CN110072540B - 用于tusc2免疫治疗的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

治疗患有癌症之对象的方法，其包括施用与免疫检查点抑制剂结合的肿瘤抑制治疗，例如TUSC2治疗。还提供了用于癌症治疗的药盒和药剂。

Description

用于TUSC2免疫治疗的方法和组合物
本申请要求于2016年10月12日提交的美国临时专利申请No.62/407,329的权益，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
1.技术领域
本文提供的本发明实施方案一般性地涉及分子生物学、免疫学和癌症治疗领域。
2.相关领域的描述
随着肿瘤发生的分子和遗传机制得到更好的阐明，癌症治疗的重点已从组织转向遗传水平(Bishop，1991)。癌基因和肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene，TSG)这两大类基因的突变在肿瘤发生过程中起着核心作用。TSG似乎需要纯合缺失或突变以失活，并且TSG表达的恢复在人肿瘤中是可行的(Lowe等，2004；Roth，2006)。肺癌细胞系和原发性肺肿瘤中3p21.3区域的纯合缺失导致从该区域鉴定出多个具有肿瘤抑制活性的基因(Lerman等，2000)。这些缺失已导致了靶向抗癌治疗的发展。然而，尚不清楚如何提高这样的治疗的效力。
发明概述
在第一个实施方案中，提供了治疗患有癌症之对象的方法，其包括施用与免疫检查点抑制剂结合的肿瘤抑制治疗(例如，TUSC2治疗)。因此，提供了用于治疗患有癌症之对象的方法，其中该对象正在用至少一种免疫检查点抑制剂进行治疗(或先前施用了至少一种免疫检查点抑制剂)，该方法包括向所述对象施用肿瘤抑制治疗(例如TUSC2治疗)。例如，用TUSC2治疗进行治疗的对象可以是在施用TUSC2治疗之前少于1小时、6小时、12小时、1天、3天、一周或两周施用免疫检查点抑制剂的对象。本文中使用的TUSC2治疗可以是在癌细胞中提供或导致TUSC2多肽表达的任何类型的治疗(参见，例如，美国专利No.7，902，441，通过引用并入本文)。例如，TUSC2治疗可包括将TUSC2多肽或TUSC2表达载体递送至癌细胞。例如，治疗可通过纳米颗粒递送，或在核酸表达载体的情况下通过使用病毒载体递送。
在某些实施方案中，提供了用于治疗患有癌症之对象的方法，其包括向对象施用与至少一种免疫检查点抑制剂结合的TUSC2治疗。例如，TUSC2治疗可以在至少一种免疫检查点抑制剂之前、之后或基本上与之同时施用。因此，在一些实施方案中，提供了用于治疗癌症的组合物，其包含治疗有效量的TUSC2治疗剂和免疫检查点抑制剂。
在一些方面，至少一种检查点抑制剂选自CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3、KIR或A2aR的抑制剂。在某些方面，至少一种免疫检查点抑制剂是人程序性细胞死亡1(PD-1)轴结合拮抗剂。在一些方面，PD-1轴结合拮抗剂选自PD-1结合拮抗剂、PDL1结合拮抗剂和PDL2结合拮抗剂。在某些方面，PD-1轴结合拮抗剂是PD-1结合拮抗剂。在一些方面，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PDL1和/或PDL2的结合。在一些特定方面，PD-1结合拮抗剂是单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些特定方面，PD-1结合拮抗剂是纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、匹地利珠单抗(pidillizumab)、
Figure BDA0002091966620000021
AMP-514、REGN2810、CT-011、BMS 936559、MPDL328OA或AMP-224。在一些方面，至少一种免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体。在一些特定方面，抗CTLA-4抗体是曲美木单抗(tremelimumab)、/>
Figure BDA0002091966620000022
或伊匹单抗(ipilimumab)。在某些方面，至少一种免疫检查点抑制剂是抗杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer-cell immunoglobulin-likereceptor，KIR)抗体。在一些方面，抗KIR抗体是利鲁单抗(lirilumab)。在某些方面，对象已经或正在施用多于一种免疫检查点抑制剂，例如抗PD1抗体和抗CTLA4抗体。
在某些实施方案中，施用TUSC2治疗包括施用TUSC2表达载体，例如编码TUSC2的DNA质粒。根据本文提供的实施方案使用的表达载体一般性地包含用于表达TUSC2编码序列的控制元件。例如，载体可包含对于在目的癌细胞中表达有效的启动子和增强子元件。在某些方面，例如，TUSC2表达由CMV启动子或其重组形式(例如在美国专利公开No.20070092968中描述的CMV启动子构建体，通过引用并入本文)提供。在某些实施方案中，本文提供的载体包含经修饰的CMV启动子。在某些实施方案中，本文提供的载体包含mini-CMV启动子。可包含另外的表达控制元件，例如内含子、药物响应元件、RNA稳定化或去稳定化序列、细胞定位信号、多腺苷酸化信号序列和/或优化的翻译起始密码子。质粒DNA载体还可包含有助于促进DNA产生的序列，例如，细菌复制起点和/或抗药性标志物。在某些特定方面，TUSC2表达载体是pLJ143/KGB2/FUS1质粒。
用于将表达载体递送至细胞(例如，体内递送)的方法是本领域公知的，并且包括但不限于纳米颗粒(例如，脂质体纳米颗粒)、脂质缀合物和病毒载体。在某些方面，TUSC2表达载体在纳米颗粒中施用，例如N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTAP)：胆固醇脂质体纳米颗粒。技术人员将认识到可以调节脂质体的多种特性以优化载体递送。例如，可以将脂质体调节至具有一定的尺寸范围和/或特定比的DNA与脂质；DNA与胆固醇；或脂质与胆固醇。例如，在DOTAP：胆固醇脂质体的情况下，DOTAP：胆固醇比可以限定为约1.5∶1至1∶1.5，例如约10∶9。在另外的方面，TUSC2表达载体在脂质体纳米颗粒中提供，其中纳米颗粒的平均颗粒尺寸为约50至约500nm(例如，200至500nm)。在另外的方面，TUSC2-纳米颗粒制剂可以通过它们的光密度(optical density，OD)来限定，例如OD400为约0.65至0.95。
在另外的实施方案中，TUSC2治疗可包括施用TUSC2多肽。用于施用TUSC2多肽的方法已在例如美国公开No.20060251726和20090023207中进行描述，其通过引用并入本文。可修饰TUSC2多肽以提高其活性和/或进入癌细胞的能力。例如，可以用脂质部分(例如，经肉豆蔻酰化的)修饰多肽。在某些方面，TUSC2作为纳米颗粒(例如，基于脂质的纳米颗粒)提供，例如超顺磁性纳米颗粒、纳米壳、半导体纳米晶体、量子点、基于聚合物的纳米颗粒、基于硅的纳米颗粒、基于二氧化硅的纳米颗粒、基于金属的纳米颗粒、富勒烯或纳米管。
根据本文提供的实施方案，TUSC2治疗和/或免疫检查点抑制剂通常配制在可药用载体中。根据实施方案的治疗可通过以下途径进行递送：例如静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、表面、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、囊内(intravesicularlly)、经黏膜、心包内、脐内(intraumbilically)、眼内、经口、经表面、局部、通过吸入(例如，气雾剂吸入)、通过注射或通过输注，并且递送途径可以取决于待治疗癌症的类型。例如，与DOTAP：胆固醇脂质体复合的TUSC2表达载体可以通过静脉内输注施用。在某些具体方面，TUSC2治疗以约0.01mg/kg至约0.10mg/kg的剂量，例如约0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09或0.10mg/kg的剂量静脉内施用。在另外的方面，TUSC2治疗可以施用两次或更多次(例如，3、4、5、6、7、8、9或10次)。这样的治疗的剂量之间的时间可以变化，并且可包括但不限于在剂量之间约1、2或3天，约1、2或3周，或者1个月或更长时间。
在另一个实施方案中，提供了用于治疗患有癌症之对象的方法，其包括向对象施用与至少一种免疫检查点抑制剂结合和/或与一种或更多种抗炎剂结合的TUSC2治疗。例如，可在TUSC2治疗之前、之后或期间施用抗炎剂。在另一个方面，施用多于一种抗炎剂，例如施用抗组胺药和皮质类固醇。因此，在某些特定方面，与TUSC2治疗结合使用的抗炎药是苯海拉明和/或地塞米松。
在另外的实施方案中，本文提供的方法还包括施用另外的抗癌治疗。另外的抗癌治疗可以是但不限于手术治疗、化学治疗(例如，施用蛋白激酶抑制剂或EGFR靶向治疗)、放射治疗、冷冻治疗、高热治疗、光治疗、放射消融治疗、激素治疗、免疫治疗、小分子治疗、受体激酶抑制剂治疗、抗血管生成治疗、细胞因子治疗或生物治疗例如单克隆抗体、siRNA、反义寡核苷酸、核酶或基因治疗。不受限制地，生物治疗可以是基因治疗，例如肿瘤抑制基因治疗、细胞死亡蛋白基因治疗、细胞周期调节基因治疗、细胞因子基因治疗、毒素基因治疗、免疫基因治疗、自杀基因治疗、前药基因治疗、抗细胞增殖基因治疗、酶基因治疗或抗血管生成因子基因治疗。
因此，在另一个实施方案中，本文提供了用于治疗患有癌症之对象的组合物、治疗和方法，其包括向对象施用与免疫检查点抑制剂和另外的抗癌剂(例如化学治疗剂)结合的TUSC2治疗(例如，TUSC2多肽或TUSC2表达载体)。例如，化学治疗剂可以是蛋白激酶抑制剂，如Src或Akt激酶抑制剂。在一些方面，化学治疗剂是表皮生长因子受体(epidermal growthfactor receptor，EGFR)抑制剂。
因此，在某些实施方案中，提供了用于治疗患有癌症之对象的方法，其包括向对象施用与至少一种免疫检查点抑制剂和任选地蛋白激酶抑制剂结合的TUSC2治疗。例如，TUSC2治疗和/或免疫检查点抑制剂可以在蛋白激酶抑制剂之前、之后或基本上与之同时施用。因此，在一些实施方案中，提供了用于治疗癌症的组合物，其包含治疗有效量的TUSC2治疗剂、免疫检查点抑制剂和蛋白激酶抑制剂。根据一些实施方案使用的蛋白激酶抑制剂包括但不限于EGFR、VEGFR、AKT、Erb1、Erb2、ErbB、Syk、Bcr-Ab1、JAK、Src、GSK-3、PI3K、Ras、Raf、MAPK、MAPKK、mTOR、c-Kit、eph受体或BRAF抑制剂。例如，蛋白激酶抑制剂可以是阿法替尼(Afatinib)、阿西替尼(Axitinib)、贝伐单抗(Bevacizumab)、博舒替尼(Bosutinib)、西妥昔单抗(Cetuximab)、克唑替尼(Crizotinib)、达沙替尼(Dasatinib)、厄洛替尼(Erlotinib)、福他替尼(Fostamatinib)、吉非替尼(Gefitinib)、伊马替尼(Imatinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、乐伐替尼(Lenvatinib)、木利替尼(Mubritinib)、尼罗替尼(Nilotinib)、帕尼单抗(Panitumumab)、帕唑帕尼(Pazopanib)、哌加他尼(Pegaptanib)、雷珠单抗(Ranibizumab)、鲁索替尼(Ruxolitinib)、塞卡替尼(Saracatinib)、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、凡德他尼(Vandetanib)、AP23451、威罗菲尼(Vemurafenib)、CAL101、PX-866、LY294002、雷帕霉素、替西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)、地磷莫司(ridaforolimus)、阿沃西地(Alvocidib)、金雀异黄素(Genistein)、司美替尼(Selumetinib)、AZD-6244、瓦他拉尼(Vatalanib)、P1446A-05、AG-024322、ZD1839、P276-00、GW572016，或其混合物。在某些方面，蛋白激酶抑制剂是AKT抑制剂(例如，MK-2206、GSK690693、A-443654、VQD-002、米替福新(Miltefosine)或哌立福新(Perifosine))。
根据一些实施方案使用的EGFR靶向治疗包括但不限于EGFR/ErbB1/HER、ErbB2/Neu/HER2、ErbB3/HER3和/或ErbB4/HER4的抑制剂。广泛的这样的抑制剂是已知的并且包括但不限于针对受体具有活性的酪氨酸激酶抑制剂和EGFR结合抗体或适配体。例如，EGFR抑制剂可以是吉非替尼、厄洛替尼、西妥昔单抗、马妥珠单抗(matuzumab)、帕尼单抗、AEE788；CI-1033、HKI-272、HKI-357或EKB-569。在某些实施方案中，本文提供的组合物和治疗全身或局部施用。在一个实施方案中，本文提供的组合物和治疗全身施用。在某些方面，EGFR抑制剂在TUSC2治疗之前、之后或基本上与之同时向患者施用。例如，治疗可共同施用，例如通过静脉内输注共同施用。在某些实施方案中，TUSC2和EGFR抑制剂可以以有效治疗癌症的任意量施用。在某些实施方案中，本文提供的组合物、治疗和方法包括以比单独施用的任一组合物更低的剂量施用TUSC2和EGFR抑制剂。在某些实施方案中，所述组合物、治疗和方法包括以降低副作用的较低剂量施用TUSC2和EGFR抑制剂。在某些实施方案中，组合物、治疗和方法包括以比单独施用的任一组合物所提供的叠加、协作或协同效应更有效的剂量施用TUSC2治疗、免疫检查点抑制剂和EGFR抑制剂。在某些方面，用这样的治疗进行治疗的癌症可以是本文所述的任何癌症，例如肺癌(例如，非小细胞肺癌)。在某些优选的方面，用组合治疗进行治疗的癌症是表达EGFR的癌症。在某些实施方案中，表达EGFR的癌症包含至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％，98％或99％的表达EGFR的肿瘤细胞。
在另一个实施方案中，本文提供了用于治疗患有癌症之对象的方法，其中先前确定癌症表达EGFR，该方法包括向对象施用与免疫检查点抑制剂和EGFR抑制剂结合的TUSC2治疗。在某些实施方案中，本文提供了用于治疗患有癌症之对象的方法，其包括以下步骤：确定癌症是否表达EGFR，并且向对象施用TUSC2、免疫检查点抑制剂和EGFR抑制剂。用于评估癌症的EGFR表达状态的方法已在例如美国专利公开No.20110052570中进行描述，通过引用并入本文。在某些方面，表达EGFR的癌症可以是表达突变EGFR的癌症，例如表达具有L858R和/或T790M突变的EGFR的癌症。在某些实施方案中，向患有表达EGFR的癌症的患者施用本文所提供的组合物和治疗，所述癌症包含至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的表达EGFR的肿瘤细胞。在另外的方面，治疗对象患有先前确定表达EGFR的癌症，并且其中至少10％的癌症细胞是凋亡的。在某些实施方案中，本文提供的方法还包括确定是否至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的表达EGFR的癌细胞是凋亡的。
在某些实施方案中，用于治疗或评估的癌症可表现为肿瘤，例如原发性或转移性肿瘤。癌症可能是早期癌症，或可能是转移性或晚期癌症。在某些方面，癌症是口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、呼吸系统癌(respiratory cancer)、泌尿生殖系统癌(urogenital cancer)、胃肠癌、中枢或周围神经系统组织癌(central or peripheral nervous system tissuecancer)、内分泌或神经内分泌癌(endocrine or neuroendocrine cancer)、造血癌(hematopoietic cancer)、胶质瘤、肉瘤、上皮癌(carcinoma)、淋巴瘤、黑素瘤、纤维瘤、脑膜瘤、脑癌、口咽癌、鼻咽癌、肾癌、胆道癌(biliary cancer)、前列腺癌、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞癌、利-弗劳梅尼瘤(Li-Fraumeni tumor)、甲状腺癌、甲状旁腺癌、垂体瘤、肾上腺瘤、成骨肉瘤肿瘤(osteogenic sarcoma tumor)、I型和II型多发性神经内分泌肿瘤、乳腺癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)或小细胞肺癌(smallcell lung cancer，SCLC))、头颈癌(head&neck cancer)、前列腺癌、食管癌、气管癌、皮肤癌脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。在另外的方面，癌症可被限定为对一种或更多种抗癌治疗具有抗性的癌症，例如抗化学治疗性癌症。例如，癌症可以是对基于铂的化学治疗剂(例如顺铂)具有抗性的癌症。
在上述实施方案的一些方面，施用TUSC2治疗和至少一种免疫检查点抑制剂导致肿瘤中NK和/或CD8+T细胞密度提高。在一些具体方面，CD8+T细胞密度提高至少3倍，例如4、5、6、7、8、9或10倍。在一些方面，施用TUSC2治疗和至少一种免疫检查点抑制剂导致了CcL3、CcL4、CcL21a和/或CcL19血清水平。
在另外的实施方案中，本文提供了包含TUSC2治疗剂和至少一种免疫检查点抑制剂的药盒(kit)。例如，在一些方面，本文提供的药盒包含TUSC2治疗剂、至少一种免疫检查点抑制剂和用于测试对象以确定其对TUSC2治疗剂和/或免疫检查点抑制剂的应答的药剂。例如，用于测试对象以确定其对TUSC2治疗剂的应答的药剂可以是用于确定对象的癌细胞中的凋亡水平的药剂。在另外的方面，药盒还包含一种或更多种抗炎剂或激酶抑制剂。在另外的方面，药盒可包含一种或更多种另外的组件，包括但不限于可药用稀释剂、注射器、输注袋、输注线和/或一套使用该药盒的说明书。
预期本文中所述的任何方法或组合物可以针对本文中所述的任何其他方法或组合物来实施。同样，在用于治疗对象的方法的背景下讨论的本发明实施方案的方面同样适用于预测对象中的应答的方法，并且反之亦然。
当在权利要求和/或说明书中与术语“包括/包含”结合使用时，未用数量词限定的名词可意指“一个/种”，但它也与“一个或更多个/种”、“至少一个/种”或“一个/种或多于一个/种”的含义一致。
如本文中使用的，就指定组分而言的“基本上不含”在本文中用于意指没有指定组分被有目的地配制成组合物和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何非预期的污染导致的特定组分的总量远低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法不能检测到特定组分之量的组合物。
如本文在说明书和权利要求书中所用的，没有数量词修饰的名词可以意指一个/种或更多个/种。如本文在说明书和权利要求书中所用的，当与词语“包含/包括”结合使用时，没有数量词修饰的名词可以意指一个/种或多于一个/种。如本文中使用的，在说明书和权利要求书中，“另一”或“另一个”可意指至少两个或更多个。
如本文在说明书和权利要求中所使用的，术语“约”用于表示这样的值，其包括装置、用于确定该值之方法的固有的误差变化，或者存在于研究对象之间的变化。
从以下详细描述中，本发明的其他目标、特征和优点将变得明显。然而，应当理解，虽然详细描述和具体实例指示了本发明的某些实施方案，但是其仅以举例说明的方式给出，因为根据该详细描述，本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员将变得明显。
附图简述
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过结合本文中给出的具体实施方案的详细描述来参考这些附图中的一个或更多个可以更好地理解本发明。
图1A至1E：通过TUSC2和抗PD1组合治疗发现对CMT167皮下模型的增强的抗肿瘤活性。(A)示出了肿瘤接种、治疗方案和剂量、用于免疫细胞分析的血液和脾收集和用于免疫组织化学的肿瘤收获，以及RNA分离的顺序治疗策略。(B)通过流式细胞术确定CMT167-luc细胞上的PD-L1的表面表达水平。(C)、(D)基于通过IVIS 200的小动物成像产生的肿瘤体积和生物发光强度确定四个不同治疗组(N＝10只小鼠/组)的肿瘤生长曲线。对照组用装载有空(无TUSC2基因)载体的纳米囊泡进行治疗。TUSC2+PD1治疗导致了对肿瘤生长的最强的抑制作用，随后是TUSC2、PD1和对照。(E)具有通过IVIS 200成像采集的生物发光信号的来自每个治疗组的荷瘤小鼠的代表性图像。该数据为四个独立实验的代表。使用SAS中的PROCMIXED程序中的CONTRAST语句来比较治疗组之间的成像强度。使用9.4版本的SAS和8.04版本的S-Plus以执行所有分析的计算。除非另有说明，否则统计以P＜0.05的显著性水平显示。*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001。
图2A至2F：组合的TUSC2和抗PD1上调了自然杀伤和细胞毒性T细胞并下调了调节细胞。TUSC2+抗PD1治疗改变了外周血和脾中的免疫细胞群。对照组用装载有空(无TUSC2基因)载体的纳米囊泡进行治疗。(A)TUSC2对无肿瘤小鼠的NK、T细胞和B细胞的影响。将n＝3只小鼠/组的合并的样品用于流式细胞术分析。基于外源TUSC2表达确定TUSC2纳米囊泡的体内摄取。静脉内注射TUSC2纳米囊泡之后24小时，从脾中分选出4种不同的免疫群体(T细胞、B细胞、NK细胞和Lin阴性细胞)，并进行RT-PCR以确定TUSC2的表达。(B)肿瘤植入第2周时TUSC2和TUSC2+抗PD1治疗对自然杀伤(NK)细胞、T细胞和B细胞的影响。(C)TUSC2治疗改变了MDSC状态。使用以下设门策略确定单核细胞和粒细胞MDSC；CD45+＞CD3-＞MHCII低＞CD11b+＞Gr-1+。CD11b+Gr-l高被认为是粒细胞MDSC，而CD11b+Gr-1低被认为是单核细胞MDSC。数据显示为平均百分比±SD，n＝5。*，P＜0.05；**，P＜0.01；***P＜0.001。(D)治疗对外周血和脾细胞中Treg的影响。T淋巴细胞群的CD4+CD25+双阳性被认为是Treg。数据显示为平均百分比±SD，n＝5，**，P＜0.01；***P＜0.001。(E)PD1、CTLA4和Tim-3在T淋巴细胞上的表面表达。数据显示为CD3+PD1+/CLTA4+/Tim-3+的平均百分比±SD，n＝5；*，P＜0.05；**，P＜0.01；***P＜0.001。(F)TUSC2和抗PD1的治疗效果显示为外周血白细胞中的NK/MDSC细胞以及CD8T效应细胞/Treg细胞的比。数据显示为平均值±SD，n＝5，流式数据的统计分析通过SAS中的PROC GENMOD程序中的一般线性回归模型和CONTRAST语句完成。*，P＜0.05；**，P＜0.01；***P＜0.001。
图3A至3C：与抗PD1组合的TUSC2提高了NK和CD8T细胞的浸润并阻碍了MDSC和Treg的浸润。(A)用装载有空(无TUSC2基因)载体的纳米囊泡(对照)、TUSC2纳米囊泡、抗PD1和TUSC2+抗PDl治疗皮下肿瘤。经福尔马林固定的切除的肿瘤用以下免疫染色：针对活化的NK细胞的抗CD8和抗NKp46；针对MDSC的抗Gr-1、针对Treg的抗Foxp3。使用Vectra自动成像系统拍摄高分辨率图像(20X)，其中对25％的肿瘤区域进行成像。对N＝5个肿瘤切片/组进行成像。通过InForm软件分析每个治疗组大约100个图像以用于H评分。使用一般线性回归模型对治疗组之间的H评分进行统计分析。使用复合对称协方差结构来解释数据的小鼠间的变异性和重复测量性质。使用SAS中PROC MIXED程序中的ESTIMATE语句以比较每对治疗组之间的H评分。*，P＜0.05；**，P＜0.01；***P＜0.001。(B)从来自治疗组的新切除的肿瘤(n＝3个肿瘤/治疗组)中提取RNA，并通过NanoString技术确定趋化因子的基因表达。将数据归一化并通过nCounter分析软件分析表达的倍数变化。将倍数变化与对照样品进行比较。条显示平均倍数变化(n＝3)。(C)显示了由TUSC2治疗诱导的血清中的CCL4和CCL5趋化因子的水平。根据方法中描述的方案用TUSC2治疗皮下荷瘤小鼠。治疗之后10天收集血清并进行luminex多路复用ELISA。使用线性回归模型以比较治疗组之间的趋化因子。使用SAS中PROCMIXED程序中的ESTIMATE语句来比较每对治疗组之间的趋化因子。使用9.4版本的SAS和8.04版本的S-Plus以执行所有分析的计算。数据；平均值±SD；N＝3；***，P＜0.001。
图4A至4F：TUSC2的抗肿瘤活性对产生Th1介导的免疫应答的自然杀伤细胞的依赖性。细胞因子IL-15和IL-18与自然杀伤细胞调节有关。(A)NK细胞的耗竭消除了治疗效力和抗肿瘤免疫应答。肿瘤生物发光强度图显示了来自在NK耗竭和非耗竭小鼠中用TUSC2和组合治疗的肿瘤的信号。每3天注射NK1.1抗体进行5次以耗竭NK细胞。对照组用装载有空(无TUSC2基因)载体的纳米囊泡治疗。*，P＜0.05；**，P＜0.01。(B)肿瘤强度图中显示的受CD8T细胞耗竭的影响的TUSC2+抗PD1治疗的抗肿瘤活性(n＝5只小鼠/组)。(C)治疗之后10天，通过1uminex测定确定NK耗竭和未耗竭小鼠中的IFN-γ和IL-4细胞因子的血清水平，并且条显示为IFN-γ(Th1)和IL-4(Th2)的比。数据显示为平均值±SD，n＝3。*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001；****，P＜0.0001。(D)在NK耗竭和未耗竭小鼠中在治疗之后IL-18和IL-15细胞因子水平的变化。使用Luminex测定测量血清细胞因子。数据显示为平均值pg/ml±SD，n＝3。*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001；****，P＜0.0001。(E)与对照相比，来自用TUSC2治疗的小鼠的分选的NK细胞中IL-15Ra和IL-18R1的倍数表达。数据显示为平均值±SD，n＝3；通过多重t检验确定*P＜0.05；**，P＜0.01。(F)用于比较IL-15Ra和IL-18R1的倍数变化mRNA表达的用TUSC2和TUSC2+PD1治疗的肿瘤的NanoString分析。
图5A至5I：组合的TUSC2和抗PD1治疗显著提高了KRAS-突变体肺转移小鼠模型中的存活并将自然杀伤细胞募集至荷瘤的肺。(A)344SQ-luc细胞用于该实验性转移模型，其具有KrasG12D等位基因并且具有Trp53R172HΔG等位基因的敲入。通过流式细胞术确定PD-L1表达水平，并与CMT167-luc细胞进行比较。(B)示意性显示了检查点阻断(抗PD1和抗CTLA4)和TUSC2的顺序治疗。(C)治疗之后以Kaplan Meier曲线显示存活。静脉内注射344SQ细胞，并且用单独的TUSC2和检查点阻断或其组合治疗小鼠(以组显示)。对照组用装载有空(无TUSC2基因)载体的纳米囊泡治疗并记录存活(n＝10只小鼠/组)。使用单变量Cox模型进行统计分析，以比较治疗组之间的总体存活。在TUSC2+PD1组(左)中观察到最高的存活百分比，随后是TUSC2、PD1和对照。类似地，在TUSC2+PD1+CTL4组(右)中观察到最高的存活百分比，随后是TUSC2、PD1+CTLA4和对照。(D)通过IVIS 200拍摄的荷瘤小鼠的生物发光图像显示出肿瘤细胞的肺特异性定植。治疗组之间显示信号强度水平。显示了三个独立实验的代表。(E)显示肿瘤植入之后两周的肿瘤结节状态的经解剖的肺部图像。(F)(G)(H)&(I)根据方法中描述的方案从来自不同组的转移肺制备单一细胞，并通过流式细胞术确定CD49b+NK细胞、CD4+CD25+Treg、Gr-1+MDSC和PD-L-1以及PD-L2(+)ve白细胞浸润。基于每克肿瘤组织对数据进行归一化。NK细胞根据CD45+CD3-CD19-设门；如下对MDSC进行设门：CD45+＞CD3-＞MHCII低＞CDl1b+＞GR-1+。PD+CT表明抗PD1和抗CTLA4治疗。数据显示为细胞/克组织±SD，n＝5。*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001。使用SAS中的PROC GENMOD程序中的CONTRAST语句来比较流式数据用于统计分析。
图6A至6F：组合的TUSC2和抗PD1治疗改变了肿瘤微环境中的免疫基因表达谱。对来自四个治疗组(空载体纳米囊泡、TUSC2、抗PD1和组合)的12个样品(n＝3/治疗组)进行776个基因的NanoString泛癌免疫组(panel)的基因表达分析。在用于将基因谱进行量化和统计分析之前，将nCounter系统生成的数据归一化。使用阳性对照、持家基因和阴性对照以针对样品制备变化、背景噪音和RNA含量变化进行调节。使用线性模型来评价总体治疗效果，并且使用对照物以进行目的成对比较。使用β-均匀混合物(beta-uniform mixture，BUM)模型对得到的p值进行建模，以确定错误发现率(false discovery rate，FDR)截止值并识别显著差异表达的基因。(A)热图显示治疗组间的总体显著基因。在治疗下33个基因发生显著变化。(B)TUSC2+抗PD1和抗PD1之间的成对比较鉴定了另一组13个基因。火山图显示了通过治疗上调和下调的基因的分离。在统计学上显著的基因以颜色显示。(C)与单一药剂治疗相比，已知用于抗肿瘤免疫应答的所选基因在组合治疗组中高度上调至少2倍。(D)、(E)和(F)显示与对照相比，分别通过TUSC2、抗PD1和组合治疗的CD8、INF-γ和转录因子(Tbx21、Gata3)表达的倍数变化。此处显示的所有基因表达数据均由NanoString技术生成。
图7：显示外周血白细胞和脾细胞的设门策略以确定用于多色流式细胞术测定的免疫亚群。
图8A至8B：NK耗竭抗体(NK1.1)对其他免疫细胞的影响。根据方法中描述的方案，腹膜内注射NK1.1进行5次。最终注射之后3天评价NK耗竭的效率。通过流式细胞术分析脾细胞的T细胞、B细胞和NK细胞。(A)用于分析的设门策略。(B)将N＝3只小鼠样品合并在一起用于进行CD45、CD3、CD19、CD49b抗体染色，并且以条形图显示每个群体的百分比。代表性散点图显示NK耗竭的效率。
图9：CD8T耗竭对其他免疫细胞的影响。根据方法中描述的方案，进行腹膜内注射CD8T细胞耗竭抗体5次。最终注射之后3天评价NK耗竭的效率。通过流式细胞术分析脾细胞的T细胞、B细胞和NK细胞。代表性散点图显示在不影响其他细胞的情况下CD8T细胞耗竭的效率。
图10：肿瘤微环境中的NanoString基因表达分析。PD1和TUSC2+PD1组合治疗之间的成对比较显示出13个显著改变的基因。列出了所有13个基因的P值和倍数变化。使用线性模型来评价总体治疗效果，并且使用对照物以进行目的成对比较。使用β-均匀混合物(BUM)模型对得到的p值进行建模，以确定错误发现率(FDR)截止值并识别显著差异表达的基因。
具体实施方式
癌症的发展涉及控制正常细胞生长的许多细胞通路的失调。健康细胞表达许多肿瘤抑制基因，它们充当分子守门者并阻止不受控制的细胞分裂。因此，癌细胞发展中的重要步骤是破坏肿瘤抑制信号传导通路。鉴于此，癌症治疗的一种有希望的途径涉及在癌细胞中表达肿瘤抑制基因以恢复正常的细胞生长控制。然而，迄今为止还不知道何种类型可能起到提高肿瘤抑制治疗(例如TUSC2治疗)效力的作用。
本专利申请中的研究首次证明，TUSC2治疗在与免疫检查点抑制剂结合施用时特别有效。免疫检查点抑制剂(例如抗PD1治疗)通过提高个体自身的免疫细胞而起作用以抑制肿瘤的生长。相反，用肿瘤抑制剂(例如TUSC2治疗)对肿瘤进行治疗性治疗意味着使癌细胞的转化表型逆转。由于后一种治疗(如果有的话)会使肿瘤细胞“转化更少”并且可能免疫原性更低，因此试图将TUSC2治疗与免疫检查点抑制剂一起使用在之前是与直觉相悖的。尽管如此，在此提出的研究证明，当免疫检查点抑制剂(例如，抗PD1和/或CTLA4)与TUSC2治疗组合时，其抗肿瘤效力实际上显著提高(参见例如，图1)。
具体地，在本研究中，抗PD1在作为具有不同PDL-1表达水平的肺腺癌的同基因小鼠模型的两种Kras突变体(G12V和G12D)中显示出在抑制肿瘤生长和延长存活中的有限效力。然而，当与TUSC2基因恢复相结合时，对肿瘤消退和存活的影响要大得多。TUSC2改变了先天性和适应性免疫细胞群二者。这可以通过循环性NK和CD8+T细胞的显著增加以及源自骨髓的抑制细胞(MDCS)、调节性T细胞(Tregs)、B细胞、T细胞检查点受体PD1和T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)以及包含黏蛋白结构域-3(TIM-3)的减少来证明。通过TUSC2-抗PD1组合诱导了肿瘤浸润性NK和CD8+T细胞的密度。体内耗竭NK或CD8+T细胞分别完全和部分地减轻了组合的效力，表明虽然CD8+T细胞可能有助于TUSC2增强的对抗PD1的敏感性，但这种协同作用需要NK细胞。在TUSC2恢复之后，干扰素下(IFNγ)、白介素15和18(IL15和IL18)的细胞因子水平显著提高，这还通过双重检查点阻断、抗PD1+抗CTLA-4增强存活。基因表达谱分析显示通过TUSC2-抗PD1组合治疗改变了肿瘤微环境。这些数据表明这种新型组合治疗可能是治疗Kras突变体肺腺癌的潜在策略。
因此，本文详述的方法首次提供了通过结合使用免疫检查点抑制剂和肿瘤抑制剂(例如TUSC2治疗)来治疗癌症的有效方法。
I.免疫检查点阻断
术语“免疫检查点”是指免疫系统的组分，所述免疫系统向其组分提供抑制信号以调节免疫反应。已知的免疫检查点蛋白包括CTLA-4、PD-1及其配体PD-L1和PD-L2以及另外的LAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3、KIR。涉及LAG3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3和KIR的通路在本领域中被认为构成类似于CTLA-4和PD-1依赖性通路的免疫检查点通路(参见例如Pardoll，2012，Nature Rev Cancer 12：252-264；Mellman等，2011，Nature 480：480-489)。
术语“PD-1轴结合拮抗剂”是指这样的分子：其抑制PD-1轴结合配偶体(bindingpartner)与其一个或更多个结合配偶体相互作用，以去除由PD-1信号传导轴上的信号传导导致的T细胞功能障碍，结果是恢复或增强T细胞功能(例如，增殖、细胞因子产生、靶细胞杀伤)。术语“PD-1轴”是指PD-1免疫检查点的任何组分(例如，PD-1、PD；-L1和PD-L2)。如本文中使用的，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。
术语“PD-1结合拮抗剂”是指这样的分子，其降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与其一个或更多个结合配偶体(例如PD-L1和/或PD-L2)的相互作用导致的信号转导。PD-1结合拮抗剂可以是抑制PD-1与其一个或更多个结合配偶体的结合的分子。在一个特定方面，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2的结合。例如，PD-1结合拮抗剂包括抗PD-1抗体、其抗原结合片段、免疫黏附蛋白(immunoadhesin)、融合蛋白、寡肽，以及降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与PD-L1和/或PD-L2的相互作用导致的信号转导的其他分子。示例性的PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体。例如，PD-1结合拮抗剂是MDX-1106(纳武单抗)、MK-3475(派姆单抗)、CT-011(匹地利珠单抗)或AMP-224。
术语“PD-L1结合拮抗剂”是指这样的分子，其降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其一个或更多个结合配偶体(例如PD-1或B7-1)相互作用导致的信号转导。例如，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合配偶体的结合的分子。在一个特定方面，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1和/或B7-1的结合。PD-L1结合拮抗剂可包括抗PD-L1抗体、其抗原结合片段、免疫黏附蛋白、融合蛋白、寡肽，以及降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其一个或更多个结合配偶体(例如PD-1或B7-1)的相互作用导致的信号转导的其他分子。例如，PD-L1结合拮抗剂降低了通过PD-L1的负共刺激信号介导的信号传导，所述负共刺激信号由或通过T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导，从而使功能障碍的T细胞的功能障碍降低(例如增强对抗原识别的效应物应答)。在一个实例中，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。抗PD-L1抗体可以是YW243.55.S70、MDX-1105、MPDL3280A或MEDI4736。
术语“PD-L2结合拮抗剂”是指这样的分子，其降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L2与其一个或更多个结合配偶体(例如PD-1)的相互作用导致的信号转导。PD-L2结合拮抗剂可以是抑制PD-L2与其一个或更多个结合配偶体的结合的分子。例如，PD-L2结合拮抗剂抑制PD-L2与PD-1的结合，例如PD-L2拮抗剂，包括抗PD-L2抗体、其抗原结合片段、免疫黏附蛋白、融合蛋白、寡肽，以及降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L2与其一个或更多个结合配偶体(例如PD-1)的相互作用导致的信号转导的其他分子。
“免疫检查点抑制剂”是指抑制免疫检查点蛋白的功能的任何化合物。抑制包括功能降低和完全阻断。特别地，免疫检查点蛋白是人免疫检查点蛋白。因此免疫检查点蛋白抑制剂特别地是人免疫检查点蛋白的抑制剂。
因此，本公开内容提供了通过施用肿瘤抑制剂(例如TUSC2治疗)来提高免疫检查点阻断的效力的方法。如上所述，免疫检查点调高信号(例如，共刺激分子)或调低信号。可通过免疫检查点阻断而被靶向的抑制性免疫检查点分子包括腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(也被称为CD276)、B和T淋巴细胞弱化子(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也被称为CD152)、吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、程序性死亡蛋白1(PD-1)、T-细胞免疫球蛋白结构域和黏蛋白结构域3(TIM-3)和T细胞活化的V结构域Ig抑制物(VISTA)。特别地，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。
免疫检查点抑制剂可以是药物，例如小分子、重组形式的配体或受体，或者是抗体，例如人抗体(例如，国际专利公开No.WO2015016718；Pardoll，Nat Rev Cancer，12(4)：252-64，2012；二者均通过引用并入本文)。可使用已知的免疫检查点蛋白的抑制剂或其类似物，特别是可使用嵌合的、人源化或人形式的抗体。如技术人员将知晓的，替代和/或等同名称可用于本公开内容中提及的某些抗体。在本发明的上下文中，这样的替代和/或等同名称是可互换的。例如，已知，lambrolizumab也以替代和等同名称MK-3475和派姆单抗为人所知。
预期可使用本领域已知刺激免疫应答的任何免疫检查点抑制剂。这包括直接或间接刺激或增强抗原特异性T淋巴细胞的抑制剂。这些免疫检查点抑制剂包括但不限于靶向涉及PD-L2、LAG3、BTLA、B7H4和TIM3的免疫检查点蛋白和途径的药剂。例如，本领域已知的LAG3抑制剂包括可溶性LAG3(WO2009044273中公开的IMP321或LAG3-Ig，通过引用并入本文)以及阻断人LAG3的小鼠或人源化抗体(例如，WO2008132601中公开的IMP701，通过引用并入本文)或阻断人LAG3的完全人抗体(例如EP 2320940中公开的，通过引用并入本文)。通过使用针对BTLA的阻断剂提供了另一个实例，包括但不限于阻断人BTLA与其配体相互作用的抗体(例如WO2011014438中公开的4C7，通过引用并入本文)。通过使用中和B7H4的药剂提供了另一个实例，包括但不限于针对人B7H4(WO2013025779和WO2013067492中公开的，各自通过引用并入本文)或可溶性重组形式的B7H4(例如US20120177645中公开的，通过引用并入本文)的抗体。通过中和B7-H3的药剂提供了另一个实例，包括但不限于中和人B7-H3的抗体(例如US 20120294796中作为BRCA84D公开的MGA271及衍生物，通过引用并入本文)。通过靶向TIM3的药剂提供了另一个实例，包括但不限于靶向人TIM3的抗体(例如，如WO2013006490A2中公开的，或者由Jones等，J Exp Med.2008；205(12)：2763-79公开的抗人TIM3阻断抗体F38-2E2，各自通过引用并入本文)。
A.PD-1轴拮抗剂
T细胞功能障碍或无反应性与抑制性受体程序性死亡1多肽(PD-1)的诱导且持续表达同时发生。因此，本文中提供了PD-1和通过与PD-1相互作用来发信号的其他分子(例如程序性死亡配体1(PD-L1)和程序性死亡配体2(PD-L2))的治疗性靶向。PD-L1在许多癌症中过表达并且常常与不良预后有关(Okazaki T等，Intern.Immun.20O719(7)：813)。因此，通过抑制PD-L1/PD-1相互作用与施用肿瘤抑制剂(例如TUSC2治疗)结合改进了治疗癌症的方法。
例如，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂、PDL1结合拮抗剂和PDL2结合拮抗剂。“PD-1”的替代名称包括CD279和SLEB2。“PDL1”的替代名称包括B7-H1、B7-4、CD274和B7-H。“PDL2”的替代名称包括B7-DC、Btdc和CD273。在一些实施方案中，PD-1、PDL1和PDL2是人PD-1、PDL1和PDL2。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在一个具体方面，PD-1配体结合配偶体是PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面，PDL1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PDL2结合拮抗剂是抑制PDL2与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面，PDL2结合配偶体是PD-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫黏附蛋白、融合蛋白或寡肽。示例性抗体描述于美国专利No.US8735553、US8354509和US8008449中，所有均通过引用并入本文。用于本文中提供的方法的其他PD-1轴拮抗剂在本领域中是已知的，例如美国专利申请No.US20140294898、US2014022021和US20110008369中所述，所有均通过引用并入本文。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自纳武单抗、派姆单抗和CT-011。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是免疫黏附蛋白(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PDL1或PDL2的胞外或PD-1结合部分的免疫黏附蛋白)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。纳武单抗，也被称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和
Figure BDA0002091966620000171
是WO2006/121168中描述的抗PD-1抗体。派姆单抗，也被称为MK-3475、Merck 3475、lambrolizumab、/>
Figure BDA0002091966620000172
和SCH-900475，是WO2009/114335中描述的抗PD-1抗体。CT-011，也被称为hBAT或hBAT-1，是WO2009/101611中描述的抗PD-1抗体。AMP-224，也被称为B7-DCIg，是WO2010/027827和WO2011/066342中描述的PDL2-Fc融合可溶性受体。另外的PD-1结合拮抗剂包括匹地利珠单抗，其也被称为CT-011；MEDI0680，其也被称为AMP-514；和REGN2810。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-L1拮抗剂，例如杜伐单抗(Durvalumab)，其也被称为MEDI4736；阿特珠单抗(atezolizumab)，其也被称为MPDL3280A；或阿维单抗(avelumab)，其也被称为MSB00010118C。在某些方面，免疫检查点抑制剂是PD-L2拮抗剂，例如rHIgM12B7。在一些方面，免疫检查点抑制剂是LAG-3拮抗剂，例如但不限于IMP321和BMS-986016。免疫检查点抑制剂可以是腺苷A2a受体(A2aR)拮抗剂，例如PBF-509。
在一些实施方案中，本文中所述的抗体(例如抗PD-1抗体、抗PDL1抗体或抗PDL2抗体)还包含人或鼠恒定区。在另一个方面，人恒定区选自IgG1、IgG2、IgG2、IgG3和IgG4。在另一个具体方面，人恒定区是IgG1。在另一个方面，鼠恒定区选自IgG1、IgG2A、IgG2B和IgG3。在另一个具体方面，抗体具有降低的或最小的效应物功能。在另一个具体方面，最小效应物功能由原核细胞中的产生引起。在另一个具体方面，最小效应物功能由“更少效应物的Fc突变”或无糖基化引起。
因此，本文中使用的抗体可以是无糖基化的。抗体的糖基化通常是N-连接或O-连接的。“N-连接的”是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸)是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的酶促连接的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中的任一种的存在产生潜在的糖基化位点。“O-连接的糖基化”是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一个与羟基氨基酸的连接，所述羟基氨基酸最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。通过改变氨基酸序列使得上述三肽序列(用于N-连接的糖基化位点)中的一个被去除，来方便地完成从抗体中去除糖基化位点。改变可通过用另外的氨基酸残基(例如，甘氨酸、丙氨酸或保守替换)替换糖基化位点中的天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸残基来进行。
抗体或其抗原结合片段可使用本领域已知的方法例如通过包括以下的过程来制备：在适于产生前述抗PDL1、抗PD-1或抗PDL2抗体或抗原结合片段的条件下培养包含适于表达的形式的核酸的宿主细胞，所述核酸编码任何前述抗PDL1、抗PD-1或抗PDL2抗体或抗原结合片段，以及回收所述抗体或片段。
B.CTLA-4
可以在本文中提供的方法中被靶向的另外的免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也被称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列的Genbank登记号为L15006。CTLA-4在T细胞表面上被发现并且当与抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时充当“关闭”开关。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员，其在辅助T细胞的表面上表达并向T细胞传递抑制信号。CTLA4与T细胞共刺激蛋白CD28类似，并且这两种分子均与抗原呈递细胞上的CD80和CD86(也分别被称为B7-1和B7-2)结合。CTLA4向T细胞传递抑制信号，而CD28传递刺激信号。胞内CTLA4还在调节性T细胞中被发现并且可能对其功能很重要。通过T细胞受体和CD28的T细胞活化导致CTLA-4(B7分子的抑制性受体)的表达提高。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附蛋白、融合蛋白或寡肽。
可以使用本领域公知的方法来产生适用于本发明方法的抗人CTLA-4抗体(或来源于其的VH和/或VL结构域)。或者，可以使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。例如，公开于以下的抗CTLA-4抗体可用于本文公开的方法中：US 8,119,129、WO 01/14424、WO 98/42752；WO00/37504(CP675,206，也被称为曲美木单抗；原为替西木单抗(ticilimumab))、美国专利No.6,207,156；Hurwitz等，1998。每个上述公开物的教导在此通过引用并入。也可以使用与任何这些本领域公认的抗体竞争与CTLA-4的结合的抗体。例如，人源化CTLA-4抗体描述于国际专利申请No.WO2001014424、WO2000037504和美国专利No.US8017114中；全部通过引用并入本文。
示例性的抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(也被称为10D1、MDX-010、MDX-101和
Figure BDA0002091966620000191
)或其抗原结合片段和变体(参见例如WO01/14424)。在另外的实施方案中，抗体包含伊匹单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，抗体包含伊匹单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及伊匹单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，抗体竞争与CTLA-4上的与上述抗体相同的表位的结合，和/或者与CTLA-4上的与上述抗体相同的表位结合。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹单抗具有至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。
用于调节CTLA-4的其他分子包括可溶性CTLA-4配体和受体(例如美国专利No.US5844905、US5885796和国际专利申请No.WO1995001994和WO1998042752中所述；所有均通过引用并入本文)和免疫黏附蛋白(例如美国专利US8329867中所述，通过引用并入本文)。
C.杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)
用于本公开内容的另外的免疫检查点抑制剂是抗KIR抗体。可以使用本领域公知的方法来产生适用于本发明方法的抗人KIR抗体(或来源于其的VH/VL结构域)。
或者，可以使用本领域公认的抗KIR抗体。抗KIR抗体可以与多种抑制性KIR受体交叉反应并增强具有这些受体中的一种或更多种的NK细胞的细胞毒性。例如，抗KIR抗体可与KIR2D2DLl、KIR2DL2和KIR2DL3中的每个结合，并且通过降低、中和和/或逆转由任何或所有这些KIR介导的NK细胞细胞毒性的抑制来增强NK细胞活性。在一些方面，抗KIR抗体不结合KIR2DS4和/或KIR2DS3。例如，可以使用单克隆抗体1-7F9(也被称为IPH2101)、14F1、1-6F1和1-6F5，其描述于WO 2006/003179中，其教导在此通过引用并入。还可以使用与任何这些本领域公认的抗体竞争与KIR结合的抗体。可以使用的其他本领域公认的抗KIR抗体包括，例如，WO 2005/003168、WO 2005/009465、WO 2006/072625、WO 2006/072626、WO 2007/042573、WO 2008/084106、WO 2010/065939、WO 2012/071411和WO 2012/160448中公开的那些，所有均通过引用并入本文。
示例性的抗KIR抗体是利鲁单抗(也被称为BMS-986015或IPH2102)。在另外的实施方案中，抗KIR抗体包含利鲁单抗的重链和轻链互补决定区(complementaritydetermining region，CDR)或可变区(variable region，VR)。因此，在一个实施方案中，抗体包含利鲁单抗的重链可变(VH)区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及利鲁单抗的轻链可变(VL)区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，抗体与利鲁单抗具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性。
II.肿瘤抑制治疗
在某些方面，涉及用于将核酸或多肽递送至细胞的组合物和方法。特别是，本文提供了纳米颗粒-核酸或纳米颗粒-多肽复合物以及向对象施用这样的复合物的方法。复合物包含与纳米颗粒缔合的TUSC2多肽和/或核酸。本文中使用的“缔合”意指物理缔合、化学缔合或二者。例如，缔合可以涉及共价键、疏水性相互作用、包封、表面吸附等。
多肽和核酸通常难以穿过细胞膜。两种类型的分子均包含带电残基，其阻碍膜结合和膜向细胞的运输。本发明实施方案通过提供促进细胞摄取的纳米颗粒复合物克服了这一困难。
根据本发明实施方案，多肽和/或核酸可以与纳米颗粒缔合以形成纳米颗粒复合物。在一些实施方案中，纳米颗粒是脂质体或其他基于脂质的纳米颗粒，例如基于脂质的囊泡(例如，DOTAP：胆固醇囊泡)。如在癌症治疗中所使用的，脂质体利用癌症新血管系统中增多的窗状孔(fenestration)来提高肿瘤部位处的脂质体浓度。
在另外的实施方案中，纳米颗粒是非脂质纳米颗粒，例如基于氧化铁的超顺磁性纳米颗粒。直径为约10nm至100nm的超顺磁性纳米颗粒足够小以避免被脾隔离(sequester)，但足够大以避免被肝清除。该尺寸的颗粒可以渗透非常小的毛细血管并且可以有效地分布在身体组织中。可使用超顺磁性纳米颗粒复合物作为MRI造影剂来鉴定和跟踪那些摄取治疗复合物的细胞。在某些实施方案中，纳米颗粒是半导体纳米晶体或半导体量子点，其二者均可以用于光学成像。在另外的实施方案中，纳米颗粒可以是在二氧化硅核芯之上包含金层的纳米壳。纳米壳的一个优点是可以使用标准化学来使多肽或核酸与金层缀合。在另外的实施方案中，纳米颗粒可以是富勒烯或纳米管(Gupta等，2005)。
根据本发明实施方案，纳米颗粒复合物可以靶向特定组织和细胞。这可以通过使细胞靶向部分与纳米颗粒缀合来实现。靶向部分可以是，但不限于，蛋白质、肽、脂质、类固醇、糖、碳水化合物或合成化合物。细胞靶向部分(例如配体)识别其在细胞表面上的同源受体并与之结合。类似地，抗体可以通过识别其在细胞表面上的同源抗原而发挥细胞靶向部分的作用。在某些实施方案中，本文提供的靶向纳米颗粒复合物可以增强疾病治疗的特异性并提高进入靶细胞的治疗剂的量。
A.纳米颗粒
本文中使用的术语“纳米颗粒”是指尺寸为1nm至1,000nm的任何材料。在一些实施方案中，纳米颗粒的尺寸为50nm至500nm。在本发明实施方案中使用的纳米颗粒包括这样的纳米级材料，例如基于脂质的纳米颗粒、超顺磁性纳米颗粒、纳米壳、半导体纳米晶体、量子点、基于聚合物的纳米颗粒、基于硅的纳米颗粒、基于二氧化硅的纳米颗粒、基于金属的纳米颗粒、富勒烯和纳米管(Ferrari，2005)。多肽或核酸与纳米颗粒的缀合为结构提供了靶向递送、受控释放、增强细胞摄取和胞内运输以及体外和体内治疗肽的分子成像的潜在应用(West，2004；Stayton等，2000；Ballou等，2004；Frangioni，2003；Dubertret等，2002；Michalet等，2005；Dwarakanath等，2004)。
1.基于脂质的纳米颗粒
基于脂质的纳米颗粒包含脂质体、脂质制剂和基于脂质的囊泡(例如，DOTAP：胆固醇囊泡)。基于脂质的纳米颗粒可以是带正电荷、带负电荷或中性的。在某些实施方案中，基于脂质的纳米颗粒是带中性电荷的(例如，DOPC脂质体)。
“脂质体”是通用术语，包括通过产生封闭的脂双层或脂质聚集体形成的多种单层和多层脂质载体。脂质体可表征为具有囊泡结构，所述囊泡结构具有通常包含磷脂的双层膜，和通常包含水性组合物的内部介质。本文提供的脂质体包括单层脂质体，多层脂质体和多囊脂质体。本文提供的脂质体可带正电荷、带负电荷或带中性电荷。在某些实施方案中，脂质体是电荷中性的。
多层脂质体具有由水性介质分隔的多个脂质层。它们在包含磷脂的脂质悬浮在过量的水溶液中时自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自身重排并包载脂双层之间的水和溶解的溶质(Ghosh和Bachhawat，1991)。亲脂性分子或具有亲脂性区域的分子也可溶解在脂双层中或与脂双层缔合。
在一些具体方面，多肽或核酸可例如包封在脂质体的水性内部、散布在脂质体的脂双层内、通过与脂质体和多肽/核酸二者缔合的连接分子与脂质体连接、包埋在脂质体中、与脂质体复合等。
如本领域普通技术人员已知的，根据本发明实施方案使用的脂质体可以通过不同方法制备。例如，将磷脂(Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL)，例如如中性磷脂二油酰基磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine，DOPC)溶解在叔丁醇中。然后将脂质与多肽、核酸和/或其他组分混合。将吐温20添加到脂质混合物中，使得吐温20为组合物重量的约5％。向该混合物中添加过量的叔丁醇，使得叔丁醇的体积为至少95％。涡旋混合物，在干冰/丙酮浴中冷冻并冻干过夜。冻干制剂被储存在-20℃，并可以使用长达三个月。当需要时，将冻干脂质体在0.9％盐水中重构。
或者，脂质体可以通过将脂质在容器(例如玻璃、梨形烧瓶)中的溶剂中混合来制备。容器的体积应比预期的脂质体混悬液的体积大十倍。使用旋转蒸发器，在负压下在约40℃下去除溶剂。溶剂通常在约5分钟至2小时内去除，取决于所期望的脂质体体积。组合物可以在真空干燥器中进一步干燥。干燥的脂质通常由于随着时间的推移趋于恶化而在约1周后丢弃。
干燥的脂质可以在无菌且无热原的水中在约25mM至50mM磷脂下通过摇动直至所有脂质膜重新悬浮而水合。然后可将水性脂质体分成等分试样，将每个放置于小瓶中，冻干并在真空下密封。
如上所述制备的干燥脂质或冻干脂质体可脱水并在蛋白质或肽的溶液中重构，并用合适的溶剂(例如DPBS)稀释至合适的浓度。然后将混合物在涡旋混合器中剧烈摇动。通过在29,000g下离心去除未包封的其他材料(例如包括但不限于激素、药物、核酸构建体等的试剂)，并洗涤脂质体颗粒。将经洗涤的脂质体以合适的总磷脂浓度重新悬浮，例如约50mM至200mM。包封的其他材料或活性剂的量可以根据标准方法确定。在确定包封在脂质体制剂中的其他材料或活性剂的量之后，可将脂质体稀释至合适的浓度并储存在4℃直至使用。包含脂质体的药物组合物通常包含无菌可药用载体或稀释剂，例如水或盐水溶液。
在另外的替代方法中，脂质体可以根据其他已知的实验室程序制备(例如，参见Bangham等，1965；Gregoriadis，1979；Deamer和Uster，1983；Szoka和Papahadjopoulos，1978，各自在相关部分通过引用并入本文)。对于本发明实施方案有用的其他脂质体包括阳离子脂质体，例如，如WO02/100435A1、美国专利5,962,016、美国申请2004/0208921、WO03/015757A1、WO04029213A2、美国专利5,030,453和美国专利6,680,068中所述，其所有均在没有放弃权利要求的情况下通过引用整体并入本文。制造脂质体的方法也描述于WO04/002453A1中。中性脂质可以并入阳离子脂质体中(例如，Farhood等，1995)。可用于某些实施方案的多种中性脂质体在美国专利5,855,911中公开，其通过引用并入本文。这些方法的各自包载水性物质的能力和它们各自的水性空间-脂质比不同。
脂质体的尺寸根据合成方法而变化。本发明实施方案中的脂质体可以是多种尺寸。在某些实施方案中，脂质体是小的，例如，外径小于约100nm、约90nm、约80nm、约70nm、约60nm或小于约50nm。例如，一般来说，在核酸并入之前，根据本发明实施方案使用的DOTAP：胆固醇脂质体包含约50nm至500nm的尺寸。这样的脂质体制剂还可以通过颗粒电荷(ζ电位)和/或光密度(OD)来限定。例如，DOTAP：胆固醇脂质体制剂在核酸并入之前通常包含小于0.45的OD400。同样地，溶液中这样的颗粒的总电荷可以通过约50mV至80mV的ζ电位来限定。
在制备这样的脂质体中，可以使用本文所述的，或者如本领域普通技术人员已知的任何方案。制备脂质体的另外的非限制性实例描述于美国专利4,728,578、4,728,575、4,737,323、4,533,254、4,162,282、4,310,505和4,921,706；国际申请PCT/US85/01161和PCT/US89/05040；英国专利申请GB 2193095A；Mayer等，1986；Hope等，1985；Mayhew等，1987；Mayhew等，1984；Cheng等，1987；和Liposome Technology，1984，各自通过引用并入本文)。
在某些实施方案中，基于脂质的纳米颗粒是中性脂质体(例如，DOPC脂质体)。本文中使用的“中性脂质体”或“不带电荷的脂质体”被限定为具有一种或更多种脂质组分的脂质体，所述脂质组分产生基本上中性的净电荷(基本上不带电荷)。“基本上中性”或“基本上不带电荷”意指给定群体(例如，脂质体群体)中的少数(如果有的话)脂质组分包含未被另一组分的相反电荷消除的电荷(即，少于10％的组分包含未消除的电荷，更优选少于5％，最优选少于1％)。在某些实施方案中，中性脂质体可以主要包含在生理条件下(即，在约pH 7下)本身是中性的脂质和/或磷脂。
本发明实施方案的脂质体和/或基于脂质的纳米颗粒可包含磷脂。在某些实施方案中，单种磷脂可用于产生脂质体(例如，中性磷脂(例如DOPC)，可用于产生中性脂质体)。在另外的实施方案中，可使用多于一种的磷脂来产生脂质体。
磷脂包括，例如，磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺；因为磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱在生理条件下(即，在约pH 7下)是不带电荷的，所以这些化合物可特别用于产生中性脂质体。在某些实施方案中，磷脂DOPC用于产生不带电荷的脂质体。在某些实施方案中，可使用非磷脂(例如胆固醇)的脂质。
磷脂包括甘油磷脂和某些鞘脂。磷脂包括但不限于二油酰基磷脂酰胆碱(“DOPC”)、卵磷脂酰胆碱(“EPC”)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(“DLPC”)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(“DMPC”)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(“DPPC”)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(“DSPC”)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(“MPPC”)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(“PMPC”)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(“PSPC”)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(“SPPC”)、二月桂酰基磷脂酰甘油(“DLPG”)、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(“DMPG”)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(“DPPG”)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(“DSPG”)、二硬脂酰基鞘磷脂(“DSSP”)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(“DSPE”)、二油酰基磷脂酰甘油(“DOPG”)、二肉豆蔻酰基磷脂酸(“DMPA”)、二棕榈酰基磷脂酸(“DPPA”)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(“DMPE”)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(“DPPE”)、二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸(“DMPS”)、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(“DPPS”)、脑磷脂酰丝氨酸(“BPS”)、脑鞘磷脂(“BSP”)、二棕榈酰基鞘磷脂(“DPSP”)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(“DMPC”)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(“DAPC”)、1，2-二花生酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(“DBPC”)、1，2-二十二碳烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(“DEPC”)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(“DOPE”)、棕榈酰氧基磷脂酰胆碱(“POPC”)、棕榈酰氧基磷脂酰乙醇胺(“POPE”)、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺和二亚油酰基磷脂酰胆碱。
磷脂可以来自天然或合成来源。然而，在某些实施方案中，不使用来自天然来源的磷脂(例如卵磷脂酰胆碱或大豆磷脂酰胆碱、脑磷脂酸、脑或植物磷脂酰肌醇，心脏心磷脂和植物磷脂酰乙醇胺或细菌磷脂酰乙醇胺)作为主要磷脂(即，构成总磷脂组成的50％或更多)，因为这可能导致所得脂质体的不稳定性和渗漏。
2.DOTAP：胆固醇纳米颗粒
在某些实施方案中，基于脂质的囊泡是DOTAP：胆固醇纳米颗粒。DOTAP：胆固醇纳米颗粒是通过将阳离子脂质DOTAP(1，2-双(油酰氧基)-3-(三甲基氨基)-丙烷)与胆固醇混合来制备的。用DNA制备的囊泡可以形成结构(被称为“夹心(sandwich)”)，其中DNA似乎在两个脂双层之间浓缩(美国专利6,770,291和6,413,544)。
DOTAP：胆固醇-核酸复合物可以如以下非限制性实施例中那样制备。如前所述(美国专利6,770,291和6,413,544；Templeton，1997)合成DOTAP：胆固醇(DC)纳米颗粒(尺寸为50nm至500nm)。简言之，测量420mgDOTAP和208mg胆固醇并与30ml氯仿混合在一起。然后使混合物在旋转蒸发器上干燥30分钟并冷冻干燥15分钟。将干燥的混合物在30mlD5W中通过在50℃下涡旋45分钟和在37℃下涡旋10分钟进行重构。将混合物进行低频超声5分钟以形成脂质体。然后将DOTAP：胆固醇脂质体加热至50℃并依次通过1.0、0.45、0.2和0.1μm无菌Whatman过滤器过滤。将合成的纳米颗粒储存在4℃下并用于制备纳米颗粒复合物。配制的DOTAP：胆固醇脂质体应均匀分散，其中颗粒尺寸为50nm至250nm，OD400小于0.45，ζ电位为50mV至80mV。剩余的CHCl3水平应低于60ppm。
为了制备DOTAP：胆固醇-核酸纳米颗粒，将240μl脂质体(参见上文)在室温下在360μl D5W中稀释。向混合物添加DNA(约5mg/ml)至总体积为600μl。将混合物在移液管中上下移动以混合。一旦沉降，混合物的OD400应为0.65至0.95，颗粒尺寸应为200nm至500nm，并被确认为革兰氏染色阴性。将脂质体复合物储存在3℃至28℃并尽可能少地搅拌。
B.靶向纳米颗粒
通过添加配体来实现靶向递送而不影响纳米颗粒递送其有效载荷的能力。可以预期，这将使得能够递送至特定的细胞、组织和器官。基于配体的递送系统的靶向特异性基于配体受体在不同的细胞类型上的分布。靶向配体可非共价地或共价地与纳米颗粒缔合，并且可以通过如本文所讨论的多种方法与纳米颗粒缀合。
可用于靶向纳米颗粒的蛋白质或肽的实例包括转铁蛋白、乳铁蛋白、TGF-α、神经生长因子、白蛋白、HIV Tat肽、RGD肽和胰岛素以及其他(Gupta等，2005；Ferrari，2005)。
C.TUSC2表达载体
术语“载体(vector)”用于指载体核酸分子，其中可以插入核酸序列以引入到其可以在此进行复制的细胞中。核酸序列可以是“外源的”，这意味着其对于引入载体的细胞是外来的，或者该序列与细胞中的序列同源但在宿主细胞核酸内该序列通常不存在的位置中。载体包括质粒、黏粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如，YAC)。本领域技术人员将能够通过标准重组技术构建载体(参见例如Maniatis等，1989和Ausubel等，1994，二者均通过引用并入本文)。
术语“表达载体”是指包含编码能够被转录的RNA的核酸的任何类型的遗传构建体。在一些情况下，随后将RNA分子翻译为蛋白质、多肽或肽。在另外的情况下，这些序列例如在反义分子或核酶的产生中不翻译。表达载体可包含多种“控制序列”，其是指在特定的宿主细胞中可操作地连接的编码序列之转录和可能的翻译所必需的核酸序列。除了控制转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体还可包含用于其他功能的核酸序列，并且在下文中描述。
在某些实施方案中，本文提供了核酸TUSC2编码序列的用途。例如，这样的载体可以用于在对象体内重组产生TUSC2多肽和/或用于在对象体内表达TUSC2。考虑到数种不同的密码子编码单一氨基酸的能力，在序列仍然编码相同的蛋白质或多肽的同时，可对序列进行修饰。密码子选择的优化也可以根据用于重组表达的特定生物体进行，或者可以针对人细胞(例如癌细胞)中的最大表达进行优化。根据本发明实施方案使用的载体另外包含控制基因表达和/或有助于载体生产和纯化的元件。
1.启动子和增强子
“启动子”是控制序列，其是控制转录的起始和速率的核酸序列的区域。其可包含调节蛋白和分子(例如RNA聚合酶和其他转录因子)可与之结合的遗传元件，以启动核酸序列的特异性转录。短语“可操作地定位”，“可操作地连接”、“在控制下”和“在转录控制下”意指启动子处于相对于核酸序列的正确的功能位置和/或取向以控制该序列的转录起始和/或表达。
启动子通常包含用于定位RNA合成的起始位点的序列。其最为人知的实例是TATA盒，但在一些缺少TATA盒的启动子(例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子)中，覆盖起始位点的离散元件本身有助于确定起始位置。另外的启动子元件调节转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30至110bp的区域，尽管已经显示许多启动子也包含在起始位点下游的功能元件。为了使编码序列“在启动子的控制下”，将转录阅读框的转录起始位点的5’端定位于所选择的启动子的“下游”(即3’)。“上游”启动子刺激DNA的转录并促进编码的RNA的表达。
启动子元件之间的间隔通常是灵活的，使得当元件相对于彼此倒转或移动时保持启动子功能。在tk启动子中，在活性开始下降之前启动子元件之间的间隔可以提高到50bp。取决于启动子，似乎各个元件可以协作地或独立地发挥功能来激活转录。启动子可与或可不与“增强子”结合使用，“增强子”是指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调控序列。
启动子可与核酸序列天然相关，如可通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5’非编码序列获得的。这样的启动子可以被称为“内源”或“同源”。类似地，增强子可与核酸序列自然缔合、位于该序列的上游或下游。或者，通过将编码核酸区段置于重组或异源启动子的控制下将获得某些优点，所述启动子是指在其天然环境中通常不与核酸序列相缔合的启动子。重组或异源增强子也是指在其天然环境中通常不与核酸序列相缔合的增强子。这样的启动子或增强子可包括病毒启动子和增强子，例如CMV启动子。
当然，重要的是使用有效指导DNA区段在选择用于表达的细胞器、细胞、组织、器官或生物体中表达的启动子和/或增强子。分子生物学领域的技术人员通常知晓启动子、增强子和细胞类型组合用于蛋白质表达的用途(参见例如Sambrook等，1989，通过引用并入本文)。所使用的启动子可以是组成型、组织特异性、诱导型和/或在合适的条件下可用于指导引入的DNA区段的高水平表达，例如有利于大规模生产重组蛋白和/或肽。启动子可为异源的或内源的。
此外，还可以使用任何启动子/增强子组合(根据例如真核启动子数据库EPDB，WWW.epd.isb-sib.ch/)来驱动表达。使用T3、T7或SP6胞质表达系统是另一个可能的实施方案。如果提供合适的细菌聚合酶作为递送复合物的一部分或作为另外的遗传表达构建体，真核细胞可以支持来自某些细菌启动子的胞质转录。
2.翻译起始信号
编码序列的有效翻译也可需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子或邻近序列。可能需要提供包含ATG起始密码子的外源翻译控制信号。本领域普通技术人员将能够容易地对此进行确定并提供必需的信号。公知的是起始密码子必须与期望编码序列的阅读框“同框(in-frame)”，以确保整个插入片段的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。通过包含合适的转录增强子元件可增强表达效率。
3.多克隆位点
载体可包含多克隆位点(MCS)，多克隆位点是包含多个限制酶位点的核酸区域，所述限制酶位点中的任何一个可以与标准重组技术结合用于消化载体(参见例如Carbonelli等，1999，Levenson等，1998，和Cocea，1997，通过引用并入本文)。“限制酶消化”是指用仅在核酸分子中的特定位置发挥功能的酶对核酸分子进行催化切割。这些限制酶中的许多是市售的。这样的酶的使用是本领域技术人员广泛理解的。通常，使用在MCS内切割的限制性酶将载体线性化或片段化，以使外源序列能够连接至载体。“连接”是指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，所述两个核酸片段可彼此连续或可不连续。涉及限制酶和连接反应的技术是重组技术领域的技术人员公知的。
4.剪接位点
大多数转录的真核生物RNA分子将经历RNA剪接以从初级转录物去除内含子。包含基因组真核序列的载体可能需要供体和/或受体剪接位点以确保对转录物的正确加工用于蛋白质表达(参见例如Chandler等，1997，通过引用并入本文)。包含这样的剪接位点还可以通过避免所得RNA转录物的无义介导的衰变来增强表达。
5.终止信号
本发明实施方案的载体或构建体将通常包含至少一种终止信号。“终止信号”或“终止子”由通过RNA聚合酶参与RNA转录物的特异性终止的DNA序列构成。因此，在某些实施方案中，预期了结束RNA转录物产生的终止信号。终止子可能是在体内达到理想信使水平所必需的。
预期用于本发明实施方案的终止子包括本文所述或本领域普通技术人员已知的任何已知的转录终止子，包括但不限于例如基因的终止序列，例如牛生长激素终止子或病毒终止序列，例如如SV40终止子。在某些实施方案中，终止信号可能缺少可转录或可翻译的序列，例如由于序列截短。6.多腺苷酸化信号
在表达，特别是在真核生物表达中，通常将包含多腺苷酸化信号以实现转录物的合适的多腺苷酸化。多腺苷酸化信号的性质并不被认为是成功实践本发明实施方案的关键，并且可采用任意这样的序列。一些优选的实施方案包括SV40多腺苷酸化信号或牛生长激素多腺苷酸化信号，其是方便的且已知在多种靶细胞中良好地起作用。多腺苷酸化可提高转录物的稳定性或可促进胞质运输。
7.复制起点
为了在宿主细胞中使载体增殖，其可包含一个或更多个复制起始位点(通常被称为“ori”)，所述位点是复制在此处起始的特异性核酸序列。或者，如果宿主细胞是酵母，则可以使用自主复制序列(ARS)。
8.选择性和筛选性标志物
在某些实施方案中，可通过在表达载体中包含标志物来体外或体内鉴定包含本文提供的核酸构建体的细胞。这样的标志物会赋予细胞以可鉴定变化，从而允许容易地鉴定包含表达载体的细胞。通常，选择性标志物是赋予允许选择之特性的标志物。阳性选择性标志物是其中标志物的存在允许其选择的标志物，而阴性选择性标志物是其中标志物的存在阻止其选择的标志物。阳性选择性标志物的实例是抗药性标志物。
通常包含药物选择标志物有助于转化体的克隆和鉴定，例如赋予针对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素(zeocin)和组氨醇之抗性的基因是有用的选择性标志物。除了赋予允许基于条件实施来区分转化体之表型的标志物之外，还预期了其他类型的标志物，包括筛选性标志物，例如GFP，其基础是比色分析。或者，可利用筛选性酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还知晓如何使用免疫标志物，可能与FACS分析结合。认为所使用的标志物不重要，只要其能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择性标志物和筛选性标志物的另外的实例是本领域技术人员公知的。
9.质粒载体
在某些实施方案中，预期质粒载体用于转化宿主细胞。一般来说，包含来源于与宿主细胞相容的物种之复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主一起使用。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。在一个非限制性实例中，通常使用来源于大肠杆菌物种的质粒pBR322的衍生物转化大肠杆菌。pBR322包含氨苄青霉素和抗四环素抗性基因，因此提供了鉴定转化细胞的简便方法。pBR质粒或其他微生物质粒或噬菌体还必须包含或经修饰以包含例如可被微生物生物体用于表达其自身蛋白质的启动子。
此外，包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可以用作与这些宿主相关的转化载体。例如，噬菌体λGEMTM-11可用于制备可以用于转化宿主细胞的重组噬菌体载体，例如大肠杆菌LE392。
另外的有用的质粒载体包括pIN载体(Inouye等，1985)；和pGEX载体，用于产生谷胱甘肽S转移酶(GST)可溶性融合蛋白，用于后期的纯化和分离或切割。其他合适的融合蛋白是具有β-半乳糖苷酶、泛素等的融合蛋白。
包含表达载体的细菌宿主细胞(例如大肠杆菌)在许多合适的培养基中的任一种中生长(例如LB)。如本领域技术人员所理解的，通过使宿主细胞与对某些启动子具有特异性的试剂接触，例如通过向培养基添加IPTG或通过将孵育温度转换到更高的温度，可诱导重组蛋白在某些载体中的表达。在将细菌培养另外一段时间之后(一般为2至24小时)，通过离心收集细胞并洗涤以去除剩余的培养基。
10.病毒载体
某些病毒通过受体介导的胞吞感染细胞或进入细胞，和整合到宿主细胞基因组中并稳定且有效地表达病毒基因的能力使其成为将外来核酸转移到细胞(例如，哺乳动物细胞)中的有吸引力的候选者。因此可利用编码和表达TUSC2的病毒。以下描述了可用于递送TUSC2核酸的病毒载体的非限制性实例。
腺病毒载体。一种用于递送核酸的特殊方法涉及使用腺病毒表达载体。虽然已知腺病毒载体整合到基因组DNA中的能力低，但是该特征被这些载体提供的高效率基因转移所抵消。“腺病毒表达载体”意指包括包含足以(a)支持构建体包装和(b)最终表达在其中克隆的组织特异性或细胞特异性构建体之腺病毒序列的那些构建体。遗传组织或腺病毒(36kb的线性双链DNA病毒)的知识允许将大片腺病毒DNA替换为多至7kb的外来序列(Grunhaus和Horwitz，1992)。
AAV载体。可使用腺病毒辅助转染将核酸引入细胞中。已经在使用腺病毒偶联系统的细胞系统中报道了提高的转染效率(Kelleher和Vos，1994；Cotten等，1992；Curiel，1994)。腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)具有高整合频率并且它可以感染非分裂细胞，因此使其可用于将基因递送至哺乳动物细胞中(例如，递送至组织培养物中(Muzyczka，1992)或体内)。AAV具有广泛的宿主感染范围(Tratschin等，1984；Laughlin等，1986；Lebkowski等，1988；McLaughlin等，1988)。关于rAAV载体的产生和用途的细节描述于美国专利5,139,941和4,797,368，各自通过引用并入本文。
逆转录病毒载体。逆转录病毒有能力将它们的基因整合到宿主基因组中，转移大量的外来遗传物质，感染广谱的物种和细胞类型，并被包装在特殊的细胞系中(Miller，1992)。为了构建逆转录病毒载体，将核酸(例如，编码目的蛋白质的核酸)代替某些病毒序列而插入到病毒基因组中以产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒粒子，构建了包含gag、pol和env基因但无LTR以及包装组分的包装细胞系(Mann等，1983)。当将包含cDNA与逆转录病毒LTR和包装序列的重组质粒引入特殊细胞系(例如如通过磷酸钙沉淀)中时，包装序列允许重组质粒的RNA转录物被包装成病毒颗粒，然后所述病毒颗粒分泌到培养基中(Nicolas和Rubinstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。然后收集包含重组逆转录病毒的培养基，任选地浓缩并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染多种细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂(Paskind等，1975)。
慢病毒是复杂的逆转录病毒，其除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env之外还包含具有调节或结构功能的其他基因。慢病毒载体是本领域公知的(参见，例如，Naldini等，1996；Zufferey等，1997；Blomer等，1997；美国专利6,013,516和5,994,136)。慢病毒的一些实例包括人免疫缺陷病毒：HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。通过对HIV毒力基因进行多次减毒(例如，缺失基因env、vif、vpr、vpu和nef)产生慢病毒载体，使得载体在生物学上是安全的。
其他病毒载体。其他病毒载体可用作本发明实施方案中的疫苗构建体。可使用来源于以下病毒的载体，例如痘苗病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、辛德毕斯病毒(sindbis virus)、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒。它们为数种哺乳动物细胞提供了数个有吸引力的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。
经修饰的病毒。待传递的核酸可容纳在已经被工程化以表达特异性结合配体的感染性病毒中。因此病毒颗粒将与靶细胞的同源受体特异性地结合并将内容物递送至细胞。基于逆转录病毒的化学修饰通过将乳糖残基化学添加到病毒包膜中而开发了旨在允许逆转录病毒载体的特异性靶向的新方法。这种修饰可以允许通过唾液酸糖蛋白受体的肝细胞的特异性感染。
设计了靶向重组逆转录病毒的另外的方法，其中使用了针对逆转录病毒包膜蛋白和针对特定细胞受体的生物素化抗体。抗体通过使用链霉抗生物素蛋白经由生物素组分偶联(Roux等，1989)。使用针对主要组织相容性复合体I类和II类抗原的抗体，其证明了在体外用同向性病毒感染多种带有这些表面抗原的人细胞(Roux等，1989)。
III.药物制剂
本文提供的药物组合物包含有效量的一种或更多种TUSC2治疗剂和/或免疫检查点抑制剂，以及任选地，溶解或分散在可药用载体中的另外的药剂。短语“可药用或药理学上可接受的”是指当适当地向动物(例如如人)施用时不产生不利的、变应性或其他不良反应的分子实体和组合物。制备至少包含TUSC2核酸、肽或纳米颗粒复合物或者另外的活性成分的药物组合物将根据本公开内容为技术人员所知，如Remington′s PharmaceuticalSciences，第18版.Mack Printing Company，1990所举例说明的，通过引用并入本文。此外，对于动物(例如，人)施用，应当理解，制剂应符合FDA生物标准办公室(FDA Office ofBiological Standards)所要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。
本文中所使用的“可药用载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延迟剂、盐类、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶剂、黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、芳香剂、染料、类似物质及其组合，如本领域普通技术人员所知(参见，例如，Remington's PharmaceuticalSciences，第18版.Mack Printing Company，1990，第1289-1329页，通过引用并入本文)。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则预期其在治疗性组合物或药物组合物中的使用。
在某些实施方案中，药物组合物可包含不同类型的载体，这取决于其是以固体、液体或气雾剂形式施用，以及对于例如注射的施用途径是否需要是无菌的。在某些实施方案中，本文提供的药物组合物可通过静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、表面、瘤内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、囊内、经黏膜、心包内、脐内、眼内、经口、经表面、局部、吸入(例如，气雾剂吸入)、注射、输注、连续输注、直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、以乳膏剂、以脂质组合物(例如，脂质体)，或通过本领域普通技术人员已知其他方法或前述的任意组合进行施用(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版.Mack Printing Company，1990，通过引用并入本文)。
在某些实施方案中，腹膜内施用药物组合物。在另外的实施方案中，腹膜内施用药物组合物以治疗癌症(例如，癌性肿瘤)。例如，可腹膜内施用药物组合物以治疗胃肠道癌。在某些实施方案中，可能期望将药物组合物施用到肿瘤中或肿瘤附近。
在某些优选的实施方案中，经口施用药物组合物以治疗癌症(例如，胃肠道癌)。
在某些实施方案中，向患者施用的组合物的实际剂量可以由物理和生理因素来确定，所述因素例如体重、病症的严重程度、所治疗疾病的类型、先前或同时治疗干预、患者的特发病和施用途径。在任何事件下，负责施用的医疗人员将确定组合物中活性成分的浓度和用于个体对象的合适剂量。
在某些实施方案中，药物组合物可包含例如至少约0.1％的活性化合物。在另外的实施方案中，活性化合物可包含单位重量的约2％至约75％，或例如约25％至约60％，以及从中可推论出的任何范围。在另外的非限制性实施例中，剂量还可包含每次施用约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约15微克/kg/体重、约20微克/kg/体重、约25微克/kg/体重、约30微克/kg/体重、约35微克/kg/体重、约0.04毫克/kg/体重、约0.05毫克/kg/体重、约0.06毫克/kg/体重、约0.07毫克/kg/体重、约0.08毫克/kg/体重、约0.09毫克/kg/体重、约0.1毫克/kg/体重、约0.2毫克/kg/体重、至约0.5mg/kg/体重或更多，以及从中可推论出的任何范围。可从本文中所列数字推论出之范围的非限制性实例中，基于上述数量，可以施用约0.01mg/kg/体重至约0.1mg/kg/体重、约0.04微克/kg/体重至约0.08毫克/kg/体重。
在任何情况下，组合物可包含多种抗氧化剂以延迟一种或更多种组分的氧化。另外，防止微生物作用可通过防腐剂(例如多种抗细菌剂和抗真菌剂)来实现，包括但不限于对羟基苯甲酸酯类(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。
可将一种或更多种肽、纳米颗粒复合物或另外的药剂配制成游离碱、中性或盐形式的组合物。可药用盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的盐，或与无机酸(例如如盐酸或磷酸)形成的盐，或与有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的盐。与游离羧基形成的盐也可来源于无机碱，例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物；或有机碱例如异丙胺、三甲胺、组胺或普鲁卡因。
在其中组合物为液体形式的一些实施方案中，载体可以是溶剂或分散介质，包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、脂质(例如，甘油三酯、植物油、脂质体)及其组合。合适的流动性可以例如通过以下方法来保持：使用例如卵磷脂的涂层；通过在载体(例如液体多元醇或脂质)中分散来维持所需的颗粒尺寸；使用表面活性剂，例如如羟丙基纤维素；或此类方法的组合。在许多情况下，优选包含等张剂，例如如糖、氯化钠或其组合。
在另外的实施方案中，可以在本发明实施方案中使用滴眼剂、鼻用溶液或喷雾剂、气雾剂或吸入剂。通常将这样的组合物设计成与靶组织类型相容。在一个非限制性实例中，鼻用溶液通常是设计为以滴剂或喷雾剂施用于鼻部通道的水性溶液。制备鼻用溶液使得它们在许多方面类似于鼻分泌物，从而维持正常的纤毛作用。因此，在一些优选的实施方案中，水性鼻用溶液通常是等张的或略微缓冲的，以维持约5.5至约6.5的pH。此外，如果需要，可在制剂中包含抗微生物防腐剂(其类似于眼用制剂中使用的那些)、药物或合适的药物稳定剂。例如，多种市售鼻用制剂是已知的并且包含例如抗生素或抗组胺药的药物。
在某些实施方案中，制备一种或更多种多肽、核酸或纳米颗粒复合物用于通过经口摄入等途径施用。在这些实施方案中，固体组合物可包含例如溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂(例如硬壳或软壳明胶胶囊剂)、持续释放制剂、含服组合物、锭剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、晶片剂，或其组合。经口组合物可直接并入饮食的食物中。用于经口施用的优选载体包括惰性稀释剂、可同化的食用载体或其组合。在另外的方面，经口组合物可制备成糖浆剂或酏剂。糖浆剂或酏剂，并且可包含例如至少一种活性剂、甜味剂、防腐剂、芳香剂、染料、防腐剂，或其组合。
在某些优选的实施方案中，经口组合物可包含一种或更多种黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、芳香剂，及其组合。在某些实施方案中，组合物可包含以下中的一种或更多种：黏合剂，例如如黄蓍胶(gum tragacanth)、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶，或其组合；赋形剂，例如磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁，或其组合；崩解剂，例如如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸或其组合；润滑剂，例如如硬脂酸镁；甜味剂，例如如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；芳香剂，例如如薄荷、冬青油、樱桃芳香剂、橙子芳香剂等；或前述物质其的组合。当剂量单位形式是胶囊时，其除了上述类型的材料之外可包含载体(例如液体载体)。多种其他材料可作为涂层存在或以其他方式改变剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可用虫胶(shellac)、糖或二者涂层。
适用于其他施用方式的另外的制剂包括栓剂。栓剂是具有多种重量和形状的固体剂型，通常包含药物，用于插入直肠、阴道或尿道。插入之后，栓剂软化，融化或溶解在腔液中。一般来说，对于栓剂，传统载体可包括，例如聚亚烷基二醇、甘油三酯或其组合。在某些实施方案中，栓剂可由包含例如约0.5％至10％，并且优选约1％至约2％的活性成分的混合物形成。
通过将所需量的活性化合物并入到具有上文所列的多种其他成分的合适的溶剂中，随后无菌过滤来制备无菌可注射溶液。通常，通过将多种经灭菌活性成分并入包含基本分散介质(basic dispersion medium)和/或其他成分的无菌载体中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、混悬剂或乳剂的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，这由其经先前无菌过滤的液体介质产生活性成分加任何另外期望成分的粉末。如果必要的话，液体介质应被合适地缓冲，并且在用足够的盐水或葡萄糖注射之前先用液体稀释剂实现等张。还预期了用于直接注射的高度浓缩组合物的制剂，其中预期使用DMSO作为溶剂以实现极其迅速的渗透，从而使高浓度的活性剂递送至小区域。
组合物在制造和储存条件下必须稳定，并且防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。将理解，内毒素污染应在安全水平下保持最低，例如小于0.5ng/mg蛋白质。
在一些特定的实施方案中，通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如如单硬脂酸铝、明胶或其组合)，可以实现可注射组合物的延长吸收。
IV.组合治疗
为了提高本发明实施方案的核酸、多肽或纳米颗粒复合物的有效性，可期望将这些组合物与有效治疗目的疾病的其他药剂组合。
作为非限制性实例，可使用本发明实施方案的TUSC2治疗剂和/或免疫检查点抑制剂以及其他抗癌剂来实现癌症的治疗。“抗癌”剂能够负面地影响对象中的癌症，例如通过杀伤癌细胞、诱导癌细胞的凋亡、降低癌细胞的生长速率、降低转移的发生率或数量、降低肿瘤尺寸、抑制肿瘤生长、降低向肿瘤或癌细胞的血液供应、促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答、预防或抑制癌症的进展或提高患有癌症之对象的寿命。更一般地，这些其他组合物将以有效杀伤或抑制细胞增殖的组合量提供。该过程可涉及使细胞与抗癌肽或纳米颗粒复合物和药剂或更多种因子同时接触。这可通过使细胞与包含两种药剂的单一组合物或药理学制剂接触或者通过使细胞与两种不同的组合物或制剂同时接触来实现，其中一种组合物包含抗癌肽或纳米颗粒复合物而另一种包含第二药剂。在一些特定的实施方案中，抗癌肽可以是一种药剂，并且抗癌纳米颗粒复合物可以是其他药剂。
用抗癌肽或纳米颗粒-复合物的治疗可以在其他药剂治疗之前或之后进行，间隔为数分钟至数周。在其中其他药剂和抗癌肽或纳米颗粒复合物分别施加于细胞的实施方案中，通常将确保在每次递送的时间之间的有效时段没有超出，以使得药剂和抗癌肽或纳米颗粒复合物仍然能够对细胞发挥有利的组合作用。在这样的情况下，预期可在彼此约12至24小时内并且更优选地在彼此约6至12小时内使细胞与这两种形式接触。在一些情况下，可期望显著延长治疗的时间段，其中在各次施用之间间隔数天(例如，2、3、4、5、6或7天)至数周(例如，1、2、3、4、5、6、7或8周)。
同样，在某些方面，TUSC2治疗与免疫检查点抑制剂结合施用。可使用多种组合，其中TUSC2治疗是“A”并且免疫检查点抑制剂是“B”：
Figure BDA0002091966620000361
在某些实施方案中，向对象施用本发明实施方案的TUSC2治疗和/或免疫检查点抑制剂将遵循用于施用化学治疗剂的一般方案，同时考虑到载体的毒性(如果有的话)。预计可按需要重复治疗周期。还预期可将多种标准治疗以及手术干预与所述的过度增殖细胞治疗结合使用。
a.化学治疗
癌症治疗还包括多种组合治疗。在一些方面，实施方案的TUSC2治疗剂和/或免疫检查点抑制剂与化学治疗剂结合施用(或配制)。例如，在一些方面，化学治疗剂是蛋白激酶抑制剂，例如EGFR、VEGFR、AKT、Erb1、Erb2、ErbB、Syk、Bcr-Abl、JAK、Src、GSK-3、PI3K、Ras、Raf、MAPK、MAPKK、mTOR、c-Kit、eph受体或BRAF抑制剂。蛋白激酶抑制剂的非限制性实例包括阿法替尼、阿西替尼、贝伐单抗、博舒替尼、西妥昔单抗、克唑替尼、达沙替尼、厄洛替尼、福他替尼(Fostamatinib)、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、乐伐替尼、木利替尼、尼洛替尼、帕尼单抗、帕唑帕尼、哌加他尼、兰尼单抗、鲁索替尼、塞卡替尼、索拉非尼、舒尼替尼、曲妥珠单抗、凡德他尼、AP23451、维莫非尼、MK-2206、GSK690693、A-443654、VQD-002、米替福新、哌立福辛、CAL101、PX-866、LY294002、雷帕霉素、坦罗莫司、依维莫司、地磷莫司、Alvocidib、金雀异黄素、司美替尼、AZD-6244、瓦他拉尼、P1446A-05、AG-024322、ZD1839、P276-00、GW572016或其混合物。
另外的组合化学治疗包括例如：烷化剂类，例如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯类，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷类，例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三甲蜜胺；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛和布拉他辛酮)；喜树碱类(包括合成的类似物拓扑替康)；苔藓虫素(bryostatin)；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素；倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；五加素；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇类；海绵抑制素；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，例如烯二炔类抗生素(例如，加利车霉素，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1；达因霉素，包括达因霉素A；二膦酸盐类，例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素类；以及新制癌菌素发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类(例如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类、培洛霉素、泼非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物类，例如甲氨蝶呤和5-氟脲嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，例如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺类，例如米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；贝斯布西；比生群；依达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依洛尼塞；依利醋铵；埃博霉素类；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登木素生物碱类，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2，2′，2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A、漆斑菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位络合物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；卡培他滨、卡铂、丙卡巴肼、普卡霉素、吉西他滨、诺维本、法尼基-蛋白质转移酶抑制剂、反铂，以及上述任意一种的可药用的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，本文中提供的组合物可与吉非替尼组合使用。在另外的实施方案中，可将本发明实施方案与格列卫组合实践(例如，可将约400mg/天至约800mg/天的格列卫施用于患者)。在某些实施方案中，一种或更多种化学治疗剂可与本文中提供的组合物组合使用。
b.放射治疗
造成DNA损伤并且已被广泛使用的其他因素包括通常已知的γ-射线、X-射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的直接递送。还考虑了其他形式的DNA损伤因素，例如微波和UV辐照。很可能的是，所有的这些因素对DNA、DNA前体、DNA复制和修复以及染色体的组装和维持产生广泛的损伤。X-射线的剂量范围为：日剂量为在延长时间段(3至4周)中的50伦琴至200伦琴，到2000伦琴至6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、所发射辐射的强度和类型以及赘生性细胞的摄入。
本文中使用的术语“接触”和“暴露”当应用于细胞时描述将治疗性组合物和化学治疗剂或放射治疗剂递送至靶细胞或与靶细胞直接邻接放置的过程。为了实现细胞杀伤或停滞，将这两种药剂以有效杀伤细胞或阻止细胞分裂的联合量递送至细胞。
c.免疫治疗
一般来说，免疫治疗依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的一些标志物具有特异性的抗体。抗体可单独充当治疗的效应物，或者其可招募其他细胞来实际实现细胞杀伤。抗体也可与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并且仅充当靶向剂。或者，效应物可为携带直接或间接与肿瘤细胞靶标相互作用之表面分子的淋巴细胞。多种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
因此，免疫治疗可与本发明实施方案的TUSC2治疗结合，作为组合治疗的一部分。下面讨论组合治疗的一般方法。通常，肿瘤细胞必须具有适用于靶向(即，不存在于大多数其他细胞上)的一些标志物。存在许多肿瘤标志物，并且这些肿瘤标志物中的任何一种可能适于本发明实施方案的上下文中的靶向。常见的肿瘤标志物包括癌胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿系统肿瘤相关抗原(urinary tumor associated antigen)、胎儿抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层黏连蛋白受体、erb B和p155。
d.基因治疗
在另一个实施方案中，二级治疗是基因治疗，其中治疗性多核苷酸在治疗组合物之前、之后或与之同时施用。用于基因产物的表达的病毒载体在本领域中是公知的，并且包括真核表达系统，例如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒(包括痘苗病毒)和乳头状瘤病毒(包括SV40)。或者，表达构建体的施用可以用基于脂质的载体(例如脂质体或DOTAP：胆固醇囊泡)来完成。所有这些方法在本领域中是公知的(参见，例如Sambrook等，1989；Ausubel等，1998；Ausubel，1996)。
编码以下基因产物中的任一个的载体的递送将对靶组织具有组合的抗过度增殖作用。多种蛋白质包含在本发明实施方案中，其中一些描述如下。
i.细胞增殖的抑制剂
如上所述，肿瘤抑制癌基因具有抑制过度细胞增殖的功能。这些基因的失活破坏了它们的抑制活性，导致不受调节的增殖。
可用作根据本发明实施方案的二级治疗的基因包括p53、p16、Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zacl、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、P27、P27/P16融合体、p21/P27融合体、抗血栓形成基因(例如，COX-1、TFPI)、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk，ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、涉及血管生成的基因(例如，VEGF、FGF、血小板反应蛋白、BAI-1、GDAIF，或其受体)、MCC和表IV中列出的其他基因。
ii.程序性细胞死亡的调节因子
细胞凋亡或程序性细胞死亡是正常胚胎发育、维持成体组织内的稳态和抑制癌发生的必需过程(Kerr等，1972)。已经证明了Bcl-2蛋白家族和ICE样蛋白酶都是其他系统中细胞凋亡的重要调节因子和效应因子。被发现与滤泡性淋巴瘤相关的Bcl-2蛋白在控制细胞凋亡和提高细胞存活方面发挥重要作用，以响应多种凋亡刺激(Bakhshi等，1985；Cleary和Sklar，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA，82(21)：7439-43，1985；Cleary等，1986；Tsujimoto等，1985；Tsujimoto和Croce，1986)。现在认识到演变上保守的Bcl-2蛋白是可归类为死亡激动剂或死亡拮抗剂的相关蛋白的家族的成员。
在Bcl-2的发现之后，已经表明Bcl-2发挥抑制由多种刺激引发的细胞死亡的作用。此外，现在明显的是，存在共有共同结构和序列同源性的Bcl2细胞死亡调节蛋白的家族。已经显示出这些不同的家族成员具有与Bcl-2(例如，BclXL，、Bclw、BclS、Mcl-1、A1、Bfl-1)类似的功能或抵消Bcl-2功能并促进细胞死亡(例如，Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)。
e.手术
约60％的癌症患者经受某类型的手术，其包括预防性、诊断性或分期性、治愈性和姑息性手术。治愈性手术是可与其他疗法(例如，本文提供的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法)结合使用的癌症治疗。
治愈性手术包括切除，其中物理性移除、切掉和/或破坏所有或部分癌组织。肿瘤切除是指物理性移除至少一部分肿瘤。除肿瘤切除之外，通过手术的治疗包括激光手术、冷冻手术、电手术和微观控制手术(Mohs手术)。还预期本实施方案可与浅表癌、初癌或伴随量的正常组织的移除结合使用。
在切除部分或所有的癌细胞、组织或肿瘤后，在体内可形成腔。可通过灌注、直接注射或对该区域局部施用额外的抗癌疗法来实现治疗。这种治疗可例如每1、2、3、4、5、6或7天进行重复，或者每1、2、3、4和5周进行重复，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月进行重复。这些治疗也可使用不同的剂量。
f.抗炎剂
在某些方面，TUSC2治疗和/或免疫检查点抑制剂与抗炎剂结合施用。本文所限定的抗炎剂是指已知或怀疑有益于治疗或预防对象中的炎症的药剂。皮质类固醇是抗炎剂的主要类型。皮质类固醇可以是短期、中期或长期作用的，并且可以以多种方法递送。在本发明实施方案中预期的皮质的非限制性列表包括经口皮质类固醇，例如：可的松、氢化可的松、泼尼松和地塞米松。
抗炎剂的另一类主要类型是非甾体抗炎剂。非甾体抗炎剂包括用于治疗炎症和疼痛的一类药物。这类药物的确切作用方式是未知的。这类药剂的成员的实例包括但不限于布洛芬、酮洛芬、氟比洛芬、萘丁美酮、吡罗昔康、萘普生、双氯芬酸、吲哚美辛、舒林酸、托美丁、依托度酸、氟芬那酸、二氟尼柳、奥沙普秦、罗非昔布和塞来昔布。本领域的普通技术人员将熟悉这些药剂。此类中包括水杨酸盐类和水杨酸盐类的衍生物，例如乙酰水杨酸、水杨酸钠、水杨酸胆碱、水杨酸胆碱镁和二氟尼柳。
其他抗炎剂包括抗风湿剂，例如金盐(例如，硫代苹果酸金钠、硫金代葡萄糖和金诺芬)、抗风湿剂(例如，氯喹、羟氯喹和青霉胺)、抗组胺剂(例如，苯海拉明、氯苯那敏、氯马斯汀、羟嗪和曲普利啶)和免疫抑制剂(例如，氨甲蝶呤、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、环孢菌素和硫唑嘌呤)。本发明实施方案所预期的其他免疫抑制剂是他克莫司和依维莫司。他克莫司抑制与T细胞活化相关的白介素-2产生，抑制细胞毒性T细胞的分化和增殖。如今，它被全世界公认为免疫抑制剂治疗的基石。本领域的普通技术人员将熟悉这些药剂和这类药剂的其他成员，以及这些药剂的作用机理和使用这些药剂的适应症。
g.其他药剂
预期其他药剂可与本文中提供的组合物组合使用以提高治疗的治疗效力。这些另外的药剂包括免疫调节剂、影响细胞表面受体和GAP连接的上调的药剂、细胞抑制剂和分化剂、细胞黏附抑制剂或提高过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子；干扰素α、β和γ；IL-2和其他细胞因子；F42K和其他细胞因子类似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES和其他趋化因子。还预期细胞表面受体或其配体(例如Fas/Fas配体、DR4或DR5/TRAIL)的上调将通过建立对过度增殖细胞的自分泌或旁分泌效应而增强本文中提供的组合物的凋亡诱导能力。通过升高GAP连接数来提高细胞间信号传导可提高对邻近过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在另外的实施方案中，细胞抑制剂或分化剂可以与本文中提供的组合物组合使用以提高治疗的抗过度增殖效力。预期细胞黏附抑制剂提高本发明的效力。细胞黏附抑制剂的实例是黏着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。还预期可以将提高过度增殖细胞对凋亡的敏感性的其他药剂(例如抗体c225)与本文中提供的组合物组合使用以提高治疗效力。
在某些实施方案中，激素治疗也可与本发明实施方案结合使用或与先前描述的任何其他癌症治疗组合使用。激素的使用可用于治疗某些癌症(例如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或宫颈癌)以降低某些激素(例如睾酮或雌激素)的水平或阻断其作用。这种治疗通常作为治疗选择或为降低转移风险而与至少一种其他癌症治疗组合使用。
M实施例
包括以下实施例以说明本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术表示发明人发现的在本发明的实践中运行良好的技术，并因此可以认为构成用于其实施的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案中进行许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果。
实施例1-TUSC2治疗与免疫检查点抑制剂组合
用TUSC2和抗PD1组合治疗有效地抑制在G12VKras突变体同基因肺皮下模型中的肿瘤生长：在C57BL/6小鼠皮下植入具有Kras G12V突变和低水平的TUSC2表达的鼠肺癌细胞系CMT/167-萤光素酶。每组分配10只小鼠：DOTAP：胆固醇(DC)-空载体/同种型；抗PD1抗体；DC-TUSC2纳米颗粒；和DC-TUSC2纳米颗粒+抗PD1抗体。随机化的TUSC2(i.v.)和抗PD1(i.p.)的顺序治疗示于图1A中。没有伴随着组合治疗的毒性。分别用卡尺和IVIS成像测量肿瘤体积和生物发光强度。CMT/167细胞中PD-L1的表达为23.7％(图1B)。抗PD1显示出抑制肿瘤生长的有限效力，而TUSC2显著抑制肿瘤生长(图1C)。该组合通过TUSC2进一步增强了肿瘤的消退。同种型对照、抗PD1、TUSC2和TUSC2+抗PD1的平均体积分别为800mm3、600mm3、300mm3和180mm3(*P＜0.05；**P＜0.01；并且***p＜0.001)。将肿瘤中的生物发光强度测量为每秒总通量的IVS成像也显示了组合的效力(图1D至E)。TUSC2与抗PD1之间的协作效应的后验概率大于99％。这些结果表明，在该模型中，TUSC2与抗PDl协同作用以减小肿瘤生长。
用TUSC2和抗PD1组合治疗提高了NK和CD8+T细胞的密度，并抑制调节性细胞：为了描述TUSC2与抗PD1组合的免疫影响，使用十色组流式细胞术对外周血白细胞(PBL)和脾细胞中的主要免疫群体进行分析。在无肿瘤小鼠中静脉内递送TUSC2纳米囊泡对外周NK、B和T细胞的影响示于图2A中。在无肿瘤小鼠中TUSC2和TUSC2+抗PD1之间没有差异。用于流式细胞术分析的设门策略示于图1的补充中。肿瘤细胞接种之后，发现TUSC2显著且适度地分别诱导了NK和CD8+T细胞的密度(P＜0.001和p＜0.05)，同时伴随着表达PD1、CTLA4和Tim3的B细胞、MDSC、Treg、T细胞显著降低(图2B至E)。抗PD1对NK、T和B细胞没有明显的作用，但减少了表达PD1、CTLA4和Tim3的MDSC、Treg和T细胞。组合治疗与单独的TUSC2具有相同的效果。相对于Treg，组合治疗的最大差异是提高了NK细胞相对于MDSC和CD8+T细胞的比(p＜0.001)(图2F)。综上所述，这些结果表明TUSC2-抗PD1协同作用可能与NK和CD8+T细胞扩增的提高有关。
用TUSC2和抗PD1组合治疗增强了肿瘤浸润NK和CD+8T细胞：为了确定TUSC2+抗PD1治疗是否与更密集的肿瘤免疫细胞浸润有关，使用Vectra高通量病理系统对免疫浸润进行分析，所述系统覆盖了每个肿瘤区域的25％(N＝5个肿瘤/每个治疗组)。将整个皮下肿瘤均匀切除用于处理，并且考虑到不同治疗组之间不同的肿瘤尺寸，分析来自每个肿瘤的数个切片以消除任何潜在的采样偏差。考虑染色强度并结合阳性细胞百分比，使用H评分值。当与对照或抗PD1相比时，该组合使肿瘤内的CD8+T细胞密度分别提高10倍和3倍(P＜0.0001；图3A)。TUSC2组的CD8+T浸润低于组合，但不显著。活化的NK细胞的浸润在用TUSC2治疗的肿瘤中最高(p＜0.0001)，随后是组合(p＜0.0001)(图3A)。与TUSC2或该组合相比，抗PD1略微提高了NK浸润。相反，TUSC2和TUSC2+抗PD1显著抑制肿瘤浸润的Foxp3(由Treg表达的标志物)阳性T细胞(p＜0.0001)，以及带有肿瘤抑制性粒细胞标志物1(Gr-1)的MDSC(p＜0.0001)。虽然抗PD1略微降低了Foxp3密度(p＝0.18)，但它对GR1没有影响。这些结果表明TUSC2和该组合改变了肿瘤免疫微环境。
用TUSC2和抗PD1的组合治疗增强了与NK细胞和T淋巴细胞相关的趋化因子表达：使用Nanostring技术分析血清趋化因子的表达谱。在暴露于TUSC2和组合之后，发现一组趋化因子基因的上调与T淋巴细胞和NK细胞的迁移有关(图3B)。通过CCR5识别参与NK细胞迁移的CcL3和CcL4的表达提高多于两倍，而与CCR7受体相互作用并将T细胞和树突细胞募集到肿瘤的CcL21a和CcL19(Viola等，2012；Griffith等，2014)与未经治疗的对照相比，提高了多于四倍。与对照组相比，通过TUSC2和TUSC2+抗PD1治疗也提高了CcL4和CcL5血清趋化因子水平(图3C)。
NK或CD8+T细胞的耗竭分别完全和部分消除了该组合的抗肿瘤作用：组合治疗之后NK和CD+8二者的密度上调的发现强烈提示了CD8+T细胞和NK细胞调节TUSC2+抗PD1诱导的肿瘤消退。为了确认该假设，通过腹膜内注射抗NK1.1或抗CD8+T细胞抗体，使携带CMT167肿瘤的小鼠中的NK或CD8+T细胞耗竭(图8、9)。如图4A中所示，通过组合用抗NK1.1抗体的治疗完全消除了肿瘤消退，而用抗CD8+T抗体的治疗使其部分受损(图4B)。此外，NK细胞耗竭消除了TUSC2诱导的肿瘤生长抑制，而CD8+T细胞耗竭没有效果。哪一种耗竭都不会对抗PD1应答产生任何影响。这些研究结果表明，虽然CD8+T细胞可能有助于对抗PD1的TUSC2增强的敏感性，但NK细胞对于这种协同作用是必不可少的。
接下来，使用Luminex测定分析血清细胞因子，发现TUSC2和该组合均诱导强烈的Th1介导的免疫应答(对照vs TUSC2：p＜0.0001；对照vs组合：p＝0.007(图4C)，该免疫应答是NK耗竭所消除的影响(TUSC2vs TUSC2/NK1.1：p＝0.008；组合vs组合/NK1.1：p＝0.0009)，这表明NK细胞在诱导Th1介导的对TUSC2和组合的免疫应答中很重要。但是，在有或没有NK耗竭的情况下，这两个治疗组的Th1/Th2比没有显著差异。与它们未经治疗或经抗PD1治疗的对应物相比，TUSC2+抗PD1治疗促使IL-15(p＝0.0001)和IL-18(p＜0.0001)细胞因子的水平升高(图4D)。在TUSC2和组合组中IL-15被诱导至相同水平，而在TUSC2中的IL-18水平显著高于组合中的IL-18水平。当NK细胞耗竭时，IL-15的水平(对照vs TUSC2：p＝0.03)和IL-18(对照组vs TUSC2：p＝0.0005)显著降低。在NK耗竭或没有耗竭的情况下，TUSC2和组合之间的IL-18水平存在显著差异，但对于IL-15则没有。最后，使用qPCR和Nanostring技术的分选的NK细胞和肿瘤组织的表达谱显示TUSC2治疗中的IL-15R和IL-18R的表达显著高于其未经治疗和经抗PD1治疗的对应物中的IL-15R和IL-18R的表达(分别地，p＝0.01和p＝0.001；图4E、F)。
用TUSC2和抗PD1的组合治疗增强了同基因G12D Kras-突变体肺转移模型的存活：在使用129Sv小鼠的第二Kras转移模型中评价TUSC2+抗PD1的效力，所述小鼠静脉内接种有具有K-rasG12D突变的344SQ-萤光素酶肺癌细胞。344SQ细胞中的PD-L1表达水平为仅4.5％(图5A)。顺序治疗策略示于图5B中。治疗组与之前的模型类似，其中添加两组，抗PD1与抗CTLA4的组合以及TUSC2与抗PD1和抗CTLA4的组合。前者组合用于该实验，因为与单独的每种药物相比，报道了增强的临床效力(Larkin等，2015)。与未经治疗、抗PD1和抗PD1+抗CTLA4治疗组相比，TUSC2显著提高了存活(TUSC2vs对照：p＜0.0001；TUSC2vs抗PD1：p＜0.001；TUSC2vs抗PD1+抗CTLA4：p＜0.001)(图5C)。当TUSC2与抗PD1组合时，存活显著延长(组合vs对照：p＜0.0001；组合vs抗PD1：p＜0.001；组合vs TUSC2：p＝0.024)。将TUSC2与抗PD1和抗CTLA4组合比TUSC2+抗PD1治疗延长存活数天。肿瘤的生物发光成像支持这些发现(图5D)。图5E显示在第2周给予TUSC2+抗PD1的情况下肺中肿瘤结节的明显清除。这些结果证实了TUSC2+抗PD1组合的效力，并且表明TUSC2与双检查点阻断(抗PD1和抗CTLA4)组合具有转化价值。
使用单一细胞分析的免疫细胞浸润分析显示，与对照或与抗CTLA4组合的抗PD1治疗组相比，通过TUSC2的NK细胞浸润更高(p＜0.001)(图5F)。TUSC2+抗PD1或TUSC2+抗PD1+抗CTLA4的作用略高于TUSC2的作用。相反，Treg和MDSC细胞浸润被抗PD1显著抑制(p＝0.004；p＝0.0003)，通过TUSC2和组合进一步增强了该作用(图5G和5H)。这些结果与在CMT167皮下肿瘤模型的评价中观察到的结果一致(图2)。
TUSC2与抗PD1组合改变了肿瘤微环境中的免疫基因表达谱：为了鉴定在TUSC2+抗PD1组合中差异表达的特异性免疫基因，使用由770个小鼠免疫基因组成的小鼠泛癌组对来自肿瘤样品的RNA进行数字多路复用分析，所述小鼠免疫基因覆盖具有40个持家对照(NanoStringTechnologies Inc.)的适应性和先天性应答二者。应用具有错误发现率(q＜0.05)校正的Welch′s t检验得出治疗组之间统计学上显著的基因表达差异。p值＜0.05被认为是显著的。使用火山图和热图来使结果可视化(图6A、B)。因为TUSC2添加增强了对抗PD1治疗的应答，所以在抗PD1和TUSC2+抗PD1组之间进行成对比较。在所有其他组之间也进行了成对比较。首先，发现6个基因簇在组合组中显著上调。这包括Cdld2、Ltf、Klra21、H60a、Tnfsf18和Bcl6。发现另一簇显著下调，其由Egr3、Cd46、Ncr1、Klra5、Ccl1、Il12rb2和Cd59b组成(图6B)。所有这些基因对于NK和CD8+T细胞调节都很重要(Deng等，2013；Shevach和Stephens，2006；Orr等，2009)。组合治疗还上调了肿瘤微环境中与T细胞介导的抗肿瘤功能相关的基因的表达(图6D至F)。这些结果支持NK和CD8+T免疫分析和肿瘤浸润数据(图2至3)。
实施例2-材料和方法
细胞培养和试剂：KRasG12/CMT167-luc和K-RasG12D/344SQ-luc细胞由AlanFields博士(Mayo Clinic)，FrankR.Jirik博士(University ofCalgary)友情提供。细胞在补充有10％胎牛血清(Atlanta Biological，GA)和1％青霉素和链霉素(life sciencetechnologies)的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。同种型，抗PD1、抗CTLA4、InVivoPlus抗NK1.1(克隆PK136)和抗CD8+T(克隆2.43)抗小鼠单克隆抗体均购自Bio X Cell(WestLebanon，NH)。DOTAP和胆固醇购自Avanti Polar Lipids(Albaster，AL)。先前描述了DC-TUSC2的合成和制备(Ito等，2004)。
动物研究：所有动物程序均由德克萨斯大学MD安德森癌症中心的动物护理和使用委员会(Animal Care and Use Committee of The University of Texas MD AndersonCancer Center)审查和批准。对于CMT167-1uc同基因模型，将6至8周龄雌性C57BL/6-Elite小鼠(Charles River Laboratories，Houston，TX)在右胁皮下注射1×106个CMT167-luc细胞，并如下随机分为治疗组，每组10只小鼠：对照(空载体纳米囊泡、同种型抗体)、抗PD1、TUSC2纳米囊泡和TUSC2+抗PD1。简言之，每48小时静脉内注射25μg TUSC2，共3个周期，每4天腹膜内(i.p.)注射0.25mg抗PD1抗体，共3个周期。根据公式1/2(长度×宽度2)计算肿瘤体积。在肿瘤细胞注射之后3至4周对小鼠进行安乐死，并收获肿瘤和脾。对于344SQ转移模型，向6至8周龄雌性129/Sv小鼠静脉内注射100,000个344SQ-luc细胞。治疗组/各10只，治疗组为：对照(空载体纳米囊泡、同种型抗体)、抗PD1、TUSC2、抗CTLA4、TUSC2+抗PD1、抗PD1+抗CTLA4和TUSC2+抗PD1+抗CTLA4。对于这两种模型，常规监测动物并使用IVIS对肿瘤进行成像。所有治疗和测量均为双盲。对于免疫分型分析，在肿瘤细胞注射之后2周处死动物，收获肺并通过心脏穿刺收集外周血。
NK或CD8+T细胞的耗竭：为了耗竭荷瘤CMT167小鼠的NK细胞或CD8+T细胞，在皮下接种肿瘤细胞之后的第0天开始，每3天向小鼠注射中和单克隆抗体抗NK1.1(克隆PK136)或抗CD8+T(克隆2.43)抗小鼠单克隆抗体(100μg，i.p.)，共4个周期。通过流式细胞术分析脾细胞监测NK或CD8+T细胞耗竭状态。测量肿瘤体积并用IVIS对肿瘤生物发光强度进行定量。
多色流式细胞术：分离PBL并根据流式细胞术的标准方案对细胞进行染色。使用Gallios流式细胞仪研究系统(Beckman Coulter，Brea，CA)开发并优化多色组。小鼠抗体购自BioLegend(San Diego，CA)。用荧光激活细胞分选染色缓冲液洗涤单一细胞混悬液，将其与小鼠Fc受体结合抑制剂孵育10分钟，并用指定的抗体染色。使用10版本的FlowJo软件(FlowJo，Ashland，OR)对数据进行分析。
免疫组织化学：将从CMT167收获的肿瘤固定在10％多聚甲醛中，并用抗CD8、抗Foxp3、抗Gr-1和抗NKp46小鼠抗体对8μm福尔马林固定的石蜡包埋组织切片进行染色。所有免疫组织化学分析均在MD安德森Histology Core Laboratory(Smithville，TX)进行。用每种抗体对每组至少五个肿瘤样品进行染色，使用MD安德森的Imaging Core Facility(Houston，TX)的200张载玻片Vectra 3.0自动定量病理成像系统(PerkinElmer，Waltham，MA)进行成像和分析。通过每个细胞产生0至+3的H评分。
定量PCR：使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)提取总RNA，并使用SuperScript III试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行逆转录。用SYBR Green PCRMaster Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行定量PCR。将相对表达水平归一化，并用ABI Viia7实时PCR系统(Applied Biosystems)测量表达水平。使用制造商描述的比较CT方法进行相对定量。
Luminex测定：为了鉴定血清细胞因子和趋化因子，根据制造商的说明使用Affymetrix(eBioscience)ProcartaPlex 36重免疫测定(Affymetrix，Santa Clara，CA)。将每个治疗组的三个样品一式两份进行分析。简言之，根据制造商的方案制备七份标准品，并将25μL血清样品与指定的抗体包被的珠混合，并在室温下以500rpm摇动孵育2小时。ProcartaPlex Multiplex Immunoassays使用Luminex xMAP(多分析物分析)技术。使用Luminex 200系统(Luminex，Austin，TX)读取板以绘制标准曲线。使用1.0版本的ProcartaPlex Analyst软件来分析数据。
基因表达分析：将使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒从治疗组提取的总肿瘤RNA(每个重复三次)提交给Baylor College of Medicine的Genomic Core Facility(Houston，TX)，用于进行质量控制和使用NanoString Technology的表达谱分析。NanoString泛癌小鼠免疫分析组使用了与特定免疫细胞类型和免疫细胞功能相关的776个基因进行分析。在MD安德森的Bioinformatics Core Facility对数据进行分析。
统计分析：对于CMT167模型，使用一般线性回归模型来分析肿瘤生长。所有数据均以平均值±SD表示，治疗间差异的统计学显著性通过双因素ANOVA和加尾t检验进行检验；P＜0.05被认为是显著的。对于344SQ模型，通过Kaplan-Meier方法估算总存活(overallsurvival，OS)的分布。进行对数秩检验以测试组间存活的差异。当OS被限定为从治疗开始时间到死亡时间的情况下对基于Cox比例风险模型的存活数据进行回归分析。
通过一般线性回归模型对流式细胞术和luminex数据进行统计分析，以比较不同的治疗组。对于免疫组织化学数据，使用一般线性回归模型对治疗组之间的H评分进行统计分析。在每对之间使用SAS中的PROCMIXED程序中的ESTIMATE语句。对于NanoString分析，数据在用于对基因谱和统计分析进行量化之前被归一化。使用阳性对照、持家基因和阴性对照以对样品制备变化、背景噪音和RNA含量变化进行调节。使用线性模型来评估整体治疗效果，并且使用对照物以进行目的成对比较。使用β-均匀混合物(BUM)模型对得到的p值进行建模，以确定错误发现率(FDR)截止值并识别显著差异表达的基因。所有统计分析均使用R统计学软件进行。
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根据本公开内容，无需过度实验就可以进行和实施本文公开和要求保护的所有方法。尽管已经以一些优选实施方案的方式描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员来说明显的是可改变本文中所述的方法以及所述方法的步骤或步骤顺序而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，明显的是，可用化学和生理学二者相关的某些试剂替代本文描述的试剂，同时将获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的所有此类相似的替代和改变被视为在由所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。
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以下参考文献通过引用特定地并入本文，在某种程度上，其提供了补充本文所列那些的示例性过程或其他细节。
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Claims (39)

1.TUSC2治疗剂和抗PD1抗体在制造用于治疗患有癌症之对象的药物组合中的用途，其中所述对象已经或正在用所述抗PD1抗体进行治疗。
2.权利要求1所述的用途，其中所述治疗还包括施用所述抗PD1抗体。
3.权利要求2所述的用途，其中向所述对象施用所述抗PD1抗体包括在所述TUSC2治疗剂之前施用所述抗PD1抗体。
4.权利要求2所述的用途，其中向所述对象施用所述抗PD1抗体包括在所述TUSC2治疗剂之后或与之同时施用所述抗PD1抗体。
5.权利要求1所述的用途，其中在所述TUSC2治疗剂之前不超过两周内向所述对象施用所述抗PD1抗体。
6.权利要求1所述的用途，其中所述抗PD1抗体是纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗、KEYTRUDA®、AMP-514、REGN2810、CT-011、BMS 936559、MPDL328OA或AMP-224。
7.权利要求1所述的用途，其中所述对象已经或正在用第二种免疫检查点抑制剂进行治疗。
8.权利要求7所述的用途，其中所述第二种免疫检查点抑制剂是抗CTL4抗体。
9.权利要求1所述的用途，其中所述TUSC2治疗剂包括TUSC2表达载体。
10.权利要求9所述的用途，其中所述TUSC2表达载体是质粒DNA。
11.权利要求10所述的用途，其中所述质粒是pLJ143/KGB2/FUS1。
12.权利要求9所述的用途，其中在脂质体中提供所述TUSC2表达载体。
13.权利要求12所述的用途，其中所述脂质体是DOTAP:胆固醇脂质体。
14.权利要求13所述的用途，其中所述DOTAP:胆固醇比为1.5:1至1:1.5。
15.权利要求13所述的用途，其中所述DOTAP:胆固醇比为10:9。
16.权利要求13所述的用途，其中所述TUSC2表达载体和DOTAP:胆固醇脂质体以0.01mg/kg至0.10 mg/kg的剂量施用。
17.权利要求1所述的用途，其中所述TUSC2治疗剂施用两次或更多次。
18.权利要求1所述的用途，其中所述治疗还包括施用抗炎剂。
19.权利要求1所述的用途，其中所述TUSC2治疗剂包括TUSC2多肽。
20.权利要求19所述的用途，其中所述TUSC2多肽是经肉豆蔻酰化的。
21.权利要求19所述的用途，其中所述TUSC2多肽包含在纳米颗粒中。
22.权利要求21所述的用途，其中所述纳米颗粒是基于脂质的纳米颗粒、超顺磁性纳米颗粒、纳米壳、半导体纳米晶体、量子点、基于聚合物的纳米颗粒、基于硅的纳米颗粒、基于二氧化硅的纳米颗粒、基于金属的纳米颗粒、富勒烯或纳米管。
23.权利要求1所述的用途，其中所述治疗还包括向所述对象施用另外的抗癌治疗。
24.权利要求23所述的用途，其中所述另外的抗癌治疗是化学治疗、放射治疗、基因治疗、手术、激素治疗、抗血管生成治疗或细胞因子治疗。
25.权利要求24所述的用途，其中所述另外的抗癌治疗是EGFR抑制剂。
26.权利要求1所述的用途，其中所述癌症是口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、呼吸系统癌、泌尿生殖系统癌、胃肠癌、中枢或周围神经系统组织癌、内分泌或神经内分泌癌或造血癌、胶质瘤、肉瘤、上皮癌、淋巴瘤、黑素瘤、纤维瘤、脑脊膜瘤、脑癌、肾癌、胆道癌、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞癌、利-弗劳梅尼瘤、甲状腺癌、甲状旁腺癌、垂体瘤、肾上腺瘤、成骨肉瘤肿瘤、I型和II型多发性神经内分泌肿瘤、乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食管癌、气管癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。
27.权利要求26所述的用途，其中所述癌症是肺癌。
28.权利要求27所述的用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。
29.权利要求27所述的用途，其中所述癌症是转移性肺癌。
30.权利要求1所述的用途，其中所述癌症对至少第一化学治疗有抗性。
31.权利要求30所述的用途，其中所述癌症对基于铂的化学治疗有抗性。
32.权利要求2所述的用途，其中施用所述TUSC2治疗剂和所述抗PD1抗体导致所述癌症患者的肿瘤中NK和/或CD8+ T细胞密度提高。
33.权利要求32所述的用途，其中所述CD8+ T细胞密度提高至少3倍。
34.权利要求2所述的用途，其中施用所述TUSC2治疗剂和所述抗PD1抗体导致了CcL3、CcL4、CcL21a和/或CcL19血清水平提高。
35.药盒，其包含TUSC2治疗剂和抗PD1抗体。
36.权利要求25所述的用途，其中所述EGFR抑制剂是酪氨酸激酶抑制剂。
37.权利要求25所述的用途，其中所述EGFR抑制剂是EGFR结合抗体或适配体。
38.权利要求25所述的用途，其中所述EGFR抑制剂是吉非替尼，厄洛替尼、西妥昔单抗、马妥珠单抗、帕尼单抗、AEE788；CI-1033、HKI-272、HKI-357或EKB-569。
39.组合物，其包含治疗癌症之治疗有效量的TUSC2治疗剂和抗PD1抗体。
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