JP6097690B2 - 抗ｃｘｃｌ１３抗体およびそれを用いる方法 - Google Patents

抗ｃｘｃｌ１３抗体およびそれを用いる方法 Download PDF

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［電子的に提出した配列表の参照］
本出願とともにファイルし、ＡＳＣＩＩテキストファイルで電子的に提出した配列表（名称：「ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ＿ａｓｃｉｉ．ｔｘｔ」；サイズ：１６，９２３バイト；および作成日時：２０１１年４月２８日）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
恒常性Ｂ細胞誘引性ケモカイン１（ＢＣＡ−１）（他にはＣＸＣＬ１３（またはＡＮＧＩＥ、ＢＬＣ、ＢＬＲ１Ｌ、ＡＮＧＩＥ２もしくはＳｃｙｂ１３）として知られる）は、２次リンパ器官（例えば脾臓、リンパ節およびパイエル板）において濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）およびマクロファージにより構成的に発現される。Ｇｕｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ３９１：７９９〜８０３頁（１９９８）およびＣａｒｌｓｅｎら、Ｂｌｏｏｄ１０４（１０）：３０２１〜３０２７頁（２００４）を参照されたい。ＣＸＣＬ１３は、主に、Ｇタンパク質共役型ＣＸＣＲ５受容体（バーキットリンパ腫受容体１）を介して作用する。ＣＸＣＲ５は、例えば成熟Ｂリンパ球、ＣＤ４＋濾胞ヘルパーＴ細胞（Ｔｈｆ細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞のわずかな部分集合および活性化扁桃腺Ｔｒｅｇ細胞上で発現される。Ｌｅｇｌｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：６５５〜６６０頁（１９９８）；Ｆｏｒｓｔｅｒら、Ｂｌｏｏｄ８４：８３０〜８４０頁（１９９４）；Ｆａｚｉｌｌｅａｕら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ３０：３２４〜３３５頁（２００９）；Ａｎｓｅｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：１１２３〜１１３４頁（１９９９）；Ｌｉｍら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４（１１）：１６４０〜１６４９頁（２００４）；およびＲ．Ｆｏｒｓｔｅｒ、Ｃｈａｐｔｅｒ ｉｎ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、２０００年８月を参照されたい。
自己抗体（自己抗原に対する抗体）生成の可能性を有するＢ細胞が作られることは、正常な生理条件下で通常のことである。しかし、このような天然自己抗体は、広範囲の反応性と、細胞表面抗原よりも可溶性自己抗原について強い嗜好性を示す低親和性のＩｇＭ抗体である（例えばＤｉｃｈｉｅｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４（２）：７６５〜７７１頁（１９８５）；Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ８３：２９５９〜２９６３頁（１９８６）を参照されたい）。自己反応性低親和性Ｂ細胞はアポトーシスを受け、よって、健常生物に対して危険性を示す可能性は低い。
感染がなく、正常な免疫応答の間、ＣＸＣＬ１３とその受容体ＣＸＣＲ５は、リンパ節および脾臓中の１次濾胞へのＢ細胞および濾胞ＢヘルパーＴ細胞のホーミング、胚中心形成、ならびにリンパ器官形成に関与する。例えばＦｏｒｓｔｅｒら、Ｃｅｌｌ８７：１０３７〜１０４７頁（１９９６）を参照されたい。
ＣＸＣＬ１３およびＣＸＣＲ５欠損マウスでは、組織化された濾胞の欠如により、パイエル板およびリンパ節の発達が損なわれることが示された。Ａｎｓｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ４０６：３０９〜３１４頁（２０００）を参照されたい。さらに、ＣＸＣＬ１３ノックアウト表現型の関係におけるＴ細胞依存性抗原を用いる免疫化は、リンパ節および脾臓における誤って配置された異常に小さい胚中心の形成を導いた（Ａｎｓｅｌら）。
慢性炎症性の環境では、異所性胚中心が患部（頻繁に非リンパ系）組織内で形成される。濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）、Ｂ細胞および濾胞Ｔｈ細胞の間の相互作用の調節不全を伴うこれらの胚中心におけるＦＤＣによるＣＸＣＬ１３過剰発現は、自己反応性Ｂ細胞の排除と、その後の親和性が成熟した長命の形質細胞と高親和性ＩｇＧ自己抗体を生成するメモリーＢ細胞との抗原により駆動される生成とを低減した（これは、自己免疫炎症性障害の発生をもたらし得る）。例えば、Ｖｉｎｕｅｓａら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ９：８４５〜８５７頁（２００９）を参照されたい。さらに、ある種のがんにおけるＣＸＣＲ５受容体の過剰発現は、ＣＸＣＬ１３依存性細胞増殖および転移を促進することが報告されている。
ＣＸＣＬ１３（ＢＣＡ−１）およびその受容体ＣＸＣＲ５の高レベル発現が、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ誘発性胃リンパ濾胞および粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫において検察されている。例えば、Ｍａｚｚｕｃｃｈｅｌｌｉら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ１０４：Ｒ４９〜Ｒ５４頁（１９９９）を参照されたい。さらに、ＣＸＣＬ１３（ＢＣＡ−１）発現は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ誘発性胃炎の全ての試料において見出された。同著。Ｈ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉに感染した野生型マウスの胃粘膜において、リンパ組織（ＭＡＬＴを含む）の器官形成に関与することが知られているＣＸＣＬ１３のｍＲＮＡ発現レベルは、非感染マウスのものよりも著しくより高かった。Ｎｏｂｕｔａｎｉら、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ６０：１５６〜１６４頁（２０１０）を参照されたい。
ＣＸＣＬ１３仲介シグナル伝達経路を標的にする治療に対する必要性が、近年、より明確になっている。このような処置についての作用機序は、例えば、ＣＸＣＬ１３とその受容体との相互作用の遮断を含み、これは、Ｂ細胞と濾胞ＢヘルパーＴ細胞が炎症性組織に移動することおよび胚中心形成（例えば自己免疫疾患の場合）に干渉し、がん細胞の増殖および腫瘍学的障害に広がる能力を阻害する。
発明の分野
本発明は、ＣＸＣＬ１３中和結合分子、例えば抗体およびその抗原結合断片、例えばヒト化モノクローナル抗体、該結合分子を用いる方法、ならびにＣＸＣＬ１３発現細胞に関連する状態および疾患を処置するための方法に関する。
本発明の一態様は、ＭＡｂ５２６１、ＭＡｂ５３７８、ＭＡｂ５０８０、ＭＡｂ１４７６、３Ｄ２および３Ｃ９からなる群から選択される基準モノクローナル抗体と同じＣＸＣＬ１３エピトープに特異的に結合する単離抗原結合分子に関する。特定の実施形態では、抗原結合分子は、ＭＡｂ５２６１およびＭＡｂ５３７８と同じＣＸＣＬ１３エピトープに特異的に結合する。
別の態様では、本発明は、ＣＸＣＬ１３に特異的に結合する単離抗原結合分子であって、ＭＡｂ５２６１、ＭＡｂ５３７８、ＭＡｂ５０８０、ＭＡｂ１４７６、３Ｄ２および３Ｃ９からなる群から選択される基準モノクローナル抗体がＣＸＣＬ１３に特異的に結合することを競合的に阻害する結合分子に関する。特定の実施形態では、抗原結合分子は、ＭＡｂ５２６１およびＭＡｂ５３７８を競合的に阻害する。別の実施形態では、抗体またはその断片は、ＭＡｂ５２６１、ＭＡｂ５３７８、ＭＡｂ５０８０、ＭＡｂ１４７６、３Ｄ２および３Ｃ９からなる群から選択される。
本発明の一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ＣＸＣＬ１３に特異的に結合し、上記の抗体またはその断片の重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号１３および配列番号３からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片の軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号１５、配列番号１７および配列番号８からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ＣＸＣＬ１３に特異的に結合し、前記抗体またはその断片のＶＨは、配列番号１３および配列番号３からなる群から選択される配列と２０以下の保存的アミノ酸置換を除いて同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、抗体またはその断片のＶＬは、配列番号１５、配列番号１７および配列番号８からなる群から選択される配列と２０以下の保存的アミノ酸置換を除いて同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ＣＸＣＬ１３に特異的に結合し、抗体またはその断片のＶＨおよびＶＬは、（ａ）それぞれ配列番号１３および配列番号１５、（ｂ）それぞれ配列番号１３および配列番号１７、ならびに（ｃ）それぞれ配列番号３および配列番号８からなる群から選択されるＶＨおよびＶＬ配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ＣＸＣＬ１３に特異的に結合し、前記抗体またはその断片のＶＨおよびＶＬは、（ａ）それぞれ配列番号１３および配列番号１５、（ｂ）それぞれ配列番号１３および配列番号１７、ならびに（ｃ）それぞれ配列番号３および配列番号８からなる群から選択されるＶＨおよびＶＬ配列とそれぞれ２０以下の保存的アミノ酸置換を除いて同一であるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ＣＸＣＬ１３に特異的に結合し、前記抗体またはその断片のＶＨは、配列番号４と２以下のアミノ酸置換を除いて同一であるＣｈｏｔｈｉａ−Ｋａｂａｔ重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列；配列番号５と４以下のアミノ酸置換を除いて同一であるＫａｂａｔ重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列；配列番号６と２以下のアミノ酸置換を除いて同一であるＫａｂａｔ重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列；配列番号１６または９と４以下のアミノ酸置換を除いて同一であるＫａｂａｔ軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列；配列番号１０と２以下のアミノ酸置換を除いて同一であるＫａｂａｔ軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列；または配列番号１１と２以下のアミノ酸置換を除いて同一であるＫａｂａｔ軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ＣＸＣＬ１３に特異的に結合し、前記抗体またはその断片のＶＨは、配列番号４、５および６をそれぞれ含むＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を、前記ＶＨ−ＣＤＲの１または複数における４以下のアミノ酸置換を除いて含む。別の実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、ＣＸＣＬ１３に特異的に結合し、前記抗体またはその断片のＶＬは、配列番号１６または９、１０および１１をそれぞれ含むＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を、前記ＶＬ−ＣＤＲの１または複数における４以下のアミノ酸置換を除いて含む。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体またはその断片は、ＣＸＣＬ１３がＣＸＣＬ１３受容体に結合することを阻害する。特定の実施形態では、ＣＸＣＬ１３受容体は、ＣＸＣＲ５である。別の実施形態では、本発明の抗体またはその断片は、ヒト化、霊長類化またはキメラである。
本発明の別の態様は、本発明の抗体またはその断片と担体とを含む組成物を対象とする。
本発明のさらなる態様は、抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１２および配列番号２からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一である単離ポリヌクレオチドを対象とする。別の態様では、本発明は、抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号７および配列番号１４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一であり、前記ＶＬポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合断片が、ＣＸＣＬ１３に特異的に結合する単離ポリヌクレオチドを対象とする。
一実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含み、ここで、ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２および配列番号１２からなる群から選択される配列と２０以下の保存的アミノ酸置換を除いて同一である。別の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含み、ここで、ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号７、配列番号１４および配列番号１８からなる群から選択される配列と２０以下の保存的アミノ酸置換を除いて同一であり、前記ＶＬポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合断片は、ＣＸＣＬ１３に特異的に結合する。
本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを対象とする。別の態様は、本発明のベクターを含む宿主細胞を対象とする。本発明は、ＣＸＣＬ１３に特異的に結合する抗体またはその断片を生成する方法であって、本発明の宿主細胞を培養するステップと、前記抗体またはその断片を回収するステップとを含む方法も対象とする。
本発明の別の態様は、動物においてＣＸＣＬ１３を中和するための方法であって、前記動物に、本発明の単離抗体もしくはその断片または組成物と薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与するステップを含む方法を対象とする。
本発明のさらなる実施形態は、処置を必要とする動物において自己免疫疾患または炎症性疾患またはがんを処置するための方法であって、前記動物に、本発明の単離抗体もしくはその断片または組成物と薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与するステップを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患または前記炎症性疾患は、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）または関節炎、例えば関節リウマチである。
本発明のさらなる態様は、動物において胃リンパ濾胞を低減または阻害するための方法であって、前記動物に、本発明の単離抗体またはその断片と薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与するステップを含む方法を対象とする。本発明のさらなる実施形態は、予防または処置を必要とする動物において粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫または胃もしくは十二指腸潰瘍を予防または処置するための方法であって、前記動物に、本発明の単離抗体またはその断片と薬学的に許容される担体とを含む組成物を投与するステップを含む方法を対象とする。一実施形態では、動物は、ヘリコバクター細菌に感染している。一実施形態では、ヘリコバクター細菌は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉまたはＨ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉである。
抗体対照（マウスＭＡｂ８０１および／またはラットＭＡｂ４７０）と比較した、マウス抗ヒトＣＸＣＬ１３抗体（３Ｄ２および３Ｃ９）と組換えヒトＣＸＣＬ１３（１Ａ）、組換えマウスＣＸＣＬ１３（１Ｂ）および組換えカニクイザルＣＸＣＬ１３（１Ｃ）との結合を示す特異的ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。ＥＣ５０値を示し、これは、４パラメータシグモイドカーブフィッティングを用いて得た（曲線をグラフ上に示す；ＥＣ５０値を生成する曲線についてのＲ２は０．９９であった）。 競合物質なしまたはＭＡｂ８０１を用いた結果と比較した、マウス抗ヒトＣＸＣＬ１３抗体（３Ｃ９および３Ｄ２）についてのヒトＣＸＣＬ１３へのビオチン化３Ｄ２の結合のパーセント阻害を示すエピトープ競合ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。 天然または組換えヒトＣＸＣＬ１３（３Ａ）とのビオチン−３Ｃ９の結合および天然または組換えマウスＣＸＣＬ１３（３Ｂ）とのビオチン−３Ｄ２の結合の３Ｄ２阻害を示す捕捉エピトープ競合ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。曲線は、４パラメータシグモイドカーブフィッティングを用いてフィッティングした（曲線をグラフ上に示す；Ｒ２＝０．９９）。ＥＣ５０値の差を、対応のないｔ検定により分析し、Ｐ＞０．０５であることが見出された。 ヒトプレＢ−６９７−ｈＣＸＣＲ５細胞のヒトＣＸＣＬ１３誘発性移動（４Ａ）およびプレＢ−６９７−ｈＣＸＣＲ４細胞のヒトＳＤＦ−１アルファ誘発性移動（４Ｂ）に対する３Ｄ２および３Ｃ９の影響を示すＢ細胞移動の結果を示す図である。マウスＩｇＧを陰性対照として用いた。ＭＡｂ８０１をヒトＣＸＣＬ１３移動の阻害についての陽性対照として用い、ＭＡｂ８７ＡをヒトＳＤＦ−１アルファ誘発性移動についての陽性対照として用いた。 Ｃ５７Ｂｌａｃｋ／６における３Ｄ２、ＭＡｂ４７０、マウスＩｇＧ（対照）またはラットＩｇＧ（対照）（５Ａ）による、そしてＳＪＬ／Ｊにおける３Ｄ２、３Ｃ９、ＭＡｂ４７０またはマウスＩｇＧ（対照）（５Ｂ）による脾細胞移動のパーセント阻害を示す図である。結果を、２回（Ｃ５７Ｂｌａｃｋ／６移動）の独立した実験の平均＋／−ＳＤおよび３回（ＳＪＬ／Ｊ移動）の独立した実験の平均＋／−ＳＥＭとして表す。Ｃ５７Ｂｌａｃｋ／６およびＳＪＬ／Ｊ移動に対する３Ｄ２の影響の比較（５Ｃ）を、対応のないｔ検定により分析し、これによりＰ値＞０．０５が得られた。曲線は、４パラメータシグモイドカーブフィッティングを用いてフィッティングした（曲線をグラフ上に示す；Ｒ２＝０．９９）。 ３Ｄ２または対照（ＭＡｂ４７０および／またはマウスＩｇＧ）による、ヒトおよびマウスＣＸＣＲ５受容体のヒトＣＸＣＬ１３仲介エンドサイトーシス（６Ａ）およびマウスＣＸＣＬ１３仲介エンドサイトーシス（６Ｂ）についてのＣＸＣＬ１３仲介エンドサイトーシスの結果を示す図である。１（マウスエンドサイトーシス）および０．９９４（ヒトエンドサイトーシス）に等しいＲ２値でのシグモイド用量応答曲線から算出したヒトおよびマウスＣＸＣＬ１３仲介エンドサイトーシスのＥＣ５０値の比較を示す（６Ｃ）。ヒトおよびマウス受容体エンドサイトーシスに対する３Ｄ２の影響を比較するデータを、対応のないｔ検定により分析し、これによりＰ値＞０．０５が得られた。 ３Ｄ２（０日目に開始）、３Ｄ２（スコア＞１にて開始）またはマウスＩｇＧ対照で処置したマウスにおけるＥＡＥ疾患の進行（ＲＲ−ＥＡＥ−１研究）を示す図である。各データ点は、９匹のマウスから得たスコアの平均を表す。群平均（ＧＭＳ）を、一元配置ＡＮＯＶＡとその後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較事後検定とを用いることにより比較した。 ３Ｄ２（０日目に開始）、３Ｄ２（６日目に開始）、３Ｄ２（＞２日目に開始）またはマウスＩｇＧ対照で処置したマウスにおけるＥＡＥ疾患の進行（ＲＲ−ＥＡＥ−２研究）を示す図である。各データ点は、９匹のマウスから得たスコアの平均を表す。群平均（ＧＭＳ）を、一元配置ＡＮＯＶＡとその後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較事後検定とを用いることにより比較した。 ３Ｄ２またはマウスＩｇＧ（対照）処置の後の進行ループス腎炎マウスにおける腎臓病態（ＳＬＥ−１研究）を示す図である。蛋白尿スコア（９Ａ）ならびに糸球体腎炎、間質性腎炎および血管炎についての腎臓病態スコア（９Ｂ）について、各データ点は、１０回の測定の平均を表す。 ３Ｄ２およびマウスＩｇＧ（対照）処置の後の早期ループス疾患マウスにおける腎臓病態（ＳＬＥ−２研究）を示す図である。蛋白尿スコア（１０Ａ）ならびに糸球体腎炎および間質性腎炎についての腎臓病態スコア（１０Ｂ）について、各データ点は、３Ｄ２処置群からの７匹のマウスおよびマウスＩｇＧ処置群からの９匹のマウスを表す。 ループスマウス脾臓中の胚中心（ＧＣ）および１次濾胞の数に対する３Ｄ２の影響を示している組織学的切片を示す図である。３Ｄ２処置（１１Ａ）およびマウスＩｇＧ処置（１１Ｂ）ＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスからの脾臓切片を、ＧＬ−７（ＧＣ染色）、Ｂ２２０抗体（Ｂ細胞マーカー）または濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）に対する抗体を用いて染色した。 ３Ｄ２で処置したループスマウスの脾臓中の１次濾胞およびＧＣサイズを示す図である。値は、群あたり５匹のマウスを用いた平均＋／−ＳＥＭとして示す。３Ｄ２で処置したマウス（「ｔｘ」）は、１次：２次（ＧＣ）濾胞の比率として表した場合に、ＧＣの数の減少（ｐ＝０．１９）（１２Ａ）およびＧＣサイズの有意な減少（ｐ＝０．０３）（１２Ｂ）に向かう傾向を示した。 ３Ｄ２可変重鎖（Ｈ１６０９）および可変軽鎖（Ｌ０２９３）のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図である。相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を付す。 可変重鎖Ｈ１６０９からＨ２１７７への改変（１４Ａ）および可変軽鎖Ｌ０２９３からＬ５０５５へそしてＬ５１４０への改変（１４Ｂ）を示している、キメラ３Ｄ２のヒト化についてのアミノ酸配列を示す図である。推定グリコシル化部位および相補性決定領域（ＣＤＲ）を箱で囲む。 ＭＡｂ５２６１可変重鎖および軽鎖（Ｈ２１７７／Ｌ５１４０）ならびにＭＡｂ５０８０可変重鎖および軽鎖（Ｈ２１７７／Ｌ５０５５）のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図である。相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を付す。 組換えヒト（１６Ａ）、カニクイザル（１６Ｂ）およびマウス（１６Ｃ）ＣＸＣＬ１３へのＭＡｂ５２６１、ＭＡｂ５０８０、ＭＡｂ１４７６およびヒトアイソタイプ対照の結合についての特異的ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。各データ点は、三重測定の平均を表す。ＥＣ５０値は、４パラメータシグモイドカーブフィッティングから算出した（曲線をグラフ上に示す；ＥＣ５０値を生成する曲線についてのＲ２は０．９９であった）。ＮＢ＝結合なし。 天然ヒト（１７Ａ）および天然マウス（１７Ｂ）ＣＸＣＬ１３へのＭＡｂ５２６１、ＭＡｂ５０８０および３Ｄ２の結合についての捕捉エピトープ競合ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。各データ点は、少なくとも３回の独立した実験の１回からの二重測定の平均を表す。曲線は、４パラメータシグモイドカーブフィッティングを用いてフィッティングした（曲線をグラフ上に示す；Ｒ２＝０．９９）。 ＭＡｂ５２６１によるヒトプレＢ−６９７−ｈＣＸＣＲ５（１８Ａ）およびヒト扁桃腺細胞（１８Ｂ）移動のパーセント阻害を示す図である。データは、少なくとも３回の実験の１回からの三重測定の平均＋／−ＳＥＭを表す。曲線は、４パラメータシグモイドカーブフィッティングを用いてフィッティングした（曲線をグラフ上に示す；Ｒ２＝０．９８〜０．９９）。 ＭＡｂ５２６１によるＳＪＬ／Ｊ（１９Ａ）およびＣ５７Ｂｌａｃｋ／６（１９Ｂ）脾細胞移動のパーセント阻害を示す図である。代表的な実験からのデータを、二重測定の平均＋／−ＳＤとして示す。 ＭＡｂ５２６１およびアイソタイプ対照によるヒトＣＸＣＲ５受容体のヒトＣＸＣＬ１３仲介内部移行のパーセント阻害を示す図である。データは、少なくとも３回の独立した実験の１回からの三重測定の平均である。曲線は、４パラメータシグモイドカーブフィッティングを用いてフィッティングした（曲線をグラフ上に示す；Ｒ２＝０．９９）。 ＭＡｂ５３７８可変重鎖（Ｈ５１８８）および可変軽鎖（Ｌ５１５３）のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図である。相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を付す。 ＭＡｂ５３７８、ＭＡｂ５２６１およびＭＡｂ４７０についてのエピトープ競合ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。 組換えヒト（２３Ａ）、カニクイザル（２３Ｂ）およびマウス（２３Ｃ）ＣＸＣＬ１３へのＭＡｂ５３７８、３Ｄ２およびマウスアイソタイプ対照の結合についての特異的ＥＬＩＳＡの結果を示す図である。各データ点は、三重測定の平均を表す。ＥＣ５０値は、４パラメータシグモイドカーブフィッティングから算出した（曲線をグラフ上に示す；ＥＣ５０値を生成する曲線についてのＲ２は０．９９であった）。 ＭＡｂ５２６１またはＭＡｂ５３７８（２４Ａ〜Ｂ）およびＭＡｂ５３７８または３Ｄ２（２４Ｃ）による、ヒトプレＢ−６９７−ｈＣＸＣＲ５（２４Ａ）、ヒト扁桃腺細胞（２４Ｂ）およびＣ５７Ｂｌａｃｋ６マウス脾細胞（２４Ｃ）移動のパーセント阻害を示す図である。データは、少なくとも３回の実験の１回からの三重測定の平均＋／−ＳＥＭを表す。曲線は、４パラメータシグモイドカーブフィッティングを用いてフィッティングした（曲線をグラフ上に示す；Ｒ２＝０．９９）。 ＭＡｂ５３７８、ＭＡｂ５２６１、３Ｄ２、マウスアイソタイプ対照またはヒトアイソタイプ対照による、ヒトＣＸＣＲ５受容体のヒトＣＸＣＬ１３仲介内部移行のパーセント阻害を示す図である。５２６１および５３７８についてのデータ点は、２回の独立した実験からの測定の平均を表す。３Ｄ２およびアイソタイプ対照についてのデータ点は、１回の実験からの三重測定の平均を表す。曲線は、４パラメータシグモイドカーブフィッティングを用いてフィッティングした（曲線をグラフ上に示す；Ｒ２＝０．９９）。ＮＥ＝影響なし。 ＭＡｂ５３７６、エタネルセプトまたはマウスＩｇＧ（対照）で処置したマウスにおけるコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）の疾患進行（ＣＩＡ−１研究）を示す図である。各データ点は、１０匹のマウスから得たスコアの平均を表す。群平均を、一元配置ＡＮＯＶＡとその後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較事後検定とを用いることにより比較した。 ＭＡｂ５３７８、エタネルセプト、ＭＡｂ４７０またはマウスＩｇＧ（対照）で処置したマウスにおけるコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）の疾患進行（ＣＩＡ−２研究）を示す図である。各データ点は、１０匹のマウスから得たスコアの平均を表す。群平均を、一元配置ＡＮＯＶＡとその後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較事後検定とを用いることにより比較した。 ＭＡｂ５３７８、マウスアイソタイプ対照で処置したかまたは処置していないＮＰ−ＣＧＧ免疫化マウスにおける胚中心形成（ＧＣ−１研究）を示す図である。各脾臓データ点は、３匹のマウスから測定した値の平均を表す。各リンパ節データ点は、３匹のマウスから回収したプール細胞から得た単一の値を表す。 マウスのＨ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ感染および抗体投与についての処置スケジュールを示す図である。 Ｈ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ特異的１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を、アイソタイプ対照抗体処置および抗ＣＸＣＬ１３抗体処置を含むＨ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ感染マウスから得た全ての胃試料において増幅したことを示す図である。陽性対照（Ｐ）および陰性対照（Ｎ）も示す。 リアルタイム定量ＰＣＲにより決定した（値は、各試料中のマウスベータアクチン発現レベルに対して標準化した）、感染１カ月後（３１Ａ）および３カ月後（３１Ｂ）のＨ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ（ＨＨ）感染野生型（ＷＴ）マウスの胃粘膜におけるＣＸＣＬ１３のｍＲＮＡ発現レベルを示す図である。 アイソタイプ対照抗体または抗ＣＸＣＬ１３抗体処置後のＨ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ感染マウスの胃におけるＣＸＣＬ１３ ｍＲＮＡおよびβアクチンの発現（上のパネル）を示す図である。非感染マウスの胃におけるＣＸＣＬ１３ ｍＲＮＡおよびβアクチンの発現（下のパネル）。陽性対照（Ｐ）および陰性対照（Ｎ）も示す。 Ｈ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ感染３カ月後のアイソタイプ対照抗体処置マウス（左上のパネル）および抗ＣＸＣＬ１３抗体処置マウス（右上のパネル）からのヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色胃試料を示す図である。下のパネルは、アイソタイプ対照抗体および抗ＣＸＣＬ１３抗体処置マウスからの胃試料中で同定された胃リンパ濾胞の数を示す。
Ｉ．定義
用語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」実体は、１または複数の実体のことをいうことに注意されたい。例えば、「抗ＣＸＣＬ１３抗体」は、１または複数の抗ＣＸＣＬ１３抗体を表すと理解される。したがって、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１または複数」および「少なくとも１つの」は、本明細書において交換可能に用いることができる。
本明細書で用いる場合、用語「腫瘍」は、悪性または良性に関わらず全ての新生物細胞成長および増殖ならびに全てのがん性および前がん性細胞および組織のことをいう。
用語「がん」または「がん性」は、制御されない細胞成長を典型的に特徴とする哺乳動物における生理的状態のことをいうかまたは説明する。がんの例は、それらに限定されないが、癌、リンパ腫および白血病を含む。
本明細書で用いる場合、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を包含することを意図し、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）により直鎖状に連結されたモノマー（アミノ酸）で構成される分子のことをいう。用語「ポリペプチド」は、２以上のアミノ酸の任意の１または複数の鎖のことをいい、特定の長さの生成物のことをいわない。つまり、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２以上のアミノ酸の１もしくは複数の鎖のことをいうために用いられる任意のその他の用語は、「ポリペプチド」の定義の中に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの任意の用語の代わりにまたは交換可能に用いることができる。用語「ポリペプチド」は、限定することなくグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮蔽基による誘導体化、タンパク質分解切断または非天然アミノ酸による修飾を含むポリペプチドの発現後修飾の生成物のことをいうことも意図する。ポリペプチドは、自然の生物学的供給源に由来するか、または組み換え技術により生成できるが、指定する核酸配列から翻訳される必要はない。これは、化学合成を含む任意の方法で作製してよい。
本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上または２，０００以上のアミノ酸のサイズのものであってよい。ポリペプチドは、規定された３次元構造を有してよいが、そのような構造を有する必要はない。規定された３次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれたといい、規定された３次元構造を有さないがむしろ多数の異なる高次構造を採用できるポリペプチドは、折り畳まれていないという。本明細書で用いる場合、用語「糖タンパク質」は、少なくとも１の炭水化物部分（これは、タンパク質に、アミノ酸残基、例えばセリン残基またはアスパラギン残基の酸素含有または窒素含有側鎖により付着する）に結合したタンパク質のことをいう。
「単離」ポリペプチドまたはその断片、バリアントもしくは誘導体により、その自然環境にないポリペプチドを意図する。特定のレベルの精製は必要とされない。例えば、単離ポリペプチドは、その天然または自然の環境から取り出すことができる。宿主細胞中で発現された組換え生成ポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術により分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドと同様に、本発明の目的のために単離されたとみなされる。
本発明のポリペプチドとして、上記のポリペプチドの断片、誘導体、類似体またはバリアント、およびそれらの任意の組み合わせも含まれる。用語「断片」、「バリアント」、「誘導体」および「類似体」は、本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体または抗体ポリペプチドのことをいう場合、本発明の対応する抗体または抗体ポリペプチドの少なくともいくらかの抗原結合特性を保持する任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの断片は、タンパク質分解断片および欠失断片を、本明細書の他の場所で論じる特異的抗体断片に加えて含む。本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体および抗体ポリペプチドのバリアントは、上記の断片、およびアミノ酸置換、欠失または挿入によるアミノ酸配列の変更を有するポリペプチドを含む。バリアントは、自然に存在するかまたは自然に存在しないものであってよい。自然に存在しないバリアントは、当技術分野において既知の突然変異誘発技術を用いて生成できる。バリアントポリペプチドは、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含んでよい。バリアントポリペプチドは、本明細書において「ポリペプチド類似体」ということもある。本明細書で用いる場合、抗ＣＸＣＬ１３抗体または抗体ポリペプチドの「誘導体」は、官能性側基の反応により化学的に誘導体化した１または複数の残基を有する主題ポリペプチドのことをいう。「誘導体」として、２０の標準的アミノ酸の１または複数の自然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドも含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンは、プロリンを置換でき、５−ヒドロキシリシンは、リシンを置換でき、３−メチルヒスチジンは、ヒスチジンを置換でき、ホモセリンは、セリンを置換でき、オルニチンは、リシンを置換できる。本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体および抗体ポリペプチドの誘導体は、本発明の基準抗体または抗体ポリペプチドにおいて見出されないさらなる特徴を示すように変更されたポリペプチドを含んでよい。
用語「ポリヌクレオチド」は、単数の核酸および複数の核酸を包含することを意図し、単離核酸分子または構築物、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）のことをいう。ポリヌクレオチドは、通常のホスホジエステル結合または通常でない結合（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）において見出されるようなアミド結合）を含んでよい。用語「核酸」は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１または複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ断片のことをいう。「単離」核酸またはポリヌクレオチドにより、その天然の環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクターに含まれる、抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例は、異種宿主細胞において維持される組換えポリヌクレオチドまたは溶解している（部分的または実質的）精製ポリヌクレオチドを含む。単離ＲＮＡ分子は、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転写産物を含む。本発明による単離ポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に生成されたこのような分子をさらに含む。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位または転写ターミネーターのような調節エレメントであるかまたはそれを含んでよい。
本明細書で用いる場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、これは、コード領域の一部とみなすことができ、しかし、任意のフランキング配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コード領域の一部でない。本発明の２以上のコード領域は、単一のポリヌクレオチド構築物、例えば単一のベクター上または別々のポリヌクレオチド構築物、例えば別々の（異なる）ベクター上に存在できる。さらに、ベクターはいずれも単一のコード領域を含有するか、または２以上のコード領域を含んでよく、例えば単一のベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードしてよい。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体をコードする核酸と融合しているかまたは融合していない異種コード領域をコードできる。異種コード領域は、限定されないが、分泌シグナルペプチドまたは異種機能性ドメインのような専門のエレメントまたはモチーフを含む。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１または複数のコード領域に作動可能に連結したプロモーターおよび／またはその他の転写もしくは翻訳制御エレメントを含んでよい。作動可能な会合は、遺伝子生成物、例えばポリペプチドのコード領域が、遺伝子生成物の発現を１以上の調節配列の影響または制御の下におくような様式で１以上の調節配列と会合する場合である。２つのＤＮＡ断片（例えばポリペプチドコード領域とそれと会合するプロモーター）とは、プロモーター機能の誘発が所望の遺伝子生成物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらし、２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が遺伝子生成物の発現を駆動する発現調節配列の能力に干渉しないかまたは転写されるＤＮＡ鋳型の能力に干渉しないならば、「作動可能に連結」している。つまり、プロモーター領域は、プロモーターが核酸の転写を可能にできるならば、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に連結している。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を駆動する細胞特異的プロモーターであってよい。プロモーター以外のその他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写終結シグナルは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結して、細胞特異的転写を駆動できる。適切なプロモーターおよびその他の転写制御領域は、本明細書に開示する。
様々な転写制御領域が当業者に知られている。これらは、限定することなく、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えばそれらに限定されないが、サイトメガロウイルス（イントロンＡを伴う最初期プロモーター）、サルウイルス４０（初期プロモーター）およびレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）からのプロモーターおよびエンハンサーセグメントを含む。その他の転写制御領域は、脊椎動物遺伝子に由来するもの、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβグロビン、ならびに真核細胞における遺伝子発現を制御できるその他の配列を含む。さらなる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えばインターフェロンまたはインターロイキンにより誘導できるプロモーター）を含む。
同様に、様々な翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらは、それらに限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、ならびにピコルナウイルスに由来するエレメント（特に配列内リボソーム進入部位またはＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列ともよばれる）を含む。
他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を駆動する分泌またはシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と会合してよい。シグナルの仮説によると、哺乳動物細胞により分泌されるタンパク質は、成長するタンパク質鎖が粗面小胞体を横切って一旦輸送され始めると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞により分泌されるポリペプチドが、通常、ポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有し、これは、完全または「全長」ポリペプチドから切断されて分泌または「成熟」形態のポリペプチドを生成することを理解している。特定の実施形態では、天然シグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖シグナルペプチド、または作動可能に連結したポリペプチドの分泌を駆動する能力を保持するその配列の機能的誘導体を用いる。代わりに、異種哺乳動物シグナルペプチドまたはその機能的誘導体を用いてよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換してよい。
本発明の「結合分子」または「抗原結合分子」は、その広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子のことをいう。一実施形態では、結合分子は、ＣＸＣＬ１３（ＢＣＡ−１ともよばれる）に特異的に結合する。別の実施形態では、本発明の結合分子は、抗体またはその抗原結合断片、例えば抗ＣＸＣＬ１３抗体である。別の実施形態では、本発明の結合分子は、抗体分子の少なくとも１の重鎖または軽鎖ＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、１または複数の抗体分子からの少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、１または複数の抗体分子からの少なくとも３つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、１または複数の抗体分子からの少なくとも４つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、１または複数の抗体分子からの少なくとも５つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明の結合分子は、１または複数の抗体分子からの少なくとも６つのＣＤＲを含む。特定の実施形態では、１または複数のＣＤＲは、ＭＡｂ５２６１、ＭＡｂ５３７８、ＭＡｂ５０８０、ＭＡｂ１４７６、３Ｄ２または３Ｃ９からである。
本発明は、ある抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体を対象とする。自然に存在する抗体のような完全サイズ抗体と特に言及しない限り、用語「抗ＣＸＣＬ１３抗体」は、完全サイズ抗体およびそのような抗体、例えば自然に存在する抗体もしくは免疫グロブリン分子の抗原結合断片、バリアント、類似体または誘導体、あるいは抗体分子と同様の様式で抗原に結合する工学的に作製された抗体分子または断片を包含する。
本明細書で用いる場合、「ヒト」または「完全ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーからまたは１もしくは複数のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体（以下および例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載されるような）を含む。「ヒト」または「完全ヒト」抗体は、少なくとも重鎖の可変ドメインまたは少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む抗体も含み、ここで、可変ドメイン（複数可）は、ヒト免疫グロブリン可変ドメイン（複数可）のアミノ酸配列を有する。
「ヒト」または「完全ヒト」抗体は、本明細書で記載する抗体分子（例えばＶＨ領域および／またはＶＬ領域）の（誘導体を含む）バリアント（該抗体またはその断片は、ＣＸＣＬ１３ポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントに特異的に結合する）を含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる上記の「ヒト」または「完全ヒト」抗体も含む。それらに限定されないが、アミノ酸置換をもたらす部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ仲介突然変異誘発を含む当業者に知られる標準的な技術を用いて、ヒト抗ＣＸＣＬ１３抗体をコードするヌクレオチド配列に変異を導入できる。好ましくは、（誘導体を含む）バリアントは、基準ＶＨ領域、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２またはＶＬＣＤＲ３に対して５０未満のアミノ酸置換、４０未満のアミノ酸置換、３０未満のアミノ酸置換、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換または２未満のアミノ酸置換をコードする。
特定の実施形態では、アミノ酸置換は、以下にさらに論じる保存的アミノ酸置換である。代わりに、変異は、例えば飽和突然変異誘発によりコード配列の全体または一部にわたって無作為に導入でき、得られた変異体は、生物活性についてスクリーニングして、活性（例えばＣＸＣＬ１３ポリペプチド、例えばヒト、マウスまたはヒトおよびマウス両方のＣＸＣＬ１３に結合する能力）を保持する変異を同定できる。「ヒト」または「完全ヒト」抗体のこのようなバリアント（またはその誘導体）は、「最適化」または「抗原結合について最適化」されたヒトまたは完全ヒト抗体ということもでき、抗原に対する親和性が改善された抗体を含む。
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、本明細書において交換可能に用いられる。抗体または免疫グロブリンは、少なくとも重鎖の可変ドメインを含み、通常、少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。例えばＨａｒｌｏｗら（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。
以下により詳細に論じるように、用語「免疫グロブリン」は、生化学的に区別できる様々な広いクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）に、それらのうちのいくつかのサブクラス（例えばγ１〜γ４）とともに分類されることを認識する。抗体の「クラス」をＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ ＩｇＧまたはＩｇＥにそれぞれ決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などは、十分に特徴づけられ、機能的に特化されていることが知られている。当業者は、これらのクラスおよびアイソタイプのそれぞれの改変バージョンを本開示の観点で容易に認識でき、よって、これらの改変バージョンは本発明の範囲内である。全ての免疫グロブリンクラスは、明らかに本発明の範囲内であり、以下の議論は、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスを全般的に対象とする。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、およそ２３，０００ダルトンの分子量の２つの同一の軽鎖ポリペプチドと、５３，０００〜７０，０００の分子量の２つの同一の重鎖ポリペプチドとを含む。４つの鎖は、典型的に、ジスルフィド結合により「Ｙ」形状につながれ、ここでは、軽鎖が、「Ｙ」の口から開始して可変領域全体に継続して重鎖を囲む。
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかとして分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかと結合できる。一般的に、軽鎖および重鎖は、互いに共有結合しており、２つの重鎖の「尾」部分は、共有ジスルフィド結合または免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞または遺伝子工学で作製された宿主細胞のいずれかにより作製される場合に非共有結合により互いに結合する。重鎖において、アミノ酸配列は、Ｙ形状の分かれた端のＮ末端から、各鎖の底のＣ末端までに及ぶ。
軽鎖および重鎖はともに、構造的および機能的相同性の領域に分けられる。用語「定常」および「可変」は、機能的に用いられる。この点に関して、軽鎖（ＶＬまたはＶＫ）および重鎖（ＶＨ）部分の両方の可変ドメインが抗原認識および特異性を決定することが認識される。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などのような重要な生物学的特性を与える。慣例的に、定常領域ドメインの番号付けは、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠ざかるにつれて増加する。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域である。ＣＨ３およびＣＬドメインは、実際に、それぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
上述したように、可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識してそれに特異的に結合することを可能にする。つまり、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメイン、またはこれらの可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）の部分集合は、組み合わされて、３次元抗原結合部分を規定する可変領域を形成する。この４元の抗体構造は、Ｙの各腕の端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＬ各鎖上の３つのＣＤＲにより規定される。いくつかの場合、例えばラクダ種に由来するかまたはラクダ免疫グロブリンに基づいて工学的に作製されたある免疫グロブリン分子において、完全免疫グロブリン分子は、軽鎖を有さず重鎖のみからなることがある。例えばＨａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ３６３：４４６〜４４８頁（１９９３）を参照されたい。
自然に存在する抗体において、各抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体が水性環境中で３次元形状をとるように抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置されているアミノ酸の短い不連続配列である。「フレームワーク」領域とよばれる抗原結合ドメイン中の残りのアミノ酸は、分子間変動性がより低い。フレームワーク領域は、大部分がβシート高次構造を採用し、ＣＤＲは、βシート構造をつなぎ、その一部を形成する場合もあるループを形成する。つまり、フレームワーク領域は、鎖間非共有相互作用によりＣＤＲを正しい向きに配置するための足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲにより形成される抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに対する表面相補性を規定する。この相補的表面は、抗体のその同族エピトープへの非共有結合を促進する。当業者は、ＣＤＲおよびフレームワーク領域を含むアミノ酸をそれぞれ、任意の与えられた重鎖または軽鎖可変ドメインについて容易に同定できる。なぜなら、これらは精密に定義されているからである（以下を参照されたい）。
ある用語について当技術分野において用いられかつ／または受け入れられている２以上の定義がある場合、本明細書で用いる用語の定義は、そうでないと明示的に述べない限り、全てのそのような意味を含むことを意図する。具体例は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内で見出される、不連続抗原結合部位を記載するための用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。この特定の領域は、Ｋａｂａｔら（１９８３）Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」ならびにＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７頁（１９８７）（これらは本明細書に参照により組み込まれている）により記載され、ここで、これらの定義は、互いに比較した場合にオーバーラップまたはアミノ酸残基の部分集合を含む。それにもかかわらず、抗体またはそのバリアントのＣＤＲに言及するためのどちらの定義を用いることも、本明細書で定義され用いられる用語の範囲内であることを意図する。上記の引用した参考文献のそれぞれにより定義されるＣＤＲを包含する適当なアミノ酸残基を、比較のために以下の表１に示す。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列およびサイズに依存して変動する。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列に鑑みて、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを慣例的に決定できる。
Ｋａｂａｔらは、いずれの抗体にも用いることができる可変ドメイン配列についての番号付けシステムを定義した。当業者は、「Ｋａｂａｔ番号付け」のこのシステムを、任意の可変ドメイン配列に、配列自体を超えるいずれの実験データにも依存することなく、明確に割り当てることができる。本明細書で用いる場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔら（１９８３）Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」に示される番号付けシステムのことをいう。そうでないと明記しない限り、本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体中の特定のアミノ酸残基の位置の番号付けについての言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う。
本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、それらに限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化、霊長類化またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬもしくはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生成される断片、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば本明細書で開示する抗ＣＸＣＬ１３抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）を含む。ＳｃＦｖ分子は、当技術分野において知られており、例えば米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、任意のタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２など）またはサブクラスの免疫グロブリン分子であり得る。
本明細書で用いる場合、用語「重鎖部分」は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば上部、中間および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはそのバリアントもしくは断片の少なくとも１つを含む。例えば、本発明で用いるための結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインとヒンジドメインの少なくとも一部分とＣＨ２ドメインとを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメインとを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインとヒンジドメインの少なくとも一部分とＣＨ３ドメインとを含むポリペプチド鎖またはＣＨ１ドメインとヒンジドメインの少なくとも一部分とＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含むポリペプチド鎖を含んでよい。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明で用いるための結合ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部分（例えばＣＨ２ドメインの全てまたは一部）を欠いてよい。上述したように、当業者は、自然に存在する免疫グロブリン分子からアミノ酸配列が変動するようにこれらのドメイン（例えば重鎖部分）を改変できることを理解している。
本明細書で開示するある抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体において、マルチマーのあるポリペプチド鎖の重鎖部分は、該マルチマーの第２のポリペプチド鎖上のものと同一である。あるいは、本発明の重鎖部分を含有するモノマーは、同一でない。例えば、各モノマーは、例えば二重特異性抗体を形成する異なる標的結合部分を含んでよい。
本明細書で開示する診断および処置方法において用いるための結合分子の重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来してよい。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域とを含んでよい。別の例では、重鎖部分は、部分的にＩｇＧ１分子と部分的にＩｇＧ３分子とに由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例では、重鎖部分は、部分的にＩｇＧ１分子と部分的にＩｇＧ４分子とに由来するキメラヒンジを含むことができる。
本明細書で用いる場合、用語「軽鎖部分」は、免疫グロブリン軽鎖、例えばカッパまたはラムダ軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖部分は、ＶＬまたはＣＬドメインの少なくとも１つを含む。
本明細書で開示する抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、抗原の１以上のエピトープまたはその一部分、例えばそれらが認識または特異的に結合する本明細書で開示する標的ポリペプチド（例えばＣＸＣＬ１３）の点で記載または特定することがある。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的ポリペプチドの一部分は、「エピトープ」または「抗原決定基」である。標的ポリペプチドは、単一のエピトープを含んでよいが、典型的に、少なくとも２つのエピトープを含み、抗原のサイズ、高次構造およびタイプに依存して、任意の数のエピトープを含むことができる。さらに、標的ポリペプチド上の「エピトープ」は、非ポリペプチド要素であってよいかまたはそれを含んでよく、例えばエピトープは、炭水化物側鎖を含んでよいことに注意すべきである。
抗体についてのペプチドまたはポリペプチドエピトープの最小サイズは、約４〜５アミノ酸であると考えられる。ペプチドまたはポリペプチドエピトープは、好ましくは、少なくとも７、より好ましくは少なくとも９、最も好ましくは少なくとも約１５から約３０の間のアミノ酸を含有する。ＣＤＲは、抗原性ペプチドまたはポリペプチドをその３次形態で認識できるので、エピトープを含むアミノ酸は連続的である必要はなく、同じペプチド鎖上にない場合さえある。本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体が認識するペプチドまたはポリペプチドエピトープは、ＣＸＣＬ１３の少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、より好ましくは少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５または約１５から約３０の間の連続または不連続アミノ酸の配列を含有してよい。
「特異的に結合する」とは、全般的に、抗体がエピトープにその抗原結合ドメインを介して結合し、該結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間のいくらかの相補性を必然的に伴うことを意味する。この定義に従って、抗体がエピトープに、その抗原結合ドメインを介して、抗体が無作為で無関係のエピトープに結合するよりも容易に結合する場合に、該抗体はエピトープに「特異的に結合する」という。用語「特異性」は、本明細書において、ある抗体があるエピトープに結合する相対的親和性を述べるために用いられる。例えば、抗体「Ａ」は、抗体「Ｂ」よりも所与のエピトープについてより高い特異性を有すると考えることができるか、または抗体「Ａ」は、関係するエピトープ「Ｄ」についてそれが有するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合するということができる。
「優先的に結合する」とは、抗体がエピトープに、抗体が関係する、同様の、相同のまたは類似のエピトープに結合するよりも容易に、特異的に結合することを意味する。よって、所与のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、そのエピトープに、関係するエピトープよりも結合する可能性が高いが、そのような抗体は、関係するエピトープと交差反応し得る。
非限定的な例として、第２のエピトープについての抗体の解離定数（ＫＤ）未満のＫＤで抗体が第１のエピトープに結合するならば、抗体は第１のエピトープに優先的に結合すると考えてよい。別の非限定的な例では、第２のエピトープについての抗体のＫＤより少なくとも１桁小さいＫＤで抗体が第１のエピトープに結合するならば、抗体は第１の抗原に優先的に結合すると考えてよい。別の非限定的な例では、第２のエピトープについての抗体のＫＤよりも少なくとも２桁小さいＫＤで抗体が第１のエピトープに結合するならば、抗体は第１のエピトープに優先的に結合すると考えてよい。
別の非限定的な例では、第２のエピトープについての抗体のオフレート（ｋ（ｏｆｆ））未満のｋ（ｏｆｆ）で抗体が第１のエピトープに結合するならば、抗体は第１のエピトープに優先的に結合すると考えてよい。別の非限定的な例では、第２のエピトープについての抗体のｋ（ｏｆｆ）より少なくとも１桁小さいｋ（ｏｆｆ）で抗体が第１のエピトープに結合するならば、抗体は第１のエピトープに優先的に結合すると考えてよい。別の非限定的な例では、第２のエピトープについての抗体のｋ（ｏｆｆ）より少なくとも２桁小さいｋ（ｏｆｆ）で抗体が第１のエピトープに結合するならば、抗体は第１のエピトープに優先的に結合すると考えてよい。本明細書で開示する抗体または抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、本明細書で開示する標的ポリペプチド（例えばＣＸＣＬ１３、例えばヒト、マウスまたはヒトおよびマウス両方のＣＸＣＬ１３）またはその断片もしくはバリアントに、５×１０−２ｓｅｃ−１、１０−２ｓｅｃ−１または５×ｌ０−３ｓｅｃ−１以下のオフレート（ｋ（ｏｆｆ））で結合するということができる。特定の実施形態では、ｋ（ｏｆｆ）は、約３×１０−２以下であり、例えばここで抗体は３Ｄ２であり、ＣＸＣＬ１３はヒトまたはマウスである。別の実施形態では、ｋ（ｏｆｆ）は、約３×１０−３以下であり、例えばここで抗体はＭＡｂ５２６１であり、ＣＸＣＬ１３はヒトまたはマウスである。別の実施形態では、ｋ（ｏｆｆ）は、約４×１０−３以下であり、例えばここで抗体はＭＡｂ５３７８であり、ＣＸＣＬ１３はヒトまたはマウスである。一実施形態では、本発明の抗体は、本明細書で開示する標的ポリペプチド（例えばＣＸＣＬ１３、例えばヒト、マウスまたはヒトおよびマウス両方のＣＸＣＬ１３）またはその断片もしくはバリアントに、５×１０−４ｓｅｃ−１、１０−４ｓｅｃ−１、５×１０−５ｓｅｃ−１または１０−５ｓｅｃ−１、５×１０−６ｓｅｃ−１、１０−６ｓｅｃ−１、５×１０−７ｓｅｃ−１または１０−７ｓｅｃ−１以下のオフレート（ｋ（ｏｆｆ））で結合するということができる。
本明細書で開示する抗体または抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、本明細書で開示する標的ポリペプチド（例えばＣＸＣＬ１３、例えばヒト、マウスまたはヒトおよびマウス両方のＣＸＣＬ１３）またはその断片もしくはバリアントに、１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１または５×１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１以上のオンレート（ｋ（ｏｎ））で結合するということができる。特定の実施形態では、ｋ（ｏｎ）は、約５×１０５以上であり、例えばここで抗体は３Ｄ２であり、ＣＸＣＬ１３はヒトであるか、またはｋ（ｏｎ）は、約１×１０５以上であり、例えばここで抗体は３Ｄ２であり、ＣＸＣＬ１３はマウスである。別の実施形態では、ｋ（ｏｎ）は、約１×１０６以上であり、例えばここで抗体はＭＡｂ５２６１であり、ＣＸＣＬ１３はヒトまたはマウスである。別の実施形態では、ｋ（ｏｎ）は約１×１０６以上であり、例えばここで抗体はＭＡｂ５３７８であり、ＣＸＣＬ１３はヒトまたはマウスである。一実施形態では、本発明の抗体は、本明細書で開示する標的ポリペプチド（例えばＣＸＣＬ１３、例えばヒト、マウスまたはヒトおよびマウス両方のＣＸＣＬ１３）またはその断片もしくはバリアントに、１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１または５×１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１または１０７Ｍ−１ｓｅｃ−１以上のオンレート（ｋ（ｏｎ））で結合するということができる。
抗体がある程度エピトープへの基準抗体の結合を遮断する程度に抗体がエピトープに優先的に結合するならば、抗体は、所与のエピトープへの基準抗体、例えば本明細書に開示する抗ＣＸＣＬ３抗体、例えばＭＡｂ５２６１、ＭＡｂ５３７８、ＭＡｂ５０８０、ＭＡｂ１４７６、３Ｄ２または３Ｃ９の結合を、競合的に阻害するという。競合阻害は、当技術分野において知られる任意の方法、例えば競合ＥＬＩＳＡアッセイにより決定できる。抗体は、所与のエピトープへの基準抗体の結合を、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％または少なくとも５０％競合的に阻害するということができる。
本明細書で用いる場合、用語「親和性」は、免疫グロブリン分子のＣＤＲとの個別のエピトープの結合の強度の尺度のことをいう。例えば、Ｈａｒｌｏｗら（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版）２７〜２８頁を参照されたい。本明細書で用いる場合、用語「結合活性」は、免疫グロブリンの集団と抗原との間の複合体の全体的な安定性、すなわち抗原と免疫グロブリン混合物とが機能的に組み合わさる強度のことをいう。例えば、Ｈａｒｌｏｗの２９〜３４頁を参照されたい。結合活性は、特定のエピトープとの集団中の個別の免疫グロブリン分子の親和性と、免疫グロブリンと抗原との価数との両方に関する。例えば、二価モノクローナル抗体と、高反復性エピトープ構造を有する抗原、例えばポリマーとの間の相互作用は、高い結合活性の１つである。
本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、それらの交差反応性の点で記載または特定することもできる。本明細書で用いる場合、用語「交差反応性」は、ある抗原に特異的な抗体が第２の抗原と反応する能力のことをいい、２つの異なる抗原性物質間の関係性の尺度である。つまり、その形成を誘発したエピトープ以外のエピトープに抗体が結合するならば、抗体は交差反応性である。交差反応性エピトープは、通常、誘導エピトープと同じ相補性構造特徴の多くを含有し、いくつかの場合では、元のものよりも実際によりうまく適合することがある。
例えば、ある抗体は、関係するが同一でないエピトープ、例えば基準エピトープと少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および少なくとも５０％の同一性（当技術分野において知られ、本明細書で記載する方法を用いて算出される）を有するエピトープと該抗体が結合するという、ある程度の交差反応性を有する。抗体は、基準エピトープと９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性（当技術分野において知られ、本明細書で記載する方法を用いて算出される）を有するエピトープと抗体が結合しないならば、ほとんどまたは全く交差反応性を有さないということができる。抗体は、あるエピトープのいずれのその他の類似体、オルソログまたはホモログにも抗体が結合しないならば、抗体は該エピトープについて「高度に特異的」であると考えることができる。
抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、本発明のポリペプチド、例えばＣＸＣＬ１３、例えばヒト、マウスまたはヒトおよびマウス両方のＣＸＣＬ１３に対するそれらの結合親和性の点で記載または特定することもできる。特定の実施形態では、本発明の結合親和性は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍまたは１０−１５Ｍ未満または以下の解離定数またはＫｄを有するものを含む。一実施形態では、抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＣＸＣＬ１３に、約５×１０−９Ｍ〜約５×１０−１０Ｍ未満のＫｄで結合し、例えばここで抗体はＭＡｂ５２６１であり、Ｋｄは約５×１０−９Ｍ以下である。別の実施形態では、抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば本発明の抗体またはその抗原結合断片は、マウスＣＸＣＬ１３に、約５×１０−７Ｍ〜約９×１０−９Ｍ未満のＫｄで結合し、例えばここで抗体はＭＡｂ５２６１であり、Ｋｄは約８×１０−９Ｍ以下である。
本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、「多重特異的」、例えば二重特異的、三重特異的またはそれより多い多重特異性であってよく、これは、これが１または複数の異なる抗原（例えばタンパク質）上に存在する２以上の異なるエピトープを同時に認識してそれに結合することを意味する。つまり、抗ＣＸＣＬ１３抗体が「単一特異的」または「多重特異的」、例えば「二重特異的」であるかは、結合ポリペプチドが反応する異なるエピトープの数のことをいう。多重特異的抗体は、本明細書で記載する標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であるか、または標的ポリペプチドおよび異種エピトープ、例えば異種ポリペプチドもしくは固体支持体材料に特異的であってよい。
本明細書で用いる場合、用語「価数」は、結合ポリペプチドまたはＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体もしくはその抗原結合断片中に存在する、可能性のある結合ドメイン、例えば抗原結合ドメインの数のことをいう。各結合ドメインは、１のエピトープに特異的に結合する。結合ポリペプチドまたはＣＸＣＬ１３結合分子が１より多い結合ドメインを含む場合、各結合ドメインは、同じエピトープ（２つの結合ドメインを有する抗体について「二価単一特異性」と称する）または異なるエピトープ（２つの結合ドメインを有する抗体について「二価二重特異性」と称する）に特異的に結合してもよい。抗体またはその抗原結合断片は、二重特異性で、各特異性について二価であってもよい（「二重特異性四価抗体」と称する）。別の実施形態では、四価ミニボディまたはドメイン欠失抗体を作製できる。
二重特異性二価抗体およびそれらを作製する方法は、例えば米国特許第５，７３１，１６８号；第５，８０７，７０６号；第５，８２１，３３３号；ならびに米国特許出願公開第２００３／０２０７３４号および第２００２／０１５５５３７号（これらすべての開示は、本明細書に参照により組み込まれている）に記載される。二重特異性四価抗体およびそれらを作製する方法は、例えば国際公開第０２／０９６９４８号および国際公開第００／４４７８８号（これらの開示はともに、本明細書に参照により組み込まれる）に記載される。全般的に、国際公開第９３／１７７１５号；国際公開第９２／０８８０２号；国際公開第９１／００３６０号；国際公開第９２／０５７９３号；Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０〜６９頁（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号；第４，７１４，６８１号；第４，９２５，６４８号；第５，５７３，９２０号；第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３頁（１９９２）を参照されたい。
以前に示したように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および３次元形状は、公知である。本明細書で用いる場合、用語「ＶＨドメイン」は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、用語「ＣＨ１ドメイン」は、免疫グロブリン重鎖の最初（最もアミノ末端側）の定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端側である。
本明細書で用いる場合、用語「ＣＨ２ドメイン」は、従来の番号付けスキームを用いて、抗体の例えば約２４４残基〜３６０残基（残基２４４〜３６０、Ｋａｂａｔ番号付けシステム；および残基２３１〜３４０、ＥＵ番号付けシステム；Ｋａｂａｔ ＥＡらを参照されたい）にわたる重鎖分子の一部分を含む。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対形成しない点で、独特である。むしろ、２つのＮ連結分岐炭水化物鎖が、インタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に介在する。ＣＨ３ドメインが、ＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端まで広がり、およそ１０８残基を含むことも十分に報告されている。
本明細書で用いる場合、用語「ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとをつなぐ重鎖分子の一部分を含む。このヒンジ領域は、およそ２５残基を含み、フレキシブルであり、よって、２つのＮ末端抗原結合領域が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域は、３つの別個のドメイン：上部、中間および下部ヒンジドメインに細分化できる（Ｒｏｕｘら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３頁（１９９８））。
本明細書で用いる場合、用語「ジスルフィド結合」は、２つの硫黄原子の間に形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、第２のチオール基とジスルフィド結合またはブリッジを形成できるチオール基を含む。最も多く自然に存在するＩｇＧ分子において、ＣＨ１領域とＣＬ領域とは、ジスルフィド結合により連結され、２つの重鎖は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムを用いて２３９および２４２に相当する位置（２２６位または２２９位、ＥＵ番号付けシステム）にて２つのジスルフィド結合により連結される。
本明細書で用いる場合、用語「キメラ抗体」は、免疫反応性領域または部位が第１の種から得られるかまたはそれに由来し、定常領域（これは、インタクト、部分的または本発明に従って改変されていることがある）が第２の種から得られる任意の抗体を意味するために用いられる。特定の実施形態では、標的結合領域または部位は、非ヒト供給源（例えばマウスまたは霊長類）からであり、定常領域はヒト（例えば本明細書で記載するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）１４７６）である。
本明細書で用いる場合、用語「工学的に作製された抗体」は、重鎖もしくは軽鎖または両方のいずれかにおける可変ドメインが、既知の特異性の抗体からの１または複数のＣＤＲの少なくとも部分的な置き換えにより、そして必要であれば、部分的フレームワーク領域置き換えおよび配列変更により変更された抗体のことをいう。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体とクラスまたはサブクラスでさえが同じ抗体に由来できるが、ＣＤＲは、異なるクラスの抗体、そして好ましくは異なる種の抗体に由来することが構想される。既知の特異性の非ヒト抗体からの１または複数の「ドナー」ＣＤＲが、ヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域中にグラフトされた工学的に作製された抗体は、本明細書において「ヒト化抗体」という。ある可変ドメインの抗原結合能力を別のものに移すために、全てのＣＤＲをドナー可変ドメインからの完全ＣＤＲに置き換える必要はないことがある。むしろ、標的結合部位の活性を維持するために必要な残基を移すことだけが必要になり得る。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ドナー可変重鎖ドメインからの１、２または３つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、ヒト化抗体は、ドナー可変軽鎖ドメインからの１、２または３つのＣＤＲを含む。
ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖または両方における可変ドメイン中のフレームワーク領域が、ヒト起源の残基のみを含み得ることがさらに認識され、この場合、ヒト化抗体（例えばＭＡｂ５０８０または５２６１）のこれらのフレームワーク領域は、「完全ヒトフレームワーク領域」という。代わりに、ドナー可変ドメインの１以上のフレームワーク領域の１または複数の残基を、ヒト化抗体の重鎖もしくは軽鎖または両方における可変ドメインのヒトフレームワーク領域の対応する位置内で必要に応じて工学的に作製して、ＣＸＣＬ１３抗原との適当な結合を維持するかまたは亢進できる。この様式で工学的に作製されたヒトフレームワーク領域は、よって、ヒトおよびドナーのフレームワーク残基が混合されており、本明細書において「部分的ヒトフレームワーク領域」という。
例えば、抗ＣＸＣＬ１３抗体のヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２〜５２５頁（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ、Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３〜３２７頁（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４〜１５３６頁（１９８８））の方法に従って、げっ歯類もしくは変異げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗ＣＸＣＬ１３抗体の対応する配列に置換することにより、本質的に行うことができる。米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；および第５，８５９，２０５号（参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。得られるヒト化抗ＣＸＣＬ１３抗体は、ヒト化抗体の重鎖および／または軽鎖の可変ドメインの完全ヒトフレームワーク領域内に、少なくとも１つのげっ歯類または変異げっ歯類ＣＤＲを含み得る。いくつかの場合では、ヒト化抗ＣＸＣＬ１３抗体の１または複数の可変ドメインのフレームワーク領域内の残基は、対応する非ヒト（例えばげっ歯類）残基で置き換えられ（例えば米国特許第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；および第６，１８０，３７０号を参照されたい）、この場合、得られるヒト化抗ＣＸＣＬ１３抗体は、重鎖および／または軽鎖の可変ドメイン内に部分的ヒトフレームワーク領域を含み得る。
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見出されない残基を含んでよい。これらの改変は、抗体性能をさらに改良するため（例えば所望の親和性を得るため）に作製される。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、全てまたは実質的に全てのＣＤＲは、非ヒトヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てのまたは実質的に全てのフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、場合によって、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部分も含む。さらなる詳細について、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ３３１：５２２〜５２５頁（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３〜３２９頁（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３〜５９６頁（１９９２）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。よって、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ないものが、非ヒト種からの対応する配列で置換された抗体を含み得る。実際上、ヒト化抗体は、典型的に、いくつかまたは全てのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのフレームワーク残基が、げっ歯類抗体の類似部位からの残基で置換されたヒト抗体である。例えば米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；および第５，８５９，２０５号を参照されたい。米国特許第６，１８０，３７０号および国際公開第０１／２７１６０号も参照されたい（ここでは、ヒト化抗体および所定の抗原に対する親和性が改善されたヒト化抗体を生成する技術が開示されている）。
本明細書で用いる場合、用語「連結された」、「融合された」または「融合」は、交換可能に用いられる。これらの用語は、２以上の要素または成分を、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段を含むいずれかの手段によりつなぐことをいう。「インフレーム融合」は、元のＯＲＦの正しい翻訳リーディングフレームを維持する様式で、２以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をつないで、連続するより長いＯＲＦを形成することをいう。つまり、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによりコードされるポリペプチドに対応する２以上のセグメント（これらのセグメントは、自然では、通常、そのようにつながれていない）を含有する単一タンパク質である。リーディングフレームは、このようにして、融合されたセグメント全体を通して連続的にされるが、セグメントは、例えばインフレームリンカー配列により物理的または空間的に分けられてよい。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドは、インフレームで融合できるが、「融合された」ＣＤＲが連続的ポリペプチドの一部として同時翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域またはさらなるＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドにより分けられてよい。
ポリペプチドの関係において、「直鎖状配列」または「配列」は、アミノ末端からカルボキシル末端方向でのポリペプチド中のアミノ酸の順序であり、ここで、配列中で互いに隣にある残基は、ポリペプチドの１次構造において連続的である。
用語「発現」は、本明細書で用いる場合、遺伝子が生化学的物質、例えばポリペプチドを生成するプロセスのことをいう。このプロセスは、限定することなく、遺伝子ノックダウンならびに一過性発現および安定的発現の両方を含む、細胞内での遺伝子の機能的存在の任意の顕れを含む。これは、限定することなく、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への遺伝子の転写、およびポリペプチドへのそのようなｍＲＮＡの翻訳を含む。所望の最終生成物が生化学的物質であるならば、発現は、その生化学的物質と任意の前駆体の創出を含む。遺伝子の発現は「遺伝子生成物」を生成する。本明細書で用いる場合、遺伝子生成物は、核酸、例えば遺伝子の転写により生成されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写産物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書で記載する遺伝子生成物は、転写後修飾、例えばポリアデニル化された核酸、または翻訳後修飾、例えばメチル化、グリコシル化、脂質付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク質分解切断などを受けたポリペプチドをさらに含む。
本明細書で用いる場合、用語「処置する」または「処置」は、治療的処置および予防的または防止的措置の両方のことをいい、ここで、目的は、多発性硬化症、ループス、関節炎もしくはがんの進行のような望ましくない生理的変化または障害を妨げるかまたは遅くする（少なくする）ことである。有益なまたは所望の臨床的結果は、それらに限定されないが、検出可能または検出不可能な、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち悪化しない）、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善もしくは一次的緩和および寛解（部分的または完全のいずれか）を含む。「処置」は、処置を受けない場合に予期される生存と比較して延長された生存も意味し得る。処置を必要とするものは、状態または障害を既に有するもの、および状態もしくは障害を有する傾向にあるものまたは状態もしくは障害を妨げようとするものを含む。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」により、それについての診断、予後または治療が所望される任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象は、ヒト、家畜、畜産動物ならびに動物園、スポーツまたはペット動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシなどを含む。
本明細書で用いる場合、「抗ＣＸＣＬ１３抗体の投与により利益を受け得る対照」および「処置を必要とする動物」のような句は、例えば抗ＣＸＣＬ１３ポリペプチドの検出のため（例えば診断手順のため）に、用いる抗ＣＸＣＬ１３抗体の投与から、および／または抗ＣＸＣＬ１３抗体を用いる処置、すなわち疾患の一次的緩和もしくは防止から利益を受け得る哺乳動物対象のような対象を含む。本明細書でより詳細に記載するように、抗ＣＸＣＬ１３抗体は、非コンジュゲート形態で用いることができるか、または例えば薬物、プロドラッグもしくは同位体にコンジュゲートできる。
ＩＩ．標的ポリペプチドの説明
本明細書で用いる場合、用語「ＣＸＣＬ１３」および「ＣＸＣＬ１３ポリペプチド」は、交換可能に用いられる。特定の実施形態では、ＣＸＣＬ１３は、完全サイズＣＸＣＬ１３もしくはその断片、またはＣＸＣＬ１３バリアントポリペプチドを含んでよく、ここで、ＣＸＣＬ１３の断片またはＣＸＣＬ１３バリアントポリペプチドは、完全サイズＣＸＣＬ１３のいくらかまたは全ての機能的特性を保持する。ヒトＣＸＣＬ１３ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列（それぞれ配列番号１９および２０）は記載されており、例えばＬｅｇｌｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７（４）：６５５〜６６０頁（１９９８）を参照されたい。マウスＣＸＣＬ１３ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列（それぞれ配列番号２１および２２）は記載されており、例えばＧｕｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ３９１（６６６９）：７９９〜８０３頁（１９９８）を参照されたい。さらに、カニクイザルＣＸＣＬ１３ポリペプチド配列は、配列番号２３に示すように、記載されている。
ＩＩＩ．抗ＣＸＣＬ１３抗体
ＣＸＣＬ１３に結合する市販の抗体、例えばラット抗マウスＭＡｂ４７０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびマウス抗ヒトＭＡｂ８０１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、当技術分野において開示されている。さらに、マウス抗ＣＸＣＬ１３抗体は、米国特許出願公開第２００８ ０２２７７０４Ａ１号に開示されている。
本発明の抗体は、抗ＣＸＣＬ１３抗体、またはＣＸＣＬ１３に結合するその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体、例えばＭＡｂ５２６１、ＭＡｂ５３７８、ＭＡｂ５０８０、ＭＡｂ１４７６、３Ｄ２または３Ｃ９を含む。特定の実施形態では、抗ＣＸＣＬ１３抗体は、ヒト、霊長類、マウスまたはヒトおよびマウス両方のＣＸＣＬ１３に結合する。特定の実施形態では、本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体は、ヒト化されている。他の実施形態では、抗ＣＸＣＬ１３抗体は、その受容体、例えばＣＸＣＲ５へのＣＸＣＬ１３の結合を遮断する。特定の実施形態では、本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体は、ＭＡｂ５２６１、ＭＡｂ５３７８、ＭＡｂ５０８０、ＭＡｂ１４７６、３Ｄ２、３Ｃ９またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体である。
一実施形態では、本発明は、基準抗体、例えばＭＡｂ５２６１、ＭＡｂ５３７８、ＭＡｂ５０８０、ＭＡｂ１４７６、３Ｄ２または３Ｃ９と同じＣＸＣＬ１３エピトープに特異的に結合する単離結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片、バリアントおよび誘導体を提供する。別の実施形態では、本発明は、ＣＸＣＬ１３に特異的に結合し、基準抗体、例えばＭＡｂ５２６１、ＭＡｂ５３７８、ＭＡｂ５０８０、ＭＡｂ１４７６、３Ｄ２または３Ｃ９が、ＣＸＣＬ１３、例えばヒト、霊長類、マウスまたはヒトおよびマウス両方のＣＸＣＬ１３に特異的に結合することを競合的に阻害する単離結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片を提供する。
特定の実施形態では、本発明の結合分子は、基準抗ＣＸＣＬ１３抗体分子についてのアミノ酸配列の少なくとも約８０％、約８５％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％または約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態では、結合分子は、基準抗体と少なくとも約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％の配列同一性を共有する。特定の実施形態では、基準抗体は、ＭＡｂ５２６１、ＭＡｂ５３７８、ＭＡｂ５０８０、ＭＡｂ１４７６、３Ｄ２または３Ｃ９である。
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）を含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる単離抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、ＶＨドメインのＣＤＲの少なくとも１つは、配列番号３または１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または同一であるアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）を含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる単離抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、ＶＨドメインのＣＤＲの少なくとも１つは、配列番号４、５または６と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または同一であるアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）を含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる単離抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、ＶＨドメインは、配列番号３または１３と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または同一のアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）を含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる単離抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、ＶＨドメインのＣＤＲの少なくとも１つは、配列番号３または１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３と１、２、３、４または５の保存的アミノ酸置換を除いて同一であるアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）を含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる単離抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、ＶＨドメインのＣＤＲの少なくとも１つは、配列番号４、５または６と１、２、３、４または５の保存的アミノ酸置換を除いて同一であるアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号３または１３と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる単離抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、コードされるＶＨドメインを含む抗ＣＸＣＬ１３抗体は、ＣＸＣＬ１３に特異的または優先的に結合する。
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）を含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる単離抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、ＶＬドメインのＣＤＲの少なくとも１つは、配列番号８、１５または１７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または同一であるアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）を含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる単離抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、ＶＬドメインのＣＤＲの少なくとも１つは、配列番号９、１６、１０または１１と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または同一であるアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）を含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる単離抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、ＶＬドメインは、配列番号８、１５または１７と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または同一であるアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）を含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる単離抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、ＶＬドメインのＣＤＲの少なくとも１つは、配列番号８、１５または１７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３と１、２、３、４または５の保存的アミノ酸置換を除いて同一であるアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）を含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる単離抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、ＶＬドメインのＣＤＲの少なくとも１つは、配列番号９、１６、１０または１１と１、２、３、４または５の保存的アミノ酸置換を除いて同一であるアミノ酸配列を有する。
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号８、１５または１７と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる単離抗体またはその抗原結合断片を含み、ここで、コードされるＶＬドメインを含む抗ＣＸＣＬ１３抗体は、ＣＸＣＬ１３に特異的または優先的に結合する。
本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体の適切な生物活性バリアントを、本発明の方法において用いることができる。このようなバリアントは、親の抗ＣＸＣＬ１３抗体の所望の結合特性を保持する。抗体バリアントを作製する方法は、当技術分野において一般的に利用可能である。
突然変異誘発およびヌクレオチド配列変更の方法は、当技術分野において公知である。例えば、ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８〜４９２頁（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７〜３８２頁（１９８７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）；米国特許第４，８７３，１９２号；およびその中で引用される参考文献（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。対象とするポリペプチドの生物活性に影響しない適当なアミノ酸置換についての手引きは、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）、３４５〜３５２頁（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）中のＤａｙｈｏｆｆら（１９７８）のモデルで見出すことができる。Ｄａｙｈｏｆｆらのモデルは、点許容変異（ＰＡＭ）アミノ酸相似マトリクス（ＰＡＭ２５０マトリクス）を用いて、適切な保存的アミノ酸置換を決定する。あるアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸に交換するような保存的置換が好ましいことがある。ＤａｙｈｏｆｆらのモデルのＰＡＭ２５０マトリクスにより教示される保存的アミノ酸置換の例は、それらに限定されないが、Ｇｌｙ←→Ａｌａ、Ｖａｌ←→Ｉｌｅ←→Ｌｅｕ、Ａｓｐ←→Ｇｌｕ、Ｌｙｓ←→Ａｒｇ、Ａｓｎ←→ＧｌｎおよびＰｈｅ←→Ｔｒｐ←→Ｔｙｒを含む。
抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片、すなわち対象とするポリペプチドのバリアントの構築において、バリアントが継続して所望の特性を有するように、例えばＣＸＣＬ１３、例えばヒト、霊長類、マウスまたはヒトおよびマウス両方のＣＸＣＬ１３に特異的に結合できるように改変を作製する。明らかに、バリアントポリペプチドをコードするＤＮＡ中に作製されるいずれの変異も、リーディングフレームから外れて配列を配置してはならず、好ましくは、２次ｍＲＮＡ構造を生成し得る相補領域を創出しない。例えば欧州特許第ＥＰ００７５４４４Ｂ１号を参照されたい。
抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片の結合特異性を測定する方法は、それらに限定されないが、標準的競合結合アッセイ、Ｔ細胞またはＢ細胞による免疫グロブリン分泌をモニタリングするアッセイ、Ｔ細胞増殖アッセイ、アポトーシスアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイなどを含む。例えば国際公開第９３／１４１２５号；Ｓｈｉら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１３：６３３〜６４２頁（２０００）；Ｋｕｍａｎｏｇｏｈら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１６９：１１７５〜１１８１頁（２００２）；Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１６７：４３２１〜４３２８頁（２００１）；Ｗａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ９７：３４９８〜３５０４頁（２００１）；およびＧｉｒａｕｄｏｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１７２（２）：１２４６〜１２５５頁（２００４）（これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるアッセイを参照されたい。
本明細書で開示する定常領域、ＣＤＲ、ＶＨドメインまたはＶＬドメインを含む任意の特定のポリペプチドが、別のポリペプチドと少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％さえ同一であるかを本明細書で論じる場合、％同一性は、それらに限定されないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｕｎｉｘ用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）のような当技術分野において知られる方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェアを用いて決定できる。ＢＥＳＴＦＩＴは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２〜４８９頁の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の相同性の最良のセグメントを見出す。ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意のその他の配列アラインメントプログラムを用いて特定の配列が、本発明による参照配列と例えば９５％同一であるかを決定する場合、パラメータは、もちろん、同一性のパーセンテージが参照ポリペプチド配列の全長にわたって算出され、参照配列中のアミノ酸の総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように設定される。
本発明の目的のために、パーセント配列同一性は、１２のギャップ開始ペナルティ、２のギャップ伸長ペナルティ、６２のＢＬＯＳＵＭマトリクスでアフィンギャップ検索を用いるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを用いて決定してよい。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２〜４８９頁に教示されている。バリアントは、例えば、わずか１〜１５のアミノ酸残基、１〜１０、例えばわずか６〜１０のアミノ酸残基、わずか５、４、３、２またはわずか１のアミノ酸残基だけ、基準抗ＣＸＣＬ１３抗体（例えばＭＡｂ５２６１、ＭＡｂ５３７８、ＭＡｂ５０８０、ＭＡｂ１４７６、３Ｄ２または３Ｃ９）と異なってよい。
ＣＸＣＬ１３に特異的に結合でき、所望のＣＸＣＬ１３遮断活性を保持するポリペプチドの精密な化学構造は、いくつかの因子に依存する。イオン化可能なアミノおよびカルボキシル基が分子中に存在するので、特定のポリペプチドは、酸性もしくは塩基性の塩としてまたは中性の形態で得ることができる。適切な環境条件においた場合にそれらの生物活性を保持する全てのこのような調製物は、本明細書で用いる場合の抗ＣＸＣＬ１３抗体の定義に含まれる。さらに、ポリペプチドの１次アミノ酸配列は、糖部分（グリコシル化）または脂質、リン酸塩、アセチル基などの他の補助分子を用いる誘導体化により増強してよい。これは、糖とのコンジュゲーションにより増強してもよい。このような増強のある態様は、生成宿主の翻訳後プロセシングシステムにより達成される。その他のこのような改変は、インビトロで導入してよい。いずれの場合でも、このような改変は、抗ＣＸＣＬ１３抗体の所望の特性が損なわれない限り、本明細書で用いる抗ＣＸＣＬ１３抗体の定義に含まれる。このような改変は、様々なアッセイにおいて、ポリペプチドの活性を亢進または減少させることにより、活性に量的または質的に影響し得ることが予期される。さらに、鎖中の個別のアミノ酸残基は、酸化、還元またはその他の誘導体化により改変されることがあり、ポリペプチドは、活性を保持する断片を得るために切断されることがある。所望の特性（例えばＣＸＣＬ１３についての結合特異性、結合親和性および／またはＣＸＣＬ１３遮断活性）を損なわないこのような変更は、ポリペプチド配列を、本明細書で用いる対象とする抗ＣＸＣＬ１３抗体の定義から除去しない。
当技術分野は、ポリペプチドバリアントの調製および使用に関して実質的な手引きを提供する。抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片、バリアントの調製において、当業者は、天然タンパク質のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対するどの改変が、本発明の方法において用いる医薬組成物の治療活性成分として用いるために適切なバリアントをもたらすかを容易に決定できる。
抗ＣＸＣＬ１３抗体の定常領域は、いくつかの様式で、エフェクター機能を変更するために変異させてよい。例えば、米国特許第６，７３７，０５６Ｂ１号および米国特許出願公開第２００４／０１３２１０１Ａ１号（これらは、Ｆｃ受容体との抗体結合を最適化するＦｃ変異を開示する）を参照されたい。
ある抗ＣＸＣＬ１３抗体では、Ｆｃ部分は、当技術分野において知られる技術を用いて、エフェクター機能を減少させるために変異させてよい。例えば、定常領域ドメインの欠失または不活性化（点突然変異またはその他の手段による）は、循環改変抗体のＦｃ受容体結合を低下させ、そのことにより腫瘍局在化を増加させることがある。他の場合では、これは、本発明と一貫する定常領域改変が、補体結合を和らげ、よって血清半減期およびコンジュゲートした細胞毒の非特異的会合を低減することであり得る。定常領域のさらに別の改変を用いてジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を改変してよく、このことは、抗原特異性または抗体フレキシビリティの増加により局在化の亢進を可能にする。改変の結果として得られる生理的プロフィール、バイオアベイラビリティーならびに腫瘍局在化、生体分布および血清半減期のようなその他の生化学的影響は、過度の実験を行うことなく、公知の免疫学的技術を用いて容易に測定および定量できる。
本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体は、例えばその同族エピトープに抗体が特異的に結合することを共有結合が妨げないような抗体への任意の型の分子の共有結合により改変された誘導体も含む。例えば、しかし限定することなく、抗体誘導体は、例えばグリコシル化、アセチル化、ｐｅｇ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／遮蔽基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞性リガンドまたはその他のタンパク質との結合などにより改変された抗体を含む。任意の多数の化学的改変を、それらに限定されないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化などを含む既知の技術により行うことができる。さらに、誘導体は、１または複数の非伝統的アミノ酸を含有してよい。
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。代わりに、飽和突然変異誘発によるようにコード配列の全体または一部にわたって変異を無作為に導入でき、得られた変異体を生物活性についてスクリーニングして、活性（例えばＣＸＣＬ１３についての結合特異性、結合親和性および／またはＣＸＣＬ１３遮断活性）を保持する変異体を同定できる。
例えば、抗体分子のフレームワーク領域のみまたはＣＤＲ領域のみに変異を導入することが可能である。導入された変異は、サイレントまたは中立ミスセンス変異であってよく、すなわち抗原と結合する抗体の能力に対して全くまたはほとんど影響しない。これらの型の変異は、コドン使用を最適化するためまたはハイブリドーマの抗体生成を改善するために有用であり得る。代わりに、非中立ミスセンス変異は、抗原と結合する抗体の能力を変更し得る。ほとんどのサイレントおよび中立ミスセンス変異の場所は、フレームワーク領域内であることが多いが、ほとんどの非中立ミスセンス変異の場所は、ＣＤＲ内であることが多い（しかし、これは絶対的な要件でない）。当業者は、抗原結合活性に変更がないかまたは結合活性に変更がある（例えば抗原結合活性の改善または抗体特異性の変化）ことのような所望の特性を有する変異体分子を設計して試験できる。突然変異誘発の後に、コードされるタンパク質を慣例的に発現させ、コードされたタンパク質の機能的および／または生物学的な活性（例えばＣＸＣＬ１３ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープに免疫特異的に結合する能力）を、本明細書に記載される技術を用いてまたは当技術分野において知られる技術を慣例的に改変することにより決定できる。
特定の実施形態では、本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体は、少なくとも１つの最適化相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。「最適化ＣＤＲ」により、ＣＤＲが改変され、最適化配列が、結合親和性および／もしくは最適化ＣＤＲを含む抗ＣＸＣＬ１３抗体に与えられる抗ＣＸＣＬ１３活性の持続または改善に基づいて選択されることを意図する。「抗ＣＸＣＬ１３活性」または「ＣＸＣＬ１３遮断活性」は、ＣＸＣＬ１３に関連する以下の活性の１または複数を調節する活性を含み得る。Ｂ細胞および濾胞ＢヘルパーＴ細胞が炎症性組織に移動することおよび胚中心形成（例えば自己免疫疾患の場合）に干渉する、その受容体とのＣＸＣＬ１３の相互作用の遮断；がん細胞の増殖および腫瘍学的障害へ広がる能力の阻害；またはＣＸＣＬ１３発現細胞に関連する任意のその他の活性。抗ＣＸＣＬ１３活性は、それらに限定されないが、ある型の自己免疫疾患（例えば多発性硬化症、関節炎（例えば関節リウマチ）、慢性胃炎、胃リンパ腫、移植片拒絶、シェーグレン症候群（ＳＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｃ型肝炎ウイルス感染における活動性混合型クリオグロブリン血症（ＭＣ）血管炎、若年性皮膚筋炎および重症筋無力症）およびある種のがん（例えばバーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫（例えば胃ＭＡＬＴリンパ腫）、癌（例えば結腸、前立腺、乳、胃、食道および膵臓）および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ））ならびにその他の炎症性疾患、例えばヘリコバクター感染誘発性炎症性疾患、例えば胃炎、潰瘍および胃粘膜病変を含むＣＸＣＬ１３発現に関連する疾患の発生率または重症度の減少に起因すると考えることもできる。
ＩＶ．抗ＣＸＣＬ１３抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明は、本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体をコードする核酸分子も提供する。
一実施形態では、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨドメイン）をコードする核酸を含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供し、ここで、ＶＨドメインのＣＤＲの少なくとも１つは、配列番号２または１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３から選択されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または同一であるアミノ酸配列を有する。
他の実施形態では、本発明は、免疫グロブリンＶＨドメインをコードする核酸を含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供し、ここで、ＶＨドメインのＣＤＲの少なくとも１つは、（ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；（ｂ）配列番号５に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号３または配列番号１３を含む基準ＶＨドメインポリペプチド配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨドメインをコードする核酸を含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる単離ポリヌクレオチドを含み、ここで、コードされるＶＨドメインを含む抗ＣＸＣＬ１３抗体は、ＣＸＣＬ１３に特異的または優先的に結合する。
さらなる実施形態では、本発明は、ＶＨドメインをコードする核酸を含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる単離ポリヌクレオチドを含み、ここで、該ポリヌクレオチド配列は、配列番号２または配列番号１２を含む配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％同一であり、コードされるＶＨドメインを含む抗ＣＸＣＬ１３抗体は、ＣＸＣＬ１３に特異的または優先的に結合する。
一実施形態では、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬドメイン）をコードする核酸を含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供し、ここで、ＶＬドメインのＣＤＲの少なくとも１つは、配列番号８、配列番号１５または配列番号１７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３のポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または同一であるアミノ酸配列を有する。
他の実施形態では、本発明は、免疫グロブリンＶＬドメインをコードする核酸を含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる単離ポリヌクレオチドを提供し、ここで、ＶＬドメインのＣＤＲの少なくとも１つは、（ａ）配列番号９または１６に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号１１に示すアミノ酸配列を含むＣＤＲ３からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号８、１５または１７を含む基準ＶＬドメインポリペプチド配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬドメインをコードする核酸を含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる単離ポリヌクレオチドを含み、ここで、コードされるＶＬドメインを含む抗ＣＸＣＬ１３抗体は、ＣＸＣＬ１３に特異的または優先的に結合する。
さらなる実施形態では、本発明は、ＶＬドメインをコードする核酸を含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる単離ポリヌクレオチドを含み、ここで、該ポリヌクレオチド配列は、配列番号７、配列番号１４または配列番号１８を含む配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％同一であり、コードされるＶＬドメインを含む抗ＣＸＣＬ１３抗体は、ＣＸＣＬ１３に特異的または優先的に結合する。
上記のポリヌクレオチドはいずれも、例えば、コードされるポリペプチドの分泌を駆動するシグナルペプチド、本明細書で記載する抗体定常領域または本明細書で記載するその他の異種ポリペプチドをコードするさらなる核酸をさらに含んでよい。また、本明細書の他の場所でより詳細に記載するように、本発明は、上記のポリヌクレオチドの１または複数を含む組成物を含む。
一実施形態では、本発明は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含む組成物であって、前記第１のポリヌクレオチドが、本明細書で記載するＶＨドメインをコードし、前記第２のポリヌクレオチドが、本明細書で記載するＶＬドメインをコードする組成物を含む。具体的に、配列番号２および１２に示すＶＨドメインコードポリヌクレオチドと、ＶＬドメインコードポリヌクレオチド、例えば配列番号７、１４または１８に示すＶＬドメインをコードするポリヌクレオチドを含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる組成物。
本発明は、他の場所で記載するように、本発明のポリヌクレオチドの断片も含む。さらに、融合ポリポリペプチド、Ｆａｂ断片および本明細書で記載するその他の誘導体をコードするポリヌクレオチドも、本発明により企図される。
ポリヌクレオチドは、当技術分野において知られる任意の方法により生成または製造できる。例えば、抗体のヌクレオチド配列がわかっているならば、抗体をコードするポリヌクレオチドを、化学合成オリゴヌクレオチドから組み立てることができ（例えばＫｕｔｍｅｉｅｒら、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１７：２４２頁（１９９４）に記載されるようにして）、これは、簡単に述べると、抗体をコードする配列の部分を含有するオーバーラップオリゴヌクレオチドの合成と、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションと、次いで、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅とを含む。
代わりに、本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体または抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸から作製できる。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが入手可能でないが、抗体分子の配列がわかっているならば、抗体をコードする核酸は、化学合成できるか、あるいは適切な供給源（例えば抗体ｃＤＮＡライブラリー、あるいは抗体もしくはその他の抗ＣＸＣＬ１３抗体を発現する任意の組織または細胞、例えば抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーまたはそれから単離した核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から、配列の３’および５’端にハイブリダイズできる合成プライマーを用いるＰＣＲにより、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて例えば抗体もしくはその他の抗ＣＸＣＬ１３抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを同定するクローニングにより得ることができる。ＰＣＲにより作製される増幅核酸は、次いで、当技術分野において公知の任意の方法を用いて複製可能なクローニングベクターにクローニングできる。
抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が一旦決定されると、そのヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列の操作のための当技術分野において公知の方法、例えば組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなどを用いて操作して（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）およびＡｕｓｕｂｅｌら編（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ）（これらはともにそれらの全体が本明細書に参照により組み込まれている）に記載される技術を参照されたい）、異なるアミノ酸配列を有する抗体を得る、例えばアミノ酸置換、欠失および／または挿入を創出できる。
抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドで構成でき、これらは、未改変ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい。例えば、抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、１本鎖および２本鎖ＤＮＡ、１本鎖および２本鎖領域が混合されたＤＮＡ、１本鎖および２本鎖ＲＮＡ、ならびに１本鎖および２本鎖領域が混合されたＲＮＡ、１本鎖もしくはより典型的には２本鎖または１本鎖および２本鎖領域が混合され得るＤＮＡとＲＮＡとを含むハイブリッド分子で構成できる。さらに、抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡとの両方を含む３本鎖領域で構成できる。抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、１または複数の修飾塩基あるいは安定性もしくはその他の理由のために修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡ主鎖を含有してもよい。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基およびイノシンのような特殊塩基を含む。様々な修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに対して行うことができる。つまり、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態を包含する。
免疫グロブリン（例えば免疫グロブリン重鎖部分または軽鎖部分）に由来するポリペプチドの非自然バリアントをコードする単離ポリヌクレオチドは、１もしくは複数のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされるタンパク質に導入されるように、１もしくは複数のヌクレオチド置換、付加または欠失を免疫グロブリンのヌクレオチド配列に導入することにより創出できる。変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ仲介突然変異誘発のような標準的な技術により導入できる。好ましくは、保存的アミノ酸置換を、１または複数の非必須アミノ酸残基にて作製する。
Ｖ．融合タンパク質および抗体コンジュゲート
本明細書の他の場所でより詳細に論じるように、抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、さらに、Ｎ末端もしくはＣ末端にて異種ポリペプチドと組換えにより融合できるか、またはポリペプチドもしくはその他の組成物と化学的にコンジュゲート（共有的および非共有的コンジュゲーションを含む）できる。例えば、抗ＣＸＣＬ１３抗体は、検出アッセイにおいて標識として有用な分子および異種ポリペプチド、薬物、放射性核種もしくは毒素のようなエフェクター分子と組換えにより融合またはコンジュゲートできる。例えば、国際公開第９２／０８４９５号；国際公開第９１／１４４３８号；国際公開第８９／１２６２４号；米国特許第５，３１４，９９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照されたい。
本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、改変された誘導体を含むことができ、すなわち抗ＣＸＣＬ１３に結合する抗体を共有的付着が妨げないような抗体への任意の型の分子の共有的付着による。例えば、しかし限定することなく、抗体誘導体は、例えばグリコシル化、アセチル化、ｐｅｇ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／遮蔽基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞性リガンドまたはその他のタンパク質との結合などにより改変された抗体を含む。任意の多数の化学的改変を、それらに限定されないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化などを含む既知の技術により行うことができる。さらに、誘導体は、１または複数の非伝統的アミノ酸を含有してよい。
抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、ペプチド結合または改変ペプチド結合により互いにつながれたアミノ酸、すなわちペプチドアイソスターで構成でき、遺伝子によりコードされる２０のアミノ酸以外のアミノ酸を含有してよい。例えば抗ＣＸＣＬ１３抗体は、翻訳後プロセシングのような自然のプロセスにより、または当技術分野において公知の化学改変技術により改変できる。このような改変は、基本的な参考書およびより詳細な研究論文ならびに巻数が多い研究文献に十分に記載されている。改変は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノもしくはカルボキシル末端または炭水化物のような部分を含む抗ＣＸＣＬ１３結合分子の任意の場所で生じることができる。所与の抗ＣＸＣＬ１３結合分子中のいくつかの部位にて同じまたは変動する程度の同じ型の改変が存在できることが認識される。また、所与の抗ＣＸＣＬ１３結合分子は、多くの型の改変を含有してよい。抗ＣＸＣＬ１３結合分子は、例えばユビキチン化の結果として分岐してよく、これらは、分岐を有してまたは有さずに環状であってよい。環状、分岐状および分岐状で環状の抗ＣＸＣＬ１３結合分子は、翻訳後の自然のプロセスの結果であってよいか、または合成的方法により作製してよい。改変は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有的付着、ヘム部分の共有的付着、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有的付着、脂質もしくは脂質誘導体の共有的付着、ホスホチジルイノシトールの共有的付着、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有的架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ｐｅｇ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化のようなタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ仲介付加ならびにユビキチン化を含む（例えばＰｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＮＹ；第２版（１９９３）；Ｊｏｈｎｓｏｎ編（１９８３）Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）、１〜１２頁；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６〜６４６頁（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８〜６２頁（１９９２）を参照されたい）。
本発明は、抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体と、異種ポリペプチドとを含む融合タンパク質も提供する。抗体と融合する異種ポリペプチドは、機能のために有用であり得るか、または抗ＣＸＣＬ１３ポリペプチド発現細胞を標的にするために有用である。
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、本発明の抗体の任意の１もしくは複数のＶＨドメインのアミノ酸配列、または本発明の抗体の任意の１もしくは複数のＶＬドメインのアミノ酸配列あるいはその断片もしくはバリアントと、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる。
別の実施形態では、本明細書で開示する診断および処置方法において用いるための融合タンパク質は、抗ＣＸＣＬ１３抗体のＶＨドメインの任意の１、２、３のＣＤＲのアミノ酸配列またはその断片、バリアントもしくは誘導体および／あるいは抗ＣＸＣＬ１３抗体のＶＬドメインの任意の１、２、３のＣＤＲのアミノ酸配列またはその断片、バリアントもしくは誘導体と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含むか、本質的にそれからなるかまたはそれからなる。一実施形態では、融合タンパク質は、本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体の少なくとも１つのＶＨドメインのアミノ酸配列および本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体の少なくとも１つのＶＬドメインのアミノ酸配列またはその断片、誘導体もしくはバリアントと、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含む。好ましくは、融合タンパク質のＶＨおよびＶＬドメインは、ＣＸＣＬ１３の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する、単一供給源の抗体（またはｓｃＦｖもしくはＦａｂ断片）に相当する。まだ別の実施形態では、本明細書で開示する診断および処置方法において用いるための融合タンパク質は、抗ＣＸＣＬ１３抗体のＶＨドメインの任意の１、２、３以上のＣＤＲのアミノ酸配列および抗ＣＸＣＬ１３抗体のＶＬドメインの任意の１、２、３以上のＣＤＲのアミノ酸配列またはその断片もしくはバリアントと、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含む。好ましくは、ＶＨドメインまたはＶＬドメインの２，３、４、５、６以上のＣＤＲ（複数可）は、本発明の単一供給源の抗体（またはｓｃＦｖもしくはＦａｂ断片）に相当する。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子も本発明に包含される。
文献において報告されている例示的な融合タンパク質は、Ｔ細胞受容体（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：２９３６〜２９４０頁（１９８７））；ＣＤ４（Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ３３７：５２５〜５３１頁（１９８９）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ３３９：６８〜７０頁（１９８９）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ９：３４７〜３５３頁（１９９０）；およびＢｙｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ３４４：６６７〜６７０頁（１９９０））；Ｌ−セレクチン（ホーミング受容体）（Ｗａｔｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：２２２１〜２２２９頁（１９９０）；およびＷａｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ３４９：１６４〜１６７頁（１９９１））；ＣＤ４４（Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ６１：１３０３〜１３１３頁（１９９０））；ＣＤ２８およびＢ７（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１〜７３０頁（１９９１））；ＣＴＬＡ−４（Ｌｉｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５６１〜５６９頁（１９９１））；ＣＤ２２（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、Ｃｅｌｌ６６：１１３３〜１１４４頁（１９９１））；ＴＮＦ受容体（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１０５３５〜１０５３９頁（１９９１）；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２８８３〜２８８６頁（１９９１）；およびＰｅｐｐｅｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３〜１４８９頁（１９９１））；およびＩｇＥ受容体ａ（ＲｉｄｇｗａｙおよびＧｏｒｍａｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第１１５巻、アブストラクト第１４４８号（１９９１））の融合体を含む。
本明細書の他の場所で論じるように、抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、異種ポリペプチドと融合させて、ポリペプチドのインビボ半減期を増加させるか、または当技術分野において知られる方法を用いるイムノアッセイにおいて用いることができる。例えば、一実施形態では、ＰＥＧを本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体にコンジュゲートして、それらの半減期をインビボで増加させることができる。Ｌｅｏｎｇら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ１６：１０６頁（２００１）；Ａｄｖ．ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：５３１頁（２００２）；またはＷｅｉｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ３０：５１２頁（２００２）を参照されたい。
さらに、抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、それらの精製または検出を容易にするためのペプチドのようなマーカー配列と融合できる。特定の実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、なかでもｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．，９１３１１）において提供されるタグのようなヘキサヒスチジンペプチドである（これらの多くは市販で入手可能である）。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８２１〜８２４頁（１９８９）に記載されるように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製をもたらす。精製に有用なその他のペプチドタグは、それらに限定されないが、「ＨＡ」タグ（これは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに相当する（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ３７：７６７頁（１９８４）））および「フラグ」タグを含む。
融合タンパク質は、当技術分野において公知の方法を用いて調製できる（例えば米国特許第５，１１６，９６４号および第５，２２５，５３８号を参照されたい）。融合が作製される精密な部位は、融合タンパク質の分泌または結合の特徴を最適化するために経験的に選択できる。融合タンパク質をコードするＤＮＡを、次いで、発現のために宿主細胞にトランスフェクトする。
抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、コンジュゲートされていない形態で用いることができるか、あるいは例えば分子の治療特性を改善するため、標的検出を容易にするためまたは患者のイメージングもしくは治療のために様々な分子の少なくとも１つとコンジュゲートできる。抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、精製の前もしくは後または精製を行うときに標識またはコンジュゲートできる。
特に、本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的応答修飾物質、薬剤またはＰＥＧとコンジュゲートできる。
当業者は、コンジュゲートさせる選択された物質に依存して様々な技術を用いてコンジュゲートを組み立てることもできることを認識している。例えば、ビオチンとのコンジュゲートは、例えば、結合ポリペプチドをビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのようなビオチンの活性化エステルと反応させることにより調製される。同様に、蛍光マーカーとのコンジュゲートは、カップリング剤、例えば本明細書で列挙するものの存在下で、またはイソチオシアネート、好ましくはフルオレセイン−イソチオシアネートとの反応により調製できる。本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体のコンジュゲートは、類似の様式で調製される。
本発明は、診断剤または治療剤とコンジュゲートした抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば本発明の抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体をさらに包含する。その抗原結合断片、バリアントおよび誘導体を含む抗ＣＸＣＬ１３抗体は、例えば、例えば所与の処置および／または防止計画の効力を決定するための臨床試験手順の一部として疾患の発展または進行をモニタリングするために、診断的に用いることができる。例えば、検出は、抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体を検出可能物質に結合させることにより容易にできる。検出可能物質の例は、様々な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射活性物質、様々な陽電子放射断層撮影を用いる陽電子放射金属、および非放射活性常磁性金属イオンを含む。本発明による診断薬として用いるための抗体にコンジュゲートできる金属イオンについて、例えば米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素の例は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含み、適切な補欠分子団複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み、適切な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンを含み、発光物質の例は、ルミノールを含み、生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを含み、適切な放射活性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９０Ｙまたは９９Ｔｃを含む。
抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、細胞毒、治療剤または放射活性金属イオンのような治療部分とコンジュゲートできる。細胞毒または細胞傷害作用物質は、細胞にとって有害な任意の物質を含む。
抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、それを化学発光化合物に結合させることにより検出可能に標識することもできる。化学発光タグ付加抗ＣＸＣＬ１３結合分子の存在は、次いで、化学反応の経過中に生じる発光の存在を検出することにより決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびオキサレートエステルである。
抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体を検出可能に標識できる方法の１つは、これを酵素に連結させ、連結生成物を酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）において用いることによる（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．、「Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ （ＥＬＩＳＡ）」Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ２：１〜７頁（１９７８）；Ｖｏｌｌｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７〜５２０頁（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２〜５２３頁（１９８１）；Ｍａｇｇｉｏ編（１９８０）Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．；Ｉｓｈｉｋａｗａら編（１９８１）Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｋｇａｋｕ Ｓｈｏｉｎ、Ｔｏｋｙｏ））。抗ＣＸＣＬ１３抗体と結合した酵素は、適当な基質、例えば色素産生基質と、例えば分光光学的、蛍光測定的にまたは視覚的手段により検出できる化学部分を生成するような様式で反応させる。抗体を検出可能に標識するために用いることができる酵素は、それらに限定されないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを含む。さらに、検出は、酵素についての色素酸性基質を用いる比色法により達成できる。検出は、同様に調製した標準物質との比較における基質の酵素反応の程度の視覚的比較により達成してもよい。
検出は、様々なその他のイムノアッセイのいずれを用いて達成してもよい。例えば、抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体を放射活性標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いて結合分子を検出することが可能である（例えばＷｅｉｎｔｒａｕｂ（１９８６年３月）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ）（これは、本明細書に参照により組み込まれている）を参照されたい）。放射活性同位体は、それらに限定されないが、ガンマカウンタ、シンチレーションカウンタまたはオートラジオグラフィを含む手段により検出できる。
抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、１５２Ｅｕまたはランタニド系の他のもののような蛍光放出金属を用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート基を用いて結合分子に付着できる。
様々な部分を抗体、例えば抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体にコンジュゲートするための技術は公知であり、例えばＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら編（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）、２４３〜５６頁中のＡｍｏｎら（１９８５）「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編（第２版；Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、６２３〜５３頁中のＨｅｌｌｓｔｒｏｍら（１９８７）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら編、４７５〜５０６頁中のＴｈｏｒｐｅ（１９８５）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、３０３〜１６頁（１９８５）中の「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」；およびＴｈｏｒｐｅら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９〜５８頁（１９８２）を参照されたい。
ＶＩ．抗体ポリペプチドの発現
抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ配列は、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを公知の方法に従って用いて、同時にまたは別々に作製できる。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマーによりまたは発表された重鎖および軽鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づくより特異的なプライマーにより開始できる。上で論じたように、ＰＣＲを用いて、抗体軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離できる。この場合、ライブラリーを、コンセンサスプライマーまたはマウス定常領域プローブのようなより大きい相同プローブによりスクリーニングできる。
ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡは、当技術分野において知られる技術を用いて細胞から単離し、制限マッピングし、例えば組換えＤＮＡ技術に関する上記の参考文献において詳細に示される標準的で公知の技術に従って配列決定できる。もちろん、ＤＮＡは、単離プロセスまたはその後の分析中の任意の時点で本発明に従って合成的されてよい。
本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体を提供するための単離遺伝物質の操作の後に、抗ＣＸＣＬ１３抗体をコードするポリヌクレオチドを、典型的に、所望の量の抗ＣＸＣＬ１３抗体を生成するために用い得る宿主細胞に導入するために発現ベクターに挿入する。
抗体またはその断片、誘導体もしくは類似体、例えば本明細書で記載する標的分子、例えばＣＸＣＬ１３に結合する抗体の重鎖または軽鎖の組換え発現は、抗体をコードする１または複数のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。本発明の抗体分子あるいは抗体の重鎖もしくは軽鎖またはその一部分（好ましくは重鎖または軽鎖可変ドメインを含む）をコードするポリヌクレオチドが一旦得られると、抗体分子の生成のためのベクターを、当技術分野において公知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術により生成できる。つまり、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含有するポリヌクレオチドを発現することによりタンパク質を調製する方法が本明細書に記載される。当業者に公知の方法を用いて、抗体コード配列ならびに適当な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築できる。これらの方法は、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ遺伝子組み換えを含む。本発明は、つまり、本発明の抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードする、プロモーターに作動可能に連結したヌクレオチド配列を含む複製可能ベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでよく（例えば国際公開第８６／０５８０７号；国際公開第８９／０１０３６号；および米国特許第５，１２２，４６４号を参照されたい）、抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖全体の発現のためにこのようなベクターにクローニングできる。
用語「ベクター」または「発現ベクター」は、本明細書において、宿主細胞に所望の遺伝子を導入して発現させるための媒体としての本発明に従って用いるベクターを意味するために用いる。当業者に知られるように、このようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスからなる群から容易に選択できる。一般的に、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを容易にする適当な制限部位および真核もしくは原核細胞に侵入し、かつ／またはそこで複製する能力を含む。
本発明の目的のために、多数の発現ベクター系を用いることができる。例えば、あるクラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルスのような動物ウイルスに由来するＤＮＡエレメントを利用する。その他のものは、配列内リボソーム結合部位を有するポリシストロン系の使用を含む。さらに、染色体中にＤＮＡを組み込んだ細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１または複数のマーカーを導入することにより選択できる。マーカーは、栄養要求性宿主に原栄養性を、殺生物剤耐性（例えば抗生物質）または銅のような重金属に対する耐性を与えることができる。選択可能マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結できるか、または同時形質転換により同じ細胞に導入できる。さらなるエレメントが、ｍＲＮＡの最適な合成のために必要になることもある。これらのエレメントは、シグナル配列、スプライシングシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサーおよび終結シグナルを含み得る。
特定の実施形態では、クローニングされた可変領域遺伝子を、上で論じたようにして合成された重鎖および軽鎖定常領域遺伝子（例えばヒト）とともに発現ベクターに挿入する。もちろん、真核細胞において発現を誘発できる任意の発現ベクターを本発明において用いることができる。適切なベクターの例は、それらに限定されないが、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１およびｐＺｅｏＳＶ２（インビトロｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能）ならびにプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から入手可能）を含む。一般的に、免疫グロブリン重鎖および軽鎖が適切に高いレベルを発現するものについての、多数の形質転換細胞のスクリーニングは、例えばロボットシステムにより行うことができるような慣例的な実験である。
より一般的に、抗ＣＸＣＬ１３抗体のモノマーサブユニットをコードするベクターまたはＤＮＡ配列が一旦調製されると、発現ベクターを適当な宿主細胞に導入できる。宿主細胞へのプラスミドの導入は、当業者に公知の様々な技術により達成できる。これらは、それらに限定されないが、トランスフェクション（電気泳動およびエレクトロポレーションを含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、被包ＤＮＡを用いる細胞融合、マイクロインジェクションおよびインタクトウイルスを用いる感染を含む。Ｖｅｃｔｏｒｓ、ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）、第２４．２章、４７０〜４７２頁中のＲｉｄｇｗａｙ（１９８８）「Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ」を参照されたい。典型的に、宿主へのプラスミド導入は、エレクトロポレーションによる。発現構築物を有する宿主細胞を、軽鎖および重鎖の生成に適当な条件下で成長させ、重鎖および／または軽鎖タンパク質合成についてアッセイする。例示的なアッセイ技術は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または蛍光標示式細胞分取分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などを含む。
発現ベクターを、宿主細胞に、従来の技術により移入し、トランスフェクトされた細胞を、次いで、従来の技術により培養して、本明細書で記載する方法において用いるための抗体を生成する。つまり、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結した本発明の抗体またはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現のための好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターを、以下に詳述するように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞で同時発現させることができる。
本明細書で用いる場合、「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターを有する細胞のことをいう。組換え宿主からの抗体の単離のためのプロセスの記載において、用語「細胞」および「細胞培養物」は、そうでないと明確に特定しない限り、抗体の供給源を示すために交換可能に用いられる。言い換えると、「細胞」からのポリペプチドの回収は、スピンダウンした細胞全体から、または培地および懸濁細胞の両方を含有する細胞培養物からのいずれかを意味し得る。
様々な宿主−発現ベクター系を用いて、本明細書で記載する方法において用いるための抗体分子を発現できる。このような宿主−発現系は、それにより対象とするコード配列を生成して、その後、精製できる媒体を表すが、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合に、本発明の抗体分子をｉｎ ｓｉｔｕで発現できる細胞も表す。これらは、限定されないが、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染したかもしくは組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム（例えばメタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルス（例えばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含有する組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）を含む。特定の実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、およびさらなる実施形態では、特に組換え抗体分子全体の発現のための真核細胞が、組換え抗体分子の発現のために用いられる。例えば、ヒトサイトメガロウイルスからの主要中間初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターを伴うチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞は、抗体についての有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ４５：１０１頁（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：２頁（１９９０））。
タンパク質発現のために用いられる宿主株化細胞は、頻繁に哺乳動物起源のものである。当業者は、発現させる所望の遺伝子生成物に最も適する具体的な宿主株化細胞を優先的に決定する能力を有すると信じられる。例示的な宿主株化細胞は、それらに限定されないが、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系統、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頚癌）、ＣＶＩ（サル腎臓系統）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系統）、ＳＰ２／Ｏ（マウスミエローマ）、Ｐ３．ｔｉｍｅｓ．６３−Ａｇ３．６５３（マウスミエローマ）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）および２９３（ヒト腎臓）を含む。宿主株化細胞は、商業的なサービスＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたは発表された文献から典型的に入手可能である。
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の特定の様式で遺伝子生成物を改変およびプロセシングする宿主細胞株を選択できる。タンパク質生成物のこのような改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば切断）は、タンパク質の機能のために重要なことがある。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子生成物の翻訳後プロセシングおよび改変について特徴的で特異的な機構を有する。適当な株化細胞または宿主系を選択して、発現される外来タンパク質の正しい改変およびプロセシングを確実にすることができる。このために、１次転写産物の正しいプロセシング、遺伝子生成物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞の仕組みを有する真核宿主細胞を用いることができる。
組換えタンパク質の長期で高収率の生成のために、安定発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定的に発現する株化細胞を工学的に作製できる。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを用いるよりむしろ、宿主細胞を、適当な発現制御エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）と選択可能マーカーとで制御されたＤＮＡで形質転換できる。外来ＤＮＡの導入の後に、工学的に作製された細胞を富栄養培地中で１〜２日間成長させることができ、次いで選択培地に交換する。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を与え、細胞の染色体中に細胞がプラスミドを安定的に組み込み、成長して増殖巣を形成することを可能にする（これが次いでクローニングされ、株化細胞に発展することができる）。この方法は、抗体分子を安定的に発現する株化細胞を工学的に作製するために有利に用いることができる。
それらに限定されないが、ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ１１：２２３頁（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋａおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ４８：２０２頁（１９９２））およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ２２：８１７頁（１９８０））遺伝子（ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ細胞においてそれぞれ用いることができる）を含むいくつかの選択系を用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性を、以下の遺伝子についての選択の基礎として用いることができる：ｄｈｆｒ（これは、メトトレキセートに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：３５７頁（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：１５２７頁（１９８１）））；ｇｐｔ（これは、ミコフェノール酸に対する耐性を与える（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：２０７２頁（１９８１）））；ｎｅｏ（これは、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与えるＣｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ１２：４８８〜５０５頁；ＷｕおよびＷｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ３：８７〜９５頁（１９９１））；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３〜５９６頁（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：９２６〜９３２頁（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１〜２１７頁（１９９３）；ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５〜２１５頁（１９９３年５月））；およびｈｙｇｒｏ（これは、ハイグロマイシンに対する耐性を与える（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ３０：１４７頁（１９８４））。用いることができる組換えＤＮＡ技術の分野において一般的に知られる方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ）；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）中のＫｒｉｅｇｌｅｒ（１９９０）「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」；Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編）（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ）１２および１３章；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１頁（これらはそれらの全体が本明細書に参照により組み込まれている）に記載される。
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅により増やすことができる（総説については、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ（１９８７）「Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）第３巻を参照されたい）。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害物質のレベルが増加すると、マーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅領域は抗体遺伝子と関連するので、抗体の生成も増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７頁（１９８３））。
インビトロ生成は、大量の所望のポリペプチドを得るためのスケールアップを可能にする。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養のための技術は当技術分野において知られており、例えばエアリフトリアクタもしくは連続撹拌リアクタ中での均質懸濁培養、あるいは例えば中空繊維、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジ上での固定化または包括細胞培養を含む。必要でありかつ／または望ましいならば、ポリペプチドの溶液を、例えば合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的生合成の後または本明細書で記載するＨＩＣクロマトグラフィーステップの前もしくは後の慣習的なクロマトグラフィー法、例えばゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロースでのクロマトグラフィー、または（免疫）親和性クロマトグラフィーにより精製できる。
本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体をコードする遺伝子は、昆虫、細菌もしくは酵母または植物細胞のような非哺乳動物細胞において発現することもできる。核酸を容易に取り込む細菌は、腸内細菌のメンバー、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの株もしくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ；Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ；ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを含む。細菌において発現される場合、異種ポリペプチドが典型的に封入体の一部になることがさらに認識される。異種ポリペプチドは、単離し、精製し、次いで機能的分子に組み立てなければならない。四価の形態の抗体が望まれる場合、サブユニットを、次いで、四価抗体に自己集合させる（国際公開第０２／０９６９４８号）。
細菌系において、いくつかの発現ベクターを、発現される抗体分子が意図する使用に依存して有利に選択できる。例えば、抗体分子の医薬組成物の作製のために大量のこのようなタンパク質を生成する場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質生成物の発現を駆動するベクターが望ましい場合がある。このようなベクターは、それらに限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１頁（１９８３））（ここでは、抗体コード配列が、融合タンパク質が生成されるようにｌａｃＺコード領域とインフレームでベクター中に個別にライゲーションされ得る）；ｐＩＮベクター（ＩｎｏｕｙｅおよびＩｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１〜３１０９頁（１９８５）；Ｖａｎ ＨｅｅｋｅおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３〜５５０９頁（１９８９））などを含む。ｐＧＥＸベクターを用いて、外来ポリペプチドを、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させてもよい。一般的に、このような融合タンパク質は、可溶性であり、溶解細胞から、マトリクスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合と、その後の遊離グルタチオンの存在下での溶出とにより容易に精製できる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子生成物がＧＳＴ部分から遊離され得るように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
原核生物に加えて、真核微生物も用いてよい。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは一般的にパン酵母は、真核微生物のうちで最も一般的に用いられるが、いくつかのその他の株、例えばＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓも一般的に利用可能である。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおける発現について、例えばプラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ２８２：３９頁（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ７：１４１頁（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ１０：１５７頁（１９８０））が一般的に用いられる。このプラスミドは、ＴＲＰ１遺伝子を既に含有し、これは、トリプトファン中で成長する能力を欠く酵母変異株、例えばＡＴＣＣ第４４０７６号またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ８５：１２頁（１９７７））についての選択マーカーを提供する。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１欠損の存在は、次いで、トリプトファンの非存在下での成長による形質転換の検出のための有効な環境を提供する。
昆虫系において、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして典型的に用いられる。ウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞で成長する。抗体コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）中に個別にクローニングして、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下におくことができる。
本発明の抗体分子が組換えにより一旦発現されると、これは、免疫グロブリン分子の精製のための当技術分野において知られる任意の方法、例えばクロマトグラフィー（例えばイオン交換、親和性、特にプロテインＡの後の特異的抗原についての親和性、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差的溶解性またはタンパク質の精製のための任意のその他の標準的な技術により精製できる。代わりに、本発明の抗体の親和性を増加させる方法は、米国特許出願公開第２００２ ０１２３０５７Ａ１号に開示される。
ＶＩＩ．治療的抗ＣＸＣＬ１３抗体を用いる処置方法
リンパ系ケモカインＣＸＣＬ１３は、濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）およびマクロファージにより発現される。様々な免疫細胞（例えばＢ細胞、濾胞ヘルパーＴ細胞および活性化されたばかりのＴ細胞）上で見出されるその受容体であるＣＸＣＲ５を介して、ＣＸＣＬ１３は、免疫系恒常性の維持、リンパ器官形成、白血球のやり取りおよび化学走性移動ならびに２次リンパ組織（例えば胚中心）の発達に必要な細胞内変化を誘発する。ＣＸＣＬ１３およびその受容体ＣＸＣＲ５の過剰発現は、様々な自己免疫疾患に関わっている（例えば多発性硬化症（例えばＣｏｒｃｉｏｎｅら、ＰＮＡＳ１０１（３０）：１１０６４〜１１０６９頁（２００４）；Ｓｅｒａｆｉｎｉら、Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．１４：１６４〜１７４頁（２００４）；Ｍａｇｌｉｏｚｚｉら、Ｂｒａｉｎ１３０：１０８９〜１１０４頁（２００７）を参照されたい）、関節炎（例えば関節リウマチ（例えばＲｉｏｊａら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ５８（８）：２２５７〜２２６７頁（２００８）；Ｓｈｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．１６６：６５０〜６５５頁（２００１）；Ｓｃｈｍｕｔｚら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｔｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ７：Ｒ２１７〜Ｒ２２９頁（２００５）；Ｈｊｅｌｍｓｔｒｏｍら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏ．６９：３３１〜３３９頁（２００１）を参照されたい）、慢性胃炎（例えばＨｊｅｌｍｓｔｒｏｍら；Ｍａｚｚｕｃｃｈｅｌｌｉら、Ｂｒａｉｎ１３０：１０８９〜１１０４頁（２００７）を参照されたい）、胃リンパ腫（例えば同著；Ｎｏｂｕｔａｎｉら、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ６０：１５６〜１６４頁（２０１０）を参照されたい）、移植片拒絶（例えばＳｔｅｉｎｍｅｔｚら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ６７：１６１６〜１６２１頁（２００５）を参照されたい）、シェーグレン症候群（ＳＳ）（例えばＢａｒｏｎｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．１８０：５１３０〜５１４０頁（２００８）；Ｈｊｅｌｍｓｔｒｏｍらを参照されたい）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（例えばＳｔｅｉｎｍｅｔｚら、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｒｈｅｕｍ．３７（１）：４５〜５２頁（２０１０）；Ｓｃｈｉｆｆｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１７１：４８９〜４９７頁（２００３）を参照されたい）、Ｃ型肝炎ウイルス感染における活動性混合型クリオグロブリン血症（ＭＣ）血管炎（例えばＳａｎｓｏｎｎｏら、Ｂｌｏｏｄ１１２（５）：１６２０〜１６２７頁（２００８）を参照されたい）、若年性皮膚筋炎（例えばｄｅ Ｐａｄｉｌｌａら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ６０（４）：１１６０〜１１７２頁（２００９）を参照されたい）および重症筋無力症（例えばＭａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．１７６：５１００〜５１０７頁（２００６）；Ｍｅｒａｏｕｎａら、Ｂｌｏｏｄ１０８（２）：４３２〜４４０頁（２００６）；Ｓａｉｔｏら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ１７０：１７２〜１７８頁（２００５）を参照されたい）ならびにある種のがん（例えばバーキットリンパ腫（例えばＦｏｒｓｔｅｒら、Ｂｌｏｏｄ８４：８３０〜８４０頁（１９９４）；Ｆｏｒｓｔｅｒら、Ｃｅｌｌ８７：１０３７〜１０４７頁（１９９６）を参照されたい）、非ホジキンリンパ腫（例えばＴｒｅｎｔｉｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２５１〜８１頁（１９８８）；Ｇｏｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：８１７〜８２６頁（２００５）；Ｈａｍａｇｕｃｈｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：４３８９〜４３９９頁（２００５）を参照されたい）、癌（例えば結腸および膵臓）（例えばＧｕｎｔｈｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ１１６：７２６〜７３３頁（２００５）；Ｍｅｉｊｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６：９５７６〜９５８２頁（２００６）を参照されたい）、乳がん（例えばＰａｎｓｅら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ９９：９３０〜９３８頁（２００８）を参照されたい）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）（例えばＢｕｒｋｌｅら、Ｂｌｏｏｄ１１０：３３１６〜３３２５頁（２００７）を参照されたい）および前立腺がん（例えばＳｉｎｇｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ２８３（１）：２９〜３５頁（２００９）を参照されたい）。ＣＸＣＬ１３活性の阻害のための本発明の方法は、上記の障害に対して治療効果を有することが予期される。
本発明の特定の方法は、ＣＸＣＬ１３発現細胞、例えばＣＸＣＬ１３過剰発現細胞に関連する疾患を有する患者を処置するための抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えばその抗原結合断片、バリアントおよび誘導体を含む抗体の使用を対象とする。「ＣＸＣＬ１３発現細胞」により、ＣＸＣＬ１３抗原を発現する正常および悪性細胞を意図する。細胞においてＣＸＣＬ１３発現を検出するための方法は当技術分野において公知であり、それらに限定されないが、ＰＣＲ技術、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡなどを含む。
以下の議論は、本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体を用いる様々な疾患および障害の診断方法および処置に言及するが、本明細書で開示する方法は、本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体の所望の特性、例えばＣＸＣＬ１３、例えばヒト、霊長類、マウスまたはヒトおよびマウスのＣＸＣＬ１３に特異的に結合できることおよびＣＸＣＬ１３中和活性を有することを保持するこれらの抗ＣＸＣＬ１３抗体の抗原結合断片、バリアントおよび誘導体にも当てはめることができる。
一実施形態では、処置は、本発明の抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片の患者への施用または投与、あるいは抗ＣＸＣＬ１３結合分子の患者からの単離組織または株化細胞への施用または投与を含み、ここで、患者は、疾患、疾患の症状または疾患に対する素因を有する。別の実施形態では、処置は、本発明の抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物の患者への施用または投与、あるいは抗ＣＸＣＬ１３結合分子を含む医薬組成物の患者からの単離組織または株化細胞への施用または投与を含むことも意図し、ここで、患者は疾患、疾患の症状または疾患に対する素因を有する。
本発明の抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその結合断片は、様々な悪性および非悪性腫瘍の処置のために有用である。「抗腫瘍活性」により、悪性ＣＸＣＬ１３発現細胞増殖または蓄積の速度の低下、よって現存する腫瘍の成長速度の減退もしくは治療中に生じる腫瘍の減退および／または現存する新生物（腫瘍）細胞もしくは新しく形成される新生物細胞の破壊、よって治療中の腫瘍の全体的なサイズの減少を意図する。例えば、少なくとも１つの抗ＣＸＣＬ１３抗体を用いる治療は、ヒトにおけるＣＸＣＬ１３発現細胞に関連する疾患状態の処置に関して有益である生理的応答を引き起こす。
一実施形態では、本発明は、医薬品として用いるため、特にがんの処置または予防において用いるためまたは前がん性状態もしくは病変において用いるための本発明による抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその結合断片に関する。特定の実施形態では、本発明の抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその結合断片、例えばＭＡｂ５２６１は、ＣＸＣＬ１３過剰発現がんの処置のために用いられる。特定の実施形態では、本発明の抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその結合断片は、ＣＸＣＬ１３発現もしくは過剰発現白血病、リンパ腫（例えばＭＡＬＴリンパ腫）、結腸、膵臓、胃、食道、乳または前立腺がんの処置のために用いられる。一実施形態では、本発明の抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその結合断片は、がん、例えば結腸または前立腺がんの処置のために用いられる。一実施形態では、本発明の抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその結合断片は、ＣＸＣＲ５発現または過剰発現がんの処置のために用いられる。
がんの処置または防止のための抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその結合断片の有効性は、動物モデルを用いて示すことができる。例えば、前立腺がんの処置または防止のための本発明の抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその結合断片の有効性は、前立腺がんについての動物モデル、例えばＰＣ３−ｌｕｃヒト前立腺がん細胞を注射され、本発明の抗ＣＸＣＬ１３結合分子で処置されたマウスを用いて示すことができる。別の例では、結腸がんの処置または防止のための本発明の抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその結合断片の有効性は、結腸がんについての動物モデル、例えばＣＴ２６結腸癌細胞を注射され、本発明の抗ＣＸＣＬ１３結合分子で処置されたマウスを用いて示すことができる。別の例では、ＭＡＬＴリンパ腫の処置または防止のための本発明の抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその結合断片の有効性は、胃ＭＡＬＴリンパ腫についての動物モデル、例えばヘリコバクター細菌に感染し（Ｎｏｂｕｔａｎｉら（２０１０）を参照されたい）、本発明の抗ＣＸＣＬ１３結合分子で処置されたマウスを用いて示すことができる。Ｎｏｂｕｔａｎｉらのモデルを用いて、ヘリコバクター感染組織の胃リンパ濾胞の低減についての本発明の抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその結合断片の有効性を評価することもできる。
本発明の方法に従って、本明細書の他の場所で定義されるような少なくとも１つの抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片は、悪性ヒト細胞に関する正の治療応答を促進するために用いられる。がんの処置に関する「正の治療応答」により、これらの結合分子、例えば抗体もしくはその断片の抗腫瘍活性に関連する疾患の改善、および／または疾患に関連する症状の改善を意図する。つまり、抗増殖効果、さらなる腫瘍増生の防止、腫瘍サイズの低下、腫瘍脈管構造の減少、がん細胞の数の低下および／または疾患に関連する１もしくは複数の症状の減少が観察できる。つまり、例えば、疾患の改善は、完全応答を特徴とできる。「完全応答」により、以前のいずれの異常なＸ線検査、骨髄および脳脊髄液（ＣＳＦ）の正常化を伴う臨床的に検出できる疾患の非存在を意図する。このような応答は、本発明の方法に従う処置の後少なくとも１カ月間持続しなければならない。代わりに、疾患の改善は、部分的応答として分類できる。「部分的応答」により、新しい病変の非存在下での全ての測定可能な腫瘍量（すなわち対象に存在する腫瘍細胞の数）の少なくとも約５０％の減少（少なくとも１カ月間持続する）を意図する。このような応答は、測定可能な腫瘍にのみ用いることができる。
腫瘍応答は、生物発光イメージング、例えばルシフェラーゼイメージング、骨スキャンイメージングおよび骨髄吸引（ＢＭＡ）を含む腫瘍生検標本採取のようなスクリーニング技術を用いて、腫瘍形態（すなわち全体的な腫瘍量、腫瘍細胞数など）の変化について評価できる。これらの正の治療応答に加えて、抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片を用いる治療を受ける対象は、疾患に関連する症状の改善の有益な効果を経験し得る。例えば、対象は、いわゆるＢ症状、例えば寝汗、発熱、体重減少および／またはじんま疹の減少を経験し得る。
本明細書で記載する抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片は、炎症性疾患およびＣＸＣＬ１３発現細胞に関連する免疫系の機能不全もしくは障害の処置または防止において用いることもできる。炎症性疾患は、炎症および組織破壊またはその組み合わせを特徴とする。「抗炎症活性」により、炎症の低下または防止を意図する。「炎症性疾患」は、開始イベントまたは免疫応答の標的が例えば同種抗原、異種抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、未知抗原またはアレルゲンを含む非自己抗原に関与する任意の炎症性免疫仲介プロセスを含む。
一実施形態では、炎症性疾患は、細菌感染、例えばヘリコバクター感染、例えばＨ．ｐｙｌｏｒｉ、Ｈ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ、Ｈ．ａｃｉｎｏｎｙｃｈｉｓ、Ｈ．ａｎｓｅｒｉｓ、Ｈ．ａｕｒａｔｉ、Ｈ．ｂａｃｕｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｈ．ｂｉｌｉｓ、Ｈ．ｂｉｚｚｏｚｅｒｏｎｉｉ、Ｈ．ｂｒａｎｔａｅ、Ｈ．ｃａｎｄａｄｅｎｓｉｓ、Ｈ．ｃａｎｉｓ、Ｈ．ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｕｓ、Ｈ．ｃｉｎａｅｄｉ、Ｈ．ｃｙｎｏｇａｓｔｒｉｃｕｓ、Ｈ．ｅｑｕｏｒｕｍ、Ｈ．ｆｅｌｉｓ、Ｈ．ｆｅｎｅｌｌｉａｅ、Ｈ．ｇａｎｍａｎｉ、Ｈ．ｈｅｐａｔｉｃｕｓ、Ｈ．ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｏｒｕｍ、Ｈ．ｍａｒｍｏｔａｅ、Ｈ．ｍｕｒｉｄａｒｕｍ、Ｈ．ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｈ．ｐａｍｅｔｅｎｓｉｓ、Ｈ．ｐｕｌｌｏｒｕｍ、Ｈ．ｒａｐｐｉｎｉ、Ｈ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ、Ｈ．ｓａｌｏｍｏｎｉｓ、Ｈ．ｓｕｉｓ、Ｈ．ｔｒｏｇｏｎｔｕｍ、Ｈ．ｔｙｐｈｌｏｎｉｕｓおよびＨ．ｗｉｎｇｈａｍｅｎｓｉｓ感染に関連する。ある実施形態では、ヘリコバクター感染は、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉまたはＨ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ感染である。さらなる実施形態では、ヘリコバクター関連炎症性疾患は、ＭＡＬＴリンパ腫、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）がん（例えば食道または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん）、胃もしくは十二指腸潰瘍、胃炎（胃の裏層の炎症）または胃病変である（例えばＣｈｅｎら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ５５（２）：１３３〜７頁（２００２）；Ｇｅｎｔａら、Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ２４（６）：５７７〜８３頁（１９９３）；Ｏｋｉｙａｍａら、Ｐａｔｈｏｌ Ｉｎｔ５５（７）：３９８〜４０４頁（２００５）を参照されたい）。
一実施形態では、炎症性疾患は、末梢または中枢神経系の炎症性障害である。
さらに、本発明の目的のために、用語「炎症性疾患」は、それらに限定されないが「自己免疫疾患」を含む。本明細書で用いる場合、用語「自己免疫」は、「自己」抗原に関わる炎症性免疫仲介プロセスを包含すると一般的に理解される。自己免疫疾患において、自己抗原は、宿主免疫応答を引き起こす。
一実施形態では、本発明の抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体または抗原結合断片は、多発性硬化症（ＭＳ）を処置または妨げるために用いられる。播種性硬化症または播種性脳脊髄炎としても知られるＭＳは、免疫系が中枢神経系を攻撃して脱髄を導く自己免疫状態である。名称「多発性硬化症」は、神経系に形成される瘢痕（プラークまたは病変ともよばれる硬化）のことをいう。ＭＳ病変は、小脳の脳室、脳幹、大脳基底核および脊髄ならびに視神経に近い白質領域に一般的に関与する。ＭＳは、髄鞘の創出および維持を担う細胞であるオリゴデンドロサイトの破壊をもたらす。ＭＳは、ミエリンの薄化または完全喪失と、疾患が進行するにつれて軸策の切断をもたらす。
ＭＳに伴う神経症状は様々であり得、疾患は、頻繁に、身体および認知能力障害に進行する。ＭＳはいくつかの形態をとり、新しい症状は、孤立した発作（再発型）または経時的なゆっくりとした蓄積（進行型）のいずれかで生じる。発作の間に、症状は完全になくなることがあるが、特に疾患が進行するにつれて、永続的な神経損傷が頻繁にもたらされる。
実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症の広く受け入れられている動物モデルである。ＥＡＥは、脊髄を主に標的にする炎症を伴う、程度が拡大する上行性麻痺を累進的にもたらすＣＮＳの脱髄疾患である。この疾患は、誘発の方法および用いる動物の型に依存して、急性、慢性または再発−寛解経過を呈することができる。Ｂａｇａｅｖａらは、Ｂ細胞およびＣＸＣＬ１３発現樹状細胞を含有する濾胞が、再発−寛解ＥＡＥを有するマウスの炎症性髄膜において形成され、ＣＸＣＬ１３発現のレベルが疾患の経過の間を通して絶え間なく上昇したことを示している。ＣＸＣＬ１３欠損マウスは、寛解速度が減少した温和な疾患を経験し、ＣＸＣＬ１３を抗ＣＸＣＬ１３ ＭＡｂで遮断することにより、Ｂ１０．ＰＬマウスにおいて受動的に誘発したＥＡＥの疾患の減弱が導かれた。Ｂａｇａｅｖａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．１７６：７６７６〜７６８５頁（２００６）。
本発明の抗ＣＸＣＬ１３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、例えばＭＡｂ５２６１を用いるＣＸＣＬ１３の中和を用いて、いくつかの異なる機構、例えば、例えばＢ細胞および濾胞ＢヘルパーＴ細胞が炎症性組織に移動することおよび胚中心形成の干渉をもたらす、その受容体を用いてＣＸＣＬ１３相互作用を遮断することによりＭＳの重症度を低下させることができる。
一実施形態では、本発明の抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体または抗原結合断片は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥまたはループス）を処置または妨げるために用いられる。ＳＬＥは、複数の器官に関わり、異所性胚中心の自発的形成およびいくつかの核抗原に対する自己抗体生成を特徴とする自己免疫疾患である。ＳＬＥは、最も頻繁には、心臓、関節、皮膚、肺、血管、肝臓、腎臓および神経系に影響する。
活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞およびそれらの移動促進性ケモカインＣＸＣＬ１３は、ＳＬＥを含む複数の自己免疫障害の炎症性異所性部位においてみられる組織化されたリンパ組織の形成において重要な役割を演じる。ループス易発症Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｂｌａｃｋ Ｘ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ Ｆ１（ＮＺＢ／ＮＺＷＦ１）マウスは、高力価の抗ｄｓＤＮＡ抗体および腎臓の糸球体における免疫複合体の形成を原因とする重症増殖性糸球体腎炎を自発的に発生する。これらのマウスにおけるループス様症状の発生は、腎臓および胸腺における樹状細胞によるＣＸＣＬ１３の発現の増加を伴う（Ｉｓｈｉｋａｗａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３（１２）：１３９３〜１４０２頁（２００１）；Ｓｃｈｉｆｆｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１７１：４８９〜４９７頁（２００３））。
本発明の抗ＣＸＣＬ１３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、例えばＭＡｂ５２６１を用いるＣＸＣＬ１３の中和を用いて、いくつかの異なる機構、例えば、例えばＢ細胞および濾胞ＢヘルパーＴ細胞が炎症性組織に移動することおよび胚中心形成の干渉をもたらす、その受容体を用いてＣＸＣＬ１３相互作用を遮断することによりＳＬＥの重症度を低下させることができる。
一実施形態では、本発明の抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体または抗原結合断片は、関節炎、例えば関節リウマチを処置または妨げるために用いられる。関節リウマチ（ＲＡ）は、最も一般的な自己免疫疾患の１つであり、米国において２〜４％の人に影響する。これは、滑膜関節の融着、軟骨浸食および骨破壊を特徴とする慢性で進行性の全身性炎症障害である。ＲＡにおいて、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）は、パンヌスを形成する滑膜層（軟骨および骨に浸食する滑膜の浸潤性領域）において蓄積される。さらに、滑膜病変内のＴおよびＢ細胞は、リンパ系胚中心様構造に組織化され、これが自己抗体（リウマチ因子）生成を支持し、よって、疾患病原に直接寄与する（Ｔａｋｅｍｕｒａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．１６７：１０７２〜１０８０頁（２００１）；Ｓｈｉら、Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ．１６６：６５０〜６５５頁（２００１））。
滑膜線維芽細胞、選択された内皮細胞、滑膜抗原刺激Ｔヘルパー細胞およびＦＤＣにより生成されるリンパ系ケモカインＣＸＣＬ１３（Ｔａｋｅｍｕｒａら（２００１）；Ｓｈｉら（２００１）；Ｍａｎｚｏら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ５８（１１）：３３７７〜３３８７頁（２００８））は、ＣＸＣＲ５陽性リンパ系細胞（主にＢ細胞および濾胞Ｔヘルパー細胞）の炎症性滑膜への移動を駆動することにより、滑膜組織における胚中心形成において重要な役割を演じる。
臨床的に、ＲＡ患者におけるＣＸＣＬ１３の血漿レベルは、疾患の重症度と相関する。なぜなら、著しくより高いレベルのＣＸＣＬ１３が、対照および静止疾患の患者と比較して、活動性ＲＡの患者からの血漿において見出されたからである（Ｒｉｏｊａら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ５８（８）：２２５７〜２２６７頁（２００８））。さらに、ＣＸＣＲ５受容体は、ＲＡ患者の滑膜において上方制御され、浸潤性ＢおよびＴ細胞上、ならびにマクロファージおよび内皮細胞上に存在する（Ｓｃｈｍｕｔｚら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｈｅｒａｐｙ７：Ｒ２１７〜Ｒ２２９頁（２００５））。
マウスおよびラットにおけるコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）は、ヒト関節リウマチ（ＲＡ）の十分に確立されたモデルである。疾患は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中で乳化したウシＩＩ型コラーゲンの皮内注射により典型的に誘発され、マウスコラーゲン抗体の生成と、その後の足における関節炎の進行性の発展を特徴とする。Ｓｔａｎｎａｒｄらは、ラット抗マウスＣＸＣＬ１３抗体を用いるＣＸＣＬ１３の中和が、関節炎ＤＢＡ／１マウスにおける関節炎スコアおよび関節破壊の重症度の著しい低下を導いたことを示した。Ｓｔａｎｎａｒｄら、「Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＸＣＬ１３ ｉｍｐａｃｔｓ Ｂ−ｃｅｌｌ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙの２００８年Ａｎｎｕａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｅｅｔｉｎｇにて発表（２００８）。
本発明の抗ＣＸＣＬ１３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、例えばＭＡｂ５２６１を用いるＣＸＣＬ１３の中和を用いて、いくつかの異なる機構、例えば、例えばＢ細胞および濾胞ＢヘルパーＴ細胞が炎症性組織に移動することおよび胚中心形成の干渉をもたらす、その受容体を用いてＣＸＣＬ１３相互作用を遮断することにより関節炎、例えば関節リウマチの重症度を低下させることができる。さらに、本発明の抗ＣＸＣＬ１３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、例えばＭＡｂ５２６１を用いて、例えばＲＡＮＫＬ過剰発現の対象においてＲＡＮＫＬ発現および骨減少を低減できる。
本発明の方法に従って、本明細書の他の場所で定義するような少なくとも１つの抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片は、自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置または防止に関する正の治療応答を促進するために用いられる。自己免疫疾患および／または炎症性疾患に関する「正の治療応答」により、これらの抗体の抗炎症活性、抗血管新生活性、抗アポトーシス活性などに関連する疾患の改善および／または疾患に関連する症状の改善を意図する。つまり、抗増殖効果、ＣＸＣＬ１３発現細胞のさらなる増殖の防止、それらに限定されないが、炎症性サイトカイン、接着分子、プロテアーゼ、免疫グロブリン（例えばＣＸＣＬ１３を有する細胞がＢ細胞である場合）、それらの組み合わせの分泌の低下などを含む炎症性応答の低減、抗炎症性タンパク質の生成の増加、自己反応性細胞の数の低下、免疫寛容の増加、自己反応性細胞生存の阻害、アポトーシスの低下、内皮細胞移動の低下、自発的単球移動の増加、ＣＸＣＬ１３発現細胞の刺激により仲介される１もしくは複数の症状の低下および／または減少が観察できる。このような正の治療応答は、投与経路に限定されず、ドナー、ドナー組織（例えば臓器灌流）、ホスト、それらの任意の組み合わせなどへの投与を含み得る。
臨床応答は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャン、ｘ線撮影イメージング、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、フローサイトメトリーまたは蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）分析、組織学的検査、肉眼所見、およびそれらに限定されないがＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、クロマトグラフィーなどにより検出可能な変化を含む血液化学のようなスクリーニング技術を用いて評価できる。これらの正の治療応答に加えて、抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片を用いる治療を受ける対象は、疾患に関連する症状の改善の有益な効果を経験し得る。
本発明のさらなる実施形態は、例えば所与の処置計画の効力を決定するための臨床試験手順の一部として組織におけるタンパク質レベルを診断的にモニタリングするための、抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片の使用である。例えば、検出は、抗体を検出可能物質に結合させることにより容易にできる。検出可能物質の例は、様々な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射活性物質を含む。適切な酵素の例は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含み、適切な補欠分子団複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み、適切な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンを含み、発光物質の例は、ルミノールを含み、生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを含み、適切な放射活性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを含む。
ＶＩＩＩ．医薬組成物および投与方法
必要とする対象に本発明の抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体を調製して投与する方法は、当業者に公知であるかまたは当業者により容易に決定する。抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入によるかまたは局所的であってよい。用語「非経口」は、本明細書で用いる場合、例えば静脈内、動脈内、腹腔内、筋内、皮下、直腸または膣投与を含む。これらの全ての投与の形態は本発明の範囲内であると明確に考えられるが、投与の形態の例は、注射用、特に静脈内もしくは動脈内注射または点滴用の液剤である。通常、注射用の適切な医薬組成物は、緩衝剤（例えば酢酸塩、リン酸塩またはクエン酸塩緩衝剤）、界面活性剤（例えばポリソルベート）、場合によって安定化剤（例えばヒトアルブミン）などを含み得る。しかし、本明細書における教示に適合するその他の方法において、本発明の抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、有害な細胞集団の部位に直接送達することにより、疾患組織が治療剤により多く曝露されるようにできる。
本明細書で論じるように、本発明の抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、ある種のがん、自己免疫疾患ならびに中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）炎症性疾患を含む炎症性疾患のようなＣＸＣＬ１３発現細胞仲介疾患のインビボ処置のための薬学的有効量で投与できる。この点について、本発明の開示される結合分子は、投与を容易にし、かつ活性作用物質の安定性を促進するように処方される。特定の実施形態では、本発明に従う医薬組成物は、食塩水、非毒性緩衝剤、防腐剤などのような薬学的に許容される非毒性の滅菌担体を含む。本出願の目的のために、コンジュゲートされたかまたはコンジュゲートされていない抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体の薬学的有効量は、標的との有効な結合を達成するため、および利益、例えば疾患もしくは障害の症状を改善するかまたは物質もしくは細胞を検出することを達成するために十分な量を意味するために用いられる。
本発明で用いる医薬組成物は、例えばイオン交換物質、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩もしくは電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛の塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースに基づく物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂を含む薬学的に許容される担体を含む。
非経口投与用の調製物は、滅菌水性または非水性の液剤、懸濁剤および乳剤を含む。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は、例えば食塩水および緩衝溶媒を含む水、アルコール性／水性溶液、乳化物、懸濁物を含む。主題の発明において、薬学的に許容される担体は、それらに限定されないが、０．０１〜０．１Ｍ、例えば０．０５Ｍのリン酸塩緩衝液または０．８％食塩水を含む。その他の一般的な非経口媒体は、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは不揮発性油を含む。静脈内用の媒体は、流体および栄養補充剤、電解質補充剤、例えばリンゲルブドウ糖に基づくものなどを含む。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスなどのような防腐剤およびその他の添加物も存在してよい。
より具体的には、注射用に適切な医薬組成物は、滅菌水性液剤（水溶性の場合）または分散剤、および滅菌注射用液剤または分散剤の即時調製用の滅菌散剤を含む。このような場合、組成物は滅菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性であるべきである。これは、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、好ましくは、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対向して保存される。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含有する溶剤または分散媒であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを用いることにより、分散剤の場合に要求される特定のサイズを維持することにより、および界面活性剤を用いることにより維持できる。本明細書で開示する治療方法で用いるための適切な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）第１６版（１９８０）に記載されている。
微生物の作用の防止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成できる。あるいくつかの場合では、等張剤、例えば糖類、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の持続吸収性は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによりもたらすことができる。
いずれの場合でも、滅菌注射用液剤は、活性化合物（例えばそれ自体またはその他の活性作用物質との組み合わせでの抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体）を必要量で、適当な溶剤中に、必要であれば本明細書で列挙する１または組み合わせでの成分とともに組み込み、その後、ろ過滅菌することにより調製できる。一般的に、分散剤は、活性化合物を、基本的な分散媒および上で列挙したものからの必要なその他の成分を含有する滅菌媒体中に組み込むことにより調製される。滅菌注射用液剤の調製のための滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、予めろ過滅菌された溶液から活性成分と任意のさらなる所望の成分との粉末が得られる。注射用の調製物は、加工され、アンプル、バッグ、瓶、シリンジまたはバイアルのような容器に充填され、当技術分野において知られる方法に従って無菌的条件下で密閉される。さらに、調製物は、米国特許出願第０９／２５９，３３７号に記載されるもののようなキットの形態で包装および販売できる。このような製品は、好ましくは、関連する組成物が、疾患もしくは障害に罹患しているかまたはその素因がある対象を処置するために有用であることを示すラベルまたは包装挿入物を有する。
非経口製剤は、単回ボーラス用量、注入または負荷ボーラス用量、その後に維持用量であってよい。これらの組成物は、特定の固定もしくは変動性の間隔で、例えば１日１回、または「必要に応じて」を原則として投与してよい。
本発明で用いるあるいくつかの医薬組成物は、例えばカプセル剤、錠剤、水性懸濁剤または液剤を含む許容される剤形で経口投与してよい。あるいくつかの医薬組成物は、鼻エアロゾルまたは吸入により投与してもよい。このような組成物は、ベンジルアルコールもしくはその他の適切な防腐剤、バイオアベイラビリティーを亢進するための吸収促進剤および／またはその他の従来の可溶化もしくは分散化剤を用いる食塩水中の溶液として調製してよい。
単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体の量は、処置されるホストおよび具体的な投与形態に依存して変動する。組成物は、単回用量、複数回用量または注入で確立された期間にわたって投与してよい。投与計画も、最適な所望の応答（例えば治療または予防応答）を提供するように調整してよい。
本開示の範囲と一致して、本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、ヒトまたはその他の動物に、上記の処置の方法に従って、治療効果をもたらすために十分な量で投与してよい。本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、そのようなヒトまたはその他の動物に、本発明の抗体、例えばＭＡｂ５２６１を従来の薬学的に許容される担体または希釈剤と既知の技術に従って組み合わせることにより調製される従来の剤形で投与できる。薬学的に許容される担体または希釈剤の形態および特徴は、それが組み合わされる活性成分の量、投与経路およびその他の公知の変数により指図されることが当業者により認識される。当業者は、さらに、一種以上の本発明の抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体を含むカクテルが特に効果的であると証明され得ることを認識する。
「治療有効用量または量」または「有効量」により、投与されたときに、処置される疾患を有する患者の処置に関して正の治療応答をもたらす抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片の量を意図する。
ある型のがん、例えば白血病、リンパ腫（例えばＭＡＬＴリンパ腫）、結腸、乳、食道、胃および前立腺がん；自己免疫疾患、例えばループス、関節炎、多発性硬化症、ならびに中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）炎症性疾患を含む炎症性疾患のようなＣＸＣＬ１３発現細胞仲介疾患の処置についての本発明の組成物の治療有効用量は、投与の手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトまたは動物であるか、投与されるその他の薬物療法および処置が予防的または治療的であるかを含む多くの異なる因子に依存して変動する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も処置できる。処置投与量は、安全性および効力を最適化するために、当業者に知られる慣例的な方法を用いて用量設定できる。
投与される少なくとも１つの抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその結合断片の量は、本発明の開示に鑑みて、過度の実験を行うことなく当業者により容易に決定される。少なくとも１つの抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体、その抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体の投与形態およびそれぞれの量に影響する因子は、それらに限定されないが、疾患の重症度、疾患の履歴、ならびに治療を受ける個体の年齢、身長、体重、健康状態および身体状態を含む。同様に、投与される抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその断片、バリアントもしくは誘導体の量は、投与の形態および対象がこの作用物質の単回用量または複数回用量を受けるかに依存する。
本発明は、例えばＭＳ、関節炎、ループス、胃炎、潰瘍を含む自己免疫疾患および／もしくは炎症性疾患またはがんを処置するための医薬品の製造における、抗ＣＸＣＬ１３結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体の使用も提供する。
ＩＸ．診断
本発明は、ある型のがんおよび自己免疫疾患を含む炎症性疾患のようなＣＸＣＬ１３発現細胞仲介疾患の診断中に有用な診断方法をさらに提供し、これは、個体からの組織またはその他の細胞または体液中のＣＸＣＬ１３タンパク質または転写産物の発現レベルを測定するステップと、測定された発現レベルを、正常組織または体液中の標準ＣＸＣＬ１３発現レベルと比較することにより、標準と比較した発現レベルの増加が障害を示すステップとを含む。特定の実施形態では、本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントおよび誘導体、例えばＭＡｂ ＭＡｂ５２６１、ＭＡｂ５３７８、ＭＡｂ５０８０、ＭＡｂ１４７６、３Ｄ２または３Ｃ９は、がん、多発性硬化症、関節炎またはループスの診断において用いられる。
本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体ならびにその抗原結合断片、バリアントおよび誘導体は、当業者に知られる伝統的な免疫組織学的方法を用いて生体試料中のＣＸＣＬ１３タンパク質レベルをアッセイするために用いることができる（例えばＪａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６〜９８５頁（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７〜３０９６頁（１９８７）を参照されたい）。ＣＸＣＬ１３タンパク質発現を検出するために有用なその他の抗体に基づく方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降またはウェスタンブロッティングのようなイムノアッセイを含む。適切なアッセイは、本明細書の他の場所でより詳細に記載する。
「ＣＸＣＬ１３ポリペプチドの発現レベルをアッセイする」により、第１の生体試料中のＣＸＣＬ１３ポリペプチドのレベルを、直接的（例えば絶対タンパク質レベルを決定または推定することにより）または相対的（例えば第２の生体試料中の疾患関連ポリペプチドレベルと比較することにより）に、定性的もしくは定量的に測定または推定することを意図する。一実施形態では、第１の生体試料中のＣＸＣＬ１３ポリペプチド発現レベルは、測定または推定され、標準ＣＸＣＬ１３ポリペプチドレベルと比較される（標準は、障害を有さない個体から得られた第２の生体試料から得られるか、または障害を有さない個体の集団からのレベルを平均することにより決定される）。当技術分野において認識されるように、「標準」ＣＸＣＬ１３ポリペプチドレベルが一旦わかったら、これを比較のための標準として反復して用いることができる。
「生体試料」により、個体、株化細胞、組織培養物またはＣＸＣＬ１３を発現する可能性がある細胞のその他の供給源から得られる任意の生体試料を意図する。組織生検および体液を哺乳動物から得るための方法は、当技術分野において公知である。
Ｘ．イムノアッセイ
本発明の抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体は、免疫特異的結合について、当技術分野において知られる任意の方法によりアッセイしてよい。用いることができるイムノアッセイは、それらに限定されないが（ほんの数例を挙げれば）、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイのような技術を用いる競合および非競合アッセイ系を含む。このようなアッセイは慣例的であり、当技術分野において公知である（例えばＡｕｓｕｂｅｌら編、（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ）第１巻（これは、その全体が本明細書に参照により組み込まれる）を参照されたい）。
抗原との抗体の結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレートは、競合結合アッセイにより決定できる。競合結合アッセイの一例は、標識抗原（例えば３Ｈまたは１２５Ｉ）と対象とする抗体とを、漸増量の未標識抗原の存在下でインキュベートすることと、標識抗原と結合した抗体を検出することとを含むラジオイムノアッセイである。特定の抗原についての対象とする抗体の親和性および結合オフレートは、スキャッチャードプロット分析によりデータから決定できる。第２の抗体との競合も、ラジオイムノアッセイを用いて決定できる。この場合、抗原を、標識された化合物（例えば３Ｈまたは１２５Ｉ）とコンジュゲートした対象とする抗体と、漸増量の未標識の第２の抗体の存在下でインキュベートする。
所与のロットの抗ＣＸＣＬ１３抗体またはその抗原結合断片、バリアントもしくは誘導体の結合活性は、公知の方法に従って決定してよい。当業者は、慣例的な実験を採用することにより、各決定について機能的で最適なアッセイ条件を決定できる。
抗体−抗原相互作用の親和性を測定するために様々な方法が利用可能であるが、速度定数を決定するためのものは比較的少ない。ほとんどの方法は、標識抗体または抗原のいずれかに依存し、これは、慣例的な測定を必然的に複雑にし、測定された値に不確かさを導入する。
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）で行われる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、抗体−抗原相互作用の親和性を測定する従来の方法に対していくつかの利点をもたらす：（ｉ）抗体または抗原のいずれも標識する必要がない；（ｉｉ）抗体は前もって精製する必要がなく、細胞培養上清を直接用いることができる；（ｉｉｉ）異なるモノクローナル抗体相互作用の迅速な半定量的比較を可能にするリアルタイム測定が可能であり、多くの評価目的について十分である；（ｉｖ）一連の異なるモノクローナル抗体を同一条件下で容易に比較できるように、生体特異的表面を再生できる；（ｖ）分析手順は完全に自動化されており、ユーザが介入することなく網羅的な一連の測定を行うことができる。ＢＩＡａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、バージョンＡＢ（再版１９９８）、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）コード第ＢＲ−１００１−８６号；ＢＩＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、バージョンＡＢ（再版１９９８）、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）コード第ＢＲ−１００１−８４号。ＳＰＲに基づく結合研究は、結合対の一方のメンバーがセンサ表面に固定化されていることを必要とする。固定化された結合パートナーは、リガンドとよばれる。溶解している結合パートナーは、分析物とよばれる。いくつかの場合、リガンドは、別の固定化分子（捕捉分子とよばれる）との結合により表面に間接的に付着する。ＳＰＲ応答は、分析物が結合または解離することによる、検出表面での質量濃度の変化を反映する。
ＳＰＲに基づいて、リアルタイムＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）測定は、相互作用が生じるとそれを直接モニタリングする。この技術は、速度パラメータの決定によく適する。比較による親和性の順位付けは行うのが単純であり、速度定数および親和性定数の両方を、センサグラムデータから導くことができる。
分析物をリガンド表面にわたって離散したパルスで注入する場合、得られるセンサグラムは、３つの必須の段階に分割できる。（ｉ）試料注入中のリガンドとの分析物の会合；（ｉｉ）試料注入中の平衡または定常状態（ここで、分析物結合の速度は、複合体の解離により釣り合っている）；（ｉｉｉ）緩衝液フロー中の表面からの分析物の解離。
会合および解離段階は、分析物−リガンド相互作用の速度論についての情報を提供する（ｋａおよびｋｄ、複合体形成および解離の速度、ｋｄ／ｋａ＝ＫＤ）。平衡段階は、分析物−リガンド相互作用の親和性についての情報を提供する（ＫＤ）。
ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアは、数値積分およびグローバルフィッティングアルゴリズムの両方を用いる曲線フィッティングのための包括的な機能を提供する。データの適切な分析を用いて、相互作用の別々の速度および親和性定数を、単純なＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）調査から得ることができる。この技術により測定可能な親和性の範囲は、ｍＭからｐＭまでの非常に広い範囲である。
エピトープ特異性は、モノクローナル抗体の重要な特徴である。ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡまたはその他の表面吸着法を用いる従来の技術とは対照的に、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）を用いるエピトープマッピングは、標識または精製抗体を必要とせず、一連のいくつかのモノクローナル抗体を用いる多重部位特異性試験を可能にする。さらに、多数の分析を自動で処理できる。
ペアワイズ結合実験は、２つのＭＡｂが同じ抗原に同時に結合する能力を試験する。別々のエピトープを指向するＭＡｂは、独立して結合するが、同一または密接に関連したエピトープを指向するＭＡｂは、互いの結合に干渉する。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）を用いるこれらの結合実験は、行うのが簡単である。
例えば、第１のＭａｂを結合するために捕捉分子を用い、その後、抗原および第２のＭＡｂを逐次的に加えることができる。センサグラムは、（１）どれぐらいの量の抗原が第１のＭａｂと結合するか、（２）どの程度第２のＭＡｂが表面付着抗原と結合するか、（３）第２のＭＡｂが結合しないならば、ペアワイズ試験の順序を逆にすることにより結果が変わるかを明らかにする。
ペプチド阻害は、エピトープマッピングのために用いられる別の技術である。この方法は、ペアワイズ抗体結合研究を補うことができ、抗原の１次配列がわかっている場合に、機能的エピトープを構造的特徴に関連付けることができる。ペプチドまたは抗原断片は、固定化された抗原との異なるＭＡｂの結合の阻害について試験される。所与のＭＡｂの結合に干渉するペプチドは、そのＭＡｂにより規定されるエピトープと構造的に関係すると考えられる。
本発明の実施は、そうでないと記載しない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術を採用し、これらは当業者の熟練の範囲内である。このような技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら編（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ）；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編（１９８５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第ＩおよびＩＩ巻；Ｇａｉｔ編（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｗｕら編、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４および１５５巻；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）；ＷｅｉｒおよびＢｌａｃｋｗｅｌｌ編、（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ〜ＩＶ巻；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８６）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌら（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）を参照されたい。
抗体工学の全般的な原理は、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（第２版；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）に示されている。タンパク質工学の全般的な原理は、Ｒｉｃｋｗｏｏｄら編（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．）に示されている。抗体および抗体−ハプテン結合の全般的な原理は、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ（１９８４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第２版；Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．）；およびＳｔｅｗａｒｄ（１９８４）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）に示されている。さらに、当技術分野において知られ具体的に記載されない免疫学における標準的な方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓら編（１９９４）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第８版；Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）ならびにＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編）（１９８０）Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ＮＹ）に全般的に従う。
免疫学の全般的な原理を示す標準的な参照研究は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ（１９８２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ）；Ｋｅｎｎｅｔｔら編（１９８０）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｕｒｄｅｎら編、（Ｅｌｓｅｖｅｒｅ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）中のＣａｍｐｂｅｌｌ（１９８４）「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」；Ｇｏｌｄｓｂｙら編（２０００）Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｎｏｌｏｇｙ（第４版；Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎｄ＆Ｃｏ．）；Ｒｏｉｔｔら（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第６版；Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ）；Ａｂｂａｓら（２００５）Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第５版；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）；ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｎ）；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）；Ｌｅｗｉｎ（２００３）Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩＩ（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ２００３）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）；ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ（２００３）ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）を含む。
上で引用した全ての参考文献および本明細書で引用する参考文献の全ては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
以下の実施例は、限定のためではなく説明のために提供される。
［実施例１］
＜ヒトＣＸＣＬ１３に特異的なマウス抗体の選択および特徴決定＞
ハイブリドーマ作製。Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）コンジュゲートヒトＣＸＣＬ１３で免疫化した。３回の免疫化の後に、最高の抗ＣＸＣＬ１３力価を有するマウスから脾臓を採集し、脾臓細胞とＳＰ２／０ミエローマ細胞とを標準的な手順を用いて融合することによりハイブリドーマを作製した。
ハイブリドーマクローンを、ＥＬＩＳＡにより、ヒトおよびマウスＣＸＣＬ１３タンパク質との結合についてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡプレートを約１００ｎＭのヒト（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ：＃３００−４７）またはマウス（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ：＃２５０−２４）ＣＸＣＬ１３タンパク質で１晩、室温（ＲＴ）にて被覆した。プレートを洗浄してブロッキングした後に、標準抗ＣＸＣＬ１３抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ：ラット抗マウスＭＡｂ４７０およびマウス抗ヒトＭＡｂ８０１）またはハイブリドーマ上清の希釈物を加え、ＲＴにて１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、２次抗体（ハイブリドーマ上清およびＭＡｂ８０１についてヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ；ＭＡｂ４７０についてロバ抗ラットＩｇＧ−ＨＲＰ）を加え、ＲＴにて１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、等容量で混合したテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質試薬ＡおよびＢ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：＃５５５２１４）で暗所にて１５分間発色させ、４５０／５７０波長にて読み取った。「３Ｄ２」および「３Ｃ９」とよばれる２つの陽性ハイブリドーマクローン（ともにマウスＩｇＧ１抗体）をさらなる特徴決定のために選択した。
ハイブリドーマにより生成されるマウス抗ヒト抗体３Ｄ２および３Ｃ９の特異性を、ＥＬＩＳＡにより（上記のようにして）、組換えケモカイン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ：マウスおよびヒトＣＸＣＬ１３、ヒトＩＬ−８／ＣＸＣＬ８（＃２００−０８）、ヒトＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０（＃２００−１０）、ヒトＭＩＧ／ＣＸＣＬ９（＃３００−２６）、ヒトＳＤＦ−１アルファ／ＣＸＣＬ１２（＃３００−２８Ａ）ならびにカニクイザルＣＸＣＬ１３）およびいくつかの非特異的対照抗原（組換えヒトＣ３５、ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ：＃２１１２２）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＳｅｒａＣｏｒｅ：＃ＡＰ−４５１０−０１））、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）（Ｓｉｇｍａ：＃Ａ８７６３）、インスリン（Ｇｉｂｃｏ：＃１２５８５−０１４）およびヘモグロビン（Ｓｉｇｍａ：＃Ｈ７３７９））を含むパネルに対して評価した。市販の抗体ＭＡｂ４７０およびＭＡｂ８０１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、マウスおよびヒト／カニクイザルＣＸＣＬ１３結合のそれぞれについての陽性対照として用いた。
３Ｄ２および３Ｃ９は、ＣＸＣＬ１３に特異的に結合することが示された。３Ｄ２および３Ｃ９クローンはともに、組換えヒト、マウスおよびカニクイザルＣＸＣＬ１３に結合したので、多重種ＣＸＣＬ１３特異性を示した（図１Ａ〜１Ｃ）。図１は、少なくとも３回の実験についての二重測定からの結果を示す。３Ｄ２抗体は、組換えヒト、マウスおよびサルＣＸＣＬ１３との強い結合を有することが示された。特に、３Ｄ２は、３Ｃ９およびＭＡｂ８０１と比較して、組換えマウスＣＸＣＬ１３に対してより強く結合した。３Ｄ２は、インビトロおよびインビボにおいてさらに特徴決定した（結果を以下に示す）。３Ｄ２抗体も、キメラおよびヒト化ＣＸＣＬ１３抗体の作製のための原型として用いた（結果を以下に示す）。３Ｃ９抗体は、３Ｄ２、ＭＡｂ４７０およびＭＡｂ８０１と比較して、組換えヒトＣＸＣＬ１３に対して最も強い結合を有することを示した。３Ｃ９および３Ｄ２は、バイオアッセイ開発における試薬として用いた（例えば以下に記載するエピトープ競合ＥＬＩＳＡ）。
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）による３Ｄ２親和性測定。組換えヒトおよびマウスＣＸＣＬ１３についての３Ｄ２、３Ｃ９、ＭＡｂ８０１およびＭＡｂ４７０の親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）により測定した。ケモカインを、酢酸塩緩衝液（ｐＨ＝５）中でＣ１チップ上に１μｇ／ｍｌのヒトＣＸＣＬ１３、０．３μｇ／ｍｌのマウスＣＸＣＬ１３および０．５μｇ／ｍｌの陰性対照ＳＤＦ−１αとともに固定化した。３Ｄ２および３Ｃ９をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で、１００ｎＭから０．７８ｎＭまでおよび３８ｎＭから０．５９４ｎｍまで２倍で希釈した。ＭＡｂ８０１およびＭＡＢ４７０を５０ｎＭから０．７８ｎＭまでおよび１９ｎＭから０．５９４ｎｍまで２倍で希釈した。結果は、ヒトおよびマウスＣＸＣＬ１３に対する３Ｄ２についての親和性測定（ｎＭ）が、それぞれ市販抗体ＭＡｂ８０１およびＭＡｂ４７０のものより著しく低かったことを示した。結果を表２に示す。
３Ｄ２エピトープマッピング。エピトープマッピング研究を、エピトープ競合ＥＬＩＳＡを用いて行った。プレートを、１００ｎＭ組換えヒトＣＸＣＬ１３で被覆し、０．０３３ｎＭビオチン化３Ｄ２とインキュベートした後に、競合未標識抗体を、３Ｄ２の量より過剰の様々な量で加えた。代表的な実験からの結果を図２に示す。結果は、３Ｃ９が、ヒトＣＸＣＬ１３との結合について３Ｄ２と競合するが、ＭＡｂ８０１は、ヒトＣＸＣＬ１３との結合について３Ｄ２と競合しなかったことを示す。
天然ＣＸＣＬ１３への３Ｄ２の結合。捕捉エピトープ競合ＥＬＩＳＡを用いて、天然ヒトおよびマウスＣＸＣＬ１３への３Ｄ２結合を評価した。このアッセイにおいて、天然ヒトＣＸＣＬ１３を、ヒトＩＦＮ−ガンマ刺激ＴＨＰ−１細胞から回収した上清から得た。ヒトＣＸＣＬ１３（ＴＨＰ１上清の１：４希釈物または０．０９７ｎＭ（１ｎｇ／ｍｌ）のｒｈｕＣＸＣＬ１３）を、６．６ｎＭ ＭＡｂ８０１で捕捉し、０．６６ｎＭビオチン−３Ｃ９を用いて検出した。適当な抗原提示のために、組織培養上清からのケモカイン（または対照として用いた組換えヒトＣＸＣＬ１３）をＥＬＩＳＡプレート上でＭＡｂ８０１により捕捉した。プレートを、次いで、ビオチン化３Ｃ９と、様々な量の未標識３Ｄ２の存在下でインキュベートした。ヒトＣＸＣＬ１３への結合についての競合（これは、ビオチン化３Ｃ９の結合の低下をもたらした）が、ストレプトアビジン−ＨＲＰにより検出された。図３Ａから明らかなように、３Ｄ２は、天然および組換えの両方のヒトＣＸＣＬ１３と強く結合し、統計的に同様のＥＣ５０値が得られた。
ＴＮＦ−アルファトランスジェニックマウスからのマウスＣＸＣＬ１３リッチ器官抽出物を、天然マウスＣＸＣＬ１３の供給源として用いた。マウスＣＸＣＬ１３（ＴＮＦ−Ｔｇ器官抽出物の１：４０希釈物または０．５ｎＭ ｒｍｕＣＸＣＬ１３）を、３３ｎＭ ＭＡｂ４７０で捕捉し、３．３ｎＭビオチン−３Ｄ２を用いて検出した。抽出物からのケモカイン（および対照として用いた組換えマウスＣＸＣＬ１３）をＥＬＩＳＡプレート上でＭＡｂ４７０により捕捉した。プレートを、次いで、ビオチン化３Ｄ２と、様々な量の未標識３Ｄ２の存在下でインキュベートした。次いで、マウスＣＸＣＬ１３との結合についての競合（これは、ビオチン化３Ｄ２の結合の低下をもたらした）が、ストレプトアビジン−ＨＲＰにより検出された。図３Ｂからわかるように、３Ｄ２は、それ自体のビオチン化バージョンと競合してそれを外し、天然および組換えの両方のマウスＣＸＣＬ１３と等しい効力で結合できた。
図３Ａおよび３Ｂの両方について、各データ点は、少なくとも３回の独立した実験の１回からの二重測定の平均を表す。曲線は、４パラメータシグモイドカーブフィッティングを用いてフィッティングした（Ｒ２＝０．９９）。ＥＣ５０値の差は、対応のないｔ検定により分析し、有意でなかった（Ｐ＞０．０５）。これらの結果は、マウス抗ヒト３Ｄ２抗体が、抗体がそれに対して作製された組換えケモカインだけでなく、天然ヒトおよびマウスケモカインにも結合したことを示す。
［実施例２］
＜ヒトＢ細胞移動の抗ＣＸＣＬ１３抗体阻害＞
ＣＸＣＬ１３機能、例えばＢ細胞移動の阻害を、ヒトおよびマウス両方の系におけるＢ細胞移動をシミュレートする確立されたモデルを用いて評価した。非ＣＸＣＬ１３ケモカインであるＳＤＦ−１α（ＣＸＣＬ１２としても知られる）に向かう移動を対照として用いて、Ｂ細胞移動の阻害に対する抗ＣＸＣＬ１３抗体の特異性を確認した。つまり、抗ＣＸＣＬ１３抗体を、ヒトＣＸＣＬ１３誘発性移動の阻害およびＳＤＦ−１α誘発性移動に対する影響がないことについて試験した。
ヒトＣＸＣＬ１３に向かうヒトＢ細胞移動の阻害。ヒトＣＸＣＬ１３誘発性Ｂ細胞移動に対する３Ｄ２、３Ｃ９およびＭＡｂ８０１の影響を試験した。
２つのクローン株化細胞であるヒトプレＢ−６９７−ｈＣＸＣＲ５およびヒトプレＢ−６９７−ｈＣＸＣＲ４を用いて、組換えヒトＣＸＣＬ１３依存性移動および組換えヒトＳＤＦ−１α依存性移動のそれぞれに対する抗ＣＸＣＬ１３抗体の影響を評価した。孔サイズ８μｍおよび直径６．５ｍｍのトランスウェル組織培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ：３４２２）を用いた。ヒトプレＢ−６９７−ｈＣＸＣＲ５細胞をｒｈＣＸＣＬ１３誘発性移動のために用い、ヒトプレＢ−６９７−ｈＣＸＣＲ４をｒｈＳＤＦ−１誘発性移動（陰性対照）のために用いた。細胞を、化学走性緩衝液（（ｌ−グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ＰｅｎｎＳｔｒｅｐおよび０．５％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０）ＲＴに予め温める）に５×１０６／ｍｌにて再懸濁し、３７℃に３０分間戻した。希釈ケモカイン（化学走性緩衝液中に９７ｎｍ（１μｇ／ｍｌ）ｒｈＣＸＣＬ１３または１２．５ｎＭ（０．１μｇ／ｍｌ）ｒｈＳＤＦ−１α）＋／−抗体を、下方のチャンバに５９０μｌ／ウェルで加え、ＲＴにて３０分間予備インキュベートした。細胞を１００μｌ（５×１０５）細胞／上方のチャンバで加えた。プレートを３７℃にて１晩インキュベートした。インサートを次いで除去し、アラマーブルーをウェルあたり６０μｌにて加え、プレートを３７℃にて４時間インキュベートした。蛍光を波長５３０ｎｍおよび５９０ｎｍにて測定した。
移動インデックスを各条件について次のように算出した。（（移動インデックス［アイソタイプ対照］−移動インデックス［抗体］）×１００）／（移動インデックス［アイソタイプ対照］）。パーセント移動阻害をｌｏｇ［ｎＭ抗体］に対してプロットして、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５を用いて力価曲線を得た。ヒトＣＸＣＬ１３誘発性移動についての結果を図４Ａに示す。結果は、２回のｈＣＸＣＬ１３誘発性移動および３回のｈＳＤＦ−１誘発性移動の独立した実験の平均＋／−ＳＥＭとして表す。
３Ｄ２、３Ｃ９およびＭＡｂ８０１の間でのヒトＣＸＣＬ１３誘発性移動の阻害の程度の差は、ヒトＣＸＣＬ１３についての親和性の差に相当した（上の表２を参照されたい）。つまり、ケモカインに対して最低の親和性を有する抗体（３Ｄ２）は、ヒトプレＢ−ｈＣＸＣＲ５化学走性の最も弱い阻害物質であるとみられるが、それより高くほぼ同一の親和性を有する抗体（ＭＡｂ８０１および３Ｃ９）は、細胞移動のより高いパーセントの阻害をもたらした（図４Ａ）。いずれの抗ヒトＣＸＣＬ１３抗体（３Ｄ２、３Ｃ９またはＭＡｂ８０１）も、ヒトプレＢ−ｈＣＸＣＲ４（５）細胞のヒトＳＤＦ−１α仲介化学走性に対していずれの影響も示さなかった（図４Ｂ）。一方、陽性対照であるヤギ抗ヒトＳＤＦ−１α抗体（ＭＡｂ８７Ａ）は、ＳＤＦ−１α依存性移動を強く阻害した。
マウス脾細胞のマウスＣＸＣＬ１３依存性移動の阻害。抗ＣＸＣＬ１３抗体を、マウス脾細胞（機械的に解離させた脾臓から得た）の組換えマウスＣＸＣＬ１３仲介化学走性を阻害する能力について試験した。アッセイは、４８５ｎＭ（５μｇ／ｍｌ）ｒｍｕＣＸＣＬ１３を用い、より小さい孔サイズを有するトランスウェルプレート（すなわち孔サイズ５μｍおよび直径６．５ｍｍのトランスウェル組織培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ：＃３４２１））を用い、ウェルあたりより多い量の細胞（１０６）を用いたことを含むわずかな変更を含めて、ヒトＣＸＣＬ１３依存性Ｂ細胞移動アッセイについて上記したことと本質的に同じプロトコールを用いて行った。マウスの２つの異なる株Ｃ５７／ＢＬ６およびＳＪＬからの脾細胞の移動に対する試験した抗体の影響を、それぞれ図５Ａおよび５Ｂに示す。ＭＡｂ４７０は、陽性対照として用いた。ラットおよびマウスＩｇＧならびにヒトＣＸＣＬ１３特異的マウス抗体３Ｃ９を陰性対照として含めた。図５Ａおよび５Ｂに示すように、阻害のパターンは、ＭＡｂ４７０と３Ｄ２の間で異なった。特に、３Ｄ２は力価決定可能な様式で化学走性を阻害したが、ＭＡｂ４７０の影響は、３９６ｎＭの最高の抗体濃度でのみ明らかであった。Ｃ５７Ｂｌａｃｋ／６およびＳＪＬ／Ｊ移動に対する３Ｄ２の影響を比較するデータを、対応のないｔ検定により分析し、これによりＰ値＞０．０５が得られ、２つの曲線間に有意な差がないことを示した。曲線は、４パラメータシグモイドカーブフィッティングを用いてフィッティングした（Ｒ２＝０．９９）。ＳＪＬ／ＪおよびＣ５７Ｂｌａｃｋ／６脾細胞移動に対する３Ｄ２の影響の比較を図５Ｃに示す。３Ｄ２阻害プロフィールにおける有意な差は、２つのマウス株間で示されなかった。
［実施例３］
＜ヒトＣＸＣＲ５のＣＸＣＬ１３仲介エンドサイトーシスの抗ＣＸＣＬ１３抗体阻害＞
ＣＸＣＬ１３ケモカイン機能、例えばＣＸＣＲ５受容体のＣＸＣＬ１３仲介エンドサイトーシスの抗ＣＸＣＬ１３抗体を用いる阻害を、ヒトＣＸＣＲ５受容体のヒトＣＸＣＬ１３仲介エンドサイトーシスについての確立されたモデルを用いて評価した（Ｂｕｒｋｅら、Ｂｌｏｏｄ１１０：２２１６〜３３２５頁（２００７））。
ヒトＣＸＣＲ５受容体のＣＸＣＬ１３仲介エンドサイトーシスの阻害。ケモカインとそのケモカイン受容体との結合は、リガンド−受容体複合体の内部移行と、その後の細胞内シグナル伝達カスケードの活性化とを導く（Ｎｅｅｌら、Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ１６：６３７〜６５８頁（２００５））。Ｂｕｒｋｌｅらに記載されるフローに基づく方法を適応させて、ヒトおよびマウスの両方の細胞におけるＣＸＣＬ１３仲介ＣＸＣＲ５受容体内部移行を阻害する３Ｄ２の能力を決定した。ヒトＣＸＣＬ１３仲介エンドサイトーシスについて、ｈＣＸＣＬ１３を３Ｄ２、ＭＡｂ４７０またはマウスＩｇＧ（濃度０、３３、６６、１３２、２６４および５２８ｎＭにて）と組み合わせ、４℃にて１晩インキュベートした。次の日に、細胞を希釈剤（ＲＰＭＩ＋０．５％ＢＳＡ）に、１０７細胞／ｍｌにて再懸濁した。細胞を、１０μｇ／ｍｌ抗ヒトＦｃブロックを用いて３７℃にて１５分間予備ブロッキングした。細胞を、次いで、ＣＸＣＬ１３／抗体ミックス（５０μｌ細胞：５０μｌミックス）と３７℃にて２時間インキュベートした。細胞を、次いで、抗ヒトＣＸＣＲ５抗体（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ：＃５５８１１３）で４℃にて３０分間染色し、フローサイトメトリーにより分析した。同様に、マウスＣＸＣＬ１３仲介エンドサイトーシスを、３Ｄ２またはマウスＩｇＧ（濃度０、２０、５９、１９８および５２８ｎＭにて）と組み合わせたｍＣＸＣＬ１３を用いてアッセイした。エンドサイトーシスの阻害を、次のようにして算出した：％阻害＝１００−［１００×（０ＣＸＣＬ１３−ｇｅｏｍｅａｎ）／（０ＣＸＣＬ１３−０ｍＡＢ）］。
図６は、代表的なヒトおよびマウスＣＸＣＬ１３実験からのデータを示す。図６Ａは、４８５ｎＭ（５μｇ／ｍｌ）のヒトＣＸＣＬ１３で処置したヒトプレＢ−６９７−ｈＣＸＣＲ５細胞の表面上のヒトＣＸＣＲ５受容体発現に対する３Ｄ２抗体の影響を示す。図６Ｂは、１０００ｎＭ（１０μｇ／ｍｌ）のマウスＣＸＣＬ１３と予備インキュベートしたＷｅｈｉ−２３１細胞におけるマウスＣＸＣＲ５受容体内部移行の３Ｄ２仲介阻害を示す。両方の場合において、３Ｄ２は、ＣＸＣＲ５受容体のＣＸＣＬ１３誘発性下方制御に、効果的および力価決定可能な様式で干渉した。図６Ｃは、ＥＣ５０値を示し、これは、シグモイド用量応答曲線（グラフに示す）から、１（マウスエンドサイトーシス）および０．９９４（ヒトエンドサイトーシス）に等しいＲ２値で算出した。ヒトおよびマウス受容体エンドサイトーシスに対する３Ｄ２の影響を比較するデータを対応のないｔ検定により分析し、これによりＰ値＞０．０５が得られ、ヒトＣＸＣＬ１３およびマウスＣＸＣＬ１３曲線間に有意な差がないことを示した。
［実施例４］
＜多発性硬化症についてのマウス疾患モデルにおける抗ＣＸＣＬ１３抗体の評価＞
多発性硬化症のマウスモデル。実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、多発性硬化症の広く受け入れられている動物モデルである。ＥＡＥは、脊髄を主に標的にする炎症を伴う、程度が拡大する上行性麻痺を累進的にもたらすＣＮＳの脱髄疾患である。この疾患は、誘発の方法および用いる動物の型に依存して、急性、慢性または再発−寛解経過を呈することができる。つまり、ＥＡＥは、ＣＮＳの成分、ペプチド（能動誘発）および一方の動物から別の動物への細胞移動（受動誘発）によっても誘発できる。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を抽出物またはペプチドとともに用い、これは、百日咳毒素とともに頻繁に用いられる。
ＲＲ−ＥＡＥ−１：ＳＪＬマウスにおける再発−寛解ＥＡＥに対する３Ｄ２の影響。３Ｄ２抗体を、ＥＡＥの能動免疫化モデルを用いて試験した。「ＲＲ−ＥＡＥ−１」研究において、再発−寛解（ＲＲ）疾患を、ＳＪＬ／Ｊマウスにおいて、５ｍｇの熱不活化Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７ＲＡ株で増強した１ｍｇ／ｍｌ ＣＦＡ中のプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）１３９−１５１ペプチドエピトープ（ＨＳＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ；配列番号１）の皮下免疫化により誘発した。研究は、以下の処置群を含んだ：
Ａ．０日目に開始する対照（マウスＩｇＧ）
Ｂ．０日目に開始する３Ｄ２
Ｃ．スコア≧１にて開始する３Ｄ２
マウスに、０．３ｍｇ（１５ｍｇ／ｋｇ）の抗体を１週間に２回、腹腔内注射した。処置は群ＡおよびＢについて０日目に開始し、群Ｃについて臨床スコア≧１にて開始した（評点システムは、以下の表３に記載する）。
図７に示すように、３Ｄ２での処置は、疾患の改善をもたらした。各データ点は、９匹のマウスから得たスコアの平均を表す。群平均（ＧＭＳ）を、一元配置ＡＮＯＶＡ、その後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較事後検定を用いることによって比較した。統計的に有意な差が、対照群（マウスＩｇＧ）と各３Ｄ２処置群との間に観察された（Ｐ＜０．０５）が、２つの３Ｄ２処置群間では観察されなかった（Ｐ＞０．０５）。疾患の減弱は、マウスが活動性疾患を示すまで処置を開始しなかったときでさえ観察された（群Ｃ）。
ＲＲ−ＥＡＥ−２：ＳＪＬマウスにおける再発−寛解ＥＡＥに対する３Ｄ２の影響。第２の研究（「ＲＲ−ＥＡＥ−２」）を、誘発プロトコールにおいて百日咳毒素を用いて行って、３Ｄ２をより重症の疾患モデルにおいて試験した。この第２の再発−寛解ＥＡＥ研究において、ＳＪＬ／Ｊマウスを、５ｍｇの熱不活化Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７ＲＡ株で増強した１ｍｇ／ｍｌ ＣＦＡ中のＰＬＰ１３９−１５１で皮下免疫化し、１００ナノグラムの百日咳毒素を免疫後０および２日目に腹腔内投与した。処置は、以下の群に分けた０．３ｍｇ（１５ｍｇ／ｋｇ）の抗体の週２回の腹腔内注射により行った。
Ａ．０日目に開始する対照（マウスＩｇＧ）
Ｂ．０日目に開始する３Ｄ２
Ｃ．７日目に開始する３Ｄ２
Ｄ．ＥＡＥの発症時に開始する３Ｄ２（スコア≧２）
ＲＲ−ＥＡＥ−２の結果を図８に示す。各データ点は、９匹のマウスから得たスコアの平均を表す。群平均を、一元配置ＡＮＯＶＡと、その後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較事後検定とを用いることによって比較した。統計的に有意な差が、対照群（マウスＩｇＧ）と各３Ｄ２処置群との間に観察された（Ｐ＜０．０５）が、３つの３Ｄ２処置群の間では観察されなかった（Ｐ＞０．０５）。ここでもまた、３Ｄ２での処置は、ＥＡＥ症状の開始、スコア≧２にて処置が開始しても（群Ｄ）、疾患の重症度に対して統計的に有意な影響を有した。
［実施例５］
＜ループスについてのマウス疾患モデルにおける抗ＣＸＣＬ１３抗体の評価＞
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のマウスモデル。ＳＬＥは、複数の器官に関わり、異所性胚中心の自発的形成およびいくつかの核抗原に対する自己抗体生成を特徴とする自己免疫疾患である。抗ＣＸＣＬ１３ ３Ｄ２抗体の影響を、ループスのマウスモデルにおいて試験した。ループス易発性Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｂｌａｃｋ Ｘ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ Ｆ１（ＮＺＢ／ＮＺＷＦ１）マウスは、高力価の抗ｄｓＤＮＡ抗体および腎臓の糸球体における免疫複合体の形成を原因とする重症増殖性糸球体腎炎を自発的に発生する。
ＳＬＥ−１：進行疾患の処置。研究「ＳＬＥ−１」において、処置を、蛋白尿≧２（蛋白尿評点システムは、以下の表４に記載する）である２４〜３０週齢のＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおいて開始し、処置を８週間継続した。処置は、０．３ｍｇ（１５ｍｇ／ｋｇ）の３Ｄ２またはマウスＩｇＧ（対照）の週２回の腹腔内注射により行った。
図９Ａに示すように、３Ｄ２での処置は、蛋白尿の進行を停止させた。十分に定義された評点システムを用いた腎臓の組織学的分析（表５）も、糸球体腎炎（ＧＮ）、間質性腎炎（ＩＮ）および血管炎（ＶＩ）の病態スコアが対照（マウスＩｇＧ）と比較して３Ｄ２処置群においてより低かったので、抗ＣＸＣＬ１３処置の有益な影響を示した。図９Ｂを参照されたい。
蛋白尿スコア（図９Ａ）および腎臓病態スコア（図９Ｂ）について、各データ点は、１０回の測定の平均を表す。統計的に有意な差を同定するための（Ｐ＜０．０５）二元配置ＡＮＯＶＡとその後のＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較事後検定とにおいて、統計的に有意な差は観察されなかった（Ｐ＞０．０５）。
ＳＬＥ−２：早期疾患（自己抗体誘発後であるが、重症の蛋白尿の前）のマウスにおける防止試験。研究「ＳＬＥ−２」において、処置を、２０週齢のＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスにおいて開始し、１２週目まで継続した。処置は、０．３ｍｇ（１５ｍｇ／ｋｇ）の３Ｄ２またはマウスＩｇＧ（対照）の週２回の腹腔内注射により行った。図１０Ａに示すように、３Ｄ２での処置は、特に処置の最初の８週間の間に蛋白尿の進行を統計的に有意に阻害した。８週間後に、３Ｄ２処置群の７匹のマウスのうち０匹（０％）および対照群の９匹のマウスのうち４匹（４４％）が、＞２＋の蛋白尿スコアを有した。１２週間の処置の最後に、平均尿タンパク質は、３Ｄ２処置での２．１＋／−０．２に対してマウスＩｇＧ（対照）抗体での３．１＋／−０．１５であった。
腎臓病態スコアも、３Ｄ２処置群およびマウスＩｇＧ処置群からのマウスにおいて測定した。糸球体腎炎（ＧＮ）および間質性腎炎（ＩＮ）病態スコアのまとめを図１０Ｂに示す。
蛋白尿レベル（図１０Ａ）および腎臓病態スコア（図１０Ｂ）を、３Ｄ２処置群からの７匹のマウスおよびマウスＩｇＧ処置群からの９匹のマウスにおいて測定した。蛋白尿スコアは、これらの群の間で有意に異なっていた（Ｐ＝０．００４２；二元配置ＡＮＯＶＡとＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較検定）。腎臓病態スコアは、有意に異ならなかった（Ｐ＞０．０５）。平均病態スコアは有意に異ならなかったが、３Ｄ２処置群において７匹のマウスのうち２匹（２９％）において重症腎臓疾患の組織学的証拠があった一方、対照群の９匹のマウスのうち４匹（４４％）が重傷疾患の証拠を示した。３Ｄ２によりＣＸＣＬ１３を遮断することは、自己抗体の発生を妨げなかったことが注目された（データは示さず）。
ループスマウスの脾臓における胚中心（ＧＣ）および１次濾胞の数に対する３Ｄ２処置の影響を評価した。３Ｄ２処置およびマウスＩｇＧ処置（対照）ＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスからの脾臓切片を、ＧＬ−７（ＧＣ染色）、Ｂ２２０抗体（Ｂ細胞マーカー）または濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）に対する抗体で染色した。脾臓リンパ系構造に対するＣＸＣＬ１３阻害の影響を、図１１Ａ〜Ｂに示す。１次濾胞はインタクトなままであった。３Ｄ２で処置したマウスは、脾臓における自発的胚中心（ＧＣ）のサイズおよび頻度が著しく低下した。３Ｄ２で処置したマウス（「ｔｘ」）は、１次：２次（ＧＣ）濾胞の比率として表した場合のＧＣの数が減少し（ｐ＝０．１９）（図１２Ａ）、ＧＣサイズが著しく減少する（ｐ＝０．０３）（図１２Ｂ）傾向を示した。値は、１群あたり５匹のマウスの平均＋／−ＳＥＭとして示す。
上記のＳＬＥの結果は、３Ｄ２抗体によるＣＸＣＬ１３阻害が、特に疾患の早期段階でループスのＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウスモデルにおける腎炎の減少を導き、脾臓構造に影響し得ることを示す。
［実施例６］
＜キメラおよびヒト化抗ＣＸＣＬ１３モノクローナル抗体の調製＞
３Ｄ２ハイブリドーマＶ遺伝子の単離およびキメラ３Ｄ２抗体のクローニング。マウス３Ｄ２抗体を、キメラ抗ＣＸＣＬ１３モノクローナル抗体の作製のための原型として用いた。可変（Ｖ）遺伝子を、標準的な方法を用いて３Ｄ２ハイブリドーマから単離した。３Ｄ２の重鎖（Ｈ１６０９）および軽鎖（Ｌ０２９３）のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、図１３に示す。ＶＨおよびＶＫ相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を付す（それぞれ配列番号４、５、６、９、１０および１１）。
可変重鎖（ＶＨ）遺伝子を、ヒトガンマ１重鎖遺伝子を含有する哺乳動物発現ベクターにクローニングして、全長キメラ重鎖を創出した。可変軽鎖（ＶＫ）遺伝子を、ヒトカッパ定常遺伝子を有する哺乳動物発現ベクターにクローニングして、全長キメラ軽鎖を創出した。キメラ抗体を作製するために、キメラ重鎖およびキメラ軽鎖を含有する発現ベクターをＣＨＯ−Ｓ細胞に同時トランスフェクトした。生成されたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は細胞から分泌され、これを３〜６日間の発現期間の後に採集した。得られたＭＡｂを、プロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製して、特徴決定した。得られたキメラＩｇＧ１抗体（「ＭＡｂ１４７６」）は、ＥＬＩＳＡによりヒトおよびマウスＣＸＣＬ１３に特異的であることが示され、マウスおよびヒトＣＸＣＬ１３に対して同様の親和性を有することが示され、親のマウス抗体である３Ｄ２と同様の機能的活性を有することが示された（データは示さず）。さらに、ＭＡｂ１４７６は、エピトープ競合ＥＬＩＳＡにおいて、マウスおよびヒトＣＸＣＬ１３への結合についてビオチン化３Ｄ２および３Ｃ９と競合できた（データは示さず）。
キメラ３Ｄ２（ＭＡｂ１４７６）のヒト化。キメラ３Ｄ２抗体のヒト化について以下にまとめる。キメラＭＡｂ１４７６からの重鎖（Ｈ１６０９）および軽鎖（Ｌ０２９３）のフレームワーク領域（ＦＷＲ）に導入した改変を、それぞれ図１４Ａおよび１４Ｂに示す。Ｈ１６０９中の推定Ｎ結合グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ）を、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒに置き換えた（図１４Ａ）。この変異は、抗体親和性に影響せず（表６を参照されたい）、「ＭＡｂ５０８０」の作製をもたらした。ＭＡｂ５０８０の親和性および機能性を改善するために、いくつかの可変領域変異体を生成し、ＩＣ５０ ＥＬＩＳＡによりヒトＣＸＣＬ１３に対してスクリーニングした。Ｌ５０５５−ＣＤＲ１中の３１位での単一のセリン（Ｓ）からメチオニン（Ｍ）への変異および軽鎖フレームワーク領域中の変化（図１４Ｂおよび１５を参照されたい）により「ＭＡｂ５２６１」が作製され、これは、３Ｄ２およびＭＡｂ５０８０と比較して著しい親和性の改善を示した（表６）。Ｈ１６０９（配列番号３）およびＨ２１７７（配列番号１３）のアミノ酸配列の比較を図１４Ａに示し、Ｌ０２９３（配列番号８）、Ｌ５０５５（配列番号１７）およびＬ５１４０（配列番号１５）の比較を図１４Ｂに示す。
ＭＡｂ５０８０のＶＨおよびＶＫ（Ｈ２１７７（配列番号１３）およびＬ５０５５（配列番号１７）のそれぞれ）ならびにＭＡｂ５２６１のＶＨおよびＶＫ（Ｈ２１７７（配列番号１２）およびＬ５１４０（配列番号１５）のそれぞれ）のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、図１５に示す。
ＣＸＣＬ１３についてのＭＡｂ５２６１特異性。３Ｄ２と同様に、ＭＡｂ５２６１の特異性を、組換えケモカイン（組換えマウス、ヒトおよびカニクイザルＣＸＣＬ１３、ヒトＩＬ−８／ＣＸＣＬ８；ヒトＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０、ヒトＭＩＧ／ＣＸＣＬ９およびヒトＳＤＦ−１アルファ／ＣＸＣＬ１２）；天然ヒトおよびマウスＣＸＣＬ１３；ならびに様々な非特異的抗原（組換えヒトＣ３５、ストレプトアビジン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）、インスリンおよびヘモグロビン）を含むパネルに対する特異的ＥＬＩＳＡおよび捕捉エピトープ競合ＥＬＩＳＡにより評価した。
特異的ＥＬＩＳＡについて、組換えヒト、カニクイザルおよびマウスＣＸＣＬ１３をそれぞれ１００ｎＭで被覆した。ＭＡｂ５２６１は、ＣＸＣＬ１３に対して多重種特異性を示した（図１６Ａ〜Ｃ）。組換えヒト（図１６Ａ）およびカニクイザルＣＸＣＬ１３（図１６Ｂ）に対するＭＡｂ５２６１の結合は、その直接の「親」であるＭＡｂ５０８０の結合に匹敵し、ＭＡｂ１４７６（キメラ３Ｄ２）の結合よりも強かった。ＭＡｂ５２６１は、ＭＡｂ１４７６およびＭＡｂ５０８０の両方と比較して、組換えマウスＣＸＣＬ１３に対する結合が著しく優れていた（図１６Ｃ）。各ケモカインについてのデータ点は、三重測定の平均を表す。ＥＣ５０値は、４パラメータシグモイドカーブフィッティングから算出した（ＥＣ５０値を生成する曲線についてのＲ２は０．９９であった）。
天然ヒトおよびマウスＣＸＣＬ１３へのＭＡｂ５２６１の結合を、捕捉エピトープ競合ＥＬＩＳＡにより決定した。ヒトＥＬＩＳＡについて、ヒトＣＸＣＬ１３（ＴＨＰ１上清の１：４希釈物または０．０９７ｎＭ）を６．６ｎＭ ＭＡｂ８０１で捕捉し、０．６６ｎＭビオチン−３Ｃ９で検出した。マウスＥＬＩＳＡについて、マウスＣＸＣＬ１３（ＴＮＦ−Ｔｇ器官抽出物の１：４０希釈物）を３３ｎＭ ＭＡｂ４７０で捕捉し、３．３ｎＭビオチン−３Ｄ２で検出した。各データ点は、少なくとも３回の実験の１回からの二重測定の平均を表す。天然ヒト（図１７Ａ）およびマウスＣＸＣＬ１３（図１７Ｂ）に対して捕捉エピトープ競合ＥＬＩＳＡで試験した場合に、ＭＡｂ５２６１は、ヒトおよびマウス両方の天然ＣＸＣＬ１３への結合について３Ｄ２および５０８０抗体の両方よりも優越性を示した。図１７Ａ〜Ｂに示す曲線は、４パラメータシグモイドカーブフィッティング（Ｒ２＝０．９９）を用いてフィッティングした。
［実施例７］
＜抗ＣＸＣＬ１３ ＭＡｂ５２６１の機能的特徴決定＞
ヒトおよびマウスＢ細胞移動の阻害。ヒトＣＸＣＬ１３誘発性ヒトＢ細胞化学走性を阻害するＭＡｂ５２６１の能力を、安定株化細胞ヒトプレＢ−６９７−ｈＣＸＣＲ５および初代ヒト扁桃腺細胞の両方について試験した。
安定株化細胞ヒトプレＢ−６９７−ｈＣＸＣＲ５についてのヒトＣＸＣＬ１３誘発性ヒトＢ細胞化学走性のＭＡｂ５２６１による阻害を、上の実施例２に記載するプロトコールを用いて試験した。ＭＡｂ５２６１によるヒトプレＢ−６９７−ｈＣＸＣＲ５細胞移動の阻害を図１８Ａに示す。ヒト初代扁桃腺細胞研究について、扁桃腺細胞を、組織の機械的解離により得た。細胞（１０６／５μｍのトランスウェルプレートの上方のチャンバ）を、５μｇ／ｍｌのヒトＣＸＣＬ１３に向かって３７℃にて２時間移動することを可能にした。ヒト初代扁桃腺細胞の移動のＭＡｂ５２６１による阻害を、図１８Ｂに示す。図１８Ａ〜Ｂに示す結果は、少なくとも３回の実験の１回からの三重測定の平均＋／−ＳＥＭを表す。曲線は、４パラメータシグモイドカーブフィッティング（Ｒ２＝０．９８〜０．９９）を用いてフィッティングした。
マウスＣＸＣＬ１３仲介マウスＢ細胞化学走性に対するＭＡｂ５２６１の影響を、上の実施例２に記載するようにして、Ｃ５７Ｂｌａｃｋ／６およびＳＪＬ／Ｊマウスからのマウス脾細胞について評価した。ここでもまた、ヒトまたはマウスＳＤＦ−１α（０．１μｇ／ｍｌ）に向かう移動を陰性対照として用いて、抗体の影響のＣＸＣＬ１３特異性を確実にした（データは示さず）。脾細胞移動のＭＡｂ５２６１による阻害を図１９に示す（代表的な実験からのデータは、二重測定の平均＋／−ＳＤとして示す）。移動阻害の値を、対応するアイソタイプ対照を用いて得られた値に基づいて算出した。
図１８および１９に示すように、ＭＡｂ５２６１は、ヒトおよびマウス両方のＣＸＣＬ１３依存性化学走性を阻害した。培養細胞と初代細胞との間のＥＣ５０値の差（図１８を参照されたい）は、ヒトＣＸＣＬ１３濃度の差に起因すると考えられる可能性が高く、例えば９７ｎＭ（１μｇ／ｍｌ）をヒトプレＢ−６９７−ｈＣＸＣＲ５細胞移動において用い、４８５ｎＭ（５μｇ／ｍｌ）をヒト扁桃腺細胞移動において用いた。
ヒトＣＸＣＲ５受容体のヒトＣＸＣＬ１３仲介エンドサイトーシスの阻害。この実験は、上の実施例３に記載する方法に従って、ヒトＣＸＣＲ５受容体のエンドサイトーシスを誘発するためにヒトＣＸＣＬ１３で処理したヒトプレＢ−６９７−ｈＣＸＣＲ５細胞を用いて行った。ヒトＣＸＣＬ１３の量は２μＭであり、これは実施例３に示す３Ｄ２エンドサイトーシスアッセイにおいて用いた量（すなわち０．４８５μＭ）よりも高く、よってＥＣ５０値の差が観察された。ＣＸＣＲ５受容体エンドサイトーシスのＭＡｂ５２６１による阻害を図２０に示す。結果は、少なくとも３回の独立した実験の１回からの三重測定の平均として示す。曲線は、４パラメータシグモイドカーブフィッティング（Ｒ２＝０．９９）を用いてフィッティングした。
［実施例８］
＜抗ＣＸＣＬ１３ ＭＡｂ５２６１のマウスバージョンの作製および特徴決定＞
ＭＡｂ５２６１は、ヒト重鎖および軽鎖可変領域とヒトＩｇガンマ１−Ｆアロタイプとヒトカッパとを含有する。マウスの対応物（「ＭＡｂ５３７８」）を、マウスＩｇＧ２ａ（ガンマ２ａ鎖）を用いて工学的に作製した。ＩｇＧ２ａアイソタイプは、補体を固定し、Ｆｃ受容体に結合する能力を含めてヒトＩｇＧ１と密接な類似性を有する。ＭＡｂ５３７８は、ＭＡｂ５２６１と同じヒト重鎖および軽鎖可変遺伝子を、マウスＩｇＧ２ａ定常およびマウスカッパそれぞれとともに含有する。
重鎖および軽鎖発現プラスミドのうちの共通制限部位を用いて、アイソタイプの変更を可能にした。アイソタイプ種の作製は、制限消化、ライゲーションおよび形質転換により達成した。具体的に、ＭＡｂ５２６１重鎖について、遺伝子の可変領域を制限エンドヌクレアーゼで消化し、マウスＩｇＧ２ａ定常領域を含有する発現プラスミド中の匹敵する部位にライゲーションして、ＭＡｂ５３７８についての重鎖（Ｈ５１８８）を作製した。同様に、ＭＡｂ５２６１軽鎖について、遺伝子の可変領域を制限エンドヌクレアーゼで消化し、マウスＩｇカッパ定常領域を含有する発現プラスミド中の匹敵する部位にライゲーションして、ＭＡｂ５３７８についての軽鎖（Ｌ５１５３）を作製した。ＭＡｂ５３７８軽鎖および重鎖の可変領域のポリペプチドおよびアミノ酸配列は、ＭＡｂ５２６１と同一であり、図２１に示す。ＶＨおよびＶＫ相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を付す（それぞれ配列番号４、５、６、１６、１０および１１）。
ＭＡｂ５３７８親和性測定。組換えヒトおよびマウスＣＸＣＬ１３についてのＭＡｂ５３７８の親和性測定を、実施例１に記載するものと同様の方法を用いてＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）により測定した。組換えヒトおよびマウスＣＸＣＬ１３についてのＭＡｂ５３７８親和性を、ＭＡｂ５２６１および３Ｄ２と比較した。表７に示すように、ヒトおよびマウス両方のケモカインについてのＭＡｂ５２６１およびＭＡｂ５３７８の親和性測定（ｎＭ）は、３Ｄ２と比較して著しく改善された。
ＭＡｂ５３７８エピトープマッピング。エピトープ競合ＥＬＩＳＡ実験を行って、ＭＡｂ５３７８がマウスＣＸＣＬ１３上の結合エピトープをＭＡｂ５２６１と共有するかを決定した。組換えマウスＣＸＣＬ１３を、プレート上に１μｇ／ｍｌのＭＡｂ４７０、５３７８または５２６１（対照）を用いて捕捉した。抗体／ケモカイン相互作用を、０．５μｇ／ｍｌ（３．３ｎＭ）のビオチン化ＭＡｂ５２６１とその後のストレプトアビジン−ＨＲＰとを用いて検出した。市販のラット抗マウス抗体ＭＡｂ４７０も研究に含めた。ＭＡｂ４７０または５３７８のいずれかと予備インキュベートしたマウスＣＸＣＬ１３がビオチン化ＭＡｂ５２６１と結合する能力を、エピトープ競合ＥＬＩＳＡを用いて評価した。ＭＡｂ５３７８がマウスＣＸＣＬ１３結合エピトープをＭＡｂ５２６１と共有するが、ＭＡｂ４７０と共有しないことが示された（図２２）。つまり、ＭＡｂ５３７８は、エピトープ結合および親和性を保持し、これはＭＡｂ５３７８を動物モデル研究においてＭＡｂ５２６１の代用物として用いるために必要であった。さらに、実施例を通して記載するエピトープ結合の結果は、３Ｄ２、３Ｃ９、ＭＡｂ１４７６、ＭＡｂ５０８０、ＭＡｂ５２６１およびＭＡｂ５３７８が全て、ヒトＣＸＣＬ１３の同じエピトープに結合することを示すと要約することができる。
ＣＸＣＬ１３についてのＭＡｂ５３７８特異性。ＭＡｂ５３７８の特異性を、組換えヒト、マウスおよびカニクイザルＣＸＣＬ１３（図２３）ならびに組換えケモカインおよび様々な抗原のパネル（組換えケモカイン（マウス、ヒトおよびカニクイザルＣＸＣＬ１３、ヒトＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、ヒトＩＰ−１０／ＣＸＣＬ１０、ヒトＭＩＧ／ＣＸＣＬ９およびヒトＳＤＦ−１アルファ／ＣＸＣＬ１２）；天然ヒトおよびマウスＣＣＬ１３；ならびに様々な非特異的抗原（組換えヒトＣ３５、ストレプトアビジン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）、インスリン、ヘモグロビン）に対して評価した（データは示さず）。特異的ＥＬＩＳＡは、実施例１に記載するようにして行った。特に、各ケモカインは１００ｎＭで被覆した。図２３に示すように、ＭＡｂ５３７８を、マウス抗体３Ｄ２および対照（マウスＩｇＧ）と比較した。ＭＡｂ５３７８は、様々な程度で、３つ全ての種からのケモカインとの結合において３Ｄ２より優れていた。結合の最も著しい差は、マウスＣＸＣＬ１３で観察され、動物研究において３Ｄ２を超えるＭＡｂ５３７８の可能性のある利点を示した。各データ点は、三重測定の平均を表す。ＥＣ５０値は、４パラメータシグモイドカーブフィッティングから算出した（ＥＣ５０値を生成する曲線についてのＲ２は０．９９であった）。
ヒトおよびマウスＢ細胞移動の阻害をＭＡｂ５３７８について試験した。ＭＡｂ５３７８がマウスおよびヒトＢ細胞のＣＸＣＬ１３依存性化学走性に干渉する能力を、それぞれ実施例２、７および２に記載する方法を用いる培養（ヒトプレＢ−６９７−ｈＣＸＣＲ５細胞；図２４Ａ）および初代（ヒト扁桃腺細胞；図２４Ｂ）ヒト細胞ならびにマウス脾細胞（図２４Ｃ）を含む移動アッセイにおいて試験した。ケモカイン濃度は、ヒトプレＢ−６９７−ｈｕＣＸＣＲ５移動について９７ｎＭのｈｕＣＸＣＬ１３；ヒト扁桃腺細胞移動について４８５ｎＭのｈｕＣＸＣＬ１３；およびマウス脾細胞移動について５００ｎＭのｍｕＣＸＣＬ１３であった。ヒトまたはマウスＳＤＦ−１アルファに向かう移動を陰性対照として用いた（示さず）。移動阻害の値は、対応するアイソタイプ対照を用いて得られた値に基づいて算出した。図２４Ａ〜Ｃに示す結果は、少なくとも３回の実験の１回からの三重測定の平均＋／−ＳＥＭを表す。曲線は、４パラメータシグモイドカーブフィッティング（Ｒ２＝０．９９）を用いてフィッティングした。ヒト移動アッセイでは、ＭＡｂ５３７８をＭＡｂ５２６１と比較し、マウス移動アッセイでは、ＭＡｂ５３７８を３Ｄ２と比較した。両方の場合において、ＭＡｂ５３７８は、ＣＸＣＬ１３誘発性ヒトおよびマウス細胞移動を、ＭＡｂ５２６１に匹敵する程度および３Ｄ２より少し優れる程度でうまく阻害した。
ヒトＣＸＣＲ５受容体のヒトＣＸＣＬ１３仲介エンドサイトーシスの阻害。ＭＡｂ５３７８を、その原型ＭＡｂ５２６１およびマウス抗ヒトＣＸＣＬ１３抗体３Ｄ２と、実施例３に記載する方法を用いるヒトＣＸＣＬ１３仲介ヒトＣＸＣＲ５受容体内部移行アッセイにおいて比較した。図２５に示すように、ＭＡｂ５３７８は、ヒトＣＸＣＲ５受容体内部移行を阻害するその能力が、ＭＡｂ５２６１と同一であり、３Ｄ２より著しく優れていた。ＭＡｂ５２６１およびＭＡｂ５３７８についてのデータ点は、２回の独立した実験からの測定の平均を表す。３Ｄ２およびアイソタイプ対照についてのデータ点は、１回の実験からの三重測定の平均を表す。曲線は、４パラメータシグモイドカーブフィッティング（Ｒ２＝０．９９）を用いてフィッティングした。
［実施例８］
＜関節リウマチについてのマウス疾患モデルにおける抗ＣＸＣＬ１３抗体の評価＞
関節リウマチのマウスモデル。マウスおよびラットにおけるコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）は、ヒト関節リウマチ（ＲＡ）の十分に確立されたモデルである。疾患は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中で乳化したウシＩＩ型コラーゲンの皮内注射により典型的に誘発され、マウスコラーゲン抗体の生成と、その後の足における関節炎の進行性の発展を特徴とする。
ＣＩＡ−１：ＤＢＡ１／Ｊマウスを用いるＣＩＡモデルにおけるＭＡｂ５３７８の抗関節炎効力。疾患を、ＤＢＡ１／Ｊマウスにおいて、１００μｇの熱死滅Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒａで増強したＣＦＡ中の１００μｇのウシＩＩ型コラーゲンの皮下免疫化と、その後の２１日目の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中の１００μｇのウシＩＩ型コラーゲンでの追加免疫化により誘発した。動物を、毎週３回、関節炎の巨視的な徴候（表８を参照されたい）について評点し、関節炎インデックス（ＡＩ）を、個別の足スコアを加算することにより算出した（いずれの与えられた動物においても達成できる最大の関節炎インデックスは１６であった）。
予防的処置は、追加免疫化の１日前、すなわち誘発後２０日目に２〜６の低ＡＩの動物において開始し、以下の処置群（群あたり１０匹）からなった。
Ａ．マウスＩｇＧアイソタイプ（対照）
Ｂ．ＭＡｂ５３７８
Ｃ．エタネルセプト（ＴＮＦ阻害剤；陽性対照）
マウスに、１週間に２回、３週間にわたって０．６ｍｇ（３０ｍｇ／ｋｇ）の抗体の腹腔内（マウスＩｇＧおよびＭＡｂ５３７８）または皮下（エタネルセプト）注射のいずれかを行った。研究は、誘発後４１日目に終了した。
図２６に示すように、ＭＡｂ５３７８での予防的処置は、疾患発展の速度の減少と、疾患重症度の著しい阻害とをもたらし、これは、研究の終点にて明らかになった。統計的に有意な差が、研究の終点（４１日目）にて、マウスＩｇＧ処置群とＭＡｂ５３７８処置群との間（Ｐ＜０．０５）およびマウスＩｇＧ処置群とエタネルセプト処置群との間（Ｐ＜０．０５）で観察された。ＭＡｂ５３７８の阻害効果は、陽性対照作用物質エタネルセプトの阻害効果から統計的に異ならなかった（Ｐ＞０．０５）。
ＣＩＡ−２：ＤＢＡ１／ＪマウスにおけるＣＩＡモデルでのＭＡｂ５３７８の抗関節炎効力。ＭＡｂ５３７８を用いる第２のＣＩＡ研究「ＣＩＡ−２」を行った。この研究では、疾患を、ＤＢＡ１／Ｊマウスにおいて、ＣＩＡ−１について上に記載したようにして誘発した。ここでもまた、予防的処置を追加免疫化の１日前、誘発後２０日目に、２〜６の低ＡＩの動物において開始した。エタネルセプトに加えて、市販のラット抗マウスＣＸＣＬ１３抗体ＭＡｂ４７０を対照として用いた。研究は、よって、以下の群を含んだ：
Ａ．マウスＩｇＧアイソタイプ対照
Ｂ．ＭＡｂ５３７８
Ｃ．エタネルセプト（ＴＮＦ阻害剤；陽性対照）
Ｄ．ＭＡｂ４７０
マウスに、１週間に２回、３週間にわたって０．６ｍｇ（３０ｍｇ／ｋｇ）の抗体の腹腔内（マウスＩｇＧ、ＭＡｂ４７０およびＭＡｂ５３７８）または皮下（エタネルセプト）注射のいずれかを行った。研究は、誘発後４２日目に終了した。
図２７から明らかなように、ＭＡｂ５３７８での予防的処置は、ここでもまた、研究中ずっとそして終点（４２日目）にて疾患発展の速度の減少と疾患重症度の著しい阻害とをもたらした。統計的に有意な差が、マウスＩｇＧ処置群とＭＡｂ５３７８処置群との間（Ｐ＜０．０５）およびマウスＩｇＧ処置群とＭＡｂ４７０処置群との間で観察された（Ｐ＜０．０５）。ＭＡｂ５３７８の阻害効果は、陽性対照作用物質エタネルセプトおよびラット抗マウスＣＸＣＬ１３抗体ＭＡｂ４７０の阻害効果から統計的に異ならなかった（Ｐ＞０．０５）。
ＧＣ−１：免疫化ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける胚中心形成に対するＭＡｂ５３７８の影響。自己免疫性の動物モデルにおける我々の抗ＣＸＣＬ１３抗体の性能の成功に鑑みて、異所性胚中心形成の破壊に関する可能性のある作用機序について試験した。１００ｕｌのミョウバン中で沈殿させた１００μｇの４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニルアセチル−ニワトリ−ｇ−グロブリン（ＮＰ−ＣＧＧ）で免疫化したＭＡｂ５３７８処置ＢＡＬＢ／Ｃマウスにおける胚中心を調べた。動物に、１週間に合計０．６ｍｇ（３０ｍｇ／ｋｇ）のマウスアイソタイプ対照（０．６ｍｇの毎週の注射）またはＭＡｂ５３７８（０．３ｍｇの週２回の注射）のいずれかを腹腔内注射した。注射はＮＰ−ＧＣＣ免疫化の１週間前に開始し、１週間後まで継続した。胚中心形成を、攻撃後１０日目に評価した。脾臓およびリンパ節からの単細胞懸濁物を、フローサイトメトリーにより、様々なＢ細胞（活性化ＧＣ Ｂ細胞；濾胞および辺縁帯Ｂ細胞）およびＴ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）部分集合の存在について分析した。ＭＡｂ５３７８はＴ細胞または濾胞および辺縁帯Ｂ細胞に対して影響しなかった（データは示さず）が、胚中心Ｂ細胞（Ｂ２２０＋／ＣＤ３８ｌｏｗ／ＰＮＡ＋）は、脾臓およびリンパ節においてそれぞれ４３％および４１％低下した（図２８）。脾臓群平均を、対応のないスチューデントのｔ検定を用いることにより比較した。ＧＣ−Ｂ細胞の低下は、マウスＩｇＧ処置群と比較して、ＭＡｂ５３７８処置脾臓において統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５）。リンパ節から回収した細胞の数は非常に低く、よってプールした（その結果、リンパ節からのデータを用いて統計解析を行わなかった）。
［実施例９］
＜ヘリコバクター感染についてのマウスモデルにおける抗ＣＸＣＬ１３抗体の評価＞
ヘリコバクター感染のマウスモデル。Ｈ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉおよびＨ．Ｐｙｌｏｒｉのようなヘリコバクター種は、患者において胃ＭＡＬＴリンパ腫を誘発する。ヘリコバクター誘発性胃リンパ濾胞のマウスモデルは、Ｎｏｂｕｔａｎｉら、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ６０：１５６〜１６４頁（２０１０）（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載された。Ｎｏｂｕｔａｎｉらのマウスモデルは、本明細書において、胃リンパ濾胞の低下における抗ＣＸＣＬ１３抗体の影響を試験するために用いた。マウスのＨ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ感染についての処置スケジュールおよび本実施例で用いた抗体投与を図２９に示す。
特に、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスをＨ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉに感染させた。感染後１週目に開始して、マウスにアイソタイプ抗体対照または抗ＣＸＣＬ１３抗体（ＭＡｂ５３７８）のいずれかを毎週、１２週間にわたって投与した。抗ＣＸＣＬ１３ ＭＡｂ５３７８（マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ）は、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中で３ｍｇ／ｍｌで処方した。マウスに、２００マイクロリットル（６００マイクログラム）を、感染後７日目に開始してその後毎週腹腔内注射した。アイソタイプ対照は、独立したモノクローナルマウスＩｇＧ２ａ抗体であった。
マウスからの胃試料を、ＰＣＲにより、Ｈ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ特異的１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の発現について評価して、感染を確認した。ＰＣＲ増幅反応は、１単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）を含有する１×反応緩衝液［２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０および５０％グリセロール］；１０ｎｍｏｌの各デオキシヌクレオチド三リン酸；１０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマー；ならびに１μｌの希釈ＤＮＡ（これは、およそ２０〜１００ｎｇ／μｌのＤＮＡ濃度の元の試料の１：１０希釈により調製した）を５０μｌの最終容量中に含んだ。１６ｓ ｒＲＮＡ反応についてのサイクル条件は、９４℃にて３０秒間、５６℃にて３０秒間および７２℃にて３０秒間の３５サイクルを含んだ。
Ｈ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ特異的１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子ＰＣＲプライマーを以下に示す：
Ｆ：５’−ＴＴＧＧＧＡＧＧＣＴＴＴＧＴＣＴＴＴＣＣＡ−３’（配列番号２４）
Ｒ：５’−ＧＡＴＴＡＧＣＴＣＴＧＣＣＴＣＧＣＧＧＣＴ−３’（配列番号２５）
Ｈ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ感染マウスから得られた全ての胃試料中のＨ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ特異的１６ｓ−ｒＲＮＡ遺伝子の発現についての結果を図３０に示す。これらの結果は、全ての処置マウスが、Ｈ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ感染について陽性であったことを示す。
ヘリコバクター感染マウスの胃粘膜におけるＣＸＣＬ１３発現。Ｈ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ感染マウスおよび非感染マウスの胃粘膜におけるＣＸＣＬ１３のｍＲＮＡ発現レベルを、リアルタイム定量ＰＣＲにより決定した。感染後１カ月および３カ月での非感染野生型対照マウスと比較したＨ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ感染マウスの胃粘膜におけるＣＸＣＬ１３のｍＲＮＡ発現を、それぞれ図３１Ａおよび３１Ｂに示す。これらの結果は、Ｈ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ感染マウスにおけるＣＸＣＬ１３発現の増加を示す。
抗体処置ヘリコバクター感染マウスの胃粘膜におけるＣＸＣＬ１３発現。アイソタイプ対照または抗ＣＸＣＬ１３抗体で処置した後のＨ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ感染マウスの胃粘膜におけるＣＸＣＬ１３のｍＲＮＡ発現レベルを、逆転写ＰＣＲにより決定した。胃の粘膜層および粘膜下層を筋および漿膜から取り外し、１ｍｌのＴＲＩＺＯＬ試薬（インビトロｇｅｎ）とともにホモジナイズした。ＲＮＡを、製造業者の使用説明に従ってホモジネートから抽出した。ＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従ってＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いる逆転写反応に供した。ＰＣＲ増幅反応は、１単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）を含有する１×反応緩衝液［２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０および５０％グリセロール］；１０ｎｍｏｌの各デオキシヌクレオチド三リン酸；１０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマー；ならびに１μｌの希釈ＤＮＡ（これは、およそ１００ｎｇ／μｌのＤＮＡ濃度の元の試料の１：１０希釈により調製した）を５０μｌの最終容量中に含んだ。ＣＸＣＬ１３およびβアクチン反応のサイクル条件は、９４℃にて２分間と、９４℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間および７２℃にて１分間の３５サイクルとを含んだ。
図３２は、アイソタイプ対照または抗ＣＸＣＬ１３抗体処置後のＨ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ感染マウスの胃におけるＣＸＣＬ１３およびβアクチン対照ｍＲＮＡの発現を示す。これらの結果は、ＣＸＣＬ１３が、非感染野生型マウスでは発現されなかったが、全てのＨ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ感染マウスにおいて発現されたことを示す。
抗ＣＸＣＬ１３抗体処置は、ヘリコバクター感染マウスにおける胃リンパ濾胞を低下させる。Ｈ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ感染の３カ月後のマウスの胃を切除し、大弯にて開いた。胃の半分をパラフィンワックスに包埋し、パラフィン包埋組織を切片にして、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。図３３は、アイソタイプ対照（左のパネル）および抗ＣＸＣＬ１３抗体（右のパネル）処置マウスからの胃のＨ＆Ｅ染色画像を示す。胃リンパ濾胞の数を、アイソタイプ対照および抗ＣＸＣＬ１３抗体試料について計数した。結果を図３３の下のパネルに示す。これらの結果は、対照処置に対して、抗ＣＸＣＬ１３抗体で処置したＨ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉ感染マウスにおける胃濾胞の低下を示す。
具体的な実施形態についての上記の記載は、本発明の全般的な性質を完全に明らかにするので、他者は、当技術分野における熟練の範囲内の知識を用いることにより、過度の実験を行うことなく、本発明の全般的な概念から逸脱することなく、このような具体的な実施形態の様々な応用について容易に改変および／または改作できる。よって、このような改作および改変は、本明細書で示す教示および手引きに基づいて、開示される実施形態の等価物の意味および範囲内であることを意図する。本明細書における言葉使いおよび術語は、説明を目的とし、限定を目的としないので、本明細書の術語または言葉使いは、教示および手引きに鑑みて当業者により解釈されると理解される。
本発明の広さおよび範囲は、上記の例示的な実施形態のいずれによっても限定されないが、以下の特許請求の範囲およびその等価物に従ってのみ定義される。

Claims (22)

  1. ａ）配列番号４と同一である重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号５と同一である重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列、および配列番号６と同一である重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、かつ、
    配列番号１６または配列番号９と同一である軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号１０と同一である軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列、および配列番号１１と同一である軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体またはその抗原結合断片、
    ｂ）ＶＨが、配列番号３または１３のアミノ酸配列を含み、かつ、ＶＬが、配列番号８、１５または１７のアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合断片、ならびに、
    ｃ）基準モノクローナル抗体を競合的に阻害する、または、前記基準モノクローナル抗体と同じＣＸＣＬ１３エピトープに対して特異的に結合し、かつ、前記基準モノクローナル抗体と同じ抗原結合部位を含む抗体またはその抗原結合断片であって、ここで、前記基準モノクローナル抗体が、前記ａ）またはｂ）の抗体もしくはその抗原結合断片である、抗体またはその抗原結合断片
    からなる群から選択される、ヒト、マウスおよびカニクイザルＣＸＣＬ１３に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合断片。
  2. 前記抗体またはその抗原結合断片のＶＨが、配列番号４、配列番号５および配列番号６とそれぞれ同一のＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、かつ、前記抗体またはその抗原結合断片のＶＬが、配列番号９または配列番号１６、配列番号１０および配列番号１１とそれぞれ同一のＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  3. ＶＨが、配列番号３または１３のアミノ酸配列を含み、かつ、ＶＬが、配列番号８、１５または１７のアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  4. 前記ＶＨおよび前記ＶＬが、
    （ｉ）それぞれ配列番号１３および配列番号１５、
    （ｉｉ）それぞれ配列番号１３および配列番号１７、ならびに、
    （ｉｉｉ）それぞれ配列番号３および配列番号８
    からなる群から選択されるＶＨおよびＶＬ配列のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
  6. ＶＨをコードする単離ポリヌクレオチドとＶＬをコードする単離ポリヌクレオチドとを含む組成物であって、
    ＶＨをコードする前記ポリヌクレオチドが、それぞれ配列番号４、配列番号５および配列番号６からなるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２およびＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＨポリペプチドをコードし、かつ、
    ＶＬをコードする前記ポリヌクレオチドが、それぞれ配列番号９または配列番号１６、配列番号１０および配列番号１１からなるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＬポリペプチドをコードし、
    ＶＨおよびＶＬをコードする前記ポリヌクレオチドによりコードされる抗体またはその抗原結合断片が、ＣＸＣＬ１３に特異的に結合する、組成物。
  7. ＶＨをコードする前記ポリヌクレオチドおよびＶＬをコードする前記ポリヌクレオチドが、単一のベクターに含有される、請求項６に記載の組成物。
  8. ＶＨをコードする前記ポリヌクレオチドが、第１のベクターに含有され、ＶＬをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記第１のベクターと同一でない第２のベクターに含有される、請求項６に記載の組成物。
  9. 前記第１のベクターおよび前記第２のベクターが、単一の宿主細胞に含有される、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記第１のベクターおよび前記第２のベクターが、別々の宿主細胞に含有される、請求項８に記載の組成物。
  11. 請求項７に記載の組成物、または、請求項９に記載の第１のベクターおよび第２のベクターを含む宿主細胞。
  12. ＣＸＣＬ１３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を生成する方法であって、請求項１１に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記抗体またはその抗原結合断片を回収するステップとを含む方法。
  13. ＣＸＣＬ１３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を生成する方法であって、請求項１０に記載の組成物の第１のベクターおよび第２のベクターを含む個々の宿主細胞を同時培養するステップと、前記抗体またはその抗原結合断片を回収するステップとを含む方法。
  14. ＣＸＣＬ１３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を生成する方法であって、請求項１０に記載の組成物の第１のベクターおよび第２のベクターを含む個々の宿主細胞を別々に培養するステップと、前記ＶＨおよびＶＬコードポリペプチドを組み合わせるステップと、前記抗体またはその抗原結合断片を回収するステップとを含む方法。
  15. 動物においてＣＸＣＬ１３を中和するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離抗体もしくはその抗原結合断片を含む医薬組成物。
  16. がん、自己免疫疾患または炎症性疾患を処置するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離抗体もしくはその抗原結合断片を含む医薬組成物。
  17. 前記自己免疫疾患または前記炎症性疾患が、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）または関節炎である、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記がんが、前立腺または結腸がんである、請求項１６に記載の組成物。
  19. 動物において胃リンパ濾胞を阻害するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離抗体もしくはその抗原結合断片を含む医薬組成物。
  20. 胃潰瘍もしくは十二指腸潰瘍、または粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫を防止または処置するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離抗体もしくはその抗原結合断片を含む医薬組成物。
  21. 前記動物が、ヘリコバクター細菌に感染している、請求項１９または２０に記載の医薬組成物。
  22. 前記動物がヒトである、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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