BR112015032690B1

BR112015032690B1 - Uso de moléculas inibidoras de semaforina-4d em combinação com uma terapia imunomoduladora para inibir o crescimento tumoral e metástase

Info

Publication number: BR112015032690B1
Application number: BR112015032690-0A
Authority: BR
Inventors: Elizabeth E. Evans; Ernest S. Smith; Maurice Zauderer
Original assignee: Vaccinex, Inc.
Priority date: 2013-06-25
Filing date: 2014-06-20
Publication date: 2020-03-10
Also published as: JP7021153B2; US11078295B2; US20150044219A1; SG10201902380SA; US20170335008A1; EA201690080A1; BR112015032690A8; JP2019213530A; IL243301A0; US10526414B2; IL243301B; CA2916245C; JP6611709B2; AU2014302812A1; JP7356531B2; NZ755091A; EP3656392A1; DK3013350T3; MX2015017485A; SG11201510505VA

Abstract

resumo uso de moléculas inibidoras de semaforina-4d em combinação com uma terapia imunomoduladora para inibir crescimento tumoral e metástases aqui provido são métodos para inibir, atrasar, ou reduzir crescimento tumo-ral e metástases de células cancerígenas expressando plexina b1 em um paciente, compreendendo administração ao paciente de uma quantidade efetiva de uma mo-lécula ligante isolada que especificamente liga a semaforina-4d (sema4d) em combinação com uma quantidade efetiva de pelo menos uma outra terapia imuno-moduladora.

Description

“USO DE MOLÉCULAS INIBIDORAS DE SEMAFORINA-4D EM COMBINAÇÃO COM UMA TERAPIA IMUNOMODULADORA PARA INIBIR O CRESCIMENTO TUMORAL E METÁSTASE” REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA SUBMETIDA ELETRONICAMENTE

[001]O conteúdo da listagem de sequência eletronicamente submetida no arquivo texto (Nome: 58008_133124_SEQ_LST.txt; Tamanho: 37.171 bytes; e Data de Criação: 20 de Junho de 2014) depositado com o pedido é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

ANTECEDENTE

[002]Semaforina 4D (SEMA4D), também conhecido como CD100, é uma proteína transmembranar (por exemplo, SEQ ID NO:1 (humana); SEQ ID NO:2 (mu-rina)) que pertence a família gênica semaforina. SEMA4D é expressa na superfície celular como um homodímero, mas com ativação celular SEMA4D pode ser liberada a partir de uma superfície celular através de clivagem proteolítica para gerar sSE-MA4D, uma forma solúvel da proteína, que é também biologicamente ativo. Ver, Suzuki e colaboradores., Nature Rev. Immunol. 3:159-167 (2003); Kikutani e colaboradores., Nature Immunol. 9:17-23 (2008).

[003]SEMA4D é expressa em altos níveis em órgãos linfoides, incluindo o baço, timo, e linfonodos, e nos órgãos não linfoides, tais como o cérebro, coração, e rim. Nos órgãos linfoides, SEMA4D é abundantemente expresso em células T em repouso, mas somente fracamente expressa em células B em repouso e células apresentadoras de antígeno (APCs), tal como células dendrítica (CDs). Sua expressão, entretanto, é regulada positivamente nessas células seguindo ativação por vários estímulos imunológicos. A liberação de SEMA4D solúvel a partir de células imunes é também aumentada pela ativação celular. SEMA4D tem sido implicada no desenvolvimento de certos cânceres (Ch'ng e colaboradores., Cancer 110:164-72 (2007); Campos e colaboradores., Oncology Letters, 5:1527-35 (2013); Kato e colaboradores., Cancer Sci. 102:2029-37 (2011)) e vários relatos sugerem que um mecanismo desta influência é o papel de SEMA4D na promoção de angiogênese tumoral (Conrotto e colaboradores., Blood 105:4321-4329 (2005). Basile e colaboradores., J Biol. Chem. 282: 34888-34895 (2007); Sierra et.al. J. Exp. Med. 205:1673 (2008); Zhou e colaboradores., Angiogenesis 15:391-407 (2012)). Crescimento tumoral e metástase envolve um processo complexo de conversa cruzada entre as células tumorais, estroma e infiltrado imune, bem como as células endoteliais e vas-culatura. SEMA4D é superexpressa em uma ampla rede de tipos de tumores e é também produzida por células inflamatórias recrutadas ao microambiente tumoral, a questão de qual papel SEMA4D pode desenvolver na migração, sobrevivência, diferenciação e organização de diferentes tipos celulares que constituem o estroma tumoral permanece para ser abordada.

Breve Resumo [004]Este pedido aborda a necessidade por tratamentos para câncer seguros e efetivos que servem ou como um agente único que inibe, reduz, suprime, previne, torna mais lento ou atrasa a progressão de, diminui, ou diretamente ataca células tumorais ou que podem atuar em combinação com outras terapias imunomodu-ladora para aumentar seu benefício terapêutico. Em particular, SEMA4D foi mostrada desempenhar um papel na infiltração, maturação e organização de células imunes e macrófago que ou promovem ou inibem o crescimento tumoral, que pode contribuir para desenvolvimento de métodos efetivos para reduzir o crescimento tumoral e metástases em um paciente com câncer.

[005]Certos aspectos do pedido são direcionados a um método para inibir, atrasar ou reduzir o crescimento do tumor ou metástase ou ambos, crescimento do tumor e metástase em um paciente com câncer compreendendo administração ao paciente de uma quantidade efetiva de uma molécula ligante isolada que especifi camente liga a semaforina-4D (SEMA4D) e uma quantidade efetiva de pelo menos uma terapia imunomoduladora.

[006]Em algumas modalidades, a molécula ligante inibe interação de SEMA4D com seu receptor (por exemplo, Plexina-B1). Em algumas modalidades, a molécula ligante inibe a transdução de sinal de Plexina-B1 mediada por SEMA4D. Em algumas modalidades, a inibição, atraso, ou redução de metástases ocorre independentemente da inibição, atraso ou redução do crescimento do tumor primário. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo consistindo de carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, leucemia, câncer de célula escamosa, câncer pulmonar de pequena célula, câncer pulmonar de não pequena célula, adenocarcinoma pulmonar, carcinoma escamoso pulmonar, câncer de peritônio, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer neuroendócrino, glioblastoma, câncer cervival, câncer de ovário, câncer hepático, câncer de bexiga, câncer cerebral, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer coloretal, carcinoma endometrial ou uterino, câncer esofágico, carcinoma de glândula salivar, câncer renal, câncer hepático, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer de tireoide, câncer de cabeça e pescoço, e uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o paciente tem níveis elevados de ou células B, células T ou ambas, células B e células T, quando comparado a outros pacientes com câncer.

[007]Em algumas modalidades, a molécula ligante isolada especificamente se liga ao mesmo epítopo SEMA4D como um anticorpo monoclonal de referência selecionado a partir do grupo consistindo de VX15/2503 e 67. Em algumas modalidades, a molécula ligante isolada compreende um anticorpo ou fragmento ligador de antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento ligador de antígeno do mesmo compreende as seis regiões determinantes de complementarie-dade (CDRs) do anticorpo monoclonal VX15/2503 ou 67.

[008]Em algumas modalidades, a terapia imunomoduladora é selecionada a partir do grupo consistindo de uma vacina de câncer, um agente imunoestimulatório, terapia de célula T adotiva ou de anticorpo, bloqueio de ponto de checagem imune e uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o agente modulador imune é selecionado a partir do grupo consistindo de interleucinas, citocinas, quimioci-nas, antagonistas de bloqueios de pontos de checagem imunes e uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a terapia imunomoduladora pode ser uma terapia de câncer. Em algumas modalidades, a terapia de câncer é selecionada a partir do grupo consistindo de cirurgia ou procedimentos cirúrgicos, terapia de radiação, quimioterapia ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a molécula ligadora isolada e o agente imunomoduladora ou terapia imunomoduladora são administrados separadamente ou concomitantemente.

[009]Em algumas modalidades, métodos para inibir, atrasar ou reduzir crescimento tumoral em um paciente com câncer são providos que compreendem administração ao paciente de uma quantidade efetiva de uma molécula ligadora isolada que especificamente se liga à semaforina-4D (SEMA4D) e uma quantidade efetiva de pelo menos uma outra terapia imunomoduladora. Em algumas modalidades, a molécula ligante inibe interação de SEMA4D com seu receptor. Em algumas modalidades, o receptor é Plexina-B1. Em algumas modalidades, a molécula ligadora inibe transdução de sinal de Plexina-B1 mediada por SEMA4D. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo consistindo de carcinoma, linfoma, blasto-ma, sarcoma, leucemia, câncer de célula escamosa, câncer pulmonar de pequena célula, câncer pulmonar de não pequena célula, adenocarcinoma pulmonar, carcinoma escamoso pulmonar, câncer de peritônio, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer neuroendócrino, glioblas-toma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer hepático, câncer de bexiga, câncer cerebral, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer coloretal, carcinoma endometrial ou uterino, câncer esofágico, carcinoma de glândula salivar, câncer re nal, câncer hepático, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer de tireoide, câncer de cabeça e pescoço, e uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, câncer vulvar, câncer de tireoide, câncer de cabeça e pescoço, e uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a molécula ligante isolada especificamente se liga ao mesmo epítopo SEMA4D como um anticorpo monoclonal de referencia VX15/2503 ou 67. Em algumas modalidades, a molécula ligante isolada competitivamente inibe um anticorpo monoclonal de referencia VX15/2503 ou 67 de especificamente ligar a SEMA4D. Em algumas modalidades, a molécula ligante isolada compreende um anticorpo ou fragmento ligador de antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento ligador de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada variável (VH) compreendendo VHCDRs 1-3 compreendendo SEQ ID Nos:6, 7, e 8, respectivamente, e uma cadeia leve variável (VL) compreendendo VLCDRs 1-3 compreendendo SEQ ID Nos 14, 15, e 16, respetivamente. Em algumas modalidades, o VH e VL compreende, respectivamente, SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:17 ou SEQ ID NO:10 e SEQ ID NO:18. Em algumas modalidades, a terapia imunomoduladora é selecionada a partir do grupo consistindo de administração de uma vacina de câncer, administração de um agente imunomodulatório, terapia de célula T adotiva ou anticorpo, administração de um inibidor do bloqueio de ponto de checagem imune, administração de um modulador de célula T reguladora (Treg), e uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a terapia imu-nomoduladora compreende um inibidor do bloqueio do ponto de checagem imune. Em algumas modalidades, em que o inibidor do bloqueio do ponto de checagem imune é um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-PD-1, ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a terapia imunomoduladora compreende administração de uma vacina de câncer. Em algumas modalidades, o modulador Treg é ciclofosfamida. Em algumas modalidades, a molécula ligante isolada e a terapia imunomoduladora são administradas separadamente ou concomitantemente. Em algumas modalidades, administração da combinação da molécula ligante isolada e a terapia imunomoduladora resulta em eficácia terapêutica aumentada relativa a administração da molécula ligante isolada ou a terapia imunomoduladora sozinha. Em algumas modalidades, o paciente que tem um nível elevado de células B, células T ou ambas, células B e células T quando comparado a outros pacientes com câncer. Em algumas modalidades, o nível de células B e/ou células T por microlitro de sangue no paciente é cerca de 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; ou 5 vezes o número médio de células B e/ou células T na circulação em outros pacientes com câncer. Em algumas modalidades, o nível de células B e/ou células T por microlitro de sangue nos pacientes varia de cerca de 147 a cerca de 588 e de cerca de 1173 a cerca de 3910, respetivamente, por exemplo, quando comparado a outros pacientes com câncer. Em algumas modalidades, o paciente tem níveis de célula B e/ou celular T que caem dentro ou acima da variação de células B e/ou células T de pacientes saudáveis sem câncer. Em algumas modalidades, os níveis de célula B e/ou célula T por microlitro de sangu no paciente variam de cerca de 225 a cerca de 275 ou mais e de cerca de 1350 a 1650 ou mais, respectivamente, por exemplo, quando comparado a pacientes saudáveis sem câncer.

[010]Em algumas modalidades, métodos para tratar um paciente tendo câncer com imunoterapia são providos que compreendem: (a) determinação do número de células B e/ou células T em um paciente com câncer; e (b) administração ao paciente de uma quantidade efetiva de uma molecular ligante isolada que especificamente liga a semaforina-4D (SEMA4D) e uma quantidade efetiva de pelo menos uma outra terapia imunomoduladora se o número de células B e/ou células T no paciente excede um nível limite pré-determinado. Em algumas modalidades, os níveis limites pré-determinados de células B e/ou células T por microlitro de sangue no paciente é cerca de 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5 ou 5 vezes o número médio de células B e/ou células T na circulação em outros pacientes com câncer. Em algumas modali dades, os níveis limites pré-determinados das células B e/ou células T por microlitro de sangue no paciente variam de cerca de 147 a cerca de 588 e de cerca de 1173 a cerca de 3910, respectivamente, por exemplo, quando comparado a outros pacientes com câncer. Em algumas modalidades, os níveis limites pré-determinados de células B e/ou células T por microlitro de sangue no paciente caem dentro ou acima da variação de células B e/ou células T de pacientes saudáveis sem câncer. Em algumas modalidades, os níveis limites pré-determinados de células B e/ou células T por microlitro de sangue no paciente variam de cerca de 225 a cerca de 275 ou mais e de cerca de 1350 a cerca de 1650, respectivamente, por exemplo, quando comparado a pacientes saudáveis sem câncer.

[011]Em algumas modalidades, métodos de tratar um paciente tendo câncer com imunoterapia são providos que compreende: administração de uma combinação de uma quantidade efetiva de uma molécula ligante isolada que especificamente liga a semaforian-4D (SEMA4D) e uma quantidade efetiva de pelo menos uma outra terapia imunomoduladora a um paciente com câncer, em que administração da combinação resulta na eficácia terapêutica aumentada relativa a administração da molécula ligante isolada ou outra terapia imunomoduladora sozinha. Em algumas modalidades, a terapia imunomoduladora é selecionada a partir do grupo consistindo de administração de uma vacina de câncer, administração de um agente imunoestimulató-rio, terapia de célula T adotiva ou anticorpo, administração de um inibidor de bloqueio de ponto de checagem imune, administração de um modulador de célula T reguladora (Treg), e uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a terapia imunomoduladora compreende um inibidor de bloqueio de ponto de checagem imune. Em algumas modalidades, o inibidor de bloqueio de ponto de checagem imune é um anticorpo anti-CTLA4, um anticorpo anti-PD-1, ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a terapia imunomoduladora compreende administração de uma vacina de câncer. Em algumas modalidades, o modulador Treg é ciclofosfamida. Em algumas modalidades, a molécula ligante isolada e a terapia imunomoduladora são administradas separadamente ou concomitantemente. Em algumas modalidades, o paciente tem níveis elevados de ou células B, células T, ou ambas, células B e células T quando comparado a outros pacientes com câncer. Em algumas modalidades, os níveis de células B e/ou células T por microlitro de sangue no paciente é cerca de 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; ou 5 vezes o número médio de células B e/ou células T na circulação em outros pacientes com câncer. Em algumas modalidades, os níveis de células B e/ou células T por microlitro de sangue no paciente variam de cerca de 147 a cerca de 588 e de cerca de 1173 a cerca de 3910, respectivamente, por exemplo, quando comparados a outros pacientes com câncer. Em algumas modalidades, o paciente tem níveis de células B e/ou células T que caem dentro ou acima da variação de células B e/ou células T de pacientes saudáveis sem câncer. Em algumas modalidades, os níveis de células B e/ou células T por mi-crolitro de sangue no paciente variam de cerca de 225 a cerca de 275 ou mais e de cerca de 1350 a cerca de 1650, ou mais, respeticamente, por exemplo, quando comparado a pacientes saudáveis sem câncer. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo consistindo de carcinoma, linfoma, blastoma, sarco-ma, leucemia, câncer de célula escamosa, câncer pulmonar de pequena célula, câncer pulmonar de não pequena célula, adenocarcinoma pulmonar, carcinoma escamoso pulmonar, câncer de peritoneo, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer neuroendócrino, glioblastoma, câncer cervival, câncer de ovário, câncer hepático, câncer de bexiga, câncer cerebral, hepa-toma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer coloretal, carcinoma endometrial ou uterino, câncer esofágico, carcinoma de glândula salivar, câncer renal, câncer hepá-tico, câncer de próstata, câncer vulcar, câncer de tireoide, câncer de cabeça e pescoço, e uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades de quaisquer dos métodos acima mencionados, a molécula ligante isolada especificamente liga ao mesmo epítopo SEMA4D como um anticorpo monoclonal de referência selecionado a partir do grupo consistindo de VX15/2503 ou 67. Em algumas modalidades de quaisquer dos métodos acima mencionados, a molécula ligante isolada competitivamente inibe um anticorpo monoclonal de referencia selecionada a partir do grupo consistindo de VX15/2503 ou 67 de especificamente ligar a SEMA4D. Em algumas modalidades, a molécula ligante isolada compreende um anticorpo ou fragmento ligador de antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento ligador de antígeno do mesmo compreende as seis regiões determinantes de com-plementariedade (CDRs) do anticorpo monoclonal VX15/2503. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento ligador de antígeno do mesmo é anticorpo monoclonal VX15/2503 ou 67.

[012]Também provido são métodos para inibir, atrasar, ou reduzir crescimento de células tumorais expressando Her2 e Plexina B1, Plexina B2, ou uma combinação dos mesmos, compreendendo colocar em contato as células tumorais com uma quantidade efetiva de uma molécula ligante isolada que especificamente liga a semaforina-4D (SEMA4D), em que o crescimento de células tumorais é inibido, atrasado, ou reduzido. Em algumas modalidades, o colocar em contato compreende administração da molécula ligadora de SEMA4D a um paciente com câncer, em que as células cancerígenas do paciente expressam Her2 e Plexina B1, Plexina B2, ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de mama, câncer de ovário, câncer pulmonar ou câncer de próstata.

[013]Também provido são métodos para tratar um paciente tendo câncer compreendendo: (a) ensaio das células cancerígenas do paciente para expressão de Her2 e Plexina B1, Plexina B2, ou uma combinação das mesmas; e (b) administração ao paciente de uma quantidade efetiva de uma molécula ligante isolada que especificamente liga a semaforina-4D (SEMA4D) se as células cancerígenas do paciente expressarem Her2 e Plexina B1, Plexina B2, ou uma combinação dos mes mos. O método da reivindicação 48 ou reivindicação 49, ainda compreendendo a administração de uma quantidade efetiva de uma molécula ligante anti-HER2/neu. O método da reivindicação 48 ou reivindicação 49, em que a molécula ligante isolada especificamente liga ao mesmo epítopo SEMA4D como um anticorpo monoclonal de referência VX15/2503 ou 67. O método da reivindicação 48 ou reivindicação 49, em que a molécula ligante isolada competitivamente inibe um anticorpo monoclonal de referência VX15/2503 ou 67 a partir de especificamente ligar a SEMA4D. O método da reivindicação 48 ou reivindicação 49, em que a molécula ligante isolada compreende um anticorpo ou fragmento ligante de antígeno do mesmo. O método da reivindicação 53, em que o anticorpo ou fragmento ligante de antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada variável (VH) compreendendo VHCDRs 1-3 compreendendo SEQ ID Nos 6, 7 e 8, respectivamente, e uma cadeia leve variável (VL) compreendendo VLCDRs 1-3 compreendendo SEQ ID Nos:14, 15 e 16, respetivamente. O método da reivindicação 54, em que VH e VL compreendem, respectivamente, SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:17 ou SEQ IDNO:10 e SEQ IDNO:18.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS

[014]Figuras 1A-1B: Medida do volume do tumor em camundongos implantados com células tumorais Colon26 singenêicas. FIG. 1â mostra medida do volume tumoral Colon26 em camundongos Balb/c e SCID tratados duas vezes por semana com ou 1 mg (50 mg/kg) de anticorpo anti-SEMA4D (Ab) 67 ou imunoglobulina controle isotipo 2B8 (2B8 Controle Ig). FIG. 1B mostra tempo de sobrevivência, como definido no Exemplo 1 abaixo, de camundongos Balb/c e SCID tratados com ou Ab anti-SEMA4D 67 ou Ig Controle 2B8.

[015]FIGURA 2: Mostra medida do volume do tumor Colon26 em camun-dongos Balb/c implantados com células tumorais e tratados primeiro com anticorpo depletando anti-CD8 (Clone 2.43, bioXCell) ou Ig Controle de Rato (150 mg/kg) e então tratados como na FIG. 1A com ou Ig Controle 2B8 ou Ab anti-SEMA4D 67.

[016]FIGURAS 3A-3B: Medida da densidade de célula imune no tumor Co-lon26 de camundongos enxertados. FIG. 3A mostra densidade de células T CD8+ como determinado por % de área tumora corada com anticorpo anti-CD8 após tratamento com Ig Controle ou Ab anti-SEMA4D 67. FIG. 3B mostra densidade de células B CD20+ como determinado por % de área tumoral corada com anticorpo anti-CD20 após tratamento com Ig Controle ou Ab anti-SEMA4D 67.

[017]FIGURAS 4A-4D: Medida da distribuição de macrófago e célula T CD8+ nas bordas do tumor em camundongos Colon26 enxertados. FIG. 4A mostra imagens de tumores Colon26 representativos a partir de camundongos enxertados há 27 dias e tratados com ou Ig Controle ou Ab anti-SEMA4D 67 como descrito na FIG. 1. FIG. 4B mostra medida de densidade de macrófago tipo M1 nas bordas do tumor, definido como uma região ampla de 300 pixel (250 micron) a partir da borda do tumor, como determinado por % de pixel por área corada com anticorpo anti-F4/80. FIG. 4C mostra medida da densidade de macrófago tipo M2 na borda do tumor como determinado por % de pixel por área coranda com anticorpo anti-CD206. FIG. 4D mostra medida da densidade de células T CD8+ na borda do tumor, como determinado por % de pixel na área corada com anticorpo anti-CD8 de célula T citotóxica.

[018]FIGURAS 5A-5D: Medida de volume do tumor em camundongos implantados com células tumorais Colon26 singenêicos. FIG. 5A mostra medida do volume tumoral Colon26 em camundongos Balb/c tratados com ou controle IgG1/2B8 de camundongo ou anti-SEMA4D 67-2 (50 mg/kg, IP, semanalmente), com ou sem anti-CTLA/MAb UC10-4F10-11 (100 gg no dia 8 e 50 gg nos dias 11 e 14 pós inoculação de tumor), e com anti-PD1/RPMI-14 (100 gg no dia 3, duas vezes semanalmente) em combinação com anti-CTLA4/Mab UC10-4F10-11. FIG. 5B mostra tempo de sobrevivência de camundongos Balb/c tratados com ou IgG1/2B8 de camundongo controle ou anti-SEMA4D/MAb 67-2, com ou sem anti-CTLA4/MAb UC10-4F10-11, e com anti-PD1/RPM1-14 (100 gg no dia 3, duas vezes semanal mente) em combinação com anti-CTLA4/MAb UC10-4F10-11. FIG. 5C mostra a frequência de regressão tumoral em camundongos Balb/c tratados com ou IgG1/2B8 de camundongo controle ou anti-SEMA4D/MAb 67-2, com ou sem anti-CTLA4/MAb UC10-4F10-11, e com anti-PD1/RPMI1-14 (100 pg no dia 3, duas vezes por semana) em combinação com anti-CTLA4/Mab UC10-4F10-11 (valores de p, *0,05 e **0,001). FIG. 5D mostra medidas de citocinas pró-inflamatórias IFNy nos linfócitos infiltrantes do tumor de camundongos tratados com a combinação de anti-SEMA4D/Mab e anti-CTLA4/Mab UC10-4F10-11 comparado com ou IgG1-2B8 de camundongo controle ou monoterapia (ou anti-SEMA4D/Mab 67-2 ou anti-CTLA4/Mab UC10-4F10-11). FIG. 5E mostra frequências de respondedores secreto-res de IFNy peptídeo-específico entre linfócitos infiltrantes do tumor recuperados a partir do baço de camundongos tratados com a combinação de anti-SEMA4D/Mab 67-2 e anti-CTLA4/Mab UC10-4F10-11 comparado a ou IgG1/2B8 de camundongo controle ou monoterapia (ou anti-SEMA4D/Mab 67-2 ou anti-CTLA4/Mab UC10-4F10-11).

[019]FIGURAS 6A-6E: Medida de um anticorpo anti-SEMA4D para afetar infiltração tumoral de células T CD8+ citotóxicas específicas para o tumor. FIG. 6A mostra medida de células secretoras de IFNy em camundongos tratados com MAb 67 em ambos, em presença e ausência de peptídeo. FIG. 6B mostra imagens ELISPOT representativas. FIG. 6C mostra medida de citocinas antitumor, tais como IFNy e TNFa, em linfócitos infiltrantes de tumor (TIL). FIG. 6D mostra medidas de citocinas anti-inflamatórias IFNy e TNFa em TIL em camundongos tratados com o anticorpo anti-SEMA4D/MAb 67. FIG. 6E mostra frequência de respondedores se-cretando IFNy específico ao peptídeo nos linfócitos infiltrantes de tumor de camundongos tratados com anticorpo anti-SEMA4D/MAb 67.

[020]FIGURAS 7A-7D: Medida do volume de tumor em camundongos implantados com células tumorais Colon26 singenêicas. FIG. 7A mostra medida do volume do tumor Colon26 em camundongos Balb/c tratados com ou IgG1/2B8 de camundongo controle ou anti-SEMA4D/MAb 67-2 (50 mg/kg, IP, semanalmente), junto com ou Ig de rato controle ou anti-PD1/MAbRPMI1-14 de rato (100 pg, duas vezes pode semana, por 2 semanas começando 3 dias pós-inoculação do tumor). FIG. 7B mostra tempo de sobrevivência de camundongos Balb/c tratados com ou IgG1/2B8 de camundongo controle ou anti-SEMA4D/MAb 67-2 junto com ou Ig de rato controle ou anti-PD1/MAbRPMI1-14 de rato. FIGS. 7C e 7D mostram a frequência da regressão tumoral em camundongos Balb/c tratados com ou IgG1/2B8 de camundongo controle ou anti-SEMA4D/MAb 67-2 junto com ou Ig de rato controle ou anti-PD1/MAbRPMI1-14.

[021]FIGURAS 8A-8E: Medida do volume tumoral em camundongos implantados com células tumorais Colon26 singenêicos. FIG. 8A mostra média da medida do volume do tumor Colon26 em camundongos Balb/c tratados com ou IgG1/2B8 de camundongo controle ou anti-SEMA4D/MAb 67-2 (50 mg/kg, IP, semanalmente), com ou sem ciclofosfamida (CY) (50 mg/kg, IP). FIG. 8B mostra média da medida do volume do tumor Colon26 em camundongos Balb/c tratados com ou IgG1/2B8 de camundongo controle ou anti-SEMA4D/MAb 67-2 (50 mg/kg, IP, semanalmente), com ou sem ciclofosfamida (CY) (50 mg/kg, IP). FIG. 8C mostra tempo de sobrevivência de camundongos Balb/c tratados com ou IgG1/2B8 de camundongo controle ou anti-SEMA4D/MAb 67-2, com ou sem ciclofosfamida. FIGS. 8D e 8E mostram a frequência de regressões tumorais em camundongos Balb/c tratados com ou IgG1/2B8 de camundongo controle ou anti-SEMA4D/MAb 67-2, com ou sem ciclofos-famida (CY).

[022]FIGURAS 9A-9C: Medida do volume tumoram em camundongos implantados com células tumorais Tubo.A5. FIG. 9A mostra medida do volume tumora em camundongos Balb/c tratados com ou IgG1/2B8 de camundongo controle ou an-ti-SEMA4D/MAb 67-2 (50 mg/kg, IP, semanalmente), com ou sem anti- Neu/MAb7.16.4 (aNeu) (200 gg IP semanalmente X2 começando quando Volume do Tumor (TV) é aproximadamente 200 mm3, nos dias 21 e 28). FIG. 9B mostra tempo-de sobrevivência de camundongos Balb/c tratados com ou IgG1/2B8 de camundon-go controle ou anti-SEMA4D/MAb 67-2, com ou sem anti-Neu/MAb7.16.4 (aNeu). FIG. 9C mostra a frequência de regressão de tumor em camundongos Balb/c tratados com ou IgG1/2B8 de camundongo controle ou anti-SEMA4D/MAb 67-2, com ou sem anti-Neu/MAb7.16.4 (aNeu).

[023]FIGURAS 10A-10E: Medida do volume do tumor em camundongos Balb/c implantados com células de tumor Tubo.A5. FIG. 10A mostra medida do volume do tumor em camundongos Balb/c tratados com ou IgG1/2B8 de camundongo controle ou anti-SEMA4D/MAb 67-2 (50 mg/kg, IP, semanalmente). FIG. 10B mostra tempo de sobrevivência de camundongos Balb/c tratados com ou IgG1/2B8 de camundongo controle ou anti-SEMA4D/MAb 67-2. FIGS. 10C-10E mostram a frequência de regressões de tumor no modelo de tumor Tubo.A5. Especificamente, FIG. 10C mostra camundongos controle enxertados com o tumor Tubo.A5. FIG. 10D mostra camundongos que têm enxertos de tumor Tubo.A5 rejeitados seguindo tratamento com anti-SEMA4D/MAb 67-2 e que foram desafiados novamente com tumor Tu-bo.A5 no dia 90 seguindo o enxerto original. FIG. 10E mostra camundongos virgens desafiados com o mesmo enxerto de tumor como na FIG. 10D para demonstrar viabilidade do tumor in vivo.

[024]FIGURAS 11A-11B: Medida de infiltração de célula T e MDSC nos modelos de tumro Tubo.A5. FIG. 11A mostra medida de células T CD3+ em tumores de camundongos Balb/c tratados com ou IgG1/2B8 de camundongo controle ou anti-SEMA4D/MAb 67-2 (50 mg/kg, IP, semanalmente). FIG. 11B mostra medida de CD11b+Gr1+ MDSC em tumores de camundongos Balb/c tratados com ou IgG1/2B8 de camundongo controle ou anti-SEMA4D/MAb 67-2 (50 mg/kg, IP, semanalmente).

[025]FIGURAS 12A-12D: Medida do volume de tumor em camundongos im plantados com ou células de tumor Colon 26 ou Tubo.A5. FIG. 12A mostra medida do volume de tumor Tubo.A5 em camundongos Balb/c tratados com ou IgG1/2B8.IE7 de camundongo controle (50 mg/kg, IP, semanalmente x 6) ou níveis variando de anti-SEMA4D/MAb 67-2 (1, 10 ou 50 mg/kgm IP, semanalmente x 6). FIG. 12B mostra tempo de sobrevivência de camundongos Balb/c tratados com ou IgG1/2B8.IE7 de camundongos controle (50 mg/kg, IP, semanalmente x6) ou níveis variado de anti-SEMA4D/MAb 67-2 (1, 10 ou 50 mg/kg, IP, semanalmente x6). FIG. 12C mostra medida do volume do tumor 26 em camundongos Balb/c tratados com IgG1/2B8/IE7 de camundongo controle (50 mg/kg, IP, semanalmente x5), anti-SEMA4D/MAb 67-2 (50 mg/kg, IP, semanalmente x 5), anti-CTLA4/MAb UC10-4F10-11 (5mg/kg, IP, semanalmente x 5), ou uma combinação de anti-CTLA4/MAb UC10-4F10-11 (5mg/kg, IP, semanalmente x 5) e níveis variantes de anti-SEMA4D/MAb 67-2 (0,3, 3, 10, or 50 mg/kg, IP, semanalmente x 5). FIG. 12D mostra tempo de sobrevivência de camundongos Balb/c tratados com IgG1/2B8.IE7 de camundongo controle (50 mg/kg, IP, semanalmente x 5), anti-SEMA4D/MAb 67-2 (50 mg/kg IP, semanelmente x5), anti-CTLA4/MAb UC10-4F10-11 (5 mg/kg, IP, semanalmente x 5), ou uma combinação de anti-CTLA4/MAb UC10-4F10-11 (5 mg/kg, IP, semanalmente x 5) e níveis variantes de anti-SEMA4D/MAb 67-2 (0,3, 3, 10, ou 50 mg/kg, IP, semanalmente x 5).

[026]FIGURA 13: Resumo de experimentos conduzidos nas figuras acima mostrando regressões tumorais e crescimento após novo desafio de tumor nos modelos de tumor Colon26 e Tubo.A5.

DESCRIÇÃO DETALHADA I. Definições [027]É para ser notado que o termo “um” ou “uma” entidade refere-se a uma ou mais desta entidade; por exemplo, “um polinucleotídeo”, é entendido representar um ou mais polinucleotídeos. Tal como, os termos “um” (ou “uma”), “um ou mais”, e “pelo menos um” podem ser usados de forma intercambiável.

[028]Além disso, “e/ou” onde aqui utilizado é para ser tomado como revelação específica de cada das duas características ou componentens especificados com ou sem o outro. Então, o termo “e/ou” como utilizado em uma frase tal como “A e/o B” aqui é tencionada incluir “A e B”, “A ou B”, “A” (sozinho), e “B” (sozinho). Igualmente, o termo “e/ou” como utilizado em uma frase tal como “A, B, e/ou C” é tencionado a compreender cada das seguintes modalidades: A, B e C; A, B, ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (sozinho); B (sozinho); e C (sozinho).

[029]A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por um versado na técnica a qual esta revelação é relacionada. Por exemplo, O Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2a ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3a ed., 1999, Academic Press; e o Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revisado, 2000, Oxford University Press, prove um versado na técnica com um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta revelação.

[030]Unidades, prefixos, e símbolos são denotados em sua forma aceita no Sistema Internacional de Unidades (SI). Variações numéricas são inclusivas dos números definindo a variação. A menos que de outra forma indicado, sequências aminoácidas são escritas da esquerda para a direita na orientação amino para car-bóxi. As seções aqui providas não são limitações dos vários aspectos ou modalidades da revelação, que podem ser tidos por referência à especificação como um inteiro. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente definidos por referência à especificação em sua totalidade.

[031]Onde quer que as modalidades sejam descritas com a linguagem “compreendendo”, de outra forma modalidades análogas descritas nos termos de “consistindo de” e/ou “consistindo essencialmente de” são também providas.

[032]Aminoácidos são referidos aqui por seus comumente conhecidos símbolos de três letras ou por um símbolo de uma letra recomendado pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Nucleotídeos, do mesmo modo, são referidos por seus códigos comumente aceitos de uma letra.

[033]Como aqui utilizado, os termos “câncer” e “canceroso” refere-se a ou descreve a condição fisiológica em mamíferos em que uma população de células é caracterizada por crescimento celular não regulado. Exemplos de câncer incluem, mas não são limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, e leucemia. Exemplos mais particulares de tais cânceres incluem câncer de célula escamosa, câncer pulmonar de pequena célula, câncer pulmonar de não pequena célula, adenocarcinoma pulmonar, carcinoma escamoso pulmonar, câncer de peritônio, câncer hepa-tocelular, câncer gastrointestinal, câncer gástrico, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer hepático, câncer de bexiga, câncer cerebral, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer coloretal, carcinoma endometrial ou uterino, câncer esofágico, carcinoma de glândula salivar, sarcoma, câncer renal, câncer hepático, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer de tireoide, carcinoma hepático e vários tipos de cânceres de cabeça e pescoço.

[034]Em certas modalidades, cânceres metastáticos que são passíveis de tratamento através dos métodos providos aqui incluem, mas não são limitados a sarcomas metastáticos, carcinomas de mama, câncer de ovário, câncer de cabeça e pescoço, e câncer pancreático. Em certas modalidades cânceres metastáticos ou células tumorais que são passíveis de tratamento através de métodos aqui providos expressam receptores Plexina-B1 e/ou Plexina-B2 para SEMA4D.

[035]“Angiogênese” refere-se a um complexo evento morfogênico multipasso durante o qual células endoteliais, estimuladas por determinantes principais de re-modelamento vascular, dinamicamente modifica seus contatos célula-a-célula e cé-lula-a-matriz e movem direcionamente para serem reconhecidas em uma árvore vascular madura (Bussolino e colaboradores., Trends Biochem Sci. 22:251-256 (1997); Risau, Nature 386:671-674 (1997); Jain, Nat. Med. 9:685-693 (2003)). A formação dos novos vasos sanguíneos é um passo chave durante o desenvolvimento embrionário, mas é também ocorrido em adultos em condições fisiológicas e patológicas, tais como retinopatia, artrite reumatoide, isquemia, e particularmente crescimento tumoral e metástase (Carmeliet, Nat. Med. 9:653-660 (2003)).

[036]Como aqui utilizado, o termo “laboratório clínico” refere-se a facilidade para o exame ou processamento de materiais derivados de um paciente vivo, por exemplo, ser humano. Exemplos não limitantes de processamento incluem biológico, bioquímico, sorológico, químico, imunoematológico, hematológico, biofísico, citológi-co, patológico, genético ou outro exame de materiais derivados do corpo humano para o propósito de prover informação, por exemplo, para o diagnóstico, prevenção, ou tratamento de qualquer doença ou impedimento de, ou a avaliação da saúde de pacientes vivos, por exemplo, seres humanos. Esses exames podem também incluir procedimentos para coletar ou de outra forma obter uma amostra, preparar, determinar, medir, ou de outra forma descrever a presença ou ausência de várias substâncias no corpo de um paciente vivo, por exemplo, um ser humano, ou uma amostra obtida a partir do corpo de um paciente vivo, por exemplo, um ser humano.

[037]Os termos “distúrbio proliferativo” e “doença proliferativa” refere-se a distúrbios associados com proliferação de célula anormal tal como câncer.

[038]“Tumor” e “neoplasma” como aqui utilizados referem-se a qualquer massa de tecido que resulta a partir de crescimento celular ou proliferação excessiva, ou benigna (não cancerosa) ou maligna (cancerosa) incluindo lesões pré-cancerosas. Em certas modalidades, tumores aqui descritos expressam Plexina-B1 e/ou Plexina-B2, e podem expressar SEAM4D e Met ativado.

[039]Como aqui utilizado, o termo “provedor de benefícios de cuidados de saúde” compreende partes individuais, organizações, ou grupo provendo, apresen tando, oferecendo, pagando por totalmente ou em parte, ou sendo de outra forma associado com dar um acesso ao paciente de um ou mais benefícios de cuidados de saúde, planos de benefício, seguro de saúde, e/ou programas de contagem de despesas de cuidados de saúde.

[040]O termo “terapia imunomodulatória” ou “imunoterapia” refere-se a tratamento que impacta uma doença ou distúrbio em um paciente por induzir e/ou aumentar uma resposta imune neste paciente. Terapias imunomoduladora incluem vacinas de câncer, agentes imunoestimulatórios, terapia de célula T adotiva ou anticorpo, e bloqueio de ponto de checagem imune (Lizée e colaboradores. 2013. Harnessing the Power of the Immune System to Target Cancer. Annu. Rev. Med. Vol. 64 No. 71-90).

[041]O termo “agente imunomoduladora” refere-se a agentes ativos de imu-noterapia. Agentes imunomoduladores incluem uma diversa rede de preparação re-combinante, sintética e natural. Exemplos de agentes imunomoduladores incluem, mas não são limitados a, interleucinas tais como IL-2, IL-7, IL-12; citocinas tais como fator estimulador de colônia de granulócito (G-CSF), interferons; várias quimiocinas tais como CXCL13, CCL26, CXCL7; antagonistas de bloqueios de ponto de checagem imune tais como anti-CTLA4, anti-PDI ou anti-PD-L1 (ligante de PD-1), anti-LAG3, anti-B7-H3, oligodeoxinucleotídeos citosina fosfato-guanosina (CpG) sintéticos, glucanos; e moduladores de células T reguladoras (T regs) tal como ciclofosfa-mida.

[042]Os termos “metástase”, “metástases”, “metastático”, e outros equivalentes gramaticais como aqui utilizados referem-se a células de câncer que espalham ou transferem a partir do sítio de origem (por exemplo, um tumor primário) para outras regiões do corpo com o desenvolvimento de uma lesão cancerosa similar em uma nova localização. Uma célula “metastática” ou “metastatizando” é uma que perde contato adesivo com as células vizinhas e migra através da corrente sanguínea ou linfa de um sítio primário de doença para invadir as estruturas corpóreas vizinhas. Os termos também se referem a processos de metástase, que incluem, mas não são limitados a descolamento de células de câncer a partir de um tumor primário, intra-vasamento de células tumorais à circulação, sua sobrevivência e migração para um sítio distante, ligação e extravasamento em um novo sitio a partir da circulação, e microcolonização no sítio distante, e crescimento tumoral e desenvolvimento em um sítio distante.

[043]O termo “quantidade terapeuticamente efetiva” refere-se a uma quantidade de um anticorpo, polipeptídeo, polinucleotídeo, molécula orgânica pequena, ou outra driga efetiva para “tratar” uma doença ou distúrbio em um paciente ou mamífero. No caso de câncer, a quantidade terapeuticamente efetiva da droga pode reduzir o número de células cancerígenas; retardar ou parar a divisão de células de câncer, reduzir ou retardar um aumento no tamanho do tumor; inibir, por exemplo, suprimir, retardar, prevenir, parar, atrasar, ou reverter infiltração de célula cancerígena em órgãos periféricos incluindo, por exemplo, o espalhar de câncer em tecido molde e ósseo; inibir, por exemplo, suprimir, retardar, prevenir, retrair, parar, atrasar, ou reverter metástase tumora; inibir, por exemplo, suprimir, retardar, prevenir, parar, atrasar, ou reverter o crescimento tumoral; aliviar em alguma extensão um ou mais sintomas associados com o câncer, reduzir a morbidade e mortalidade; melhorar a quantidade de vida; ou uma combinação de tais efeitos. A uma extensão a droga que previne crescimento e/ou morte de células cancerígenas existentes, pode ser referida como citostática e/ou citotóxica.

[044]Termos tal como “tratar” ou “tratamento” ou “para tratar” ou “aliviar” ou “para aliviar” referem-se a ambos, 1) medidas terapêuticas que curam, abrandam, diminuir sintomas de, reverter, e/ou interromper a progressão de uma condição ou distúrbio patológico diagnosticado e 2) medidas profiláticas ou preventivas que pre-viem e/ou diminuem o desenvolvimento de uma condição ou distúrbio patológico al vo. Então, aqueles em necessidade de tratamento incluem aqueles já com o distúrbio; aqueles propensos a ter o distúrbio; e aqueles em que o distúrbio é para ser prevenido. Um paciente é “tratado” com sucesso de acordo com os métodos da presente invenção se o paciente mostra um ou mais dos seguintes: uma redução no número de ou ausência completa de células cancerígenas; uma redução no tamanho do tumor; ou retardamento ou inversão do crescimento tumoral, inibição, por exemplo, supressão, prevenção, retardo, encolhimento, atraso, ou revesão de me-tástases, por exemplo, da infiltração da célula de câncer nos órgãos periféricos incluindo, por exemplo, o espalhar do câncer no tecido mole e ósseo; inibição de, por exemplo, supressão de, retarde de, prevenção de, encolhimento de, reversão de, atraso de, ou ausência de metástase tumoral, inibição de, por exemplo, supressão de, retardo de, prevenção de, encolhimento de, reversão de, atraso de, ou uma ausência de crescimento tumoral; alívio de um ou mais sintomas associados com o câncer específico; morbidade e mortalidade reduzida; melhoramento na qualidade de vida; ou alguma combinação de efeitos. Resultados benéficos ou clínicos desejados incluem, mas não são limitados a, alívio de sintomas, diminuição da extensão da doença, estado estabilizado (isto é, não piora) da doença, atraso ou diminuição da progressão de doença, melhora ou paliação do estado de doença, e remissão (se parcial ou total), se detectável ou indetectável. “Tratamento” pode também significa prolongamento de sobrevivência como comparado a sobrevivência esperada se não recebendo tratamento. Aqueles em necessidade de tratamento incluem aqueles já com a condição ou distúrbio bem como aqueles propensos a ter a condição ou distúrbio ou aqueles em que a condição ou distúrbio a ser prevenido.

[045]Por “sujeito” ou “indivíduo” ou “animal” ou “paciente” ou “mamífero”, é significado qualquer paciente, particularmente um paciente mamífero, para o qual diagnóstico, prognóstico, ou terapia é desejado. Pacientes mamíferos incluem humanos, animais domésticos, animais de fazenda, e animais de zoológico, esportes ou domésticos tais como cachorros, gatos, porquinhos da índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, gado, vacas, ursos, e afins.

[046]Como aqui utilizado, frases tal como “um paciente que pode beneficiar a partir da administração de um anticorpo anti-SEMA4D como um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora” “um animal em necessidade de tratamento” inclui pacientes, tais como pacientes mamíferos, que podem beneficar a partir da administração de um anticorpo anti-SEMA4D como um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomodula-dora.

[047]Uma “molécula ligante” ou “molécula ligadora de antígeno” da presente revelação refere-se em seu senso maior a uma molécula que especificamente liga a um determinante antigênico. Em uma modalidade, a molécula ligante liga a SEMA4D, por exemplo, um polipeptídeo SEMA4D transmembranar de cerca de 150 kDa ou um polipeptídeo SEMA4D solúvel de cerca de 120 kDa (comumente referido como sSEMA4D). Em outra modalidade, uma molécula ligante da revelação é um anticorpo ou um fragmento ligador de antígeno do mesmo. Em outra modalidade, uma molécula ligante da revelação compreende pelomenos uma Região Determinante de Complementariedade (CDR) de cadeia pesada ou leve de uma molécula de anticorpo. Em outra modalidade, uma molécula ligante da revelação compreende pelo menos dois CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade, uma molécula ligante da revelação compreende pelo menos três CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade, a molécula ligadora da revelação compreende pelo menos quatro CDRs a partir de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade, uma molécula ligante da revelação compreende pelo menos cinco CDRs a partir de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade, uma molécula ligante da revelação compreende pelomenos seis CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpo. Em outra modalidade, a molécula ligante pode ser um antagonista do receptor Plexina-BI para SEMA4D. Por antagonista é significado uma molécula ligante que interfere com a função de sinalização do receptor. O antagonista pode competitivamente bloquear a ligação de um ligante natural, mas falhar em iniciar a resposta fisiológica normal. Moléculas ligantes podem ser anticorpos ou fragmentos ligadores de antígeno dos mesmos como descrito acima ou podem ser outras drogas biológicas ou de moléculas pequenas que atuam como inibidores competitivos ou interferem com sinalização por ligantes naturais. A presente revelação é direcionada a um método de inibir o crescimento de tumor e me-tástase em um paciente, por exemplo, paciente com câncer, compreendendo administração ao paciente de uma molécula ligante anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivados dos mesmos, como um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomodu-ladora. A menos especificamente referindo a anticorpos de comprimento inteiro tal como anticorpor de ocorrência natural, o termo “anticorpo anti-SEMA4D” compreende anticorpos de comprimento inteiro bem como fragmentos ligadores de antígeno, variantes, análogos, ou derivados de tais anticorpos, por exemplo, anticorpo de ocorrência natural ou molécula de imunoglobulinas ou moléculas de anticorpos construídas ou fragmentos que ligam antígeno em uma forma similar a moléculas de anticorpo. Também inclusas nas moléculas ligantes SEMA4D são outras moléculas biológicas ou pequenas que ligam e inibem a atividade de SEMA4D ou de seu receptor Plexina-B1.

[048]Como aqui utilizado, anticorpos “humano” ou “completamente humano” incluem anticorpos tendo a sequência aminoácida de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulina humana ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas, como descrito acima e, por exemplo, na Pat. Norte-Americana No. 5.939.598 por Kucherlapati e colaboradores. Anticorpos “humanos” ou “completamente humano” também incluem anticorpos compreendendo pelomenos o domínio variável de uma cadeia pesada, ou pelo menos os domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve, onde o(s) do-mínio(s) variável(is) tem (têm) a sequência aminoácida de domínio(s) variável(is) de imunoglobulina.

[049]Anticorpos “humano” ou “complementamente humano” também incluem anticorpos “humano” ou “completamente humano”, como descrito acima, que compreendem, consistem essencialmente de, ou consistem de, variantes (incluindo derivados) de moléculas de anticorpo (por exemplo, as regiões VH e/ou regiões VL) aqui descritas, cujos anticorpos ou fragmentos dos mesmos imunoespecificamente ligam a um polipeptídeo ou fragmento SEMA4D ou variante do mesmo. Técnicas padrões conhecidas por aqueles versados na técnica podem ser usadas para introduzir mutações na sequência nucleotídica codificando um anticorpo anti-SEMA4D humano, incluindo, mas não limitado a, mutagênese sítio-direcionada e mutagênese mediada por PCR que resulta em substituições aminoácidas. Em certos aspectos, os variantes (incluindo derivados) codificando menos que 50 substituições aminoácidas, menos que 40 substituições aminoácidas, menos que 30 substituições aminoácidas, menos que 25 substituições aminoácidas, menos que 20 substituições aminoácidas, menos que 15 substituições aminoácidas, menos que 10 substitiuções aminoácidas, menos que 5 substituições aminoácidas, menos que 4 substituições aminoácidas, menos que 3 substituições aminoácidas, ou menos que 2 substituições aminoácidas, relativas à reigão Vh de referência, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VL region, VLCDR1, VLCDR2, ou VLCDR3.

[050]Em certas modalidades, as substituições aminoácidas são substituições aminoácidas conservadas, discutidas ainda abaixo. Alternativamente, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente junto com toda ou parte da sequência codifican-te, tal como por saturação de mutagênese, e os mutantes resultantes podem ser selecionados para atividade biológica que retêm atividade (por exemplo, a habilidade de ligar ao polipeptídeo SEMA4D, por exemplo, SEMA4D humano, murinho, ou ambos, humano e murinho). Tais variantes (ou derivados dos mesmos) de anticorpos “humano” ou “completamente humano” podem também ser referidos como anticorpos humanos ou completamente humanos que são “otimizados” ou “otimizados para ligante de antígeno” e incluem anticorpos que têm afinidade melhorada ao antígeno.

[051]Os termos “anticorpo” ou “imunoglobulina” são usados de forma inter-cambiável aqui. Um anticorpo ou imunoglobulina compreende pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada, e normalmente compreende pelo menos os domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve. Estruturas de imunoglobulina básica em sistemas vertebrados são relativamente bem entendidas. Ver, por exemplo, Harlow e colaboradores. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press).

[052]Como aqui utilizado, o termo “imunoglobulina” compreende várias classes amplas de polipeptídeos que podem ser bioquimicamente distinguidos. Aqueles versados na técnica apreciarão que cadeias pesadas são classificadas como gam-ma, um, alpha, delta e épsilon (γ, μ, α, δ, ε) com algumas subclasses entre elas (por exemplo, γ1-γ4). É a natureza desta cadeia que determina a “classe” do anticorpo como IgG, IgM, IgA IgGou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 etc são bem caracterizadas e são conhecidas para conferir especialização funcional. Versões modificadas de cada dessas classes e isótopos são facilmente discerníveis ao versado na técnica na visão desta presente revelação e, consequentemente, estão dentro do objetivo desta revelação presente. Todas as classes de imunoglobulinas estão claramente dentro do objetivo da presente revelação, a seguinte discussão geralmente será direcionada a classe IgG de moléculas de imunoglobulina. Com relação a IgG, uma molécula de imunoglobulina padrão compreende dois polipeptídeos de cadeia leve idênticas de peso molecular de aproximadamente 23000 Daltons, e dois polipeptídeos de ca deia pesada idênticos de peso molecular 53000-70000. As quatro cadeias são tipicamente unidas por pontes dissulfeto em uma configuração “Y” em que as cadeias leves sustentam as cadeias pesadas começando na entrada do “Y” e continuando através da região variável.

[053]Cadeias leves são classificadas como ou kappa ou lambda ((κ, λ). Cada classe de cadeia pesada pode ser ligada com ou uma cadeia leve kappa ou lambda. Em geral, as cadeias leve ou pesada são covalentemente ligadas a cada outra, e as porções “terminais” das duas cadeias pesadas são ligadas a cada outra por ligações dissulfeto covalentes ou ligações não covalentes quando imunoglobuli-nas são geradas ou por hbridomas, células B ou células hospedeiras geneticamente construídas. Na cadeia pesada, as sequências aminoácidas correm de um N-terminal na terminação bifurcada da configuração Y para o terminal C no fundo de cada cadeia.

[054]Ambas as cadeias leve e pesada são divididas nas regiões de homolo-gia estrutural e funcional. Os termos “constante” e “variável” são usados funcionalmente. A este respeito, será apreciado que os domínios variáveis de ambas porções de cadeia leve (VL ou VK) e pesada (VH) determinam o reconhecimento e especificamente de antígeno. Por outro lado, os domínios constantes de cadeia leve (CL) e cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) conferem propriedades biológicas importantes tais como secreção, mobilidade transplacental, ligação ao receptor Fc, ligação ao complemento, e semelhantes. Por convenção a numeração dos domínios de região constante aumenta quando ela se torna mais distal do sítio de ligação de antígeno ou amino-terminal do anticorpo. A porção N-terminal é uma região variável e a porção C-terminal é uma região constante; os domínios CH3 e Cl na verdade compreende terminal carbóxi de cadeia pesada e leve, respectivamente.

[055]Como indicado acima, a região variável permite o anticorpo seletivamente reconhecer e especificamente ligar epítopo ou antígenos. Isto é, o domínio VL e domínio VH, ou subgrupo das regiões determinantes de complementariedade (CDRs) dentro desses domínios variáveis, de um anticorpo combinam para formar a região variável que define um sítio de ligação de antígeno tridimensional. Esta estrutura de anticorpo quaternária forma o sítio de ligação de antígeno presente no final de cada braço do Y. Mais especificamente, o sítio de ligação de antígeno é definido por três CDRs em cada das cadeias VH e VL. Em alguns exemplos, por exemplo, certas moléculas de imunoglobulinas derivadas de espécies camelídeas ou imuno-globulinas construídas baseadas em camelídeos, uma molécula de imunoglobulina completa pode consistir de cadeias pesadas somente, com nenhuma cadeia leve. Ver, por exemplo, Hamers-Casterman e colaboradores., Nature 363:446-448 (1993).

[056]Em anticorpos de ocorrência natural, a seis “regiões determinantes de complementariedade” ou “CDRs” apresentam em cada domínio ligador de antígeno são sequências curtas não contíguas de aminoácidos que são especificamente posicionados para formar o domínio ligador de antígeno como o anticorpo assume sua configuração tridimensional em um ambiente aquoso. O restante dos aminoácidos dos domínios ligadores de antígeno, referido como regiões “estruturais”, mostra menos variabilidade intermolecular. As regiões estruturais amplamente adotam uam conformação de folha β e os CDRs formam alças que conectan, e em alguns casos formam parte da estrutura de folha β. Então, regiões estruturais atuam para formar uma estrutura que provê para posicionar os CDRs na orientação correta por interações intercadeiras não cavalentes. O domínio ligador de antígeno pelos CDRs posicionados define uma complementariedade de superfície ao epítoo no antígeno imu-norreativo. Esta superfície complementar promove a ligação não covalente do anticorpo ao seu epítopo cognato. Os aminoácidos compreendendo os CDRs e as regiões estruturais, respectivamente, podem ser facilmente identificados para qualquer dado domínio variável de cadeia pesada ou leve por um versado na técnica, desde que eles tenham sido precisamente definidos (ver abaixo).

[057]No caso onde existam duas ou mais definições de um termo que é usado e/ou aceitos dentro da técnica, a definição do termo como aqui utilizado é tencio-nado incluir todos os significados a menos que explicitamente atestado em contrário. Um exemplos específico é o uso do termo “região determinante de complementarie-dade” (“CDR”) para descrever o antígeno não contiguo combinando sítios encontrados dentro da região variável de ambos polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Esta região particular tem sido descrita por Kabat e colaboradores. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" e por Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), que são aqui incorporadas por referência, onde as definições incluem sobreposição ou subgrupos de resíduos ami-noácidos quando comparados entre eles. Entretanto, aplicação de ou definição para referir a um CDR de um anticorpo ou variantes do mesmo é tencionado estar dentro do objetivo do termo como definido e aqui utilizado. Os resíduos apropriados que compreendem os CDRs como definido por cada das referências citadas acima são revelados abaixo na Tabela 1 como uma comparação. Os números de resíduo exatos que compreendem um CDR particular variarão dependendo da sequência e tamanho do CDR. Aqueles versados na técnica podem rotineiramente determinar quais resíduos compreendem uma CDR particular dada a sequência de aminoácido de região variável do anticorpo.

Tabela 1. Definições CDR1 1Numeração de todas as definições CDR na Tabela 1 é de acordo com as convenções de numeração reveladas por Kabat e colaboradores (ver abaixo).

[058]Kabat e colaboradores também definiu um sistema de numeração para sequências de domínio variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Um versado na técnica pode inequivocadamente atribuir este sistema de “numeração Kabat” a qualquer sequência de domínio variável, sem confira em qualquer dado experimental além de sua própria sequência. Como aqui utilizado, “numeração Kabat” refere-se ao sistema de numeração revelado por Kabat e colaboradores (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest." A menos que de outra forma especificado, referências à numeração das posições de resíduos aminoácidos específicos em um anticorpo anti-SEMA4D ou fragmento liga-dor de antígeno, variante ou derivado do mesmo da presente revelação estão de acordo com o sistema de numeração Kabat.

[059]Anticorpos ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes ou derivados dos mesmos da revelação incluem, mas não são limitados a, anticorpos policlonais, monoclonais, multiespecíficos, biespecíficos, humanos, humanizados, primatizados, ou quiméricos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos ligadores de epítopo, por exemplo, Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs, Fvs (scFv) de cadeia simples, Fvs (sdFv) ligado a dissulfeto, fragmentos compreendendo ou um domínio VL ou VH, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão Fab, e anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id para anticorpos anti-SEMA4D aqui revelados). Moléculas ScFv são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, na Pat. Norte-Americana No. 5.892.019. Moléculas de imunoglobulina ou anticorpo da revelação podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgD, IgA, e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2 etc), ou subclasse de molécula de imunoglobulina.

[060]Como aqui utilizado, o termo “porção de cadeia pesada” inclui sequências aminoácidas derivadas a partir de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Em certas modalidades, um polipeptídeo compreendendo uma porção de cadeia pesada compreende pelo menos um de: um domínio VH, um domínio CH1, um domínio da dobradiça (por exemplo, região da alça superior, média, e/ou inferior), um domínio CH2, um domínio CH3, ou um variante ou fragmento do mesmo. Por exemplo, um polipetpídeo ligante para uso na revelação pode compreende uma cadeia polipeptí-dica compreendendo um domínio CH1; uma cadeia polipeptídica compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça, e um domínio CH2; uma cadeia polipeptídica compreendendo um domínio CH1 e um domínio CH3; uma cadeia polipeptídica compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça, e um domínio CH3, ou uma cadeia polipeptídica compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma porção de um domínio de dobradiça, um domínio CH2, e um domínio CH3. Em outra modalidade, um polipep-tídeo da revelação compreende uma cadeia polipeptídica compreendendo um domínio CH3. Ainda, um polipeptídeo ligante para uso na revelação pode ter ausente pelo menos uma porção de um domínio CH2 (por exemplo, toda ou parte de um domínio CH2). Como revelado acima, será entendido por um versado na técnica que esses domínios (por exemplo, as porções de cadeia pesada) podem ser modificados tal que eles variam na sequência aminoácida a partir da molécula de imunoglobulina de ocorrência natural.

[061]Em certos anticorpos anti-SEMA4D, ou fragmentos ligadores de antíge-no, variantes ou derivados dos mesmos aqui revelados, as porções de cadeia pesada de uma cadeia polipeptídica de um multímero são idênticas àquelas em uma segunda cadeia polipeptídica do multímero. Alternativamente, monômeros contendo porção de cadeia pesada da revelação não são idênticos. Por exemplo, cada monômero pode compreender um sítio de ligação ao alvo diferente, formando, por exemplo, um anticorpo biespecífico. Um anticorpo biespecífico é uma proteína artificial que é composta de fragmentos de dois anticorpos monoclonais diferentes e consequentemente se liga a dois tipos diferentes de antígeno. Variações no formato de anticorpo biespecífico são contempladas dentro do objetivo da presente revelação. Anicorpos biespecíficos podem ser gerados usando técnicas que são bem conheci das, por exemplo, ver, Ghayur e colaboradores., Expert Review of Clinicai Pharmacology 3.4 (July 2010): p491; Lu e colaboradores., J. Biological Chemistry Vol. 280, No. 20, p. 19665-19672 (2005); Marvin e colaboradores., Acta Pharmacologic Sinica 26(6):649-658 (2005); e Milstein C e colaboradores., Nature 1983; 305: 537-40; 30 Brennan M e colaboradores., Science 1985; 229: 81-3; Thakur e colaboradores., Curr Opin Mol Ther. 2010 Jun;12(3):340-9; e Publicação de Patente Norte-Americana No. 2007/0004909.

[062]As porções de cadeia pesada de uma molécula ligante para uso nos métodos revelados aqui podem ser derivados a partir de diferentes moléculas de imunoglobulina. Por exemplo, uma porção de cadeia pesada de um polipeptídeo pode compreende um domínio CH1 derivado de uma molécula IgG1 e uma região de dobradiça derivada de uma molécula de IgG3. Em outro exemplo, uma porção de cadeia pesada pode compreender uma região deo dobradiça drivada, em parte, a partir de uma molécula IgG1 e, em parte, de uma molécula IgG3. Em outro exemplo, uma porção de cadeia pesada pode compreender uma dobradiça quimérica derivada, em parte, a partir de uma molécula de IgG1 e, em parte, a partir de uma molécula de IgG4.

[063]Como aqui utilizado, o termo “porção de cadeia leve” inclui sequências aminoácidas derivadas a partir de uma cadeia leve de imunoglobulina, por exemplo, uma cadeia leve kappa ou lambda. Em certos aspectos, a porção de cadeia leve compreende pelo menos um domínio VL ou CL.

[064]Anticorpos anti-SEMA4D, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, o derivados dos mesmos aui revelados podem ser descritos ou especificados em termos do(s) epítopo(s) ou porção(ões) de um antígeno, por exemplo, um poli-peptídeo alvo aqui revelado (por exemplo, SEMA4D) que ele reconhecem ou ligam especificamente. A porção de um polipeptídeo alvo que especificamente interage com o domínio ligador de antígeno de um anticorpo é um “epítopo” ou um “determi nante antigênico”. Um polipeptídeo alvo pode compreender um epítopo simples, mas tipicamente compreende pelo menos dois epítopo, e podem incluir qualquer número de epítopo, dependendo do tamanho, conformação, e tipo de antígeno. Além disso, deve ser notado que um “epítopo” em um polipeptídeo alvo pode ser ou pode incluir elementos não polipeptídicos, por exemplo, um epítopo pode incluir uma cadeia lateral de carboidrato.

[065]O tamanho mínimo de um peptídeo ou epítopo polipeptídico para um anticorpo é pensado ser cerca de quatro a cinco aminoácidos. Peptídeo ou epítopos polipeptídicos podem conter pelomenos sete, pelo nove e, em alguns casos, entre pelo menos cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos. Desde de que um CDR pode reconhecer um peptídeo ou polipeptídeo antigênico em sua forma terciária, os ami-noácidos compreendendo um epítopo não precisa ser contíguo, e em alguns casos, pode mesmo não ser na mesma cadeia peptídica. Um peptídeo ou epítopo polipep-tídico reconhecido por anticorpos anti-SEMA4D da presente revelação pode conter uma sequência de pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, ou entre cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos contíguos ou não contíguos de SEMA4D.

[066]Por “ligar especificamente” é geralmente significado que um anticorpo liga a um epítopo através de seu domínio ligadora de antígeno, e que a ligação acarreta alguma complementariedade entre o domínio ligador de antígeno e epítopo. De acordo com esta definição, um anticorpo é referido “especificamente ligar” a um epí-topo quando ele liga a este epítopo, via seu domínio ligador de antígeno mais facilmente que pode ligar a um epítopo aleatório não relacionado. O termo “especificidade” é aqui utilizado para qualificar a afinidade relativa pelo qual um certo anticorpo se liga a um certo epítopo. Por exemplo, anticorpo “A” pode ser considerado ter uma especificidade ou afinidade maior para um dado epítopo que anticorpo “B”, ou anti corpo “A” pode ser referido ligar ao epítopo “C” com uma especificidade ou afinidade maior que ele tem para o epítopo “D” relacionado.

[067]Por “ligar preferivelmente” é significado que o anticorpo liga especificamente a um epítopo mais facilmente que ele pode ligar a um epítopo relacionado, similar, homólogo ou análogo. Então, um anticorpo que “liga preferivelmente” a um dado epítopo pode mais provavelmente ligar aquele epítopo que a um epítopo relacionado, embora tal um anticorpo pode reagir cruzadamente com o epítopo relacionado.

[068]Por meio de exemplo não limitante, um anticorpo pode ser considerado ligar um primeiro epítopo preferivelmente se ele liga ao referido epítopo com uma constante de dissociação (KD) que é menos que o KD do anticorpo para o segundo epítopo. Em outro exemplo não limitante, um anticorpo pode ser considerado ligar um primeiro antígeno preferivelmente se ele liga ao primeiro epítopo com uma afinidade que é pelomenos uma ordem de magnitude menos que o KD do anticorpo para o segundo epítopo. Em outro exemplo não limitante, um anticorpo pode ser considerado ligar um primeiro epítopo preferivelmente se ele liga ao primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos duas ordens de magnitude menos que o KD do anticorpo para o segundo epítopo.

[069]Em outro exemplo não limitante, um anticorpo pode ser considerado ligar um primeiro epítopo preferivelmente se ele liga ao primeiro epítopo com uma off rate (k(off)) que é menos que o k(off) do anticorpo para o segundo epítopo. Em outro exemplo não limitante, um anticorpo pode ser considerado ligar um primeiro epítopo preferivelmente se ele liga ao primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos uma ordem de magnitude menos que o k(off) do anticorpo para o segundo epítopo. Em outro exemplo não limitante, um anticorpo pode ser considerado ligar um primeiro epítopo preferivelmente se ele liga ao primeiro epítopo com uma afinidade que é pelo menos duas ordens de magnitude menos que o k(off) do anticorpo para o se gundo epítopo.

[070]Um anticorpo é referido competitivamente inibir a ligação de um anticorpo de referência para um dado epítopo se ele preferivelmente liga aquele epítopo para a extensão que bloqueia, em algum grau, ligação do anticorpo referência ao epítopo. Inibição competitiva pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, ensaios competição por ELISA. Um anticorpo pode ser referido competitivamente ligar ao anticorpo de referência a um dado epítopo por pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, ou pelo menos 50%.

[071]Como aqui utilizado, o termo “afinidade” refere-se a uma medida da força de ligação de um epítopo individual com o CDR de uma molécula de imunoglobu-lina. Ver, por exemplo, Harlow e colaboradores. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed.) páginas 27-28. Como aqui utilizado, o termo “avidez” refere-se a estabilidade geral do complex entre uma população de imunoglobulinas e um antígeno, isto é, a força de combinação funcional de uma mistura de imunoglobulina com o antígeno. Ver, por exemplo, Harlow nas páginas 29-34. Avidez é relacionada a ambas, a afinidade de moléculas de imunoglobu-lina individual na população com epítopos específicos, e também as valências das imunoglobulinas e o antígeno. Por exemplo, a interação entre um anticorpo monoclonal bivalente e um antígeno com uma estrutura de epítopo altamente repetida, tal como um polímero, pode ser uma de alta avidez.

[072]Anticorpos anti-SEMA4D ou fragmentos ligadores de antígenos, variantes ou derivados dos memos da revelação podem também ser descritos ou especificados em termos de sua reatividade cruzada. Como aqui utilizado, o termo “reativi-dade cruzada” refere-se a habilidade de um anticorpo, específico para um antígeno, para reagir com um segundo antígeno; uma medida de relação entre duas diferentes substâncias antigênicas. Então, um anticorpo tem reatividade cruzada se ele liga a um epítopo outro que o um que induziu sua formação. O epítopo de reatividade cruzada geralmente contém muitas das mesmas características estruturais complementares como o epítopo induzido, e em alguns casos, pode realmente ajustar melhor que o original.

[073]Por exemplo, certos anticorpos têm o mesmo grau de reatividade cruzada, em que eles ligam a epítopos relacionados mas não idênticos, por exemplo, epítopos com pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55%, pelo menos 50% de identidade (como calculado usando métodos conhecidos na técnica e aqui descritos) a um epítopo de referência. Um anticorpo pode ser referido ter pouca ou nenhuma reatividade cruzada se não liga a epítopos com menos que 95%, menos que 90%, menos que 85%, menos que 80%, menos que 75%, menos que 70%, menos que 65%, menos que 60%, menos que 55%, e menos que 50% de identidade (como calculado usando métodos conhecidos na técnica e aqui descritos) a um epítopo referência. Um anticorpo pode ser considerado “altamente específico” para um certo epítopo, se ele não liga a qualquer outro análogo, ortólogo, ou homólogo deste epítopo.

[074]Moléculas ligante anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpos ou framentos ligadores de antígeno, variantes ou derivados dos mesmos da revelação podem também ser descritos ou especificados em termos dessa afinidade de ligação a um polipeptídeo da revelação, por exemplo, SEMA4D, por exemplo, SEMA4D humano, murinho, ou ambos, humano e murinho. Em certos aspectos, afinidades de ligação incluem aquelas com uma constante de dissociação ou Kd menor que 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, ou 10-15 M. Em certas a molécula ligante anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento ligador de antígeno do mesmo, da revelação liga SEMA4D humano com um um Kd de cerca de 5 x 10-9 a cerca de 6 x 10-9. Em outra modalidade, a molécula ligante anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento ligador de antígeno do mesmo da revelação liga SEMA4D murina com um Kd de cerca de 1 x 10-9 a cerca de 2 x 10-9.

[075]Como aqui utilizado, o termo “anticorpo quimérico” será mantido para significar qualquer anticorpo em que a região ou sítio imunorreativo é obtido ou derivado de uma primeira espécie e a região constante (que pode ser intacta, parcial ou modificada) é obtido a partir de uma segunda espécie. Em algumas modalidades a região ou sítio de ligação alvo será de uma fonte não humana (por exemplo, camun-dongo ou primata) e a região constante é humana.

[076]Como aqui utilizado, o termo “anticorpo construído” refere-e a um anticorpo em que o domínio variável em ou as cadeias pesadas ou leves ou ambas é alterada por pelo menos substituição parcial de um ou mais CDRs a partir de um anticorpo de especificidade conhecida e, se necessário, por substituição da região de estrutura parcial e mudança de sequência. Embora os CDRs possam ser derivados de um anticorpo de mesma classe ou mesmo subclasse como o anticorpo a partir do qual as regiões estruturais são derivadas, é previsto que os CDRs derivarão a partir de um anticorpo de classe diferente ou de um anticorpo a partir de uma espécie diferente. Um anticorpo construído em que um ou mais “doadores” CDRs a partir de um anticorpo não humano de especificidade conhecida é enxertado em uma região estrutural de cadeia pesada e leve humana é referido aqui como um “anticorpo humanizado”. Em certos aspectos não é necessário substituir todos os CDRs com os CDRs completos a partir de um domínio variável do doador para transferir a capacidade de ligação do antígeno de um domínio variável para outro. Preverivelmente, somente resíduos que são necessários para manter a atividade do sítio ligante contra o antígeno alvo podem ser transferidos.

[077]E ainda reconhecido que as regiões estruturais dentro do domínio variável em uma cadeia pesada ou leve, ou ambas, de um anticorpo humanizado podem compreender somente resíduos de origem humana, em cujo caso essas regiões estruturais do anticorpo humanizado são referidos como “regiões estruturais completamente humanas” (por exemplo, MAb VX15/2503, revelada na Publicação do Pedido de Patente Norte-Americano No. UA 2010/0285036 A1 como MAb 2503, aqui incorporado por referência em sua totalidade). Alternativamente, um ou mais resíduos da(s) região(ões) estrutural(is) do domínio variável doador pode(m) ser construído(s) dentro da posição correspondente da(s) região(ões) estrutural(is) humana(s) de um domínio variável em uma cadeia pesada e ou leve, ou ambas, de um anticorpo humanizado se necessário para manter ligação apropriada ou para aumentar ligação ao antígeno SEMA4D. Uma região estrutural humana que tem sido construída desta forma deve então compreender uma mistura de resíduos estruturais humanos e doadores, e é referido aqui como uma “região estrutural parcialmente humana”.

[078]Por exemplo, humanização de um anticorpo anti-SEMA4D pode ser essencialmente feita seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones e colaboradores., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann e colaboradores., Nature 332:323327 (1988); Verhoeyen e colaboradores., Science 239:1534-1536 (1988)), por substituir CDRs de roedores ou roedores mutantes ou sequências CDRs para as sequências correspondentes de um anticorpo anti-SEMA4D humano. Ver, também, Pat. Norte-Americana Nos. 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.859.205; aqui incorporadas por referência. O anticorpo anti-SEMA4D humanizado resultante pode compreender pelo menos um CDR roedor ou roedor mutante dentro das regiões estruturais completamente humanas do domínio variável da cadeia pesada e/ou leve do anticorpo humanizado. Em alguns exemplos, resíduos dentro das regiões estruturais de um ou mais domínios variáveis do anticorpo anti-SEMA4D humanizado são substituídos por resíduos não humanos (por exemplo, roedores) correspondentes (ver, por exemplo, Pat. Norte-Americana Nos. 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; e 6.180.370), em cujo caso o anticorpo anti-SEMA4D humanizado pode compreender regiões estruturais parcialmente humanas dentro do domínio variável da cadeia pesada e/ou leve. Métodos similares podem ser usados para humanização de um anticorpo anti-VEGF.

[079]Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para ainda definir o desempenho do anticorpo (por exemplo, para obter afinidade desejada). Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos dos CDRs correspondem aqueles de imunoglobuli-na não humana e todas ou substancialmente todas das regiões estruturais são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, ver Jones e colaboradores, Nature 331:522-525 (1986); Riech-mann e colaboradores., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992); aqui incorporado por referência. Consequentemente, tais anticorpos “humanizados” podem incluir anticoros em que menos substancialmente que um domínio variável humano intacto tem sido substituído pela sequência correspondente a partir de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos CDR e possivelmente alguns resíduos estruturais são substituído por resíduos a partir de sítios análogos em anticorpos roedores. Ver, por exemplo, Pat. Norte-Americana Nos. 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.859.205. Ver também Pat. Norte-Americana No. 6.180.370, e Publicação Internacional No. WO 01/27160, onde anticorpos humanizados e técnicas para produzir anticorpos humanizados tendo afinidade melhorada para um antígeno pré-determinado são revelados.

II. Descrição Polipeptídeo Alvo - SEMA4D

[080]Como aqui utilizado, os termos “semaforina-4D”, “SEMA4D”, e “polipeptídeo SEMA4D” são usados de forma intercambiável, como são “SEMA4D” e “Se-ma4D”. Em certas modalidades, SEMA4D é expresso na superfície de ou secretado por uma célula. Em outra modalidade, SEMA4D é ligado a membrana. Em outra modalidade, SEAM4D é solúvel, por exemplo, sSEMA4D. Em outra modalidade, SEAM4D pode incluir um SEMA4D de tamanho inteiro ou um fragmento do mesmo, ou um polipeptídeo variante SEMA4D, em que o fragmento de SEMA4D ou polipeptídeo variante SEMA4D retém algumas ou todas as propriedades funcionais do SEMA4D de tamanho inteiro.

[081]A proteína SEMA4D humana de tamanho inteiro é uma proteína trans-membranar homodimérica consistindo de duas cadeias polipeptídicas de 150 kDa. SEMA4D pertence a família semaforina dos receptores de superfície celular e é também referido como CD100. Ambos, SEMA4D/Sema4D humano e de camundon-go são proteoliticamente clivados a partir de sua forma transmembranar para gerar formas solúveis de 120 kDa, dando aumento a duas isoformas Sema4D (Kumano-goh e colaboradores., J. Cell Science 116(7):3464 (2003)). Semaforinas consistem de proteínas solúveis e ligadas a membrana que foram originalmente de definidas como fatores de guia axonal que desempenham um papel importante em estabelecer conexões precisas entre neurônios e seu alvo apropriado. Estruturalmente considerada uma semaforina classe IV, SEMA4D consiste de uma sequência sinal terminal seguida por um domínio “Sema” característico, que contém 17 resíduos cisteí-na conservados, um domínio tipo Ig, um trecho rivo em lisina, uma região transmem-branar hidrofóbica, e uma cauda citoplasmática.

[082]O polipeptídeo SEMA4D inclui uma sequência sinal de cerca de 13 aminoácidos seguido por um domínio semaforina de cerca de 512 aminoácidos, um domínio tipo imunoglobulina (tipo Ig) de cerca de 65 aminoácidos, um trecho rico em lisina de 104 aminoácidos, uma região transmembranar hidrofóbica de cerca de 19 aminoácidos, e uma cauda citoplasmática de 110 aminoácidos. Um sítio consenso para fosforilação de tirosina na cauda citoplasmática sustenta a associação predita de SEMA4D com uma tirosina quinase (Schlossman e colaboradores., Eds. (1995) Leucocyte Typing V (Oxford University Press, Oxford).

[083]SEMA4D é conhecido ter pelo menos três receptores funcionais, Plexi-na-B1, Plexina-B2 e CD72. Plexina-B1 é expressa em tecidos não linfoides e tem mostrado ser um receptor de alta afinidade (1 nM) para SEMA4D (Tamagnone e colaboradores., Cell 99:71-80 (1999)). Estimulação SEMA4D da sinalização de Plexina B1 tem sido mostrada induzir crescimento colapso de cone de neurônios, e para induzir processo de colapso de exntesão e apoptose de oligodendrócitos (Giraudon e colaboradores., J. Immunol. 172:1246-1255 (2004); Giraudon e colaboradores., Neu-roMolecular Med. 7:207-216 (2005)). Após ligação ao SEMA4D, sinalização de Ple-xina B1 medeia a inativação de R-Ras, levando a uma diminuição na ligação mediada por intgrina à matriz extracelular, bem como ativação de RhoA, levando ao colapso celular por reorganização do citoesqueleto. Ver, Kruger e colaboradores., Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6:789-800 (2005); Pasterkamp, TRENDS in Cell Biology 15:61-64 (2005)). Plexina-B2 tem uma afinidade intermediária para SEMA4D e um relato recente indica que PLXNB2 é expresso em queratinócitos e ativa células T γδ positivas para SEMA4D para contribuir para reparo epitelial (Witherden e colaboradores., Immunity. 2012 Aug 24;37(2):314-25).

[084]Em tecidos linfoides, CD72 é utilizado como um receptor SEMA4D de baixa afinidade (300 nM) (Kumanogoh e colaboradores., Immunity 13:621-631 (2000)). Células B e Células Apresentadoras de Antígeno (APC) expressam CD72, e anticorpos anti-CD72 têm muitos dos mesmos efeitos como sSEMA4D, tal como aumento de resposta de célula B induzido por CD40 e supressão de célula B de CD23. CD72 é pensado atuar como um regulador negativo de respostas de célula B por recrutamento de fosfatase tirosina SHP-1, que pode associar com muitos receptores inibitórios. Interação de SEMA4D com CD72 resulta na dissociação de SHP-1, e a perda deste sinal de ativação negativo. SEMA4D tem sido mostrado promover estímulo de célula T e agregação de célula B e sobrevivência in vitro. A adição das células expressando SEMA4D ou sSEMA4D aumenta proliferação de célula B induzida por CD40 e produção de imunoglobulina in vitro, e acelera respostas de anticorpos in vivo (Ishida e colaboradores., Inter. Immunol. 15:1027-1034 (2003); Kuma-nogoh e H. Kukutani, Trends in Immunol. 22:670-676 (2001)). sSEMA4D aumenta maturação induzida por CD40 de CDs, incluindo regulação positiva de moléculas co-estimulatórias e secreção aumentada de IL-12. Em adição, sSEMA4D pode inibir migração de célula imune, que pode ser revertida pela adição de bloqueio de anticorpos de camundongo anti-SEMA4D (Elhabazi e colaboradores., J. Immunol. 166:4341-4347 (2001); Delaire e colaboradores., J. Immunol. 166:4348-4354 (2001)).

[085]Sema4D é expresso em altos níveis nos órgãos linfoides, inclindo o baço, timo, e linfonodos, e órgãos não linfoides, tais como cérebro, coração e rim. Nos órgãos linfoides, Sema4D é abundamentemente expresso em células T em respou-so, mas somente fracamente expresso em células B e células apresentadoras de antígeno (APCs), tais como células dendrítica (CDs).

[086]Ativação celular aumenta a expressão de superfície de SEMA4D bem como a geração de SEMA4D solúvel (sSEMA4D). O padrão de expressão de SEMA4D sugere que ele desempenha um importante papel fisiológico bem como patológico no sistema imune. SEMA4D tem sido mostrado promover a ativação, agregação e sobrevivência de célula B; proliferação induzida por CD40 aumentada e produção de anticorpo; resposta de anticoro aumentada para antígenos dependente de célula T; proliferação de célula T aumentada; maturação de célula dendrítica au mentada e habilidadepara estimular células T; e é diretamente implicada na demieli-nação e degeneração axonal (Shi e colaboradores., Immunity 13:633-642 (2000); Kumanogoh e colaboradores., J Immunol 169:1175-1181 (2002); e Watanabe e colaboradores., J Immunol 167:4321-4328 (2001)).

[087]Camundongos SEMA4D nocaute (SEMA4D-/-) têm evidência adicional provida que SEMA4D desempenha um papel importante em ambas as respostas imunes humoral e celular. Não existem anormalidades conhecidas de tecidos não linfoides em camundongos SEMA4D-/-. Células dendrítica (CDs) a partir de camundongos SEMA4D-/- têm pobre habilidade aloestimulatória e mostram defeitos na expressão de moléculas co-estimulatórias, que podem ser resgatadas pela adição de sSEMA4D. Camundongos deficientes em SEMA4D (SEMA4D-/-) falham em desenvolver encefalomielite autoimune experimental induzida por peptídeo glicoproteína mielina oligodendrócito, por causa de células T específicas para glicoproteína mieli-na oligodendrócito são pobremente geradas em ausência de SEMA4D (Kumanogoh e colaboradores., J Immunol 169:1175-1181 (2002)). Uma quantidade significante de SEMA4D solúvel é também detectada no soto de camundongos MRL/lpr propensos a autoimunidade (modelo de doenças autoimunes sistêmicas tal como SLE), mas não em camundongos normais. Ainda, os níveis de sSEMA4D correlacionam com níveis de auto-anticorpos e aumentam com idade (Wang e colaboradores., Blood 97:3498-3504 (2001)). SEMA4D solúvel tem também sido mostrado acumular no fluido cérebro-espinhal e soro de pacientes com doença desmielinizante, e sSE-MA4D induz apoptose de precursores neurais pluripotentes humanos (células Dev), e ambos inibem processo de extensão e induzem apoptose de oligodendrócitos de rato in vitro (Giraudon e colaboradores., J Immunol 172(2):1246-1255 (2004)). Esta apoptose foi bloqueada por um anticorpo monoclonal anti-SEMA4D (MAb).

III. Anticorpos anti-SEMA4D

[088]Anticorpos que ligam SEMA4D têm sido descritos na técnica. Ver, por exexemplo, Publicação Norte-Americana Nos. 2008/0219971 A1, US 2010/0285036 A1, e US 2006/0233793 A1, Pedidos de Patente Internacional WO 93/14125, WO 2008/100995, e WO 2010/129917, e Herold e colaboradores., Int. Immunol. 7(1): 1-8 (1995), cada dos quais é aqui incorporado em sua totalidade por referência.

[089]A revelação geralmente relaciona-se a um método de inibir, atrasar, ou reduzir crescimento tumoral ou metástase em um paciente, por exemplo, um paciente com câncer humano, compreendendo administração de um anticorpo que especificamente liga a SEMA4D, ou um fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado do mesmo. Em certas modalidades, o anticorpo bloqueia a interação de SEMA4D com um ou mais desses receptores, por exemplo, Plexina-B1 e/ou Plexina-B2. Em certas modalidades as células cancerígenas expressam Plexina-B1 e/ou Plexina-B2. Anticorpos anti-SEMA4D tendo essas propriedades podem ser usados nos métodos aqui providos. Anticorpos que podem ser usados incluem, mas não são limitados a MAbs VX15/2503, 67, 76, 2282 e fragmentos ligadores de antígenos, variantes, ou derivados dos mesmos que são completamente descritos em US 2010/0285036 A1 e US 2008/0219971 A1. Anticorpos adicionais que podem ser usados nos métodos providos aqui incluem o anticorpo BD16 descrito em US 2006/0233793 A1 bem como fragmentos ligadores de antígenos, variantes, ou derivados dos mesmos; ou quaisquer de MAb 301, MAb 1893, MAb 657, MAb 1807, MAb 1656, MAb 1808, Mab 59, MAb 2191, MAb 2274, MAb 2275, MAb 2276, MAb 2277, MAb 2278, MAb 2279, MAb 2280, MAb 2281, MAb 2282, MAb 2283, MAb 2284, e MAb 2285, bem como quaisquer fragmentos, variantes ou derivados dos mesmos como descrito em US 2008/0219971 A1. Em certas modalidades um anticorpo anti-SEMA4D para uso nos métodos providos aqui ligam SEMA3D humano, murino, ou ambos, humano e muri-nho. Também úteis são anticorpos que ligam ao mesmo epítopo como dos anticorpos acima mencionados e/ou anticorpos que competitivamente inibem ligação ou atividade de quaisquer anticorpos acima mencionados.

[090]Em certas modalidades, um anticorpo anti-SEMA4d ou fragmento liga-dor de antígeno, variante ou derivado do mesmo útil nos métodos aqui providos tem uma sequência aminpoácida que tem pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, ou cerca de 95% de identidade de sequência para a sequência aminoácida para uma molécula de anticorpo anti-SEMA4D, por exemplo, aquelas descritas aqui. Em uma modalidade adicional, a molécula ligante divide pelo menos cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou 100% de identidade de sequência a um anticorpo referência.

[091]Em outra modalidade, um anticorpo anti-SEMA4D ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado do mesmo útil nos métodos providos aqui compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (domínio VH), onde pelo menos um dos CDRs do domínio VH tem uma sequência aminoácida que tem pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou idênticos a CDR1, CDR2 ou CDR3 das SEQ ID NO:9, 10, 25 ou 48.

[092]Em outra modalidade, um anticorpo anti-SEMA4D ou fragmento ligador de antígeno variante, ou derivado do mesmo útil nos métodos providos aqui compreendem, consistem essencialmente de, ou consistem de um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (domínio VH), onde pelo menos um dos CDRs do domínio VH tem uma sequência aminoácida que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou idêntico a SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, or SEQ ID NO: 28.

[093]Em outra modalidade, um anticorpo anti-SEMA4Dou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado do mesmo útil nos métodos aqui providos compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina (domínio VH), onde pelo menos um dos CDRs do domínio VH tem uma sequência aminoácida idêntica, exceto por 1,2, 3, 4, ou 5 substituições aminoácidas conservadas, para SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, ou SEQ ID NO: 28.

[094]Em outra modalidade, um anticorpo anti-SEMA4D ou fragamento liga-dor de antígeno, variante, ou derivado do mesmo útil nos métodos providos aqui compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um domínio VH que tem uma sequência aminoácida que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou 100% idêntica a SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:25 ou SEQ ID NO:48, em que um anticorpo anti-SEMA4D compreendendo o domínio VH codificado especificamente ou preferencialmente liga a SEMA4D.

[095]Em outra modalidade, um anticorpo anti-SEMA4D ou fragmento ligador de antígeno, variante ou derivado do mesmo útil nos métodos aqui providos compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (domínio VL), onde pelo menos um dos CDRs do domínio VL tem uma sequência aminoácida que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou idêntica a CDR1, CDR2, ou CDR3 da SEQ ID NO: 17, 18, 29 ou 47.

[096]Em outra modalidade, um anticorpo anti-SEMA4D ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado do mesmo útil nos métodos providos aqui compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um domínio variável de cadeia leve imunoglobulina (domínio VL), onde pelo menos um dos CDRs do domínio VL tem uma sequência aminoácida que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou idêntica a SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO: 31, ou SEQ ID NO:32.

[097]Em outra modalidade, um anticorpo anti-SEMA4D ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado útil do mesmo nos métodos providos aqui compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina (domínio VL), onde pelo menos um dos CDRs do domínio VL tem uma sequência aminoácida idêntica, exceto por 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições aminoácidas conservadas para SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO: 31, ou SEQ ID NO:32.

[098]Em uma modalidade adicional, um anticorpo anti-SEMA4D ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado do mesmo útil nos métodos aqui compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de um domínio VL que tem uma sequência aminoácida que é pelo menos cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%m cerca de 92%m cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerc ade 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou 100% idêntico a SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:29, ou SEQ ID NO:47, em que um anticorpo anti-SEMA4D compreende o domínio VL codificado especificamente ou preferivelmente liga a SEMA4D.

[099]Também incluso para uso nos métodos aqui providos são polipeptídeos codificando anticorpos anti-SEMA4D, ou fragmentos ligadores do antígeno, verian-tes, ou derivados dos mesmos como descrito aqui, polinucleotídeos codificando tais polipeptídeos, vetores compreendendo tais polinucleotídeos, e céllas hospedeiras compreendendo tais vetores ou polinucleotídeos, todos para produzir anticorpos an-ti-SEMA4D, ou fragmentos ligadoras de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos para uso nos métodos aqui descritos.

[0100]Variantes biologicamente ativos adequados dos anticorpos anti-SEMA4D da revelação podem ser usados nos métodos para a presente revelação. Tais variantes reterão as propriedades ligadoras desejadas do anticorpo anti- SEMA4D parental. Métodos para fazer anticorpos variantes são geralmente disponíveis na técnica.

[0101]Métodos para alterações de mutagênese e sequência nucleotídica são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nova Iorque); Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985); Kunkel e colaboradores., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987); Sambrook e colaboradores. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.I.); Pat. Norte-Americana No. 4.873.192; e as referências citadas nas mesmas; aqui incorporados por referência. Guia para substituições aminoácidas apropriado que não afeta atividade biológica do polipeptídeo de interesse pode ser encontrado no modelo de Dayhoff e colaboradores. (1978) em Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), pp. 345-352, aqui incorporado por referência em sua totalidade. O modelo de Dayhoff e colaboradores. Usa a matriz de similaridade amino-ácida de Ponto de Mutação Aceita (PAM) (matriz PAM 250) para determinar substituições aminoácidas conservadas adequadas. Em certos aspectos, substituições conservadas, tal como troca de um aminoácido com outro tendo propriedades siimla-res são usadas. Exemplos de substituições aminoácidas conservadas como ensinado pela matriz PAM 250 do modelo Dayhoff e colaboradores, incluem, mas não são limitadas a, Gly^Ala, Val^Ile^Leu, Asp^Glu, Lys^Arg, Asn^Gln, e Phe^Trp^Tyr.

[0102]Em construções variantes da molécula ligadora anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento ligador de antígeno do mesmo, polipeptídeos de interesse, modificações são feitas tal que variantes continuem possuindo as propriedades desejadas, por exemplo, sendo capazes de especificamente ligar a um SEMA4D, por exemplo, SEMA4D humano, murinho, ou ambos, humano e murinho, por exemplo, expresso na superfície de ou secretado por uma célula e tendo ativida de bloqueadora de SEMA4D, como aqui descrito. Em certos aspectos, mutações feitas no DNA codificando o polipeptídeo variante mantém a estrutura de leitura e não cria regiões complementares que podem produzir estrutura mRNA secundária. Ver Publicação do Pedido de Patente EP No. 75.444.

[0103]Métodos para medir molécula ligadora anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento ligador de anticorpo, variante, ou derivado do mesmo, especificidade de ligação inclui, mas não é limitado a, ensaios de ligação competitiva padrão, ensaios para monitorar secreção de imunoglobulina por células T ou células B, ensaios de proliferação de célula T, ensaio de apoptose, ensaio ELISA, e semelhantes. Ver, por exemplo, tais ensaios revelados em WO 93/14125; Shi e colaboradores., Immunity 13:633-642 (2000); Kumanogoh e colaboradores., J Immunol 169:1175-1181 (2002); Watanabe e colaboradores., J Immunol 167:4321-4328 (2001); Wang e colaboradores., Blood 97:3498-3504 (2001); and Giraudon e colaboradores., J Immunol 172(2):1246-1255 (2004), todos as quais são aqui incorporadas por referências.

[0104]Métodos para medir a habilidade anti-angiogênica de um anticorpo an-ti-SEMA4D ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado do mesmo são bem conhecidos na técnica.

[0105]Quando aqui discutido se qualquer polipeptídeo particular, incluindo as regiões constantes, CDRs, domínios VH, ou domínios VL aqui revelado, é pelo menos cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, ou mesmo cerca de 100% idêntico a outro polipeptídeo, a % de identidade pode ser determinada usando métodos e programas/software de computador conhecidos na técnica tais como, mas não limitados a, programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Scien- ce Drive, Madison, Wis. 53711).BESTFIT usa o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489, para encontrar o melhor segmento de homologia entre duas sequências. Quando usando BESTFIT ou qualquer outro programa de alinhamento de sequência para determinar se uma sequência particular é, por exemplo, 95% idêntico a uma sequência referência de acordo com a presente revelação, ao parâmetros são ajustados, claro, tal que a percentagem de identidade é calculada pelo comprimento inteiro da sequência polipeptídica de referência e as lacunas na homologia de até 5% do número total de aminoácidos na sequência referência são permitidas.

[0106]Para propósito da presente revelação, percentagem de identidade de sequência pode ser determinada usando o algoritmo de pesquisa de homologia Smith-Waterman usando uma pesquisa de lacuna afim com um penalidade de lacuna aberta de 12 e uma penalidade de extensão de lacuna de 2, matriz BLOSUM de 62. O algoritmo de pesquisa de homologia Smith-Waterman é ensinado em Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489. Um variante pode, por exemplo, diferir de um anticorpo anti-SEMA4D de referência (por exemplo, MAb VX15/2503, 67, 76, ou 2282) por tão poucos quanto 1 a 15 resíduos aminoácidos, tão poucos como 1 a 10 resíduos aminoácidos, tais como 6-10, tão poucos como 5, tão poucos como 4, 3, 2 ou mesmo 1 resíduo aminoácido.

[0107]A região constante de anticorpo anti-SEMA4D pode ser mutado para alterar função efetora em um número de formas. Por exemplo, ver Pat. Norte-Americana No. 6.737.056B1 e Publicação do Pedido de Patente Norte-Americano No. 2004/013210A1, que revela mutações Fc que otimizam ligação de anticorpo para receptores Fc.

[0108]Em certos anticorpos ou fragmentos anti-SEMA4D, variantes ou derivados dos mesmos úteis nos métodos providos aqui, a porção Fc pode ser mutada para diminuir a função efetora usando técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, a deleção ou inativação (através dos pontos de mutações ou outros meios) de um domínio de região constante pode reduzir ligação ao receptor Fc do anticorpo modificado circulante desse modo aumentando a localização do tumor. Em outros casos, modificações da região constante consistente com a ligação do complemento moderada da presente revelação e então redução da meia vida sérica. Ainda outras modificações da região constante podem ser usadas para modificar ligações dissulfetos ou frações oligossacarídicas que permitem para localização aumentada devido a especificidade antigênica aumentada ou flexibilidade de anticorpo. O perfil fisiológico resultante, biodisponibilidade e outros efeitos bioquímicos das modificações, tal como localização do tumor, biodistribuição e meia vida sérica, pode facilmente ser medido e quantificado usando técnicas imunológicas bem conhecidas sem experimentação indevida.

[0109]Anticorpos anti-SEMA4D para uso nos métodos aqui provido incluem derivados que são modificados, por exemplo, por ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo tal que ligação covalente não previne o anticorpo a partir de ligação específica ao seu epítopo cognato. Por exemplo, mas não por meio de limitação, os derivados de anticorpos incluem anticorpos que têm sido modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivação por grupos protetores/bloqueadores, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outra proteína etc. Quaisquer das numerosas modificações químicas podem ser realizadas por técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitados para cliva-gem química específica, acetilação, formilação etc. Adicionalmente, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos.

[0110]Uma “substituição aminoácida conservada” é uma em que o resíduo aminoácido é substituído com um resíduo aminoácido tendo uma cadeia lateral com uma carga similar. Famílias de resíduos aminoácidos tendo cadeias laterais com cargas similares têm sido definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutaminia, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina), e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Alternativamente, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente junto com toda ou parte da sequência codifi-cante, tal como por saturação de mutagênese, e os mutantes resultantes podem ser selecionados para atividade biológica para identificar mutantes que retêm atividade (por exemplo, a habilidade de ligar um polipeptídeo anti-SEMA4D, para bloquear interação SEMA4D com seu receptor, ou para inibir, atrasar, ou reduzir metástases em um paciente, por exemplo, um paciente com câncer).

[0111]Por exemplo, é possível introduzir mutações somente nas regiões estruturais ou somente nas regiões CDR de uma molécula de anticorpo. Mutações introduzidas podem ser mutações com troca de sentido silenciosas ou neutras, isto é, não ter, ou ter pouco efeito de uma habilidade do anticorpo para ligar antígeno. Esses tipos de mutações podem ser úteis para otimizar o códon de uso, ou melhorar uma produção de anticorpo do hibridoma. Alternativamente, mutações com trocas de sentido não neutras podem alterar uma habilidade do anticorpo em ligar ao antígeno. Um versado na técnica pode ser capaz de desenhar e testar moléculas mutantes com propriedades desejadas tais como nenhuma alteração na atividade ligadora do antígeno ou alteração na atividade ligadora (por exemplo, melhoramentos na atividade ligadora de antígeno ou mudança na especificidade do anticorpo). Seguindo mutagênese, a proteína codificada pode rotineiramente ser expressa e a atividade funcional e/ou biológica da proteína codificada (por exemplo, habilidade de ligar imunoespecificamente pelomenos um epítopo de um polipeptídeo SEMA4D) pode ser determinada usando técnicas descritas aqui ou por rotineiramente modificar técnicas conhecidas na arte.

[0112]Em certas modalidades, os anticorpos anti-SEMA4D para uso nos métodos providos aqui compreendem pelomenos uma região determinante de complementariedade (CDR) otimizada. Por “CDR otimizado” é tencionado que o CDR tem sido modificado e otimizado para melhorar a afinidade de ligação e/ou atividade anti-SEMA4D que é impedida para umanticorpo anti-SEMA4D compreendendo o CDR otimizado. “Atividade anti-SEMA4D” ou “atividade bloqueadora de SEMA4D” pode incluir atividade que modula uma oumais das seguintes atividades associadas com SEMA4D: ativação, agregação e sobrevivência de célula B; proliferação induzida por CD40 e produção de anticorpo; resposta de anticorpo à antígenos dependentes de célula T; proliferação celular de célula T ou outra célula imune; maturação de célula dendrítica; desmielinação e degeneração axonal; apoptose de precursores neurais pluripotentes e/ou oligodendrócitos; indução de migração celular endotelial; inibição de migração de monócito espontâneo; inibição, atraso, ou redução de crescimento de célula tumoral ou metástase, ligação da plexina B1 de superfície celular ou outro receptor, ou qualquer outra atividade de associação com SEMA4D solúvel ou SEMA4D que é expressa na superfície de células SEMA4D+. Em uma modalidade particular, atividade anti-SEMA4D inclui a habilidade de inibir, atrasar, ou reduzir me-tástases tumorais, ou em combinação com inibição, atraso, ou redução de crescimento de célula tumoral primária e metástases tumorais, ou independentemente de crescimento de célula tumoral primária e metástase tumoral. Atividade anti-SEMA4D pode também ser atribuída a uma diminuição na incidência ou severidade de doenças associadas com expressão SEMA4D, incluindo, mas não limitado a, certos tipos de cânceres incluindo linfomas, doenças autoimunes, doenças inflamatórias incluindo doenças inflamatórias do sistema nervoso central (SNC) e sistema nervoso peri-féfico (SNP), e angiogênese invasiva. Exemplos de anticorpos otimizados baseados no MAb BD16 anti-SEMA4D foram descritos na Pub. Norte-Americana No. 2008/0219971 A1, Pedido de Patente Interncional WO 93/14125 e Herold e colaboradores., Int. Immunol. 7(1): 1-8 (1995), cada das quais são aqui incorporadas por referência em sua totalidade. As modificações podem envolver substituição de resíduos aminoácidos dentro do CDR tal que um anticorpo anti-SEMA4D retém especificidade para o antígeno SEMA4D e tem afinidade de ligação melhorada e/ou atividade anti-SEMA4D melhorada.

IV. Características de Ligação dos Anticorpos anti-SEMA4D

[0113]Em certas modalidades a molécula ligante é um anticorpo que especificamente liga ao SEMA4D, ou um fragmento ligador do antígeno, variante, ou derivado do mesmo. Em certas modalidades, a molécula ligadora liga a um epítopo de SEMA4D. O nucleotídeo e sequências aminoácidas para um variante de SEMA4D são reveladas na SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14, respectivamente, e para outro variante de SEMA4D são reveladas na SEQ ID NO:15 e SEQ ID NO:16. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-SEMA4D designado como VX15/2503 é provido. Anticorpos que têm as características de ligação do anticorpo VX15/2503 são também revelados aqui. Tais anticorpos incluem, mas não são limitados a, anticorpos que competem em ensaios de ligação de competitividade com VX15/2503, bem como anticorpos que ligam a um epítopo (como definido abaixo) capazes de ligar VX15/2503. Métodos para avaliar se anticorpos têm as mesmas ou similares características de ligação incluem métodos quatitativos tradicionais tais como, por exemplo, determinando e comparando afinidade ou avidez de anticorpo para o epítopo antigênico (por exemplo, peptídeo SEMA4D). Outros métodos exemplares para comparar as características de ligação de anticorpos incluem western blotting competitivo, imunoensaios enzimáticos, ELISA, e citometria de fluxo. Métodos para avaliar e comparar características de ligação anticorpo-antígeno são bem conhecidos na técnica. Variantes e fragmentos de VX15/2503 que retêm a habilidade de especifi camente ligar ao SEMA4D são também providos. Anticorpos VX15/2503 e 67 dividem os mesmos 6 CDRs e ligam ao mesmo epítopo SEMA4D.

[0114]Em algumas modalidades, anticorpos anti-SEMA4D, ou fragmentos li-gadores de antígeno, variantes ou derivados dos mesmos aqui revelados podem ser descritos ou especificados em termos do(s) epítopo(s) ou porção (ões) de um antí-geno, por exemplo, um polipeptídeo alvo aqui revelado (por exemplo, SEMA4D) que eles reconhecem ou ligam especificamente. A porção de um polipeptídeo alvo que especificamente interage com o domínio ligador de antígeno de um anticorpo é um “epítopo”, ou um “determinante antigênico”.

[0115]Em algumas modalidades, um “epítopo” é tencionado ser parte de uma molécula antigênica que é usado para produzir um anticorpo e/ou que um anticorpo ligará especificamente. Um epítopo “SEMA4D” compreende a parte da proteína SEMA4D ao qual um anticorpo anti-SEMA4D liga. Epítopos podem compreender resíduos aminoácidos lineares (isto é, resíduos dentro do epítopo que são arranjados sequencialmente uma após outra em uma forma linear), resíduos aminoácidos não lineares (referidos aqui como “epítopos não lineares” ou “epítopos conformacio-nais”, esses epítopos não são arranjados sequencialmente), ou ambos resíduos aminoácidos lineares ou não lineares. Epítopos não lineares ou epítopos conforma-cionais podem também incluir resíduos aminoácidos que contribuem para a conformação geral da estrutura de reconhecimento do anticorpo. Tipicamente, epítopos sequências aminoácidas curtas, por exemplo, cerca de cinco aminoácidos em comprimentos. Técnicas sistemáticas para identificar epítopos são conhecidas na arte e são descritas, por exemplo, nos exemplos revelados abaixo.

[0116]Um polipeptídeo alvo pode compreender um epítopo único, mas tipicamente compreende pelo menos dois epítopos, e pode incluir qualquer número de epítopos, dependendo do tamanho, conformação, e tipo de antígeno. Além disso, deve ser notado que um “epítopo” em um polipeptídeo alvo pode ser ou pode incluir elementos não polipeptídicos, por exemplo, um epítopo pode incluir uma cadeia lateral carboidrato.

[0117]O tamanho mínimo de um peptídeo ou epítopo polipeptídico para um anticorpo é pensado ser cerca de quatro a cinco aminoácidos. Peptídeo ou epítopos polipeptídicos podem conter pelo menos sete, pelo menos nove, ou pelo menos cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos. Desde que um CDR pode reconhecer um pep-tídeo ou polipeptídeo antigênico em sua forma terciária, os aminoácidos compreendendo um epítopo não precisam ser contíguos, e alguns casos, podem mesmo não ser na mesma cadeia peptídica. Um peptídeo ou epítopo polipeptídico reconhecido por anticorpos anti-SEMA4D da presente revelação podem conter uma sequência de pelo menos 4, pelo menos 4, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo m enos 25, ou entre cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos contíguos ou não contíguos de SEMA4D.

[0118]Em algumas modalidades, o epítopo tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de identidade a uma sequência aminoácida polipeptídica alvo (por exemplo, a sequência revelada na SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44 ou SEQ ID NO:46).

[0119]Em algumas modalidades, o epítopo é idêntico a uma sequência ami-noácida polipeptídica alvo (por exemplo, a sequência revelada na SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, ou SEQ ID NO:46) exceto 4, 3, 2, 1 ou 0 substituições aminoácidas. Em outra modalidade, o epítopo é idêntico a uma sequência aminoácida polipeptídi-ca alvo (por exemplo, a sequência revelada em SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, ou SEQ ID NO:46) exceto para substituições aminoácidas conservadas (por exemplo, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0 substituições aminoácidas conservadas).

[0120]Em algumas modalidades, o epítoo compreende uma sequência revelada na SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, ou SEQ ID NO:46. Em outra modalidade, o epítopo é a sequência revelada na SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, ou SEQ ID NO:46. Em algumas modalidades, o epítopo é um epítopo linear. Em algumas modalidades, o epítopo é um epítopo conformacional.

[0121]Em algumas modalidades, o epítopo compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de LKVPVFYALFTPQLNNV (SEQ ID NO: 42, correspondendo a resíduos 304 a 320 da sequência SEMA4D de comprimento inteiro revelado em SEQ ID NO:1), KWTSFLKARLIASRP (SEQ ID NO: 44, correspondendo a resíduos 270 a 284 da sequência aminoácida SEMA4D de comprimento inteiro revelada na SEQ ID NO:1, em que posição 281 pode ser uma cisteína ou uma alanina), ou EFVFRVLIPRIARV (SEQ ID NO:46; correspondendo a resíduos 243 a 256 da sequência aminoácida SEMA4D de comprimento inteiro revelada na SEQ ID NO:1). Em algumas modalidades, o epítopo compreende uma ou mais das sequências ami-noácidas reveladas na SEQ ID NO:42, 44 e 46. Em algumas modalidades, o epítopo é um epítopo descontínuo compreendido nos resíduos aminoácidos abrangendo domínio 243 a 320 de SEQ ID NO:1. V. Métodos de Tratamento Usando Anticorpos Anti-SEMA4D Terapêuticos Como Um Agente Único Ou Em Combinação Com Pelo Menos Uma Terapia Imu-nomoduladora [0122]Métodos da revelação são direcionados ao uso de moléculas ligadoras anti-SEMA4d ou anti-Plexina-B1, por exemplo, anticorpos, incluindo fragmentos liga-dores de antígeno, variantes, de derivados dos mesmos, ou como agentes únicos ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora, para inibir, atrasar, ou reduzir crescimento tumoral ou metástase em um paciente em necessidade de tal inibição, atraso, ou redução, por exemplo, um paciente com câncer. Em certas modalidades as células de câncer expressam um receptor SEMA4D, em certas modalidades o receptor é Plexina-B1. Embora a seguinte discussão refere-se a administração de um anticorpo anti-SEMA4D, os métodos aqui descritos são igualmente aplicáveis para os fragmentos ligadores de antígeno, variantes, e derivados desses anticorpos que retêm as propriedades desejadas dos anticorpos da revelação, por exemplo, capaz de especificamente ligar SEMA4D, por exemplo, SEMA4D humano, de camundongo, ou humano e camundongo, tendo atividade neutralizante de SEMA4D, e/ou bloqueando a interação de SEMA4D com seus receptores. Os métodos aqui descritos são também aplicáveis a outros produtos biológicos ou drogas de pequenas moléculas que retêm as propriedades desejadas dos anticorpos da revelação, por exemplo, capazes de especificamente ligar SEMA4D, por exemplo, SEMA4D humano, de camundongo, ou de humano e camundongo, tendo atividade neutralizante de SEMA4D, e/ou bloqueando a interação de SEMA4D com seus receptores.

[0123]Em uma modalidade, moléculas anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpos, incluindo fragmentos ligadores de antígeno, variantes, e derivados dos mesmos, podem ser usados como um agente único para inibir, atrasar, ou reduzir crescimento tumoral em um paciente em necessidade de tal inibição, atraso, ou redução, por exemplo, um paciente com câncer. Em certas modalidades, as células de câncer expressam um receptor SEMA4D, tal como, por exemplo, Plexina-B1 ou Plexina-B2. Em outras modalidades, as células cancerígenas expressam outros receptores que podem trabalhar em conjunto com um receptor SEMA4D. Um exemplo de tal um receptor é HER2 (ErbB2). Exemplos de cânceres em cuja expressão da Plexina-B1 ou Plexina-B2 em combinação com Her2 tem sido observado incluir câncer pulmonar, câncer de mama, câncer de próstata, e câncer de ovário. Tal como, em certas modalidades moléculas anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpos, incluindo fragmentos liga-dores de antígeno, variantes, e derivados dos mesmos, podem ser usados como um agente único para inibir, atrasar, ou reduzir o crescimento tumoral em um paciente tendo câncer pulmonar, câncer de mama, câncer de próstata, ou câncer de ovário.

[0124]Em uma modalidade, a terapia imunomoduladora pode incluir vacinas de câncer, agentes imunoestimulatórios, terapia de célula T adotiva ou anticorpo, e inibidores de bloqueio de ponto de checagem imune (Lizée e colaboradores. 2013. Harnessing the Power of the Immune System to Target Cancer. Annu. Rev. Med. Vol. 64 No. 71-90).

[0125]Vacinas de câncer. Vacinas de câncer ativam o sistema imune corpó-reo e resistência natural a uma célula anormal, tal como câncer, resultando em erradicação ou controle de doença. Vacinas de câncer geralmente consistem de um an-tígeno tumoral em uma formulação imunogênica que ativa células auxiliares específicas para antígeno tumoral e/ou células CTLs e B. Vacinas podem ser em uma variedade de formulações, incluindo, mas não limitados a, células dendrítica, especialmente células dendrítica autólogas pulsadas com células tumorais ou antígenos tu-morais, células tumorais heterólogas transfectadas com um agente imunoestimulan-te, tal como GM-CSF, vírus recombinante, ou proteínas ou peptídeos que são usualmente administradas com um adjuvante imune potente tal como CpG.

[0126]Agentes Imunoestimulatórias. Agentes imunoestimulatórios atuam para melhorar ou aumentar a resposta imune aos tumores, que é suprimida em muitos pacientes de câncer através de vários mecanismos. Terapias imunomoduladora podem ter como algo linfócitos, macrófagos, células dendrítica, células matadoras naturais (célula NK), ou subgrupos dessas células tais como linfócitos T citotóxicos (CTL) ou células T matadoras naturais (NKT). Por causa da interação de cascatas imunes, um efeito de um grupo de células imunes sempre aplificarão pelo espalhamento de outras células, por exemplo, atividade de célula apresentadora de antígeno aumentada promove resposta de linfócitos T e B. Exemplos de agentes imunoestimulatórios incluem, mas não são limitados a, HER2, citocinas tais como G-CSF, GM-CSF e IL-2, frações de membrana celular a partir de bactéria, glicolipídeos que associam com CD1d para ativar células T matadoras naturais (NKT), oligonucleotídeos CpG.

[0127]Macrófagos, células mielofagocíticas do sistema imune, são uma parte fundamental de mecanismos de defesa inata, que podem promover imunidade es pecífica por induzir recrutamento e ativação de célula T. A despeito disto, sua presença dentro do ambiente tumoral tem sido associado com progressão de tumor aumentada e mostrada para promover crescimento e dispersão de célula de câncer, angiogênese e imunossupressão. Participantes chaves no ajuste do seu fenótipo são os sinais do microambiente aos quais os macrófagos são expostos, que seletivamente afinam suas funções dentro de um espectro funcional compreendendo os extremos M1 (macrófagos inibindo tumor) e M2 (macrófago promotor de tumor). Sica e colaboradores., Seminars in Cancer Biol. 18:349-355 (2008). Números de macró-fagos aumentados durante câncer geralmente correlaciona com prognóstico pobre (Qualls and Murray, Curr. Topics in Develop. Biol. 94:309-328 (2011)). Dos múltiplos tipos de células estromais únicas comuns para tumores sólidos, macrófagos associados com tumor (TAMs) são significados para estimular progressão tumoral. Vias moleculares alvos regulando polarização TAM possuem ótima promessa para terapia anticâncer. Ruffell e colaboradores., Trends in Immunol. 33:119-126 (2012).

[0128] Transferência de Célula Adotiva. Transferência de célula adotiva pode empregar respostas citotóxicas baseadas e célula T para atacar células cancerígenas. Células T autólogas que têm uma reatividade natural ou geneticamente construída a um câncer de paciente são geradas e expandidas in vitro e então transferidas novamente no paciente com câncer. Um estudo demonstrou que transferência adotiva de linfócitos infiltrantes de tumor autólogos expandidos in vitro foi um tratamento efetivo para pacientes com melanoma metastático. (Rosenberg SA, Restifo NP, Yang JC, Morgan RA, Dudley ME (April 2008). "Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy". Nat. Rev. Cancer 8 (4): 299-308). Isto pode ser alcançado por tomar células T que são encontradas dentro do tumor ressecado do paciente. Essas células T são referidas como linfócitos infiltrantes de tumor (TIL) e são presumidas ter traficado ao tumor por causa de sua especificidade para antíge-nos tumorais. Tais células T podem ser induzidas para multiplicar in vitro usando altas concentrações de células alimentadoras IL-2, anti-CD3 e aloreativa. Essas células T são então transferidas novamente no paciente junto com administração exó-gena de IL-2 para ainda desafiar sua atividade anti-câncer. Em outros estudos, células T autólogas têm sido transduzidas com um receptor antigênico quimérico que levam a mesma reagir a um antígeno tumoral alvo (Liddy e colaboradores., Nature Med. 18:980-7, (2012); Grupp e colaboradores., New England J. Med. 368:1509-18, (2013)).

[0129]Outra terapia de transferência de célula adotiva emprega células den-drítica autólogas expostas a antígenos tumorais naturais ou modificados ex vivo que são re-infundidos no paciente. Provenge é tal que uma terapia aprovada pelo FDA em que céulas autólogas são incubadas com uma proteína de fusão de fosfatase ácida prostática e GM-CSF para tratar pacientes com tumores de próstata. GM-CSF é pensado promover a diferenciação e atividade de células dendrítica apresentadoras de antígeno (Small e colaboradores., J. Clin. Oncol. 18: 3894-903(2000); US Patent 7,414,108)).

[0130]Bloqueio do Ponto de Checagem Imune: Terapias de bloqueio do ponto de checagem imune aumentam a imunidade de célula T por remoção de um controle de feedback negativo que limita respostas imunes contínuas. Esses tipos de terapias com alvo em vias inibitórias no sistema imune que são cruciais para modular a duração e amplitude de respostas imunes fisiológicas em tecidos periféricos (anti-CTLA4) ou em tecido tumoral expressando PD-L1 (anti-PD1 ou anti-PD-L1) a fim de minimizar dano colateral do tecido. Tumores podem evoluir para explorar certas vias de ponto de checagem imune como um mecanismo principal de resistência imune contra células T que são específicas para antígenos tumorais. Desde que muitos pontos de checagem imune são iniciadas por interações ligante-receptor, esses pontos de checagem podem ser bloqueados por anticorpos para ou receptor ou ligante ou podem ser modulados por formas recombinantes solúveis dos ligantes ou receptores. Neutralização de pontos de checagem imune permitem células T espefí-ficas para tumor para continuar a funcionar de outra forma no microambiente tumoral imunossupressor. Exemplos de terapias de bloqueio de ponto de checagem imune são aqueles que têm alvo antígeno associado a linfócito T citotóxico 4 (CTLA-4), PD-1, seu ligante PD-L1, LAG3 e B7-H3.

[0131]Ciclofosfamida. Ciclofosfamida, um agente quimioterapêutico comu-mente usado, pode aumentar respostas imunes. Ciclofosfamidas diferentemente suprimem a função de células T reguladoras (T regs) relativas às células T efetoras. T regs são importantes na regulação de respostas imunes anticâncer. T regs infiltran-tes de tumor têm previamente sido associadas com prognóstico pobre. Enquanto agentes que tem como alvo T regs especificamente são correntemente indisponíveis, ciclofosfamida tem emergido como um agente viável clinicamente que pode preferivelmente suprimir T regs relativas a outras células T e, assim, permitir mais indução efetiva de respostas imunes antitumor.

[0132]Outras Terapias Imunomoduladoras: Em outra modalidade, terapia com uma molécula ligadora de SEMA4D ou Plexina-B1, por exemplo, um fragmento ligador de anticorpo ou antígeno, variante, ou derivado do mesmo, pode ser combinado com ou baixa dose de quimioterapia ou terapia de radiação. Embora quimioterapia padrão é sempre imunossupressora, baixas doses de agentes quimioterapêuti-cos tais como ciclofosfamida, doxorubicina, e paclitaxel têm sido mostradas aumentar respostas para terapia de vacina para câncer (Machiels e colaboradores., Cancer Res. 61:3689-3697 (2001)). Em alguns casos, quimioterapia pode difentemente ina-tivar células T reguladoras (Treg) e células supressoras de origem mielóide (MDSC) que negativamente regulam respostas imunes no ambiente tumoral. Terapia de radiação tem sido geralmente empregada para explorar o efeito tumoricida direto de radiação ionizante. De fato, alta dose de radiação pode, como quimioterapia, ser imu-nossupressora. Numerosas observações, entretanto, sugerem que sob condições apropriadas do fracionamento e sequenciamento da dose, terapia de radiação pode aumentar respostas imunes específicas ao tumor e os efeitos de agentes imunomo-duladores. Um dos vários mecanismos que contribuem para este efeito é apresentação cruzada por células dendrítica e outras células apresentadoras de antígeno de antígenos tumorais liberados por morte de célula tumoral induzda por radiação (Higgins e colaboradores., Cancer Biol. Ther. 8:1440-1449 (2009)). Em efeito, terapia de radiação pode induzir vacinação in situ contra um tumor (Ma e colaboradores., Seminar Immunol. 22:113-124 (2010)) e esta pode ser amplificada pela combinação com terapia com uma molécula ligadora de SEAM4D ou Plexina-B1, por exemplo, uma anticorpo ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado do mesmo.

[0133]Em uma modalidade, a terapia imunomoduladora pode ser um agente imunomoduladora, incluindo, mas não limitado a, interleucinas tais como IL-2, IL-7, IL-12; citocinas tais como fator estimulante de colônia granulócito-macrófago (GM-CSF), interferon; várias quimiocinas tais como CXCL13, CCL26, CXCL7; antagonistas de bloqueios de ponto de checagem imune tais como anti-CTLA-4, anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-LAG3 e anti-B7-H3; citosina guanosina-fosfato sintética (CpG), oli-godeoxinucleotídeos, glucanos, moduladores de células T reguladoras (T regs) tal como ciclofosfamida, ou outros agentes imunomoduladores. Em uma modalidade, o agente imunomoduladora é um anticorpo agonista a 4-1BB (CD137). Como recentemente relatado, tal anticorpo agonista para 4-1BB pode dar origem a uma nova classe de células T KLRG1+ que são altamente citotóxicos para tumores (Curran e colaboradores., J. Exp. Med. 210:743-755 (2013)). Em todos os casos, a terapia imunomoduladora adicional é administrada antes de, durante, ou subsequente a molécula ligante anti-SEMA4D ou anti-Plexina-B1, por exemplo, terapia comanticorpo ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado do mesmo. Onde as terapias combinadas compreendem administração de uma molécula ligadora anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado do mesmo, em combinação com administração de outro agente imunomoduladora, os métodos da revelação compreendem coadministração, usando formulações separadas ou uma formulação farmacêutica única, com administração simultânea ou consecutiva em ambas as ordens.

[0134]Em uma modalidade, a terapia imunomoduladora pode ser um agente de terapia de câncer, incluindo, mas não limitado a, cirurgia ou procedimentos cirúrgicos (por exemplo, esplenectomia, hepatectomia, linfadenoctomia, leucoforese, transplante de medula óssea, e semelhantes); terapia por radiação; quimioterapia, opcionalmente em combinação com transplante de medula óssea autólogo, ou outra terapia de câncer; onde a terapia de câncer adicional é administrada antes de, durante, ou subsequente à molécula ligante anti-SEMA4D por exemplo, terapia com anticorpo ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado do mesmo. Onde as terapias combinadas compreendem administração de uma molécula ligadora anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado do mesmo, em combinação com administração de outro agente terapêutico, os métodos da revelação compreendem coadministração, usando formulações separadas ou uma formulação farmacêutica únida, com administração simultânea ou consecutiva em ambas as ordens.

[0135]Em outra modalidade, a revelação é direcionada ao uso de moléculas ligadoras anti-SEMA4D ou anti-Plexina-B1, por exemplo, anticorpos, incluindo fragmentos ligadores de antígeno, variantes, e derivados dos mesmos, ou como agentes únicos ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora, para tratar pacientes com câncer com níveis elevados de ou células B, células T ou ambas, células B e células T em circulação quando comparado a outros pacientes com tumores sólidos, tal como encontrado no cérebro, ovário, mama, cólon, e outros tecidos mas excluindo cânceres hematológicos. Como aqui utilizado, o termo “elevado” refere-se a pacientes com câncer que têm pelo menos 1,5 vezes, por exemplo, cerca de 1,5 a cerca de 5 vezes, por exemplo, cerca de 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; ou 5 mais vezes o número médio de células B e/ou células T na circulação que outros pacientes de câncer. Em um exemplo não limitante, em um grupo de 34 pacientes com tumores sólidos, o número médio de células B foi 98 por microlitro de sangue e o número médio de células T foi 782 por microlitro de sangue. Consequentemente, o número médio de células B e células T por microlitro de sangue observados neste subgrupo de pacientes com níveis elevados de câncer com células B e célula T variando de cerca de 147 a cerca de 588 e de cerca de 1173 a cerca de 3910, respectivamente, quando comparado a outros pacientes com câncer.

[0136]Em outra modalidade, a revelação é direcionada ao uso de moléculas ligadoras anti-SEMA4D ou anti-Plexina-B1, por exemplo, anticorpos, incluindo fragmentos ligadores de antígeno, variantes, e derivados dos mesmos, ou como agentes únicos ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora, para tratar pacientes com câncer com níveis de ou células B, células t ou ambas células B e células T na circulação que caem dentro ou acima da variação de indivíduos normais. Como aqui utilizado, o termo “normal” refere-se aos níveis de célula B e/ou T que são encontrados nos pacientes saudáveis sem câncer. Como aqui utilizado, o termo “dentro” refere-se a dez (10) percento de diferença em níveis de célula B e/ou T. Em um exemplo não limitante, a variação de níveis normais inclui, por exemplo, uma contagem de célula B de cerca de 250 células por microlitro ou mais e/ou uma contagem de célula T de cerca de 1500 células por microlitro ou mais. Assim, o número médio de céulas B ou células T por microlitro de sangue em pacientes com câncer com níveis de célula B e célula T podem variar de cerca de 225 a cerca de 275 ou mais e a partir de cerca de 1350 a cerca de 1650 e mais, respectivamente, quando comparado a pacientes saudáveis sem câncer. Claro, um versado na técnica pode apreciar que os níveis de células B e T podem variar dependendo de uma variaedade de fatores, por exemplo, tipo de câncer, estágio de câncer etc, e assim, níveis que estão abaixo de um provido acima pode também constitui níveis elevados por um certo tipo ou estágio de câncer.

[0137]Em algumas modalidades, as contagens de célula T e B absolutas são medidas usando um ensaio imunofenotípico baseado em citometria de fluxo validado (MD Mutitest 6-color TBNK Reagent), que é um ensaio de imunofluorescência direta de seis cores que também utiliza tubos BD Trucount e um citômetro de fluxo BD FACScanto. Este ensaio é usado rotineiramente para determinar as percentagens e contagens absolutas de células T, B e NK, bem como, subpopulações CD4 e CD8 de células T no sangue periférico. Células de sangue periférico são primeiro selecionadas (gate) nos linfócitos CD45+. Células T são definidas como células CD3+ dentro deste gate e células B são definidas como células CD19+ CD3- dentro deste gate. Percentagens são simplesmente tomadas diretamente do citômetro de fluxo após o gate apropriado ser ajustado, e as contagens absolutas são calculadas usando a fórmula seguinte (retirada diretamente a partir do procedimento do manual BD): [(#eventos na população celular / # eventos na região esférica de contagem absoluta)] * [(esferas/teste) / volume de teste] = contagem absoluta da população celular, onde “a” é o valor encontrado na marcação de folhad e alumínio do tubo BD Tru-count.

[0138]Deve também ser apreciado que os métodos aqui descritos são também aplicáveis à substituição das moléculas ligantes anti-Plexina-B1 para moléculas ligantes anti-SEMA4D. Em algumas modalidades, uma molécula ligante anti-Plexina-B1 pode ser usada para inibir a interação de SEMA4D com Plexina-B1 por ligação de bloqueio de SEMA4D a Plexina-B1 e/ou por prevenção de ativação de Plexina-B1 por SEMA4D. Deve também ser apreciado que os métodos aqui descritos são também aplicáveis ao uso de drogas de pequenas moléculas ou outros produtos biológicos para inibir a atividade de SEMA4D ou Plexina-B1. Em algumas modalidades, uma droga pequena molécula ou um produto biológico outro que uma molécula li- gante anti-SEMA4D pode ser usada para inibir a interação de SEMA4D com Plexina-B1 por bloqueio ligante de SEMA4D a Plexina-B1 e/ou por prevenção da ativação de Plexina-B1 por SEMA4D.

[0139]Em uma modalidade, tratamento inclui a aplicação ou administração de uma molécula ligante anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento li-gador de antígeno do mesmo como aqui descrito coo um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora a um paciente, ou aplicação ou administração da molécula ligadora anti-SEMA4D como um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora a um tecido isolado ou linhagem celular a partir de um paciente, onde o paciente tem, ou tem o risco de metástase de desenvolvimento de células de câncer. Em outra modalidade, tratamento é também tencionado incluir a aplicação ou administração de uma composição farmacêutica compreendendo as moléculas ligadoras anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento ligador de antígeno do mesmo a um paciente, em combinação com pelo menos uma outra terapia imunoterapia ou aplicação ou administração de uma composição farmacêutica compreendendo a molécula ligadora anti-SEMA4D e pelo menos uma terapia imunomoduladora a um tecido isolado ou linhagem celular a partir de um paciente, onde o paciente tem, ou tem o risco de desenvolver metástase de células cancerígenas.

[0140]As moléculas ligadoras anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpos ou fragmentos ligadores dos mesmos como aqui descrito, como agentes únicos ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora são úteis para o tratamento de vários tumores malignos e não malignos. Por “atividade anti-tumor” é tencionado uma redução na taxa de produção ou acúmulo de SEMA4D associado diretamente com o tumor ou indiretamente com células estromais do ambiente tumo-ral, e então um declínio na taxa de crescimento de um tumor existente ou de um tumor que aumenta durante a terapia, e/ou destruição de células neoplásticas (tumo res) existentes ou células neoplásticas recém-formadas, e então uma diminuição no tamanho geral de um tumor e/ou o número de sítios metastáticos durante terapia. Por exemplo, terapia com pelo menos um anticorpo anti-SEMA4D ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora causa uma resposta fisiológica, por exemplo, uma redução nas metástases, que é benéfico com respeito ao tratamento de estados de doença associados com células expressando SEMA4D em um humano.

[0141]Em uma modalidade, a revelação relaciona-se ao uso de moléculas ligadoras anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpos ou fragmentos ligadores de antíge-no, variantes, ou derivados do mesmo, como um agente único ou em combinação com pelo menos uma terapia imunomoduladora como um medicamento, no tratamento ou profilaxia de câncer ou para uso em uma condição pré-cancerosa ou lesão para inibir, reduzir, prevenir, atrasar, ou minimalizar o crescimento ou metástase de células tumorais.

[0142]Em acordo com os métodos da presente revelação, pelo menos uma molécula ligadora anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado do mesmo, como um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora pode ser usada para promover uma resposta terapêutica positiva com respeito a uma célula humana maligna. Por “resposta terapêutica positiva” com respeito ao tratamento de câncer é tenci-onado uma melhora na doença em associação com a atividade anti-tumor dessas moléculas ligadoras, por exemplo, anticorpos ou fragmentos dos mesmos, e/ou uma melhora nos sintomas associados com a doença. Em particular, os métodos aqui providos são direcionados para inibir, prevenir, reduzir, aliviar, atrasar, ou diminuir o crescimento de um tumor e/ou o desenvolvimento de metástases de tumores primários em um paciente. Isto é a prevenção das consequências de tumores distais pode ser observada. Então, por exemplo, uma melhora na doença pode ser caracterizada como uma resposta completa. Por “resposta completa” é tencionado uma ausência de metástases clinicamente detectáveis com normalização de quaisquer estudos prévios radiográficos anormais, por exemplo, no sítio do tumor primário ou a presença de metástase tumoral na medula óssea. Alternativamente, uma melhora na doença pode ser categorizada como sendo uma resposta parcial. Por “resposta parcial” é tencionado pelo menos cerca de 50% de diminuição em todas as metástases mensuráveis (isto é, o número de células tumorais presentes no paciente em um sítio remoto a partir do tumor primário). Alternativamente, uma melhora na doença pode ser categorizada como sendo sobrevivência livre recidiva ou “progressão livre de sobrevivência”. Por “sobrevivência livre de recidiva” é tencionado o tempo de recorrência de um tumor em qualquer sítio. “Sobrevivência livre de progressão” é o tempo antes de crescimento adicional do tumor em um sítio sendo monitorado ser detectado.

[0143]Inibição, atraso, ou redução de metástases podem ser avaliadas usando técnicas de seleção tal como imagem, por exemplo, imagem de anticorpo fluorescente, imagem de escaneamento ósseo, e amostra de biopsia do tumor incluindo aspiração de medula óssea (BMA), ou imunoistoquímica. Em adição a essas respostas terapêuticas positivas, o paciente passando por terapia com a molécula ligadora anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado do mesmo, pode experimentar o efeito benéfico de uma melhora nos sintomas associada com a doença.

[0144]Resposta clínica pode ser avaliada usando técnicas de seleção tais como escaneamento de imagem por ressonância magnética (MRI), imagem X-radiográfica, escaneamento por tomografia computadorizada (CT), citometria de fluxo ou análise por separação de célula ativada por fluorescência (FACS), histologia, patologia gross, e química sanguínea, incluidno mas não limitado a mudanças detectáveis por ELISA, RIA, cromatogradia, e semelhantes.

[0145]Para aplicar os métodos e sistemas da revelação em certas modalidades, amostras a partir de um paciente podem ser obtidas antes ou depois da administração de uma terapia compreendendo ou: (1) uma quantidade efetiva de uma molécula ligadora isolada que especificamente liga a semaforina-4D (SEMA4D) e uma quantidade efetiva de pelo menos uma outra terapia imunomoduladora; ou (2) uma quantidade efetiva de uma molécula ligante isolada que especificamente liga a semaforina-4D (SEMA4D) a um paciente tendo um tumor que é Her2+ e ou Plexina B1+ ou Plexina B2+. Em alguns casos, amostras sucessivas podem ser obtidas a partir do paciente após terapia ter começado ou ter terapia ter cessado. Amostras podem, por exemplo, ser requeridas por um provedor de cuidado de saúde (por exemplo, um médido) ou provedor de benefícios de cuidado de saúde, obtido e/ou processo pelo mesmo provedor ou um provedor de cuidado de saúde diferente (por exemplo, uma enfermeira, um hospital) ou um laboratório clínico, e após processamento, os resultados podem ser encaminhados para ainda outro provedor de cuidado de saúde, provedor de benefícios de cuidade de saúde ou o paciente. Similarmente, a medida/determinação de uma ou mais pontuações, comparações entre pontuações, avaliação das pontuações e decisões de tratamento podem ser feitas por um ou mais provedores de cuidado de saúde, provedores de benefícios de cuidado de saúde, e/ou laboratórios clínicos.

[0146]Como aqui utilizado, o termo “provedor de cuidado de saúde” refere-se a indivíduos ou instituições que diretamente interagem e administram para pacientes vivos, por exemplo, pacientes humanos. Exemplos não limitantes de provedores de cuidado de saúde incluem doutores, enfermeiras, técnicos, terapeutas, farmacêuticos, conselhereiros, práticos de medicina alternativa, instalações médicas, consultórios médicos, hospitais, salas de emergências, clínicas, centros de cuidados urgentes, clínicas/instalações de medicina alternativa, e qualquer outra entidade provendo tratamento geral e/ou especializado, avaliação, manutenção, terapia, medicamento, e/ou conselho relativo a todo, ou qualquer porção de, um estado de saúde do paciente, incluindo, mas não limitado médico geral, médico especializado, cirurgia e/ou qualquer outro tipo de tratamento, avaliação, manutenção, terapia, medicamento e/ou dispositivo.

[0147]Em alguns aspectos, o provedor de cuidado de saúde pode administrar ou instruir outro provedor de cuidado de saúde a administrar uma terapia compreendendo ou: (1) uma quantidade efetiva de uma molécula ligadora isolada que especificamente liga a semaforina-4D (SEMA4D) e uma quantidade efetiva de pelo-menos uma outra terapia imunomoduladora; ou (2) uma quantidade efetiva de uma molécula ligadora isolada que especificamente liga a semaforina-4D (SEMA4D), onde o paciente tem, ou é suspeito de ter, células tumorais que são Her2+ e ou Plexina B1+ ou Plexina B2+. Um provedor cuidado de saúde pode implementar ou instruir outro provedor de cuidado de saíde ou paciente a fazer as seguintes ações: obter uma amostra, processar uma amostra, submeter uma amostra, receber uma amostra, transferir uma amostra, analisar ou medir uma amostra, quantificar uma amostra, prover os resultados obtidos após análise/medida/quantificação de uma amostra, receber os resultados obtidos após analisar/medir/quantificar uma amostra, compa-rar/pontuar os resultados obtidos após analisar/medir/quantificar uma ou mais amostras, prover a comparação/pontuação de uma ou mais amostras, obter a compara-ção/pontuação de uma ou mais amostras, administrar uma terapia (por exemplo, (1) uma quantidade efetiva de uma molécula ligante isolada que especificamente liga a semaforina-4D (SEMA4D) e uma quantidade efetiva de pelo menos uma outra terapia imunomoduladora; ou (2) uma quantidade efetiva de uma molécula ligadora isolada que especificamente liga a semaforina-4D (SEMA4D) a um paciente, onde o paciente tem, ou é suspeito de ter, células tumorais que são Her2+ e ou Plexina B1 + ou Plexina B2+, inciando a administração de uma terapia, interrompendo a administração de uma terapia, continuar a administração de uma terapia, temporariamente interromper a administração de uma terapia, aumentar a quantidade de um agente terapêutico administrado, diminuir a quantidade de um agente terapêutico administrado, continuar a administração de uma quantidade de um agente terapêutico, aumento da frequência de administração de uma gente terapêutico, diminuir a frequência de administração de um agente terapêutico, manter a mesma frequência de dose em um agente terapêutico, substituir uma terapia ou agente terapêutico por pelo menos outra terapia ou agente terapêutico, combinar uma terapia ou agente terapêutico com pelo menos outra terapia ou agente terapêutico adicional. Em alguns aspectos, um provedor de benefícios de cuidado de saúde pode autorizar ou negar, por exemplo, coleção de uma amostra, processamento de uma amostra, submissão de uma amostra, recebimento de uma amostra, transferência de uma amostra, análise ou medida de uma amostra, quantificação de uma amostra, provisão de resultados obtidos após análise/medida/quantificação de uma amostra, transferência de resultados obtidos após análise/medida/quantificação de uma amostra, compara-ção/pontuação de resultados obtidos após análise/medida/quantificação de uma ou mais amostras, transferência da comparação/pontuação de uma ou mais amostras, administração de uma terapia ou agente terapêutico, início da administração de uma terapia ou agente terapêutico, interrupção da administração de uma terapia ou agente terapêutico, continuação da administração de uma terapia ou agente terapêutico, interrupção temporária da administração de uma terapia ou agente terapêutico, aumento da quantidade de agente terapêutico administrado, diminuição da quantidade de agente terapêutico administrado, continuação da administração de uma quantidade de uma gente terapêutico, aumento na frequência de administração de um agente terapêutico, diminuição na frequência de administração de um agente terapêutico, mantendo a mesma frequência de dose em uma gente terapêutico, substituição ou agente terapêutico por pelo menos outra terapia ou agente terapêutico, ou combinar uma terapia ou agente terapêutico com pelo menos outra terapia ou agen te terapêutico adicional.

[0148]Em adição um benefício de cuidado de saúde provido pode, por exemplo, autorizar ou negar a prescrição de uma terapia, autorizar ou negar a cobertura para terapia, autorizar ou negar o reembolso para o custo da terapia, determinar ou negar a elegibilidade para terapia etc.

[0149]Em alguns aspectos, um laboratório clínico pode, por exemplo, coletar ou obter uma amostra, processar uma amostra, submeter uma amostra, receber uma amostra, transferir uma amostra, analisar ou medir uma amostra, quantificar uma amostra, prover os resultados obtidos após análise/medida/quantificação de uma amostra, receber os resultados obtidos após análise/medida/quantificação de uma amostra, comparar/pontuar os resultados obtidos após análi-se/medida/quantificação de uma ou mais amostras, prover a comparação/pontuação de uma ou mais amostras, obter a comparação/pontuação de uma ou mais amostras, ou outras atividades relacionadas. VI. Métodos de Diagnóstico e Tratamento [0150]Em certas modalidades, esta revelação provê métodos de tratar u paciente, por exemplo, um paciente com câncer, onde o paciente tem níveis elevados de ou células B, células T ou ambas, células B e células T, compreendendo administração de uma combinação de uma quantidade efetiva de uma molécula ligante isolada que especificamente liga a semaforina-4D (SEMA4D) e uma quantidade efetiva de pelo menos uma outra terapia imunomoduladora se os níveis de célula B, célula T ou ambas células B e célula T do paciente estão acima de um nível limite pré-determinado de células B, células T ou ambas células B e células T, ou são elevadas relativas ao nível de células B, células T ou ambas, células B e células T, em uma ou mais amostras controle que podem incluir, mas não limitar a amostras a partir de outros pacientes de câncer ou de pacientes saudáveis sem câncer. Níveis de célula B, célula T, ou célula B ou célula T podem ser medidos por um provedor de cuidado de saúde ou por um laboratório clínico, onde uma amostra, por exemplo, uma amostra de sangue, é obtida a partir do paciente ou pelo provedor de cuidado de saúde ou pelo laboratório clínico. Em um aspecto, o nível do paciente de células B, células T ou ambas, células B e células T, podem ser medidas em um ensaio imunofenotípi-co baseado em citometria.

[0151]Em certas modalidades, esta revelação também provê um método de tratar um paciente, por exemplo, um paciente com câncer, compreendendo administração ao paciente de uma quantidade efetiva de uma molécula ligante isolada que especificamente liga a semaforina-4D (SEMA4D) se expressão de Her2 e ou Plexina B1 ou Plexina B2 em uma amostra retirada a partir de células tumorais do paciente está acima de níveis limites pré-determinados, ou é elevado relativo a expressão de Her2 e ou Plexina B1 ou Plexina B2 em um ou mais amostras controle. Expressão Her2, Plexina B1, e/ou Plexina B2 nas células tumorais do paciente podem ser medidas por um provedor de cuidado de saúde ou por um laboratório no nível de proteína e/ou ao nível mRNA. Em certos aspectos, expressão de Her2, Plexina B1. e/ou Plexina B2 pode ser medida in situ, por exemplo, através de técnicas de imagens. Em certos aspectos expressão de Her2, Plexina B1, e/ou Plexina B2 pode ser medida em uma amostra de célula tumoral a partir do paciente através de uma biopsia. Em um aspecto, expressão de Her2, Plexina B1, e/ou Plexina B2 em células tumo-rais pode ser medida em um imunoensaio empregando anticorpos ou fragmentos ligadores de antígeno dos mesmos que reconhecem proteínas Her2, Plexina B1, e/ou Plexina B2, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes ou derivados dos mesmos. Em outro aspecto expressão de Her2, Plexina B1, e/ou Plexina B2 pode ser medida através de um ensaio de expressão gênica quantitativa, por exemplo, um ensaio RT-PCR.

[0152]Esta revelação também provê métodos, ensaios, e kits para facilitar uma determinação por um provedor de cuidado de saúde, um provedor de benefício de cuidado de saúde, ou um laboratório clínico para como se um paciente, por exemplo, um paciente com câncer, beneficiará a partir de um tratamento com ou: (1) uma quantidade efetiva de uma molécula ligante isolada que especificamente liga a semaforina-4D (SEMA4D) e uma quantidade efetiva de pelo menos uma outra terapia imunomoduladora; ou (2) uma quantidade efetiva de uma molécula ligante isolada que especificamente liga a semaforina-4D (SEMQ4D), onde o paciente tem, ou é suspeito de ter, células tumorais que são Her2+ e ou Plexina B1+ ou Plexina B2+. Os métodos, ensaios, e kits providos aqui também facilitarão uma determinação por um provedor de cuidade de saúde, um provedor de benefício de cuidado de saúde, ou um laboratório clínico se um paciente, por exemplo, um paciente com câncer, se beneficiará a partir do tratamento com (1) uma quantidade efetiva de uma molécula ligante isolada que especificamente liga a semaforina-4D (SEMA4D) e uma quantidade efetiva de pelo menos uma outra terapia imunomoduladora; (2) uma quantidade efetiva de uma molécula ligante isolada que espeficicamente liga a semaforina-4D (SEMA4D) (por exemplo, onde as células tumorais do paciente expressam, ou podem ser determinadas para expressar, Her2 e ou Plexina B1 ou Plexina B2).

[0153]A presente revelação provê um método de tratar um paciente, por exemplo, um paciente com câncer, compreendendo administração de uma quantidade efetiva de uma molécula ligante isolada que especificamente liga a semaforina-4D (SEMA4D) e uma quantidade efetiva de pelo menos uma outra terapia imunomo-duladora; se o nível de células B, células T, ou células T e células B em uma amostra retirada do paciente está acima de um nível limite pré-determinado, ou está acima do nível de células B, células T, ou células T e células B em uma ou mais amostras controle. Em alguns aspectos, a amostra é obtida a partir do paciente e é submetida para medida do nível de células B, células T, ou células T e células B na amostra, por exemplo, a um laboratório clínico.

[0154]Também provido é um método de tratar um paciente, por exemplo, um paciente com câncer, compreendendo (a) submetendo uma amostra retirada do paciente para medida do nível de células B, células T, ou células T e células B na amostra; e, (b) administrando uma quantidade efetiva de uma molécula ligante isolada que especificamente liga a semaforina-4D (SEMA4D) e uma quantidade efetiva de pelo menos uma outra terapia imunomoduladora ao paciente se o nível de células B, células T, ou células T e células B do paciente está acima de um nível limite pré-determinado, ou está acima do nível de células B, células T, ou células T e células B em uma ou mais amostras controle.

[0155]A revelação também provê um método de tratar um paciente, por exemplo, um paciente com câncer, compreendendo (a) medida do nível de células B, células T, ou células T e células B em uma amostra obtida a partir de um paciente, por exemplo, um paciente com câncer, em que o nível de células B, células T, ou células T e células B do paciente na amostra é medido, por exemplo, em um ensaio imunofenotípico baseado em citometria; (b) determinando se o nível de células B, células T, ou células T e células B na amostra está acima de um nível limite pré-determinado, ou está acima do nível de células B, células T ou células T e células B em uma ou mais amostras controle; e (c) advertendo, instruindo, ou autorizando um provedor de cuidado de saúde a administrar uma quantidade efetiva de uma molécula ligante isolada que especificamente liga a semaforina-4D (SEMA4D) e uma quantidade efetiva de pelo menos uma outra terapia imunomoduladora ao paciente se o nível de células B, células T, ou células T e células B do paciente está acima de um nível limite pré-determinado, ou está acima do nível de células B, células T, ou células T e células B em uma ou mais amostras controle.

[0156]Em alguns aspectos, o nível de células B, células T, ou células T e células B do paciente pode ser medido em um ensaio imunofenotípico baseado em citometria. Em certos aspectos, o ensaio pode ser feito em uma amostra obtida a partir do paciente, pelo profissional de cuidado de saúde tratando o paciente, por exemplo, usando um ensaio como aqui descrito, formulado como um kit diagnóstico de “ponto de cuidado”. Em alguns aspectos, uma amostra pode ser obtida a partir do paciente e pode ser submetida, por exemplo, a um laboratório clínico, para medida do nível de células B, células T, ou células T e células B na amostra de acordo com as instruções do profissional de cuidado de saúde, incluindo, mas não limitado a, uso de um ensaio imunofenotípico baseado em citometria como aqui descrito. Em certos aspectos, o laboratório clínico fazendo o ensaio pode aconselhar o provedor de cuidado de saúde ou um provedor de benefício de cuidado de saúde se o paciente pode beneficiar a partir do tratamento com uma quantidade efetiva de uma molécula ligandora isolada que liga especificamente a semaforina-4D (SEMA4D0 e uma quantidade efetiva de pelo menos uma outra terapia imunomoduladora, se o nível do paciente de células B, células T, ou células T e células B está acima de um nível limite pré-determinado, ou está acima do nível de células B, células T, ou células T e células B em uma ou mais amostras controle.

[0157]Em certos aspectos, resultados de um imunoensaio como aqui provido podem ser submetidos a um provedor de benefício de cuidado de saúde para determinação se o seguro do paciente cobrirá o tratamento com uma molécula ligante isolada que especificamente liga a semaforina-4D (SEMA4D) e pelo menos uma outra terapia imunomoduladora. VII. Composicões Farmacêuticas e Métodos de Administração [0158]Métodos de preparar e administrar moléculas ligadoras anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpos, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos como um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora a um paciente em necessidade do mesmo são bem conhecidos a ou são facilmente determinados por aqueles versados na técnica. A via de administração da molécula ligadora anti-SEMA4D, por exemplo, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado do mesmo como um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora, pode ser, por exemplo, oral, parenteral, por inalação ou tópico ao mesmo tempo ou diferentes para cada agente terapêutico. O termo parenteral como aqui utilizado inclui, por exemplo, administração intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutâneo, retal, ou vaginal. Enquanto todas essas formas de administração são claramente contempladas como estando dentro do objetico da revelação, um exemplo de uma forma para administração pode ser uma solução para injeção, em particular para injeção intravenosa ou intraarterial ou gotas. Uma composição farmacêutica adequada para injeção pode compreender um tampão (por exemplo, acetato, fosfato ou tampão citrato), um tensoativo (por exemplo, polisorbato), opcionalmente um agente estabilizador (por exemplo, albumina humana) etc. Entretanto, em outros métodos compatíveis com os ensinamentos aqui, moléculas ligantes anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpos, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou derivados do mesmo como um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora pode ser distribuída diretamente ao sítio da população celular adversa assim aumentando a exposição do tecido doente ao agente terapêutico.

[0159]Como aqui discutido, moléculas ligantes anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpos, ou fragmentos ligantes de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos como um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imu-nomoduladora pode ser administrada em uma quantidade farmaceuticamente efetiva para o tratamento in vivo de doenças tais como distúrbios neoplásticos, incluindo tumores sólidos. A este respeito, será apreciado que as moléculas ligantes reveladas podem ser formuladas de forma a facilitar administração e promover estabilidade do agente ativo. Em certas modalidades, composições farmacêuticas de acordo com a presente revelação compreende um veículo estéril, não tóxico, farmaceuticamente aceitável tal como tampões de salina fisiológica não tóxica, conservantes e seme lhantes. Para os propósitos da presente pedido, uma quantidade farmaceuticamente efetiva de uma molécula ligante anti-SEMA4D, por exemplo, ou um fragmento liga-dor de antígeno, variante, ou derivado do mesmo, como um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora deve ser mantida para significar uma quantidade suficiente para alcançar ligação efetiva a um alvo e para alcançar um benefício, isto é, para inibir, atrasar, ou reduzir metástases em um paciente com câncer.

[0160]As composições farmacêuticas usadas nesta revelação compreendem veículos farmaceuticamente aceitáveis, incluindo, por exemplo, trocadores iônicos, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas séricas, tal como albumina sérica humana, substâncias tamponantes tais como fosfatos, glicina, ácidos sórbico, sorba-to de potássio, misturas de glicéridos parciais de ácidos graxos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, tais como sulfato de protamina, fosfato de hidrogênio disó-dico, fosfato de potássio hidrogênio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinil pirrolidona, substâncias baseadas em celulose, po-lietileno glicol, carboximetilcelulose de sódio, poliacrilatos, ceras, polímeros bloquea-dores polietileno-polioxipropileno, polietileno glicol, e lanolina.

[0161]Preparações para administração parenteral incluem soluções, suspensões e emulsões aquosas ou não aquosas estéreis. Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais tais como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis tal como oleato de etila. Veículso aquosos incluem, por exemplo, água, soluções alcóolicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo salina e meio tamponado. Veículos farmaceuticamente aceitáveis podem incluir, mas não são limitados a, 0,01-0,1 M, ou 0,05 M de tamão fosfato ou salina 0,8%. Outros veículos parenterais comuns incluem soluções fosfato de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, de Ringer lactato, ou óleos fixados. Veículos intravenosos incluem nutrientes repositores, eletrólitos repositores, tais como aque les baseados em desxtrose de Ringer, e semelhantes. Conservantes e outros aditivos podem também estar presentes tais como, por exemplo, antimicrobianos, antio-xidantes, agentes quelantes, e gases inertes e semelhantes.

[0162]Mais particularmente, composições farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções aquosas (onde solúvel em água) ou dispersões e pós-estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em tais casos, a composição pode ser estéril e deve ser fluida à extensão que existe fácil siringabilidade. Deve ser estável em condições de fabricação e armazenamento e podem ser conservados contra a ação contaminante de microorganismos, tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, pro-pileno glico, e polietileno glicol líquido, e semelhantes), e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção de um certo tamanho de partícula no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Formulações adequadas para uso nos métodos terapêuticos aqui revelados são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16a ed. (1980).

[0163]Prevenção da ação de micro-organismos pode ser alcançada pelos vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e semelhantes. Em certas modalidades, agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio pode podem ser inclusos na composição. Absorção prolongada de composições injetáveis pode ser trazidas por inclusão na composição de um agente que atrasa a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[0164]Em qualquer caso, soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorporar um composto ativo (por exemplo, um anticorpo anti-SEMA4D, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado do mesmo, por ele mesmo ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora) em uma certa quantidade em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados aqui, seguido por esterilização por filtração. Geralmente, dispersões são preparadas por incorporação do composto ativo em um veículo estéril, que contém um meio de dispersão básico e outros ingredientes a partir daqueles enumerados acima. Em caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, métodos de preparação podem incluir secagem a vácuo ou liofilização, que pode produzir um pó de um ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma solução estéril-filtrada previamente do mesmo. As preparações para injeções são processadas, colocadas em recipientes tais como ampalas, bolsas, garrafas, seringas ou frascos, e seladas em condições assépticas de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Ainda, as preparações podem ser embaladas e mantidas na forma de um kit. Tais artigos de fabricação podem ter etiquetas ou embalagens inseridas indicando que as composições associadas são úteis para tratar um paciente sofrendo de, ou pré-dispostos a uma doença ou distúrbio.

[0165]Formulações parenterais pode ser uma dose bolus única, uma infusão ou uma dose bolus carregada seguida de uma dose de manutenção. Essas composições podem ser administradas em intervalos fixados específicos ou variáveis, por exemplo, uma vez por dia, ou em uma base “como necessário”.

[0166]Certas composições farmacêuticas podem ser oralmente administradas em uma forma de dosagem aceitável incluindo, por exemplo, cápsulas, comprimidos, suspensões ou soluções aquosas. Certas composições farmacêuticas também podem ser administradas por aerossol nasal ou inalação. Tais composições podem ser preparadas como soluções em salina, empregando benzil álcool ou outros conservantes adequados, promotores de absorção para aumentar biodisponibi-lidade, e/ou outros agentes convencionais solubilizantes ou dispersantes.

[0167]A quantidade de uma molécula ligadora anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpo, ou fragmento, variante, ou derivado do mesmo, como um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora a ser combinada com os materiais veículo para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do hospedeiro tratado e o modo particular de administração. A composição pode ser administrada como uma dose única, múltiplas doses ou em um período estabelecido de tempo em uma infusão. Regimes de dose também podem ser ajustados para prover a resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática).

[0168]Mantendo o objetivo da presente revelação, anticorpos anti-SEMA4D, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou derivados do dos mesmos como um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomodu-ladora pode ser administrada a um humano ou outro animal de acordo com os métodos acima mencionados de tratamento em uma quantidade suficiente para produzir um efeito terapêutico. Os anticorpos anti-SEMA4D, ou fragmentos ligadores de antí-geno, variantes ou derivados dos mesmos como um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomodulante pode ser administrada a tal humano ou outro animal em uma forma de dosagem convencional preparada por combinação do anticorpo provido aqui com um veículo ou diluente farmaceuticamen-te aceitável convencional de acordo com técnicas conhecidas. Será reconhecido por um versado na técnica que a forma e caráter do veículo ou diluente farmaceutica-mente aceitável é ditado pela quantidade de ingrediente ativo com o qual é para ser combinada, a via de administração e outras variáveis bem conhecidas. Aqueles versados na técnica ainda apreciarão que um coquetel compreendendo uma ou mais espécies de moléculas ligantes de anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpos, ou fragmentos ligadores de antígeno, variantes, ou derivados dos mesmos como provado aqui podem ser usados.

[0169]Por “dose ou quantidade terapeuticamente efetiva” ou “quantidade efe tiva” é tencionado uma quantidade de molécula ligante anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpo ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado do mesmo, como um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora que quando administrada traz uma resposta terapêutica positiva com respeito a tratamento de um paciente com uma doença a ser tratada, por exemplo, uma inibição, atraso, ou redução de metástases no paciente.

[0170]Doses terapeuticamente efetivas das composições da presente revelação, para a inibição, atraso, ou redução de metástase, variam dependendo dos muitos fatores diferentes, incluindo meios de administração, sítio alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é humano ou um animal, outras medicações administradas, e se tratamento é profilático ou terapêutico. Em certas modalidades o paciente é um humano, mas mamíferos não humanos incluindo mamíferos transfênicos podem também ser tratados. Doses de tratamento podem ser tituladas usando métodos de rotina conhecidos por aqueles versados na técnica para otimizar a segura-ça e eficácia.

[0171]A quantidade de molécula ligadora anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpo ou fragmento ligador, variante, ou derivado do mesmo, administrado como um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomodula-dora é facilmente determinada por um versado na técnica sem experimentação indevida dada a revelação da presente revelação. Fatores influenciando o modo de administração e quantidade respectiva de molécula ligadora anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpo, fragmento ligador de antígeno, variante ou derivado do mesmo a ser administrado como um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora inclui, mas não é limitada a severidade da doença, a história da doença, o potencial para metástase, e a idade, altura, peso, saúde, e condição física do indivíduo passando por terapia. Similarmente, a quantidade de molécula ligadora anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpo, ou fragmento, variante, ou derivado do mesmo, como um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora a ser administrada será dependente do modo de administração e se o paciente passará por uma dose única ou doses múltiplas deste agente.

[0172]A revelação também provê para o uso de uma molécula ligadora anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpo, ou fragmento ligador de anticorpo, variante, ou derivado do mesmo, como um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora na fabricação de um medicamento para tratar um paciente com um câncer, em que o medicamento é usado em um paciente que tenha sido pré-tratado com pelo menos uma terapia. Por “pré-tratado” ou “pré-tratamento” é tencionado o paciente ter recebido uma ou mais outras terapias (por exemplo, sido tratado com pelo menos uma outra terapia de câncer) antes de receber o medicamento compreendendo a molécula ligadora anti-SEMA4D, por exemplo, anticorpo ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado do mesmo como um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomodu-ladora. “Pré-tratado” ou “pré-tratamento” inclui pacientes que tenham sido tratados com pelo menos uma outra terapia dentro de 2 anos, dentro de 18 meses, dentro de 1 ano, dentro de 6 meses, dentro de 2 meses, dentro de 6 semanas, dentro de 1 mês, dentro de 4 semanas, dentro de 3 semanas, dentro de 2 semanas, dentro de 1 mês, dentro de 6 dias, dentro de 5 dias, dentro de 4 dias, dentro de 3 dias, dentro de 2 dias, ou menos dentro de 1 dia antes do início do tratamento com o medicamento compreendendo a molécula ligadora anti-SEMA4D, por exemplo, o anticorpo monoclonal VX15/2503 aqui revelado, ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado do mesmo como um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora. Não é necessário que o paciente tenha sido res-pondedor ao pré-tratamento com a terapia ou terapia anteriores. Então, o paciente que recebe o medicamento compreendendo a molécula ligadora anti-SEMA4D, por exemplo, um anticorpo ou fragmento ligador de anticorpo, variante, ou derivado do mesmo como um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora pode ter respondido, ou pode ter falhado em responder (por exemplo,o câncer foi retratário), para pré-tratamento com a terapia anterior, ou a uma ou mais das terapias anteriores onde pré-tratamento compreendeu múltiplas terapias. Exemplos de outras terapias de câncer para as quais um paciente pode ter recebido pré-tratamento antes de receber o medicamento compreendendo a molécula ligadora anti-SEAM4D, por exemplo, anticorpo ou fragmento ligador de antígeno, variante, ou derivado do mesmo como um agente único ou em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora inclui, mas não é limitado a cirurgia; terapia de radiação; quimioterapia, opcionalmente em combinação com transplanta de medula óssea autólogo, onde agentes quimioterápicos adequados incluem, mas não são limitados àqueles listados aqui acima; outra terapia de anticorpo monoclonal an-ti-câncer; terapia de câncer baseada em molécula pequena, incluindo, mas não limitado a moléculas pequenas listadas aqui acima; terapias de câncer baseadas em vacina/imunoterapia; terapia esteroide; outra terapia de câncer; ou qualquer combinação das mesmas.

[0173]A prática da presente revelação empregará, a menos que de outra forma indicado, técnicas convencionais de biologia celular, cultura celular, biologia molecular, biologia transgênica, microbiolodia, DNA recombinante, e imunologia, que estão dentro da competência da técnica. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook e colaboradores., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook e colaboradores., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis e colaboradores. U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames e Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames e Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Cul- ture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller e Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu e colaboradores., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 e 155; Mayer e Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir e Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I., (1986); e em Ausubel e colaboradores. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).

[0174]Princípios gerais da construção de anticorpos são revelados em Bor-rebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2a ed.; Oxford Univ. Press). Princípios gerais da construção de proteínas são revelados em Rickwood e colaboradores., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.). Princípios gerais da construção de anticorpos e ligação anti-corpo-hapteno são revelados em: Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2a ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); e Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, Nova Iorque, N.I.). Adicionalmente, métodos padrões em imunologia conhecidos na técnica e não especificamente descritos são geralmente seguidos como em Current Protocols in Immunology, John Wiley & SonsNova Iorque; Stites e colaboradores., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8a ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) e Mishell e Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NI).

[0175] Trabalhos de referência padrões contend princípios gerais de imuno-logia incluem Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nova Iorque; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett e colaboradores., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybrid- oma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden e colaboradores., (Elsevere, Amsterdam); Goldsby e colaboradores., eds. (2000) Kuby Immunnology (4a ed.; H. Freemand & Co.); Roitt e colaboradores. (2001) Immunology (6a ed.; London: Mosby); Abbas e colaboradores. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5a ed.; Elsevier Health Sciences Divi-sion); Kontermann and Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlan); Sam-brook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall2003); Harlow e Lane (1988) Anti-bodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach e Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press).

[0176]Todas as referências citadas acima, bem como todas as referências citadas aqui, são incorporadas aqui por referência em suas totalidades.

[0177]Os seguintes exemplos são oferecidos por meio de ilustração e não por meio de limitação.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Teste de habilidade de um anticorpo anti-SEMA4D para atrasar o crescimento tumoral em camundongos competentes imunologicamente [0178]Desenho Experimental: O desenho experimental básico é como segue. Células de tumor Colon26 foram implantadas subcutaneamente no flanco de camundongos Balb/c imunocompetentes singenêicos (5χ10Λ5 células) ou camundongos SCID deficientes imunologicamente (1χ10Λ5 células) em 0,2 mL de salina. Tratamento com Controle Ig 2B8 ou anti-SEMA4D ab 67 foi iniciado no dia 2 pós-implante de tumor. Camundongos (n=20) foram tratados duas vezes pode semana com 1,0 mg (aproximadamente 50 mg/kg) cada do anticorpo monoclonal via injeção intraperitoneal (IP). Tumores foram medidos com calibradores 3x/semana começando 3 dias após o implante. Camundongos foram pesados 2x/semana começando no dia 3. Animais foram sacrificados quando volume de tumor alcançaou 1000 mm3.

[0179]Tratamento anti-SEMA4D atrasou o crescimento tumoral em camun-dongos com sistema imune competente. Crescimento tumoral foi medido por cali-bradores e medidas foram usadas para calcular o volume tumoral usando a fórmula (l2 x c)/2, onde l= largura, medida menor e l = comprimento, em mm, do tumor. Volume médio do tumor (FIG1A) e curvas de sobrevivência Kaplan Meier (FIG 1B), definidos como tempo para o ponto final onde o volume do tumor = 1000 mm3, são mostrados nas FIGS. 1A e 1B. Análise estatística foi conduzida usando Análise de Variancia Bicaudal (ANOVA) e análise Log Rank, respectivamente, que mostraram um efeito de tratamento estatisticamente significante com anticorpo anti-SEMA4D em camundongos Balb/c.

[0180]Atraso no crescimento de tumor de vinte e nove percento (29%) foi alcançado em camundongos Balb/c, entretanto, nenhum tratamento relacionado a crescimento tumoral foi observado em camundongos SCID. Crescimento tumoral atrasado (TGD), é definido como o aumento na média de tempo para ponto final (TTE) em um grupo de tratamento comparado ao grupo controle: % TGD - [(T-C)/C] x 100, onde T= TTE médio para um grupo de tratamento, C = TTE médio para o grupo de tratamento. Os animais Balb/c tratados com anticorpo anti-SEMA4D 67 mostraram uma redução estatisticamente significante em volume de tumor primário no tempo de sacrifício sobre os animais controle (p<0,0001). Este descobrimento mostra que o anticoro anti-SEMA4D foi efetivo em atrasar o crescimento tumoral em ca-mundongos com um sistema imune competente, mas não em camundongos imuno-deficientes.

Exemplo 2: Teste da habilidade de um anticorpo anti-SEMA4D em atrasar o crescimento tumoral em presença de Células T Efetoras CD8+ [0181]Desenho Experimental: Células tumorais Colon26 foram implantadas subcutaneamente no flanco de camundongos Balb/c (5x10A5 em 0,2 mL de salina).

Anticorpo depletador anti-CD8 (Clone 2,43, BioXCell) ou Ig de rato controle (Clone LTF-2, BioXCell) (150 mg/kg) foram administrados via injeção intraperitoneal (IP) nos dias -1, 0, 1, 11 e semanalmente depois disso. Tratamento com Ig Controle 2B8 ou Ab 67 anti-SEMA4D foi iniciado no dia 2. Camundongos (n=20) foram tratados duas vezes semanalmente com 1,0 mg (aproximadamente 50 mg/kg) de anticorpo monoclonal através de injeção intraperitoneal. Tumores foram medidos com calibradores 3x/semana começando com 3 dias após implante. Animais foram sacrificados quando a média do volume do tumor do grupo controle alcançou 1000 mm3, dia 30 para grupos tratados com Ig de rato, e dia 26 para grupos tratados com anti-CD8.

[0182]Tratamento anti-SEMA4D atrasou o crescimento de tumor em presença de linfócitos T CD8+. Volume tumoral foi medido por calibradores usando a fórmula (l2 x c)/2, onde l = largura, medida menor e c = comprimento, em mm, do tumor. Diferenças estatísticas no volume tumoral foram determinadas usando uma Análise de Variância One-Way (ANOVA) bicaudal comparando grupos tratados com anticorpos com o grupo controle Ig 2B8. Volume tumoral médio é mostrado na FIG. 2.

[0183]Inibição do crescimento tumoral foi também determinada. Inibição do crescimento tumoral (TGI) foi medida usando a seguinte fórmula: %TGI = 1-[(Tf-Ti)/média(Cf-Ci)]; %TGI relatada é a média de % TGI para cada tumor tratado. Diferenças estatísticas no volume tumoral foram determinadas usando uma Análise de Variância One-Way bicaudal (ANOVA) seguido por teste de comparações múltiplas de Dunnett comparando grupos tratados com grupo controle 2B8. Trinta percento (30%) de inibição de crescimento de tumor foram alcançados seguindo tratamento com anticorpo anti-SEMA4D, entretanto nenhum efeito relacionado ao tratamento foi observado quando células T CD8+ foram depletadas. Esses resultados mostram que a inibição do crescimento tumoral com anti-SEMA4D foi dependende da presença de células T CD8+ efetoras.

Exemplo 3: Teste da habilidade de um anticorpo anti-SEMA3D para aumen tar a densidade dos Linfócitos Infiltrantes de Tumores (TIL) [0184]Desenho Experimental: Células tumorais Colon26 foram implantadas subcutaneamente no flanco de camundongos Balb/c (5χ10Λ5 células em 0,2 mL de salina). Tratamento com Ig Controle 2B8 ou Ab 67 anti-SEMA4D foi iniciado no dia 2 (50 mg/kg IP, duas vezes por semana, n=10), Tumores foram medidos com calibra-dores 3x/semana começando 3 dias após o implante. Animais foram sacrificados no dia 27, quando o volume tumoral médio do grupo controle alcançou 1000 mm3. Tumores, incluindo circundante de estroma e pele, foram coletados e fixados em formalina por 24 horas, então transferidos para etanol 70%. Amostras foram então processadas por incorporação em parafina, e seções de 5 micron foram cortadas a partir dos blocos resultantes.

[0185]Seções adjacentes foram coradas para Sema4D, CD8 e CD20 usando os seguintes métodos: [0186]a. Para detecção de Sema4D, lâminas foram aquecidas a 60° C por 1 hora, então desparafinizadas e reidratadas através de banhos de xileon e etanol graduado. Recuperação de epítopo foi realizada por fervura por 20 min com Solução de Recuperação de Alvo (Dako, Carpinteria, CA) seguido por 30 min de arrefecimento. Lâminas foram lavadas duas vezes com PBS contendo 0,0% de Tween-20 (TPBS), então peroxidases endógenas foram inativadas com um bloqueio de 10 min com Enzima Bloqueadora Dupla (Dako, Carpinteria, CA). Lâminas foram lavadas com TPBS duas vezes, então ligação não específica foi bloqueada por uma incubação de 20 min com 2,5% de soro de cabra normal em TPBS. Seguindo uma lavagem única com TPBS, lâminas foram incubadsa por 60 min com anti-Sema4d de coelho a 2 pg/mL em TPBS, seguido por 2 lavagens com TPBS. Lâminas foram então incubadas por 20 min com polímero anti-coelho de cabra marcado com Envision HRP (Dako, Carpinteria, CA), seguido por 2 lavagens com TPBS e uma incubação de 5 min com DAB+ (Dako, Carpinteria, CA). Seções foram contracoradas com hematoxi- lina Harris, descoloradas, azuladas com água corrente, desidratadas, e montadas não aquosas com Permount.

[0187]b. CD8 foi detecatado usando o método acima, mas usando um anticorpo policonal de coelho comercial (Abbiotec) a 2 pg/mL.

[0188]c. CD20 foi detectado usando o método acima, mas usando soro de asno normal para bloqueio, e usando um anticorpo primário anti-CD20 de cabra (Santa Cruz) a 1 pg/mL seguido por uma incubação de 20 min com anticorpo anti-cabra marcado com HRP (Golden Bridge).

[0189]d. Lâminas foram fotografadas em um aumento de 20x usando uma câmera Retiga WICAM-12 bit acoplada a um microscópio Olympus Ix50.

[0190]Tratamento anti-SEM4D aumentou a frequência de células imunes in-filtrantes de tumor (TIL). Densidade de células imunes foi medida por seções de es-caneamento do tumor inteiro, quantificando áreas de Linfócitos Infiltrantes de Tumor CD8+ ou CD20+ (TIL), e então normalizando a área total do tumor. Seções a partir de 9 (Ig Controle) ou 10 (Ab 67 anti-SEMA4D) camundongos por grupo foram usados para análise. Significância estatística foi calculada para CD8 e CD20 usando teste T não pareado bicaudal para 95% CI.

[0191]Tratamento de tumores Colon26 com anticorpo 67 anti-SEMA4D resultou em um aumento em ambas, densidade de célula T CD8+ e densidade de células Y CD20+, como comparado ao grupo controle. O aumento na densidade de céluls T CD20+ foi estatisticamente significativo para 95% com um valor de 0,0388. O aumento na densidade das células T CD8+ mostrou uma tendência, mas não significância estatística. Esses achados mostram que o tratamento anti-SEMA4D de tumores Colon26 resultou em frequência aumentada de células imunes infiltrando tumor. Os resultados são mostrados graficamente nas FIGS. 3A e 3B.

[0192]Exemplo 4. Teste da habilidade de um anticorpo anti-SEMA4D para afetar migração e distribuição de subgrupos de macrófago M1 e M2 e células T CD8+ nas extremidades frontais do tumor.

[0193]Tratamento anti-SEMA4d alterou distribuição de macrófago e células T CD8+ na extremindade frontal do tumor. Distribuição de macrófago foi medida por escaneamento de seções do tumor inteiro, quantificando a área de M1 (coloração com Alexa67 conjugado com anti-F4/80 de rato (clone Biolegend BM8) a 2 pg/mL) e M2 (coloração com biotina conjugada com anti-CD206 de rato (Biolegend, clone C068C2) a 2 pg/mL), e então normalizado para a área total do tumor para determinar densidade de M1 e M2 dentro do tumor. Seções de 9 (Ig Controle) ou 10 (Ab 67 anti-SEMA4D) camundongos tratados por grupor foram usadas para análise. Para determinar densidade celular no crescimento tumoral frontal, uma região de largura de 300 pixel (250 micron) foi definida a partir da extremidade do tumor. Significância estatística para M1 e M2 foi calculada usando ANOVA One-Way com pós-teste de Dunn para 95% de CI. Mudança na densidade de macrófago M1 normalizado para extremidade frontal foi significativa.

[0194]Números de célula T CD8+ foram medidos nas seções tumorais inteiras coradas com anticorpo CD8 (Abbiotec Cat#250596 a 1:250) e sistema de detecção DAB. O número de eventos CD8+ nas seções tumorais inteiras foi enumerado após limiar para sinal positivo usando Programa Imagepro. Densidade CD8+ para cada animal foi calculada por divisão do número de eventos CD8+ por área de pixel de tumor inteiro. Médias das densidades CD8 individuais foram feitas para chegar na distribuição de célula T CD8+ nos animais tratados com 2E8 e mAb67 (n=10). Significância estatística foi calculada usando ANOVA One-Way com pós-teste Kruskal-Wallace e Dunn pata 95% CI.

[0195]Distribuição SEMA4D foi medida por escaneamento de seções do tumor inteiro corado para SEMA4D com um anticorpo a um epítopo distinto a partir daquele reconhecido por Ab 67 e análise para distribuição Sema4D. Seções de 9 (Ig Controle) ou 10 (Ab 67 anti-SEMA4D) de camundongos tratados por grupo foram usadas para análise.

[0196]Células tumorais Colon26 expressaram níveis baixos de SEMA4D quando cultivadas in vitro, mas SEMA4D regulado positivamente in vivo na extremidade frontal do tumor. Isto leva ao estabelecimento de um gradiente de expressão de SEMA4D com alta concentração na periferia do tumor. Tratamento com anticorpo anti-SEMA4D neutralizou SEMA4D e rompeu o gradiente de expressão. Isto resultou em uma mudança notável na migração e distribuição de macrófago, como mostrado na FIG. 4A. Em particular, tumores tratados com Ab 67 anti-SEMA4D tiveram níveis mais altos de macrófagos pró-inflamatórios M1+ na extremidade frontal do tumor como mostrado na FIG. 4B. O aumento no macrófago M1+ foi estatisticamente significativo. Tumores tratados com Ab 67 anti-SEMA4D também mostrou uma diminuição na frequência do macrófago M2 pró-tumor na extremindade frontal do tumor como mostrado na FIG. 4C. Esses descobrimentos mostraram que tratamento com Ab 67 anti-SEMA4D alterou distribuição e macrófagos em uma forma que aumentou a densidade de macrófago inibidor de tumro, isto é, M1, na extremidade frontal do tumor enquanto diminui a presença do macrófago promotor de tumor, isto é, M2, na mesma região. Além disso, esses descobrimentos mostraram um aumento geral na densidade de célula T CD8+ dentro de tumores isolados a partir de camundongos tratados com MAb 67, como mostrado na FIG. 4D. Esses decobrimentos sugerem que neutralização de SEMA4D com MAb 67-2 facilita entreda de macrófago M1 antitumor não zona de alta proliferação de células tumorais e células T CD8+ através da zona e extensão na extremidade frontal (inserção).

Exemplo 5: Teste de habilidade de um anticorpo anti-SEMA4D para atrasar o crescimento tumoral em camundongos quando usado na combinação anticorpos anti-CTLA4 [0197]Desenho Experimental: Células tumorais Colon26 5x105 foram implantadas subcutaneamente no flanco de camundongos Balb/c fêmeas. Tratamento com IgG1/2B8 de camundongo controle ou anti-SEMA4D/MAb67-2 foi iniciado 1 dia pós-inoculação (50 mg/kg, IP, semanalmente x5), com ou sem anti-CTLA4/MAb UC10-4F10-11 (100 pg no dia 8 e 50 pg nos dias 11 e 14 pós-inoculação de tumor). Tratamento com anti-PD1/RPM1-14 foi iniciado 1 dia após inoculação (100 pg no dia 3, duas vezes por semana) em combinação com anti-CTLA4/MAb UC10-4F10-11. Foram 20 camundongos por grupo. Tumores foram medidos com calibradores 2x/semana iniciando 5 dias pós-implante. Animais foram sacrificados quando volume de tumor alcançou 1000 mm3.

[0198]Combinação de anticorpos anti-SEMA4D e anti-CTLA4 atrasou crescimento tumoral em camundongos. Crescimento tumoral foi medido por calibradores e medidas foram usadas para calcular volume tumoral usando a fórmula (l2 x c)/2, onde l = largura, medida menor e c = comprimento, em mm, do tumor. Volume médio de tumor e curvas de sobrevivência Kaplan Meier, definidos como tempo de ponto final onde volume do tumor = 1000 mm3, são mostrados nas FIGS. 5A e 5B, respectivamente. Análise estatística foi conduzida usando Análise de Variância Bicaudal (ANOVA) e análise Log Rank, respectivamente, que mostrou um efeito de tratamento estatisticamente significativo com anticorpo anti-SEMA4D (9% de Atraso de Crescimento Tumoral, TGD**) e anticorpo anti-CTLA4 (2% TGD, ns), e um aumento altamente significativo no atraso do crescimento de tumor com a combinação de anticorpos anti-SEMA4D e anti-CTLA4 (TGD máximo, 114%****). As respostas foram duráveis por pelo menos 60 dias.

[0199]A frequência de regressão de tumor no modelo de tumor Colon26 foi também determinada. Regressão é a ausência de tumor palpável, definda por uma medida de tumor <50 mm3 por pelo menos duas medidas consecutivas. Como mostrado na FIG. 5C, combinação de anticorpos anti-SEMA4D e anti-CTLA4 aumenta o número de regressões no modelo de tumor Colon26. Regressões para a terapia de combinação (anticorpos anti-SEMA4D+ antiCTLA4) são estatisticamente significan- tes comparadas a Ig Controle (p<0,0001) e comparadas a monoterapias anti-CTLA4 ou anti-SEMA4D (p=0,0022), como determinado por teste Exato de Fisher. Importantemente, esses achados mostram que a combinação dos anticorpos anti-SEMA4D e anti-CTLA4 foi sinergística: isto é, a combinação foi significativamente mais efetiva, resultando na frequência aumentada de regressões tumorais duráveis, então tratamento com anticorpo anti-SEMA4D sozinho ou com anticorpo anti-CTLA4 sozinho. Além disso, esses resultados demonstram que a combinação de anticorpos anti-SEMA4D e anti-CTLA4 é pelo menos tão efetivo como, ou melhor, que, a combinação de anti-PD1 e anti-CTLA4.

[0200]Foi ainda determinado que tratamento com anticorpo anti-SEMA4D aumenta atividade CTL reativa ao tumor, e também aumenta atividade CTL mediada por anti-CTLA4. Um acompanhamento do estudo foi conduzido para examinar o efeito de monoterapia anti-CTLA, comparado a terapia de combinação anti-CTLA4 e anti-SEMA4D na frequência de leucócitos infiltrantes tumor-específico (TIL) e secreção de citocinas pró-inflamatórias. Neste acompanhamento de estudo, células imunes foram isoladas a partir de tumores e baços de camundongos com tumor Colon26 tratados in vivo com IgG1/MAb2b8 Controle, anti-CTLA4/MabUC10-4F10, ou a combinação de anti-CTLA4/MabUC10-4F10 e anti-SEMA4D/MAb67. Tecidos foram coletados no dia 15, dia 1 pós-dose final de anticorpo anti-CTLA4 e exatamente antes da regressão tumoral. CD45+ TIL total foi avaliada para níveis de citocina secretados, e frequência de células T CD8+ secretoras de IFNg em presença de peptídeo g70 imunodominante específico para tumor Colon26 restrito a MHC-I foi determinada por ELISPOT. A frequência de respondedores específicos para MHCI foi calculada por substração da média do controle a partir de poços contendo peptídeo.

[0201]Como mostrado na FIG. 5D, níveis aumentados de citocina pró-inflamatória IFNg foi observado nos tumores de camundongos tratados com monoterapia de anticorpo anti-CTLA4 (p=0,0135), que foi ainda e significativamente aumen tado seguindo tratamento com a terapia de combinação de anti-CTLA4 e anti-SEMA4D (p=0,0002 comparado ao controle ou monoterapia). Na FIG. 5E, frequência aumentada de IFNg específica para peptídeo secretando respondedores foi observada nos baços de camundongos tratados com anticorpo anti-CTLA4. Este descobrimento foi esperado porque anti-CTLA4 é relatado induzir ativação de célula T na periferia. Terapia de combinação de anti-CTLA4 e anti-SEAM4D não foi encontrada para ainda atividade aumentada no baço. Em contraste, um aumento substancial na frequência de respondedores secretando IFNg peptídeo-específico foi observado em TIL seguindo tratamento com monoterapia anti-CTLA4, que foi ainda e significativamente aumentado seguindo tratamento com terapia de combinação anti-CTLA4 e anti-SEMA4D. Este descobrimento sugere que a adição do tratamento anti-SEMA4D pode significativamente melhorar a atividade de célula T CD8+ tumor-específico em uma forma específica tumoral localizada.

Exemplo 6: Teste da habilidade de um anticorpo anti-SEMA4D para afetar infiltração tumoral de células T CD8+ citotóxicas específicas para tumor [0202]Tratamento com MAb 67-2 aumenta a frequência de TIL específica para tumor e secreção de citocinas pró-inflamatórias. Seguindo quatro semanas de tratamento anti-SEMA4D in vivo, tumores foram dissociados e enriquecidos para células CD45+ por separação magnética. CD45+ TIL, agrupadas de 5 camundon-gos, foram incubadas em presença e ausência de peptídeo tumoral imunodominan-te, AH-1 em várias densidades celulares. Células secretando IFNy foram medidas por ELISPOT; resposta específica ap peptídeo foi determinada por susbtração da média de poços sem peptídeo. Cada amostra foi testada em replicatas de 6 e é plo-tada acima. Significância estatística foi determinada com teste T não paramétrico Mann-Whitney.

[0203]Um aumento em células secretoras de IFNy foi observado em camundongos tratados com MAb 67 ambas, em presença e ausência do peptídeo, como mostrado na FIG. 6A. CD45+ TIL, especialmente células T citotóxicas CD8+ específicas para peptídeo restritas a MHC-I, representa, células efetoras ativas seguindo tratamento com MAb 67-2. FIG. 6B mostra imagens ELISPOT representativas. CD45+ TIL então foram cultivadas ex vivo por 48 horas e avaliadas por secreção de citocina usando análise de CBA. Como mostrado na FIG. 6C, MAb 67-2 promove secreção de citocinas anti-tumor, tais como IFNy e TNFa, em TIL. Significância estatística foi determinada com teste T não paramétrico Mann-Whitney.

[0204]Um estudo de acompanhamento foi conduzido para examinar o efeito do tratamento de MAb 67-2 na frequência de leucócitos infiltrantes de tumor (TIL) específicos para tumor e secreção e citocinas pró-inflamatórias. Neste acompanhamento de estudo, células imunes foram isoladas a partir de tumores de camundon-gos tendo tumor Colon26 tratados in vivo com IgG1/MAb2B8 controle ou anti-SEMA4D/MAb67. TIL CD45+ total foi avaliada para níveis de citocina secretado, e frequência de células T CD8+ secretando IFNg em presença de peptídeo gp70 imu-nodominante específico para tumor Colon 26 restrito a MHC-I foi determinado por ELISPOT. A frequência dos respondedores específicos de MHCI foi calculada por substração da média do controle a partir dos poços contendo peptídeo.

[0205]Como mostrado na FIG. 6D, níveis aumentados de citocinas pró-inflamatórias IFNg e TNFa foram observados em TIL de camundongos tratados com anticorpo anti-SEMA4D. Além disso, como mostrado na FIG. 6E, frequência aumentada de respondedores secretando IFNg específico para peptídeo foi observada TIL de camundongos tratados com anticorpo anti-SEMA4D. Este achado sugere que a adição de tratamento anti-SEMA4D pode significativamente melhorar a atividade de células T CD8+ específica para tumor em uma forma específica para tumor localizado.

[0206]Exemplo 7: Teste da habilidade de um anticorpo anti-SEMA4D para atrasar o crescimento tumoral em camundongos quando usado em combinação com anticorpos anti-PD1.

[0207]Desenho Experimental: 5x105 células de tumor Colon26 foram implantadas subcutaneamente no flanco de camundongos Balb/c fêmeas. Tratamento com IgG1/2B8 de camundongo controle ou anti-SEMA4D/MAb 67-2 foi iniciado 1 dia pós-inoculação (50 mg/kg, IP, semanalmente). Cada grupo de camundongos foi também tratado com ou Ig de rato controle ou anti-PD1/MAbRMP1-14 de rato (100 pg, duas vezes pode semana, X 2 semanas començando em 3 dias pós inoculação do tumor). Tinham 20 camundongos por grupo. Tumores foram medidos com calibradores 3x/semana começando 5 dias após implante. Animais foram sacrificados quando volume de tumor alcançou 1000 mm3.

[0208]Combinaçao de anticorpos anti-SEMA4D e anti-PD1 atrasou o crescimento tumoral em camundongos. Crescimento tumoral foi medido por calibradores e medidas foram usadas para calcular volume tumoral usando a fórmula (l2 x c)/2, onde l = largura, medida menor, e c = comprimento, em mm, do tumor. Média do volume do tumor e curvas de sobrevivência Kaplan Meier, definida com tempo para ponto final onde volume do tumor = 1000 mm3, são mostrados nas FIGS. 7A e 7B, respectivamente. Análise estatístiva foi conduzida usando Análise de Variância Bicau-dal (ANOVA) e análise Log Rank, respectivamente, que mostrou um efeito do tratamento estatisticamente significante com anticorpo anti-SEMA4D combinado com anticoro anti-PD1 em camundongos Balb/c. Esses descobrimentos mostram que a combinação de anticorpos anti-SEMA4D e anti-PD1foi mais efetiva que tratamento com anticorpo anti-SEMA4D ou com anti-PD1 sozinho.

[0209]A frequência de regressões no modelo de tumor Colon26 foi também medida e é mostrada nas FIGS. 7C e 7D. Regressão é a ausência de tumor palpável, definido por uma medid de tumor <50 mm3 por pelo menos duas medidas consecutivas. Combinação de anticorpos anti-SEMA4D e anti-PD1 aumenta o número de regressões no modelo de tumor Colon26. Regressões para a terapia de combina ção (anticorpos aSEMA4D+ α PD1) são estatisticamente significantes comparados aSEMA4D+ α PD1 a Ig controle (p=0,0083) ou um agente único anti-PD-1 (p=0,02), como determinado pelo teste Exato de Fisher.

Exemplo 8: Teste de habilidade de um anticorpo anti-SEMA4D para atrasar o crescimento tumoral em camundongos quando usado em combinação com ciclo-fosfamida [0210]Desenho Experimental. Células tumorais Colon26 5x105 foram implantadas subcutaneamente no flanco de camundongos Balb/c. Tratamento com IgG1/2B8 de camundongo controle ou anti-SEMA4D/MAb 67-2 foi iniciado 1 dia pós-inoculação (50 mg/kg, IP, semanalmente). Tratamento com ciclofosfamida (50 mg/kg, IP) foi administrado nos dias 12 e 20. Tinham 20 camundongos por grupo. Tumores foram medidos com calibradores 3x/semana começando 5 dias após implante. Animais foram sacrificados quando volume de tumor alcançou 1000 mm3.

[0211]Combinação de anticorpos anti-SEMA4D e ciclofosfamida atrasou o crescimento tumoral em camundongos. Crescimento tumoral foi medido por calibra-dores e medidas foram usadas para calcular volume tumoral usando a fórmula (l2 x c)/2, onde l = largura, medida menor, e c = comprimento, em mm, do tumor. Média do volume do tumor, mediana do volume do tumor, e curvas de sobrevivência Kaplan Meier, definida com tempo para ponto final onde volume do tumor = 1000 mm3, são mostrados nas FIGS. 8â, 8B e 8C, respectivamente. Análise estatística foi conduzida usando Análise de Variância Bicaudal (ANOVA) e análise Log Rank, respectivamente, que mostrou um efeito do tratamento estatisticamente significante com anticorpo anti-SEMA4D combinado com ciclofosfamida em camundongos Balb/c.

[0212]Especificamente, os achados mostram um Atraso de Crescimento Tumoral de 232% (TGD) quando anticorpos anti-SEMA4D foram usados em combinação com ciclofosfamida. Este achado foi estatisticamente significante comparado a Ig Controle (p<0,0001), como determinado por análise Mantel Cox Log Rank. Hou ve também um TGD de 3% quando tratamento com anticorpo anti-SEMA4D foi usado sozinho (estatisticamente significante comparado ao Ig controle (p=0,0282)) e um TGD 96% quando tratamento com ciclofosfamida foi usado sozinho (estatisticamente significante comparado ao Ig controle (p<0,0001), como determinado por análise Mantel Cox Log Rank. As respostas foram duráveis por pelo menos 81 dias. Esses achados mostram que a combinação de anticorpos anti-SEMA4D e ciclofosfamida foi mais efetiva em atrasar o crescimento tumoral que tratamento com anticorpo anti-SEMA4D ou ciclofosfamida sozinho.

[0213]A frequência de regressão no modelo de tumor Colo26 foi também medida e mostrada nas FIGS. 8D e 8E. Regressão é a ausência de tumor palpável, definida por uma medida de tumor <50 mm3 por pelomenos duas medidas consecutivas. Combinação de anticorpos anti-SEMA4D e ciclofosfamida aumenta o número de regressões no modelo de tumor Colon26. Regressões para a terapia de combinação (anticorpos aSEMA4D + ciclofosfamida) são estatisticamente significativas comparadas a Ig controle (p<0,003), como determinado por teste Exato de Fisher. Esses dados demonstram eficácia aumentada e resposta para tratamento com ciclofosfa-mida quando combinado com anticoro anti-SEMA4D.

Exemplo 9: Teste da habilidade de um anticoro anti-SEMA4D para atrasar o crescimento tumoral em camundongos quando usado em combinação com anticoros anti-HER2/neu [0214]Desenho Experimental. Células tumorais Tubo.A5 3x104 foram implantadas subcutaneamente na gordura mamária de camundongos Balb/c fêmeas. Tratamento com IgG1/2B8 de camundongo controle ou anti-SEMA4D/MAb 67-2 foi iniciado 7 dias pós-inoculação (50 mg/kg, IP, semanalmente x6). Tratamento com anti-Neu/MAb7.16.4 (200 pg Ip semanalmenteX2, iniciado quando volume tumoral foi aproximadamente 200 mm3, nos dias 21 e 28) Tinham 15 camundongos por grupo. Tumores foram medidos com calibradores 2x/semana começando 11 dias após im plante. Animais foram sacrificados quando volume de tumor alcançou 800 mm3.

[0215]Combinação de anticorpos anti-SEMA4D e anti-HER2/Neu atrasou o crescimento tumoral em camundongos. Crescimento tumoral foi medido por calibra-dores e medidas foram usadas para calcular volume tumoral usando a fórmula (l2 x c)/2, onde l = largura, medida menor, e c = comprimento, em mm, do tumor. Média do volume do tumor, e curvas de sobrevivência Kaplan Meier, definida com tempo para ponto final onde volume do tumor = 800 mm3, são mostrados nas FIGS. 9â e 9B, respectivamente. Análise estatística foi conduzida usando Análise de Variância Bicaudal (ANOVA) e análise Log Rank, respectivamente, que mostrou um efeito do tratamento estatisticamente significante com anticorpo anti-SEMA4D combinado com anticorpo anti-Her2/Neu em camundongos Balb/c. Os achados mostram Atraso de Crescimento de Tumor de 48% quando o anticorpo anti-SEMA4D é usado em combinação com anticorpo anti-Neu e que é estatisticamente significante comparado ao uso de um anticorpo controle irrelevante (p=0,017) ou monoterapia anti-Neu (p=0,006), como determinado por análise Mantel Cox Log Rank.

[0216]A frequência de regressões de tumor no modelo de tumor Tubo foi também medida e é mostrada na FIG. 9C. Regressão é a ausência de tumor palpável, definido como um tumor mensurável < 50 mm3 por pelo menos duas medidas consecutivas. Combinação de anticorpos anti-SEMA4D e anti-Neu aumenta o número de regressões em camundongos tendo Tubo. Regressões para a terapia de combinação (anticorpos aSEMA4D+ aNeu) são estatisticamente significantes para Ig Controle (p=0,016), como determinado por teste Exato de Fisher.

[0217]Exemplo 10: Teste de habilidade de um anticorpo anti-SEMA4D para atrasar o crescimento de modelo de carcinoma mamário in vivo [0218]Desenho Experimental. Células tumorais Tubo.A5 3x104 foram implantadas subcutaneamente na gordura mamária de camundongos Balb/c fêmeas. Tratamento com IgG1/2B8 de camundongo controle ou anti-SEMA4D/MAb 67-2 foi iniciado 6 dias pós-inoculação (50 mg/kg, IP, semanalmente x6). Tinham 20 camundongos por grupo, entretanto, alguns camundongos foram excluídos da análise devido a morte prematura antes de alcançar o ponto final resultante a partir da ulcera-ção ou problema de saúde geral. Tumores foram medidos com calibradores 2x/semana começando 13 dias após implante. Animais foram sacrificados quando volume de tumor alcançou 800 mm3.

[0219]Tratamento com anticorpos anti-SEMA4D atrasou o crescimento tumoral em camundongos. Crescimento tumoral foi medido por calibradores e medidas foram usadas para calcular volume tumoral usando a fórmula (l2 x c)/2, onde l = largura, medida menor, e c = comprimento, em mm, do tumor. Média do volume do tumor, e curvas de sobrevivência Kaplan Meier, definida com tempo para ponto final onde volume do tumor = 800 mm3, são mostrados nas FIGS. 10A e 10 B, respectivamente. Análise estatística foi conduzida usando Análise de Variância Bicaudal (ANOVA) e análise Log Rank, respectivamente, que mostrou um efeito do tratamento estatisticamente significante com anticorpo anti-SEMA4D. Os achados mostram Atraso de Crescimento de Tumor (133%) com tratamento de anticorpo anti-SEMA4D; isto é estatisticamente significante comparado para usar um anticorpo controle irrelevante (p<0,0001), como determinado por análise Mantel Cox Log Rank.

[0220]A frequência de regressões de tumor no modelo de tumor Tubo.A5 foi também medida e é mostrada na FIG. 10C-10E. Regressão é a ausência de tumor palpável, definido como um tumor mensurável < 50 mm3 por pelo menos duas medidas consecutivas. Nos 90 dias pós-implante, 85% (12/14) de camundongos tratados com MAb67 foram regressores livres de tumor e um dos 14 nunca desenvolveram tumor mensurável, comparado a 0/14 regressões nos camundongos tratados com Ig controle. No dia 90, camundongos que tiveram rejeção completa de seus tumores primários (13/14 de camundongos tratados com MAb67) foram desafiadas com Tu bo.A5 viável (30.000) no lado contralateral; camundongos naive foram inclusos como controles para enxerto. Como mostrado na FIG. 10D, todos os 13 camundongos que foram tratados com anti-SEMA4D rejeitaram desafio com tumor subsequente, sugerindo uma resposta de memória imunológica, em contraste aos camundongos naive que não rejeitaram o desafio tumoral como mostrado na FIG. 10E. A frequência de regressão é estatisticamente significante comparada ao Ig controle (p<0,0001), como determinado por teste Exato de Fisher.

Exemplo 11: Efeito do anticorpo anti-SEMA4D na infiltração de célula T e MDSC nos modelos de tumor Tubo.A5.

[0221]Desenho Experimental. Células tumorais Tubo.A5 foram implantadas em camundongos Balb/c singenêicos. Tratamento com Ig controle ou anti-SEMA4D MAb 67 foi iniciado no dia 6 (50 mg/kg, IP, semanalmente). Tumores foram coletados no dia 39, exatamente antes da regressão do tumor. FACS foi feito em frações de célula linfocíticas agrupadas de tumores de 14-21 camundongos/grupo. Média de replicatadas de ensaio é mostrada; significância foi determinada usando o teste T bicaudal.

[0222]Como mostrado nas FIGS. 11A e 11B, terapia de anticorpo anti-SEMA4D aumenta a infiltração de célula T CD3+ e diminui CD11b+Gr1+ MDSC em tumores de camundongos tratados com anti-SEMA4D. Esses dados sugerem um aumento na resposta de célula T anti-tumorigênica e uma diminuição nas células imumossupressoras, tal como MDSC. Esses dados são consistentes com a modulação do balanço imune observado no modelo Colon26.

Exemplo 12: Titulação de dose de MAb67 em Modelos de Tumor Tubo.A5 e Colon 26 [0223]Desenho Experimental para Modelo de Tumor Tubo.A5. 3x104 células de tumor Tubo.A5 foram implantadas subcutaneamente na gordura mamária de ca-mundongos Balb/c fêmeas. Tratamento com IgG1/2B8.1 E7 de camundongo controle (50 mg/kg, IP, semanalmente, x6) ou anti-SEMA4D/MAb 67-2 (1, 10 ou 50 mg/kg, IP, semanalmente x6) foi iniciado 6 dias pós-inoculaç~ao. Tinham 20 camundongos por grupo, entretanto, alguns camundongos foram excluídos da análise devido a morte prematura antes de alcançar o ponto final resultando da ulceração ou problemas de saúde gerais. Tumores foram medidos com calibradores 2x/semana começando 13 dias após o implante. Animais foram sacrificados quando volume do tumor alcançou 800 mm3.

[0224]Desenho Experimental para Modelo de Tumor Colon 26. 5x105 células de tumor Colon26 foram implantadas subcutaneamente no flanco de camundongos Balb/c fêmeas. Tratamento com IgG1/2B8.1E7 de camundongo controle (50 mg/kg, IP, semanalmente, x6) ou anti-SEMA4D/MAb 67-2 (1, 10 ou 50 mg/kg, IP, semanalmente x5) foi iniciado 1 dias pós-inoculação, com ou sem anti-CTLA4-MAb UC10-4F10-11(100 pg ~ 5 mg/kg no dia 8, e 50 pg ~ 2,5 mg/kg nos dias 11 e 14 pós inocu-lação do tumor). Tinham 15 camundongos por grupo. Tumores foram medidos com calibradores 2x/semana começando 5 dias após o implante. Animais foram sacrificados quando volume do tumor alcançou > 1000 mm3.

[0225]Dose Mínima Efetiva é Aproximadamente 3 mg/kg. Tratamento de tumor Tubo.A5 com 50 ou 10 mg/kg de MAb67 resultou em crescimento de tumor atrasado que foi estatisticamente significativo comparado a IgG controle (p<0,0001 e p=0,0015, respectivamente), mas não significativamente diferente a partir de uma outra. Frequências de regressão de 38% (9/24) e 54% (6/13) no tumor Tubo.A5 tratado com 50 ou 10 mg/kg Mab67 foram também significativamente significante (p=0,0069 e p=0,0014). Em contraste, 1 mg/kg MAb67 foi inefectivo e não significativamente atrasou o crescimento tumoral (p=0,01441). Neste modelo, a dose efetiva mínima foi determinada ser entre 1 a 10 mg/kg. Crescimento tumoral foi medido por calibradores e medidas foram usados para calcular o volume tumoral usando a fórmula (l2 x c)/2, onde l = largura, medida menor, e c = comprimento, em mm, do tu mor. Volume de tumor médio e curvas de sobrevivência Kaplan Meier, definido como tempo de ponto final onde o volume tumoral = 800 mm3, são mostrados nas FIGS. 12A e 12B, respectivamente. Análise estatística foi conduzida usando Análise de variância Bicaudal (ANOVA) e análise Log Rank, respectivamente.

[0226]Refinamento adicional da dose MAb67 efetiva foi investigada no modelo Colon26 e foi determinado ser > 3 mg/kg. Tratamento de tumores Colon26 com anti-CTLA4 + anti-SEMA4D resultou em um atraso de crescimento tumoral máximo (119%) comparado a monoterapia anti-CTLA4 quando dose de anti-SEMA4D/MAb 67 foram > 3 mg/kg; em 10 mg/kg MAb67, p=0,0101 e em 3 mg/kg, p=0,571, como comparado a monoterapia anti-CTLA4 e determinado usando análise Mantel Cos Log Rank. Todas as doses entre 3-50 mg/kg não foram significativamente diferentes que uma outra. Em cotraste, quando anti-CTLA4 foi administrado em combinação com 0,3 mg/kg MAb67, a diferença foi estatisticamente diferente que tratamento com 10 mg/kg MAb 67 (p=0,0325) mas foi estatisticamente significante comparado ao tratamento com monoterapia anti-CTLA4 (p=0,4945). Crescimento tumoral foi medido por calibradores e medidas foram usadas para calcular volume tumoral usando a fórmula (l2 x c)/2, onde l = largura, medida menor, e c = comprimento, em mm, do tumor. Volume de tumor médio e curvas de sobrevivência Kaplan Meier, definido como tempo de ponto final onde o volume tumoral = 1000 mm3, são mostrados nas FIGS. 12C e 12D, respectivamente. Análise estatística foi conduzida usando Análise de variância Bicaudal (ANOVA) e análise Log Rank, respectivamente.

Exemplo 13: Efeito de anticorpo anti-SEMA4D no atraso do crescimento tumoral nos Modelos Tumorais Colon26 e Tubo.A5 [0227]Desenho Experimental. FIG. 13 é um resumo de experimentos conduzidos nos Exemplos acima mostrando regressões e crescimento tumorais após novo desafio tumoral nos modelos tumorais Colon26 e Tubo.A5. O desenho experimental dos respectivos experimentos é resumido nos Exemplos acima.

[0228]Terapia de anticorpo anti-SEMA4D resulta em completa e durável regressão tumoral. Como mostrado na FIG. 13, tratamento com terapia de anticorpo anti-SEMA4D resulta em um aumento estatisticamente significante na regressão tumoral quando comparado ao tratamento com IgG1 de camundongo controle em ambos os modelos Colon26 e Tubo.A5, 7% (P < 0.001***) e 85% (P < 0.0001****), respectivamente. Além disso, tratamento com terapia de anticorpo anti-SEMA4D não é significativamente diferente que o tratamento com anti-PD1 sozinho (7% com anti-SEMA4D sozinha, vs. 8% com anti-PD1 sozinha, n.s.), mas é significativamente aumentada usada em combinação com terapia anti-PD1 (28% para terapia de combinação vs. 7% para anti-SEMA4D ou 8% para monoterapia anti-PD1, P<0,0001****). Além disso, tratamento com terapia de anticorpo anti-SEMA4D em combinação com terapia anti-CTLA4 resulta em um aumento estatisticamente significante na regressão tumoral quando comparado ao tratamento com anti-CTLA4 sozinho (74% par terapia de combinação vs. 20% para monoterapia anti-CTLA4, P<0,0001****). Adicionalmente, tratamento com terapia de anticorpo anti-SEMA4D em combinação com terapia anti-CTLA4 resulta em um aumento estatisticamente significante na regressão de tumor quando comparado ao tratamento com anti-SEMA4D em combinação com anti-PD1 (74% para terapia combinação anti-SEMA4D/anti-CTLA4 vs. 60% para terapia de combinação anti-SEMA4D/anti-PD1, P<0,001****). A maior sinergia aparente entre anti-SEMA4D em combinação com anti-CTLA4 como comparado a ati-SEMA4D em combinação com anti-PD1 indica que nem todos os inibidores de bloqueio do ponto de checagem imune são equivalentes neste conceito e que diferenças no mecanismo podem ser associadas com benefício terapêutico diferencial. Finalmente, tratamento com anti-SEMA4D em combinação com ciclofosfamida resulta em um aumento estatisticamente significante na regressão tumoral quando comparado ao tratamento com ciclofosfamida sozinha (40% para terapia de combinação vs. 10% para monoterapia de ciclofosfamida, P <0,01**).

[0229]Muitas modificações e outras modalidades das modalidades reveladas aqui virão a mente a um versado na técnica ao qual esta revelação pertence, tendo o benefício dos ensinamentos apresentados nas descrições acima referidas e aos desenhos associados. Portanto, é para ser entendido que a revelação não é limitada às modalidades específicas reveladas e que modificações e outras modalidades são tencionadas ser inclusas dentro do objetivo das reivindicações em anexo e lista de modalidades aqui reveladas. Embora termos específicos sejam empregados aqui, eles são usados em um senso genérico e descritivo somente e não para propósitos de limitação.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Uso de um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à semaforina-4D (SEMA4D) em combinação com pelo menos uma outra terapia imunomoduladora CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para inibir, atrasar, ou reduzir crescimento tumoral sólido em um indivíduo com câncer, em que o anticorpo anti-SEMA4D ou fragmento do mesmo: (a) compreende uma cadeia pesada variável (VH) compreendendo VHCDRs 1 a 3 definidas pelas SEQ ID NOs: 6, 7 e 8, respectivamente, e uma cadeia leve variável (VL) compreendendo VLCDRs 1 a 3 definidas pelas SEQ ID NOs: 14, 15 e 16, respectivamente; ou (b) compreende uma VH e VL definidas pelas, respectivamente, SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO: 17, ou SEQ ID NO:10 e SEQ ID NO:18; e em que a pelo menos uma outra terapia imunomoduladora compreende um inibidor de bloqueio de ponto de controle imunológico que compreende um anticorpo de proteína 4 associado a linfócitos T anti-citotóxico (CTLA4), um anticorpo de morte celular 1 anti-programada (PD-1), um anticorpo de morte ligando a 1 anti-programada (PD-L1), um anticorpo de ativação de gene 3 anti-linfócito (LAG3), um anticorpo anti-B7-H3, um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, ou uma combinação dos mesmos; ou o modulador regulatório de célula T (Treg) compreende ciclofosfamida; e em que a combinação com a pelo menos uma outra terapia imunomoduladora resulta em eficácia terapêutica melhorada relativa ao anticorpo ou ao fragmento do mesmo ou a terapia imonomoduladora sozinha.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo anti-SEMA4D ou fragmento do mesmo e pelo menos uma terapia imuno-moduladora é: (a) formulado para ser administrado separadamente; ou (b) formulado para ser administrado de forma concomitante.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo tem níveis elevados de células B, células T ou ambas células B e células T na circulação quando comparado a outros pacientes com tumores sólidos.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que: (a) o nível de células B e/ou células T por microlitro de sangue em um indivíduo é 1,5 a 5 vezes o número médio de células B e/ou células T na circulação em outros pacientes com tumores sólidos; e/ou (b) o indivíduo tem níveis de células B e/ou células T que se situam dentro ou acima do intervalo de células B e/ou células T de indivíduos saudáveis.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo anti-SEMA4D ou fragmento do mesmo inibe a interação SEMA4D com seu receptor, em que o receptor é Plexin-B1, Plexin-B2 ou CD72.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo anti-SEMA4D ou fragmento do mesmo inibe a transdução de sinal Plexin-B1 mediada por SEMA4D.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é carcinoma, linfoma, blastoma, sar-coma, câncer de célula escamosa, câncer pulmonar de pequena célula, câncer pulmonar de célula não pequena, adenocarcinoma pulmonar, carcinoma escamoso pulmonar, câncer de peritônio, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer neuroendócrino, glioblastoma, câncer cervical, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer cerebral, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer coloretal, carcinoma endometrial ou uterino, câncer esofágico, carcinoma de glândula salivar, câncer renal, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer de tireoide, câncer de cabeça e pescoço, ou uma combinação dos mesmos.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer expressa Her2 e Plexin B1 ou Plexin B2.

9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é um tumor sólido.