BR112013005145B1

BR112013005145B1 - Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao cxcl13, composição e uso de uma composição

Info

Publication number: BR112013005145B1
Application number: BR112013005145-0A
Authority: BR
Inventors: Ekaterina Klimatcheva; Mark Paris; Ernest S. Smith
Original assignee: Vaccinex, Inc
Priority date: 2010-09-02
Filing date: 2011-09-01
Publication date: 2022-02-15
Also published as: WO2012031099A9; CN103347896B; EP2611832A2; JP2013539369A; DK2611832T3; KR20130101046A; CN103347896A; KR101862236B1; CA2810217A1; WO2012031099A3; US20180244764A1; US11981730B2; MX353476B; JP2017099379A; EP2611832A4; JP6097690B2; US20140147447A1; EP2611832B1; US20210087263A1; CA2810217C

Abstract

ANTICORPO ISOLADO LIGANTE DE ANTÍGENOS OU SEU FRAGMENTO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE AO CXCL13, COMPOSIÇÃO, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO CONTENDO UM ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICA UM ANTICORPO DE UM POLIPEPTÍDEO VH OU VL, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO, MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO OU SEU FRAGMENTO QUE SE LIGUE ESPECIFICAMENTE AO CXCL13 E USO DE UMA COMPOSIÇÃO Composições e métodos são fornecidos para o tratamento de doenças associadas à expressão do CXCL13, incluindo certas doenças autoimunes, doenças inflamatórias e cânceres. Em particular, anticorpos monoclonais anti-CXCL13 foram desenvolvidos para neutralizar o CXCL13. Adicionalmente, é ainda descrito o uso das referidas composições.

Description

REFERÊNCIA À LISTA DE SEQUÊNCIAS ENVIADA ELETRONICAMENTE

[0001] O conteúdo da lista de sequências enviada eletronicamente no arquivo de texto ASCII (nome: "sequencelisting_ascii.txt"; tamanho: 16.923 bytes; e data de criação: 28 de abril de 2011) registrada com o pedido de patente é aqui incorporada por referência na sua totalidade. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A quimiocina 1 atrativa de células B homeostáticas (BCA-1), também conhecida como CXCL13 (ou ANGIE, BLC, BLR1L, ANGIE2 ou Scyb13) se expressa constitutivamente em órgãos linfoides secundários (por ex., o baço, nódulos linfáticos e placas de Peyer) por células dendríticas foliculares (FDCs) e macrófagos. Vide Gunn et al., Nature 391:799-803 (1998) e Carlsen et al., Blood 104(10):3021-3027 (2004). A CXCL13 age primeiramente através do receptor CXCR5 acoplado a proteínas G (receptor 1 do linfoma de Burkitt). O CXCR5 se expressa, por ex.,, nos linfócitos B maduros, nas células T auxiliares foliculares CD4+ (células Thf), em um subconjunto menor de células T CD8+ e em células Treg tonsilares ativadas. Vide Legler et al. , J. Exp. Med. 187:655-660 (1998); Forster et al., Blood 84:830-840 (1994); Fazilleau et al., Immunity 30:324-335 (2009); Ansel et al., J. Exp. Med. 190:1123-1134 (1999); Lim et al., J. Clin. Invest. 114(11):1640-1649 (2004) e R. Forster, Chapter in Academic Press Cytokine Reference, agosto de 2000.

[0003] Sob condições fisiológicas normais, é comum a geração de células B que possuem o potencial para produzirem auto-anticorpos (anticorpos contra o auto-antígeno). No entanto, estes auto-anticorpos naturais possuem baixa afinidade pelos anticorpos IgM que apresentam amplo espectro de reatividade e forte preferência por auto-antígenos solúveis do que por antígenos da superfície celular (ver, por ex., Dichiero et al., J. Immunol. 134(2):765-771 (1985); Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci 83:2959-2963 (1986)). Células B autoreativas de baixa afinidade submetem-se à apoptose e, por isso, não são suscetíveis a constituir perigo para o organismo saudável.

[0004] Na ausência de infecção e durante uma resposta imune normal, a CXCL13 e seu receptor CXCR5 estão envolvidos na hospedagem das células B e das células T foliculares B auxiliares em folículos primários nos gânglios linfáticos e baço; formação do centro germinativo e organogênese linfoide. Veja, por ex.., Forster et al., Cell 87:1037-1047 (1996).

[0005] Ratos deficientes de CXCL13 e CXCR5 apresentaram desenvolvimento de placas de Peyer e gânglios linfáticos prejudicado devido à falta de folículos organizados. Ver Ansel et al., Nature 406:309-314 (2000). Além disso, a imunização com antígenos dependentes de célula T, no contexto da CXCL13 fenótipo knockout, levou à formação de pequenos centros germinais anormais e deslocados nos nódulos linfáticos e baços (Ansel et al.).

[0006] Em um ambiente cronicamente inflamado, os centros germinais ectópicos se formam dentro dos tecidos afetados (muitas vezes não-linfoide). A superexpressão da CXCL13 nestes centros germinais pelas células dendríticas foliculares (FDCs), acompanhada pela desregulação nas interações entre FDCs, células B e células foliculares Th, reduziu a eliminação de células B auto-reativas e subsequentes, o antígeno-driven, a geração de afinidade de células plasmáticas de vida longa maduras e as células B de memória que produzem auto-anticorpos de alta afinidade de IgG, o que pode resultar no desenvolvimento de doenças auto-imunes e inflamatórias. Ver, por ex., Vinuesa et al., Immunology 9:845-857 (2009). Além disso, a superexpressão do receptor CXCR5 em certos tipos de cancro foi relatada por promover a proliferação celular e metástase da CXCL13-dependente.

[0007] Um alto nível de expressão de CXCL13 (BCA-1) e do seu receptor, CXCR5, foi observado em folículos linfóides gástricos induzidos por H. pylori e em linfomas do tecido linfóide (MALT) associado à mucosa. Ver, por ex., Mazzucchelli et al., J Clin Invest 104:R49-R54 (1999). Além disso, a expressão de CXCL13 (BCA-1) foi encontrada em todas as amostras de gastrites induzidas por H. pylori .Id. Na mucosa gástrica de ratos do tipo selvagem infectados por H. heilmannii , o nível de expressão do mRNA de CXCL13, que é conhecido por estar envolvido na organogênese do tecido linfático (incluindo MALT), foi significativamente mais elevado do que na mucosa gástrica de ratos não infectados. Ver Nobutani et al., FEMS Immunol Med Microbiol 60:156-164 (2010).

[0008] A necessidade de terapias que almejem vias de sinalização mediadas pela CXCL13 tornou-se cada vez mais evidente nos últimos anos. Os mecanismos de ação para estes tratamentos podem incluir, por ex., o bloqueio da interação da CXCL13 com o seu receptor, resultando na interferência com células B, na migração de células T foliculares B-auxiliares para os tecidos inflamados e formação de centro germinativo (por ex., no caso de doenças auto-imunes), na inibição da proliferação de células cancerosas e na capacidade de se espalhar em doenças oncológicas. Campo da Invenção

[0009] A invenção refere-se às moléculas de ligação neutralizantes da CXCL13, por ex. anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno, por ex., anticorpos monoclonais humanizados, métodos de utilização das moléculas de ligação e métodos para o tratamento de condições e doenças associadas com células que expressam a CXCL13.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] Um aspecto da invenção é relacionado a uma molécula de ligação antigênica isolada que se liga especificamente ao mesmo epítopo da CXCL13 como um anticorpo monoclonal de referência, selecionado a partir do grupo formado por MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2, e 3C9.Em certas formas de realização, a molécula de ligação ao antígeno se liga especificamente ao mesmo epítopo da CXCL13 como MAb 5261 e MAb 5378.

[0011] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma molécula de ligação antigênica isolada que se liga especificamente à CXCL13, em que essa referida molécula de ligação inibe competitivamente um anticorpo monoclonal de referência, selecionado a partir do grupo formado por MAb 5261, MAb 5378 , MAb 5080, MAb 1476, 3D2, e 3C9, de se ligar especificamente à CXCL13. Em certas configurações, a molécula de ligação antigênica inibe competitivamente MAb 5261 e MAb 5378. Em outra, o anticorpo ou um fragmento dele é selecionado a partir do grupo formado por MAb 5261, MAb 5378,b 5080, MAb 1476, 3D2, e 3C9.

[0012] Em uma das formas de configuração da invenção, o anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga-se especificamente à CXCL13 e a região variável de cadeia pesada (VH) do referido anticorpo ou de seu fragmento compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a uma sequência selecionada dentre o grupo compreendido na SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 3. Em outra forma de realização, a região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo ou seu fragmento compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a uma sequência selecionada dentre o grupo compreendido de SEQ ID NO: 15, S EQ ID NO: 17, e SEQ ID NO: 8.

[0013] Em outra forma de configuração, o anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga-se especificamente à CXCL13 e o VH do referido anticorpo ou de seu fragmento compreende uma sequência de aminoácidos idêntica, exceto por 20 ou menos substituições conservativas de aminoácidos a uma sequência selecionada dentre o grupo compreendido de SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 3.Numa outra forma de configuração, o VL do anticorpo ou de seu fragmento compreende uma sequência de aminoácidos idêntica, exceto por 20 ou menos substituições conservativas de aminoácidos a uma sequência selecionada dentre o grupo compreendido de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, e SEQ ID NO: 8.

[0014] Em certas configurações, o anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga-se especificamente à CXCL13 e o VH e VL do anticorpo ou de seu fragmento compreendem sequências de aminoácidos pelo menos 90% idênticas às sequências de VH e VL selecionadas dentre o grupo compreendido de: (a) SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 15, respectivamente, (b) SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 17, respectivamente, e (c) SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 8, respectivamente. Em mais uma configuração, o anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga-se especificamente à CXCL13, no qual o VH e VL do referido anticorpo ou de seu fragmento compreendem sequências de aminoácidos idênticas, exceto para 20 ou menos substituições conservativas de aminoácidos em cada, para VH e sequências VL selecionadas dentre o grupo compreendido de: (a) SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 15, respectivamente, (b) SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 17, respectivamente, e (c) SEQ ID NO : 3 e SEQ ID NO: 8, respectivamente.

[0015] Em uma configuração, o anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga especificamente à CXCL13, e a VH do referido anticorpo ou de seu fragmento compreende a sequência de aminoácidos idêntica da região determinante de complementaridade 1 da cadeia pesada de Chothia-Kabat (VH-CDR1), com exceção de duas ou menos substituições de aminoácidos para a SEQ ID NO: 4; a sequência idêntica de aminoácidos da região determinante de complementaridade 2 da cadeia pesada de Kabat (VH-CDR2), com exceção de quatro ou menos substituições de aminoácidos para a SEQ ID NO: 5; a sequência idêntica de aminoácidos da região determinante de complementaridade 3 da cadeia pesada de Kabat (VH-CDR3), com exceção de duas ou menos substituições de aminoácidos para a SEQ ID NO: 6; a sequência idêntica de aminoácidos da região determinante de complementaridade 1 da cadeia leve de Kabat (VL-CDR1), com exceção de quatro ou menos substituições de aminoácido para a SEQ ID NO: 16 ou 9; a sequência idêntica de aminoácidos da região determinante de complementaridade 2 da cadeia leve de Kabat (VL-CDR2), com exceção de duas ou menos substituições de aminoácidos para a SEQ ID NO: 10, ou a sequência idêntica de aminoácidos da região determinante de complementaridade 3 da cadeia leve de Kabat (VL-CDR3), com exceção de duas ou menos substituições de aminoácidos para a SEQ ID NO: 11.

[0016] Em certas configurações, o anticorpo isolado, ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga-se especificamente à CXCL13 e a VH do referido anticorpo ou de seu fragmento, compreende as sequências de aminoácidos de VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 que constituem as SEQ ID NOs: 4, 5, e 6, respectivamente, com exceção de quatro ou menos substituições de aminoácidos em uma ou mais das referidas VH-CDRs.Em outra configuração, o anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno liga-se especificamente à CXCL13 e a VL do referido anticorpo ou de seu fragmento, compreende as sequências de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 que constituem nas SEQ ID NOs: 16 ou 9 , 10, e 11, respectivamente,com exceção de quatro ou menos substituições de aminoácidos em uma ou mais das referidas VL-CDRs.

[0017] Em algumas configurações, o anticorpo do presente invento, ou seu fragmento, inibe a CXCL13 de se ligar a um receptor de CXCL13. Em certas formas de configuração, o receptor da CXCL13 é CXCR5. Em outra forma de configuração, o anticorpo do invento, ou seu fragmento, é humanizado, primatizado ou quimérico.

[0018] Outro aspecto da presente invenção é dirigida a uma composição que compreende o mesmo anticorpo do invento, ou seu fragmento, e um transportador.

[0019] Um aspecto adicional desta invenção é dirigido a um polinucleotídeo isolado composto por um ácido nucleico que codifica um anticorpo de VH polipeptídica, em que a sequência de aminoácidos da referida VH polipeptídica é pelo menos 90% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo consistente em SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 2.Em outro aspecto, a invenção é dirigida a um polinucleotídeo isolado compreendendo um ácido nucleico que codifica um anticorpo VL polipeptídica, em que a sequência de aminoácidos da referida VL polipeptídica é pelo menos 90% idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo consistente em SEQ ID NO: 7 e SEQ ID N. ° 14, e na qual um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendendo a referida VL polipeptídica se liga especificamente à CXCL13.

[0020] Em uma configuração, o polinucleótido isolado composto por um ácido nucleico que codifica a VH polipeptídica de um anticorpo, em que a sequência de aminoácidos da VH polipeptídica é idêntica, exceto para 20 ou menos substituições conservativas de aminoácidos, a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 12.Numa outra forma de configuração, o polinucleotídeo isolado é composto por um ácido nucleico que codifica a VL polipeptídica de um anticorpo, em que a sequência de aminoácidos da VL polipeptídica é idêntica, exceto para 20 ou menos substituições conservativas de aminoácidos, a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 18, e onde um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno composto pela referida VL polipeptídica se liga especificamente à CXCL13.

[0021] Um aspecto adicional é dirigido ao vetor que compreende o polinucleotídeo da presente invenção.Outro aspecto é dirigido a uma célula hospedeira compreendendo um vetor da invenção. A invenção também é dirigida aos métodos de produção de um anticorpo ou de seu fragmento que se liga especificamente à CXCL13, contendo a cultura de uma célula hospedeira da invenção e a recuperação do referido anticorpo ou de seu fragmento.

[0022] Outro aspecto da presente invenção é dirigida aos métodos para neutralizar a CXCL13 em um animal, compreendendo a administração ao referido animal de uma composição composta por: um anticorpo isolado ou o seu fragmento ou uma composição da invenção, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0023] Outras formas de configuração da invenção são dirigidas aos métodos de tratamento de uma doença auto-imune ou de uma doença inflamatória ou cancro num animal em necessidade de tratamento, compreendendo a administração ao referido animal de uma composição composta por: um anticorpo isolado ou o seu fragmento ou uma composição da presente invenção; e um veículo farmaceuticamente aceitável.Em algumas formas de configuração, a doença auto-imune ou a referida doença inflamatória é a esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), ou artrite como, por exemplo, artrite reumatóide.

[0024] Um aspecto adicional da presente invenção é dirigida aos métodos para redução ou inibição de folículos linfóides gástricos em um animal, compreendendo a administração ao referido animal de uma composição composta por um anticorpo isolado ou o seu fragmento, do presente invento, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Uma forma de configuração adicional da presente invenção é dirigida a um método para a prevenção ou tratamento de linfoma do tecido linfóide associado à mucosa (MALT), ou uma úlcera gástrica ou duodenal em um animal com necessidade de prevenção ou tratamento, compreendendo a administração ao referido animal, de uma composição que composta por um anticorpo isolado ou seu fragmento, do presente invento, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Numa forma de configuração, o animal havia sido infectado com uma bactéria Heliobacter. Em uma configuração a bactéria Heliobacter é H. pylori ou H. heilmannii.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS

[0025] Figura 1. Resultados de ELISA demonstrando a especificidade da ligação de anticorpos CXCL13 anti-humanos de ratos (3D2 e 3C9) à CXCL13 recombinante humana (1A), CXCL13 recombinante de rato (1B) e CXCL13 recombinante de macaco Cynomolgus (1C) em comparação aos controles de anticorpos (rato MAb 801 e/ou de rato MAb 470). Os valores de EC50 são apresentados e foram obtidos com quatro parâmetros de ajuste da curva sigmoidal (curvas são mostradas no gráfico; o R 2 para as curvas que produziram valores de EC50 foi de 0,99).

[0026] Figura 2.Resultados de ELISA por competição pelo epítopo demonstrando a inibição percentual da ligação de 3D2 biotinilado à CXCL13 humana para anticorpos CXCL13 anti-humano de rato (3C9 e 3D2) em comparação c resultados obtidos com nenhum concorrente ou MAb 801.

[0027] Figura 3. Resultados de ELISA em captura e competição por epítopo demonstrando uma inibição 3D2 por ligação da biotina 3C9 a uma CXCL3 nativa ou recombinante humana (3A) e por ligação da biotina 3D2 à CXCL13 nativa ou recombinante de rato (3B).As curvas foram ajustadas usando quatro parâmetros de ajuste da curva sigmoidal (curvas são mostradas no gráfico, o R 2 = 0,99). As diferenças de valores em EC50 foram analisadas pelo teste t não emparelhado e foram consideradas P> 0,05.

[0028] Figura 4.Resultados de migração da célula B mostram o efeito da 3D2 e 3C9 na CXCL13 humana de migração induzida de células humanas pré-B-697-hCXCR5 (4A) e migração induzida da SDF-1 alfa humana de células pré-B-697-hCXCR4 (4B). IgG de ratinho foi usado como controle negativo. MAb 801 foi usada como um controle positivo para a inibição da migração de CXCL13 humana e MAb 87A foi usada como um controle positivo para a inibição da migração da SDF-1 alfa induzida por humanos.

[0029] Figura 5.A porcentagem de inibição de migração de esplenócitos em C57Black/6 por 3D2, MAb 470, IgG de ratinho (controle), ou IgG de rato (controle) (5A) e em SJL/J por 3D2, 3C9, MAb 470, ou IgG de ratinho (controle) (5B).Os resultados são apresentados como a média de duas experiências independentes (migração C57Black/6) + / - SD e três experiências independentes (migração SJL/J) + / - SEM. Uma comparação do efeito da 3D2 em migrações C57Black/6 e SJL/J (5C) foi analisada por teste t não emparelhado que produziu o valor P > 0.05. As curvas foram ajustadas usando quatro parâmetros de ajuste da curva sigmoidal (curvas são mostradas no gráfico; R 2 = 0,99).

[0030] Figura 6.Resultados de endocitose mediada por CXCL3 para a endocitose mediada por CXCL13 humana (6A) e para a endocitose mediada por CXCL3 de ratinhos (6B) de receptores CXCR5 humanos e de ratos por 3D2 ou controles (MAb 470 e/ou IgG do rato). Uma comparação da endocitose mediada por CXCL3 humana e de rato, de valores EC50, foram calculados a partir de curvas sigmoidais de resposta à dose que mostram valores de R 2 igual a 1 (endocitose do rato) e 0,994 (endocitose humana) (6C). Os dados comparativos do efeito da 3D2 em receptores de endocitose humanos e de ratos foram analisados por teste t não emparelhado que produziu o valor P > 0.05.

[0031] Figura 7.Progressão da doença EAE em ratinhos tratados com 3D2 (início no dia 0), 3D2 (início no Índice > 1), ou IgG de rato como controle (estudo RR-EAE-1). Cada ponto de dados representa uma média das contagens tomadas a partir de 9 ratos. Meios de grupo (GMS) foram comparados utilizando- se ANOVA de fator único seguido de teste posterior de comparação múltipla de Bonferroni.

[0032] Figura 8. Progressão da doença na EAE em ratinhos tratados com 3D2 (início no dia 0), 3D2 (início no dia 6), 3D2 (início no dia > 2), ou controle IgG de ratos (RR-EAE-2 Estudo). Cada ponto de dados representa uma média das contagens tomadas a partir de 9 ratos. Meios de grupo (GMS) foram comparados utilizando-se ANOVA de fator único seguido de teste posterior de comparação múltipla de Bonferroni.

[0033] Figura 9. Patologia renal em ratinhos com nefrite lúpica avançada após tratamento com 3D2 ou IgG de rato (controle) (estudo SLE-1). Para pontuação proteinúria (9A) e pontuação de patologia nos rins para glomerulonefrite, nefrite intersticial e vasculite (9B), cada ponto de dados representa uma média de 10 medições.

[0034] Figura 10. Patologia renal em ratinhos com doença de lúpus em estágio inicial após tratamento com 3D2 e IgG de ratos (controle) (estudo SLE-2).Para pontuação proteinúria (10A) e pontuação de patologia nos rins para Glomerulonefrite e nefrite intersticial (10B) cada ponto de dados representa 7 ratos do grupo tratado por 3D2 e 9 ratinhos do grupo tratado por IgG de rato.

[0035] Figura 11. Os cortes histológicos mostram o efeito de 3D2 sobre o número de centros germinais (GC) e folículos primários no baço do rato de lúpus. Seções de baço foram coradas com GL-7 (mancha GC), anticorpo B220 (marcador de células B), ou um anticorpo contra as células dendríticas foliculares (FDCs) de ratinhos tratados com 3D2 (11A) e IgG de ratos (11B) NZB/NZWF1.

[0036] Figura 12. Folículos primários e tamanho GC no baço de ratos com lúpus tratados com 3D2.Os valores são apresentados como média + / - SEM de cinco ratinhos por grupo. Os ratinhos tratados com 3D2 ("tx") mostraram uma tendência para a diminuição do número de GCs quando expresso como uma razão de folículos primário: secundário (GC) (p = 0,19) (12 A) e uma diminuição significativa no tamanho de GC (p = 0,03) (12B).

[0037] Figura 13.Polinucleotídeos e sequências de aminoácidos da cadeia pesada variável de 3D2 (H1609) e da cadeia leve variável (L0293). Regiões determinantes de complementaridade (CDRs) estão sublinhadas.

[0038] Figura 14.Sequências de aminoácidos para humanização de 3D2 quiméricos mostrando a alteração da cadeia pesada variável H1609 a H2177 (14A) e da cadeia leve variável L0293 a L5055 até L5140 (14B). O local putativo de glicosilação e as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) estão em caixas.

[0039] Figura 15. Sequências de aminoácidos polinucleotídicos dos MAb 5261 de cadeias leves e pesadas variáveis (H2177/L5140) e MAb 5080 de cadeias leves e pesadas variáveis (H2177/L5055). As regiões determinantes de complementaridade (CDR) estão sublinhadas.

[0040] Figura 16. Resultados ELISA de especificidade para MAb 5261, MAb 5080, MAb 1476, e isotipo de controle humano ligado a recombinante humano (16A), cynomolgus de macaco (16B) e CXCL13 de rato (16C).Cada ponto de dados representa a média de medições triplicada. Os valores de EC50 foram calculados a partir de quatro parâmetros de ajuste da curva sigmoidal (curvas são mostradas no gráfico; R 2 para as curvas que produziram valores de EC50 foram de 0,99).NB = no binding (sem ligação).

[0041] Figura 17.Resultados ELISA em captura e competição por epítopo para Mab 5261, Mab 5080 e ligada a 3D2 de humano nativo (17A) e CXCL13 de rato nativo (17B). Cada ponto de dados representa uma média de medições duplicadas a partir de pelo menos uma de três experiências independentes. As curvas foram ajustadas usando quatro parâmetros de ajuste da curva sigmoidal (as curvas são mostradas no gráfico; R 2 = 0,99).

[0042] Figura 18.Porcentagem de inibição de pre-B-697- hCXCR5 humano (18A) e de migração de célula tonsilar humana (18B) por MAb 5261.Os dados representam a média de medições em triplicado + / - SEM de uma de pelo menos três experiências. As curvas foram ajustadas usando quatro parâmetros de ajuste da curva sigmoidal (curvas são mostradas no gráfico; R 2 = 0,98-0,99).

[0043] Figura 19.Porcentagem de Inibição de migração de esplenócitos de SJL/J (19A) e C57Black/6 (19B) por MAb 5261. Os dados das experiências representativas estão apresentados na forma de média de medições em duplicado + / - SD.

[0044] Figura 20.Porcentagem de Inibição da internalização mediada por CXCL13 humana do receptor de CXCR5 humano pelo MAb 5261 e de isotipo de controle. Os dados são a média de medições em triplicado a partir de um de pelo menos três experiências independentes. A curva foi ajustada utilizando quatro parâmetros de ajuste da curva sigmoidal (curvas são mostradas no gráfico; R 2 = 0,99).

[0045] Figura 21.Sequência de polinucleotídeo e de aminoácido de MAb 5378 de cadeia pesada variável (H5188) e de cadeia leve variável (L5153). Regiões determinantes de complementaridade (CDRs) estão sublinhadas.

[0046] Figura 22.Resultados ELISA de competição pelo epítopo para MAb 5378, MAb 5261, e MAb 470.

[0047] Figura 23.Resultados ELISA de especificidade para MAb 5378, 3D2, e controle do isotipo de ratos ligados ao humano recombinante (23A), macaco cynomolgus (23B) e CXCL13 de ratos (23C). Cada ponto de dados representa a média de medições em triplicado. Os valores de EC50 foram calculados a partir de quatro parâmetros de ajuste da curva sigmoidal (curvas são mostradas no gráfico; R 2 para as curvas que produziram valores de EC50 foram 0,99).

[0048] Figura 24. Porcentagem de Inibição da migração de pré-B-697-hCXCR5 humano (24A), de células tonsilares humanas (24B) e de esplenócitos C57Black6 de rato (24C) pela MAb 5261 ou MAb 5378 (24A-B) e MAb 5378 ou 3D2 (24C).Os dados representam a média de medições em triplicado + / - SEM de uma de pelo menos três experiências. As curvas foram ajustadas usando quatro parâmetros de ajuste da curva sigmoidal (curvas são mostradas no gráfico; R 2 = 0,99).

[0049] Figura 25.Porcentagem de Inibição da internalização mediada pela CXCL13 humana de receptor CXCR5 humano pelo MAb 5378, MAb 5261, 3D2, isotipo de controle de rato ou isotipo de controle humano. Pontos de dados para 5261 e 5378 representam a média de medições de dois experimentos independentes.Os pontos de dados para controles 3D2 e de isotipo representam a média de medições em triplicado a partir de uma única experiência. A curva foi ajustada utilizando quatro parâmetros de ajuste da curva sigmoidal (curvas são mostradas no gráfico; R 2 = 0,99). NE = nenhum efeito.

[0050] Figura 26. Progressão da doença de artrite induzida por colágeno (CIA) em ratinhos tratados com MAb 5376, etanercept, ou IgG de ratos (controle) (Estudo CIA-1). Cada ponto de dados representa uma média das contagens tomadas a partir de 10 ratos. As médias dos grupos foram comparadas utilizando-se ANOVA de fator único seguido de posterior teste de comparação múltipla de Bonferroni.

[0051] Figura 27. Progressão da doença de artrite induzida por colágeno (CIA) em ratinhos tratados com MAb 5378, etanercept, MAb 470, ou IgG de rato (controle) (Estudo CIA- 2).Cada ponto de dados representa uma média das contagens tomadas a partir de 10 ratos. As médias dos grupos foram comparadas utilizando-se ANOVA de fator único seguido de teste posterior de comparação múltipla de Bonferroni.

[0052] Figura 28. Formação do centro germinal em NP-CGG de ratinhos imunizados tratados com MAb 5378, isotipo de controle em ratos, ou nenhum tratamento (Estudo GC-1).Cada ponto de dados do baço representa uma média de valores medidos a partir de três ratos.Cada ponto de dados do linfonodo representa um único valor obtido de células agrupadas coletados de três ratos.

[0053] Figura 29.Programa de tratamento para infecção de ratos por H. heilmannii e administração de anticorpo.

[0054] Figura 30.Genes específicos do 16s rRNA de H. heilmannii foram amplificados em todas as amostras obtidas a partir de H. heilmannii de ratos infectados incluindo o tratamento de anticorpo de isotipo de controle e tratamento de anticorpo anti-CXCL13. Controle positivo (P) e controle negativo (N) também são mostrados.

[0055] Figura 31. O nível de expressão de mRNA de CXCL13 na mucosa gástrica de ratos do tipo selvagem (WT) infectados por H. heilmannii (HH), 1 mês (31A) e 3 meses (31B) após a infecção, tal como determinado pelo PCR em tempo real quantitativo (os valores são normalizados para níveis de expressão de beta-actina de ratinhos em cada amostra).

[0056] Figura 32. A expressão de mRNA de CXCL13 e β-actina no estômago de ratinhos infectados por H. heilmannii após tratamento com anticorpo de isotipo de controle ou anticorpo anti-CXCL13 (painel superior).A expressão de mRNA de CXCL13 e β-actina no estômago de ratos não-infectados (painel inferior). Controle positivo (P) e controle negativo (N) também são mostrados.

[0057] Figura 33. Amostras de hematoxilina e eosina (H & E) manchadas do estômago de rato tratado pelo anticorpo de isotipo de controle (painel superior esquerdo) e de rato tratado pelo anticorpo anti-CXCL13 (painel superior direito), três meses depois de uma infecção H. heilmannii .O painel inferior mostra o número de folículos linfóides gástricos identificados em amostras do estômago de ratos tratados por anticorpo de isotipo de controle e por anticorpo anti-CXCL13.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Definições

[0058] É de se notar que o termo "um" ou "uma", quando em relação à entidade, refere-se a uma ou mais dessa entidade; por exemplo, "um anticorpo anti-CXCL13" é entendido para representar um ou mais anticorpos anti-CXCL13. Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "uma ou mais" e "pelo menos um" podem ser aqui utilizados indiferentemente.

[0059] Como usado aqui, o termo "tumor" refere-se a todo o crescimento e proliferação de células neoplásicas, quer malignas ou benignas, e todas as células cancerosas e pré- cancerosas e tecidos.

[0060] Os termos "cancro" e "canceroso" referem-se a ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado.Exemplos de cancro incluem mas não se limitam a carcinomas mas, linfomas e leucemias.

[0061] Como aqui utilizado, o termo "polipeptídeo" pretende abranger um singular "polipeptídeo" bem como o plural "polipéptidos", e refere-se a uma molécula constituída por monômeros (aminoácidos) linearmente ligados por ligações amida (também conhecidas como ligações peptídicas).O termo "polipeptídeo" refere-se a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, e não se refere a um comprimento específico do produto. Assim, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, "proteína", "cadeia de aminoácidos", ou qualquer outro termo utilizado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, estão incluídos dentro da definição de "polipeptídeo" e o termo "polipeptídeo" pode ser utilizado em vez de, ou de forma intercambiável com qualquer um destes termos. O termo "polipeptídeo" destina-se também para referir-se aos produtos das modificações pós-expressão do polipeptídeo, incluindo, sem limitação de glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização de grupos protetores conhecidos/de bloqueio, clivagem proteolítica ou através de modificação por aminoácidos de ocorrência não-natural. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzido por tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido a partir de uma sequência de ácido nucleico designado. Ele pode ser gerado de qualquer modo, inclusive por síntese química.

[0062] Um polipeptídeo da invenção pode ser de um tamanho de cerca de 3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 50 ou mais, 75 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, 1.000 ou mais, ou 2.000 ou mais aminoácidos.Os polipeptídeos podem ter uma estrutura definida tridimensional, embora eles não necessariamente apresentem tal estrutura. Polipeptídeos com uma estrutura tridimensional definida são referidos como dobrados, e polipeptídeos que não possuem uma estrutura tridimensional definida, mas podem adotar um elevado número de conformações diferentes, são referidos como desdobrados. Como aqui utilizado, o termo glicoproteína refere-se a uma proteína acoplada a pelo menos uma porção de hidrato de carbono que está ligado à proteína através de uma cadeia lateral de resíduo de aminoácido contendo oxigênio ou nitrogênio, por ex., um resíduo de serina ou um resíduo de asparagina.

[0063] Por um peptídeo "isolado" ou seu fragmento, variante, ou derivado do mesmo, entende-se um polipeptídeo que não está no seu ambiente natural. Nenhum nível particular de purificação é necessário. Por exemplo, um polipeptídeo isolado pode ser removido do seu ambiente nativo ou natural. Os polipeptídeos produzidos de forma recombinante e proteínas expressas em células hospedeiras são considerados isolados para fins da invenção, assim como os polipéptidos nativos ou recombinantes que foram separados, fracionados, ou parcial ou substancialmente purificados por qualquer técnica adequada.

[0064] Também incluídos como polipeptídeos da presente invenção estão os fragmentos, derivados, análogos ou variantes dos polipeptídeos que precedentes e qualquer combinação destes.Os termos "fragmento", "variante", "derivado" e "análogo" quando se referem a anticorpos anti-CXCL13 ou polipeptídeos do anticorpo da presente invenção, incluso quaisquer polipeptídeos que retêm pelo menos algumas das propriedades de ligação ao antígeno do anticorpo correspondente ou polipeptídeo de anticorpo da presente invenção. Fragmentos de polipeptídeos do presente invento incluem fragmentos proteolíticos, bem como fragmentos de deleção, além de fragmentos de anticorpos específicos discutidos aqui em outro momento. Variantes de anticorposanti- CXCL13 e polipeptídeos de anticorpo do presente invento incluem fragmentos como descrito acima, e também polipeptídeos com sequências de aminoácidos alteradas devido a substituições de aminoácidos, deleções ou inserções. As variantes podem ocorrer naturalmente ou ser de ocorrência não natural. Variantes de ocorrência não natural podem ser produzidas utilizando técnicas conhecidas na técnica de mutagênese. Polipeptídeos variantes podem compreender substituições de aminoácidos conservativos ou não conservativos, deleções ou adições. Polipeptídeos variantes podem também ser aqui referidos como "análogos polipeptídicos." Tal como aqui utilizado, um "derivado" de anticorpo anti-CXCL13 ou polipeptídeo de anticorpo refere-se a um objeto polipeptídeo tendo um ou mais resíduos quimicamente derivatizados por reação de um grupo lateral funcional. Também incluídos como "derivados" estão aqueles peptídeos que contêm um ou mais aminoácidos de ocorrência natural derivativos dos vinte aminoácidos padrão. Por exemplo, a 4-hidroxiprolina pode ser substituída por prolina; 5-hidroxilisina pode ser substituída por lisina; 3-metil-histidina pode ser substituída por histidina; homoserina pode ser substituída por serina; e a ornitina pode ser substituída por lisina. Os derivados de anticorpos anti-CXCL13 e de polipeptídeos de anticorpos do presente invento, podem incluir polipeptídeos que tenham sido alterados de modo a exibir características adicionais que não são encontradas no anticorpo de referência ou no polipeptídeo de anticorpo da presente invenção.

[0065] O termo "polinucleotídeo" é destinado a abranger um ácido nucleico singular, bem como ácidos nucleicos plural, e refere-se a uma molécula de ácido nucleico isolada ou construir,por ex.,, o RNA mensageiro (mRNA) ou de DNA de plasmídeo (pDNA). Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação fosfodiéster convencional ou uma ligação não- convencional (por ex., uma ligação amida, tal como os encontrados em ácidos nucleicos peptídicos (PNA)). O "ácido nucleico" refere-se a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por ex. , fragmentos de DNA ou RNA presentes em um polinucleotídeo.Por meio do ácido nucleico "isolado" ou polinucleotídeo é destinada a molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA, que tenha sido removida do seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica uma molécula de ligação anti-CXCL13,, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, contido num vetor é considerado isolado para os fins da presente invenção. Outros exemplos de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos purificados (parcialmente ou substancialmente) em solução. Moléculas de RNA isoladas in vivo ou in vitro transcritos do RNA de polinucleotídeos da presente invenção.Polinucleotídeos isolados ou ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção incluem ainda estas moléculas produzidas sinteticamente. Além disso, um polinucleotídeo ou um ácido nucleico pode ser ou pode incluir um elemento regulador, tal como um promotor, sítio de ligação ao ribossoma, ou de um terminador de transcrição.

[0066] Como usado aqui, uma "região de codificação" é uma porção de ácido nucleico que consiste em códons de tradução em aminoácidos.Embora um "códon de terminação" (TAG, TGA ou TAA), não seja traduzido em um aminoácido, ele pode ser considerado como parte de uma região de codificação, mas todas as sequências de flanqueamento, para os promotores exemplo, sítios de ligação ao ribossoma, terminadores da transcrição, introns e semelhantes, não são parte de uma região de codificação. Duas ou mais regiões de codificação da presente invenção podem estar presentes em uma construção polinucleotídica simples, por ex., num único vetor ou em diferentes construções polinucleotídicas, por ex., em vetores separados (diferentes).Além disso, qualquer vetor pode conter uma única região de codificação, ou pode compreender duas ou mais regiões de codificação, por por ex., um vetor simples pode separadamente codificar uma imunoglobulina da região variável da cadeia pesada e uma imunoglobulina da região variável da cadeia leve. Além disso, um vetor, de polinucleotídeo ou de ácido nucleico, da presente invenção pode codificar regiões de codificação heteróloga, quer fundidos ou não fundidos com um ácido nucleico que codifica um anticorpo anti-CXCL13, seu fragmento, seu variante ou seu derivado. Regiões codificantes heterólogas incluem sem limitação elementos especializados ou motivos, tais como um peptídeo de sinal de secreção ou um domínio heterólogo funcional.

[0067] Em certas formas de configuração, o ácido nucleico ou polinucleotídeo é o DNA.No caso do DNA, um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo normalmente pode incluir um promotor e/ou a transcrição ou elementos de controle de tradução operativamente associada com uma ou mais regiões de codificação. Uma associação operável é quando uma região de codificação para um produto de gene, por ex.., um polipeptídeo, está associada a uma ou mais sequências reguladoras de tal modo a colocar a expressão do produto do gene sob a influência ou controle da(s) sequência(s) reguladora(s). Dois fragmentos de DNA (tais como uma região de codificação do polipeptídeo e um promotor que lhe estão associados) estão "operacionalmente associados" se a indução da função do promotor resulta na transcrição de mRNA que codifica o produto do gene desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interfere com a capacidade das sequências reguladoras de expressão para dirigir a expressão do produto do gene, ou interferir com a capacidade do molde de DNA a ser transcrito. Assim, uma região promotora estaria operativamente associada a um ácido nucleico que codifica para um polipeptídeo se o promotor fosse capaz de efetuar a transcrição de tal ácido nucleico. O promotor pode ser um promotor específico de células, que dirige a transcrição do DNA substancial apenas nas células pré- determinadas. Outros elementos de controle de transcrição, além de um promotor, por exemplo, potenciadores, operadores, repressores, e sinais de terminação da transcrição, podem ser operativamente associados ao polinucleotídeo para dirigir a transcrição específica de células. Promotores adequados e outras regiões de controle de transcrição são aqui descritos.

[0068] Uma variedade de regiões de controle da transcrição são bem conhecidas dos peritos na arte.Estas incluem, sem limitação, as regiões de controle de transcrição que funcionam em células de vertebrados, tais como, mas não limitado a, o promotor e potenciador de segmentos citomegalovírus (o promotor precoce imediato, em conjunto com o intron-A), vírus símio 40 (o promotor precoce), e retrovírus (tais como o vírus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controle de transcrição incluem os derivados de genes vertebrados, tais como a a actina, a proteína de choque térmico, o hormônio de crescimento bovino e β-globina de coelho assim como outras sequências capazes de controlar a expressão de genes em células eucarióticas. Adicionais regiões de controle de transcrições adequadas incluem tecidos específicos promotores e estimuladores, assim como linfoquinas de promotores induzíveis (por ex., os promotores induzíveis por interferões ou interleucinas).

[0069] Da mesma forma, uma variedade de elementos de controle de tradução são conhecidos dos vulgares peritos na arte.Estes incluem, porém não estão limitados a, locais de ligação ao ribossoma, iniciação da tradução e os códons de terminação e elementos derivados de picornavírus (particularmente um local interno de entrada do ribossoma, ou IRES, também referido como uma sequência CITE).

[0070] Noutras formas de configuração, um polinucleotídeo da presente invenção é o RNA, por exemplo, sob a forma de RNA mensageiro (mRNA).

[0071] As regiões codificantes de polinucleotídeo e ácido nucleico da presente invenção podem estar associadas às regiões codificantes adicionais que codificam os peptídeos de secreção ou de sinal e que dirigem a secreção do polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo da presente invenção.De acordo com a hipótese de sinal, as proteínas segregadas por células de mamíferos tem um peptídeo de sinal ou de secreção líder da sequência que é clivado da proteína madura, uma vez exportado da cadeia de proteína crescente através do retículo endoplasmático rugoso haver sido iniciado. Os peritos ordinários na arte estão cientes de que polipeptídeos segregados por células de vertebrados têm, geralmente, um peptídeo de sinal fundido com o terminal N do polipeptídeo, que é clivado a partir do polipeptídeo completo ou "do comprimento total" para produzir uma forma secretada ou "madura" do polipeptídeo. Em certas formas de configuração, o peptídeo de sinal nativo como, por exemplo, um sinal de peptídeo de imunoglobulina de cadeira pesada ou leve utilizado, ou um derivado funcional dessa sequência que retenha a capacidade para direcionar a secreção do polipeptídeo que é operativamente associado a ela.Alternativamente, um peptídeo de sinal heterólogo de mamífero, ou seu derivado funcional, podem ser usados. Por exemplo, a sequência líder de tipo selvagem pode ser substituída com a sequência líder do ativador de plasminogênio de tecido humano (TPA) ou β-glucuronidase de rato.

[0072] A "molécula de ligação" ou "molécula de ligação ao antígeno" da presente invenção refere-se, no seu sentido mais amplo, a uma molécula que se liga especificamente a um determinante antigênico. Numa configuração, a molécula de ligação se liga especificamente à CXCL13 (também chamada BCA- 1).Em outra forma de configuração, a molécula de ligação do presente invento é um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, por ex., um anticorpo anti-CXCL13. Numa outra forma de configuração, uma molécula de ligação da presente invenção compreende pelo menos uma cadeia CDR pesada ou leve de uma molécula de anticorpo. Numa outra forma de configuração, uma molécula de ligação da presente invenção compreende pelo menos duas CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Numa outra forma de configuração, uma molécula de ligação da presente invenção compreende pelo menos três CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Numa outra forma de configuração, uma molécula de ligação da presente invenção compreende pelo menos quatro CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Noutra forma de configuração, uma molécula de uma ligação da presente invenção compreende pelo menos cinco CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Numa outra forma de configuração, uma molécula de ligação da presente invenção compreende pelo menos seis CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em certas formas de configuração, um ou mais dos CDRs é de MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2, ou 3C9.

[0073] A presente invenção é dirigida a determinados anticorpos anti-CXCL13, ou de ligação ao antígeno, fragmentos, variantes ou seus derivados.A menos que, referindo-se especificamente aos anticorpos de tamanho completo, tais como anticorpos de ocorrência natural, o termo "anticorpos anti- CXCL13" inclui anticorpos de tamanho completo, bem como fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, análogos, ou derivados de tais anticorpos, por exemplo, , anticorpos de ocorrência natural, moléculas de imunoglobulina, moléculas de anticorpos de engenharia, fragmentos que se ligam o antígeno de uma forma semelhante a moléculas de anticorpo.

[0074] Tal como aqui utilizado, anticorpos "humanos" ou "completamente humanos" incluem anticorpos que possuem a sequência de aminoácidos de imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados a partir de bibliotecas de imunoglobulina humana ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endógenas, tal como descrito infra e, por exemplo, na Patente dos EUA. No. 5.939.598 por Kucherlapati et al. Anticorpos "humanos" ou "completamente humanos" também incluem anticorpos que compreendem pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada, ou pelo menos os domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que o domínio variável têm a sequência de aminoácidos do domínio variável da imunoglobulina humana.

[0075] Anticorpos "humanos" ou "completamente humanos" também incluem, tal como descrito acima, anticorpos "humanos" ou "completamente humanos" que consistem essencialmente de, ou consistem de, variantes (incluindo derivados) de moléculas de anticorpo (por exemplo( , as regiões VH e/ou regiões VL) aqui descritos, em que os anticorpos ou fragmentos dos mesmos imunoespecificamente se ligam ao polipeptídeo da CXCL13 ou fragmento ou variante do mesmo. Técnicas convencionais conhecidas dos peritos na arte podem ser usadas para introduzir mutações na sequência de nucleotídeos que codifica umanticorpo anti-CXCL13 humano, incluindo, mas não se limitando a mutagênese dirigida e mutagênese mediada por PCR, que resultam em substituições de aminoácidos. Preferencialmente, as variantes (incluindo derivados) codificam menos de 50 substituições de aminoácidos, menos de 40substituições de aminoácidos, menos de 30 substituições de aminoácidos, a menos de 25 substituições de aminoácidos, a menos de 20 substituições de aminoácidos, a menos de 15 substituições de aminoácidos , inferior a 10 substituições de aminoácidos, a menos de 5 substituições de aminoácidos, a menos de 4 substituições de aminoácidos, a menos de 3 substituições de aminoácidos, ou menos de 2 substituições de aminoácidos em relação à região VH de referência, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VL região, VLCDR1, VLCDR2 ou VLCDR3.

[0076] Em certas configurações, as substituições de aminoácidos são substituições conservativas de aminoácidos, discutidas mais adiante. Alternativamente, as mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência de codificação, tal como por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser rastreados para atividade biológica a fim de identificar mutantes que retêm a atividade (por exemplo, a capacidade de se ligar ao polipeptídeo CXCL13, por ex. , humano, murino ou ambos humano e murino CXCL13).Tais variantes (ou seus derivados) de anticorpos "humano" ou "completamente humano" também podem ser referidos como anticorpos humano ou totalmente humano que são "otimizados" ou "otimizados para a ligação ao antígeno", e incluem anticorpos que melhoraram aafinidade para o antígeno.

[0077] Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são aqui utilizados indiferentemente.Um anticorpo ou imunoglobulina compreende pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada, e normalmente compreende pelo menos os domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve. Estruturas básicas de imunoglobulina em sistemas vertebrados são relativamente bem compreendidas. Ver, por exemplo, Harlow et al.(1988) Antibodies: A Laboratory Manual (2 a ed.; Fria Spr ing Harbor Laboratory Press).

[0078] Como será discutido em mais detalhe abaixo, o termo "imunoglobulina" compreende diversas amplas classes de polipeptídeos que podem ser distinguidos bioquimicamente.Aqueles que são peritos na arte apreciarão que as cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, épsilon, (□, □ , □ , □ , □) com algumas subclasses entre eles (por ex., Y1-Y4). É a natureza desta cadeia, que determina a "classe" do anticorpo como IgG, IgM, IgG IgA, ou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc, são bem caracterizadas e são conhecidos para conferir especialização funcional.Versões modificadas de cada uma destas classes e isotipos são facilmente perceptíveis para o perito na arte tendo em vista a divulgação instantânea e, em conformidade, estão dentro do âmbito do presente invento. Todas as classes de imunoglobulinas estão claramente dentro do âmbito da presente invenção, a discussão que se segue será geralmente dirigida para a classe IgG de moléculas de imunoglobulina. No que diz respeito à IgG, uma molécula de imunoglobulina padrão compreende duas cadeias leves idênticas polipeptídeos de peso molecular aproximado de 23.000 daltons, e duas cadeias pesadas idênticas polipeptídeos de peso molecular entre 53,000 a 70,000. As quatro cadeias são tipicamente unidas por ligações de dissulfureto em configuração "Y", em que as cadeias leves dão suporte às cadeias pesadas começando na boca do "Y" e continuandoatravés da região variável.

[0079] As cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda □□□ □□□Cada classe de cadeia pesada pode ser ligada a quaisquer cadeias leves seja kappa ou lambda. Em geral, as cadeias leve e pesada estão covalentemente ligadas uma à outra, e as porções "cauda" das duas cadeias pesadas estão ligadas uma à outra por ligações de dissulfureto covalentes ou ligações não-covalentes quando as imunoglobulinas são geradasquer por hibridomas, céluas B ou células hospedeiras geneticamente manipuladas. Na cadeia pesada, as sequências de aminoácidos são executadas a partir de um N-terminal das extremidades bifurcadas da configuração Y para o C-terminal,na parte inferior de cada cadeia.

[0080] Ambas as cadeias leves e pesadas são divididas em regiões de homologia estrutural e funcional.Os termos "constante" e "variável" são usados funcionalmente. A este respeito, deve notar-se que os domínios variáveis de ambas as porções de cadeias leve (VL ou VK) e pesada (VH) determinam o reconhecimento do antígeno e de especificidade.Por outro lado, os domínios constantes de cadeia leve (CL) e de cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) conferem propriedades biológicas importantes tais como secreção, mobilidade transplacentária, ligação ao receptor Fc, ligação do complemento e similares. Por convenção, a numeração dos domínios da região constante aumenta à medida que se tornam mais distais do local de ligação ao antígeno ou do amino-terminal do anticorpo. A porção N-terminal é uma região variável e, na porção C- terminal é uma região constante, e os domínios CH3 e CL realmente compreendem o carboxi-terminal da cadeia pesada e leve, respectivamente.

[0081] Conforme indicado na presente invenção, a região variável permite ao anticorpo reconhecer seletivamente e ligar especificamente os epítopos em antígenos. Isto é, o domínio VL e o domínio VH, ou um subconjunto de regiões determinantes de complementaridade (CDRs) dentro destes domínios variáveis, de um anticorpo se combinam para formar a região variável que define um local tridimensional de ligação de antígeno.Esta estrutura de anticorpo quaternário forma o antígeno presente no local de ligação da extremidade de cada braço do Y. Mais especificamente, o local de ligação ao antígeno é definido por três CDRs de cada uma das cadeias VH e VL. Em alguns casos, por ex.,certas moléculas de imunoglobulina certos derivadas de espécies de camelídeos ou concebidas com base em imunoglobulinas de camelídeos, uma molécula de imunoglobulina completa pode consistir apenas de cadeias pesadas, sem cadeias leves. Ver, por exemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363 :446-448 (1993).

[0082] Em anticorpos de ocorrência natural, as seis "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs" presentes em cada domínio de ligação ao antígeno são curtas, as sequências não contíguas de aminoácidos que estão especificamente posicionadas de modo a formar o domínio de ligação ao antígeno do anticorpo assumem a sua configuração tridimensional em um ambiente aquoso.A parte restante dos aminoácidos nos domínios de ligação a antígeno, designados por "quadro" de regiões mostram uma menor variabilidade inter- molecular. As regiões de estrutura adotam largamente uma conformação folha-β e as CDRs formam voltas que ligam, e em alguns casos formam parte, da estrutura folha- β. Assim, as regiões de estrutura atuam de modo a formar uma estrutura de suporte que propicia o posicionamento das CDRs na orientação correta por inter-cadeias de interações não covalentes. O domínio de ligação do antígeno formado pelas CDRs posicionadas define uma superfície complementar do epítopo no antígeno imunorreativo. Esta superfície complementar promove a ligação não-covalente do anticorpo ao seu epítopo cognato. Os aminoácidos que compõem as CDRs e as regiões de quadro, respectivamente, podem ser prontamente identificados por qualquer domínio variável de cadeia pesada ou leve por um vulgar perito na arte, uma vez que eles tenham sido definidos com precisão (ver abaixo).

[0083] No caso em que existam duas ou mais definições de um termo que é usado e/ou aceito na arte, a definição do termo tal como aqui é utilizado destina-se a incluir todos esses significados, a menos que explicitamente indicado em contrário.Um exemplo específico é a utilização da expressão "região determinante de complementaridade" termo ("CDR") para descrever o antígeno não-contíguo combinando locais encontrados na região variável de ambos os polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Esta região em particular tem sido descrita por Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" e por Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), que são aqui incorporados por referência, onde as definições incluem a sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos, quando comparadas umas com as outras.No entanto, a aplicação de qualquer uma das definições para se referir a uma CDR de um anticorpo ou as suas variantes destina-se a estar dentro do âmbito do termo tal como definido e aqui utilizado. Os resíduos de aminoácido apropriados que compreendem as CDRs tal como definidas por cada uma das referências acima citadas são apresentados abaixo na Tabela 1 como uma comparação.Os números de resíduos exatos que englobam uma CDR particular irão variar, dependendo da sequência e do tamanho da CDR. Os peritos na arte podem determinar rotineiramente quais resíduos compreende uma CDR particular, tendo em conta a região variável de sequência de aminoácidos do anticorpo. Tabela 1. Definições CDR 1

1 A numeração de todas as definições CDR da Tabela 1 está de acordo com o as convenções de numeração definidas por Kabat et al. (Ver abaixo).

[0084] Kabat et al. também definiu um sistema de numeração para as sequências de domínio variável que é aplicável a qualquer anticorpo.Um perito vulgar na arte pode atribuir inequivocamente este sistema de "numeração de Kabat" para qualquer sequência de domínio variável, sem depender de quaisquer dados experimentais para além da própria sequência. Como usado aqui, a "numeração de Kabat" refere-se ao sistema de numeração estabelecido por Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest." Salvo indicação em contrário, as referências à numeração das posições de aminoácidos específicos de resíduos em um anticorpo anti-CXCL13 ou fragmento de ligação ao antígeno, a variante, ou derivado da presente invenção são de acordo com o sistema de numeração de Kabat.

[0085] Fragmentos de anticorpos ou de ligação ao antígeno, variantes, ou seus derivados da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, anticorpos policlonais, monoclonais, multiespecífico, humanos, humanizados, primatizados, ou quiméricos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos de ligação ao epítopo, por ex. , Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs, Fvs de cadeia única (scFv), Fvs ligado ao dissulfureto (sdFv), fragmentos que compreendem uma VL ou VH de domínio, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, e anti- idiotípicos (anti-Id) (incluindo os anticorpos, por ex. , anticorpos anti-Id para anticorpos anti-CXCL13 aqui revelados). Moléculas ScFv são conhecidas na arte e são descritas, por ex., na patente dos EUA No. 5,892,019. Moléculas de imunoglobulina ou de anticorpo da presente invenção podem ser de qualquer tipo (por exemplo , IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY), classe (por ex., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2, etc.), ou subclasse da molécula de imunoglobulina.

[0086] Tal como aqui utilizado, o termo "porção da cadeia pesada", inclui as sequências de aminoácidos derivadas de uma cadeia pesada de imunoglobulina.Um polipeptídeo compreendendo uma porção da cadeia pesada é composto, pelo menos, de um dos seguintes: um domínio CH1, uma charneira (por ex., de região superior, média, e/ou inferior) de domínio, um domínio CH2, um domínio CH3, ou uma variante ou fragmento da mesma. Por exemplo, um polipeptídeo de ligação para uso na presente invenção pode compreender uma cadeia de polipeptídeo composta por um domínio CH1, uma cadeia polipeptídica que composta por um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de charneira e um domínio CH2, uma cadeia polipeptídica composta por um domínio CH1 e um domínio CH3, a cadeia de polipeptídeo que composta por um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de charneira e um domínio CH3, ou uma cadeia polipeptídica composta por um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de charneira, um domínio CH2, e um domínio CH3. Numa outra conformação, um polipeptídeo da presente invenção compreende uma cadeia polipeptídica composta por um domínio CH3. Além disso, um polipeptídeo de ligação para uso na presente invenção poderá faltar ao menos uma porção de um domínio CH2 (por ex., a totalidade ou uma parte do domínio CH2). Conforme estabelecido acima, será entendido por um perito vulgar na arte que estes domínios (por ex., (as porções de cadeia pesada) podem ser modificadas de tal forma que elas variam na sequência de aminoácidos da molécula de imunoglobulina que ocorre naturalmente.

[0087] Em certos anticorpos anti-CXCL13 ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou seus derivados aqui descritos, as porções de cadeia pesada de uma cadeia polipeptídica de um multímero são idênticas às de uma segunda cadeia polipeptídica do multímero.Alternativamente, parte da cadeia pesada contendo os monômeros da presente invenção não são idênticos. Por exemplo, cada monômero pode incluir um local alvo de ligação diferente, formando, por exemplo, um anticorpo bi-específico.

[0088] As porções de cadeia pesada de uma molécula de ligação para uso nos métodos de diagnóstico e de tratamento aqui descritos podem ser derivados de moléculas de imunoglobulinas diferentes.Por exemplo, uma porção da cadeia pesada de um polipeptídeo pode compreender um domínio C H1 derivado de uma molécula de IgG1 e uma região de charneira de uma molécula derivada de IgG3.Em outro exemplo, uma porção da cadeia pesada pode incluir uma região de charneira derivada, em parte, a partir de uma molécula de IgG1 e, em parte, a partir de uma molécula de IgG3. Em outro exemplo, uma porção da cadeia pesada pode incluir uma dobradiça derivada de quimérico, em parte, a partir de uma molécula de IgG1 e, em parte, a partir de uma molécula de IgG4.

[0089] Tal como aqui utilizado, o termo "porção da cadeia leve", inclui as sequências de aminoácidos derivadas a partir de uma cadeia leve de imunoglobulina, por ex.,, uma cadeia leve kappa ou lambda. Preferencialmente, a porção da cadeia leve compreende ao menos um dos domínios VL ou CL.

[0090] Fragmentos de anticorpos anti-CXCL13 ou de ligação ao antígeno, variantes ou seus derivados aqui divulgados, podem ser descritos ou especificados em termos do(s) epítopo(s) ou parte(s) de um antígeno, por ex., , um alvo de polipeptídeo aqui divulgado (por ex., CXCL13) que eles reconheçam ou se liguem especificadamente. A porção de um polipeptídeo alvo que interage especificamente com o domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo é um "epítopo", ou um "determinante antigênico". Um polipeptídeo alvo pode compreender um único epítopo, mas compreende tipicamente pelo menos dois epítopos, e pode incluir qualquer número de epítopos, dependendo do tamanho, da conformação, e do tipo de antígeno. Além disso, deve notar-se que um "epítopo" em um polipeptídeo alvo pode ser oupode incluir elementos não- polipeptídicos, por ex., um epítopo pode incluir uma cadeia lateral de hidrato de carbono.

[0091] A dimensão mínima de um epítopo de peptídeo ou polipeptídeo para um anticorpo é pensado para ser de cerca de 4-5 aminoácidos.Epítopos peptídicos ou polipeptídicos contêm preferencialmente pelo menos sete, mais preferencialmente pelo menos nove e mais preferencialmente pelo menos entre cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos. Uma vez que a CDR possa reconhecer um peptídeo antigênico ou um polipeptídeo na sua forma terciária, os aminoácidos que compreendem um epítopo não precisam ser contíguos e, em alguns casos, podem até não ser da mesma cadeia peptídica. Um epítopo de peptídeo ou polipeptídeo reconhecido pelos anticorpos anti-CXCL13 do presente invento podem conter uma sequência de pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, mais preferivelmente pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, ou entre cerca de 15 a cerca de 30 contíguos ou não contíguos aminoácidos da CXCL13.

[0092] Por "liga-se especificamente", entende-se geralmente que um anticorpo se liga a um epítopo, através do seu domínio de ligação ao antígeno, e que a ligação envolve uma complementaridade entre o domínio de ligação ao antígeno e o epítopo.De acordo com esta definição, é dito que um anticorpo "se liga especificamente" a um epítopo, quando se liga ao epítopo através do seu domínio de ligação ao antígeno mais rapidamente do que seria de se ligar a um epítopo aleatório independente. A "especificidade" é aqui usada para qualificar a afinidade relativa de um anticorpo que se liga a um determinado epítopo específico. Por exemplo, anticorpo "A" pode ser considerado como tendo uma maior especificidade para um dado epítopo do que o anticorpo "B", ou pode-se dizer que o anticorpo "A" se liga a epítopos de "C", com uma especificidade mais elevada do que tem para o epítopo "D" relacionado.

[0093] Por "liga-se preferencialmente" entende-se que o anticorpo se liga especificamente a um epítopo mais rapidamente do que seria de se ligar a um epítopo relacionado, similar, homólogo ou análogo.Assim, um anticorpo que "liga-se preferencialmente" a um dado epítopo seria mais provável de se ligar a este epítopo do que a um epítopo relacionado, apesar de que tal anticorpo pode reagir de forma cruzada com o epítopo relacionado.

[0094] A título de exemplo não limitativo, um anticorpo pode ser considerado para ligar um primeiro epítopo, preferencialmente se liga ao dito primeiro epítopo com uma constante de dissociação (KD) que é menor do que o anticorpo do KD para o segundo epítopo.Em um outro exemplo não limitativo, um anticorpo pode ser considerado para ligar um primeiro antígeno, preferencialmente, se liga ao primeiro epítopo com uma K D que é pelo menos uma ordem de grandeza menor do que o anticorpo do K D para o segundo epítopo.Em um outro exemplo não limitativo, um anticorpo pode ser considerado para ligar um primeiro epítopo, preferencialmente se liga ao epítopo primeiro com um K D que é, pelo menos, duas ordens de grandeza menor do que o anticorpo do K D para o segundo epítopo.

[0095] Em um outro exemplo não limitativo, um anticorpo pode ser considerado para ligar um primeiro epítopo, preferencialmente se liga o primeiro epítopo com uma taxa de desligado (k (desligado)), que é menor do que k do anticorpo (desligado) para o segundo epítopo.Em um outro exemplo não limitativo, um anticorpo pode ser considerado para ligar um primeiro epítopo, preferencialmente se liga ao epítopo primeiro com um k (desligado) que é pelo menos uma ordem de grandeza menor do que k do anticorpo (desligado) para o segundo epítopo . Em um outro exemplo não limitativo, um anticorpo pode ser considerado para ligar um primeiro epítopo, preferencialmente se liga ao epítopo primeiro com um k (desligado) que é pelo menos duas ordens de grandeza menor do que k do anticorpo (desligado) para o segundo epítopo. Um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado aqui revelado pode ser dito para ligar um alvo de polipeptídeo aqui divulgado (por ex.,( CXCL13, por ex., CXCL13 humana, murina ou ambas humana e murina) ou um fragmento ou variante do mesmo com uma taxa de desligado (k (desligado)) inferior ou igual a 5 x 10-2 sec-1, 10-2 sec-1, or 5 X l0-3 sec-1. Em certas configurações, o k (off) é menor do que ou igual a cerca de 3 x 10 ~ 2, por exemplo, em que o anticorpo é 3D2 e a CXCL13 é humana ou de rato.Numa outra forma de configuração, o k (off) émenor do que ou igual a cerca de 3 x 10-3, por ex., em que o anticorpo é MAb 5261 e a CXCL13 é humana ou de rato. Numa outra forma de configuração, o k (off) é menor do que ou igual a cerca de 4 x 10 -3, por ex., em que o anticorpo é MAb 5378 e a CXCL13 é humana ou de rato. Em uma forma de configuração, um anticorpo da presente invenção pode ser dito para ligar um alvo de polipeptídeo aqui divulgados (por ex., ( CXCL13, por ex., CXCL13 humana, murina ou ambas humana e murina) ou um fragmento ou variante do mesmo, com uma taxa de desligado (k ( desligado)) inferior ou igual a 5 x 10 -4 sec-1, 10-4 sec-1, 5 X 10-5 sec-1, or 10-5 sec-1, 5 X 10-6 sec-1, 10-6 sec- 1, 5 X 10-7 sec-1 or 10-7 sec-1.

[0096] Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado aqui revelado pode ser dito para ligar um alvo de polipeptídeo aqui divulgados (por ex.,( CXCL13, por ex., CXCL13 humana, murina ou ambas humana e murina) ou um fragmento ou variante do mesmo com uma taxa de (k (on)) superior ou igual a 103 M-1 sec-1, 5 X 103 M-1 sec-1, 104 M-1 sec- 1, 5 X 104 M-1 sec-1, 105 M-1 sec-1, 5 X 105 M-1 sec-1, 106 M-1 sec-1 or 5 X 106 M-1 sec-1. Em certas configurações, o k (on) é maior do que ou igual a cerca de 5 X 10 5, por exemplo, em que o anticorpo é 3D2 e a CXCL13 é humana, ou o do k(on) é maior do que ou igual a cerca de 1 X 10 5, por exemplo, em que o anticorpo é 3D2 e a CXCL13 é de ratos.Numa outra forma de configuração, o k(on) é maior do que ou igual a cerca de 1 X 106, por ex., em que o anticorpo é MAb 5261 e a CXCL13 é humano ou de ratos. Numa outra forma de configuração, o k(on) é maior do que ou igual a cerca de 1 X 10 6, por exemplo, em que o anticorpo é MAb 5378 e a CXCL13 é humana ou de rato. Em uma configuração, um anticorpo da presente invenção pode ser dito para ligar um alvo de polipeptídeo aqui divulgados (por ex., ( CXCL13, por ex., CXCL13 humana, murina ou ambas humana e murina) ou um fragmento ou variante do mesmo, com uma taxa de (k (on)) superior ou igual a 105 M-1 sec-1, 5 X 105 M-1 sec-1, 106 M-1 sec-1, or 5 X 106 M-1 sec-1 or 107 M-1 sec-1.

[0097] Um anticorpo é dito por inibir competitivamente a ligação de um anticorpo de referência,por ex., um anticorpo anti-CXCL3 aqui divulgado, por ex., MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2, ou 3C9, para um dado epítopo se este liga-se preferencialmente àquele epítopo na medida em que bloqueia, até certo grau, a ligação do anticorpo de referência para o epítopo. A inibição competitiva pode ser determinada por qualquer método conhecido na arte, por exemplo, ensaios de competição de ELISA. Um anticorpo pode ser dito para inibir competitivamente a ligação do anticorpo de referência a um dado epítopo de, pelo menos, 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, ou, pelo menos, 50%.

[0098] Tal como aqui utilizado, o termo "afinidade" refere- se a uma medida da força da ligação de um epítopo individual com a CDR de uma molécula de imunoglobulina.Ver, por exemplo, Harlow et al.(1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 a ed.) Páginas 27-28. Como usado aqui, o termo "avidez" refere-se a estabilidade global do complexo entre uma população de imunoglobulinas e um antígeno, ou seja, a resistência funcional da combinação de uma mistura de imunoglobulina com o antígeno. Ver, por exemplo, Harlow, páginas 29-34.A avidez está relacionada à afinidade de moléculas de imunoglobulina individuais na população com epítopos específicos, como também às valências das imunoglobulinas e do antígeno. Por exemplo, a interação entre um anticorpo bivalente monoclonal e um antígeno com um epítopo estrutura altamente repetitiva, tal como um polímero, seria de uma elevada avidez.

[0099] Fragmentos de anticorpos anti-CXCL13 ou de ligação ao antígeno, variantes ou seus derivados, da presente invenção podem também ser descritos ou especificados em termos da sua reatividade cruzada.Tal como aqui utilizado, o termo "a reatividade cruzada" refere-se à capacidade de um anticorpo, específico para um antígeno, para reagir com um segundo antígeno; uma medida de parentesco entre duas substâncias antigênicas diferentes. Assim, um anticorpo é reativo cruzado se se liga a um epítopo diferente do que induziu a sua formação. O epítopo reativo cruzado geralmente contém muitas das mesmas características estruturais complementares como o epítopo indutor e, em alguns casos, pode na verdade se ajustar melhor do que o original.

[0100] Por exemplo, certos anticorpos possuem um certo grau de reatividade cruzada, em que eles se ligam a epítopos relacionados, mas não idênticos, por ex., os epítopos com pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, em pelo menos 75% de identidade, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55%, e, pelo menos, 50% (calculado por métodos conhecidos na arte e aqui descritos) para um epítopo de referência. Um anticorpo pode ser considerado como tendo pouca ou nenhuma reatividade cruzada, se não se ligar a epítopos com menos de 95%, inferior a 90%, inferior a 85%, inferior a 80%, inferior a 75%, inferior a 70%, inferior a 65%, inferior a 60%, inferior a 55%, e menos de 50% de identidade (como calculado utilizando modos conhecidos na arte e aqui descritos) a um epítopo de referência. Um anticorpo pode ser considerado como "muito específico" para um determinado epítopo, se ele não se ligar a qualquer outro análogo, ortólogo, ou homólogo desse epítopo.

[0101] As moléculas de ligação anti-CXCL13, por ex., anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou seus derivados, da presente invenção podem também ser descritos ou especificados em termos da sua afinidade de ligação a um polipeptídeo da presente invenção, por ex., CXCL13, e.g.,CXCL13 humana, murina ou ambas humana e murina. Em certas configurações, as afinidades de ligação do invento incluem os que têm uma constante de dissociação ou Kd menor do que ou não maior do que 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 1010 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, ou 10-15 M. Numa configuração, a molécula de ligação anti-CXCL13, por ex., um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção, liga-se à CXCL13 humanos com um Kd de menos de cerca de 5 x 10 -9 M a cerca de 5 x 10-10 M, por ex., em que o anticorpo é MAb 5261 e o Kd é menor que ou igual a cerca de 5 x 10-9 M. Noutra forma de configuração, a molécula de ligação anti-CXCL13, por ex.,um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção, liga-se à CXCL13 murinos com um Kd de menos de cerca de 5 x 10-7 M a cerca de 9 x 10-9 M, por ex., em que o anticorpo é MAb 5261 e o Kd é menor que ou igual a cerca de 8 x 10-9 M.

[0102] Fragmentos de anticorpos anti-CXCL13 ou de ligação ao antígeno, variantes ou seus derivados do invento podem ser "multi-específico", por exemplo, biespecíficos, triespecíficos, ou de maior multiespecificidade, o que significa que ele reconhece e liga-se a dois ou mais epítopos diferentes presentes em um ou mais antígenos diferentes (por exemplo., proteínas), ao mesmo tempo.Assim, se um anticorpo anti-CXCL13 é "monoespecífico" ou "multi-específico",por ex.,"biespecífico", refere-se ao número de epítopos diferentes, com o qual uma ligação de polipeptídeos reage. Os anticorpos multi-específicos podem ser específicos para epítopos diferentes de um polipeptídeo alvo aqui descrito ou pode ser específico para um polipeptídeo alvo, bem como para um epítopo heterólogo, tal como um material de polipeptídeo heterólogo ou de suporte sólido .

[0103] Como é aqui utilizado o termo "valência" refere-se ao número de possíveis domínios de ligação como, por exemplo , os domínios de ligação ao antígeno presente em uma molécula de ligação de polipeptídeo de ligação CXCL13, por ex., um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno. Cada domínio de ligação se liga especificamente a um epítopo. Quando uma molécula de polipeptídeo ou de ligação CXCL13 compreende mais do que um domínio de ligação, cada um domínio de ligação pode ligar-se especificamente ao mesmo epítopo, para um anticorpo com dois domínios de ligação, denominado "monoespecífico bivalente", ou para epítopos diferentes, para um anticorpo com dois domínios de ligação, designado como "biespecífico bivalente."Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode também ser bi-específico e bivalentes para cada especificidade (denominados "anticorpos bi-específicos tetravalentes"). Numa outra forma de configuração, podem ser feitos mini corpos tetravalentes ou anticorpos de domínio excluídos.

[0104] Anticorpos bi-específicos bivalentes, e os métodos para a sua preparação, são descritos, por exemplo na Patente dos EUA. N ° s 5.731.168; 5.807.706; 5.821.333 e Patente dos EUA Appl. Publ. N ° s 2003/020734 e 2002/0155537, as divulgações de todas as quais são aqui incorporadas por referência. Anticorpos bi-específicos tetravalentes, e métodos para a sua preparação estão descritos, por exemplo, em WO 02/096948 e WO 00/44788, as revelações de ambas as quais são aqui incorporadas por referência. Ver geralmente, as publicações PCT WO 93/17715, WO 92/08802, WO 91/00360, WO 92/05793; Tutt et ai, J.. Immunol.147 :60-69 (1991); Patente dos EUA. N ° s 4.474.893; 4.714.681; 4.925.648; 5.573.920; 5.601.819; Kostelny et al, J.. Immunol.148: 1547-1553 (1992).

[0105] Conforme indicado anteriormente, as estruturas de subunidade e as três configurações dimensionais das regiões constantes das várias classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.Tal como aqui utilizado, o termo "domínio VH" inclui o domínio variável de amino-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina e o termo "domínio CH1" inclui o domínio da primeira região constante (maioria amino-terminais) de uma cadeia pesada de imunoglobulina. O domínio CH1 é adjacente ao domínio VH e é amino-terminal da região de charneira de uma molécula de cadeia pesada de imunoglobulina.

[0106] Tal como aqui utilizado, o termo "domínio CH2" inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada, que se estende,por ex.,aproximadamente a partir do resíduo 244 ao resíduo 360 de um anticorpo usando esquemas convencionais de numeração (resíduos 244-360, Kabat sistema de numeração, e resíduos 231 - 340, sistema europeu de numeração; ver Kabat EAet al.). O domínio CH2 é único na medida em que não está intimamente emparelhado com outro domínio. Em vez disso, duas cadeias de carboidratos ramificadas e N-ligadas são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula IgG nativa e intacta. Também está bem documentado que o domínio CH3 estende-se desde o domínio CH2 ao C-terminal da molécula de IgG e compreende aproximadamente 108 resíduos.

[0107] Como aqui utilizado, a "região de charneira" inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada que une o domínio CH1 ao domínio CH2.Esta região da charneira compreende cerca de 25 resíduos e é flexível, permitindo assim que as duas regiões N-terminais de ligação ao antígeno se movam de forma independente. Regiões de charneira podem ser subdivididas em três domínios distintos: superior, médio e inferior domínios de charneira (Roux et al., J. Immunol. 161: 4083 (1998)).

[0108] Como aqui utilizado, o termo "laço de dissulfureto" compreende a ligação covalente formada entre dois átomos de enxofre.O aminoácido cisteína compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação de dissulfureto ou uma ponte com um segundo grupo tiol. Na maioria das moléculas IgG de ocorrência natural, as regiões CH1 e CL estão ligadas por uma ligação de dissulfureto e as duas cadeias pesadas estão ligadas por duas pontes de dissulfureto nas posições correspondentes a 239 e 242, utilizando o sistema de numeração de Kabat (posição 226 ou 229, EU sistema de numeração ).

[0109] Como aqui utilizado, o termo "anticorpo quimérico" será referido a qualquer anticorpo em que a região ou local imunorreativo é obtido ou derivado de uma primeira espécie e a região constante (que pode estar intacta, parcial ou modificada de acordo com o presente invento) é obtida a partir de uma segunda espécie.Em certas formas de configuração, a região ou local de ligação alvo será a partir de uma fonte não humana (por ex., rato ou primata) e a região constante é humana (por exemplo, anticorpo monoclonal (MAb) 1476 aqui descrito).

[0110] Como aqui utilizado, o termo "anticorpo de engenharia" refere-se a um anticorpo em que o domínio variável de cadeia pesada ou leve, ou de ambas, é alterado por, pelo menos, uma substituição parcial de uma ou mais CDRs de um anticorpo de especificidade conhecida e, se necessário, por substituição parcial de estrutura da região e sequência de mudança.Embora as CDRs podem ser derivadas de um anticorpo da mesma classe ou, ainda, subclasse como o anticorpo a partir do qual as regiões de estrutura são derivadas, prevê-se que as CDRs irão ser derivadas de um anticorpo de uma classe diferente e de preferência a partir de um anticorpo de espécies diferentes. Um anticorpo de engenharia em que uma ou mais CDRs "doadoras" de um anticorpo não-humano de especificidade conhecida estão inseridas em uma região de estrutura de cadeia pesada ou leve humana é aqui referido como um "anticorpo humanizado." Pode não ser necessário substituir todas as CDRs com as CDRs completas do domínio variável do doador para transferir a capacidade de ligação ao antígeno de um domínio variável para outro. Ao contrário, pode ser somente necessário para transferir os resíduos que são indispensáveis para manter a atividade do lugar de ligação alvo. Em certas configurações, o anticorpo humanizado compreende uma, duas, ou três CDRs de um domínio variável pesado doador. Numa outra configuração, o anticorpo humanizado compreende uma, duas, ou três CDRs de um domínio leve variável doador.

[0111] É ainda reconhecido que as regiões de estrutura do domínio variável em cadeias pesada ou leve, ou ambas, de um anticorpo humanizado pode compreender exclusivamente resíduos de origem humana, caso em que estas regiões estruturais do anticorpo humanizado (por exemplo, MAb 5080 ou 5261) são referidas como "regiões de estrutura completamente humanas".Alternativamente, um ou mais resíduos de regiões estruturais do doador de domínio variável podem ser manipulados dentro da posição correspondente das regiões estruturais humanas de domínio variável em uma cadeia pesada ou leve, ou ambas, de um anticorpo humanizado se necessário para manter a ligação apropriada ou para aumentar a ligação ao antígeno CXCL13. Uma região estrutural humana, que foi desta forma assim concebida, compreende uma mistura de resíduos estruturais humanos e de doadores, e é aqui referida como uma "região de estrutura parcialmente humana".

[0112] Por exemplo, a humanização de um anticorpo anti- CXCL13 pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)), pela substituição de CDRs de roedor ou de roedores mutantes ou sequências CDR, para as sequências correspondentes de um anticorpo anti-CXCL13 humano. Ver também Patente dos EUA. N ° s 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762 e 5.859.205; aqui incorporadas por referência. O resultante anticorpo humanizado anti-CXCL13 que compreende pelo menos uma CDR de roedor ou de roedores mutantes dentro das regiões estruturais inteiramente humanas do domínio variável da cadeia pesada e/ou leve do anticorpo humanizado. Em alguns casos, os resíduos nas regiões estruturais de um ou mais domínios variáveis de um anticorpo humanizado anti-CXCL13 são substituídos pelos resíduos correspondentes não-humanos, por exemplo, roedor, (ver, por exemplo, Patente dos EUA N ° s 5.585.089;. 5693761 ; 5.693.762 e 6.180.370), caso em que a resultante do anticorpo humanizado anti-CXCL13 compreenderia regiões parciais de estrutura humana no domínio variável da cadeia pesada e/ou cadeia leve.

[0113] Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador.Estas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo por ex. (, para obter a afinidade desejada). Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as CDRs correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões estruturais são as de uma sequência de imunoglobulina humana. Opcionalmente, o anticorpo humanizado também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes ver Jones et al., Nature 331:522525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596 (1992); aqui incorporadas por referência.Consequentemente, tais anticorpos "humanizados" podem incluir anticorpos em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns ou todos os resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos estruturais são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores. Ver, por exemplo, a Patente dos EUA. N ° s 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762 e 5.859.205.Ver também Patente dos EUA. No. 6.180.370, e Publicação Internacional No. WO 01/27160, em que os anticorpos humanizados e técnicas para a produção de anticorpos humanizados possuindo uma afinidade melhorada para um antígeno pré-determinado são divulgados.

[0114] Como aqui utilizado, os termos "ligado", "fundido", ou "fusão" são usados alternadamente.Estes termos referem-se à união de mais dois elementos ou componentes, por qualquer meio, incluindo a conjugação de meios químicos ou recombinantes. Uma "fusão de estrutura" refere-se à união de duas ou mais fases de leitura aberta (ORFs) de polinucleotídeos, para formar uma ORF contínua mais longa, de uma maneira que mantém a estrutura de leitura correta de translação das ORFs originais. Assim, uma proteína de fusão recombinante é uma proteína única que contém dois ou mais segmentos que correspondem aos polipeptídeos codificados pelas ORFs originais (que normalmente não são segmentos naturalmente unidos em natureza). Embora a fase de leitura seja assim realizada contínua ao longo dos segmentos fusionados, os segmentos podem ser fisicamente ou espacialmente separados por, por exemplo, no quadro de sequência linker. Por exemplo, os polinucleotídeos codificadores de CDRs de uma região variável de imunoglobulina podem ser fundidos, em quadro, mas ser separados por um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma região de estrutura de imunoglobulina ou as regiões CDR adicionais, desde que os CDRs "fundidos" sejam co-traduzidos como parte de um polipeptídeo contínuo.

[0115] No contexto de polipeptídeos, uma "sequência linear" ou uma "sequência" é uma ordem de aminoácidos de um polipeptídeo de amino até a direção do terminal carboxilo, em que os resíduos vizinhos na sequência são contíguos na estrutura primária do polipeptídeo.

[0116] O termo "expressão", tal como aqui utilizado, refere-se a um processo pelo qual um gene produz um bioquímico, por exemplo, um polipeptídeo.O processo inclui qualquer manifestação da presença funcional do gene dentro da célula, incluindo, sem limitação, o gene knockdown, bem como ambas a expressão transitória e a expressão estável. Ele inclui sem limitação a transcrição do gene em RNA mensageiro (mRNA), e a tradução deste mRNA em tais polipeptídeos. Se o produto final desejado é bioquímico, a expressão inclui a criação desta bioquímica e que quaisquer precursores. A expressão de um gene produz um "produto do gene." Como aqui utilizado, um produto do gene pode ser um ácido nucleico, por ex., um RNA mensageiro produzido por transcrição de um gene, ou um polipéptido que é traduzido a partir de uma transcrição. Produtos de genes aqui descritos incluem ainda ácidos nucleicos com modificações pós-transcricionais, por ex., de poliadenilação, ou polipeptídeos com modificações pós- translacionais, por ex., glicosilação, metilação, a adição de lípidos, de associação com outras subunidades de proteína, clivagem proteolítica, e semelhantes.

[0117] Como aqui utilizado, os termos "tratar" ou "tratamento" se referem tanto a tratamento terapêutico como a medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é prevenir ou desacelerar (diminuir) uma alteração fisiológica indesejada ou distúrbio, tais como a progressão de esclerose múltipla, lúpus, artrite ou câncer.Resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, alívio de sintomas, diminuição da extensão da doença, estabilidade (isto é,, não piora), estado da doença, atraso ou retardamento da progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença, e remissão (quer parcial ou total), seja detectável ou indetectável. "Tratamento" também pode significar prolongar a sobrevivência, em comparação com a sobrevivência esperada caso não receba o tratamento. Aqueles que necessitam de tratamento incluem os já com a condição ou desordem, bem como os que estão propensos a ter condição ou distúrbio, ou aqueles em que a condição ou distúrbio é para ser prevenido.

[0118] Por "sujeito" ou "indivíduo" ou "animal" ou "paciente" ou "mamífero" entenda-se qualquer sujeito, em particular um mamífero, para o qual o prognóstico, diagnóstico ou terapia é desejado.Indivíduos mamíferos incluem humanos, animais domésticos, animais de fazenda e de zoológico, desporto ou animais de estimação, tais como cães, gatos, cobaias, coelhos, ratazanas, ratos, cavalos, vacas, e assim por diante.

[0119] Tal como aqui usado, frases tais como "um sujeito que iria beneficiar da administração de um anticorpo anti- CXCL13" e "um animal em necessidade de tratamento" inclui sujeitos, tais como indivíduos mamíferos, que beneficiariam com a administração de um anticorpo anti-CXCL13 utilizado, por ex., para a detecção de um anticorpo anti-polipeptídeo de CXCL13 (por ex., para um procedimento de diagnóstico) e/ou do tratamento ou seja, alívio ou prevenção de uma doença, com um anticorpo anti-CXCL13. Como aqui descrito em mais detalhe, um anticorpo anti-CXCL13 pode ser usado na forma não conjugada ou pode ser conjugado, por ex., de um fármaco, pró-fármaco, ou um isotipo./0}

II. Descrição Destino Polipeptídeo

[0120] Como aqui usado, os termos "CXCL13" e "polipeptídeo CXCL13" são utilizados de forma alternada.Em certas configurações, a CXCL13 pode incluir uma CXCL13 de tamanho completo ou um de seu fragmento, ou uma CXCL13 variante de polipeptídeo em que o fragmento de CXCL13 ou de CXCL13 variante de polipeptídeo retém algumas ou todas as propriedades funcionais dos CXCL13 de tamanho normal. As sequências de polipeptídeos humanos CXCL13 e polinucleotídeo (SEQ ID NOs: 19 e 20, respectivamente) têm sido descritos, ver, por ex., Legler, et. al., J. Exp. Med. 187(4):655-660 (1998). As sequências CXCL13 polipeptídicas e polinucleotídicas de ratos (SEQ ID NOs: 21 e 22, respectivamente) têm sido descritas,, ver, por ex., Gunn, et. al., Nature 391(6669):799-803 (1998). Além disso, a sequência polipeptídica de CXCL13 do macaco cynomolgus tem sido descrita como se mostra na SEQ ID NO: 23.

III. Os anticorpos anti-CXCL13

[0121] Anticorpos comerciais que se ligam à CXCL13 foram divulgados na técnica, por ex., de rato anti-rato MAb 470 (R & D Systems) e de rato anti-humano MAb 801 (Sistemas R & D). Além disso, de anticorpos anti-CXCL13 de murinos estão divulgados na Publicação do Pedido de Patente EUA No. 2008 0227704 A1.

[0122] Os anticorpos da invenção compreendem anticorpos anti-CXCL13 ou de ligação ao antígeno, fragmentos de ligação, variantes ou seus derivados, que se ligam a CXCL13, por ex., MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2, ou 3C9. Em certas formas de configuração, os anticorpos anti-CXCL13 se ligam a CXCL13 de humano, primata, murino ou humano e murino.Em certas formas de configuração, os anticorpos anti-CXCL13 da invenção são humanizados. Noutras formas de configuração, os anticorpos anti-CXCL13 bloqueiam a ligação CXCL13 ao seu receptor,por ex., CXCR5. Em certas formas de realização, os anticorpos anti-CXCL13 da invenção são MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2, 3C9, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou seus derivados.

[0123] Em uma forma de configuração, a presente invenção proporciona uma molécula de ligação isolada,por ex., um anticorpo ou fragmentos de ligação ao antígeno, as variantes e os seus derivados, que se ligam especificamente ao mesmo epítopo CXCL13 como um anticorpo de referência, por ex. , MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2, oi 3C9. Em outra forma de realização, a presente invenção proporciona uma molécula isolada de ligação, por exemplo, um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao antigénio, que se liga especificamente a CXCL13, e inibe competitivamente a um anticorpo de referência, por exemplo, MAb 5261, 5378 MAb, MAb 5080, MAb 1476, 3D2, 3C9 ou, de se ligar especificamente a CXCL13, por exemplo, humanos, primatas CXCL13, murino ou humano e murino.

[0124] Em certas configurações, a molécula de ligação da presente invenção tem uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94% ou cerca de 95% de identidade de sequência de uma sequência de aminoácidos para a molécula de anticorpo anti- CXCL13 de referência. Numa configuração adicional,,as partes da molécula de ligação de pelo menos cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou 100% de identidade de sequência de um anticorpo de referência. Em certas configurações, o anticorpo de referência é MAb 5261,MAb 5378 , MAb 5080, MAb 1476, 3D2, ou 3C9.

[0125] Numa outra forma de configuração, a presente invenção proporciona um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, consistindo essencialmente em, ou consistindo de um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (domínio VH), onde pelo menos uma das CDRs do domínio VH tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou idêntica a CDR1, CDR2 ou CDR3 da SEQ ID NO: 3 ou 13.

[0126] Numa outra forma de configuração, esta invenção proporciona um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, consistindo essencialmente em, ou consistindo de um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (domínio VH), onde pelo menos uma das CDRs do domínio VH tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou idêntica à SEQ ID NO: 4, 5, ou 6.

[0127] Numa outra forma de configuração, esta invenção proporciona um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, consistindo essencialmente em, ou consistindo de um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (domínio VH), em que o domínio VH tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou idêntica à SEQ ID NO: 3 ou 13.

[0128] Numa outra forma de configuração, esta invenção proporciona umanticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, consistindo essencialmente em, ou consistindo de um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (domínio VH), onde pelo menos uma das CDRs do domínio VH tem uma sequência de aminoácidos idêntica, exceto para 1, 2, 3, 4, ou 5 substituições conservativas de aminoácidos, aCDR1, CDR2 ou CDR3 da SEQ ID NO: 3 ou 13.

[0129] Numa outra configuração, esta invenção proporciona um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, onsistindo essencialmente em, ou consistindo de um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (domínio VH), onde pelo menos uma das CDRs do domínio VH tem uma sequência de aminoácidos idêntica, exceto para 1, 2, 3, 4, ou 5 substituições conservativas de aminoácidos a SEQ ID NO: 4, 5, ou 6.

[0130] Numa outra forma de configuração, esta invenção proporciona um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, consistindo essencialmente em, ou que consiste de um domínio VH que possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90% , cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 3 ou 13, em que um anticorpo anti- CXCL13 que compreende o domínio VH codificado especificamente ou preferencialmente se liga a CXCL13.

[0131] Numa outra forma de configuração, a presente invenção proporciona um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, consistindo essencialmente em, ou consistindo de uma imunoglobulina de domínio variável de cadeia leve (domínio VL), onde pelo menos uma das CDRs do domínio VL tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou idêntica a CDR1, CDR2 ou CDR3 da SEQ ID NO: 8, 15, ou 17.

[0132] Numa outra forma de configuração, a presente invenção fornece um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, consistindo essencialmente em, ou consistindo de uma imunoglobulina de domínio variável de cadeia leve (domínio VL), onde pelo menos uma das CDRs do domínio VL tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou idêntica à SEQ ID NO: 9, 16, 10, ou 11.

[0133] Numa outra forma de configuração, a presente invenção proporciona um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, consistindo essencialmente em, ou consistindo de uma imunoglobulina de domínio variável de cadeia leve (domínimo VL), em que o domínio VL tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou idêntica à SEQ ID NO: 8, 15, ou 17.

[0134] Numa outra forma de configuração, a presente invenção proporciona um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, consistindo essencialmente em, ou consistindo de uma imunoglobulina de domínio variável de cadeia leve (domínio VL), onde pelo menos uma das CDRs do domínio VL tem uma sequência de aminoácidos idêntica, exceto para 1, 2, 3, 4, ou 5 substituições conservativas de aminoácidos, a CDR1, CDR2 or CDR3 of SEQ ID NO: 8, 15, ou 17.

[0135] Em outra forma de configuração, a presente invenção proporciona um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, consistindo de uma imunoglobulina de domínio variável de cadeia leve (domínio VL), onde pelo menos uma das CDRs do domínio VL tem uma sequência de aminoácidos idêntica, exceto para 1, 2, 3, 4, ou 5 substituições conservativas de aminoácidos, a SEQ ID NO: 9, 16, 10, ou 11.

[0136] Numa outra configuração, o presente invento inclui um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, consistindo essencialmente em, ou consistindo de um domínio VL que possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90 %, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 8, 15 , ou 17, em que um anticorpo anti-CXCL13 que compreende o domínio VL codificado especificamente ou preferencialmente se liga a CXCL13.

[0137] As variantes biologicamente ativas adequadas dos anticorpos anti-CXCL13 da presente invenção podem ser utilizadas nos métodos da presente invenção.Tais variantes irão manter as propriedades de ligação desejadas em parentes do anticorpo anti-CXCL13. Métodos para fazer variantes de anticorpos estão geralmente disponíveis na arte.

[0138] Os métodos para a mutagênese e alterações de sequências nucleotídicas são bem conhecidos na arte.Ver, por exemplo, Walker e Gaastra, eds.(1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publis hing Company, New York);. Kunkel, Proc Natl.Acad. Sci. EUA 82 :488-492 (1985); Kunkel et ai, Methods Enzymol..154 :367-382 (1987); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, NY); Patente dos EUA. No. 4.873.192, e as referências citadas; aqui incorporadas por referência. Orientação quanto a substituições de aminoácidos adequados que não afetam a atividade biológica do polipeptídeo de interesse pode ser encontrada no modelo de Dayhoff et al. (1978) no Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), pp. 345-352, aqui incorporado por referência na sua totalidade. O modelo de Dayhoff et al. usa a Mutação Pontual Aceita (PAM) da matriz de similaridade de aminoácido (PAM 250 de matriz) para determinar as substituições de aminoácidos conservativos adequadas. As substituições conservativas, tais como a troca de um aminoácido por outro com propriedades semelhantes, podem ser preferidas.Exemplos de substituições conservativas de aminoácidos, como ensinado pela PAM 250 da matriz do modelo Dayhoff et al. ncluem, mas não estão limitados a, GlyθAla, ValθlleθLeu, AspθGlu, LysθArg, AsnθGln, and PheθTrpθTyr.

[0139] Na construção de variantes da molécula de ligação anti-CXCL13, por ex., um anticorpo ou um de seu fragmento de ligação ao antígeno, os polipeptídeos de interesse, as modificações são feitas de tal modo que as variantes continuem a possuir as propriedades desejadas, por ex., sendo capaz de se ligar especificamente a um CXCL13,por ex.,CXCL13 de humano, primata, murino ou ambos humano e murino.. Obviamente, quaisquer mutações efetuadas no DNA que codifica o polipeptídeo da variante não podem colocar a sequência fora do quadro de leitura e de preferência não criarão regiões complementares que possam produzir estrutura de mRNA secundária. Ver, por ex., EP Pat. No. EP0075444 B1.

[0140] Os métodos para medir a molécula de ligação anti- CXCL13, por ex., um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da mesma, incluem a especificidade de ligação, mas não estão limitados a padrão de ensaios de ligação competitiva, ensaios para a secreção de imunoglobulina de controle pelas células T ou células B, ensaios de proliferação de células T, ensaios de apoptose, ensaios de ELISA, e outros semelhantes.Ver, por exemplo, tais ensaios descritos em WO 93/14125; Shi et al., Immunity 13:633-642 (2000); Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175-1181 (2002); Watanabe et al., J Immunol 167:4321-4328 (2001); Wang et al., Blood 97:3498-3504 (2001); e Giraudon et al., J Immunol 172(2):1246-1255 (2004), todos os quais são aqui incorporados por referência.

[0141] Quando aqui discutido se qualquer polipeptídeo em particular, incluindo as regiões constantes, CDRs, domínios VH, ou domínios VL aqui divulgados, é de pelo menos cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90% , cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou mesmo cerca de 100% de identidade com outro polipeptídeo, a % de identidade pode ser determinada utilizando os métodos e programas de computador/software conhecidos na arte, tais como, mas não limitados a, o programa BESTFIT (Wisconsin Pacote de Análise de Sequência, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Ciência Drive, Madison, Wis 53711).BESTFIT utiliza o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Matemática. 2:482-489, para encontrar o melhor segmento de homologia entre duas sequências. Ao usar BESTFIT ou qualquer outro programa de alinhamento de sequência para determinar se uma sequência particular é, por exemplo, 95% idêntica a uma sequência de referência de acordo com a presente invenção, os parâmetros são ajustados, naturalmente, de tal modo que a porcentagem de identidade é calculada sobre o comprimento total da sequência polipeptídica de referência e que as falhas na homologia até 5% do número total de aminoácidos na sequência de referência são permitidas.

[0142] Para os fins da presente invenção, a porcentagem de identidade de sequência pode ser determinada usando o algoritmo de busca de homologia Smith-Waterman utilizando uma pesquisa de intervalo afim com uma penalidade de intervalo aberto de 12 e uma penalidade de extensão de intervalo de 2, matriz BLOSUM de 62.O algoritmo de busca de homologia SmithWaterman é ensinado em Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489. Uma variante pode, por exemplo, diferir da referência de anticorpo anti-CXCL13 (por ex., MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2, ou 3C9) por tão pouco como 1 a 15 resíduos de aminoácidos, apenas 1 de 10 resíduos de aminoácidos, tais como 6-10, como poucos como 5, poucos como 4, 3, 2, ou até mesmo um resíduo de aminoácido.

[0143] A estrutura química exata de um polipeptídeo capaz de se ligar especificamente à CXCL13 e reter a desejada atividade de bloqueio CXCL13 depende de uma série de fatores.Como grupos amino e carboxilo ionizáveis estão presentes na molécula, um polipeptídeo particular pode ser obtido como um sal ácido ou básico, ou na forma neutra. Todas estas preparações que conservam a sua atividade biológica quando colocadas em condições ambientais adequadas estão incluídas na definição de anticorpos anti-CXCL13 como aqui utilizado. Além disso, a sequência primária de aminoácidos do polipeptídeo pode ser aumentada por derivação utilizando partes de açúcar (glicosilação) ou por outras moléculas suplementares tais como lípidos, fosfato, grupos acetilo e semelhantes. Ela também pode ser aumentada por conjugação com sacarídeos. Certos aspectos de tal aumento são realizados por meio de sistemas de processamento pós-tradução do hospedeiro produtor; outras modificações podem ser introduzidas in vitro. Em qualquer dos casos, essas modificações são incluídas na definição de um anticorpo anti-CXCL13 aqui utilizado, desde que as propriedades desejadas para o anticorpo anti-CXCL13 não sejam destruídas. Espera-se que essas modificações possam afetar quantitativamente ou qualitativamente a atividade, quer aumentando ou diminuindo a atividade do polipeptídeo, nos vários ensaios. Além disso, os resíduos de aminoácidos individuais na cadeia podem ser modificados por oxidação, redução, ou derivatização outro, e o polipeptídeo pode ser clivado para se obter fragmentos que retêm a atividade. ais alterações que não destroem as propriedades pretendidas (por ex., especificidade de ligação para CXCL13, afinidade de ligação e/ou atividade de bloqueio CXCL13) não removem a sequência polipeptídica da definição de anticorpos anti-CXCL13 de interesse como aqui utilizado.

[0144] A arte proporciona orientação substancial em relação à preparação e uso de variantes de polipeptídeos.Na preparação da molécula de ligação anti-CXCL13 , um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno variantes, um perito na arte pode facilmente determinar quais modificações na sequência da proteína nativa de nucleotídeos ou aminoácidos irão resultar numa variante que é adequada para o uso como um componente terapeuticamente ativo de uma composição farmacêutica utilizada nos métodos da presente invenção.

[0145] A região constante de um anticorpo anti-CXCL13 pode ser mutada para alterar a função efetora de uma série de maneiras.Por exemplo, ver Patente dos EUA. No. 6737056 B1 e o Pedido de Patente EUA No. de publicação 2004/0132101A1, que divulga as mutações Fc do anticorpo que otimize a ligação a receptores de Fc.

[0146] Em certos anticorpos anti-CXCL13, a parte Fc pode ser mutada para reduzir a função efetora, utilizando técnicas conhecidas na arte.Por exemplo, a deleção ou inativação (através de mutações pontuais ou de outros meios) de um domínio de região constante podem reduzir a ligação ao receptor Fc do anticorpo circulante modificado aumentando assim a localização do tumor. Em outros casos, pode ser que as alterações constantes da região consistentes com a presente invenção moderem a ligação complementar e, assim, reduzam a semi-vida no soro e associação não específica de uma citotoxina conjugada. No entanto, outras modificações da região constante podem ser usadas para modificar ligações de dissulfureto ou frações de oligossacáridos que permitem a localização de reforço devido ao aumento da especificidade do antígeno ou à flexibilidade do anticorpo. O perfil resultante fisiológico, biodisponibilidade e outros efeitos bioquímicos das modificações, tais como a localização do tumor, biodistribuição e semi-vida do soro, podem ser facilmente medidos e quantificados utilizando técnicas imunológicas bem conhecidas sem experimentação indevida.

[0147] Os anticorpos anti-CXCL13 da presente invenção também incluem os derivados que são modificados, por ex., por ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo, tal que a ligação covalente não impeça o anticorpo de se ligar especificamente ao seu epítopo cognato. Por exemplo, mas não a título de limitação, os derivados de anticorpos incluem os anticorpos que foram modificados,por ex., por glicosilação, acetilação pegilação, fosforilação, amidação de derivatização por grupos protetores/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligando celular ou outra proteína, etc. Qualquer uma das numerosas modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, mas não se limitando a clivagem química específica, acetilação, formilação, etc Além disso, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não-clássicos.

[0148] Uma "substituição de aminoácidos conservativa" é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido de cadeia lateral com uma carga semelhante.As famílias de resíduos de aminoácidos possuindo cadeias laterais com cargas semelhantes foram definidas na arte. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por ex., lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por ex., ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por ex.(, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina , cisteína), cadeias laterais não polares (por ex., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por ex., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Alternativamente, as mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte da sequência de codificação, tal como por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser rastreados para a atividade biológica a fim de identificar mutantes que retêm a atividade (por ex.,especificidade de ligação para CXCL13, ligação de afinidade e/ou atividade bloqueada de CXCL13).

[0149] Por exemplo, é possível introduzir mutações apenas em regiões de estrutura ou apenas em regiões CDR de uma molécula de anticorpo.Mutações introduzidas podem ser mutações missense silenciosas ou neutras,, não têm, ou o efeito é pouco sobre a capacidade de um anticorpo para se ligar ao antígeno. Estes tipos de mutações podem ser úteis para otimizar a utilização de códons, ou melhorar a produção de um hibridoma de anticorpo. Alternativamente, as mutações não-neutras missense podem alterar a capacidade do anticorpo para se ligar ao antígeno. A localização das mutações missense mais silenciosas e neutras provavelmente se dá nas regiões de estrutura, enquanto que a localização da maioria das mutações missense não-neutras é suscetível de ser em CDR, embora isso não seja um requisito absoluto. Um perito na arte seria capaz de conceber e testar as moléculas mutantes com as propriedades desejadas, tais como a não-alteração na atividade de ligação do antígeno ou de alteração da atividade de ligação (por ex., a melhoria da atividade de ligação do antígeno ou alteração na especificidade do anticorpo).Seguindo a mutagênese, a proteína codificada pode ser rotineiramente expressa e a atividade funcional e/ou biológica da proteína codificada (por ex., a capacidade de ligar imunoespecificamente pelo menos um epítopo de um polipeptídeo CXCL13) pode ser determinada utilizando as técnicas aqui descritas, ou por rotina modificação de técnicas conhecidas na arte.

[0150] Em certas formas de configuração, os anticorpos anti-CXCL13 da presente invenção compreendem pelo menos uma região determinante de complementaridade otimizada (CDR).Por " CDR otimizada" entende-se que a CDR foi modificada e as sequências selecionadas otimizadas com base na afinidade de ligação sustentada ou melhorada e/ou atividade anti-CXCL13 que é transmitida a um anticorpo anti-CXCL13 compreendendo a CDR aperfeiçoada. "Atividade anti-CXCL13" ou "atividade de bloqueio CXCL13" pode incluir atividade que modula uma ou mais das seguintes atividades associadas com CXCL13: bloqueio da interação de CXCL13 com o seu receptor, resultando em interferência com células B e B-auxiliares foliculares de migração de células T em tecidos inflamados e formação de centro germinativo (por exemplo, no caso de doenças auto- imunes), inibição da proliferação de células cancerosas e capacidade de se espalhar em perturbações oncológicas ou qualquer outra atividade de associação com células CXCL13 expressivas.A atividade anti-CXCL13 também pode ser atribuída a uma diminuição na incidência ou gravidade de doenças associadas com a expressão de CXCL13, incluindo, mas não limitado a, certos tipos de doenças auto-imunes (por ex., a esclerose múltipla, a artrite (por ex., artrite reumatóide), gastrite crônica , linfomas gástricos, rejeição de transplante, síndrome de Sjogren (SS), lúpus eritematoso sistêmico (SLE), crioglobulinemia mista ativa (MC), vasculite na infecção do vírus da hepatite C, dermatomiosite juvenil, e miastenia gravis) e certos tipos de câncer (por exemplo, linfoma de Burkitt, Linfoma Não Hodgkin, infoma MALT (por ex., linfoma MALT gástrico), carcinoma (por ex., do cólon, estômago, próstata, mama, esôfago, e pâncreas), e leucemia linfocítica crônica (CLL)), bem como outras doenças inflamatórias, tais como a doenças inflamatórias de infecção induzida por Helicobacter, por ex., gastrites, úlceras gástricas, e lesões da mucosa.

IV. Polinucleotídeos que codificam anticorpos anti-CXCL13

[0151] A presente invenção também proporciona moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos anti-CXCL13 do presente invento, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou seus derivados.

[0152] Numa configuração, o presente invento proporciona um polinucleotídeo isolado, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina de domínio variável de cadeia pesada (domínio VH), onde pelo menos uma das CDRs do domínio VH tem uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou idêntica a uma sequência de polinucleotídeos selecionados de CDR1, CDR2 ou CDR3 de SEQ ID NO: 2 ou 12.

[0153] Noutras formas de configuração, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo isolado, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina de domínio VH, em que pelo menos uma das CDRs do domínio VH é selecionada a partir do grupo consistindo de: (a) uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 4, (b) uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 5, e (c) uma CDR3 que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 6.

[0154] Numa outra forma de configuração, a presente invenção inclui um polinucleotídeo isolado, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica um domínio VH, o qual possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou 100% de idêntica a uma sequência de referência de domínio VH polipeptídica compreendendo SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 13, em que um anticorpo anti-CXCL13 que compreende o domínio VH codificado especificamente ou preferencialmente se liga à CXCL13.

[0155] Numa outra forma de configuração, a presente invenção inclui um polinucleotídeo isolado, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica um domínio VH, em que a sequência de polinucleotídeo é de pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91 %, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou 100% idêntica a uma sequência que compreende a SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 12, em que um anticorpo anti-CXCL13 que compreende o domínio VH codificado especificamente ou preferencialmente se liga à CXCL13.

[0156] Numa configuração, o presente invento proporciona um polinucleotídeo isolado, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina de cadeia leve do domínio variável (domínio VL), onde pelo menos uma das CDRs do domínio VL tem uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou idêntica a uma sequência de polinucleotídeos de CDR1, CDR2 ou CDR3 da SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 15, ou SEQ ID NO: 17.

[0157] Noutras formas de configuração, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo isolado, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina de domínio VL, em que pelo menos uma das CDRs do domínio VL é selecionada a partir do grupo consistindo de: (a) uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 9 ou 16, (b) uma CDR2 que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 10, e (c) uma CDR3 que compreende o conjunto de sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 11.

[0158] Numa outra forma de configuração, a presente invenção inclui um polinucleotídeo isolado, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica um domínio VL que possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou 100% de identidade com uma sequência de referência de domínio VL polipeptídico compreendendo SEQ ID NO: 8, 15, ou 17, em que um anticorpo anti-CXCL13 que compreende o domínio VL codificado especificamente ou preferencialmente se liga à CXCL13.

[0159] Numa outra forma de configuração, a presente invenção inclui um polinucleotídeo isolado, consistindo essencialmente em, ou consistindo em um ácido nucleico que codifica um domínio VL, em que a sequência de polinucleotídeo é de pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91 %, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou 100% idêntica a uma sequência que compreende a SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14, ou SEQ ID NO: 18, em que um anticorpo anti-CXCL13 que compreende o domínio VL codificado especificamente ou preferencialmente se liga à CXCL13.

[0160] Qualquer um dos polinucleotídeos acima descritos podem ainda incluir outros ácidos nucleicos, que codificam, por exemplo, um peptídeo sinal para dirigir a secreção dos polipeptídeos codificados, as regiões constantes do anticorpo como aqui descrito, ou de outros polipeptídeos heterólogos como aqui descrito. Além disso, tal como descrito em maior detalhe em outras partes deste documento, a presente invenção inclui composições que compreendem um ou mais dos polinucleotídeos acima descritos.

[0161] Numa forma de configuração, a presente invenção inclui composições que compreendem um primeiro polinucleotídeo e um segundo polinucleotídeo em que o referido primeiro polinucleótido codifica um domínio de VH, tal como aqui descrito, e em que o referido segundo polinucleotídeo codifica um domínio VL, como aqui descrito.Especificamente uma composição que compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um polinucleotídeo de domínio VH de codificação, tal como estabelecido na SEQ ID NO: 2 ou 12, e um polinucleotídeo que codifica domínio VL, por exemplo, um polinucleotídeo que codifica o domínio VL como apresentada na SEQ ID NO: 7, 14, ou 18.

[0162] A presente invenção também inclui fragmentos de polinucleotídeos da mesma, como descrito em outro lugar.Polinucleotídeos adicionais que codificam a fusão poli- polipeptídeos, fragmentos Fab, e outros derivados, como aqui descritos, são também contemplados pelo invento.

[0163] Os polinucleotídeos podem ser produzidos ou fabricados por qualquer método conhecido na arte.Por exemplo, se a sequência de nucleotídeos do anticorpo é conhecida, um polinucleotídeo que codifica o anticorpo pode ser montado a partir de oligonucleotídeos sintetizados quimicamente (por ex., como descrito em Kutmeier et al, Bio Techniques 17:. 242 (1994)),que, em resumo, envolve a síntese de oligonucleotídeos contendo porções sobrepostas da sequência que codifica o anticorpo, hibridação e ligação destes oligonucleotídeos e, em seguida, a amplificação dos oligonucleotídeos ligados por PCR.

[0164] Alternativamente, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo anti-CXCL13, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou seu derivado do invento, pode ser gerado a partir do ácido nucleico de uma fonte adequada.Se um clone contendo um ácido nucleico que codifica um anticorpo particular, não está disponível, mas a sequência da molécula de anticorpo for conhecida, um ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser quimicamente sintetizado ou obtido a partir de uma fonte adequada (por ex., uma biblioteca de anticorpos cDNA, ou uma biblioteca gerada a partir de cDNA, ou de ácidos nucleicos, de preferência poli A+RNA isolados a partir de qualquer tecido ou células que expressam o anticorpo ou outro anticorpo anti- CXCL13, tais como as células de hibridoma selecionadas para expressar um anticorpo) por amplificação por PCR utilizando iniciadores sintéticos hibridizáveis para a extremidade 3 'e 5' extremidades da sequência ou por clonagem utilizando uma sonda oligonucleotídica específica para a sequência de gene particular para identificar, por exemplo, um clone de cDNA a partir de uma biblioteca de cDNA que codifica o anticorpo ou outro anticorpo anti-CXCL13. Os ácidos nucleicos amplificados gerados por PCR podem ser então clonados em vetores de clonagem replicáveis utilizando qualquer método bem conhecido na técnica.

[0165] Uma vez que a sequência de nucleotídeos e correspondente sequência de aminoácidos do anticorpo anti- CXCL13, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado do mesmo é determinado, a sua sequência de nucleotídeos pode ser manipulada usando processos bem conhecidos na arte para a manipulação de sequências de nucleotídeos, por exemplo,, écnicas de DNA recombinante, mutagênese dirigida ao local, PCR, etc. (ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al. (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2 a ed.; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) e Ausubel et al, eds.. (1998) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY), que são ambos aqui incorporados por referência na sua totalidade), para gerar anticorpos com uma sequência de aminoácido diferente, por exemplo para a criação de substituições de aminoácidos, exclusões , e/ou inserções.

[0166] Um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação anti-CXCL13, por exemplo um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, a variante, ou um seu derivado, pode ser composto de qualquer poliribonucleotídeo ou polidesoxirribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não- modificados ou RNA ou DNA modificados.Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica o anticorpo anti-CXCL13, ou fragmento de ligação ao antígeno, a variante, ou seu derivado pode ser composta de DNA de cadeia simples e de cadeia dupla, DNA que é uma mistura de regiões de cadeias simples e duplas, um único e RNA de cadeia dupla, e RNA que é uma mistura de regiões de uma e de cadeia dupla, moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA que podem ser de cadeia simples ou, mais tipicamente, de cadeia dupla ou uma mistura de mono-e de cadeia dupla regiões. Além disso, um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação anti-CXCL13, por ex., um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado do mesmo pode ser composto de regiões de cadeia tripla compreendendo RNA ou DNA ou RNA e DNA.Um polinucleotídeo que codifica uma molécula de de ligação anti- CXCL13, por ex., anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou seu derivado, podem também conter uma ou mais bases modificadas ou backbones de DNA ou RNA modificadas para a estabilidade ou por outras razões. Brases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tritiladas e bases invulgares tais como inosina. Uma variedade de modificações pode ser feita ao DNA e RNA, assim, um "polinucleotídeo" abrange formas modificadas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente.

[0167] Um polinucleotídeo isolado que codifica uma variante não natural de um polipeptídeo derivado de uma imunoglobulina (por ex., uma porção da cadeia pesada ou uma porção da cadeia leve de imunoglobulina), pode ser criado pela introdução de uma ou mais substituições de nucleotídeos, adições ou deleções dentro da sequência de nucleotídeos de imunoglobulina de tal forma que uma ou mais substituições de aminoácidos, adições ou deleções são introduzidas na proteína codificada. As mutações podem ser introduzidas por meio de técnicas padrão, tais como a mutagênese dirigida e mutagênese mediada por PCR. De preferência, as substituições conservativas de aminoácidos são feitas em um ou mais resíduos não-essenciais de aminoácidos.

V. Proteínas de Fusão e os Conjugados de Anticorpos

[0168] Como discutido em maior detalhe noutras partes deste documento, moléculas de ligação anti-CXCL13, por ex., nticorpos da presente invenção, ou de ligação ao antígeno, fragmentos, variantes ou seus derivados, podem ainda ser recombinantemente fundidos a um polipeptídeo heterólogo no Nou C-terminal ou quimicamente conjugados (incluindo conjugações covalentes e não covalentes) com polipeptídeos ou outras composições. Por exemplo,os anticorpos anti-CXCL13 podem ser recombinantemente fundidos ou conjugados com moléculas úteis como marcadores em ensaios de detecção e de moléculas efetoras, tais como polipeptídeos heterólogos, fármacos, radionuclídos ou toxinas.Ver, por exemplo, as publicações PCT WO 92/08495, WO 91/14438, WO 89/12624; EUA Pat. Não. 5.314.995 e EP 396387.

[0169] Anticorpos anti-CXCL13 do presente invento, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou seus derivados, podem incluir os derivados que são modificados, ou seja, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo, tal que a ligação covalente não impeça a ligação do anticorpo anti-CXCL13. Por exemplo, mas não a título de limitação, os derivados de anticorpos incluem os anticorpos que foram modificados,, por glicosilação, acetilação peguilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos protetores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligando celular ou outra proteína, etc.Qualquer uma das numerosas modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, mas não se limitando a, clivagem química específica, acetilação, formilação, etc. Além disso, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não- clássicos.

[0170] A molécula de ligação anti-CXCL13, por ex., anticorpos da presente invenção, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou seus derivados, podem ser compostas por aminoácidos ligados uns aos outros por ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas, isósteros peptídicos, e podem conter aminoácidos diferentes dos 20 genes codificados de aminoácidos. Por exemplo, anticorpos anti-CXCL13 podem ser modificados por processos naturais, tais como processamento pós-tradução, ou por técnicas de modificação química que são bem conhecidas na arte.Tais modificações estão bem descritas em textos de base e em monografias mais pormenorizadas, bem como numa volumosa literatura de investigação. As modificações podem ocorrer em qualquer parte da molécula de ligação anti- CXCL13, incluindo o esqueleto peptídico, as cadeias laterais de aminoácido e os terminais amino ou carboxilo, ou em porções, tais como hidratos de carbono. Será apreciado que o mesmo tipo de modificação possa estar presente em graus iguais ou variáveis em vários locais numa determinada molécula de ligação anti-CXCL13. Além disso, uma dada molécula de ligação anti-CXCL13 pode conter muitos tipos de modificações. Moléculas de ligação anti-CXCL13 podem ser ramificadas, por exemplo, como resultado de ubiquitinação, e podem ser cíclicas, com ou sem ramificação. Moléculas de ligação anti- CXCL13 cíclica, ramificada e ramificada ciclicamente podem resultar de processos naturais pós-tradução ou podem ser produzidas por métodos de síntese. As modificações incluem acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma porção heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou de um derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lípido ou de um derivado lipídico, ligação covalente de phosphatidylinositol, crosslinking , ciclização, formação de ligações dissulfureto, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora GPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, peguilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, incorporação de selênio em selenoproteínas, sulfatação, RNA de transferência mediado por adição de aminoácidos a proteínas, tais como arginilação, e ubiquitinação. (Ver, por ex., Proteins--Structure and Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, NY; 2nd ed. (1993); Johnson, ed. (1983) Posttranslational Covalent Modification of Proteins (Academic Press, NY), pgs. 1-12; Seifter et al, Meth..Enzymol. 182 :626- 646 (1990); Rattan et ai, Ann.. NY Acad.Sci. 663 :48-62 (1992)).

[0171] A presente invenção também proporciona a proteínas de fusão compreendendo um anticorpo anti-CXCL13, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado deste, e um polipeptídeo heterólogo.O polipeptídeo heterólogo para o qual o anticorpo é fundido pode ser útil para a função ou é útil para alvejar as células de expressão polipeptídicas anti- CXCL13.

[0172] Numa configuração, uma proteína de fusão da presente invenção compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em, um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de qualquer um ou mais dos domínios de VH de um anticorpo da invenção, ou a sequência de aminoácidos de qualquer um ou mais dos domínios VL de um anticorpo da presente invenção ou fragmentos ou variantes dos mesmos, e uma sequência de polipeptídeo heterólogo.

[0173] Numa outra forma de configuração, uma proteína de fusão para utilização nos métodos de diagnóstico e de tratamento aqui descritos compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de qualquer um, dois, três das CDRs do domínio VH de um anticorpo anti-CXCL13, ou fragmentos, variantes, ou seus derivados, e/ou a sequência de aminoácidos de qualquer um, dois, três das CDRs do domínio VL de um anticorpo anti-CXCL13, ou fragmentos, variantes, ou seus derivados, e uma sequência de polipeptídeo heterólogo.Numa configuração, uma proteína de fusão compreende um polipeptídeo possuindo a sequência de aminoácidos de pelo menos um domínio VH de um anticorpo anti- CXCL13 da invenção e a sequência de aminoácidos de pelo menos um domínio VL de um anticorpo anti-CXCL13 da invenção ou fragmentos, derivados ou variantes dos mesmos, e uma sequência de polipeptídeo heterólogo. De preferência, os domínios VH e VL da proteína de fusão correspondem a uma única fonte de anticorpo (ou fragmento scFv ou Fab) que se liga especificamente a pelo menos um epítopo de CXCL13. Em ainda outra configuração, a proteína de fusão para utilização nos métodos de diagnóstico e de tratamento aqui descritos compreende um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de qualquer um, dois, três ou mais das CDR do domínio VH de um anticorpo anti-CXCL13 e a sequência de aminoácidos de qualquer um, dois, três ou mais das CDR do domínio VL de um anticorpo anti-CXCL13, ou fragmentos ou variantes dos mesmos, e uma sequência de polipeptídeo heterólogo. De preferência, duas, três, quatro, cinco, seis, ou mais das CDR(s) do domínio VH ou VL domínio correspondem à fonte do anticorpo única (ou fragmento scFv ou Fab) da presente invenção. As moléculas de ácido nucleico que codificam estas proteínas de fusão são também englobadas pelo presente invento.

[0174] Exemplos de proteínas de fusão descritas na literatura incluem fusões do receptor de células T (Gascoigne et al., Proc. Natl.Acad. Sci. EUA 84 :2936-2940 (1987)); CD4 (Capon et ai, Nature 337 :525-531 (1989.); Traunecker et al, Nature 339 :68-70 (1989),. Zettmeissl et al, Cell DNA. Biol.USA 9:347-353 (1990); and Byrn et al., Nature 344:667- 670(1990)); L-selectina (receptor de alojamento) (Watson et al., J. Cell. Biol. 110 :2221-2229 (1990) e Watson et ai, Nature 349 :164-167 (1991)),. CD44 (Aruffo et ai, Cell 61 :1303-1313 (1990).); CD28 e B7 (Linsley et ai, J. Exp. Med. 173 :721-730 (1991)),... CTLA-4 (Lisley et ai, J. Exp. Med. 174 :561-569 (1991...)); CD22 (Stamenkovic et al. , Cell 66 :1133-1144 (1991)); receptor de TNF (Ashkenazi et ai, Proc Natl...Acad. Sci. EUA 88 :10535-10539 (1991); Lesslauer et al, Eur..J. Immunol. 27 :2883-2886 (1991), e Peppel et ai, J. Exp... Med. 174 :1483-1489 (1991)), e um receptor de IgE (Ridgway e Gorman, J. Cell.Biol. Vol. 115, Abstract No. 1448 (1991)).

[0175] Como aqui discutido outrora, moléculas de ligação anti-CXCL13, por ex., anticorpos da presente invenção, ou de ligação ao antígeno, fragmentos, variantes ou seus derivados, podem ser fundidos com polipeptídeos heterólogos, para aumentar a meia vida in vivo em um dos polipeptídeos ou para utilização em imunoensaios utilizando métodos conhecidos na arte. Por exemplo, numa configuração, o PEG pode ser conjugado com os anticorpos anti-CXCL13 da invenção para aumentar a sua meia-vida in vivo.Ver Leong et al, Cytokine 16: 106 (2001); Adv.. em Drug Deliv. Rev. 54:531 (2002), ou Weir et al, Biochem..Soc. Transações 30: 512 (2002).

[0176] Além disso, as moléculas de ligação anti-CXCL13 , por ex.,, anticorpos da presente invenção, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou seus derivados, podem ser fundidas a sequências de marcador, tal como um peptídeo para facilitar a sua purificação ou detecção. Em certas formas de configuração, o marcador de sequência de aminoácidos é um peptídeo hexa-histidina, tal como a etiqueta fornecida num vetor pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre outros, muitos dos quais são comercialmente disponível. Como descrito em Gentz et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989),por exemplo, hexa-histidina proporciona para conveniente purificação da proteína de fusão. Outras marcas de peptídeos úteis para a purificação incluem, mas não estão limitados a, marcação "HA", o que corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina influenza (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) e a marcação "sinalizadora".

[0177] As proteínas de fusão podem ser preparadas utilizando métodos que são bem conhecidos na arte (ver, por exemplo, Patente dos EUA. Nos 5116964 e 5225538).O local preciso em que a fusão é feita pode ser selecionado empiricamente para otimizar as características de secreção ou de ligação da proteína de fusão. O DNA que codifica a proteína de fusão é então transfectado para uma célula hospedeira para a expressão.

[0178] As moléculas de ligação anti-CXCL13, por ex., anticorpos da presente invenção, ou de ligação ao antígeno, fragmentos, variantes, ou seus derivados, podem ser utilizados na forma não conjugada ou pode ser conjugada a pelo menos uma de uma variedade de moléculas, por ex., para melhorar as propriedades terapêuticas da molécula, para facilitar a detecção do alvo, ou para a imagiologia ou a terapia do paciente. Moléculas de ligação anti-CXCL13, por ex., anticorpos da presente invenção ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou seus derivados, podem ser marcados ou conjugados, quer antes ou depois da purificação, ou quando a purificação é realizada.

[0179] Em particular, os anticorpos anti-CXCL13 do presente invento, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou seus derivados, podem ser conjugados com agentes terapêuticos, pró-drogas, peptídeos, proteínas, enzimas, vírus, lípidos, modificadores da resposta biológica, agentes farmacêuticos, ou PEG.

[0180] Os peritos na arte apreciarão que os conjugados podem também ser montados utilizando uma variedade de técnicas, dependendo do agente selecionado para ser conjugado.Conjugados com biotina são preparados, por exemplo, por reação de um polipeptídeo de ligação com um éster ativado de biotina tal como o éster de N-hidroxisuccinimida biotina. Do mesmo modo, conjugados com um marcador fluorescente podem ser preparados na presença de um agente de acoplamento, aqueles aqui listados, ou por reação com um isotiocianato, de preferência, isotiocianato de fluoresceína.Os conjugados dos anticorpos anti-CXCL13 da invenção, ou de fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou seus derivados, são preparados de um modo análogo.

[0181] A presente invenção abrange ainda moléculas de ligação anti-CXCL13, por ex., anticorpos da presente invenção, ou de ligação ao antígeno, fragmentos, variantes ou seus derivados, conjugados com um agente de diagnóstico ou terapêutico. Os anticorpos anti-CXCL13, incluindo fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, e os seus derivados, podem ser usados para diagnóstico como, por exemplo, monitorar o desenvolvimento ou a progressão de uma doença, como parte de um procedimento de teste clínico para, por ex., determinar a eficácia de um dado tratamento e/ou prevenção de regime. Por exemplo, a detecção pode ser facilitada pelo acoplamento do anticorpo anti-CXCL13, ou fragmento de ligação ao antígeno, a variante, ou um seu derivado, a uma substância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, materiais radioativos, metais emissores de pósitrons, utilizando várias tomografias de emissão de pósitrons, e íons metálicos paramagnéticos não radioativos. Ver, por exemplo, a Patente dos EUA. No. 4.741.900 para íons metálicos, que podem ser conjugados com anticorpos para utilização como agentes de diagnóstico de acordo com a presente invenção.Exemplos de enzimas adequadas incluem horseradish peroxidase, fosfatase alcalina, β-galactosidase, ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupos prostéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina, exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, dichlorotriazinylamine fluoresceína, cloreto de dansilo ou ficoeritrina; exemplo de um material luminescente inclui luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e aequorina, e exemplos de materiais radioativos adequados incluem 125I, 131I, 111In, 90Y, ou 99Tc.

[0182] Uma molécula de ligação anti-CXCL13, por ex., um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, a variante, ou um seu derivado, pode ser conjugada com uma porção terapêutica tal como uma citotoxina, um agente terapêutico ou de um íon de metal radioativo. Uma citotoxina ou agente citotóxico, inclui qualquer agente que seja prejudicial para as células.

[0183] Uma molécula de ligação anti-CXCL13, por ex., um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, a variante, ou derivado do mesmo, pode também ser marcada de forma detectável por acoplamento a um composto quimioluminescente. A presença da molécula de ligação anti-CXCL13 quimioluminescente marcada é então determinada pela detecção da presença de luminescência que surge no decurso de uma reação química. Exemplos de compostos quimioluminescentes de rotulagem particularmente úteis são luminol, isoluminol, theromatic éster de acridinio, imidazole, sal de acridinio e éster de oxalato.

[0184] Uma das maneiras pelas quais um anticorpo anti- CXCL13, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou seu derivado, podem ser marcados de forma detectável é ligando o mesmo a uma enzima e utilizando o produto ligado num imunoensaio enzimático (EIA) (Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)" Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md.; Diagnostic Horizons 2:1-7 (1978); Voller et al., J. Clin. Pathol. 31 :507-520 (1978); Butler, Meth.Enzymol. 73 :482-523 (1981); Maggio, ed.(1980) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla.; Ishikawa et al., eds. (1981) Enzyme Immunoassay (Kgaku Shoin, Tokyo). A enzima, que é ligada ao anticorpo anti-CXCL13 irá reagir com um substrato apropriado, por exemplo, um substrato cromogênico, de forma a produzir uma porção química que pode ser detectada, por ex., por espectrofotometria, fluorimetria ou por significados visuais.As enzimas que podem ser utilizadas para etiquetar o anticorpo de forma detectável incluem, mas não estão limitados a, malato desidrogenase, nuclease de estafilococos, isomerase delta-5-esteróide, álcool desidrogenase de levedura, alfa-glicerofosfato, desidrogenase, triose fosfato isomerase, horseradish peroxidase, fosfatase alcalina, asparaginase, glucose oxidase, beta-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glucose-6-fosfato- desidrogenase, glucoamilase e acetilcolinesterase. Além disso, a detecção pode ser realizada por métodos colorimétricos que empregam um substrato cromogênico para a enzima. A detecção pode também ser conseguida por comparação visual da extensão da reação enzimática de um substrato em comparação compadrões preparados similares.

[0185] A detecção pode também ser conseguida utilizando qualquer um de uma variedade de outros imunoensaios.Por exemplo, por marcação radioativa da molécula de ligação anti- CXCL13, por ex., anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado do mesmo, é possível detectar a molécula de ligação através da utilização de um radioimunoensaio (RIA) (ver, por exemplo, Weintraub (Março, 1986), Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques (The Endocrine Society), que é incorporada por referência).O isotipo radioativo pode ser detectado por meios, incluindo, mas não limitado a, um contador gama, um contador de cintilação, ou auto-radiografia.

[0186] Uma molécula de ligação anti-CXCL13, por ex., anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou derivado do mesmo, pode também ser marcada de forma detectável utilizando metais emissores de fluorescência, tais como 152Eu, ou outros da série dos lantanídeos.Estes metais podem ser ligados à molécula de ligação utilizando grupos quelantes de metais tais como o ácido dietiltriaminopentoacético (DTPA) ou ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).

[0187] As técnicas para a conjugação de diversas frações a um anticorpo, por exemplo, um anticorpo anti-CXCL13 ou fragmento de ligação ao antígeno, variante, ou seu derivado, são bem conhecidas, ver, por exemplo, Amon et al.(1985) "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp 243-56; Hellstrom et al. (1987) "Antibodies for Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2 a ed.; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623-53); Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al., pp. 475-506; "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al., Academic Press, pp. 303-16 (1985); and Thorpe et al. , Immunol. Rev. 62 :119-58 (1982).

VI. Expressão de Anticorpos Polipeptídicos

[0188] As sequências de DNA que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo pode ser efetuada, tanto simultaneamente quanto separadamente, utilizando transcriptase reversa e polimerase de DNA de acordo com métodos bem conhecidos.A PCR pode começar por iniciadores de consenso da região constante ou por iniciadores mais específicos com base no DNA de cadeia pesada e leve publicado e nas sequências de aminoácidos. Como discutido acima, a PCR também pode ser usada para isolar clones de DNA que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo. Neste caso, as bibliotecas podem ser rastreadas por iniciadores de consenso ou sondas maiores homólogas, tais como sondas da região constante de ratos.

[0189] O DNA, tipicamente o DNA de plasmídeo, pode ser isolado das células utilizando técnicas conhecidas na arte, restrições mapeadas e sequenciadas de acordo com o padrão, técnicas bem conhecidas estabelecidas em pormenor, por ex., nas referências anteriores relacionadas com as técnicas de DNA recombinante. Naturalmente, o DNA pode ser sintético de acordo com a presente invenção em qualquer ponto durante o processo de isolamento ou análise posterior.

[0190] Após a manipulação do material genético isolado para fornecer anticorpos anti-CXCL13, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou seus derivados, da presente invenção, os polinucleotídeos que codificam os anticorpos anti-CXCL13 são tipicamente inseridos num vetor de expressão para introdução nas células hospedeiras que pode ser utilizada para produzir a quantidade desejada de anticorpo anti-CXCL13.

[0191] A expressão recombinante de um anticorpo, ou fragmento, derivado ou análogo do mesmo, por ex. , uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo que se liga a uma molécula alvo aqui descrita, por ex., CXCL13, requer a construção de um vetor de expressão contendo um ou mais polinucleotídeos que codificam o anticorpo. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica uma molécula de anticorpo ou uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, ou parte da mesma (de preferência contendo o domínio variável de cadeia pesada ou leve), de que a invenção tenha sido obtida, o vetor para a produção da molécula de anticorpo pode ser produzido por tecnologia de DNA recombinante utilizando técnicas bem conhecidas na arte. Assim, os métodos para a preparação de uma proteína expressa por um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo encontram-se descritos no presente documento. Os métodos que são bem conhecidos dos peritos na arte podem ser utilizados para construir vetores de expressão contendo sequências de codificação de anticorpo e sinais de controle transcricionais e translacionais apropriados. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e de recombinação genética in vivo. A invenção, portanto, proporciona vetores replicáveis que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de anticorpo da invenção, ou a cadeia pesada ou leve da mesma, ou um domínio variável de cadeia pesada ou leve, ligada operativamente a um promotor. Tais vetores podem incluir a sequência de nucleotídeos que codifica a região constante da molécula de anticorpo (ver, por ex., a publicação PCT WO 86/05807;. Publicação PCT WO 89/01036; e Patente dos EUA No. 5.122.464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado em tal vetor para a expressão total da cadeia pesada ou leve.

[0192] O termo "vetor" ou "vetor de expressão" é aqui utilizado para significar vetores utilizados de acordo com o presente invento como um veículo para introduzir em e expressar um gene desejado numa célula hospedeira.Como é conhecido dos peritos na arte, tais vetores podem ser facilmente selecionados a partir do grupo consistindo de plasmídeos , fagos, vírus e retrovírus. Em geral, os vetores compatívei s com a presente invenção irão compreender um marcador de seleção, locais de restrição apropriados para facilitar a clonagem do gene desejado e a capacidade de entrar e/ou replicar-se em células eucarióticas ou procarióticas.

[0193] Para os fins da presente invenção, sistemas de vetores de expressão de numerosos podem ser empregados. Por exemplo, uma classe de vetores utiliza elementos de DNA que derivam de vírus animais tais como vírus do papiloma bovino, vírus polioma, adenovírus, vírus da vacina, baculovírus, retrovírus (RSV, MMTV ou MoMLV) ou vírus SV40. Outros envolvem a utilização de sistemas policistrônicos com locais de ligação ao ribossoma internos. Além disso, as células que tenham integrado o DNA nos seus cromossomos podem ser selecionadas através da introdução de um ou mais marcadores que permitem a seleção de células hospedeiras transfectadas. O marcador pode proporcionar prototrofia a um hospedeiro auxotrófico, resistência a biocidas (por ex.,antibióticos) ou resistência a metais pesados, tais como cobre. O gene marcador selecionável pode ser diretamente ligado às sequências de DNA a serem expressas, ou introduzido na mesma célula por cotransformação. Elementos adicionais também podem ser necessários para a síntese ótima de mRNA. Estes elementos podem incluir as sequências de sinal, sinais de splice, assim como promotores da transcrição, potenciadores e sinais de terminação.

[0194] Em certas configurações os genes das regiões variáveis clonadas são inseridos num vetor de expressão, juntamente com a região constante de genes das cadeias pesada e leve (por ex., humano) sintetizados tal como discutido acima. É claro, qualquer vetor de expressão que é capaz de induzir a expressão em células eucarióticas pode ser utilizado na presente invenção. Exemplos de vetores adequados incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos pcDNA3, pHCMV / Zeo, pCR3.1, 1/His pEF, PIND / GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER- HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1 e pZeoSV2 (disponível de Invitrogen, San Diego, Califórnia), e pCI plasmídeo (disponível de Promega, Madison, Wisconsin). Em geral, o rastreamento de grandes números de células transformadas para aqueles que expressam adequadamente níveis elevados se as cadeias leves e pesadas de imunoglobulina forem a experimentação de rotina que pode ser realizada, por exemplo, por sistemas robóticos.

[0195] De modo mais geral, uma vez que o vetor ou sequência de DNA que codifica uma subunidade monomérica do anticorpo anti-CXCL13 foi preparado, o vetor de expressão pode ser introduzido numa célula hospedeira apropriada.A introdução do plasmídeo na célula hospedeira pode ser realizada por várias técnicas bem conhecidas dos peritos na arte. Estas incluem, mas não estão limitadas a, transfecção (incluindo electroforese e eletroporação), fusão de protoplastos, precipitação com fosfato de cálcio, fusão celular com DNA envolvido, microinjeção e infecção com vírus intacto. Ver, Ridgway (1988) "Mammalian Expression Vectors", em Vectors, ed. Rodriguez e Denhardt (Butterworths, Boston, Massachusetts), Capítulo 24.2, pp 470-472. Tipicamente, a introdução de plasmídeo no hospedeiro é através de eletroporação. As células hospedeiras que abrigam o construto de expressão são cultivadas sob condições adequadas para a produção das cadeias leves e cadeias pesadas, e ensaiadas para a síntese de proteínas de cadeia pesada e/ou de cadeia leve. Exemplos de técnicas de ensaio incluem enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimunoensaio (RIA), ou análise de separador de células ativado por fluorescência (FACS), imuno-histoquímica e semelhantes.

[0196] O vetor de expressão é transferido para uma célula hospedeira através de técnicas convencionais e as células transfectadas são então cultivadas através de técnicas convencionais para produzir um anticorpo para ser utilizado nos métodos aqui descritos.Assim, a presente invenção inclui células hospedeiras que contêm um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da invenção, ou de uma cadeia pesada ou leve do mesmo, ligado operativamente a um promotor heterólogo. Em formas de configuração preferidas para a expressão de anticorpos de cadeia dupla, os vetores que codificam ambas as cadeias pesada e leve podem ser co-expressos na célula hospedeira para a expressão da molécula de imunoglobulina inteira, tal como detalhado abaixo.

[0197] Conforme aqui utilizado, "células hospedeiras" referem-se a células que abrigam vetores construídos usando técnicas de DNA recombinante e que codifica pelo menos um gene heterólogo.Em descrições de processos para o isolamento de anticorpos a partir de hospedeiros recombinantes, os termos "célula" e "cultura de células" são utilizados indiferentemente para indicar a fonte de anticorpo, a menos que seja claramente indicado de outro modo. Em outras palavras, a recuperação do polipeptídeo a partir das "células" pode significar tanto a partir de células inteiras giradas para baixo quanto a partir da cultura de células contendo ambas as células do meio e em suspensão.

[0198] Uma variedade de sistemas de vetores hospedeiros de expressão podem ser utilizados para expressar as moléculas de anticorpo para utilização nos métodos aqui descritos.Tais sistemas hospedeiros de expressão representam veículos através dos quais as sequências de codificação de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências de codificação nucleotídicas apropriadas, expressar uma molécula de anticorpo do presente invento in situ. Estes incluem, mas não estão limitados a, microrganismos tais como bactérias (por ex., E. coli, B. subtilis) transformadas com DNA recombinante de bacteriófago, DNA plasmídico ou vetores de expressão cosmídeo de DNA contendo sequências de codificação de anticorpo; levedura (por ex., Saccharomyces, Pichia) transformadas com vetores de expressão de leveduras recombinantes contendo sequências de codificação de anticorpos; sistemas de células de insetos infectadas com vectores de expressão de vírus recombinantes (por ex., baculovírus) contendo sequências codificadoras de anticorpos; sistemas de células vegetais infectadas com vetores de expressão de vírus recombinantes (por ex., vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vetores de expressão plasmídicos recombinantes (por ex., plasmídeo Ti) contendo sequências de codificação de anticorpos; ou sistemas de células de mamíferos (por ex., células COS, CHO, BLK, 293, 3T3) abrigando construtos de expressão recombinante contendo promotores derivados a partir do genoma de células de mamíferos (por ex., o promotor da metalotioneína) ou a partir de vírus de mamíferos (por ex., o promotor tardio de adenovírus; promotor do vírus vaccinia 7,5 K). Em certas formas de configuração, as células bacterianas, tais como Escherichia coli, e em outras configurações, as células eucarióticas, especialmente para a expressão da molécula inteira de anticorpo recombinante, são usadas para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante. Por exemplo, células de mamífero tais como células de ovário de hamster chinês (CHO), em conjunto com um vetor tal como o principal elemento promotor do gene precoce intermediário do citomegalovirus humano é um sistema de expressão eficiente para anticorpos (Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)).

[0199] A linha de célula hospedeira utilizada para a expressão de proteínas é geralmente de origem mamífera; os peritos na arte são creditados com a capacidade para determinar preferencialmente as linhas celulares hospedeiras particulares que são mais adequadas para o produto do gene desejado a ser aí expresso.Exemplos de linhas celulares hospedeiras incluem, mas não estão limitadas a, CHO (Ovário de Hamster Chinês), DG44 e DUXB11 (linhas de ovário de Hamster Chinês, DHFR menos), HELA (carcinoma cervical humano), CVI (linha de rim de macaco), COS (um derivado da CVI com o SV40 antígeno T), VERY, BHK (rim de bebê hamster), MDCK, 293, WI38, R1610 (fibroblastos de hamster chinês) BALBC/3T3 (fibroblastos), HAK (linha de rim de hamster), SP2/O (mieloma de rato), P3.times.63-Ag3.653 (mieloma de rato), BFA-1c1BPT (células endoteliais de bovino), RAJI (linfócitos humanos) e 293 (rim humano). Linhas de células hospedeiras estão tipicamente disponíveis a partir de serviços comerciais, da American Tissue Culture Collection ou de literatura publicada.

[0200] Além disso, pode ser escolhida uma estirpe de células hospedeiras que modula a expressão das sequências inseridas ou modifique e processe o produto gênico da forma específica desejada.Tais modificações (p. ex., Glicosilação) e processamento (p. ex., Clivagem) de produtos proteicos podem ser importantes para a função da proteína.Células hospedeiras diferentes têm mecanismos característicos e específicos para o processamento pós-tradução e modificação de proteínas e produtos de genes. Linhas de células apropriadas ou sistemas hospedeiros podem ser escolhidos para assegurar a modificação correta e o processamento da proteína estranha expressa. Para este fim, as células hospedeiras eucarióticas que possuem a maquinaria celular para o processamento adequado do transcrito primário, glicosilação e fosforilação do produto do gene podem ser utilizadas.

[0201] A expressão estável é a preferida para a produção de alto rendimento de proteínas recombinantes a longo prazo. Por exemplo, linhas celulares que expressam de forma estável a molécula de anticorpo podem ser manipuladas. Em vez de utilizar vetores de expressão que contêm origens virais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com DNA controlado por elementos de controle de expressão apropriados (por ex., promotor, estimulador, sequências, terminadores da transcrição, locais de poliadenilação, etc), e um marcador selecionável. Seguindo a introdução do DNA estranho, as células manipuladas podem crescer durante 1-2 dias num meio enriquecido e depois são mudadas para um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite às células integrar estavelmente o plasmídeo nos seus cromossomos e crescer para formar focos que por sua vez podem ser clonados e expandidos em linhas celulares. Este método pode ser vantajosamente usado para engendrar linhagens de células que expressam de forma estável a molécula de anticorpo.

[0202] Um certo número de sistemas de seleção pode ser utilizado, incluindo, mas não se limitando a, vírus herpes simplex timidina cinase (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (Szybalska and Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)),e adenina fosforibosiltransferase (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) os genes podem ser empregues em células tk-, hgprt-ou aprt-, respectivamente. Além disso, a resistência antimetabólito pode ser utilizada como a base de seleção para os seguintes genes: dhfr, o que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. EUA 77: 357 (1980); O'Hare et al, Proc.. Natl.Acad. Sci. EUA 78: 1527 (1981)); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan e Berg, Proc Natl..Acad. Sci. EUA 78: 2072 (1981)); neo, que confere resistência ao aminoglicósido G-418 Clinical Pharmacy 12:488505; Wu e Wu, Biotherapy 3 :87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol.Toxicol. 32 :573-596 (1993); Mulligan, Science 260 :926-932 (1993) e Morgan e Anderson, Ann. Rev. Biochem.62:191-217 (1993); TIB TECH 11(5):155-215 (May, 1993); e higro, que confere resistência à higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984). Métodos geralmente conhecidos na arte da tecnologia de DNA recombinante que podem ser utilizados estão descritos em Ausubel et al. (1993) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY); Kriegler (1990) "Gene Transfer and Expression" in A Laboratory Manual (Stockton Press, NY); Dracopoli et al. (eds) (1994) Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons, NY) Chapters 12 and 13; Colberre-Garapin et al. (1981) J. Mol. Biol. Biol. 150:1, as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[0203] Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo podem ser aumentados através de amplificação por vetor (para uma revisão, ver Bebbington e Hentschel (1987) "The Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning" (Academic Press , NY) Vol. 3.Quando um marcador no sistema de vetor que expressa o anticorpo é amplificável, um aumento no nível do inibidor presente na cultura da célula hospedeira irá aumentar o número de cópias do gene marcador. Uma vez que a região amplificada está associada com o gene do anticorpo, a produção do anticorpo também irá aumentar (Crouse et al., Mol.Cell Biol. 3: 257 (1983)).

[0204] A produção in vitro permite o scale-up para dar grandes quantidades de polipeptídeos desejados. Técnicas para o cultivo de células de mamíferos sob condições de cultura de tecido são conhecidas na arte e incluem cultura em suspensão homogênea, por ex., num reator airlift ou num reator de agitação contínua, ou imobilizadas ou aprisionadas cultura de células, por exemplo, em fibras ocas, microcápsulas, em microesferas de agarose ou cartuchos de cerâmica.Se necessário e/ou desejado, as soluções de polipeptídeos podem ser purificadas pelos métodos de cromatografia habituais, por ex. filtração em gel, cromatografia de permuta iônica, cromatografia em DEAE-celulose ou cromatografia de (imuno- )afinidade, por ex., depois de uma biossíntese preferencial de uma região de charneira sintética polipeptídica, prioritária ou subsequente do passo de cromatografia HIC aqui descrito.

[0205] Genes que codificam anticorpos anti-CXCL13, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou seus derivados, da presente invenção podem também ser expressos em células não-mamíferas tais como insetos, bactérias ou leveduras ou células vegetais.As bactérias que facilmente ocupam os ácidos nucleicos incluem membros da família Enterobacteriaceae, tais como estirpes de Escherichia coli ou Salmonella; Bacillaceae, tais como Bacillus subtilis; Pneumococo; Streptococcus e Haemophilus influenzae.Será ainda apreciado que, quando expressos em bactérias, os polipeptídeos heterólogos normalmente tornam-se parte de corpos de inclusão. Os polipeptídeos heterólogos devem ser isolados, purificados e em seguida montados em moléculas funcionais. Onde as formas de anticorpos tetravalentes são desejadas, as subunidades irão, em seguida, se auto-organizar em anticorpos tetravalentes (WO 02/096948A2).

[0206] Em sistemas bacterianos, uma série de vetores de expressão podem ser vantajosamente selecionados dependendo da utilização pretendida para a molécula de anticorpo a ser expressa.Por exemplo, quando é para ser produzida uma grande quantidade de tal proteína para a geração de composições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, os vetores que dirigem a expressão de elevados níveis de fusão de produtos proteicos que são facilmente purificados podem ser desejáveis. Esses vectores incluem, mas não estão limitados, ao E. coli vetor de expressão pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2:1791 (1983)), em que a sequência codificadora do anticorpo pode ser ligada individualmente no vetor em enquadramento com a região de codificação de lacZ de forma que uma proteína de fusão é produzida; pIN vectores (Inouye and Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke and Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)); e outros semelhantes. Vetores pGEX podem também ser utilizados para expressar polipeptídeos estranhos como proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir de células lisadas através de adsorção e de ligação para uma matriz de glutationa-agarose seguido de eluição grânulos na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são concebidos para incluir trombina ou fator Xa de locais de clivagem de protease de modo que o produto do gene clonado alvo pode ser libertado a partir da porção GST.

[0207] Em adição aos procariotas, micróbios eucarióticos podem também ser usados.Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de padeiro comum, é o mais vulgarmente utilizado entre os microorganismos eucariotas, embora um certo número de outras estirpes estão geralmente disponíveis, por exemplo, Pichia pastoris,.

[0208] Para a expressão em Saccharomyces, o plasmídeo YRp7, por exemplo, (Stinchcomb et ai, Nature 282:.. 39 (1979); Kingsman et ai, Gene 7:. 141 (1979); Tschemper et ai, Gene 10: 157 (1980 )) é comumente usado.Este plasmídeo já contém o gene TRP1, o qual proporciona um marcador de seleção para uma estirpe mutante de levedura sem a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo ATCC No. 44076 or PEP4-1 (Jones, Genetics 85:12 (1977)). A presença da lesão trp 1 como uma característica do genoma da célula hospedeira de levedura proporciona então um ambiente eficaz para detectar a transformação através do crescimento na ausência de triptofano.

[0209] Num sistema de inseto, Autographa californica vírus da poliedrose nuclear (AcNPV) é tipicamente usado como um vetor para expressar genes estranhos.O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda.A sequência de codificação de anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não- essenciais (por exemplo o gene da poliedrina) do vírus e colocada sob controle de um promotor AcNPV (por exemplo o promotor da poliedrina).

[0210] Uma vez que uma molécula de anticorpo do presente invento tenha sido expressa de modo recombinante, esta pode ser purificada por qualquer método conhecido na arte para a purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (por ex., permuta iônica, afinidade, particularmente por afinidade ao antígeno específico após a Proteína A, dimensionamento de uma coluna cromatográfica), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Como alternativa, um método para aumentar a afinidade de anticorpos do presente invento é revelado na Candidatura de Patente EUA No. de publicação 2002 0123057 A1. VII. Métodos de tratamento utilizando anticorpos anti-CXCL13 terapêuticos

[0211] A quimiocina CXCL13 linfóide é expressa pelas células dendríticas foliculares (FDCs) e macrófagos.Através do seu receptor, CXCR5, que se encontra numa variedade de células imunes (por exemplo, células B, células foliculares T auxiliares e células T recém-ativadas), a CXCL13 induz mudanças intracelulares necessárias para a manutenção da homeostasia do sistema imune, organogênese linfóide, tráfico de leucócitos e migração quimiotática, bem como o desenvolvimento de tecido linfóide secundário (por exemplo, centros germinais). A sobre-expressão de CXCL13 e do seu receptor CXCR5 têm sido implicados numa variedade de doenças auto-imunes (por exemplo, esclerose múltipla (ver, por exemplo, Corcione et al, PNAS 101 (30) :11064-11069 (2004),. Serafini et al, Brain. Pathol.14 :164-174 (2004); Magliozzi et al, Brain 130:. 1089-1104 (2007)), artrite (por exemplo, a artrite reumatóide (ver, por exemplo, Rioja et al, Arthritis & Rheumatism 58 (8): 2257. -2267 (2008); Shi et al, J. Immuno..166:650-655 (2001); Schmutz et al., Arthritis Restearch and Therapy 7:R217-R229 (2005); Hjelmstrom et al. , J. Leukocyte Bio. 69:331-339 (2001)), gastrite crônica (ver, por ex., Hjelmstrom et al. ; Mazzucchelli et al, Brain 130 :1089-1104 (2007)), linfomas gástricos (ver, por exemplo, ID..; Nobutani et al, FEMS Immunol Med Microbiol 60 :156-164 (2010)), a rejeição de transplantes (ver, por exemplo, Steinmetz et al, Kidney International 67 :1616-1621 (2005.)), Síndroma de Sjogren (SS) (. ver, por exemplo, Barone et al., J. Immuno.180:5130-5140 (2008); Hjelmstrom et al.), úpus eritematoso sistêmico (SLE) (ver, por ex., Steinmetz et al., Lee et al., J. Rheum. 37 (1) :45-52 (2010); Schiffer et al, J.. Immun. 171 :489-497 (2003)), crioglobulinemia mista ativa (MC), vasculite no vírus da hepatite C (ver, por exemplo, Sansonno et al., Sangue 112 (5) :1620-1627 (2008)), dermatomiosite juvenil (ver , por exemplo, de Padilla et al., Arthritis & Rheumatism 60 (4) :1160-1172 (2009)), e miastenia gravis (ver, por exemplo, Matsumoto et ai., J. Immuno.176 :5100-5107 (2006); Meraouna et ai, Blood 108 (2) :432-440 (2006),. Saito et ai, J.. Neuroimmunol 170 :172-178 (2005)) e alguns tipos de cancro (por exemplo, linfoma de Burkitt (ver, por exemplo, Forster et ai, Blood 84:830-840 (1994),.. Forster et al, Cell 87:1037-1047 ( 1996)), linfoma não-Hodgkin (ver, por exemplo, Trentin et al., Ann.Rev.Immunol.6 :251-81 (1988); Gong et ai, J..Immunol. 174: 817-826 (2005); Hamaguchi et ai, J.. Immunol.174 :4389-4399 (2005)), carcinoma (por exemplo, cólon, e pâncreas) (ver, por exemplo, Günther et al, Int. J. Cancer 116 :726-733 (2005.).; Meijer et ai, Câncer Res.. 66: 9576-9582 (2006)), o cancro da mama (. ver, por exemplo, Panse et al, British Journal of Cancer 99 :930-938 (2008)), leucemia linfocítica crnica (LLC) (ver, eg, et al Bürkle ., Blood 110 :3316-3325 (2007)), e cancro da próstata (ver, por exemplo, Singh et al., Cancer Letters 283 (1) :29-35 (2009)).Métodos da invenção para a inibição da atividade de CXCL13 seria esperado ter um efeito terapêutico sobre as perturbações acima mencionadas.

[0212] Certos métodos da invenção são direcionados para a utilização de moléculas de ligação anti-CXCL13, por ex., anticorpos, incluindo fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, e os seus derivados, para o tratamento de pacientes com uma doença associada com as células de expressão CXCL13, por ex., células superexpressivas CXCL13. Por "células expressivas CXCL13" é pretendido células normais e malignas que expressam o antigênio CXCL13. Os métodos para a detecção de expressão CXCL13 em células são bem conhecidos na arte e incluem, mas não estão limitadas a, técnicas de PCR, imuno- histoquímica, citometria de fluxo, Western blot, ELISA, e outros semelhantes.

[0213] Embora a discussão seguinte refere-se a métodos de diagnóstico e tratamento de várias doenças e distúrbios com um anticorpo anti-CXCL13 da presente invenção, os métodos descritos aqui são também aplicáveis aos fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, e derivados destes anticorpos anti- CXCL13 que mantêm as propriedades desejadas dos anticorpos anti-CXCL13 da invenção, por ex., capaz de se ligar especificamente CXCL13, por ex., CXCL13 humana, de rato, primata, ou CXCL13 humana e de rato e possuindo atividade neutralizante CXCL13.

[0214] Numa forma de configuração, o tratamento inclui a aplicação ou administração de uma molécula de ligação anti- CXCL13, por ex., um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção a um paciente, ou da aplicação ou administração da molécula de ligação anti-CXCL13 a um tecido isolado ou linha de células de um paciente, onde o paciente tem uma doença, um sintoma de uma doença, ou uma predisposição para uma doença. Numa outra forma de configuração, otratamento também se destina a incluir a aplicação ou administração de uma composição farmacêutica que compreende a molécula de ligação anti-CXCL13, por ex., um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção a um paciente, ou da aplicação ou administração de uma composição farmacêutica que compreende a molécula de ligação anti-CXCL13 a um tecido isolado ou linha celular de um paciente, que sofre de uma doença, um sintoma de uma doença, ou uma predisposição para uma doença.

[0215] As moléculas de ligação anti-CXCL13, por ex., anticorpos ou seus fragmentos de ligação, da presente invenção, são úteis para o tratamento de diversos tumores malignos e não malignos. Por "atividade anti-tumor" entende-se uma redução da taxa de proliferação ou acumulação de células expressivas CXCL13 malignas, e, consequentemente, uma diminuição da taxa de crescimento de um tumor existente ou de um tumor que surge durante a terapia, e/ou destruição da existência de células neoplásicas (tumor) ou células neoplásicas recém-formadas e, consequentemente, uma diminuição no tamanho total de um tumor durante a terapia. Por exemplo, terapia com pelo menos um anticorpo anti-CXCL13 provoca uma resposta fisiológica que é benéfica no que diz respeito ao tratamento de estados de doença associados com as células expressivas de CXCL13 em um ser humano.

[0216] Numa forma de configuração, a invenção relaciona-se com as moléculas de ligação anti-CXCL13, por ex., anticorpos ou fragmentos de ligação do mesmo, de acordo com a presente invenção, para uso como um medicamento, em particular para uso no tratamento ou profilaxia de cancro ou para utilização em condição ou lesão pré-cancerosa. Em certas formas de configuração, uma molécula de ligação anti-CXCL13, por ex., um anticorpo ou um seu fragmento de ligação, por ex., MAb 5261, da presente invenção é utilizado para o tratamento de um câncer superexpressivo de CXCL13. Em certas formas de configuração, uma molécula de ligação anti-CXCL13, por ex., um anticorpo ou um seu fragmento de ligação da presente invenção, é utilizado para o tratamento de uma leucemia expressiva ou superexpressiva de CXCL13, linfoma (por ex., MALT linfoma), cólon, pâncreas, estômago, mama, esôfago, ou câncer de próstata. Numa configuração, uma molécula de ligação anti- CXCL13, por ex., um anticorpo ou seu fragmento de ligação, da presente invenção, é utilizada para o tratamento de um carcinoma, por ex., carcinoma do cólon ou da próstata. Numa forma de configuração, a molécula de ligação anti-CXCL13, por ex., um anticorpo ou um seu fragmento de ligação, da presente invenção, é utilizada para o tratamento de um câncer de expressão ou superexpressão de CXCR5.

[0217] A eficácia de uma molécula de ligação anti-CXCL13, por ex.,e.g.um anticorpo ou um seu fragmento de ligação, para o tratamento ou prevenção de cancro pode ser demonstrado em modelos animais.Por exemplo, a eficácia de uma molécula de ligação anti-CXCL13, por ex., um anticorpo ou seu fragmento de ligação, da presente invenção, para o tratamento ou prevenção de cancro da próstata pode ser demonstrada utilizando um modelo animal, por ex., ratos injetados com células de carcinoma de próstata humana PC3 -Luc e tratados com uma molécula de ligação anti-CXCL13 da presente invenção. Em outro exemplo, a eficácia de uma molécula de ligação anti-CXCL13, por ex., um anticorpo ou um seu fragmento de ligação, da presente invenção, para o tratamento ou prevenção de cancro do cólon pode ser demonstrado utilizando um modelo animal para o cancro do cólon, por ex.,ratos injetados com células de carcinoma do cólon CT26, e tratados com uma molécula de ligação anti-CXCL13 da presente invenção. Em outro exemplo, a eficácia de uma molécula de ligação anti-CXCL13, por ex.,um anticorpo ou seu fragmento de ligação, da presente invenção, para o tratamento ou prevenção do linfoma MALT pode ser demonstrado utilizando um modelo animal para o linfoma MALT gástrico, por ex., os ratos infectados com a bactéria Helicobacter (ver Nobutani et al. (2010) e tratado com uma molécula de ligação anti-CXCL13 da presente invenção. O modelo Nobutani et al. também pode ser utilizado para avaliar a eficácia de uma molécula de ligação anti-CXCL13, por ex.,um anticorpo ou seu fragmento de ligação da invenção, para a redução dos folículos linfóides gástricos dos tecidos infectados por Helicobacter.

[0218] Em conformidade com os métodos da presente invenção, pelo menos uma molécula de ligação anti-CXCL13, por ex.,um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, tal como definido aqui outrora, é usada para promover uma resposta terapêutica positiva com respeito a uma célula maligna humana.Por "resposta terapêutica positiva" no que diz respeito ao tratamento do cancro é pretendida uma melhoria da doença em associação com a atividade anti-tumor destas moléculas de ligação, por ex.,anticorpos ou seus fragmentos, e/ou uma melhoria dos sintomas associados com a doença. Isto é, um efeito anti-proliferativo, a prevenção de outras protuberâncias de tumor, uma redução do tamanho do tumor, uma diminuição na vascularização do tumor, uma redução do número de células cancerosas, e / ou uma diminuição de um ou mais sintomas associados com a doença podem ser observados. Assim, por exemplo, uma melhoria da doença pode ser caracterizada como uma resposta completa. Por "resposta completa" destina-se a ausência de doença clinicamente detectável com normalização de estudos radiográficos previamente anormais, medula óssea, e líquido cefalorraquidiano (C). Tal resposta deve persistir durante pelo menos um mês após o tratamento de acordo com os métodos da presente invenção. Alternativamente, uma melhoria da doença pode ser categorizada como uma resposta parcial. Por "resposta parcial" destina-se, pelo menos, cerca de uma redução de 50% em todo o fardo tumor mensurável (isto é, o número de células tumorais presentes no sujeito), na ausência de novas lesões e persistem durante pelo menos um mês.Tal resposta é aplicável somente para tumores mensuráveis.

[0219] A resposta do tumor pode ser avaliada por alterações na morfologia do tumor (ie., A carga tumoral total, contagem de células de tumor, e outros semelhantes), utilizando técnicas de rastreio, tais como imagiologia bioluminescente, por exemplo, a imagem latente da luciferase, cintigrafia óssea de imagem, a amostragem e a biópsia do tumor, incluindo osso aspiração da medula (BMA).Além destas respostas terapêuticas positivas, o sujeito em tratamento com a molécula de ligação anti-CXCL13, por ex., um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno dos mesmos, pode experimentar o efeito benéfico de uma melhoria dos sintomas associados com a doença. Por exemplo, o sujeito pode experimentar uma diminuição dos chamados sintomas B, por exemplo, suores noturnos, febre, perda de peso, e / ou urticária.

[0220] As moléculas de ligação anti-CXCL13, por ex., anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, aqui descritos podem também encontrar utilização no tratamento ou prevenção de doenças inflamatórias e deficiências ou desordens do sistema imunitário que está associada com células que expressam CXCL13. As doenças inflamatórias são caracterizadas pela inflamação e destruição dos tecidos, ou uma combinação destes. Por "atividade anti-inflamatória" destina-se a redução ou prevenção da inflamação. "Doença inflamatória" inclui qualquer processo inflamatório imune mediado por onde o evento inicial ou o alvo da resposta imune envolve não auto- antígeno(s), incluindo, por exemplo, aloantígenos, xenoantígenos, antígenos virais, antígenos bacterianos, antígenos de desconhecidos, ou alérgenos.

[0221] Numa forma de realização, a doença inflamatória é associada com uma infecção bacteriana, por exemplo, uma infecção por Helicobacter, por exemplo, um H. pylori, H. heilmannii, H. acinonychis, H. anseris, H. aurati, H. baculiformis, H. bilis, H. bizzozeronii, H. brantae, H. candadensis, H. canis, H. cholecystus, H. cinaedi, H. cynogastricus, H. equorum, H. felis, H. fenelliae, H. ganmani, H. hepaticus, H. mesocricetorum, H. marmotae, H. muridarum, H. mustelae, H. pametensis, H. pullorum, H. rappini, H. rodentium, H. Salomonis, H. suis, H. trogontum, H. typhlonius e infecção por H. winghamensis. Em algumas formas de configuração específicas, a infecção por Helicobacter é uma infecção H. pylori ou H. heilmannii. Numa outra forma de configuração, a doença inflamatória associada aHelicobacteré o linfoma de MALT, um cancro gástrico (o cancro,esofágico ou gástrico), uma úlcera gástrica ou duodenal, gastrite (inflamação do estômago), ou uma lesão gástrica ver, por ex., Chen et al., J Clin Pathol 55(2):133-7 (2002); Genta et al., Hum Pathol 24(6):577-83 (1993); Okiyama et al., Pathol Int 55(7):398-404 (2005)).

[0222] Numa forma de configuração, a doença inflamatória é uma doença inflamatória do sistema nervoso central ou periférico.

[0223] Além disso, para os fins da presente invenção, a(s) "doença(s) inflamatória(s)" inclui, mas não está limitado a, "doença(s) auto-imune(s)."Como usado aqui, o termo "auto- imunidade" é geralmente entendido para abranger processos inflamatórios imunomediados envolvendo antígenos "próprios". Em doenças auto-imunes, auto-antígeno(s) de gatilho hospedam respostas imune.

[0224] Numa configuração, a molécula de ligação anti- CXCL13, por ex.,um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção, é utilizado para tratar ou prevenir a esclerose múltipla (MS). MS, também conhecida como esclerose disseminada ou encefalomielite disseminada, é uma condição auto-imune em que o sistema imunitário ataca o sistema nervoso central, que conduz a desmielinização.O nome "esclerose múltipla" refere-se às cicatrizes (esclerose, também referidas como placas ou lesões) que se formam no sistema nervoso.Lesões MS comumente envolvem áreas de substância branca perto dos ventrículos do cerebelo, tronco cerebral, gânglios basais e medula espinhal e do nervo óptico.}MS resulta em destruição deoligodendrócitos, as células responsáveis pela criação e manutenção da bainha de mielina. MS resulta em um afinamento ou perda total de mielina e, com o avanço da doença, a transecção de axônios.

[0225] Os sintomas neurológicos podem variar de acordo com o MS, e muitas vezes a doença evolui para incapacidade física e cognitiva.A MS toma várias formas, com novos sintomas que ocorrem tanto em ataques discretos (formas reincidentes) ou lentamente acumulando ao longo do tempo (formas progressivas). Entre os ataques, os sintomas podem desaparecer completamente, mas muitas vezes resultam em danos neurológicos permanentes, especialmente com o avanço da doença.

[0226] Encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo animal amplamente aceito de esclerose múltipla.EAE é uma doença desmielinizante do sistema nervoso central que resulta em graus progressivamente crescentes de paralisia ascendente com inflamação no principal alvo, a medula espinhal.A doença pode assumir um curso, aguda ou crônica, recorrente-remitente, que é dependente do método de indução e do tipo de animal usado. Bagaeva et al. mostrou queos folículos que contêm células B e células dendríticas expressivas de CXCL13 formada em meninges inflamadas de ratos com EAE recidivante-remitente com os níveis de expressão de CXCL13 aumentam constantemente ao longo do curso da doença.Ratos deficientes em CXCL13 experimentaram uma doença ligeira com diminuição da taxa de recaídas, e o bloqueio da CXCL13 com MAb anti-CXCL13 conduziu à atenuação da doença em EAE induzida passivamente em B10.Ratos PL. Bagaeva et al., J. Immuno.176 :7676-7685 (2006).

[0227] Neutralização de CXCL13, utilizando um anticorpo monoclonal anti-CXCL13 ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção, por ex., MAb 5261, pode ser usado para reduzir a gravidade de MS através de vários mecanismos diferentes, por ex., , bloqueio da interação de CXCL13 com o seu receptor resultando, por ex., em uma interferência com B e B folicular auxiliar na migração de células T para os tecidos inflamados e formação de centro germinativo.

[0228] Numa configuração, a molécula de ligação anti- CXCL13, por ex.,um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção, é utilizado para tratar ou prevenir o lúpus eritematoso sistêmico (SLE ou lúpus). O SLE é uma doença auto-imune que envolve múltiplos órgãos e é caracterizada pela formação espontânea de centros germinais ectópicos e na produção de auto-anticorpos contra um número de antígenos nucleares. O SLE na maioria das vezes afeta o coração, articulações, pele, pulmões, vasos sanguíneos, fígado, rins e sistema nervoso.

[0229] As células T ativadas, células B e suas promotoras de migração quimiocinas CXCL13 desempenham um papel crítico na formação de tecido linfóide organizado visto na inflamação de locais ectópicos em várias doenças auto-imunes, incluindo lúpus eritematoso.Ratos lupus-pone New Zealand Black X New Zealand White (F1 NZB/NZWF1) desenvolvem espontaneamente alto título de anti-dsDNA e glomerulonefrite proliferativa grave }causada pela formação de complexos imunes nos glomérulos dos rins. O desenvolvimento de sintomas do tipo lúpus nestes ratos é acompanhado pelo aumento da expressão de CXCL13 por células dendríticas em rins e timo (Ishikawa et al, J. Exp. Med. 193 (12) :1393-1402 (2001),... Schiffer et ai., J. Immun.171 :489- 497 (2003)).

[0230] A neutralização de CXCL13, utilizando um anticorpo monoclonal anti-CXCL13 ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção, por ex., MAb 5261, pode ser usado para reduzir a gravidade do SLE através de vários mecanismos diferentes, por ex., bloqueio de interação CXCL13 com o seu receptor resultando, por ex., em uma interferência com B e B folicular auxiliar na migração de células T para os tecidos inflamados e formação de centro germinativo.

[0231] Numa configuração, a molécula de ligação anti- CXCL13, por ex.,um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção, é utilizado para tratar ou prevenir a artrite, por ex.,a artrite reumatóide. A artrite reumatóide (AR) é uma das doenças auto-imunes mais comuns que afetam a 24% da população dos Estados Unidos. É uma doença crônica, progressiva, doença sistêmica inflamatória caracterizada pela fusão de articulações sinoviais, erosão e destruição da cartilagem óssea. Na AR, as células T, células B, macrófagos e células dendríticas (DCs) acumulam na camada sinovial formando pannus (região invasivo da membrana sinovial que corrói em cartilagem e osso). Além disso, as células T e B dentro das lesões sinoviais organizam em centro germinais linfóides - como estruturas que suportam a produção de auto-anticorpos (fator reumatóide) e, portanto, contribuem diretamente para a patogênese da doença (Takemura et al., J. Immuno.167 :1072- 1080 (2001); Shi et al, J.. de Immuno.166 :650-655 (2001)).

[0232] A quimiocina CXCL13 linfóide, produzida por fibroblastos sinoviais, células endoteliais selecionadas, células sinoviais do antígeno T auxiliar primário e FDCs (Takemura et al.(2001); Shi et al. (2001),. Manzo et al, Arthritis & Rheumatism 58 (11) :3377-3387 (2008)), desempenha um papel crítico na formação do centro germinal no tecido sinovial, dirigindo células linfóides CXCR5 positivas (principalmente células B e células foliculares T auxiliares) a migrarem para a sinóvia inflamada.

[0233] Clinicamente, os níveis plasmáticos de CXCL13 em pacientes com RA correlacionados com a gravidade da doença, como níveis significativamente mais elevados de CXCL13, foram encontradas no plasma dos pacientes com artrite reumatóide ativa, comparando com os controles e os pacientes com a doença quiescente (Rioja et al., Arthritis & Rheumatism 58(8):2257- 2267 (2008)). Além disso, o receptor CX CR5 foi regulado positivamente na sinóvia de pacientes com AR e presente na infiltração de células B e T, e também em macrófagos e células endoteliais (Schmutz et al, Arthritis Research Therapy 7:. R217-R229 (2005)).

[0234] Artrite induzida por colágeno (CIA) em camundongos e ratos é um modelo bem estabelecido de artrite reumatóide humana (RA).A doença é tipicamente induzida por injeção intradérmica de colágeno tipo II de bovino emulsionado em Adjuvante Completo de Freund (CFA) e é caracterizada pela produção de anticorpos de colágeno de rato e, em seguida, o desenvolvimento progressivo de artrite nas patas. Stannard et al. Mostrou que a neutralização CXCL13 com anticorpos CXCL13 anti-murino de rato conduziu a uma redução significativa na pontuação artrítica e a gravidade da destruição das articulações na artrite DBA / 1 de rato.Stannard et al., "Neutralização de CXCL13 impacta no tráfico de células B e reduz a gravidade da artrite experimental estabelecida", Apresentado no Colégio Americano de Reumatologia de 2008 Reunião Científica Anual (2008).

[0235] A neutralização de CXCL13, utilizando um anticorpo monoclonal anti-CXCL13 ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção, por ex., MAb 5261, pode ser usado para reduzir a gravidade da artrite, por ex., artrite reumatóide, através de vários mecanismos diferentes, por ex., bloqueio de interação CXCL13 com o seu receptor, resultando, por ex.,em interferência com B e B auxiliar folicular na migração de células T para os tecidos inflamados e formação de centro germinativo. Além disso, um anticorpo monoclonal anti-CXCL13 ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção, por ex.,MAb 5261, pode ser usado para reduzir a expressão de RANKL e perda de massa óssea, por ex., num sujeito com superexpressão RANKL.

[0236] Em conformidade com os métodos da presente invenção, pelo menos uma molécula de ligação anti-CXCL13, por ex., um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, tal como definido aqui anteriormente é usada para promover uma resposta terapêutica positiva com respeito ao tratamento ou prevenção de uma doença auto-imune e/ou doença inflamatória.Por "resposta terapêutica positiva" em relação a uma doença auto- imune e/ou doença inflamatória pretende-se uma melhoria da doença em associação com a atividade anti-inflamatória, atividade anti-angiogênica, atividade anti-apoptótica, ou similares a estes anticorpos , e/ou uma melhoria dos sintomas associados com a doença. Isto é, um efeito anti-proliferativo, a prevenção da proliferação de células expressivas de CXCL13, uma redução na resposta inflamatória incluindo, mas não se limitando, a redução da secreção de citoquinas inflamatórias, moléculas de adesão, proteases, imunoglobulinas (nos casos em que a célula portadora de CXCL13 é uma célula B), as suas combinações, e do gênero, a produção aumentada de proteínas anti-inflamatórias, uma redução no número de células auto- reativas, o aumento da tolerância imunológica, a inibição da sobrevivência de células autorreativas, redução na apoptose, redução migração de células endoteliais, aumento da migração de monócitos espontâneo, redução e/ou uma diminuição de um ou mais sintomas mediados pela estimulação de células que expressam CXCL13, podem ser observados. Tais respostas positivas terapêuticas não estão limitadas à via de administração e podem compreender a administração ao doador, o tecido do doador (tal como, por exemplo, a perfusão do órgão), o hospedeiro de qualquer combinação dos mesmos e semelhantes.

[0237] A resposta clínica pode ser avaliada através de técnicas de triagem, como a ressonância magnética (RM), radiografia de imagem, tomografia computadorizada (TC), citometria de fluxo ou de analise de fluorescência-ativado de classificação celular (FACS), histologia, patologia grave, e sangue química, incluindo, mas não se limitando a alterações detectáveis por ELISA, RIA, cromatografia, e similares.Além destas respostas terapêuticas positivas, o sujeito em tratamento com a molécula de ligação anti-CXCL13 por ex., um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, pode experimentar o efeito benéfico de uma melhoria dos sintomas associados com a doença.

[0238] Uma forma de realização adicional da invenção é a utilização de uma molécula de ligação anti-CXCL13, por ex.,, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, para a monitorização dos níveis de proteína de diagnóstico em tecido como parte de um procedimento de testes clínicos, por ex., para determinar a eficácia de um regime de tratamento dado. Por exemplo, a detecção pode ser facilitada pelo acoplamento do anticorpo a uma substância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, e materiais radioativos. Exemplos de enzimas adequadas incluem horseradish peroxidase, fosfatase alcalina, β-galactosidase, ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupos prostéticos adequados incluindo estreptavidina/biotina e avidina/biotina, exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, dichlorotriazinylamine fluoresceína , cloreto de dansilo ou ficoeritrina, um exemplo de um material luminescente inclui luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e aequorina, e exemplos de materiais radioativos adequados incluem 125 I, 131 I, 35 S ou 3 H.

VIII. Composições farmacêuticas e métodos de administração

[0239] Os métodos de preparação e administração da molécula de ligação anti-CXCL13, por exemplo, anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou seus derivados, da presente invenção, a um indivíduo com necessidade do mesmo são bem conhecidos ou são facilmente determinados por aqueles peritos na arte.A via de administração da molécula de ligação anti-CXCL13, por ex., , anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, a variante, ou um seu derivado, pode ser, por exemplo, oral, parentérica, por inalação ou tópica. TO termo parenteral como aqui utilizado inclui, por ex., administração intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, retal ou vaginal. Embora todas estas formas de administração sejam claramente contempladas como estando dentro do âmbito da invenção, um exemplo de uma forma para administração seria uma solução injetável, em particular por injeção intravenosa ou intra-arterial ou por gotejamento. Geralmente, uma composição farmacêutica adequada para injeção pode compreender um tampão (por ex. tampão fosfato, acetato ou citrato), um surfactante (p. ex.polisorbato), opcionalmente, um agente estabilizador (por ex.albumina humana), etc. No entanto, nos outros métodos compatíveis com os presentes ensinamentos, moléculas de ligação anti-CXCL13, por ex. , anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou seus derivados da presente invenção, podem ser entregues diretamente no local da população celular adversa aumentando assim a exposição do tecido doente para o agente terapêutico.

[0240] Como aqui discutido, moléculas de ligação anti- CXCL13, por exemplo, anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou seus derivados da presente invenção, podem ser administrados numa quantidade farmaceuticamente eficaz para o tratamento in vivo de células de doenças mediadas que expressam CXCL13 tais como determinados tipos de cancros, doenças auto-imunes, e doenças inflamatórias, incluindo o sistema nervoso central (SNC) e do sistema nervoso periférico (SNP) de doenças inflamatórias.A este respeito, deve notar-se que as moléculas de ligação descritas da presente invenção serão formuladas de forma a facilitar a administração e promover a estabilidade do agente ativo. Em certas configurações, as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção compreendem um veículo estéril não- tóxico, farmaceuticamente aceitável, tal como solução salina fisiológica, tampões não-tóxicos, conservantes e semelhantes. Para os efeitos do presente pedido de patente, uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma molécula de ligação anti- CXCL13, por ex., um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, a variante, ou um seu derivado, conjugados ou não conjugados, deverá ser realizada para significar uma quantidade suficiente para atingir de forma eficaz a ligação a um alvo e para alcançar um benefício, por exemplo., para melhorar os sintomas de uma doença ou distúrbio, ou para detectar uma substância ou uma célula.

[0241] As composições farmacêuticas utilizadas nesta invenção compreendem veículos farmaceuticamente aceitáveis, incluindo, por ex.,/2},permutadores de íons, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas séricas, tais como albumina do soro humano, substâncias tampão tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, parciais misturas de glicéridos de ácidos gordos vegetais saturados, água, sais ou electrólitos, tais como sulfato de protamina, hidrogeno-fosfato dissódico, hidrogeno-fosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinil-pirrolidona, substâncias à base de celulose, polietileno-glicol, carboximetilcelulose de sódio, poliacrilatos, ceras, polietileno-polioxipropileno de bloco de polímeros, polietileno-glicol e gordura de lã.

[0242] As preparações para administração parenteral incluem soluções estéreis aquosas ou não aquosas, suspensões e emulsões.Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais tais como azeite, e ésteres orgânicos injetáveis tais como oleato de etilo. Os veículos aquosos incluem, por exemplo, água, álcool / aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo meios salinos e tamponados.Na presente invenção, os transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, 0,01-0,1 M, por exemplo, tampão de fosfato 0,05 M, ou solução salina 0,8%.Outros veículos parenterais comuns incluem soluções de fosfato de sódio, dextrose de Ringer, cloreto de dextrose e sódio, Ringer com lactato, ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de electrólitos, tais como aqueles baseados em dextrose de Ringer, e semelhantes. Os conservantes e outros aditivos podem também estar presentes, tais como, por exemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, e gases inertes e semelhantes.

[0243] Mais particularmente, as composições farmacêuticas adequadas para a utilização injetável incluem soluções aquosas estéreis (quando solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis ou dispersões.Em tais casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluida na medida em que existe seringabilidade fácil. Deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e, de preferência ser conservada contra a ação contaminante de microorganismos, tais como bactérias e fungos. O transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por ex., glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido, e afins), e suas misturas adequadas. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pela utilização de tensioativos. As formulações adequadas para utilização nos métodos terapêuticos aqui descritos são descritos em Remington 's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. estabelece) 16a ed.1980).

[0244] A prevenção da ação de microorganismos pode ser alcançada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol ácido ascórbico, timerosal, e outros semelhantes.Em certos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como o cloreto de manitol, de sorbitol ou de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que retarde a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[0245] Em qualquer caso, soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas através da incorporação de um composto ativo(por ex.,um anticorpo anti-CXCL13, ou fragmento de ligação ao antígeno, a variante, ou um seu derivado, por si só ou em combinação com outros agentes ativos) na necessária quantidade de um solvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes enumerados no presente documento, como necessário, seguido de esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando o composto ativo num veículo estéril, que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários de entre os enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem sob vácuo e secagem por congelação, que produzem um pó do ingrediente ativo e mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente esterilizada por filtração. As preparações para injeções são processadas, introduzidas em recipientes tais como ampolas, sacos, frascos, seringas ou frascos, e seladas em condições assépticas de acordo com métodos conhecidos na arte. Além disso, as preparações podem ser empacotadas e vendidas sob a forma de um kit, tais como os descritos no U.S. patent application Ser. N ° 09/259, 337. Tais artigos de fabricação terão preferivelmente rótulos ou folhetos informativos que indicam que as composições associadas são úteis para o tratamento de um indivíduo sofrendo de, ou com predisposição para uma doença ou distúrbio.

[0246] As formulações parentéricas podem ser uma dose em bolus único, ou uma infusão de uma dose de bolus inicial seguida de uma dose de manutenção.Estas composições podem ser administradas em intervalos específicos fixos ou variáveis, por exemplo., uma vez por dia, ou numa base de "conforme necessário".

[0247] Certas composições farmacêuticas usadas na presente invenção podem ser administradas oralmente numa forma de dosagem aceitável, incluindo, por ex., cápsulas, comprimidos, suspensões ou soluções aquosas. Certas composições farmacêuticas também podem ser administradas por aerossol nasal ou inalação. Tais composições podem ser preparadas como soluções em soro fisiológico, utilizando álcool benzílico ou outros conservantes adequados, promotores de absorção para melhorar a biodisponibilidade, e/ou outros agentes convencionais de solubilização ou de dispersão.

[0248] A quantidade de uma molécula de ligação anti-CXCL13, por ex.,anticorpo, ou seu fragmento, variante ou derivado, que pode ser combinada com os materiais veiculares para produzir uma forma de dosagem única irá variar dependendo do hospedeiro tratado e do modo particular de administração. A composição pode ser administrada como uma dose única, doses múltiplas, ou durante um período estabelecido de tempo em uma infusão. Os regimes de dosagem também podem ser ajustados para fornecer a resposta ótima desejada (por ex.,uma resposta terapêutica ou profilática).

[0249] De acordo com o âmbito da presente descrição, os anticorpos anti-CXCL13, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou seus derivados, da presente invenção, podem ser administrados a um humano ou outro animal de acordo com os métodos acima mencionados do tratamento em uma quantidade suficiente para produzir um efeito terapêutico.Os anticorpos anti-CXCL13, ou de ligação ao antígeno, fragmentos, variantes ou seus derivados, da presente invenção, podem ser administrados ao animal humano ou outro animal em uma forma de dosagem convencional preparada por combinação de um anticorpo da invenção,, MAb 5261, com um veículo farmaceuticamente aceitável ou diluente convencional de acordo com técnicas conhecidas. Será reconhecido por um perito na arte que a forma e caráter do transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável é ditada pela quantidade de ingrediente ativo com que é para ser combinado, a via de administração e outras variáveis bem conhecidas. Aqueles peritos na técnica irão apreciar que mais de um cocktail que compreende uma ou mais espécies de moléculas de ligação anti-CXCL13, por ex.,anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, ou seus derivados, da presente invenção podem revelar-se particularmente eficaz.

[0250] Por "dose ou quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" entende-se uma quantidade de molécula de ligação anti-CXCL13, por ex., o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, que, quando administrada provoca uma resposta terapêutica positiva com respeito ao tratamento de um paciente com uma doença a ser tratada.

[0251] Doses terapeuticamente eficazes das composições da presente invenção, para o tratamento de doenças mediadas por células expressivas de CXCL13, tais como as doenças de determinados tipos de cancros, como por ex., leucemia, linfoma (por ex., linfoma de MALT), mama, cólon, estômago, esófago e da próstata cancro, doenças auto-imunes, por ex.lúpus, artrite, esclerose múltipla, e doenças inflamatórias do sistema nervoso central, incluindo (CNS) e doenças inflamatórias do sistema nervoso periférico (SNP),variam dependendo de muitos factores diferentes, incluindo meio de administração local, alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é humano ou um animal, outros medicamentos administrados, e se o tratamento é profiláctico ou terapêutico. Normalmente, o paciente é um ser humano, mas mamíferos não-humanos, incluindo mamíferos transgênicos podem também ser tratados. As dosagens de tratamento podem ser ajustadas utilizando métodos de rotina conhecidos dos peritos na arte, para otimizar a segurança e eficácia.

[0252] A quantidade de pelo menos uma molécula de ligação anti-CXCL13, por ex.,o anticorpo ou seu fragmento de ligação, a ser administrada é prontamente determinada por um perito ordinário na arte sem experimentação excessiva, dada a divulgação da presente invenção. Fatores que influenciam o modo de administração e a quantidade respectiva de pelo menos uma molécula de ligação anti-CXCL13, por ex., anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, variante ou seu derivado incluem, mas não estão limitados a, gravidade da doença, história da doença, e a idade, altura, peso, saúde e condição física do indivíduo submetido a terapia. Da mesma forma, a quantidade de molécula de ligação anti-CXCL13, por ex.anticorpo, ou seu fragmento, variante ou seu derivado, a ser administrada será dependente do modo de administração e se o objeto irá ser submetido a uma dose única ou doses múltiplas de este agente.

[0253] A presente invenção também prevê a utilização de uma molécula de ligação anti-CXCL13, por ex.,um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, a variante, ou um seu derivado, na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença auto-imune e/ou doença inflamatória, incluindo, por ex. , esclerose múltipla, artrite, lúpus, gastrite, úlceras, ou de um cancro.

IX. Diagnóstico

[0254] A invenção proporciona adicionalmente um método de diagnóstico útil durante o diagnóstico de doenças mediadas por celulas expressivas de CXCL13, tais como certos tipos de cancros e de doenças inflamatórias, incluindo doenças auto- imunes, o que envolve a medição do nível de expressão da proteína CXCL13 ou transcrito no tecido ou outras células ou fluido corporal a partir de um indivíduo; e comparação do nível de expressão medido com um nível de expressão padrão de CXCL13 no tecido normal ou de fluido corporal, assim que um aumento no nível de expressão em comparação com o padrão é um indicativo de doença. Em certas formas de configuração, os anticorpos anti-CXCL13 da presente invenção ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes, e os seus derivados, como por ex., MAb MAb 5261, 5378 MAb, MAb 5080, MAb 1476, 3D2, ou 3C9, são utilizados no diagnóstico do cancro, esclerose múltipla, artrite ou lúpus.

[0255] Os anticorpos anti-CXCL13 da invenção e fragmentos de ligação ao antígeno, variantes e derivados dos mesmos, podem ser utilizados para dosar os níveis da proteína CXCL13 numa amostra biológica utilizando métodos imunohistológicos clássicos conhecidos dos peritos na arte (por ex., ver Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101 :976-985 (1985); Jalkanen et al, J.. Cell Biol.105:3087-3096 (1987)).Outros métodos baseados em anticorpos úteis para detectar a expressão da proteína CXCL13 incluem imunoensaios, tais como o ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), imunoprecipitação ou transferência de Western. Ensaios adequados são descritos em mais pormenores neste documento.

[0256] Por "testando o nível de expressão de polipeptídeo CXCL13" pretende-se a medição ou estimativa qualitativa ou quantitativa do nível de polipeptídeo CXCL13 numa primeira amostra biológica, quer diretamente (por ex., por meio da determinação ou estimativa do nível de proteína total) ou relativamente (por ex., comparando à doença associada ao nível de polipeptídeo numa segunda amostra biológica). Numa forma de configuração, o nível de expressão do polipeptídeo CXCL13 na primeira amostra biológica é medido ou estimado e comparado com um nível padrão de polipeptídeo CXCL13, padrão a ser tomado a partir de uma segunda amostra biológica obtida de um indivíduo que não tem o distúrbio ou a ser determinada pelos níveis médios a partir de uma população de indivíduos que não têm a doença. Tal como será entendido na arte, uma vez que o "padrão" do nível de polipeptídeo CXCL13 é conhecido, pode ser utilizado repetidamente como um padrão para comparação.

[0257] Por "amostra biológica" entende-se qualquer amostra biológica obtida de um indivíduo, linha celular, cultura de tecidos, ou outras fontes de células potencialmente expressivas de CXCL13.Os métodos para a obtenção de biópsias de tecidos e fluidos do corpo de mamíferos são bem conhecidos na arte.

X. Imunoensaios

[0258] Anticorpos anti-CXCL13, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou seus derivados, da presente invenção, podem ser testados para a ligação imunoespecífica por qualquer método conhecido na arte.Os imunoensaios que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a, sistemas de ensaio competitivos e não-competitivos utilizando técnicas tais como Western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado a enzima), imunoensaios de "sandwich", ensaios de imunoprecipitação, reações de precipitina de difusão em gel, precipitação reações, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, fixação do complemento ensaios, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios de proteína A, para citar apenas alguns. Tais ensaios são rotineiros e bem conhecidos na arte (ver, por exemplo, Ausubel et al., Eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY). Vol. 1, que é incorporada por referência aqui na sua totalidade).

[0259] A afinidade de ligação de um anticorpo a um antígeno, e o off-rate de uma interação anticorpo-antígeno pode ser determinada por ensaios de ligação competitivos.Um exemplo de um ensaio de ligação competitiva é um radioimunoensaio compreendendo a incubação de antígeno marcado (p. ex., 3 H ou 125 I) com o anticorpo de interesse na presença de quantidades crescentes de antígeno não marcado, e a detecção do anticorpo ligado ao antígeno marcado.A afinidade do anticorpo de interesse para um antígeno particular, e os de ligação off-rates pode ser determinado a partir dos dados por análise de Scatchard. A competição com um segundo anticorpo pode também ser determinada utilizando radioimunoensaios. Neste caso, o antígeno é incubado com o anticorpo de interesse, é conjugado com um composto marcado (por ex., 3H or 125I) na presença de quantidades crescentes de um segundo anticorpo não marcado.

[0260] A atividade de ligação de um dado lote de anticorpo anti-CXCL13, ou fragmento de ligação ao antígeno, a variante, ou derivado do mesmo pode ser determinada de acordo com métodos bem conhecidos. Os peritos na arte serão capazes de determinar condições de ensaio operativas e ótimas para cada determinação empregandoexperimentação de rotina.

[0261] Há uma variedade de métodos disponíveis para a medição da afinidade da interação anticorpo-antígeno, mas relativamente poucos para determinar as constantes de velocidade.A maioria dos métodos dependem de qualquer rotulagem de anticorpo ou antígeno, o que, inevitavelmente, complica as medições de rotina e introduz incertezas nas quantidades bem determinadas.

[0262] Ressonância de plásmon de superfície (SPR) como realizado em BIACORE ® oferece uma série de vantagens em relação aos métodos convencionais de medição da afinidade da interação anticorpo-antígeno: (i) nenhuma exigência para rotular um anticorpo ou antígeno, (ii) os anticorpos não precisam de ser purificados previamente, cultura de células sobrenadantes pode ser utilizada diretamente, (iii) medidas em tempo real, permitindo a comparação semi-quantitativa rápida de diferentes interações de anticorpos monoclonais, estão ativados e são suficientes para muitos fins de avaliação, (iv) a superfície bioespecífica pode ser regenerada de modo que uma série de diferentes anticorpos monoclonais podem ser facilmente comparados em condições idênticas, (v) os procedimentos analíticos são totalmente automatizados, e séries extensas de medições podem ser realizadas sem a intervenção do utilizador.BIAapplications Handbook, versão AB (reimpressão 1998), BIACORE ® código n ° BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, versão AB (reimpressão 1998), BIACORE ® código n ° BR-1001-84. SPR baseados em estudos de ligação exigem que um membro de um par de ligação seja imobilizado sobre uma superfície do sensor. O parceiro de ligação imobilizado é referido como o ligando. O parceiro de ligação em solução é referido como o analito. Em alguns casos, o ligando é anexado indiretamente à superfície através da ligação a uma outra molécula imobilizada, que é referida como a molécula de captura. Resposta SPR reflete uma alteração na concentração de massa na superfície do detector como se ligam ou se dissociam os analitos.

[0263] Baseado em SPR, medições BIACORE ® monitoram em tempo real interações diretamente como elas acontecem.A técnica é bem adequada para a determinação dos parâmetros cinéticos. Classificação de afinidade comparativa é simples de executar, e ambas as constantes cinéticas e de afinidade pode ser derivadas partir dos dados sensorgram.

[0264] Quando analito é injetado em um pulso discreto através de uma superfície de ligação, o sensorgram resultante pode ser dividido em três fases essenciais: (i) associação de analito com o ligando durante a injeção da amostra, (ii) equilíbrio ou estado estacionário durante a injeção da amostra, em que a taxa de ligação do analito é equilibrada pela dissociação do complexo, (iii) dissociação do analito a partir da superfície durante o fluxo de tampão.

[0265] As fases de associação e dissociação fornecem informações sobre a cinética da interação ligando-analito (ka e kd, as taxas de formação do complexo e de dissociação, kd/ka=KD). A fase de equilíbrio fornece informações sobre a afinidade da interação ligando-analito (K D).

[0266] O software BIAevaluation fornece instalações completas para ajuste de curvas usando tanto a integração numérica e algoritmos de montagem globais.Com uma análise adequada dos dados, a taxa separada e constantes de afinidade para a interação podem ser obtidas a partir de investigações simples Biacore ®. A gama de afinidades mensuráveis por esta técnica é muito ampla desde mM a pM.

[0267] A especificidade de epítopo é uma característica importante de um anticorpo monoclonal.Mapeamento de epítopos com BIACORE ®, em contraste com as técnicas convencionais usando radioimunoensaio, ELISA ou outros métodos de adsorção de superfície, não necessita de rotulagem ou de purificação de anticorpos, e permite a testes multi-especificidade do local utilizar uma sequência de vários anticorpos monoclonais.Além disso, um grande número de análises podem ser processadas automaticamente.

[0268] Experimentos de ligação de pares testam a capacidade de dois MAbs de se ligarem simultaneamente para o mesmo antígeno.MAbs dirigidos contra epítopos separados iram ligar de forma independente, enquanto MAbs direcionados contra epítopos idênticos ou estreitamente relacionados irá interferir com a ligação uns com os outros. Estas experiências de ligação com BIACORE ® são fáceis de realizar.

[0269] Por exemplo, pode-se usar uma molécula de captura para se ligar ao MAb em primeiro lugar, seguido pela adição de antígeno e o segundo MAb sequencialmente. Os sensorgrams irão revelar: (1) quanto do antígeno liga-se ao primeiro MAb, (2) em que medida o segundo MAb liga-se ao antígeno ligado à superfície, (3) se o segundo MAb não se ligar, se a inversão da ordem do teste de pares altera os resultados.

[0270] Inibição de peptídeo é outra técnica utilizada para o mapeamento de epítopos.Este método pode complementar os estudos de pares de ligação do anticorpo, e pode relacionar epítopos funcionais a características estruturais quando a sequência primária do antígeno é conhecida. Peptídeos ou fragmentos de antígeno são testados para a inibição da ligação de diferentes MAbs ao antígeno imobilizado. Os péptidos que interferem com a ligação de um determinado MAb são assumidos como estruturalmente relacionados com o epítopo definido por aquele MAb.

[0271] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado em contrário, técnicas convencionais de biologia celular, cultura celular, biologia molecular, biologia transgênica, microbiologia, DNA recombinante e imunologia, que estão dentro da perícia na arte.Essas técnicas são explicadas totalmente na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Ed.(1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2 a ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et ai, ed..(1992) Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, Nova Iorque); DN Glover ed, (1985) DNA Cloning, Volumes I e II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames e Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.), Miller e Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); e em Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, B altimore, Md.).

[0272] Princípios gerais da engenharia de anticorpos são apresentados na Borrebaeck, ed.(1995) Antibody Engineering (2nd ed.; Oxford Univ. Press). Os princípios gerais de engenharia de proteínas são apresentados em Rickwood et al., Eds.(1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.). Os princípios gerais de anticorpos e de anticorpos de ligação ao hapteno são apresentados em: Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2a ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); and Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.). Adicionalmente, os métodos padrão em imunologia conhecidos na arte e não especificamente descritos são geralmente seguidos como em Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al, eds..(1994) Basic and Clinical Immunology (8th ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) and Mishell and Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY).

[0273] Os trabalhos de padrão de referência estabelecendo os princípios gerais de imunologia incluem Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett et al., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Fardo et al, (Elsevere, Amsterdam),. Goldsby et al, eds.. (2000) Kuby Immunnology (4 a ed.; Freemand H. & Co.); Roitt et al. (2001) Imunologia (6 ed.; London: Mosby); Abbas et al. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5a ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann and Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlan); Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall2003); Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach and Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press).

[0274] Todas as referências supracitadas, bem como todas as referências aqui citadas, são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

[0275] Os seguintes exemplos são oferecidos como forma de ilustração e não como forma de limitação.

EXEMPLOS Exemplo 1 Seleção e caracterização de anticorpos de camundongos específicos para o CXCL13 humano

[0276] Geração de hibridoma. Camundongos Swiss Webster foram imunizados com CXCL13 humano conjugado com hemocianina de lapa (KLH). Após três imunizações, recolheu-se o baço do camundongo com o título mais elevado de anti-CXCL13, sendo que hibridomas foram geradas por fusão das células do baço com células de mieloma SP2/0 utilizando procedimentos padrão.

[0277] Clones de hibridomas foram selecionados por ELISA para serem ligados à proteína CXCL13 de seres humanos e camundongos. Placas de ELISA foram revestidas com cerca de 100 nM de proteína CXCL13 humana (Peprotech: #300-47) ou de camundongo (Peprotech: #250-24) durante a noite à temperatura ambiente (TA).Após lavar e bloquear as placas, foram adicionadas diluições de anticorpos anti-CXCL13 padrão (R&D Systems: MAb 470 anti-camundongo de rato e MAb 801 anti-humano de camundongos) ou sobrenadante de hibridoma, incubando-os durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas e anticorpos secundários (IgG-HRP anti-camundongo de cabras e MAb 801 para sobrenadante de hibridoma e MAb 801; IgG-HRP anti-camundongo de burros para MAb 470) foram adicionados e incubados durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas e desenvolvidas com reagentes A e B de substrato de tetrametilbenzidina (TMB) (BD Biosciences: #555214)

[0278] misturados em volumes iguais durante 15 minutos no escuro e lidos a 450/570 comprimentos de onda. Dois clones de hibridoma positivos, rotulados "3D2" e "3C9", ambos anticorpos IgG1 de camundongos, foram selecionados para maior caracterização.

[0279] A especificidade dos anticorpos anti-humanos de camundongos produzidos por hibridoma, 3D2 e 3C9, foi avaliada por ELISA (conforme descrito acima) em um painel composto por quimiocinas recombinantes (Peprotech: CXCL13 humana e de camundongos, IL-8/CXCL8 humano (#200-08), IP-10/CXCL10 humano (#200-10), MIG/CXCL9 humano (#300-26), SDF-1alfa/CXCL12 humano (#300-28A) e macaco cinomolgo CXCL13), bem como por vários antígenos de controle não-específicos (C35 humano recombinante, estreptavidina (Thermo: #21122), albumina de soro bovino (BSA) (SeraCore: #AP-4510-01)), albumina sérica humana (HAS) (Sigma: #A8763), insulina (Gibco: #12585-014) e hemoglobina (Sigma: #H7379). Anticorpos comerciais MAb 470 e MAb 801 (R&D Systems) foram utilizados como controles positivos para a ligação de CXCL13 de camundongos e de humanos ou macacos cinomolgos, respectivamente.

[0280] 3D2 e 3C9 demonstraram ligar especificamente CXCL13. Ambos os clones 3D2 e 3C9 demonstraram especificidade multi- espécie de CXCL13, já que se ligaram ao CXCL13 recombinante de humanos, camundongos e macacos cinomolgos (Figuras 1A-1C). A Figura 1 ilustra os resultados de medições duplicadas para pelo menos três experimentos. O anticorpo 3D2 demonstrou possuir uma forte ligação com o CXCL13 recombinante de humanos, camundongos e macacos. Em particular, o 3D2 se ligou de maneira mais forte ao CXCL13 recombinante de camundongos em comparação com o 3C9 e MAb 801. O 3D2 também foi caracterizado in vitro e in vivo (resultados indicados abaixo). O anticorpo 3D2 foi também utilizado como um protótipo para a geração de anticorpos CXCL13 quiméricos e humanizados (resultados indicados abaixo). O anticorpo 3C9 demonstrou possuir a ligação mais forte a um CXCL13 recombinante de humanos em comparação com 3D2, MAb 470 e MAb 801. Os 3C9 e 3D2 foram utilizados como reagentes no desenvolvimento do bioensaio (por ex., ELISA de competição de epítopos, descrito abaixo).

[0281] Medições de afinidade 3D2 por BIACORE®.A afinidade de 3D2, 3C9, MAb 801 e MAb 470 com CXCL13 recombinante de humanos e camundongos foi medida por BIACORE®. As quimiocinas foram imobilizadas em um chip C1 em tampão de acetato (pH=5) com CXCL13 de humanos a 1 μg/ml, CXCL13 de camundongos a 0,3 μg/ml e SDF-lαde controle negativo a 0,5 μg/ml. O 3D2 e o 3C9 foram diluídos em um tampão HBS-EP por duas vezes a partir de 100 nM a 0,78 nM e de 38 nM a 0,594 nm. O MAb 801 e o MAb 470 foram diluídos por duas vezes a partir de 50 nM a 0,78 nM e a partir de 19 nM a 0,594 nM. Os resultados demonstraram que a medição de afinidade (nM) para 3D2 em CXCL13 de humanos e de camundongos foi significativamente menor do que a dos anticorpos comerciais MAb 801 e MAb 470, respectivamente. Os resultados são apresentados no Quadro 2. Quadro 2. Medições de afinidade1

1 as afinidades se referem a CXCL13 recombinantes de humanos e camundongos; NL = não ligantes

[0282] Mapeamento do epítopo 3D2. Um teste de mapeamento de epítopos foi realizado utilizando ELISA para competição de epítopos. Placas foram revestidas com 100 nM de CXCL13 recombinante de humanos e incubadas com 0,033 nM de 3D2 biotinilado antes da adição de anticorpos antagônicos não marcados a várias concentrações em excesso da quantidade de 3D2. Os resultados de um experimento representativo são apresentados na Figura 2. Os resultados indicam que o 3C9 compete com o 3D2 para se ligar ao CXCL13 de humanos, mas o MAb 801 não compete com o 3D2 para se ligar ao CXCL13 de humanos.

[0283] 3D2 que se liga a CXCL13 nativos. Uma captura de ELISA para competição de epítopos foi utilizada para avaliar um 3D2 que se liga a CXCL13 nativos de humanos e camundongos. Nesse ensaio, o CXCL13 nativo de humanos foi obtido a partir de sobrenadantes recolhidos a partir de células humanas THP-1 estimuladas por IFN-gama. O CXCL13 humano (diluição 1:04 de sobrenadante THP1 ou 0,097 nM (1 ng/mL) rhuCXCL13) foi capturado com 6,6 nM de MAb 801 e detectado com 0,66 nM de biotina 3C9. Para uma adequada apresentação do antígeno, a quimiocina do sobrenadante da cultura de tecidos (ou o CXCL13 recombinante de humanos que foi utilizado como controle) foi capturada na placa de ELISA pelo MAb 801. A placa foi então incubada com o 3C9 biotinilado na presença de várias quantidades de 3D2 não marcados. A competição por ligar-se a um CXCL13 humano que provocou menos ligações de 3C9 biotinilado foi detectada por estreptavidina-HRP. Conforme ilustrado na Figura 3A, o 3D2 se ligou fortemente tanto ao CXCL13 humano nativo como ao recombinante, produzindo valores de EC50 estatisticamente similares.

[0284] Extratos de órgãos de camundongos ricos em CXCL13 obtidos a partir de camundongos TNF-alfa transgênicos foram utilizados como fontes de CXCL13 nativo de camundongos. CXCL13 de camundongos (diluição 1:40 de extrato de órgão TNF-Tg ou 0,5 nM de rmuCXCL13) foram capturados com 33 nM de MAb 470 e detectados com 3,3 nM de biotina-3D2. A quimiocina dos extratos (bem como o CXCL13 recombinante de camundongos que foi utilizado como controle) foi capturada na placa de ELISA pelo MAb 470. A placa foi então incubada com 3D2 biotinilado na presença de várias quantidades de 3D2 não marcados. A competição por ligar-se a um CXCL13 de camundongos que provocou menos ligações de 3C9 biotinilado foi detectada por estreptavidina-HRP. Como pode-se observar na Figura 3B, o 3D2 foi capaz de competir fora de sua versão biotinilada e de se ligar tanto ao CXCL13 de camundongos nativo como ao recombinante com igual potência.

[0285] Para ambas as figuras 3A e 3B, cada ponto de dados representa uma média das medições duplicadas a partir de um de pelo menos três experimentos independentes. As curvas foram ajustadas utilizando um ajuste de curva sigmoidal de quatro parâmetros (R 2 = 0,99). As diferenças nos valores do EC50 foram analisadas por teste t não-pareado e não foram consideradas significativas (P>0,05). Esses resultados mostram que o anticorpo 3D2 anti-humano de camundongos se ligou não só à quimiocina recombinante contra a qual tinha sido gerado, mas também às quimiocinas nativas de humanos e camundongos.

Exemplo 2 Inibição do anticorpo anti-CXCL13 da migração de células B humanas

[0286] A inibição da função do CXCL13, por ex., migração de células B, foi avaliada utilizando modelos estabelecidos que simulam a migração de células B tanto em sistemas de humanos como de camundongos. A migração até uma quimiocina não-CXCL13, SDF-1α (também denominada CXCL12), foi utilizada como controle para confirmar a especificidade do anticorpo anti-CXCL13 na inibição da migração de células B. Assim, os anticorpos anti- CXCL13 foram testados quanto à inibição da migração induzida por CXCL13 humana e quanto à ausência de um efeito sobre a migração induzida por SDF-1α.

[0287] A inibição da migração de células B humanas até um CXCL13 humano. O efeito de 3D2, 3C9 e MAb 801 sobre a migração de células B induzida por CXCL13 humano foi testado.

[0288] Duas linhas de células clonais, pré-B-697-hCXCR5 humana e pré-B-697-hCXCR4 humana, foram utilizadas para avaliar os efeitos dos anticorpos anti-CXCL13 sobre a migração dependente de CXCL13 recombinante de humanos e a migração dependente de SDF-1α recombinante de humanos, respectivamente. Foram utilizadas placas tratadas com culturas de tecidos Transwell com um tamanho de poro de 8 μm e um diâmetro de 6,5 mm (Corning Costar: 3422). As células humanas pré-B-697-hCXCR5 foram usadas para a migração induzida por rhCXCL13 e as células humanas pré-B-697-hCXCR4 foram usadas para a migração induzida por rhSDF-1 (controle negativo). As células foram novamente suspensas em tampão de quimiotaxia ((RPMI 1640 com l-glutamina, 10 mM de HEPES, PennStrep e 0,5% de BSA) pré- aquecida até a temperatura ambiente) a 5 x 106/ml e retornou a 37oC durante 30 minutos. A quimiocina diluída (97 nm (1 μg/ml) de rhCXCL13 ou 12,5 nM (0,1 μg/ml) rhSDF-1α em tampão de quimiotaxia) +/- anticorpos foram adicionados à câmara inferior a 590 μL/poço e pré-incubados durante 30 minutos à temperatura ambiente. As células foram adicionadas a 100 μl (5 x 105) células por câmara superior. As placas foram incubadas durante a noite a 37 oC. Os insertos foram então removidos e azul de Alamar foi adicionado a 60 μl por poço, sendo que as placas foram incubadas a 37 oC durante 4 horas. A fluorescência foi medida nos comprimentos de onda de 530 nm e 590 nm.

[0289] O índice de migração foi calculado para cada condição da seguinte forma: ((índice de migração [isotipo de controle] - índice de migração [anticorpo])*100)/(índice de migração [isotipo de controle]). A inibição de migração porcentual foi representada graficamente em função de log[anticorpo nM] para produzir uma curva de titulação utilizando Graphpad Prism 5. Os resultados para a migração induzida por CXCL13 humana são ilustrados na Figura 4A. Os resultados são apresentados como a média de dois experimentos independentes de migração induzidos por hCXCL13 e três experimentos independentes de migração induzidos por hSDF-1 +/- erro padrão da média (EPM).

[0290] As diferenças nos graus de inibição da migração induzida por CXCL13 humana entre 3D2, 3C9 e MAb 801 correspondeu às diferenças nas afinidades para CXCL13 humana (vide Quadro 2). Assim, o anticorpo com a afinidade mais baixa para a quimiocina (3D2) pareceu ser o inibidor mais fraco da quimiotaxia pré-B-hCXCR5 humana, ao passo que os anticorpos com afinidades mais elevadas ou quase idênticas (MAb 801 e 3C9) resultaram em um alto porcentagem de inibição da migração celular (Figura 4A). Nenhum dos anticorpos CXCL13 anti-humanos (3D2, 3C9 ou MAb 801) produziu qualquer efeito na quimiotaxia mediada por SDF-1α humana de células pré-B-hCXCR4-(5) humanas (Figura 4B). Considerando que, o controle positivo anticorpo g de aveia SDF-1α anti-humano (MAB 87A) inibiu fortemente a migração SDF-1α-dependente.

[0291] Inibição da migração dependente de CXCL13 de camundongos dos esplenócitos de camundongos. Os anticorpos anti-CXCL13 foram testados quanto a sua capacidade para inibir a quimiotaxia recombinante mediada por CXCL13 de camundongos dos esplenócitos de camundongos (obtidos a partir de baços dissociados mecanicamente). O ensaio foi realizado utilizando basicamente o mesmo protocolo descrito acima para o ensaio de migração de células B dependentes de CXCL13 humano com pequenas modificações, incluindo a utilização de 485 nM (5 μg/ml) de rmuCXCL13, a utilização de placas Transwell com poros de menor tamanho (ou seja, placas tratadas com cultura de tecidos Transwell com poros de 5 μm de tamanho e diâmetro de 6,5 mm (Corning Costar: # 3421)), bem como a utilização de maiores quantidades de células (106) por poço. Os efeitos dos anticorpos testados sobre a migração de esplenócitos a partir de duas linhagens diferentes de camundongos, C57/BL6 SJL, são ilustrados nas Figuras 5A e 5B, respectivamente. O MAb 470 foi utilizado como um controle positivo. IgG de camundongos e camundongos, bem como o anticorpo 3C9 de camundongos específico ao CXCL13 humano, foram incluídos como controles negativos. Conforme ilustrado nas Figuras 5A e 5B, os padrões de inibição foram diferentes entre o MAb 470 e o 3D2. Em particular, o 3D2 inibiu a quimiotaxia de uma maneira titulável, ao passo que o efeito do MAb 470 só ficou aparente na concentração de anticorpos mais elevada de 396 nM. Os dados que comparam o efeito do 3D2 na migração de C57Black/6 e SJL/J foram analisados mediante um teste t não-pareado, produzindo um valor de P >0,05 e indicando a ausência de diferenças significativas entre as duas curvas. As curvas foram ajustadas utilizando um ajuste de curva sigmoidal de quatro parâmetros (R2 = 0,99). Uma comparação do efeito do 3D2 em SJL/J e da migração de esplenócitos C57Black/6 é ilustrado na Figura 5C. Não se observaram diferenças significativas nos perfis inibitórios do 3D2 entre duas linhagens de camundongos.

Exemplo 3 Inibição de anticorpos anti-CXCL13 da endocitose mediada por CXCL13 de CXCR5 de humanos

[0292] A inibição da função da quimiocina CXCL13, por ex., endocitose mediada por CXCL13 do receptor CXCR5, com anticorpos anti-CXCL13 foi avaliada utilizando um modelo estabelecido para a endocitose mediada por CXCL13 humano do receptor CXCR5 humano (Burke et al., Blood 110:2216-3325 (2007)).

[0293] Inibição da endocitose mediada por CXCL13 do receptor CXCR5 humano. A ligação de uma quimiocina ao seu receptor de quimiocinas provoca a internalização do complexo ligante-receptor com a posterior ativação da cascata de sinalização intracelular (Neel et al., Chemokine and Growth Factor Reviews 16:637-658 (2005)). O método baseado no fluxo descrito em Burkle et al. foi adaptado para determinar a capacidade de que o 3D2 iniba a internalização do receptor CXCR5 mediada por CXCL13 em células de humanos e de camundongos. Para a endocitose mediada por CXCL13 humano, o hCXCL13 foi combinado com 3D2, MAb 470 ou IgG de camundongo (em concentrações de 0, 33, 66, 132, 264 e 528 nM) e incubado durante a noite a 4 oC. No dia seguinte, as células foram ressuspensas em diluentes (RPMI + 0,5% de BSA) a 107 células/ml. As células foram pré-bloqueadas com 10 μg/ml de bloco Fc anti-humano durante 15 min. a 37 oC. As células foram então incubadas com a mistura CXCL13/anticorpo (50 μl de células:50 μl de mistura) durante 2 horas a 37 oC. As células foram posteriormente tingidas com um anticorpo CXCR5 anti- humano (BDPharmingen: #558113) durante 30 minutos a 4 oC e analisadas por citometria de fluxo. Do mesmo modo, a endocitose mediada por CXCL13 de camundongos foi testada utilizando mCXCL13 combinado com 3D2 ou IgG de camundongos (em concentrações de 0, 20, 59, 198 e 528 nM). A inibição da endocitose foi calculada da seguinte forma: % inibição = 100 - [100*(0 CXCL13 - média geométrica)/(0 CXCL13 - 0 mAB)].

[0294] A Figura 6 ilustra dados de experimentos representativos com CXCL13 de humanos e camundongos. A Figura 6A ilustra o efeito do anticorpo 3D2 na expressão do receptor CXCR5 humano na superfície de células pré-B-697-hCXCR5 humanas tratadas com 485 nM (5 μg/ml) de CXCL13 humano. A Figura 6B ilustra a inibição mediada por 3D2 da internalização do receptor CXCR5 de camundongos em células WEHI-231 pré- incubadas com 1000 nM (10 μg/ml) de CXCL13 de camundongos. Em ambos os casos, o 3D2 interferiu de forma eficiente e titulável na regulação descendente induzida por CXCL13 dos receptores CXCR5. A Figura 6C ilustra valores de EC50 calculados a partir de curvas de resposta a doses sigmoidais (ilustradas no gráfico) com valores de R2 iguais a 1 (endocitose de camundongos) e 0,994 (endocitose de humanos). Os dados que comparam o efeito do 3D2 na endocitose dos receptores de humanos e camundongos foram analisados por teste t não-pareado, o qual produziu um valor de P>0,05, indicando a ausência de diferenças significativas entre as curvas de CXCL13 humano e CXCL13 de camundongos.

Exemplo 4 Avaliação de anticorpos anti-CXCL13 em modelos de doenças de camundongos para esclerose múltipla

[0295] Modelo murino da esclerose múltipla. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo animal amplamente aceito de esclerose múltipla. A EAE é uma doença desmielinizante do sistema nervoso central (SNC) que resulta em graus progressivamente maiores de paralisia ascendente com inflamação, atacando principalmente a medula espinal. A doença pode tomar um curso agudo, crônico ou recorrente-remitente, o qual depende do método de indução e do tipo de animal usado. Assim, a EAE pode ser induzida com os componentes do SNC, péptidos (indução ativa) e também através de transferência de células de um animal a outro (indução passiva). O adjuvante completo de Freund (CFA) é utilizado com os extratos ou péptidos, sendo também normalmente utilizado com a toxina pertussis.

[0296] RR-EAE-1: efeito do 3D2 na EAE recorrente-remitente em camundongos SJL. O anticorpo 3D2 foi testado utilizando um modelo de imunização ativa do EAE. No teste "RR-EAE-1", a doença recorrente-remitente (RR) foi induzida em camundongos SJL/J através de imunização subcutânea com epítopo de peptídeo da proteína de proteolípido (PLP)139-151 (HSLGKWLGHPDKF; SEQ ID NO: 1) em 1 mg/ml de CFA reforçado com 5 mg de H37RA de cepa Mycobacterium tuberculose inativo por calor. O teste incluiu os seguintes grupos de tratamento: A. Controle (IgG de camundongos) a partir dia 0 B. 3D2 a partir do dia 0 C. 3D2 a partir de uma pontuação > 1

[0297] Os camundongos receberam injeções intraperitoneais de 0,3 mg (15 mg/kg) de anticorpo duas vezes por semana. O tratamento começou no dia 0 para os grupos A e B e em uma pontuação clínica > 1 para o grupo C (o sistema de pontuação é descrito no Quadro 3 abaixo). Quadro 3. Resumo da avaliação dos sinais clínicos da EAE

[0298] Conforme ilustrado na Figura 7, o tratamento com 3D2 resultou em uma melhoria da doença. Cada ponto de dados representa uma média das pontuações tomadas de 9 camundongos. As médias grupais (GMS) foram comparadas utilizando ANOVA de fator único seguida por um pós-teste de comparação múltipla de Bonferroni. Foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre o grupo de controle (IgG de camundongo) e cada grupo tratado com 3D2 (P<0,05), mas não entre dois grupos tratados com 3D2 (P>0,05). A atenuação da doença foi observada mesmo quando o tratamento não tinha começado até que os camundongos demonstraram doença ativa (Grupo C).

[0299] RR-EAE-2: efeito do 3D2 sobre a EAE recorrente- remitente em camundongos SJL. Um segundo teste ("RR-EAE-2") foi realizado utilizando a toxina da tosse convulsa no protocolo de indução para testar 3D2 em um modelo de doença mais grave. Para este segundo teste da EAE recorrente- remitente, camundongos SJL/J foram imunizados subcutaneamente com PLP139-151 em 1 mg/ml de CFA reforçado com 5mg de H37RA de cepa Mycobacterium tuberculosis inativo por calor, e cem nanogramas de toxina da tosse convulsa foi administrado intraperitonealmente nos dias pós-imunização 0 e 2. O tratamento incluiu injeções intraperitoneais quinzenais de 0,3 mg (15 mg/kg) de anticorpo, separadas nos seguintes grupos: A. Controle (IgG), a partir do dia 0 B. 3D2 a partir do dia 0 C. 3D2 a partir do dia 7 D. 3D2 a partir do ínicio da EAE (pontuação > 2)

[0300] Os resultados para o RR-EAE-2 são ilustrados na Figura 8. Cada ponto de dados representa uma média das pontuações tomadas a partir de 9 camundongos. As médias grupais foram comparadas utilizando ANOVA de fator único seguida por um pós-teste de comparação múltipla de Bonferroni. Diferenças estatisticamente significativas foram observadas entre o controle (IgG de camundongo) e cada grupo tratado com 3D2 (P <0,05), mas não entre os três grupos tratados com 3D2 (P > 0,05). Novamente, o tratamento com 3D2 teve um efeito estatisticamente significativo sobre a gravidade da doença, mesmo quando o tratamento foi iniciado no início dos sintomas da EAE, pontuação > 2 (grupo D).

Exemplo 5 Avaliação de anticorpos anti-CXCL13 no modelo de doenças de camundongo para Lúpus

[0301] Modelo murino de lúpus eritematoso sistêmico (SLE). O SLE é uma doença autoimune que envolve múltiplos órgãos, e é caracterizada pela formação espontânea de centros germinativos ectópicos e produção de autoanticorpos contra um número de antígenos nucleares. O efeito do anticorpo 3D2 anti-CXCL13 foi testado em um modelo murino de lúpus. Camundongos Nova Zelândia Pretos X Nova Zelândia Brancos F1 (NZB/NZWF1) desenvolvem espontaneamente anticorpos anti-dsDNA de título elevado e glomerulonefrite proliferativa grave causada pela formação de complexos imunes nos glomérulos dos rins.

[0302] SLE-1: Tratamento de doença avançada. No teste "SLE- 1", o tratamento iniciado em camundongos NZB/NZWF1 com 24 a 30 semanas de vida com proteinúria de > 2 (o sistema de pontuação de proteinúria é descrito na Tabela 4 abaixo) e o tratamento foi continuado, durante oito semanas.O tratamento inclui injeções intraperitoneais quinzenais de 0,3 mg (15 mg/kg) de 3D2 ou de IgG de camundongo (controle). Quadro 4. Pontuações de proteinúria

[0303] Conforme ilustrado na Figura 9A, o tratamento com 3D2 paralizou a progressão da proteinúria. A análise histológica dos rins utilizando um sistema de pontuação bem definido (Quadro 5) mostrou também um efeito benéfico do tratamento com anti-CXCL13, já que as pontuações da patologia de glomerulonefrite (GN), nefrite intersticial (IN) e vasculite (VI) foram menores no grupo tratado com 3D2 em comparação com o controle (IgG de camundongo). Vide Figura 9B. Quadro 5. Pontuações de patologias renais

[0304] Para pontuações de proteinúria (Figura 9A) e pontuações de patologias renais (Figura 9B), cada ponto de dados representou a média de dez medições. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas (P> 0,05) em ANOVA de fator duplo seguida pelo pós-teste de comparação múltipla de Bonferroni para identificar diferenças estatisticamente significativas (P <0,05).

[0305] SLE-2: Tentativa de prevenção em camundongos com doença precoce (indução de pós-auto-anticorpos, mas antes de proteinúria significativa). No teste "SLE-2", o tratamento foi iniciado em camundongos NZB/NZWF1 com vinte semanas de vida e continuou durante 12 semanas. O tratamento inclui injeções intraperitoneais quinzenais de 0,3 mg (15 mg / kg), quer de 3D2 ou IgG de camundongo (controle). Conforme indicado na Figura 10A, o tratamento com 3D2 resultou na inibição significativa da progressão da proteinúria, particularmente durante as primeiras oito semanas de tratamento. Após oito semanas, zero de sete (0%) camundongos no grupo de tratamento 3D2 e quatro de nove (44%) camundongos no grupo de controle tiveram > 2+ de pontuação de proteinúria. Ao fim de doze semanas de tratamento, a média de proteína na urina foi de 2,1+/-0,2 com tratamento 3D2 contra 3,1+/-0,15 com anticorpo IgG de camundongo (controle).

[0306] As pontuações de patologias renais foram também medidas nos camundongos do grupo tratado com 3D2 e no grupo tratado com IgG de camundongo. Um resumo das pontuações de patologias da glomerulonefrite (GN) e da nefrite intersticial (IN) é ilustrado na Figura 10B.

[0307] Os níveis de proteinúria (Figura 10A) e de pontuações de patologia renal (Figura 10 B) foram medidos em sete camundongos do grupo tratado com 3D2 e 9 camundongos do grupo tratado com IgG de camundongo. A pontuações de proteinúria foram significativamente diferentes entre os grupos (P = 0,0042; ANOVA de fator duplo com o teste de comparação múltipla de Bonferroni). As pontuações de patologia renal não foram significativamente diferentes (P> 0,05). Embora as pontuações de patologia médias não foram significativamente diferentes, houve evidência histológica de doença renal grave em dois dos sete (29%) camundongos no grupo de tratamento 3D2, enquanto quatro dos nove (44%) camundongos no grupo de controle mostraram evidência de doença grave. Observou-se que o bloqueio de CXCL13 pelo 3D2 não impediram o desenvolvimento de auto-anticorpos (dados não ilustrados).

[0308] O efeito do tratamento com 3D2 sobre o número de centros germinativos (GC) e folículos primários no baço de camundongos com lúpus foi avaliado. Seções de baço foram tingidas com GL-7 (tinta GC), anticorpo B220 (marcador de células B) ou um anticorpo contra as células dendríticas foliculares (FDCs) de camundongos NZB/NZWF1 tratados com 3D2 e com IgG de camundongos (controle). O efeito da inibição do CXCL13 na arquitetura linfoide do baço é ilustrado nas Figuras 11A-B. Os folículos primários permaneceram intactos. Os camundongos tratados com 3D2 apresentaram uma diminuição significativa no tamanho e frequência de centros germinativos (CG) espontâneos do baço. Os camundongos tratados com 3D2 ("tx") mostraram uma tendência de diminuição do número de GCs quando expressos como uma razão de folículos primário:secundário (GC) (p=0,19) (Figura 12A) e uma diminuição significativa no tamanho de GC (p=0,03) (Figura 12B). Os valores são apresentados como médias +/- EPM de cinco camundongos por grupo.

[0309] Os resultados SLE acima descritos demonstram que a inibição do CXCL13 pelo anticorpo 3D2 leva à diminuição da nefrite no modelo de lúpus do camundongo NZB/NZWF1, especialmente nas fases iniciais da doença, podendo afetar a arquitetura do baço.

Exemplo 6 Preparação de anticorpos monoclonais anti-CXCL13 quiméricos e humanizados

[0310] Isolamento de genes V hibridoma do 3D2 e clonagem do anticorpo 3D2 quimérico. Um anticorpo 3D2 de camundongo foi usado como um protótipo para a geração de um anticorpo monoclonal quimérico anti-CXCL13. Os genes variáveis (V) foram isolados a partir de um hibridoma 3D2 utilizando métodos padrão. As sequências de polinucleotídeos e de aminoácidos de cadeia pesada (H1609) e da cadeia leve (L0293) do 3D2 são apresentados na Figura 13. As regiões determinantes de complementaridade de VH e VK (CDRs) estão sublinhadas (SEQ ID NOs: 4, 5, 6, 9, 10 e 11, respectivamente).

[0311] O gene variável pesado (VH) foi clonado em um vetor de expressão de mamífero que continha o gene humano de cadeia pesada gama 1, criando uma cadeia pesada quimérica de extensão completa. O gene variável leve (VK) foi clonado em um vetor de expressão de mamífero que tinha o gene constante Kappa humano, criando uma cadeia leve quimérica de extensão completa. A fim de produzir o anticorpo quimérico, os vetores de expressão contendo a cadeia pesada quimérica e a cadeia leve quimérica foram cotransfectados em células CHO-S. O anticorpo monoclonal (MAb) que foi produzido foi segregado a partir das células e colhido após um período de expressão de 3 a 6 dias. O MAb resultante foi purificado utilizando cromatografia de Proteína A e caracterizado. O anticorpo quimérico IgG1 resultante ("MAb 1476") demonstrou ser específico para o CXCL13 humano e de camundongos por meio de ELISA, demonstrou ter afinidade semelhante no CXCL13 de camundongos e humanos, e demonstrou ter atividade funcional semelhante à do anticorpo do camundongo progenitor, 3D2 (dados não ilustrados). Além disso, o MAb 1476 foi capaz de competir com 3D2 e 3C9 biotinilado para se ligar ao CXCL13 de camundongos e humanos em um ELISA de competição de epítopos (dados não ilustrados).

[0312] Humanização do 3D2 quimérico (MAb 1476). A humanização do anticorpo 3D2 quimérico se resume abaixo. As modificações que foram introduzidas para regiões estruturais (FWR) das cadeias pesada (H1609) e leve (L0293) a partir do MAb 1476 quimérico são ilustradas nas Figuras 14A e 14B, respectivamente. Um local de glicosilação putativo ligado a N (Asn-Leu-Thr) em H1609 foi substituído com Ser-Leu-Thr (Figura 14A). A mutação não afetou a afinidade de anticorpos (vide Quadro 6) e resultou na geração de "MAb 5080". A fim de melhorar a afinidade e a funcionalidade do Mab 5080, foram produzidos diversos mutantes de região variável, os quais foram identificados por ELISA IC50 no CXCL13 humano. Uma única mutação de Serina (S) a Metionina (M) na posição 31 no L5055- CDR1, bem como alterações na região estrutural da cadeia leve (vide Figuras 14B e 15) resultou na geração de "MAb 5261", que mostrou uma significativa melhoria na afinidade em comparação com o MAb 3D2 e 5080 (Quadro 6). Uma comparação das sequências de aminoácidos de H1609 (SEQ ID NO: 3) e H2177 (SEQ ID NO: 13) é ilustrada na Figura 14A e uma comparação de L0293 (SEQ ID NO: 8), L5055 (SEQ ID NO: 17) e L5140 (SEQ ID NO: 15) é ilustrada na Figura 14B. Quadro 6. Afinidade de anticorpos para CXCL13 recombinante de humanos e camundongos

As sequências de aminoácidos e polinucleotídeos do MAb 5080 de VH e VK: H2177 (SEQ ID NO: 13) e L5055 (SEQ ID NO: 17), respectivamente, e do MAb 5261 VH e VK: H2177 (SEQ ID NO: 12) e L5140 (SEQ ID NO: 15), respectivamente, são ilustradas na Figura 15.

[0313] Especificidade de MAb 5261 para CXCL13: De forma similar ao 3D2, a especificidade do MAb 5261 foi avaliada por ELISA de especificidade e ELISA de competição de epítopos de captura em um painel que inclui quimiocinas recombinantes (CXCL13 recombinante de humanos, camundongos e macacos cinomolgos, IL-8/CXCL8 humano, IP-10/CXCL10 humano, MIG/CXCL9 humano e SDF-1alpha/CXCL12 humano), CCL13 nativo de humanos e camundongos, além de vários antígenos não-específicos (C35 humano recombinante, estreptavidina, albumina sérica bovina (BSA), albumina do soro humano (HAS) , insulina, hemoglobina).

[0314] Para a especificidade ELISA, cada um dos CXCL13 recombinantes de humanos, camundongos e macacos cinomolgos foram revestidos em 100 nM. O MAb 5261 demonstrou especificidade multi-espécie a CXCL13 (Figuras 16A-C). A ligação do MAb 5261 em CXCL13 recombinante de humanos (Figura 16A) e macacos cinomolgos (Figura 16B) foi comparável à ligação de seu "progenitor" direto, MAb 5080, e mais forte do que a ligação do MAb 1476 (3D2 quimérico). O MAb 5261 foi significativamente superior na ligação com CXCL13 recombinante de camundongos em comparação tanto com o MAb 1476 como com o MAb 5080 (Figura 16C). Os pontos de dados para cada quimiocina representam a média de medições em triplicado. Os valores de EC50 foram calculados a partir de ajustes da curva sigmoidal de quatro parâmetros (as curvas são ilustradas no gráfico; os R2 para as curvas que produziram valores de EC50 foram de 0,99).

[0315] O MAb 5261 que se liga a um CXCL13 nativo de humanos e camundongos foi determinado por ELISA de competição de epítopos de captura. Para o ELISA de humanos, CXCL13 humano (1:4 de diluição de sobrenadante de THP1 ou 0,097 nM) foi capturado com 6,6 nM MAb 801 e detectado com 0,66 nM de biotina-3C9. Para o ELISA de camundongos, CXCL13 de camundongo (1:4 de diluição de extrato órgão TNF-Tg) foi capturado com 33 nM de MAb 470 e detectado com 3,3 nM de biotina-3D2. Cada ponto de dados representa uma média de medições duplicadas de pelo menos um de três experimentos independentes. Ao ser testado em ELISA de competição de epítopos de captura em CXCL13 nativos de humanos (Figura 17A) e de camundongos (Figura 17B), o MAb 5261 demonstrou superioridade em relação a ambos os anticorpos 3D2 e MAb 5080 para a ligação com CXCL13 nativo de humanos e camundongos. As curvas ilustradas nas Figuras 17A-B foram ajustadas utilizando um ajuste de curva sigmoidal de quatro parâmetros (R 2 = 0,99).

Exemplo 7 Caracterização funcional de MAb 5261 anti-CXCL13

[0316] Inibição da migração de células B de humanos e camundongos. A capacidade do MAb 5261 para inibir a quimiotaxia de células B humanas induzidas por CXCL13 de humanos foi testada tanto na linha celular humana estável pré- B-697-hCXCR5 como nas células tonsilares humanas primárias.

[0317] A inibição do MAb 5261 da quimiotaxia de células B humanas induzida por CXCL13 de humanos na linha celular humana estável pré-B-697-hCXCR5 foi testada utilizando o protocolo descrito no Exemplo 2 acima. A inibição da migração celular pré-B-697-hCXCR5 humana pelo MAb 5261 é ilustrada na Figura 18A. Para os testes de células tonsilares humanas primárias, as células tonsilares foram obtidas por dissociação mecânica do tecido. As células (106/câmara superior de placa Transwell de 5 μm) puderam migrar para 5 μg/ml de CXCL13 humano durante 2 horas a 37 °C). A inibição da migração de células tonsilares primárias humanas pelo MAb 5261 é ilustrada na Figura 18B. Os resultados ilustrados nas Figuras 18A-B representam uma média de medições triplicadas +/- EPM de um de pelo menos três experimentos. As curvas foram ajustadas utilizando um ajuste de curva sigmoidal de quatro parâmetros (R2 = 0,98-0,99).

[0318] O efeito do MAb 5261 na quimiotaxia de células B de camundongos mediada por CXCL13 de camundongos foi avaliada em esplenócitos de camundongos C57Black/6 e SJL/J, conforme descrito no Exemplo 2 acima. Mais uma vez, a migração rumo a um SDF-1α (0.1 μg/ml) humano ou murino foi utilizada como controle para assegurar a especificidade do CXCL13 do efeito do anticorpo (dados não apresentados). A inibição da migração de esplenócitos pelo MAb 5261 é ilustrada na Figura 19 (os dados dos experimentos representativos são apresentados como a média de medições em duplicado +/- DP). Os valores de inibição da migração foram calculados com base nos valores obtidos com os isotipos de controle correspondentes.

[0319] Conforme indicado nas Figuras 18 e 19, o MAB 5261 inibiu a quimiotaxia dependente de CXCL13 tanto de humanos como de camundongo. As diferenças nos valores de EC50 entre células de cultura e primárias (vide Figura 18) poderiam ser atribuídas a diferenças nas concentrações de CXCL13 de humanos, por ex., 97 nM (1 μg/ml) foi usada na migração de células pré-B-697-hCXCR5 e 485 nM (5 μg/ml) foi usada na migração celular tonsilar humana.

[0320] Inibição da endocitose mediada por CXCL13 de humanos do receptor CXCR5 humano. Este experimento foi realizado utilizando células humanas pré-B-697-hCXCR5 tratadas com CXCL13 de humanos para induzir a endocitose do receptor CXCR5 de humanos de acordo com os métodos descritos acima no Exemplo 3. A quantidade de CXCL13 humano foi de 2 μM, resultando maior do que a quantidade utilizada no ensaio de endocitose do 3D2 (ou seja, 0,485 μM) indicado no Exemplo 3. Portanto, foram observadas diferenças nos valores de EC50. A inibição da endocitose do receptor CXCR5 pelo MAb 5261 é ilustrada na Figura 20. Os resultados são apresentados como a média de medições em triplicado de um dos pelo menos três experimentos independentes. A curva foi ajustada utilizando um ajuste de curva sigmoidal de quatro parâmetros (R2 = 0,99).

Exemplo 8 Geração e caracterização de uma versão murina do MAb 5261 anti-CXCL13

[0321] O MAb 5261 contém regiões variáveis leves e pesadas e alótipo IgGamma1-F humano, bem como kappa humano. Uma contraparte murina ("MAb 5378") foi projetada com IgG2a de camundongos (cadeia 2a Gamma). O isotipo IgG2a possui grandes semelhanças com o IgG1 humano, incluindo a capacidade de fixar o complemento e de se ligar ao receptor Fc. O MAb 5378 contém os mesmos genes variáveis de cadeia pesada e leve humanos que o MAb 5261 juntamente com a constante IgG2a de camundongo e kappa de camundongo, respectivamente.

[0322] Um local de restrição em comum entre os plasmídeos de expressão da cadeia pesada e leve foi utilizado para permitir a mudança de isotipos. A geração de isotipos das espécies foi obtida através de digestão de restrição, ligação e transformação. Especificamente, para a cadeia pesada do MAb 5261, a região variável do gene foi digerida com endonucleases de restrição e ligada em locais comparáveis em um plasmídeo de expressão que continha a região constante do IgG2a de camundongo, a fim de formar a cadeia pesada para p MAb 5378 (H5188). Da mesma forma, para a cadeia leve do MAb 5261, a região variável do gene foi digerida com endonucleases de restrição e ligada em locais comparáveis em um plasmídeo de expressão que contém a região constante IgKappa de camundongo, a fim de formar a cadeia leve para o mAb 5378 (L5153). As sequências de polipeptídeos e aminoácidos das regiões variáveis das cadeias leve e pesada do MAb 5378 são idênticas às do MAb 5261 e são ilustradas na Figura 21. As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) VH e VK estão sublinhadas (SEQ ID NOs: 4, 5, 6, 16, 10 e 11, respectivamente).

[0323] Medições de afinidade do MAb 5378. As medições de afinidade do MAb 5378 para CXCL13 recombinante humano e de camundongo foram medidas com BIACORE® utilizando métodos semelhantes aos descritos no Exemplo 1. A afinidade do MAb 5378 para CXCL13 recombinante de humanos e de camundongos foi comparado com o MAb 5261 e o 3D2. conforme indicado na Quadro 7, as medições de afinidade (nM) do MAb 5261 e 5378 tanto para as quimiocinas humanas como para as de camundongo foram significativamente melhoradas em comparação com o 3D2. Quadro 7. Afinidades de 5261, 5378 e 3D2 para CXCL13 recombinante de humanos e camundongos

[0324] Mapeamento de epítopos do MAb 5378. Um experimento ELISA de competição de epítopos foi realizado para determinar se o MAb 5378 compartilhou um epítopo de ligação no CXCL13 de camundongo com o MAb 5261. CXCL13 recombinante de camundongo foi capturado na placa com 1 μg/ml de MAb 470, 5378 ou 5261 (controle). Interações anticorpo/quimiocina foram detectadas com 0,5 μg/ml (3,3 nM) de MAb biotinilado 5261 seguido por estreptavidina-HRP. Anticorpo comercial MAb 470 anti- camundongo de rato também foi incluído no teste. A capacidade do CXCL13 de camundongo, pré-incubado ou com o MAbs 470 ou 5378, para se ligar ao MAb 5261 biotinilado foi avaliada por ELISA de competição de epítopos. Foi demonstrado (Figura 22) que o MAb 5378 compartilhou um epítopo de ligação de CXCL13 de camundongo com o MAb 5261, mas não com o MAb 470. Assim, o MAb 5378 provou reter epítopo de ligação e afinidade, o que foi necessário para que o MAb 5378 fosse utilizado como um substituto para o MAb 5261 em testes de modelos animais. Além disso, os resultados de ligação de epítopos descritos em todos os exemplos podem ser resumidos como indicando que 3D2, 3C9, MAb 1476, MAb 5080, MAb 5261 e MAb 5378 se ligam todos ao mesmo epítopo do CXCL13 humano.

[0325] Especificidade do MAb 5378 para CXCL13. A especificidade do MAb 5378 foi avaliada em CXCL13 recombinante de humanos, camundongos e macacos cinomolgos (Figura 23) e um painel de quimiocinas e de vários antígenos recombinantes (quimiocinas recombinantes (CXCL13 recombinante de humanos, camundongos e macacos cinomolgos, IL-8/CXCL8 humano, IP- 10/CXCL10 humano, MIG/CXCL9 humano e SDF-1alpha/CXCL12 humano); CCL13 nativo de humanos e camundongos, além de vários antígenos não-específicos (C35 humano recombinante, estreptavidina, albumina sérica bovina (BSA), albumina do soro humano (HAS) , insulina, hemoglobina) (dados não ilustrados). O ELISA de especificidade foi realizado conforme descrito no Exemplo 1. Em particular, cada quimiocina foi revestida a 100 nM. Conforme indicado na Figura 23, o MAb 5378 foi comparado ao anticorpo de camundongo 3D2 e ao controle (IgG de camundongo). O MAb 5378 foi superior ao 3D2, em grau variável, ao ligar-se com as quimiocinas de todas as três espécies. As diferenças mais significativas na ligação foram observadas quando o CXCL13 de camundongo demonstrou a vantagem potencial do MAb 5378 sobre o 3D2 em testes com animais. Cada ponto de dados representa a média de medições triplicada. Os valores de EC50 foram calculados a partir de ajustes de curva sigmoidal de quatro parâmetros (os R2 para as curvas que produziram valores de EC50 foram de 0,99).

[0326] A inibição da migração de células B de humanos e de camundongos foi testada para o MAb 5378. A capacidade do MAb 5378 para interferir na quimiotaxia dependente de CXCL13 das células B de camundongos e humanos foi testada em ensaios de migração envolvendo células humanas cultivadas (células humanas pré-B-697-hCXCR5; Figura 24A) e primárias (células tonsilares humanas; Figura 24B), bem como esplenócitos de camundongo (Figura 24C), utilizando os métodos descritos nos Exemplos 2, 7 e 2, respectivamente. As concentrações de quimiocinas foram: 97 nM de huCXCL13 para a migração de pré-B- 697-huCXCR5 humana; 485 Nm de huCXCL13 para a migração de células tonsilares humanas; e 500 Nm de muCXCL13 para a migração de esplenócitos de camundongo. A migração rumo a SDF- 1alfa humano ou murino foi utilizada como um controle negativo (não ilustrado). Os valores de inibição da migração foram calculados com base nos valores obtidos com os isotipos de controle correspondentes. Os resultados ilustrados nas Figuras 24A-C representam uma média de medições em triplicado +/- EPM de um de pelo menos três experimentos. As curvas foram ajustadas utilizando ajuste da curva sigmoidal de quatro parâmetros (R 2 = 0,99). Nos ensaios de migração humana, o MAb 5378 foi comparado com o MAb 5261 e nos ensaios de migração de camundongos, o MAb 5378 foi comparado com o 3D2. Em ambos os casos, o MAb 5378 inibiu com sucesso a migração de células de humanos e camundongos induzida por CXCL13 em um grau comparável ao MAb 5261 e ligeiramente superior ao 3D2.

[0327] Inibição da endocitose mediada por CXCL13 humano do receptor CXCR5 humano. O MAb 5378 foi comparado com seu protótipo MAb 5261 e com o anticorpo 3D2 de CXCL13 anti-humano de camundongo em ensaio de internalização do receptor CXCR5 humano mediado por CXCL13 humano, utilizando os métodos descritos no Exemplo 3. Conforme indicado na Figura 25, o MAb 5378 foi idêntico ao MAb 5261 e significativamente superior ao 3D2 na sua capacidade para inibir a internalização do receptor CXCR5 humano. Os pontos de datos para o MAb 5261 e MAb 5378 representam a média de medições de dois experimentos independentes. Os pontos de dados para o 3D2 e os isotipos de controle representam a média de medições em triplicado a partir de um único experimento. A curva foi ajustada utilizando ajuste de curva sigmoidal de quatro parâmetros (R 2 = 0,99).

Exemplo 8 Avaliação de anticorpos anti-CXCL13 no modelo de doença de camundongo para a artrite reumatoide

[0328] Modelo murino de artrite reumatoide. Artrite induzida por colágeno (CIA) em camundongos e ratos é um modelo bem estabelecido de artrite reumatoide humana (RA).A doença é normalmente induzida por injeção intradérmica de colágeno bovino tipo II emulsificado em adjuvante completo de Freund (CFA) e é caracterizada pela produção de anticorpos de colágeno de camundongos e, consequentemente, pelo desenvolvimento progressivo de artrite nas patas.

[0329] CIA-1: eficácia antiartrítica do MAb 5378 no modelo CIA utilizando camundongos DBA1/J. A doença foi induzida em camundongos DBA1/J pela imunização subcutânea com 100 □ g de CFA reforçada com 100 □ g de H37Ra M. tuberculosis morto pelo calor, seguido por imunização de reforço no dia 21 com 100 □ g de colágeno de bovino de tipo II em adjuvante incompleto de Freund (IFA).Os animais receberam pontuações com respeito aos sinais macroscópicos de artrite (vide Quadro 8) três vezes por semana e o índice artrítico (AI) foi calculado por adição das pontuações individuais da pata (o índice de artrite máximo que pode ser alcançado em um determinado animal foi de 16). Quadro 8. Sinais macroscópicos de CIA em camundongos

[0330] O tratamento profilático começou um dia antes da imunização de reforço, isto é, no dia 20 de pós-indução de animais com baixa AI de 2-6, e consistiu nos seguintes grupos de tratamento (10 camundongos por grupo): A. Isotipo IgG de camundongo (controle) B. MAb 5378 C. etanercepte (inibidor de TNF, controle positivo)

[0331] Os camundongos tinham recebido injeções intraperitoneais (IgG de camundongo e MAb 5378) ou subcutâneas (etanercepte) de 0,6 mg (30 mg/kg) de anticorpo duas vezes por semana, durante três semanas. O teste foi encerrado no dia 41 pós-indução.

[0332] Conforme indicado na Figura 26, o tratamento profilático com MAb 5378 resultou em uma diminuição da taxa de desenvolvimento da doença e uma inibição significativa da gravidade da doença, o que se tornou evidente no final do teste. Diferenças estatisticamente significativas foram observadas no final do teste (dia 41) entre grupos tratados com IgG de camundongo e MAb 5378 (P<0,05) e grupos tratados com IgG de camundongo e etanercepte (P<0,05). O efeito inibitório do MAb 5378 não foi estatisticamente diferente do efeito inibitório do agente etanercepte de controle positivo (P>0,05).

[0333] CIA-2: eficácia antiartrítica do MAb 5378 no modelo da CIA de camundongos DBA1/J. Um segundo teste da CIA com MAb 5378, "CIA-2", foi realizado. Nesse teste, a doença foi induzida em camundongos DBA1/J, conforme descrito acima para a CIA-1. Mais uma vez o tratamento profilático começou um dia antes da imunização de reforço, no dia 20 pós-indução em animais com baixo AI de 2-6. Além do etanercepte, anticorpo comercial MAb 470 com CXCL13 anti-murino de ratos foi utilizado como controle. O teste, por conseguinte, incluiu os seguintes grupos: A. Isotipo de controle de IgG de camundongo B. MAb 5378 C. etanercepte (inibidor de TNF, controle positivo) D. MAb 470

[0334] Os camundongos receberam injeções intraperitoneais (IgG de camundongo, MAb 470 e MAb 5378) ou subcutâneas (etanercepte) de 0,6 mg (30 mg/kg) de anticorpo duas vezes por semana, durante três semanas. O teste foi encerrado no dia 42 pós-indução.

[0335] Como é evidente a partir da Figura 27, o tratamento profilático com MAb 5378 resultou novamente em uma diminuição da taxa de desenvolvimento da doença e uma inibição significativa da gravidade da doença ao longo do teste, bem como no ponto final (Dia 42). Diferenças estatisticamente significativas foram entre grupos tratados com IgG de camundongo e MAb 5378 (P<0,05) e grupos tratados com IgG de camundongo e etanercepte (P<0,05). O efeito inibitório do MAb 5378 não foi estatisticamente diferente dos efeitos inibitórios do agente etanercepte de controle positivo e do anticorpo MAb 470 com CXCL13 anti-murino de ratos (P> 0,05).

[0336] GC-1: Efeito do MAb 5378 na formação de centros germinativos em camundongos BALB/c imunizados. Dado o bom desempenho dos nossos anticorpos anti-CXCL13 em modelos animais de autoimunidade, o possível mecanismo de ação envolvendo a interrupção da formação de centros germinativos ectópicos foi testado. Centros germinativos em camundongos BALB/c tratados com MAb 5378 imunizados com 100 μg de 4- hidroxi-3-nitrofenilacetil-galinha-g-globulina (NP-CGG) precipitado em 100 ul de alúmen foram examinados. Os animais receberam injeções intraperitoneais por um total de 0,6 mg (30 mg/kg) por semana de isotipo de controle de camundongos (com injeções semanais de 0,6 mg) ou de MAb 5378 (injeções quinzenais de 0,3 mg). As injeções começaram uma semana antes e continuaram até uma semana após a imunização NP-CCG. A formação de um centro germinativo foi avaliada no dia 10 pós- desafio. Suspensões de células isoladas de baços e nódulos linfáticos foram analisadas por citometria de fluxo para detectar a presença de várias células B (células B com GC ativado; células B foliculares e de zona marginal) e subconjuntos de células T (CD4+ e CD8+). Embora o MAb 5378 não tenha produzido efeito sobre as células T ou células B foliculares e de zona marginal (dados não ilustrados), as células B do centro germinal (B220+/ CD38low/PNA+) foram reduzidas em baços e os nódulos linfáticos em 43% e 41%, respectivamente (Figura 28). As médias dos grupos de baços foram comparadas utilizando um teste t de Student não-pareado. A redução das células GC-B foi estatisticamente significativa nos baços tratados com MAb 5378 em comparação com o grupo tratado com IgG de camundongo (P<0,05). As células recuperadas a partir de nódulos linfáticos foram muito poucas e, por conseguinte, elas foram agrupadas (como resultado, nenhuma análise estatística foi realizada com os dados dos nódulos linfáticos).

Exemplo 9 Avaliação de anticorpos anti-CXCL13 em modelo de camundongo para a infecção por Helicobacter

[0337] Modelo murino de infecção por Helicobacter. Espécies Heliobacter como H. heilmannii e H. Pylori induzem linfoma gástrico MALT em pacientes. Um modelo de camundongo de folículos linfoides gástricas induzidos por Heliobacter foi descrito em Nobutani et ai., FEMS Immunol Med Microbiol 60 :156-164 (2010), o qual é aqui incorporado por referência na sua totalidade. O modelo de camundongo Nobutani et al. foi aqui utilizado para testar o efeito do anticorpo anti-CXCL13 na redução folículos linfoides gástricos. O cronograma de tratamento para infecção por H. heilmannii de camundongos e a administração do anticorpo utilizado neste Exemplo são ilustrados na Figura 29.

[0338] Em particular, camundongos C57BL/6J foram infectados com H. heilmannii. Começando uma semana após a infecção, administrou-se aos camundongos anticorpo isotipo de controle ou anticorpo anti-CXCL13 (mAb 5378) semanalmente durante 12 semanas. MAb 5378 anti-CXCL13 (IgG2a de isotipo de camundongo) foi formulado em PBS, pH 7,2 a 3 mg/ml. Os camundongos receberam injeções com 200 microlitros (600 microgramas) por via intraperitoneal começando no dia 7 pós-infecção e depois semanalmente. O isotipo de controle era um anticorpo IgG2a monoclonal independente de camundongos.

[0339] As amostras gástricas dos camundongos foram avaliadas por PCR para detectar a expressão de genes rRNA 16s específicos de H. heilmannii para confirmar a infecção. As reações de amplificação por PCR envolveram um tampão de reação 1x [20 mM Tris / HCl (pH 8,0), KCl 100 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM, 0,5% de Tween-20, 0,5% de Nonidet P40 e glicerol a 50%], contendo uma unidade de Taq DNA polimerase (TOYOBO, Osaka, Japão), 10 nmol de cada trifosfato de desoxinucleótido, 10 pmol de cada iniciador oligonucleotídico, e 1 ul do DNA diluído, o qual foi preparado por diluição de 1:10 das amostras originais com uma concentração de DNA de cerca de 20- 100 ng / mL, em um volume final de 50 μl. As condições cíclicas para as reações de rRNA 16s envolveram 35 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 56 °C durante 30 segundos e 72 °C durante 30 segundos.

[0340] Os primers PCR de genes rRNA 16s específicos de H. heilmannii são apresentados a seguir: F: 5'-TTGGGAGGCTTTGTCTTTCCA-3 '(SEQ ID NO: 24) R: 5'-GATTAGCTCTGCCTCGCGGCT-3 '(SEQ ID NO: 25)

[0341] Os resultados para a expressão dos genes rRNA 16s específicos de H. heilmannii amplificados em todas as amostras gástricas obtidas a partir de camundongos infectados com H. heilmannii são ilustrados na Figura 30. Esses resultados mostram que todos os camundongos tratados foram positivos para a infecção com H. heilmannii.

[0342] Expressão do CXCL13 na mucosa gástrica de camundongos infectados com Helicobacter. Os níveis de expressão de mRNA do CXCL13 na mucosa gástrica de camundongos infectados e não-infectados com H. heilmannii foram determinados por PCR em tempo real quantitativa. A expressão de mRNA do CXCL13 na mucosa gástrica por camundongos infectados com H. heilmannii em comparação com camundongos de controle não-infectados do tipo selvagem, um mês e três meses após a infecção, é ilustrada nas Figuras 31A e 31B, respectivamente. Esses resultados mostram um aumento na expressão do CXCL13 em camundongos infectados com H. heilmannii.

[0343] Expressão do CXCL13 na mucosa gástrica de camundongos infectados com Helicobacter tratados com anticorpos. Os níveis de expressão de mRNA do CXCL13 na mucosa gástrica de camundongos infectados com H. heilmannii após o tratamento com o isotipo de controle ou anticorpo anti-CXCL13 foram determinados por transcrição de PCR inversa. As camadas da mucosa e submucosa do estômago foram removidas da muscularis e serosa e, em seguida, homogeneizadas com 1 ml de Regente TRIZOL (Invitrogen). O RNA foi extraído a partir dos homogeneizados de acordo com as instruções do fabricante. O RNA foi submetido à reação de transcrição reversa, utilizando um kit de transcrição reversa de cDBA de alta capacidade (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. As reações de amplificação por PCR envolveram um tampão de reação 1x [20 mM Tris / HCl (pH 8,0), KCl 100 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM, 0,5% de Tween-20, 0,5% de Nonidet P40 e glicerol a 50%], contendo uma unidade de Taq DNA polimerase (TOYOBO, Osaka, Japão), 10 nmol de cada trifosfato de desoxinucleótido, 10 pmol de cada iniciador oligonucleotídico, e 1 ul do DNA diluído, o qual foi preparado por diluição de 1:10 das amostras originais com uma concentração de DNA de cerca de 20-100 ng / mL, em um volume final de 50 μl. As condições cíclicas para as reações de CXCL13 e β-atina envolveram 94 °C durante 2 min., 35 ciclos de 94 C durante 30 segundos, 55 C durante 30 segundos e 72 C durante 1 min.

[0344] A Figura 32 mostra a expressão do CXCL13 e RNAm β- atina de controle no estômago por camundongos infectados com H. heilmannii após tratamento com isotipos de controle ou com anticorpos anti-CXCL13. Estes resultados mostram que a CXCL13 não foi expresso em camundongos de tipo selvagem não infectados, mas foi expresso em todos os camundongos infectados com H. heilmannii.

[0345] Tratamento com o anticorpo anti-CXCL13 reduz folículos linfoides gástricas em camundongos infectados por Helicobacter. Os estômagos dos camundongos três meses após a infecção por H. heilmannii foram ressecados e abertos em uma curvatura maior. Metade do estômago foi embebido em cera de parafina, e os tecidos embebidos em parafina foram cortadas e tingidos com hematoxilina e eosina (H&E).A Figura 33 mostra imagens tingidas com H&E do estômago dos camundongos tratados com isotipo de controle (painel à esquerda) e com anticorpo anti-CXCL13 (painel à direita). O número de folículos linfoides gástricos foi contado para as amostras do isotipo de controle e do anticorpo anti-CXCL13. Os resultados são apresentados no painel inferior da Figura 33. Esses resultados mostram uma redução nos folículos gástricos em camundongos infectados tratados com H. heilmannii tratados com anticorpo anti-CXCL13 em relação ao tratamento de controle.

[0346] A descrição anterior das configurações específicas revelará tão completamente a natureza geral da invenção que outros podem, por aplicação do conhecimento dentro da especialidade, prontamente modificar e/ou adaptar para várias outras aplicações essas configurações especificas, sem experimentação excessiva e sem se afastarem do conceito geral da presente invenção. Por conseguinte, essas adaptações e modificações pretendem estar dentro do significado e alcance de equivalência com respeito às configurações divulgadas e com base nos ensinamentos e orientações aqui apresentados. Deve-se compreender que a fraseologia ou terminologia aqui utilizada é para o propósito de descrição e não de limitação, de tal modo que a terminologia ou fraseologia da presente especificação deve ser interpretada pelo especialista à luz dos ensinamentos e orientações.

[0347] A amplitude e o escopo da presente invenção não devem ser limitados por nenhuma das configurações exemplificativa acima descritas, mas devem apenas ser definidos de acordo com as seguintes reivindicações e seus equivalentes.

Claims

1. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao CXCL13 caracterizado por a região de cadeia pesada (VH) do referido anticorpo ou de seu fragmento compreender a sequência de aminoácidos da região determinante de complementaridade de cadeia pesada variável (VH-CDR) 1, VH-CDR2 e VH-CDR3 compreendendo as SEQ ID Nos: 4, 5 e 6, respectivamente; e em que a região variável de cadeia leve (VL) do referido anticorpo ou de seu fragmento compreende a sequência de aminoácidos da região determinante de complementaridade de cadeia leve variável (VL-CDR) 1, VL-CDR2 e VL-CDR3 compreendendo as SEQ ID Nos: 9 ou 16, 10 e 11, respectivamente.

2. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por: a) a VH do referido anticorpo ou de seu fragmento compreender uma sequência de aminoácidos que idêntica à SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 3; b) a VL do referido anticorpo ou de seu fragmento compreender uma sequência de aminoácidos que é idêntica à SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 8; c) a VH e a VL do referido anticorpo ou de seu fragmento compreender sequências de aminoácidos que são idênticas a sequências de VH e VL selecionadas a partir do grupo que consiste em: (i) SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 15, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 17, respectivamente; e (iii) SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 8, respectivamente.

3. Composição caracterizada por compreender o anticorpo ou seu fragmento conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que: a) a sequência de aminoácidos do polipeptídeo VH é idêntica à SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 3; b) a sequência de aminoácidos do polipeptídeo VL é idêntica à SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 17; c) o polipeptídeo VH e o polipeptídeo VL compreendem sequências de aminoácidos idênticas às sequências VH e VL selecionadas a partir de: (i) SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 15, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 17, respectivamente; e (iii) SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 8, respectivamente.

5. Uso de uma composição caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para neutralizar o CXCL13 em um animal, sendo que essa composição compreende um anticorpo ou seu fragmento que se liga especificamente ao CXCL13, sendo que a região de cadeia pesada (VH) do referido anticorpo ou de seu fragmento compreende a sequência de aminoácidos da região determinante de complementaridade de cadeia pesada variável (VH-CDR) 1, VH-CDR2 e VH-CDR3 compreendendo as SEQ ID Nos: 4, 5 e 6, respectivamente; e em que a região variável de cadeia leve (VL) do referido anticorpo ou de seu fragmento compreende a sequência de aminoácidos da região determinante de complementaridade de cadeia leve variável (VL-CDR) 1, VL-CDR2 e VL-CDR3 compreendendo as SEQ ID Nos: 9 ou 16, 10 e 11, respectivamente.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por: a) a VH do referido anticorpo ou de seu fragmento compreender uma sequência de aminoácidos que é idêntica à SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 3; b) a VL do referido anticorpo ou de seu fragmento compreender uma sequência de aminoácidos que é idêntica à SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 8; c) a VH e a VL do referido anticorpo ou de seu fragmento compreender sequências de aminoácidos que são idênticas a sequências de VH e VL selecionadas a partir do grupo que consiste em: (i) SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 15, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 17, respectivamente; e (iii) SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 8, respectivamente.

7. Uso de uma composição caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para tratar um câncer, uma doença autoimune ou uma doença inflamatória em um animal que precise de tratamento, sendo que essa composição contém um anticorpo ou seu fragmento que se liga especificamente ao CXCL13, sendo que a região de cadeia pesada (VH) do referido anticorpo ou de seu fragmento compreende a sequência de aminoácidos da região determinante de complementaridade de cadeia pesada variável (VH-CDR) 1, VH-CDR2 e VH-CDR3 compreendendo as SEQ ID Nos: 4, 5 e 6, respectivamente; e em que a região variável de cadeia leve (VL) do referido anticorpo ou de seu fragmento compreende a sequência de aminoácidos da região determinante de complementaridade de cadeia leve variável (VL-CDR) 1, VL-CDR2 e VL-CDR3 compreendendo as SEQ ID Nos: 9 ou 16, 10 e 11, respectivamente.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por: a) a VH do referido anticorpo ou de seu fragmento compreender uma sequência de aminoácidos que é idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 3; b) a região variável da cadeia leve (VL) do referido anticorpo ou de seu fragmento compreender uma sequência de aminoácidos que é idêntica a uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 8; c) a VH e a VL do referido anticorpo ou de seu fragmento compreender sequências de aminoácidos que são idênticas a sequências de VH e VL selecionadas a partir do grupo que consiste em: (i) SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 15, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 17, respectivamente; e (iii) SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 8, respectivamente.

9. Uso de uma composição caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para inibir folículos linfólicos gástricos em um animal, sendo que essa composição contém um anticorpo ou seu fragmento que se liga especificamente ao CXCL13, sendo que a região de cadeia pesada (VH) do referido anticorpo ou de seu fragmento compreende a sequência de aminoácidos da região determinante de complementaridade de cadeia pesada variável (VH- CDR) 1, VH-CDR2 e VH-CDR3 compreendendo as SEQ ID Nos: 4, 5 e 6, respectivamente; e em que a região variável de cadeia leve (VL) do referido anticorpo ou de seu fragmento compreende a sequência de aminoácidos da região determinante de complementaridade de cadeia leve variável (VL-CDR) 1, VL-CDR2 e VL-CDR3 compreendendo as SEQ ID Nos: 9 ou 16, 10 e 11, respectivamente.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por: a) a região variável da cadeia pesada (VH) do referido anticorpo ou de seu fragmento compreender uma sequência de aminoácidos que é idêntica à SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 3; b) a região variável da cadeia leve (VL) do referido anticorpo ou de seu fragmento compreender uma sequência de aminoácidos que é idêntica à SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 8; c) a VH e a VL do referido anticorpo ou de seu fragmento compreender sequências de aminoácidos que são pelo menos 90% idênticas a sequências de VH e VL selecionadas a partir do grupo que consiste em: (i) SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 15, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 17, respectivamente; e (iii) SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 8, respectivamente.

11. Uso de uma composição caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para prevenir ou tratar uma úlcera gástrica ou duodenal ou um linfoma do tecido linfoide associado a mucosas (MALT) em um animal que precise de prevenção ou tratamento, sendo que essa composição contém um anticorpo ou seu fragmento que se liga especificamente ao CXCL13, sendo que a região de cadeia pesada (VH) do referido anticorpo ou de seu fragmento compreende a sequência de aminoácidos da região determinante de complementaridade de cadeia pesada variável (VH-CDR) 1, VH-CDR2 e VH-CDR3 compreendendo as SEQ ID Nos: 4, 5 e 6, respectivamente; e em que a região variável de cadeia leve (VL) do referido anticorpo ou de seu fragmento compreende a sequência de aminoácidos da região determinante de complementaridade de cadeia leve variável (VL-CDR) 1, VL-CDR2 e VL-CDR3 compreendendo as SEQ ID Nos: 9 ou 16, 10 e 11, respectivamente.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por: a) a região variável da cadeia pesada (VH) do referido anticorpo ou de seu fragmento compreender uma sequência de aminoácidos que é idêntica à SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 3; b) a região variável da cadeia leve (VL) do referido anticorpo ou de seu fragmento compreender uma sequência de aminoácidos que é idêntica à SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 8; c) a VH e a VL do referido anticorpo ou de seu fragmento compreender sequências de aminoácidos que são idênticas a sequências de VH e VL selecionadas a partir do grupo que consiste em: (i) SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 15, respectivamente; (ii) SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 17, respectivamente; e (iii) SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 8, respectivamente.

13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 12, caracterizado por adicionalmente compreender um veículo farmaceuticamente aceitável.