral, vetores compatíveis com a presente invenção compreenderão um marcador de seleção, sítios de restrição apropriados para facilitar clonagem do gene desejado e a capacidade de entrar e/ou replicar em células eucarióticas ou procarióticas.

[0190] Com os propósitos desta invenção, numerosos sistemas de vetor de expressão podem ser empregados. Por exemplo, uma classe de vetor utiliza elementos de DNA que são derivados de vírus de animal tais como vírus do papiloma bovino, vírus polioma, adenovírus, vírus vaccinia, baculovírus, retrovírus (RSV, MMTV ou MOMLV) ou vírus SV40. Outros envolvem o uso de sistemas policistrônicos com sítios de ligação de ribossomo internos. Adicionalmente, células que têm integrado o DNA nos seus cromossomos podem ser selecionadas introduzindo um ou mais marcadores que permitem seleção de células hospedeiras transfectadas. O marcador pode prover prototrofia para um hospedeiro auxotrófico, resistência a biocida (por exemplo, antibióticos) ou resistência a metais pesados tal como cobre. O gene marcador selecionável pode tanto ser diretamente ligado nas sequências de DNA para ser expresso, quanto introduzido na mesma célula por cotransformação. Elementos adicionais podem também ser necessários para síntese de RNAm ideal. Esses elementos podem incluir sequência de sinal, sinais de montagem, bem como promotores transcricionais, melhoradores, e sinais de terminação.

[0191] Em modalidades particularmente preferidas os genes da região variável clonados são inseridos em um vetor de expressão junto com genes da região constante da cadeia pesada e leve (preferivelmente humanos) sintetizados conforme discutido anteriormente. Certamente, qualquer vetor de expressão que é capaz de elicitar expressão em células eucarióticas pode ser usado na presente invenção. Exemplos de vetores adequados incluem, mas sem limitações, plasmídeos pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3,1, pEF I/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER- HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, e pZeoSV2 (disponível pela Invitrogen, San Diego, Calif.), e plasmídeo pCI (disponível pela Promega, Madison, Wis.). Em geral, classificar grandes números de células transformadas com relação àquelas que expressam adequadamente altos níveis em cadeias pesadas e leves de imunoglobulina é experimentação de rotina que pode ser realizada, por exemplo, por sistemas robóticos.

[0192] Mais geralmente, uma vez o vetor ou sequência de DNA que codifica uma subunidade monomérica do anticorpo anti-CD100 foi preparada, o vetor de expressão pode ser introduzido em uma célula hospedeira apropriada. Introdução do plasmídeo na célula hospedeira pode ser realizada por várias técnicas bem conhecidas pelos de versados na tecnologia. Essas incluem, mas sem limitações, transfecção (incluindo eletroforese e eletroporação), fusão de protoplasta, precipitação de fosfato de cálcio, fusão celular com DNA envelopado, microinjeção, e infecção com vírus intacto. Vide, Ridgway (1988) "Mammallian Expression Vectors" in Vectors, ed. Rodriguez and Denhardt (Butterworths, Boston, Mass.), Chapter 24.2, pp. 470-472. Tipicamente, introdução de plasmídeo no hospedeiro é por meio de eletroporação. As células hospedeiras que abrigam o construto de expressão são crescidas em condições apropriadas para a produção das cadeias leves e cadeias pesadas, e ensaiadas para síntese de proteína da cadeia pesada e/ou leve. Técnicas de ensaio exemplares incluem ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), ou análise classificadora de célula ativada por fluorescência (FACS), imunohistoquímica e similares.

[0193] O vetor de expressão é transferido para uma célula hospedeira por técnicas convencionais, e as células transfectadas são então cultivadas por técnicas convencionais para produzir um anticorpo para uso nos métodos descritos aqui. Assim, a invenção inclui células hospedeiras contendo um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da invenção, ou uma cadeia pesada ou leve deste, operacionalmente ligada a um promotor heterólogo. Em modalidades preferidas para a expressão de anticorpos de cadeia dupla, vetores que codificam tanto as cadeias pesada quanto leves podem ser co-expressos na célula hospedeira para expressão da toda a molécula de imunoglobulina, da maneira detalhada a seguir.

[0194] Da maneira aqui usada, "células hospedeiras" referem-se às células que abrigam vetores construídos usando técnicas de DNA recombinante e que codificam pelo menos um gene heterólogo. Nas descrições de processos para isolação de anticorpos de hospedeiros recombinantes, os termos "célula" e "cultura celular" são usados indiferentemente para denotar a fonte de anticorpo a menos que seja claramente especificado de outra forma. Em outras palavras, recuperação de polipeptídeo das "células" pode significar tanto de células totais centrifugadas, quanto da cultura celular contendo tanto o meio quanto as células suspensas.

[0195] Uma variedade de sistemas de vetor de expressão de hospedeiro pode ser utilizada para expressar moléculas do anticorpo para uso nos métodos descritos aqui. Tais sistemas de expressão de hospedeiro representam veículos pelos quais as sequências de codificação de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências de codificação de nucleotídeo apropriadas, expressar uma molécula do anticorpo da invenção in situ. Essas incluem, mas sem limitações, micro-organismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas com vetores de expressão de DNA de bacteriófago recombinante, DNA de plasmídeo ou DNA de cosmídeo contendo sequências de codificação de anticorpo; leveduras (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas com vetores de expressão de levedura recombinante contendo sequências de codificação de anticorpo; sistemas de célula de inseto infectados com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, baculovírus) contendo sequências de codificação de anticorpo; sistemas célula de planta de infectadas com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, vírus do mosaico de couve-flor, CaMV; vírus do mosaico de tabaco, TMV) ou transformadas com vetores de expressão do plasmídeo recombinante (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo sequências de codificação de anticorpo; ou sistemas de célula de mamífero (por exemplo, células COS, CHO, BLK, 293, 3T3) que abrigam construtos de expressão recombinante contendo promotores derivados do genoma de células de mamífero (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamífero (por exemplo, o promotor posterior de adenovírus; o promotor do vírus da vaccinia 7.5K). Preferivelmente, células bacterianas tais como Escherichia coli, e mais preferivelmente, células eucarióticas, especialmente para a expressão de molécula do anticorpo recombinante total, são usados para a expressão de uma molécula do anticorpo recombinante. Por exemplo, células de mamífero tais como células do ovário de hamster chinês (CHO), junto com um vetor tal como o principal promotor do elemento do gene anterior intermediário de citomegalovírus humano é um sistema expressão efetivo para anticorpos (Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Tecnology 8:2 (1990)).

[0196] A linhagem de célula hospedeira usada para expressão de proteína é frequentemente de origem mamífera; versados na técnica têm a capacidade de determinar preferencialmente linhagens de célula hospedeira particulares que são melhor apropriadas para o produto genético desejado a ser expresso nelas. As linhagens de célula hospedeira exemplares incluem, mas sem limitações, CHO (Ovário de hamster chinês), DG44 e DUXB11 (linhagens de ovário de hamster chinês, menos DHFR), HELA (carcinoma cervical de humano), CVI (linhagem de rim de macaco), COS (um derivado de CVI com antígeno SV40 T), MUITO, BHK (rim de filhote de hamster), MDCK, 293, WD 8, R1610 (fibroblasto hamster chinês) BALBC/3T3 (fibroblasto de camundongo), HAK (linhagem de rim de hamster), SP2/0 (mieloma de camundongo), P3.times.63-Ag3.653 (mieloma de camundongo), BFA- IcIBPT (células endoteliais bovinas), RAJI (linfócito humano) e 293 (rim humano). Linhagens de célula hospedeira são tipicamente disponíveis pelos serviços comerciais, o American Tecido Culture Coleção ou da literatura publicada.

[0197] Além disso, uma cepa da célula hospedeira pode ser escolhida que modula a expressão das sequências inseridas, ou modifica e processa o produto genético do mod específico desejado. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos de proteína podem ser importantes para a função da proteína. Células hospedeiras diferentes têm característica e mecanismos específicos para o processamento pós-translacional e modificação de proteínas e produto genéticos. Linhagens celulares apropriadas ou sistemas de hospedeiro podem ser escolhidos para garantir a modificação correta e processamento da proteína estrangeira expressa. Com esta finalidade, podem ser usadas células eucarióticas hospedeiras que possuem o maquinário celular para processamento adequado da transcrição primária, glicosilação, e fosforilação de produto genético.

[0198] A longo prazo, produção de alto rendimento de proteínas recombinantes, expressão estável é preferida. Por exemplo, linhagens celulares que expressam estavelmente a molécula do anticorpo podem ser modificadas por engenharia. Em vez de usar vetores de expressão que contêm origens virais de replicação, células hospedeiras podem ser transformadas com DNA controlado por elementos de controle de expressão apropriados (por exemplo, promotor, melhorador, sequências, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.), e um marcador selecionável. Depois da introdução do DNA estrangeiro, células modificadas por engenharia pode ser deixadas crescer por 1-2 dias em um meio enriquecido, e então são comutados em um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência para a seleção e permite que as células integrem estavelmente o plasmídeo nos seus cromossomos e cresçam para formar forragem que por sua vez pode ser clonado e expandido nas linhagens celulares. Este método pode vantajosamente ser usado para modificar por engenharia linhagens celulares que expressam estavelmente a molécula do anticorpo

[0199] Inúmeros sistemas de seleção podem ser usados, incluindo, mas sem limitações, os genes de timidina quinase do vírus simples do herpes (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), hipoxantina- guanina fosforibosiltransferase (Szybalska and Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci USA 48:202 (1992)), e adenina fosforibosiltransferase (Lowy et al., Cell 22:811 (1980)) podem ser empregados em células tk-, hgprt- ou aprt- , respectivamente. Também, resistência antimetabólita pode ser usada como a base de seleção para o seguintes genes: dhfr, que confere resistência a metotrexato (Wigler et al., Natl. Acad. Sci USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:1527 (1981)); gpt, que confere resistência a ácido micofenólico (Mulligan and Berg, Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:2072 (1981)); neo, que confere resistência ao aminoglicosídeo G-418 Clinical Pharmacy 12:488- 505; Wu and Wu, Biotherapy 3:8795 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. (52:191217 (1993); TIB TECH 11(5): 155-215 (Pode, 1993); e higro, que confere resistência a higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984). Métodos que podem ser usados comumente conhecidos na tecnologia da técnica de DNA recombinante são descritos em Ausubel et al. (1993) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY); Kriegler (1990) "Gene Transfer and Expression" in A Laboratory Manual (Stockton Press, NY); Dracopoli et al. (eds) (1994) Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons, NY) Chapters 12 e 13; Colberre-Garapin et al. (1981) J. MoI. Biol. 150:1, que estão incorporados aqui pela referência na sua íntegra.

[0200] Os níveis de expressão de uma molécula do anticorpo podem ser aumentados por amplificação do vetor (para uma revista, vide Bebbington and Hentschel (1987) "The Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Clones Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning" (Academic Press, NY) Vol. 3. Quando um marcador no sistema de vetor que expressa anticorpo é amplificável, aumento no nível de inibidor presente na cultura de célula hospedeira aumentará o número de cópias do marcador genético. Uma vez que a região amplificada está associada com o gene do anticorpo, produção do anticorpo também aumentará (Grouse et al., MoI. Cell. Biol. 3:257 (1983)).

[0201] Produção In vitro permite utilizar grandes escala para dar grandes quantidades dos polipeptídeos desejados. Técnicas para cultivo de célula de mamífero em condições de cultura do tecido são conhecidas na técnica e incluem cultura de suspensão homogênea, por exemplo, em um reator de elevação de ar ou em um reator agitador contínuo, ou cultura celular imobilizada ou aprisionada, por exemplo, em fibras ocas, microcápsulas, nas microesferas de agarose ou cartuchos cerâmicos. Se necessário e/ou desejado, as soluções de polipeptídeos podem ser purificadas pelos métodos de cromatografia usuais, por exemplo, filtração de gel, cromatografia de troca iônica, cromatografia sobre celulose DEAE ou cromatografia de (imuno-)afinidade, por exemplo, depois de biossíntese preferencial de um polipeptídeo região de articulação sintético ou antes ou subsequente à etapa de cromatografia HIC descrita aqui.

[0202] Genes que codificam anticorpos de anti-CD100, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes da invenção podem também ser expressos em células não de mamíferas tais como inseto, bactérias ou levedura ou célula de plantas. Bactérias que captam facilmente ácidos nucléicos incluem elementos de enterobacteriaceae, tais como cepas de Escherichia coli ou Salmonella; Bacillaceae, tais como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus, e Haemophilus influenzae. Será adicionalmente percebido que, quando expressos em bactérias, os polipeptídeos heterólogos tipicamente tornam parte de corpos de inclusão. Os polipeptídeos heterólogos devem ser isolados, purificados e então montados nas moléculas funcionais. Onde formas tetravalentes de anticorpos são desejadas, as subunidades automontarão então nos anticorpos tetravalentes (WO 02/096948A2).

[0203] Em sistemas bacterianos, inúmeros vetores de expressão podem ser vantajosamente selecionados dependendo do uso destinado à molécula do anticorpo sendo expresso. Por exemplo, quando uma grande quantidade de uma proteína como essa deve ser produzida, para a geração de composições farmacêuticas de uma molécula do anticorpo, vetores que direcionam a expressão de altos níveis de produtos da proteína de fusão que são facilmente purificados podem ser desejáveis. Tais vetores incluem, mas sem limitações, o vetor de expressão E. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2:1791 (1983)), em que a sequência de codificação do anticorpo pode ser ligada individualmente no vetor em alinhamento com o região de codificação lacZ de forma que uma proteína de fusão seja produzida; vetores pIN (Inouye and Inouye, Nucleic Acids Res. 73:3101- 3109 (1985); Van Heeke and Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)); e similares. Vetores pGEX podem também ser usados para expressar polipeptídeos estrangeiros como proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem facilmente ser purificadas das células lisadas por adsorção e ligação a um microesferas de glutationa- agarose matriz seguido por eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são projetados para incluir trombina ou sítios de clivagem do fator Xa protease de forma que o produto genético alvo clonado pode ser liberado da fração de GST.

[0204] Além dos procariotos, micróbios eucarióticos podem também ser usados. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de padeiro comum, é o mais comumente usado entre micro-organismos eucarióticos, embora inúmeras outras cepas sejam comumente disponíveis, por exemplo, Pichia past oris.

[0205] Para expressão em Saccharomyces, o plasmídeo YRp7, por exemplo, (Stinchcomb et al., Nature 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene 10:157 (1980)) é comumente usado. Este plasmídeo já contém o gene TRP1, que provê um marcador de seleção para uma cepa de levedura mutante que não tem a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics 85:12 (1977)). A presença da lesão TRP1 como uma característica do genoma da célula hospedeira de levedura então provê um ambiente efetivo para detectar transformação por crescimento na ausência de triptofano.

[0206] Em um sistema de inseto, vírus Autographa californica nuclear polihedrosis (AcNPV) é tipicamente usado como um vetor para expressar genes estrangeiros. O vírus cresce em células Spodoptera frugiperda. A sequência de codificação do anticorpo pode ser clonada individualmente nas regiões não essenciais (por exemplo, o gene poliedrina) do vírus e colocada sob controle de um promotor de AcNPV (por exemplo, o promotor de poliedrina).

[0207] Uma vez que uma molécula do anticorpo da invenção foi recombinatemente expressa, ela pode ser purificada por qualquer método conhecido na técnica para purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, de troca iônica, de afinidade, particularmente por afinidade com o antígeno específico depois de proteína A, e cromatografia de coluna de esclusão por tamanho), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Alternativamente, um método preferido para aumentar a afinidade de anticorpos da invenção é revelado em Publicação do pedido de patente U.S. No. 2002 0123057 A1.

VII. Métodos de Tratamento Usando Anticorpos anti-CD100 Terapêuticos

[0208] Os métodos da invenção são direcionados ao uso de moléculas de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpos, incluindo fragmentos de ligação de antígeno, variantes, e derivados destes, para tratar pacientes com uma doença associada com CD100 solúvel secretada ou expressa nas células que expressam CD100. Por "célula que expressa CD100" entende-se células normais e malignas que expressam antígeno de CD100. Métodos para detectar Expressão de CD100 em células são bem conhecidos na técnica e incluem, mas sem limitações, técnicas de PCR, imunohistoquímica, citometria de fluxo, Western blot, ELISA, e similares.

[0209] Embora a discussão seguinte refira-se a métodos de diagnóstico e tratamento de várias doenças e distúrbios com um anticorpo anti-CD100 da invenção, os métodos descritos aqui são também aplicáveis para os fragmentos de ligação de antígeno, variantes, e derivados desses anticorpos de anti-CD100 que retêm as propriedades desejadas dos anticorpos de anti-CD100 da invenção, por exemplo, capaz de ligar especificamente CD100, por exemplo, CD100 de humano, camundongo, ou humano e camundongo, e com atividade neutralizante de CD100.

[0210] Em uma modalidade, o tratamento inclui a aplicação ou administração de uma molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste, da presente invenção em um paciente, ou aplicação ou administração da molécula de ligação de anti-CD100 em um tecido isolado ou linhagem celular de um paciente, onde o paciente tem uma doença, um sintoma de uma doença, ou uma predisposição com relação a uma doença. Em uma outra modalidade, o tratamento visado também incluir a aplicação ou administração de uma composição farmacêutica compreendendo a molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste, da presente invenção a um paciente, ou aplicação ou administração de uma composição farmacêutica compreendendo a molécula de ligação de anti-CD100 to um isolado tecido ou linhagem celular de um paciente, que tem uma doença, um sintoma de uma doença, ou um predisposição com relação a uma doença.

[0211] As moléculas de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação destes, da presente invenção são usados para o tratamento de vários tumores malignos e não malignos . Por "atividade anti-tumor" entende-se uma redução na taxa de proliferação ou acúmulo celular que expressam CD100 maligno, e consequentemente um declínio na taxa de crescimento de um tumor existente ou em um tumor que surge durante a terapia, e/ou destruição de células neoplásticas existentes (tumores) ou células neoplásticas recém formadas, e consequentemente uma diminuição no tamanho geral de um tumor durante a terapia. Por exemplo, terapia com pelo menos um anticorpo anti-CD100 causa um resposta fisiológica, por exemplo, uma redução em angiogênese, que é benéfica com relação ao tratamento de estados da doença associada com células que expressam CD100 em um humano.

[0212] Em uma modalidade, a invenção diz respeito a moléculas de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação destes, de acordo com a presente invenção para uso como um medicamento, em particular para uso no tratamento ou profilaxia de câncer ou para uso em uma condição ou lesão pré- cancerosa. Em certas modalidades, uma molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação deste, da invenção é usado para o tratamento de um câncer que sobre-expressa CD100. Em certas modalidades, uma molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação deste, da invenção é usado para o tratamento de um câncer de cabeça e pescoço ou cólon que sobre-expressa CD100.

[0213] Adicionalmente, moléculas de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação destes, da presente invenção podem também ser usados para inibir angiogênese para o tratamento de condições patológicas depende da formação de novos vasos sanguíneos, incluindo desenvolvimento e degeneração macular do tumor. Angiogênese é um evento morfogenético de multietapas de complexo durante o qual células endoteliais, estimuladas por principais determinantes de remodelação vascular, modificam dinamicamente seus contatos célula a célula e célula a matriz e move direcionalmente para ser reorganizado em uma árvore vascular madura (Bussolino et al., Trends Biochem Sci. 22:251-256 (1997); Risau, Natureza 386:671-674 (1997); Jain, Nat. Med. 9:685-693 (2003)). A formação de novos vasos sanguíneos é uma etapa chave durante desenvolvimento do embrião, mas ela também ocorrer em adultos em condições fisiológicas e em patológicas, tais como retinopatia, artrite reumatóide, isquemia, e particularmente crescimento do tumor e metástase (Carmeliet, Nat. Med. 9:653-660 (2003)). Esta formação patológica de novos vasos sanguíneos está aqui referida como "angiogênese invasiva". Basile et al., PNAS 703(24):9017-9022 (2006)) demonstrou que, quando derramado de células HNSCC, CD100 estimula migração de célula endotelial, que foi prevenida por anticorpos de bloqueio de CD100 e por CD100 nocaute. Sobre-expressão de CD100 foi também notada em cânceres de próstata, cólon, mama, e pulmão, sugerindo que expressão de CD100 é uma estratégia frequentemente usada porque uma ampla variedade de carcinomas pode promover angiogênese.

[0214] De acordo com os métodos da presente invenção, pelo menos uma molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste, da maneira definida em outra parte aqui é usado para promover uma resposta terapêutica positiva com relação a uma célula humana maligna. Por "resposta terapêutica positiva" com relação ao tratamento de câncer entende-se um melhora na doença em associação com a atividade antitumor dessas moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos ou fragmentos destes, e/ou uma melhora nos sintomas associados com a doença. Ou seja, um efeito antiproliferativo, a prevenção de aumento adicional do tumor, uma redução no tamanho do tumor, uma diminuição na vasculatura do tumor, uma redução no número de células cancerígenas, e/ou uma diminuição em um ou mais sintomas associados com a doença podem ser observados. Assim, por exemplo, uma melhora na doença pode ser caracterizada como uma resposta completa. Por "resposta completa" entende-se uma ausência de doença clinicamente detectável com normalização de qualquer estudo radiográfico previamente anormal, medula óssea e fluido cerebroespinhal (CSF). Uma resposta como essa deve persistir pelo menos por um mês depois do tratamento de acordo com os métodos da invenção. Alternativamente, uma melhora na doença pode ser categorizada como uma resposta parcial. Por "resposta parcial" entende-se pelo menos cerca de 50% de diminuição em toda carga de tumor mensurável (isto é, o número de células tumorais presente no sujeito) na ausência de novas lesões e persistindo pelo menos por um mês. Uma resposta como essa é aplicável a somente tumores mensuráveis.

[0215] A resposta do tumor pode ser avaliada por mudanças na morfologia do tumor (isto é, toda a carga de tumor, contagem de célula de tumor, e similares) usando técnicas de classificação tais como imageamento bioluminescente, por exemplo, luciferase imageamento, imageamento por varredura óssea e amostragem de biópsia do tumor incluindo aspiração da medula óssea (BMA). Além dessas respostas terapêuticas positivas, o sujeito que passa por terapia com a molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno desta, pode experimentar o efeito benéfico de uma melhora nos sintomas associados com a doença. Por exemplo, o sujeito pode passar por uma diminuição nos assim chamados sintomas B, por exemplo, suores noturnos, febre, perda de peso, e/ou urticária.

[0216] As moléculas de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno destes, descritas aqui pode também encontrar uso no tratamento de doenças inflamatórias e deficiências ou distúrbios do sistema imune que são associados com células que expressam CD100. Doenças inflamatórias são caracterizadas por inflamação e destruição do tecido, ou uma combinação destes. Por "atividade anti-inflamatória" entende-se uma redução ou prevenção de inflamação. "Doença inflamatória" inclui qualquer processo inflamatório imune-mediado onde o evento ou alvo de iniciação da resposta imune envolve não auto antígeno(s), incluindo, por exemplo, aloantígenos, xeno antígenos, antígenos virais, antígenos bacterianos, antígenos desconhecidos, ou alérgenos. Em uma modalidade, a doença inflamatória é um distúrbio inflamatório do sistema nervoso central ou periférico. Em uma outra modalidade, a doença inflamatória é um distúrbio inflamatório das juntas.

[0217] Adicionalmente, com propósito da presente invenção, o termo "doença(s) inflamatória(s)" inclui "doença(s) autoimune(s)". Da maneira aqui usada, o termo "autoimunidade" entende-se geralmente englobar processos inflamatórios imune-mediados envolvendo "auto antígenos". Em doenças autoimunes, auto antígeno(s) desencadeiam respostas imune ao hospedeiro. Uma doença autoimune pode resultar de uma resposta imune inapropriada direcionada contra um auto antígeno (um autoantígeno), que é um desvio do estado normal de auto-tolerância. Em geral, anticorpos (particularmente, mas não exclusivamente, anticorpos IgG), que agem como moléculas citotóxicas ou como complexos imunes, são os principais mediadores de várias doenças autoimunes, muitas das quais podem ser debilitar ou correr risco de vida.

[0218] Em uma modalidade, a molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, da invenção é usada para tratar esclerose múltipla (MS). MS, também conhecida como esclerose disseminada ou encefalomielite disseminada, é uma condição autoimune em que o sistema imune ataca o sistema nervoso central, levando a desmielinização. O nome esclerose múltipla refere-se às feridas (esclerose, também referida como placas ou lesões) que formam no sistema nervoso. Lesões MS comumente envolvem áreas de substância branca próximas aos ventrículos do cerebelo, tronco cerebral, ganglia basal e medula espinhal, e o nervo ótico. MS resulta em destruição de oligodendrócitos, as células responsáveis por criar e manter o revestimento de mielina. MS resulta em uma diminuição ou perda completa de mielina e, à medida que a doença avança, transeção de axônios.

[0219] Sintoma neurológico pode variar com MS, e a doença frequentemente progride para incapacidade física e cognitiva. MS toma diversas formas, com novos sintomas que ocorrem tanto em ataques discretos (formas recorrentes) quanto lentamente acumulado com o tempo (formas progressivas). Entre ataques, os sintomas podem desaparecer completamente, mas dano neurológico permanente resulta frequentemente, especialmente à medida que a doença avança.

[0220] Neutralização de CD100 usando um anticorpo anti-CD100 monoclonal da invenção, por exemplo, MAb 2503, MAb 67 ou MAb 76, pode ser usada para reduzir a severidade de MS através de diversos diferentes mecanismos, por exemplo, anticorpos monoclonais anti-CD100 podem bloquear maturação imune e ativação por CD100 para reduzir a taxa de reincidência reduzindo respostas imunes secundárias para antígenos de CNS, e anticorpos monoclonais anti-CD100 pode bloquear o efeito de CD100 solúvel em apoptose de mediação de oligodendrócitos no CNS pode reduzir severidade da doença reduzindo desmielinização.

[0221] Em uma modalidade, a molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, da invenção é usado para tratar artrite. Artrite é uma doença inflamatória das juntas, que pode ser causada por uma condição autoimune em que o sistema imune ataca as juntas. Em certas modalidades, a artrite é selecionada do grupo que consiste em osteoartrite, artrite da gora, espondilite anquilosante, artrite psoríaca, reativo artrite, artrite reumatóide, artrite reumatóide de início de ação juvenil, artrite infecciosa, artrite inflamatória, artrite séptica, artrite degenerativa, artrite mutilans, e artrite de Lyme. Em uma modalidade, a artrite é artrite reumatóide (RA).

[0222] A presente invenção inclui métodos de tratar ou prevenir artrite administrando a um sujeito uma molécula de ligação de anti-CD100 da invenção, por exemplo, MAb 2503, MAb 67 ou MAb 76. Métodos da presente invenção podem reduzir o dor, inchaço, ou inflexibilidade associados com artrite, por exemplo, artrite reumatóide. A presente invenção também diz respeito a métodos para melhorar desempenho, função, e saúde da junta. Em algumas modalidades da presente invenção, tratamentos resultam em uma diminuição em pontuações de severidade de artrite, uma diminuição em severidade de artrite/área sob a curva, uma diminuição em parâmetros de histopatologia associados com artrite (inflamação, pannus, dano da cartilagem, e dano ósseo), uma diminuição nos níveis do ácido araquidônico do soro, ou uma diminuição em anticorpos de anticolágeno. Em certas modalidades, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas sem limitações, alívio de sintomas associado com artrite; prevenção de artrite; atraso no início de ação de artrite; menor incidência de artrite em uma população; diminuição da extensão da condição associada com artrite; estabilização (isto é, não piora) do estado da condição, distúrbio ou doença associados com artrite; atraso no início de ação ou redução da condição, distúrbio ou progressão da doença associados com artrite; melhoria da condição, distúrbio ou estado da doença, remissão (quer parcial ou total) da condição, distúrbio ou doença associados com artrite, quer detectável ou não detectável; ou intensificação ou melhora da condição, distúrbio ou doença associados com artrite.

[0223] O método da presente invenção pode ser administrado nos indivíduos que têm artrite ou indivíduos que estão me risco de desenvolver artrite. Assim, em algumas modalidades a invenção diz respeito a um método de tratar um sujeito tendo juntas normais, juntas artríticas limítrofes, ou juntas muito artríticas, o método compreendendo administrar uma molécula de ligação de anti-CD100 da invenção, por exemplo, MAb 2503, MAb 67 ou MAb 76, a um sujeito conforme descrito aqui. Em algumas modalidades, o método da presente invenção pode ser usado para tratar artrite crônica para o restante da vida do sujeito.

[0224] De acordo com os métodos da presente invenção, pelo menos uma molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste, da maneira definida em outra parte aqui é usado para promover uma resposta terapêutica positiva com relação ao tratamento ou prevenção de uma doença autoimune e/ou doença inflamatória. Por "resposta terapêutica positiva" com relação à uma doença autoimune e/ou doença inflamatória entende-se uma melhora na doença em associação com a atividade anti-inflamatória, atividade anti-angiogênica, atividade anti-apoptótica, ou similares, desses anticorpos, e/ou uma melhora nos sintomas associados com a doença. Ou seja, um efeito anti-proliferativo, a prevenção de proliferação adicional da célula que expressa CD100, uma redução na resposta inflamatória incluindo, mas sem limitações, menor secreção de citocinas inflamatórias, moléculas de adesão, proteases, imunoglobulinas (nos exemplos onde a célula que carrega CD100 é uma célula B), combinações desses, e similares, maior produção de proteínas anti-inflamatórias, uma redução no número de células autoreativas, um aumento na tolerância imune, inibição de sobrevivência da célula autorreativa, redução na apoptose, redução na migração de célula endotelial, aumento na migração de monócito espontânea, redução em e/ou uma diminuição em um ou mais sintomas mediados por estímulo de sCD100 ou células que expressam CD100 podem ser observados. Tais respostas terapêuticas positivas não são limitadas pela via de administração e podem compreender administração ao doador, o tecido do doador (tal como, por exemplo, perfusão de órgão), o hospedeiro, qualquer combinação destes, e similares.

[0225] Resposta clínica pode ser avaliada usando técnicas de classificação tais como varredura de imageamento por ressonância magnética (MRI), imageamento x-radiográfico, varredura tomográfica computadorizada (CT), citometria de fluxo ou análise de classificador de célula ativado por fluorescência (FACS), histologia, patologia geral, e química do sangue, incluindo, mas sem limitações, mudanças detectáveis por ELISA, RIA, cromatografia, e similares. Além dessas respostas terapêuticas positivas, o sujeito que passa por terapia com a molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste, pode experimentar o efeito benéfico de uma melhora nos sintomas associados com a doença.

[0226] As moléculas de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno desses, podem ser usadas em combinação com pelo menos uma outra terapia de câncer, incluindo, mas sem limitações, cirurgia ou procedimentos cirúrgicos (por exemplo, esplenectomia, hepatectomia, linfadenectomia, leucoforese, transplante de medula óssea, e similares); terapia de radiação; quimioterapia, opcionalmente em combinação com transplante de medula óssea antólogos, ou outra terapia de câncer; onde a terapia de câncer adicional é administrada antes, durante, ou subsequente na molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, terapia de anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste. Assim, onde as terapias combinadas compreendem administração de uma molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste, da invenção em combinação com administração de um outro agente terapêutico, como com quimioterapia, terapia de radiação, outra terapia do anticorpo de anti-câncer, terapia de câncer a base de molécula pequena, ou terapia de câncer a base de vacina/imunoterapia, os métodos da invenção englobam coadministração, usando formulações separadas ou um formulação farmacêutica única, ou e administração consecutiva em qualquer ordem.

[0227] As moléculas de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação destes, da invenção podem ser usados em combinação com qualquer terapia conhecidas para doenças autoimunes e inflamatórias, incluindo qualquer agente ou combinação de agentes que são conhecidos para ser usados, ou que foram usados ou estão atualmente em uso, para tratamento de doenças autoimunes e inflamatórias. Assim, onde as terapias combinadas compreendem administração de uma molécula de ligação de anti-CD100 em combinação com administração de um outro agente terapêutico, os métodos da invenção englobam coadministração, usando formulações separadas ou um formulação farmacêutica única, e administração consecutiva em qualquer ordem. Em algumas modalidades da invenção, os anticorpos de anti-CD100 descritos aqui são administrados em combinação com medicamentos imunossupressivos ou medicamentos anti- inflamatórios, em que o anticorpo e o(s) agente terapêutico(s) podem ser administrados sequencialmente, em qualquer ordem, ou simultaneamente (isto é, simultaneamente ou no mesmo quadro de tempo).

[0228] Em algumas outras modalidades, as moléculas de ligação de anti- CD100, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno destes, da invenção podem ser usadas sozinhas ou em combinação com medicamentos imunossupressivos para tratar e/ou prevenir artrite reumatóide. Assim, em algumas modalidades onde os anticorpos de anti-CD100 da invenção são usados para tratar artrite reumatóide, os anticorpos podem ser usado em combinação com medicamentos imunossupressivos adequados. Conforme discutido anteriormente, efetividade do tratamento pode ser avaliada usando qualquer meio e inclui, mas sem limitações, efetividade como medidas por respostas clínicas definidas pelo American College of Rheumatology criteria, the European League of Rheumatism criteria, ou qualquer outro critério. Vide por exemplo, Felson et al., Artrite. Rheum. 38:721-35 (1995) and van Gestel et al., Artrite Rheum. 39:34-40 (1996).

[0229] Ainda em outras modalidades, os anticorpos de anti-CD100 da invenção podem ser usados sozinhos ou em combinação com medicamentos imunossupressivos para tratar e/ou prevenir esclerose múltipla. Assim, em algumas modalidades onde os anticorpos de anti-CD100 da invenção são usados para tratar esclerose múltipla, os anticorpos podem usados em combinação com medicamentos imunossupressivos adequados.

[0230] Uma modalidade adicional da invenção é o uso de molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno destes, para monitoramento de diagnóstico de níveis de proteína em tecido como parte de um procedimento de teste clínico, por exemplo, para determinar a eficácia de um dado regime de tratamento. Por exemplo, detecção pode ser facilitada acoplando o anticorpo com uma substância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, e materiais radioativos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, β- galactosidase, ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupo protético adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e aequorina; e exemplos de material radioativo adequado incluem 125I, 131I, 35S, ou 3H.

VIII. Composições farmacêuticas e Métodos de Administração

[0231] Métodos de preparar e administrar a molécula de ligação de anti- CD100, por exemplo, anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes, da invenção a um sujeito que necessita desta são bem conhecidos ou são facilmente determinados pelos versados na técnica. A via de administração da molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes, pode ser, por exemplo, oral, parenteral, por inalação ou tópica. O termo parenteral da maneira aqui usada inclui, por exemplo, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, retal, ou administração vaginal. Embora todas essas formas de administração sejam claramente contempladas no escopo da invenção, um exemplo de uma forma para administração seria uma solução para injeção, em particular para injeção intravenosa ou intra-arterial ou gota. Normalmente, uma composição farmacêutica adequada para injeção pode compreender um tampão (por exemplo, tampão de acetato, fosfato ou citrato), um agente tensoativo (por exemplo, polisorbato), opcionalmente um agente estabilizador (por exemplo, albumina humana), etc. Entretanto, em outros métodos compatíveis com os preceitos aqui, moléculas de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes, da invenção podem ser distribuídas diretamente no sítio da população celular adversa aumentando assim a exposição do tecido doente ao agente terapêutico.

[0232] Conforme discutido aqui, moléculas de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes, da invenção podem ser administradas em uma quantidade farmaceuticamente efetiva para o tratamento in vivo de doenças mediadas por célula que expressa CD100 tais como certos tipos de cânceres, doenças autoimunes, doenças inflamatórias incluindo sistema nervoso central (CNS) e doenças inflamatórias do sistema nervoso periférico (PNS), e angiogênese invasiva. Com relação a isso, será percebido que as moléculas de ligação da invenção reveladas serão formuladas de maneira a facilitar administração e promover estabilidade do agente ativo. Preferivelmente, composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção compreendem um carreador não tóxico, estéril, farmaceuticamente aceitável tais como salina fisiológica, tampões não tóxicos, conservantes e similares. Com os propósitos do presente pedido, uma quantidade farmaceuticamente efetiva de uma molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes, conjugada ou não conjugada, deverá ser mantida para significar uma quantidade suficiente para obter ligação efetiva com um alvo e para obter um benefício, por exemplo, para melhorar sintomas de uma doença ou distúrbio ou para detectar uma substância ou uma célula.

[0233] As composições farmacêuticas usadas nesta invenção compreendem carreadores farmaceuticamente aceitáveis, incluindo, por exemplo, de trocares de íons, alumina, alumínio estearato, lecitina, proteínas do soro, tais como albumina de soro humano, substâncias de tampão tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicerídeo parcial de ácidos graxos vegetáveis saturados, água, sais ou eletrólitos, tais como sulfato de protamina, hidrogeno fosfato de dissódio, hidrogeno fosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinil pirrolidona, substâncias a base de celulose, polietileno glicol, carboximetilcelulose de sódio, poliacrilatos, ceras, polímeros bloco de polietileno-polioxipropileno, polietileno glicol, e gordura de lã.

[0234] Preparações para administração parenteral incluem soluções, suspensões, e emulsões aquosas ou não aquosas estéreis. Exemplos de não solventes aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetáveis tais como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis tal como oleato de etila. Carreadores aquosos incluem, por exemplo, água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas, incluindo salina e meio tamponado. Na invenção em questão, carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas sem limitações, 0,01-0,1 M e preferivelmente 0,05 M de fosfato tampão ou 0,8% de salina. Outros veículos parenterais comuns incluem soluções de fosfato de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, óleos de Ringer lactato, ou fixos. Veículos intravenosos incluem reabastecedor de fluido e nutriente, reabastecedor de eletrólito, tais como aqueles com base em dextrose de Ringer, e similares. Conservantes e outros aditivos podem também estar presentes tais como, por exemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, e gases inertes e similares.

[0235] Mais particularmente, composições farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas estéreis (onde solúvel em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em tais casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluida até o ponto em que exista fácil seringabilidade. Ela deve ser estável nas condições de fabricação e armazenamento e será preferivelmente preservada contra a ação contaminante de micro-organismos, tais como bactérias e fungos. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e similares), e misturas adequadas destes. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de dispersão e pelo uso de agentes tensoativos. Formulações adequadas para uso nos métodos terapêuticos revelados aqui estão descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980).

[0236] Prevenção da ação de micro-organismos pode ser obtida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada incluindo na composição um agente que atrasa absorção, por exemplo, alumínio monostearate e gelatina.

[0237] Em qualquer caso, soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando um composto ativo (por exemplo, um anticorpo anti-CD100, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes, por si mesmo ou em combinação com outros agentes ativos) na quantidade exigida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados aqui, conforme exigido, seguido por esterilização filtrada. Geralmente, dispersões são preparadas incorporando o composto ativo em um veículo estéril, que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes exigidos daqueles enumerados anteriormente. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são secagem a vácuo e liofilização, que rende um pó de um ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução filtrada previamente estéril destes. As preparações para injeções são processadas, cheias nos recipientes tais como ampolas, sacolas, garrafas, seringas ou frascos, e seladas em condições assépticas de acordo com métodos conhecidos na técnica. Adicionalmente, as preparações podem ser embaladas e vendidas na forma de um estojo tais como aqueles descritos em pedido de patente Ser. No. U.S. 09/259.337. Tais artigos de fabricação terão preferivelmente marcadores ou encartes de embalagem indicando que as composições associadas são usadas para tratar um sujeito que sofre de, ou é predisposto a uma doença ou distúrbio.

[0238] Formulações parenterais podem ser uma dose de bolo única, uma infusão ou uma dose de bolo de carregamento seguido com uma dose de manutenção. Essas composições podem ser administradas nos intervalos fixos ou variáveis específicos, por exemplo, uma vez ao dia, ou em uma base "conforme necessário".

[0239] Certas composições farmacêuticas usadas nesta invenção podem ser oralmente administradas em uma forma de dosagem aceitável incluindo, por exemplo, cápsulas, comprimidos, suspensões ou soluções aquosas. Certas composições farmacêuticas também podem ser administradas por aerossol nasal ou inalação. Tais composições podem ser preparadas como soluções em salina, empregando álcool benzílico ou outros conservantes adequados, promotores de absorção para melhorar a biodisponibilidade, e/ou outros convencional agentes solubilizantes ou de dispersão.

[0240] A quantidade de uma molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpo, ou fragmento, variante, ou derivado deste, que pode ser combinada com os materiais carreadores para produzir um forma de dosagem única variará dependendo do hospedeiro tratado e o modo particular de administração. A composição pode ser administrada como uma dose única, múltiplas doses ou em um período de tempo estabelecido em uma infusão. Regimes de dosagem também podem ser ajustados para prover a resposta desejada ideal (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática).

[0241] De acordo com o escopo da presente revelação, anticorpos de anti CD100, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes da invenção podem ser administrados a um humano ou outro animal de acordo com os métodos de tratamento supramencionados em uma quantidade suficiente para produzir um efeito terapêutico. Os anticorpos de anti-CD100, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes da invenção podem ser administrados a tal humano ou outro animal em uma forma de dosagem convencional preparada combinando o anticorpo da invenção com um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável convencional de acordo com técnicas conhecidas. Será percebido pelos versados na tecnologia que a forma e caráter do carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável são governados pela quantidade de ingrediente ativo com o qual devem ser combinados, a via de administração e outras variáveis bem conhecidas. Versados na técnica perceberão adicionalmente que um coquetel compreendendo um ou mais espécies de moléculas de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpos, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes, da invenção pode provar ser particularmente efetivo.

[0242] Por "dose ou quantidade terapeuticamente efetiva" ou "quantidade efetiva" entende-se uma quantidade de molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste, que quando administrados realiza uma resposta terapêutica positiva com relação ao tratamento de um paciente com uma doença a ser tratada.

[0243] Doses terapeuticamente efetivas das composições da presente invenção, para tratamento de doenças mediadas por célula que expressa CD100 tais como certos tipos de cânceres, por exemplo, cânceres de cabeça e pescoço, próstata, cólon, mama e pulmão; doenças autoimunes, por exemplo, artrite, esclerose múltipla, doenças inflamatórias incluindo sistema nervoso central (CNS) e sistema nervoso periférico (PNS) doenças inflamatórias; e angiogênese invasiva, variam dependendo de muitos diferentes fatores, incluindo meios de administração, sítio alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é humano ou um animal, outras medicações administradas, e se o tratamento é profilático ou terapêutico. Normalmente, o paciente é um humano, mas mamíferos não humanos incluindo mamíferos transgênicos podem também ser tratados. Dosagens de tratamento podem ser tituladas usando métodos de rotina conhecidos pelos versados na tecnologia para otimizar segurança e eficácia.

[0244] A quantidade de pelo menos uma molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação deste, a ser administrada é facilmente determinada pelos versados na tecnologia sem experimentação demasiada dada a revelação da presente invenção. Fatores que influenciam o modo de administração e a respectiva quantidade de pelo menos uma molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpo, fragmento de ligação de antígeno, variante ou derivado destes incluem, mas sem limitações, a severidade da doença, o histórico da doença, e a idade, altura, peso, saúde, e condição física do indivíduo que passa por terapia. Similarmente, a quantidade de molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpo, ou fragmento, variante, ou derivado destes, a ser administrada dependerá do modo de administração e se o sujeito experimentará uma dose única ou múltiplas doses deste agente.

[0245] A presente invenção também diz respeito ao uso de uma molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes, na fabricação de um medicamento para tratar uma doença autoimune e/ou doença inflamatória, incluindo, por exemplo, artrite, esclerose múltipla, doenças inflamatórias CNS e PNS, ou um câncer.

[0246] A invenção também diz respeito ao uso de uma molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpo da invenção, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes, na fabricação de um medicamento para tratar um sujeito para tratar uma doença autoimune e/ou doença inflamatória, ou para tratar um câncer, em que o medicamento é usado em um sujeito que foi pré-tratado com pelo menos uma outra terapia. Por "pré-tratado" ou "pré-tratamento" entende-se que o sujeito recebeu uma ou mais outros terapias (por exemplo, foi tratado com pelo menos uma outra terapia de câncer) antes de receber o medicamento compreendendo a molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes. "Pré-tratado" ou "pré-tratamento" inclui sujeitos que foram tratados com pelo menos uma outra terapia em 2 anos, em 18 meses, em 1 ano, em 6 meses, em 2 meses, em 6 semanas, em 1 mês, em 4 semanas, em 3 semanas, em 2 semanas, em 1 semana, em 6 dias, em 5 dias, em 4 dias, em 3 dias, em 2 dias, ou ainda em 1 dia antes da iniciação de tratamento com o medicamento compreendendo a molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, o anticorpo monoclonal 2503 revelados aqui, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes. Não é necessário que o sujeito tenha sido um respondedor ao pré-tratamento com a terapia ou terapias anteriores. Assim, o sujeito que recebe o medicamento compreendendo a molécula de ligação de anti-CD100, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes pode ter respondido, ou pode não ter conseguido responder (por exemplo, o câncer foi refratário), ao pré-tratamento com a terapia anterior, ou a uma ou mais das terapias anteriores onde o pré-tratamento compreendeu múltiplas terapias. Exemplos de outras terapias de câncer para que um sujeito pode ter recebido pré-tratamento antes to receber o medicamento compreendendo a molécula de ligação de anti- CD100, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes incluem, mas sem limitações, cirurgia; terapia de radiação; quimioterapia, opcionalmente em combinação com transplante de medula óssea antólogo, onde agentes quimioterapêuticos adequados incluem, mas sem limitações, aqueles listados anteriormente aqui; outros terapia anticorpo monoclonal anti-câncer; terapia de câncer a base de molécula pequena, incluindo, mas sem limitações, as moléculas pequenas listadas anteriormente aqui; terapias de câncer a base de vacina/imunoterapia; terapia de esteróide; outra terapia de câncer; ou qualquer combinação destas.

IX. Diagnósticos

[0247] A invenção adicionalmente diz respeito a um método de diagnóstico usado durante diagnose de doenças mediadas por célula que expressa CD100 tais como certos tipos de cânceres, doenças autoimunes, doenças inflamatórias incluindo, por exemplo, artrite, esclerose múltipla, sistema nervoso central (CNS) e sistema nervoso periférico (PNS) doenças inflamatórias, e angiogênese invasiva, que envolvem medir o nível de expressão de proteína CD100 ou transcrição em tecido ou outras células ou corpo fluido de um indivíduo e comparar o nível de expressão medido com um nível de expressão de CD100 padrão em tecido normal ou fluido corpóreo, de forma que um aumento no nível de expressão comparado com o padrão é indicativo de um distúrbio.

[0248] Os anticorpos de anti-CD100 da invenção e fragmentos de ligação de antígeno, variantes, e derivados destes, podem ser usados para ensaiar níveis de proteína CD100 em uma amostra biológica usando métodos imunohistológicos clássicos conhecidos pelos versados na tecnologia (por exemplo, vide Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen et al., J. Cell Biol. 105:3087-3096 (1987)). Outros métodos a base de anticorpo usados para detectar expressão de proteína CD100 incluem imunoensaios, tais como a enzima ligada ao ensaio imunoabsorvente (ELISA), imunoprecipitação, ou Western blotting. Ensaios adequados são descritos com mais detalhes em outra parte aqui.

[0249] Por "ensaiar o nível de expressão de polipeptídeo de CD100 entende- se medir ou estimar qualitativamente ou quantitativamente o nível de polipeptídeo de CD100 em uma primeira amostra biológica tanto diretamente (por exemplo, determinando ou estimando nível de proteína absoluto) quanto relativamente (por exemplo, comparando com a doença associada com a nível de polipeptídeo em uma segunda amostra biológica). Preferivelmente, nível de expressão de polipeptídeo de CD100 na primeira amostra biológica é medido ou estimado e comparado com um nível de polipeptídeo de CD100 padrão, o padrão sendo tomado a partir de uma segunda amostra biológica obtida de um indivíduo não tendo o distúrbio ou sendo determinado medindo os níveis a partir de uma população de indivíduos não tendo o distúrbio. Conforme será percebido na técnica, uma vez que o nível de polipeptídeo de CD100 "padrão" é conhecido, ele pode ser usado repetidamente como um padrão para comparação.

[0250] Por "amostra biológica" entende-se qualquer amostra biológica obtida a partir de um indivíduo, linhagem celular, cultura do tecido, ou outras fontes de células que expressam potencialmente CD100. Métodos para obter biópsias de tecido e fluidos corpóreos dos mamíferos são bem conhecidos na técnica.

X. Imunoensaios

[0251] Anticorpos de anti-CD100, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes da invenção podem ser ensaiados para ligação imunoespecífica por qualquer método conhecido na técnica. Os imunoensaios que podem ser usado incluem, mas sem limitações, sistemas de ensaio competitivos e não competitivos usando técnicas tais como Western blots, radioimunoensaios, ELlSA (enzima ligada a ensaio imunoabsorvente), imunoensaios "sanduíches", ensaios de imunoprecipitação, reações de precipitina, difusão de gel reações precipitina, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação de complemento, ensaios imunoradiométricos, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios de proteína A, para citar apenas alguns. Ensaios como esses são de rotina e bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Ausubel et al., eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1, que está incorporado aqui pela referência na sua íntegra). Imunoensaios exemplares são descritos resumidamente a seguir (mas não devem ser a título de limitação).

[0252] Protocolos de imunoprecipitação geralmente compreendem lisar uma população de células em um tampão de lise tal como tampão RIPA (NP-40 ou Triton X-100 1%, deoxicolato de sódio 1%, SDS 0,1%, NaCl 0,15 M, fosfato de sódio 0,01 M a pH 7,2, Trasilol 1%) suplementado com proteína fosfatase e/ou inibidores de protease (por exemplo, EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato de sódio), adicionar o anticorpo de interesse no lisato celular, incubar por um período de tempo (por exemplo, 1-4 horas) at 4°C, adicionar proteína A e/ou proteína G microesferas sefarose no lisato celular, incubar por cerca de uma hora ou mais at 4°C, lavar as microesferas em tampão de lise e ressuspender as microesferas em tampão de SDS/amostra. A capacidade do anticorpo de interesse de imunoprecipitar um antígeno particular pode ser avaliada, por exemplo, por análise western blot. Versados na tecnologia teriam conhecimento com respeito aos parâmetros que podem ser modificados para aumentar a ligação do anticorpo com um antígeno e diminuir o background (por exemplo, pré-limpar o lisato celular com microesferas de sefarose). Para discussão adicional com relação a protocolos de imunoprecipitação vide, por exemplo, Ausubel et al., eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1 at 10,16.1.

[0253] Análise Western blot geralmente compreende preparar amostras de proteína, eletroforese das amostras de proteína em um gel de poliacrilamida (por exemplo, SDS-PAGE 8%-20% dependendo do peso molecular do antígeno), transferir a amostra da proteína do gel de poliacrilamida para uma membrana tais como nitrocelulose, PVDF ou náilon, bloquear a membrana em solução de bloqueio (por exemplo, PBS com BSA 3% ou leite desnatado), lavar a membrana em tampão de lavagem (por exemplo, PBS-Tween 20), bloquear a membrana com anticorpo primário (o anticorpo de interesse) diluído em tampão de bloqueio, lavar a membrana em tampão de lavagem, bloquear a membrana com um anticorpo secundário (que reconhece o anticorpo primário, por exemplo, um anticorpo anti-humano) conjugado com um substrato enzimático (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre ou fosfatase alcalina) ou molécula radioativa (por exemplo, 32P ou 125I) diluído em tampão de bloqueio, lavar a membrana em tampão de lavagem, e detectara a presença do antígeno. Versados na tecnologia teriam conhecimento com respeito aos parâmetros que podem ser modificados para aumentar o sinal detectado e para reduzir o ruído de fundo. Para discussão adiciona com relação a protocolos western blot vide, por exemplo, Ausubel et al., eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1 at 10,8.1.

[0254] ELISAs compreendem preparar antígeno, revestir o poço de uma placa microtituladora de 96 poços com o antígeno, adicionar o anticorpo de interesse conjugado com um composto detectável tal como um substrato enzimático (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre ou fosfatase alcalina) no poço e incubar por um período de tempo, e detectar a presença do antígeno. Em ELISAs o anticorpo de interesse não tem de ser conjugado com um composto detectável; ao contrário, um segundo anticorpo (que reconhece o anticorpo de interesse) conjugado com um composto detectável pode ser adicionado ao poço. Adicionalmente, em vez de revestir o poço com o antígeno, o anticorpo pode ser revestido no poço. Neste caso, um segundo anticorpo conjugado com um composto detectável pode ser adicionado após a adição do antígeno de interesse no poço revestida. Versados na tecnologia teriam conhecimento com respeito aos parâmetros que podem ser modificados para aumentar o sinal detectado bem como outras variações de ELISAs conhecidas na tecnologia. Para discussão adicional com relação a ELISAs vide, por exemplo, Ausubel et al., eds, (1994) Current Protocols em Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1 at 11.2.1.

[0255] A afinidade de ligação de um anticorpo com um antígeno e o constante de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno pode ser determinada por ensaios de ligação competitivos. Um exemplo de um ensaio de ligação competitivo é um radioimunoensaio compreendendo a incubação de antígeno marcado (por exemplo, 3H ou 123I) com o anticorpo de interesse na presença de quantidades crescentes de antígeno não marcado, e a detecção do anticorpo ligado no antígeno marcado. A afinidade do anticorpo de interesse com um antígeno particular e as constantes de dissociação da ligação podem ser determinadas a partir dos dados por análise scatchard plot. Competição com um segundo anticorpo pode também ser determinado usando radioimunoensaios. Neste caso, o antígeno é incubado com anticorpo de interesse é conjugado com um composto marcado (por exemplo, H ou 123I) na presença de quantidades crescentes de um segundo anticorpo não marcado.

[0256] Anticorpos de anti-CD100, ou fragmentos de ligação de antígeno, variantes, ou derivados destes da invenção, adicionalmente, pode ser empregados histologicamente, como em imunofluorescência, microscopia imuno eletrônica ou não ensaios imunológicos, para detecção in situ de proteína CD100 ou variantes conservadas ou fragmentos de peptídeo destes. A detecção In situ pode ser realizada removendo uma espécie histológica de um paciente, e aplicando nele um anticorpo anti-CD100 marcado, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes, preferivelmente aplicados sobrepondo o anticorpo marcado (ou fragmento) em uma amostra biológica. Através do uso de um procedimento como esse, é possível determinar não somente a presença de proteína CD100, ou variantes conservadas ou fragmentos de peptídeo, mas também sua distribuição no tecido examinado. Usando a presente invenção, versados perceberão facilmente que qualquer de uma ampla variedade de métodos histológicos (tal como procedimentos de manchamento) pode ser modificada a fim de obter tal detecção in situ.

[0257] Imunoensaios e não imunoensaios para produto genéticos de CD100 ou variantes conservadas ou fragmentos de peptídeo destes tipicamente compreenderão incubar uma amostra, tais como um fluido biológico, um extrato de tecido, células recentemente colhidas, ou lisados de células que foram incubadas em cultura celular, na presença de um anticorpo detectavelmente marcado capaz de ligar no CD100 ou variantes conservadas ou fragmentos de peptídeo destes, e detectar o anticorpo ligado por qualquer das inúmeras técnicas bem conhecidas na tecnologia.

[0258] A amostra biológica pode ser posta em contato com o suporte ou carreador e imobilizada nele em uma fase sólida tais como nitrocelulose, ou outro suporte sólido que é capaz de imobilizar células, partículas da célula ou proteínas solúveis. O suporte pode então ser lavado com tampões adequados, seguido por tratamento com o anticorpo anti-CD100 detectavelmente marcado ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes. O suporte da fase sólida pode então ser lavado com o tampão uma segunda vez para remover anticorpo não ligado. Opcionalmente, o anticorpo é subsequentemente marcado. A quantidade de etiquetas ligadas no suporte sólido pode então ser detectada por meios convencionais.

[0259] Por "suporte ou carreador de fase sólida" entende-se qualquer suporte capaz de ligar um antígeno ou um anticorpo. Suportes ou carreadores bem conhecidos incluem vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, náilon, amilase, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, gabros, e magnetita. A natureza do carreador pode ser tanto solúvel até algum ponto quanto insolúvel com o propósito da presente invenção. O material do suporte pode ter qualquer configuração estrutural virtualmente possível desde que a molécula acoplada seja capaz de ligar a um antígeno ou anticorpo. Assim, tanto o suporte de configuração pode ser esférico, como em uma microesfera, quanto cilíndrico, como no interior da superfície de um tubo teste, ou a superfície externa de um bastão. Alternativamente, a superfície pode ser plana tais como uma lâmina, faixa de teste, etc. Suportes preferidos incluem microesferas de poliestireno. Versados na técnica conhecerão muitos outros carreadores adequados para anticorpo de ligação ou antígeno, ou serão capazes de determinar o mesmo por uso de experimentação de rotina.

[0260] A atividade de ligação de um dado lote de anticorpo anti-CD100, ou fragmento de ligação de antígeno, variante, ou derivado destes pode ser determinada de acordo com métodos bem conhecidos. Versados na técnica serão capazes de determinar condições de ensaio operacionais e ideais para cada determinação empregando experimentação de rotina.

[0261] Existe uma variedade de métodos disponível para medir a afinidade de uma interação anticorpo-antígeno, mas relativamente pouco para determinar constantes da taxa. A maioria dos métodos conta tanto com anticorpo marcado quanto antígeno, que inevitavelmente complica medições de rotina e introduz incertezas nas quantidades medidas.

[0262] Ressonância de plasma superficial (SPR) conforme realizado em BIACORE® oferece inúmeras vantagens com relação aos métodos convencionais de medir a afinidade de interações anticorpo-antígeno: (i) nenhuma exigência para marcar tanto anticorpo quanto antígeno; (ii) anticorpos não precisam ser purificados adiantados, sobrenadante de cultura celular pode ser usado diretamente; (iii) medições em tempo real, permitindo comparação semi-quantitativa rápida de diferentes interações do anticorpo monoclonal, são permitidas e são suficientes para muitos propósitos de avaliação; (iv) superfície bioespecífica pode ser regenerada de forma que uma série de diferentes anticorpos monoclonais possa facilmente ser comparada em condições idênticas; (v) procedimentos analíticos são totalmente automatizados, e série extensiva de medições pode ser realizada sem intervenção do usuário. BlAapplications Handbook, version AB (reprinted 1998), BIACORE® code No. BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, version AB (reprinted 1998), BIACORE® code No. BR-1001-84. Estudos de ligação baseados em SPR exigem que um elemento de um par de ligação seja imobilizado em uma superfície do sensor. O parceiro de ligação imobilizado é referido como o ligante. O parceiro de ligação em solução é referido como o análito. Em alguns casos, o ligante é anexado indiretamente na superfície através da ligação com uma outra molécula imobilizada, que é referida como a molécula de captura. Resposta de SPR reflete uma mudança na concentração de massa na superfície do detector à medida que os análitos se ligam ou dissociam.

[0263] Com base em SPR, interações monitoram diretamente as medições BIACORE® em tempo real à medida que elas acontecem. A técnica é bem apropriada para determinação de parâmetros cinéticos. Classificação afinidade comparativa é simples de realizar, e tanto a cinética quanto as constantes de afinidade podem ser derivada dos dados do sensorgrama.

[0264] Quando análito é injetado em um pulso discreto através de uma superfície ligante, o sensorgrama resultante pode ser dividido em três fases essenciais: (i) associação de análito com ligante durante injeção da amostra; (ii) estado de equilíbrio ou estabilizado durante injeção da amostra, onde a taxa de ligação de análito é equilibrada por dissociação do complexo; (iii) dissociação de análito da superfície durante fluxo do tampão.

[0265] As fases de associação e dissociação fornecem informação nas cinéticas de interação análito-ligante (as taxas ka e kd, de formação de complexo e dissociação, kd/ka=KD). A fase de equilíbrio fornece informação na afinidade da interação análito- ligante (KD).

[0266] Software BIAevaluation fornece facilidades compreensivas para ajuste da curva usando tanto integração numérica quanto algoritmos de ajuste global. Com análise adequada dos dados, taxa separada e constantes de afinidade para interação podem ser obtidas a partir de investigações BIACORE® simples. A faixa de afinidades mensurável por esta técnica é muito ampla variando de mM a pM.

[0267] Especificidade do epítopo é uma característica importante de um anticorpo monoclonal. Mapeamento de epítopo com BIACORE®, ao contrário das técnicas convencionais usando radioimunoensaio, ELISA ou outros métodos adsorção superficiais, não exige anticorpos marcados ou purificados, e permite testes de especificidade de multi-sítios usando uma sequência de diversos anticorpos monoclonais. Adicionalmente, grandes quantidades de análises podem ser processadas automaticamente.

[0268] Experimentos de ligação em pares testam a capacidade de duas MAbs se ligarem simultaneamente no mesmo antígeno. MAbs direcionada contra epítopos separados se ligará independentemente, ao passo que MAbs direcionada contra epítopos idênticos ou proximamente relacionados interferirá com a ligação de um com o outro. Esses experimentos de ligação com BIACORE® são realizados diretamente.

[0269] Por exemplo, pode-se usar uma molécula de captura para ligar o primeiro Mab, seguido por adição de antígeno e segundo MAb sequencialmente. Os sensorgramas revelarão: (1) quanto do antígeno liga o primeiro Mab, (2) até que ponto o segundo MAb liga no antígeno anexado na superfície, (3) se a segunda MAb não se liga, se reverter a ordem do teste em pares altera os resultados.

[0270] Inibição de peptídeo é uma outra técnica usada para mapeamento de epítopo. Este método pode complementar estudos de ligação do anticorpo em pares, e pode relacionar epítopos funcionais com recursos estruturais quando a sequência do antígeno primária é conhecida. Peptídeos ou fragmentos de antígeno são testados para inibição de ligação de diferente MAbs no antígeno imobilizado. Peptídeos que interferem com ligação de um dado MAb são considerados estruturalmente relacionados com o epítopo definido por este MAb.

[0271] A prática da presente invenção empregará a menos que de outra forma indicada, técnicas convencionais de biologia celular, cultura celular, biologia molecular, biologia, microbiologia transgênica, DNA recombinante, e imunologia, que estão na prática da técnica. Tais técnicas são explicadas totalmente na literatura. Vide, por exemplo, Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleoitide Synthesis; Mullis et al. U.S Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcrition And Translation; Freshney (1987) Culture of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalina Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, VoIs. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Imunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes IIV; Manipulating of Mouse Embrio, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); and in Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).

[0272] Princípios gerais de engenharia de anticorpo são apresentados em Borrebaeck, ed. (1995) antibody engineering (2nd ed.; Oxford Univ. Press). Princípios gerais de engenharia de proteína são apresentados em Rickwood et al., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.). Princípios gerais de anticorpos e ligação anticorpo-hapten são apresentados em: Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2nd ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); and Steward (1984) Antibodies, Their Estruture and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.). Adicionalmente, métodos padrões em imunologia conhecidos na técnica e não especificamente descritos são geralmente seguido como em Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al., eds. (1994) Basics and Clinical Immunology (8th ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) and Mishell and Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY).

[0273] Palavras de referência padrão que apresentam princípios gerais de imunologia incluem Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Auto-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett et al., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al., (Elsevere, Amsterdam); Goldsby et al., eds. (2000) Kuby Immunnology (4th ed.; H. Freemand & Co.); Roitt et al. (2001) Immunology (6th ed.; London: Mosby); Abbas et al. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5th ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann and Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlan); Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall2003); Harlow and Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach and Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press).

[0274] Todas as referências citadas anteriormente, bem como todas as referências citadas aqui, estão incorporadas aqui pela referência na sua íntegra.

[0275] Os exemplos seguintes são oferecidos a título de ilustração e não a título de limitação.

EXEMPLOS Exemplo 1 Seleção e caracterização de anticorpos específicos para CD100

[0276] Anticorpos de anti-CD100 de camundongo que reconhecem CD100 de humano, macaco e murino e foram gerados usando os métodos descritos a seguir.

[0277] Linhagem celular A "Linhagem" foi derivada de um tumor de pulmão espontâneo em um camundongo BALB/c. Os inventores mostraram previamente que injetar camundongo BALB/cs com células de linhagem 1 vivas transfectadas com um DNAc estrangeiro foi um meio efetivo de induzir respostas imunes (dados não publicados). A linhagem celular da linhagem 1 foi transfectada com um plasmídeo de expressão que codifica CD100 de comprimento total de DNAc de humano (SEQ ID NO: 23). Uma linhagem estável que expressa CD100 de humano foi isolada da linhagem celular transfectada (linhagem 1. CD100). Camundongos deficientes em CD100 (de fundo BALB/c, vide Kumanogoh et al., J. Immunol. 7(59:1175-1181 (2002)) foram inicializados por imunização com CD100-His de camundongo purificado (o domínio extracelular de CD100 de camundongo com um C-terminal 6X his tag para purificação) emulsificado em adjuvante de Freund completo (CFA). Uma semana depois desta imunização, os camundongos foram injetados intramuscularmente (i.m.) com 200.000 células Cd100 da linhagem 1 vivas. Dezenove dias depois de injeção CD100 da linhagem 1 os camundongos foram sacrificados e baços foram colhidos e fundidos com parceiro de fusão P3X63Ag8.653 (ATCC# CRL-1580) após procedimentos padrões para gerar hibridomas. Clones de hibridoma foram classificados por ELISA para ligação to com CD100 de humano e camundongo. Em particular, uma linhagem celular de hibridoma, específica para 67 MAb, foi preparada usando tecnologia de hibridoma. (Kohler et al., Nature 256:495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 5:511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hyibridomas, Elsevier, N.Y., pp. 571-681 (1981)). Um grande painel de anticorpos específicos de CD100 de camundongo foi gerado. A maioria destes anticorpos também ligam com alta afinidade a CD100 de humano. Dois hibridomas, clones 67-2 e 76-1, produziram anticorpos monoclonais (denominados MAb 67 e MAb 76, respectivamente) que apresentaram alta afinidade tanto para CD100 de camundongo quanto de humano (Vide Tabela 2). Tabela 2. Medições de afinidade com MAbs anti-CD100 de camundongo

* Afinidade foi medida usando tecnologia de ressonância de plasma de superfície BIACORE®.

[0278] Um ELISA de bloqueio cruzado do anticorpo demonstrou que MAb 67 e MAb 76 reconhecem epítopos distintos no CD100. Além disso, MAbs 67 e 76 reconhecem um epítopo que é distinto daquele reconhecido pelo anticorpo BD16 de CD100 de murino anti-humano independentemente derivado (descrito em US 2008/0219971 Al). Assim, foram gerados dois anticorpos independentes de anti- CD100 de camundongo, MAb 76 (vide SEQ ID NOs: 25-40) e MAb 67 (vide SEQ ID NOs: 3-8; 10; 11-16; 18; 20 e 22).

Exemplo 2 MAbs 67 e 76 bloqueiam atividade de CD100 de camundongo e humano in vitro

[0279] Anticorpos específicos de CD100 foram classificados por sua capacidade de inibir ligação de CD100 em um ensaio de bloqueio de fluorescência. Uma ilustração do método usado para testar se os anticorpos específicos de CD100 bloqueada ou CD100 a partir da ligação em Plexina B1 é mostrada na figura 1. 293 células de humano foram transfectada com DNAc que codifica um receptor de CD100: Plexina B1. Uma linhagem celular estável que expressa Plexina B1 foi selecionada (293/Plexina). CD100-His ligado a Plexina B1 na superfície celular foi detectado por citometria de fluxo usando um anticorpo monoclonal específico e estreptavidina-APC marcador de His biotina conjugado. Quando um MAb anti-CD100 testado foi capaz de bloquear ligação de CD100 com Plexina B1, então menos CD100-His foi detectado na célula, resultando em baixa fluorescência.

[0280] Quarenta nanogramas (ng) de CD100-His de humano ou camundongo (marcador de His do terminal C) foram incubados sozinhos ou com várias concentrações de MAb anti-CD100 por toda a noite a 4°C. Na manhã seguinte, tanto (1) CD100 quanto somente (2) CD100 pré-incubado com um MAb anti-CD100 (67 ou 76) foi combinado com as células 293/Plexina e incubado por 30 minutos no gelo. CD100 que liga na célula através de Plexina B1 foi detectado usando MAb policlonal de coelho anti-His biotinilado, seguido por estreptavidina-APC, e células foram analisadas por citometria de fluxo. Os resultados indicaram que neutralização de CD100 resultou em baixa fluorescência. Em particular, pré-incubação de CD100 com MAb 67 ou MAb 76 resultou em baixa fluorescência comparada somente com CD100 (Figura 2). O aumento na concentração de MAb anti-CD100 67 ou 76 de 0,156 μg/mL para 0,625 μg/mL resultou em uma redução adicional na fluorescência. Bloqueio de CD100 de humano similar foi também observado (dados não mostrados). Assim, esses resultados mostram que MAb 67 e MAb 76 foram tanto capazes de bloquear CD100 de humano quanto de camundongo a partir da ligação com Plexina B1.

[0281] Sinalização de CD100/Plexina B1 foi mostrada para induzir desanexação da matriz extracelular e colapso celular induzindo ré-organização de filamentos de actina (Vide Kruger et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology (5:789800 (2005)). Um ensaio heterólogo para determinar desanexação celular depois da ligação com uma matriz extracelular foi usado para determinar se anticorpos de anti- CD100 poderiam bloquear desanexação de células 293/Plexina induzida por CD100 de placas revestidas com Fibronectina.

[0282] Para o ensaio de desanexação da célula, células 293/Plexina (crescem normalmente como uma linhagem celular de suspensão) foram plaqueadas a uma densidade de 40.000 células/poço em uma placa de 96 poços revestida com fibronectina e anexada naturalmente por toda a noite. Dois (2) μg/mL de camundongo CD100-His (marcador de His do terminal C) foram incubados sozinhos ou com várias concentrações de um MAb anti-CD100 (67 ou 76) por 6 horas a 4°C. Amostras de CD100 foram então tiradas à temperatura ambiente antes da adição das células 293/Plexina. As células foram tratadas com CD100 ou CD100 pré- incubadas com anticorpo por 30 minutos a 37°C, lavadas duas vezes com PBS, e manchadas com violeta cristal por 15 minutos. As células foram então lavadas duas vezes com PBS e secas. Imagens foram tomadas em um varredor para documentação. A violeta cristal foi então solubilizada por 15 minutos a RT com 100 μl de 33% de ácido acético glacial, e pipetada em uma nova placa. Absorbância foi lida a 570 nm. CD100 causa uma redução no número de células anexadas na placa, e assim uma menor absorbância, enquanto neutralização de CD100 resulta em um aumento em absorbância.

[0283] Conforme mostrado na figura 3, tanto MAb 67 quanto MAb 76 foi capaz de bloquear desanexação da mediada por célula CD100 de camundongo e aumentar a absorbância comparada com controle de isótipo. Similarmente, ambos MAbs foram também capazes de bloquear desanexação da célula mediada por CD100 de humano (dados não mostrados).

[0284] MAbs 67 e 76 bloquearam ligação de CD100 com plexina B1 da superfície celular e induziram desanexação de células 293/Plexina das placas revestidas com Fibronectina. Os resultados dos ensaios funcionais in vitro supradescritos mostraram que MAb 67 e MAb 76 foram capazes de bloquear a função de CD100 de camundongo e humano in vitro.

Exemplo 3 Avaliação de anticorpos monoclonais anti-CD100 em modelos de doença de camundongo

[0285] Anticorpos monoclonais neutralizantes anti-CD100 (76 e 67) foram testados in vivo no modelo animal EAE de SJL. Encefalomielite autoimune experimental recorrente (R- EAE) é uma doença mediada por célula T CD4+ caracterizada por inflamação e desmielinização no sistema nervoso central. Em camundongos SJL, R-EAE pode ser induzida por imunização com um epítopo do peptídeo de proteína de proteolipídio (PLP139-15i) (HSLGKWLGHPDKF; SEQ ID NO: 24). Este modelo é caracterizado por uma fase paralítica aguda moderada a severa seguida por remissão e recorrência subsequente. A severidade da doença foi pontuada usando a escala mostrada na tabela 3. Tabe a 3. Avaliação dos sinais clínicos de EAE

[0286] Camundongos SJL foram imunizados com 100 μg de PLP139-151 em CFA. Toxina Pertussis foi administrada no dia 0 e novamente 48 horas após. Camundongos foram tratados com 30 mg/kg de MAb 76, 67 ou anticorpo de controle de isótipo duas vezes por semana começando no dia 0, ou uma vez por semana começando no dia 7. Pontuação de sinais clínicos de EAE foi iniciada a partir do décimo dia após indução de EAE.

[0287] Conforme mostrado na figura 4A, tratamento com MAb 76 ou MAb 67 reduziu a severidade de EAE em camundongos SJL comparada com controle de IgG de camundongo. A redução da porcentagem em Média de Pontuação do Grupo (GMS) entre o dia 21 e o final do estudo para MAbs 76 e 67 em 1x/semana e 2x/semana cada qual é mostrado na figura 4B. Conforme mostrado na figura 4B, MAb 76 (1x/semana) teve uma inibição de porcentagem de GMS de 35-40%; MAb 67 (1x/semana) teve uma inibição de porcentagem de GMS de 65-70%; MAb 76 (2x/semana) teve uma inibição de porcentagem de GMS de 40-50%; e MAb 67 (2x/semana) teve uma inibição de porcentagem de GMS de 45-50%. Esses resultados mostram que tanto MAb 67 quanto MAb 76 atenuou EAE remitente recorrente em camundongos SJL.

[0288] O estudo de EAE em SJL foi repetido usando MAb 76 em dose 30 mg/kg e dosagem 1x/semana. Os resultados adicionalmente demonstraram que MAb 76 foi capaz de reduzir a severidade de EAE em camundongos SJL comparada com IgG de camundongo (dados não mostrados). A redução de porcentagem em Média de Pontuação do Grupo (GMS) entre o dia 21 e o final do estudo foi entre 50- 60%. Além disso, o estudo EAE de SJL foi repetido usando MAb 76 ou MAb 67 em dosagem de 30 mg/kg 1x/semana. Tratamento com MAb 67 ou MAb 76 resultou em uma redução de porcentagem em GMS de entre 30-40% entre o dia 18 e o final do estudo. Os resultados na figura 5A e 5B adicionalmente demonstraram que MAb 76 e MAb 67 foram capazes de reduzir a severidade de EAE em camundongos SJL.

[0289] O estudo de EAE de SJL foi repetido usando MAb 67 em dosagem de 30 mg/kg 1x/semana onde tratamento iniciou no dia 7 pós-imunização. Tratamento com MAb 67 começando no dia 7 resultou em uma redução de porcentagem em GMS de cerca de 50% entre o dia 12 e o final do estudo. Os resultados estão mostrados na figura 6.

[0290] Os resultados desses estudos in vivo demonstraram que neutralização de CD100 usando MAb 76 ou MAb 67 reduziu os sinais clínicos de EAE em diferentes experimentos de EAE de murino. Os resultados para MAb 76 e MAb 67 foram similares um com o outro nesses experimentos.

[0291] Esses resultados demonstraram que MAb 76 e MAb 67 têm a capacidade de bloquear atividade de CD100 in vitro, e, importantemente, a capacidade de reduzir a severidade de EAE em experimentos de dosagem diferente no modelo EAE de camundongo.

Exemplo 4 Preparação de anticorpos monoclonais anti-CD100 humanizados e quiméricos

[0292] O clone 67 do anticorpo monoclonal de murino, supradescrito, mostrou ter a capacidade de neutralizar CD100 in vitro tanto de humano quanto de camundongo e para melhorar EAE em modelos murino in vivo.

[0293] Os genes variáveis pesados (VH) e variáveis leves (VK) foram clonados do hibridoma do clone 67 e sua sequência foi determinada. As sequências de aminoácidos dos genes VH e VK de MAb 67 estão mostradas a seguir com as regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 sublinhadas. MAb 67 VH: QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFSDYYMHWVKQSPENSLEWIGQ INPTT GGASYNQKFKGKATLTVDKS SSTAYM QLKSLTSE ESAVYYCTRYYYGRHFDVW GQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 10) MAb 67 VK: DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKL LIYA ASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEI K (SEQ ID NO: 18)

[0294] O gene VH de MAb 67 foi clonado em um vetor de expressão de mamífero que continha a região constante sequência de codificação de cadeia pesada gama 4 humana, criando uma cadeia pesada quimérica de comprimento total. O MAb 67 VK foi clonado em um vetor de expressão de mamífero que teve a sequência de codificação de região constante Kappa humana, criando uma cadeia leve quimérica de comprimento total. A fim de tornar um anticorpo quimérico, os vetores de expressão contendo a cadeia pesada quimérica e a cadeia leve quimérica foram co-transfectados em células CHO-S. O anticorpo monoclonal que foi produzido foi secretado a partir das células e colhido depois de um período de expressão 3 - 6 dias. O MAb resultante foi purificado usando cromatografia de proteína A e caracterizado. O MAb quimérico resultante (MAb 2368) foi demonstrou ser específico para CD100 por citometria de fluxo e por ELISA, e mostrou ser capaz de competir com 67 MAb de murino para ligação com CD100. Coletivamente, esses dados demonstram que os genes VH e VK corretos que codificam o MAb 67 foram isolados.

[0295] As regiões variáveis de CDR de MAb 67 foram usadas para criar um anticorpo humanizado monoclonal. Os genes VH e VK humanizados foram respectivamente clonados nos vetores contendo os domínios constantes de gama 4 humano e kappa humano. O pareamento do VH humanizado e o VK humanizado criou os 2503 MAb de IgG4/kappa. As sequências de aminoácidos de o humanizados MAb 67 VH (H2160) e VK (L553) estão mostrados a seguir com o CDR1, CDR2 e CDR3 regiões sublinhadas. Sequência de H2160: QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFSDYYMHWVRQAPGQGLEWM GQIN PTTGGASYNQKFKGKATITVD KSTSTAYM E LSSLRSEDTAVYYCARYYYGRHFD VWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 9) Sequência de L553: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KASQSVDYDGDSYMN WYQQKPGQPPKL LIYA ASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEI K (SEQ ID NO: 17)

[0296] Polinucleotídeos que codificam as regiões VH (gene de imunoglobulina de humano com gama humano; H2160) e VK (gene de imunoglobulina de humano com kappa; L553) de anticorpo MAb 2503 foram clonados nos vetores pCMV-Script (Stratagene) e foram depositados com o American Type Culture Collection ("ATCC") em 7 de maio de 2009, e ATCC dando números de depósito PTA-10004 e PTA-10005, respectivamente. O ATCC é localizado em 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA. Os depósitos ATCC foram feitos conforme os termos do Tratado de Budapeste no reconhecimento internacional do depósito de microorganismos com propósito de procedimento de patente.

Exemplo 5 Caracterização de 2503 anticorpos monoclonais anti-CD100 humanizados

[0297] Especificidade de MAb 2503 foi caracterizada por ELISA e citometria de fluxo. MAb 2503 foi testado em um ensaio de competição de epítopo com MAb 67 e em uma ensaio de determinação de afinidade usando tecnologia de ressonância de plasma de superfície BIACORE®.

[0298] A especificidade de epítopo de MAb 2503 e MAb 67 foi determinada por ELISA de competição. Para o protocolo ELISA, uma placa ELISA foi revestida com CD100-Fc. Camundongos 67 ou MAbs 2503 humanizados foram titulados. Os anticorpos foram ligados naturalmente a CD100 e anticorpo não ligado foi lavado fora. MAb 67 biotinilado foi adicionado. Os anticorpos foram ligados naturalmente a CD100 e anticorpo não ligado foi lavado fora. MAb 67 biotinilado ligado a CD100 foi detectado usando Estreptavidina-HRP. A capacidade de MAb 2503 ou MAb 67 de bloquear a ligação de 67 biotinilado com CD100 de humano (mostrado na figura 7A) e CD100 de camundongo (mostrado na figura 7B) foi analisada por ELlSA.

[0299] Afinidades de ligação de MAbs anti-CD100 foram determinadas usando tecnologia de ressonância de plasma de superfície BIACORE®. MAb 2503 mostrou ligar somente CD100 (humano, camundongo e sagui) e CD100 que expressam linhagens celulares, indicando que MAb 2503 é específico para CD100. MAb 2503 mostrou uma maior afinidade com CD100 de humano e de camundongo comparado com 67 MAb. Um sumário das características de afinidade de MAb 2503 e MAb 67 está apresentado a seguir na tabela 4. Tabela 4. Afinidades de MAbs anti-CD100 com CD100 de humano, sagui e camund ongo

* Afinidade foi medida usando tecnologia de ressonância de plasma de superfície BIACORE®.

[0300] Esses ensaios mostram que MAb 2503 é específico de CD100 e liga ao mesmo epítopo como MAb 67 de camundongo. MAb 2503 foi mostrou ligar tanto CD100 de camundongo quanto de humano, assim uma vantagem de MAb 2503 é que ele pode ser testado para segurança e eficácia em camundongos e também em humanos. Além disso, ele mostrou que MAb 2305 liga CD100 de humano, macaco, e camundongo.

Exemplo 6 MAb 2503 bloqueia atividade de CD100 de camundongo e humano in vitro

[0301] MAb 2503 foi testado para a capacidade de bloquear a função de CD100 usando os ensaios supradescritos no Exemplo 2, incluindo (1) o ensaio de bloqueio de citometria de fluxo e (2) o ensaio de desanexação da célula.

[0302] Anticorpos específicos de CD100, MAb 67 e MAb 2503, foram classificados para sua capacidade de inibir ligação de CD100 em Plexina B1 em um ensaio de bloqueio de fluorescência. O método usado para testar se os anticorpos específicos de CD100 bloquearam CD100 a partir da ligação em Plexina B1 foi mostrado na figura 1 (Exemplo 2). Pré-incubar CD100 com MAb 67 ou MAb 2503 resultou em baixa fluorescência comparada apenas com CD100. MAb 2503 foi capaz de bloquear a ligação de CD100 de humano (vide Figura 8A), sagui (vide Figura 8B) e camundongo (vide Figura 8C) in vitro. Assim, esses resultados mostraram que MAb 67 e MAb 2503 foram capazes de bloquear CD100 de humano, macaco e camundongo a partir da ligação com Plexina B1.

[0303] A capacidade de MAbs anti-CD100 de bloquear desanexação mediada por CD100 de humano e macaco de células 293/Plexina de uma placa revestida com fibronectina foi determinada usando o ensaio de desanexação da célula descrito no exemplo 2. CD100 causa uma redução em no número de células anexadas na placa, e assim uma menor absorbância. Neutralização de CD100 de humano e CD100 de sagui com MAb2503 ou MAb 67 resultou em um aumento na absorbância conforme mostrado nas figuras 9A e 9B, respectivamente. MAb 2503 e MAb 67 também neutralizaram CD100 de camundongo neste ensaio (Dados não mostrados).

[0304] MAb 2503 bloqueou a ligação de CD100 de humano, camundongo e macaco na Plexina B1 da superfície celular e induziu desanexação de células 293/Plexina das placas revestidas com Fibronectina. Assim, esses resultados mostram que MAb 2503 foi capaz de neutralizar funcionalmente CD100 de humano, camundongo e macaco.

Exemplo 7 Anticorpo anti-CD100 inibe angiogênese in vivo

[0305] CD100 é uma molécula pró-angiogênica potente e ativação de Plexina B1 através da ligação de CD100 transativa c-Met e promove a capacidade invasiva de células tumorais e promove angiogênese.

[0306] Para demonstrar o efeito in vivo da ausência de CD100 no crescimento do tumor, células tumorais CT26 foram injetadas no músculo da perna de camundongos Balb/c ou CD100-/- tipo selvagem e o crescimento do tumor resultante foi medido. Conforme mostrado na figura 10, o volume do tumor em camundongos CD100-/- foi menor comparado com camundongos Balb/c tipo selvagem neste estudo. Esses resultados demonstraram que uma linhagem celular de câncer de cólon de camundongo (CT26) prejudicou o crescimento em um ambiente que não tem CD100.

[0307] Em seguida, a capacidade de MAb 67 de reduzir o crescimento de células tumorais CT26 em camundongos Balb/c tipo selvagem foi testada. Células tumorais CT26 foram injetadas no músculo da perna de camundongos Balb/c tipo selvagem (n =48) ou CD100-/- (n=9). Depois da injeção, os camundongos tipo selvagem foram divididos em 2 grupos de 24 camundongos cada qual. Um grupo foi tratado começando no dia 1 por injeção i.p. com 1 mg 67 de MAb, e o outro grupo foi tratado por injeção i.p. com 1 mg de IgG de camundongo. Os tratamentos foram repetidos a cada 7 dias. Os camundongos foram analisados pelo crescimento do tumor. Conforme mostrado na figura 11, o tratamento com MAb 67 reduziu o crescimento de tumores CT26 em camundongos Balb/c comparado com o grupo controle de IgG de camundongo.

[0308] Assim, esses resultados mostram que um anticorpo com as características estruturais e funcionais de MAb 67 reduziu o crescimento do tumor in vivo.

Exemplo 8 Anticorpo anti-CD100 inibe artrite induzida por colágeno in vivo

[0309] MAb 67 foi testado para its capacidade para reduzir artrite é o modelo de camundongo de artrite induzida por colágeno (CIA). O modelo de artrite induzida por colágeno (CIA) é um modelo de inflamação animal pré-clínica de artrite reumatóide (RA) que é amplamente usado para endereçar doença patogênese e validar alvos RA terapêuticos (Brand et al., Nat. Protoc. 2(5): 1269-75 (2007)). O procedimento geral de CIA é ilustrado na figura 12 (qualquer modificação neste procedimento geral está descrito a seguir). Resumidamente, artrite foi induzida no dia 0 por injeção intradérmica na cauda de uma emulsão compreendendo colágeno e Adjuvante de Freund Completo (CFA). A seguir, o controle e tratamentos de teste foram administrados por injeção subcutânea (s.c.) ou intraperitoneal (i.p.) duas vezes começando semanalmente no dia 20. Os grupos de teste para Estudo 1 são descritos a seguir na tabela 5. Tabela 5. Grupos de teste 1 do Estudo de Artrite Induzida por Colágeno (CIA)

[0310] A severidade da doença foi pontuada usando a escala mostrada na tabela 6. Cada camundongo pata recebeu uma pontuação (sinais macroscópicos de artrite foram avaliados 3 vezes semanalmente). O Índice artrítico (AI) foi calculado por adição de pontuações de pata individual (Al máximo = 16). Tipicamente, os primeiro sinais de artrite aparecem no modelo de CIA 21-28 dias depois da imunização. Tabela 6. Método de Pontuação de CIA

[0311] Os resultados de Estudo 1 mostraram uma redução no desenvolvimento da doença de artrite no modelo de CIA em grupos tratados com 600 μg de 67 MAb. Índice artrítico (AI) em camundongos tratados com 600 μg de MAb 67 foi comparado com AI em camundongos tratados com 600 μg de controle negativo (IgG1) e 600 μg de controle positivo (etanercepte) onde o tratamento foi iniciado no dia 20. Resultados estão mostrados na figura 13 A. Esses resultados mostram que MAb 67 foi tão bom quanto ou melhor que etanercepte no desenvolvimento de redução da doença de artrite no modelo de CIA.

[0312] Um segundo estudo (Estudo 2) incluiu tratamentos de MAb 67 e controle positivo onde o tratamento foi atrasado, isto é, iniciado quando o índice de artrite foi >3. Os grupos de teste para Estudo 2 são descritos a seguir na tabela 7. Tabela 7. Grupos de teste do Estudo 2 de Artrite Induzida por Colágeno (CIA)

[0313] Para Estudo 2, os resultados de AI para tratamento com MAb 67 (tratamento iniciado no dia 20 ou quando o AI foi >3) foram comparado com tratamento com um controle negativo (IgG1) e controle positivo (etanercepte; tratamento iniciado quando o AI foi >3). Os resultados estão mostrados na figura 13B. Esses resultados mostram que MAb 67 foi tão bom quanto ou melhor que etanercepte no desenvolvimento de redução da doença de artrite no modelo de CIA quando o tratamento foi iniciado no dia 20 ou atrasado para AI >3. Assim, MAb 67 mostrou prevenir desenvolvimento da doença de artrite, bem como tratar doença de artrite quando administrado uma vez que AI foi >3 no modelo de CIA.

Exemplo 9 Anticorpo anti-CD100 bloqueia respostas de célula B primária e de memória in vivo

[0314] Camundongos Balb/c e CD100-/- foram imunizados com (4-hidróxi-3- nitrofenila) gama globulina de galinha conjugada com acetila precipitada com alume (hidróxido de alumínio/magnésio) ("NP-CGG") seguido por tratamento com controle de IgG1 (Balb/c e CD100-/-) ou MAb 67 (somente Balb/c). Os grupos de teste estão mostrados a seguir na tabela 8. Tabela 8. Grupos de teste respos ta de célula B primária e memória

[0315] Os camundongos foram tratados conforme supradescrito na tabela 8 começando no dia -7 e foram imunizados com NP-CGG no dia 0. Três camundongos por grupo foram eutanizados no dia 10, e o baço e linfonódulos foram analisados para células B do centro germinal (GC) ("B220+CD38lowPNA+"). Cada baço foi analisado separadamente, e os linfonódulos de todos três camundongos foram combinados em uma amostra para análise. O tratamento dos camundongos remanescentes continuou conforme mostrado na tabela 8. No dia 21 os camundongos foram estimulados com o mesmo NP-CGG em Alume. No dia 31 os camundongos remanescentes foram eutanizados e o baço e linfonódulos foram analisados para células B do centro germinal (GC) ("B220+CD38lowPNA+"). Cada baço foi analisado separadamente, e os linfonódulos de todos três camundongos foram combinados em uma amostra para análise. Os resultados nas figuras 14A e B mostram que tratamento com 600 μg de MAb 67 diminuiu o número de células B GC no baço (SP) e linfonódulos (LN) tanto depois da imunização primária (14A) quanto imunização secundária (14B), respectivamente. Assim, MAb 67 mostrou bloquear respostas de célula B primária e memória in vivo.

Exemplo 10 Anticorpo anti-CD100 diminui o crescimento do tumor in vivo

[0316] Redução de crescimento do tumor por MAb 67 foi testada em modelos de tumor de xenoenxerto de camundongo CT26 e BCA34. Para esses estudos, células tumorais foram injetadas intramuscularmente nas pernas de camundongos Balb/c. Começando no dia 1 pós-enxerto, camundongos foram tratados por injeção intraperitoneal (i.p.) 1x por semana com 1 mg de anticorpo MAb 67 ou controle negativo (IgG) em 0,2 mL de volume. Mudança no volume do tumor (mm3) e/ou volume da coxa (mm3) foi medida para determinar crescimento das taxas do tumor. O crescimento da taxa do tumor para camundongos tratados com MAb 67 comparado com o taxa de crescimento do tumor em camundongos do controle negativo foi usado para calcular atraso do crescimento do tumor (TGD).

[0317] A capacidade de células tumorais BCA34 e EMT6 de crescer em um ambiente que não tem CD100 foi também testada. Para esses estudos, células tumorais foram injetadas nas pernas de camundongos Balb/c e CD100-/- (SEMA4D- /-) e crescimento do tumor foi medido. Células tumorais do cólon CT26

[0318] Células tumorais CT26 são derivadas de tumores cólon de murino e expressam níveis muito baixos de CD100. 50.000 células tumorais do cólon CT26 foram injetadas s.c. nos camundongos Balb/c tipo selvagem (20 camundongos/grupo de tratamento). A mudança no volume do tumor (mm) foi medida em camundongos tratados com 1 mg de MAb 67 começando semanalmente no dia 1 pós-enxerto comparado com camundongos injetados com controle de IgG. Os resultados (volume médio do tumor com o tempo) estão mostrados na figura 15. O TGD para camundongos tratados com MAb 67 foi 17 % (p=0,0317). Esses resultados mostram que crescimento do tumor CT26 foi menor em camundongos tratados com MAb 67. Células tumorais fibroblásticas BCA34

[0319] Células tumorais BCA34 expressam níveis baixos de CD100. Primeiro, 50.000 células tumorais BCA34 foram injetados s.c. na região abdominal de camundongos Balb/c tipo selvagem ou camundongos CD100-/- ("SEMA4D-/-"). A mudança no volume do tumor (mm3) foi medida nesses camundongos, e os resultados estão mostrados na figura 16A. Esses resultados mostraram que células tumorais BCA34 prejudicaram o crescimento em um ambiente que não tem CD100.

[0320] Em um experimento separado, 50.000 células tumorais BCA34 foram injetadas nos músculos de perna de camundongos Balb/c tipo selvagem (21 camundongos/grupo de tratamento). A mudança no volume do tumor (mm3) foi medida em camundongos tratados com 1 mg de MAb 67 começando semanalmente no dia 1 pós-enxerto comparado com camundongos injetados com controle de IgG. Os resultados (volume médio da coxa com o tempo) estão mostrados na figura 16B. O TGD para camundongos tratados com MAb 67 foi 18 % (p=0,009). Esses resultados mostram que crescimento do tumor de BCA34 foi menor em camundongos tratados com MAb 67. Células tumorais de carcinoma mamário EMT6

[0321] Células tumorais EMT6 são derivadas de tumores de carcinoma mamário de murino e expressam níveis moderados de CD100. 50.000 células tumorais EMT6 foram injetadas nos músculos da perna de camundongos Balb/c tipo selvagem ou camundongos CD100-/- ("SEMA4D-/-"). A mudança no volume do tumor (mm) foi medida nesses camundongos, e os resultados são mostrados na figura 17. É mostrada a mudança no volume do tumor (mm3) para camundongos Balb/c tipo selvagem e camundongos CD100-/- ("SEMA4D-/-"). Esses resultados mostraram que células tumorais EMT6 prejudicaram o crescimento em um ambiente que não tem CD100.

Exemplo 11 Anticorpo anti-CD100 diminui o crescimento do tumor de humano in vivo

[0322] Redução de crescimento do tumor por MAb 2503 foi testada em modelos de tumor de humano de xenoenxerto HN12 e HN6 HIF1a mODD. HN 12 e HN6 HIF1a mODD são derivados de tumores da cabeça e pescoço de humano, e xenoenxertos expressam altos níveis tanto de HIF1a quanto CD100. O modelo de xenoenxerto HN6 HIF-1a mODD é descrito em Sun et al., J Biol Chem 2#4(46):32066- 74 (2009). Para esses experimentos, 2 tumores/camundongo foram injetados s.c. nos camundongos nude atímicos (10 camundongos/grupo de tratamento). Começando no 1 dia pós-enxerto, os camundongos foram tratados por injeção i.p.1x por semana com 1 mg de anticorpo MAb 2503 ou controle negativo (IgG4) em 0,2 mL de volume. Mudança no volume do tumor (mm3) foi medida. A taxa de crescimento do tumor para camundongos HN6 HIF-1a mODD tratados com MAb 2503 comparado com a taxa crescimento em camundongos do controle negativo foi usada para calcular atraso do crescimento do tumor (TGD).

[0323] O ponto final para este experimento foi TGD. Os resultados de crescimento do tumor para tratamento com MAb 2503 em modelos de xenoenxerto HN 12 e HN6 HIF-1a mODD estão mostrados na figuras 18 e 19A, respectivamente. O TGD em camundongos de xenoenxerto HN6 HIF-1a mODD tratados com MAb 2503 foi 13% (p=0,0008). Além disso, desenhos de tumores representativos dos camundongos de xenoenxerto HN6 HIF-1a mODD tratados com controle de IgG4 e MAb 2505 estão mostrados na figura 19B. Esses resultados mostram que tratamento com MAb 2503 reduziu crescimento do tumor da cabeça e pescoço de humano in vivo.

Exemplo 12 Linhagem celular de CHO-S estável para expressar altos tituladores de MAb 2503

[0324] Uma linhagem celular de CHO-S estável foi derivada para expressar altos tituladores de MAb 2503. DNA complementar (DNAc) para as cadeias pesadas e leves do anticorpo monoclonal anti-CD100 humanizado 2503 foi usado para produzir diversas linhagens celulares de expressão de Ovário de hamster chinês (CHO-S) construídos usando tecnologia GPEx™ (Catalent Pharma Solutions, Madison, Wisconsin) e células CHO-S progenitoras (vide Bleck et al., "An Alternative Method for the Rapid Generation of Stable, High expressem Mammalian Cell Lines," BioProcessing Journal (September/October 2005)).

[0325] Após clonagem de célula única, um clone de expressão foi selecionado com base em crescimento em cultura e produção de anticorpo, e um banco de pesquisa de células de expressão em vias foi produzido. O anticorpo expresso produzido por este clone foi Caracterizado para potência e especificidade usando ensaios funcionais in vitro e in vivo (por exemplo, ensaios de bloqueio e desanexação de fluxo). Subsequentemente, células do clone de expressão de CHO selecionadas foram expandidas sem cultura e um segundo banco (Parental Seed Stock) preparado e congelado. Células de um frasco do banco de estoque de semente parental foram subsequentemente expandidas em cultura e usadas para produção de cGMP do Banco de Célula Master (MCB).

Exemplo 13 Dosagem de anticorpo anti-CD100 e estudos PK em rato e macaco cinomolgo

[0326] Foi realizada análise de saturação de injeção intravenosa única de MAb 2503 em rato e macaco cinomolgo.

[0327] Estudo do Rato: 36 Ratos Sprague-Dawley (3/sexo/grupo) foram administrados com uma injeção intravenosa única de MAb 2503 variando de 0,01 a 100 mg/kg. Um ensaio de saturação a base de citometria de fluxo foi realizado no sangue total lisado em vários pontos de tempo para determinar a porcentagem do alvo celular (SEMA4D) que foi saturado com MAb 2503. Existe boa correlação de dados com a quantidade de MAb detectada no soro, sugerindo que saturação dependeu da quantidade de medicamento livre no soro, e que células foram saturadas quando aproximadamente 1 a 5 ug/mL de medicamento livre foram detectados no soro. A saturação de porcentagem de SEMA4D em doses de MAb 2503 de 0, 0,01, 0,1, 1,0, 10, e 100 mg/kg em ratos machos e fêmeas é mostrada nas figuras 20A e 20B, respectivamente.

[0328] Estudo de Primata: 28 macacos cinomolgos (2/sexo/grupo; 4/sexo/grupo controle) foram administrados com uma injeção intravenosa única de MAb 2503 variando de 0,01 a 100 mg/kg. Um ensaio de saturação a base de citometria de fluxo foi realizado no sangue total lisado em vários pontos de tempo para determinar a porcentagem do alvo celular (SEMA4D) que foi saturado com MAb 2503. Existe boa correlação de dados com a quantidade de MAb detectada no soro, sugerindo que a saturação dependeu da quantidade de medicamento livre no soro, e que as células foram saturadas quando aproximadamente 1 a 5 ug/mL de medicamento livre foram detectados no soro. A saturação de porcentagem de SEMA4D em doses de MAb 2503 de 0, 0,01, 0,1, 1,0, 10, e 100 mg/kg em ratos machos e fêmeas (combinados) é mostrada na figura 21. Os resultados de saturação de rato e primata foram muito similares.

[0329] Resultados farmacocinéticos (PK) incluindo meia vida (horas biológicas (dias)), concentração do anticorpo do plasma no tempo zero depois da injeção (C0), e área sob a curva de concentração de plasma do tempo zero até o tempo t (AUC0-1) para injeções intravenosa única de 0,01, 0,1, 1,0, 10, ou 100 mg/kg MAb 2503 em rato e primata estão mostrados na tabela 9. Tabela 9. PK Valores para 2503 anticorpo em rato e primata (macaco cinomolgo)

[0330] Observou-se que a meia vida da fase de eliminação de MAb 2503 era similar entre rato e macaco cinomolgo, e variou de cerca de 6 horas a cerca de 10 dias em um modo dependente da dose. Tanto a saturação quanto resultados de PK parecem ser dependentes da dose e sugerem um perfil notavelmente similar entre rato e macaco cinomolgo. Além disso, não foi observada nenhuma toxicidade signifi- cante para MAb 2503 em doses variando de 0,01 a 100 mg/kg em rato ou macaco cinomolgo.

[0331] A descrição apresentada das modalidades específicas assim revelará totalmente a natureza geral da invenção que outros podem, aplicando conhecimento dos versados na tecnologia, facilmente modificar e/ou adaptar para várias aplicações tais modalidades específicas, sem experimentação demasiada, sem fugir do conceito geral da presente invenção. Portanto, tais adaptações e modificações devem estar no significado e faixa de equivalentes das modalidades reveladas, com base nos preceitos e diretrizes apresentados aqui. Deve-se entender que a fraseologia ou terminologia aqui é com o propósito de descrição, e não de limitação, de maneira tal que a terminologia ou fraseologia da presente especificação deve ser interpretada pelos versados na tecnologia sob a luz dos preceitos e diretrizes.

[0332] A extensão e escopo da presente invenção não devem ser limitados por qualquer das modalidades exemplares supradescritas, mas devem ser definidos somente de acordo com as seguintes reivindicações e seus equivalentes.

Claims (12)

1. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao CD100, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo de região variável de cadeia pesada (VH) e um polipeptídeo de região variável de cadeia leve (VL), em que a VH compreende as sequências de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 compreendendo as SEQ ID NOs: 6, 7 e 8, respectivamente, e a VL compreende as sequências de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 compreendendo as SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que: (a) a VH do dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10; (b) a VL do dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 18; (c) o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende a VH de (a) e a VL de (b); ou (d) o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo monoclonal 2503, definido por compreender uma VL de SEQ ID NO: 17 e uma VH de SEQ ID NO: 9, ou um anticorpo monoclonal 67, definido por compreender uma VL de SEQ ID NO: 18 e uma VH de SEQ ID NO: 10.

3. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda uma região constante humana.

4. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é selecionado a partir do grupo que consiste em um anticorpo de cadeia única, um fragmento Fab, um fragmento F(ab)2 e um fragmento Fv.

5. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que inibe o CD100 de se ligar a um receptor de CD100.

6. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é humanizado, primatizado ou quimérico.

7. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda um polipeptídeo heterólogo fundido ao mesmo.

8. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e um veículo.

9. Polinucleotídeo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) uma sequência de ácido nucleico compreendendo a SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 20; (b) uma sequência de ácido nucleico compreendendo a SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 22.

10. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao CD100, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo de VH compreendendo as sequências de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2, e VH-CDR3 que consistem nas SEQ ID NOs: 6, 7 e 8, respectivamente; e um polipeptídeo de VL compreendendo as sequências de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2, e VL-CDR3 que consistem nas SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o dito polipeptídeo de VH e o dito polipeptídeo de VL são codificados por sequências de polinucleotídeos que estão contidas em um único vetor ou em vetores separados.

12. Uso do anticorpo ou de um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que é para: (a) preparar um medicamento para tratar uma doença autoimune ou uma doença inflamatória em um animal em necessidade do mesmo, em que a dita doença autoimune ou inflamatória é esclerose múltipla ou artrite; ou (b) preparar um medicamento para tratar um câncer em um animal em necessidade do mesmo.

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