KR101862236B1 - 항-ｃｘｃｌ13 항체 및 이의 이용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 특정 자가면역 질환, 염증 질환 및 암을 비롯한 CXCL13 발현과 관련된 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 상세하게는, CXCL13을 중화하기 위한 항-CXCL13 단일클론 항체를 개발하였다.

Description

항-ＣＸＣＬ13 항체 및 이의 이용 방법 {ANTI-CXCL13 ANTIBODIES AND METHODS OF USING THE SAME}
본 발명은 CXCL13 중화용 결합 분자(CXCL13 neutralizing binding molecule), 예컨대 항체 및 이의 항원 결합 단편, 예컨대, 인간화된 단일클론 항체, 상기 결합 분자의 이용 방법, 및 CXCL13-발현 세포와 관련된 병태 및 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
항상성 B 세포-유인성 케모카인 1 (BCA-1)은, CXCL13 (또는 ANGIE, BLC, BLR1L, ANGIE2, 또는 Scyb13)이라고도 하며, 여포 수지상 세포 (FDC) 및 대식세포에 의해 2차 림프 기관 (예, 비장, 림프절 및 페이어판 (peyer's patches))에서 구성적으로 발현된다. 이에 대해서는 Gunn et al., Nature 391:799-803 (1998) 및 Carlsen et al., Blood 104(10):3021-3027 (2004)을 참조한다. CXCL13는 주로 G-단백질-커플형 CXCR5 수용체 (버킷 림프종 수용체 1)를 통해 작동한다. CXCR5는 예컨대 성숙형 B 림프구, CD4+ 여포 헬퍼 T 세포 (Thf 세포), CDb+ T 세포의 소수 집단과 활성화된 편도선 Treg 세포에서 발현된다. Legler et al., J. Exp. Med. 187:655-660 (1998); Forster et al., Blood 84:830-840 (1994); Fazilleau et al., Immunity 30:324-335 (2009); Ansel et al., J. Exp. Med. 190:1123-1134 (1999); Lim et al., J. Clin. Invest. 114(11):1640-1649 (2004); 및 R. Forster, Chapter in Academic Press Cytokine Reference, Aug. 2000을 참조한다.
자기항체(autoantibody) (자기-항원에 대한 항체) 생산 잠재력을 구비한 B 세포는 정상적인 생리학적 조건에서는 통상적으로 만들어진다. 그러나, 이러한 천연 자기항체는 반응성이 넓으며 세포 표면 항원에 비해 가용성 자기 항원에 대한 선호성이 높은, 저친화성의 IgM 항체이다 (예, Dichiero et al., J. Immunol. 134(2):765-771 (1985); Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci 83:2959-2963 (1986)). 자가반응성의 저친화성 B 세포는 세포자살을 겪게 되므로, 따라서 건강한 유기체에게 위험이 되지 않을 것이다.
CXCL13과 이의 수용체 CXCR5는, 감염이 없는 상태에서의, 정상적인 면역 반응시, B 세포 및 여포 B 헬퍼 T 세포의 림프절과 비장내 1차 여포로의 회귀; 배 중심 (germinal center) 형성; 및 림프 기관 형성(lymphoid organogenesis)에 관여한다. 예로, Forster et al., Cell 87:1037-1047 (1996)을 참조한다.
CXCL13-결핍 마우스와 CXCR5-결핍 마우스에서, 조직화된 여포의 결핍으로 인한 페이어판 및 림프절의 발생 결함이 확인되었다. Ansel et al., Nature 406:309-314 (2000). 아울러, CXCL13 넉아웃 표현형 측면에서 T 세포 의존적인 항원으로 면역화한 경우, 림프절과 비장에 부적절하고 비정상적으로 작은 배 중심이 형성되었다 (Ansel et al.).
만성적인 염증 환경에서는, 이소성 (ectopic) 배 중심이 병에 걸린 (흔히 비-림프계) 조직 내부에 형성된다. 이들 배 중심내 여포 수지상 세포 (FDC)에 의한 CXCL13 과다-발현은, FDC, B 세포 및 여포 Th 세포에서의 상호작용의 조절 이상, 자가반응성 B 세포의 제거 감소, 그리고 후속적인, 친화성-성숙형의 장기 생존하는 혈장 세포와 고친화성의 IgG 자기항체를 생산하는 기억 B 세포의, 항원-유도성 생산을 수반하며, 그 결과로 자가면역 질환과 염증성 질환이 발생할 수 있다. 예컨대, Vinuesa et al., Immunology 9:845-857 (2009)을 참조한다. 아울러, 특정 암에서의 CXCR5 수용체의 과다 발현이 CXCL13-의존형 세포 증식과 전이를 촉진시키는 것으로 보고된 바 있다.
CXCL13 (BCA-1) 및 이의 수용체, 즉 CXCR5는 헬리코박터 필로리-유발성 위 림프 여포와 점막-연관 림프 조직 (MALT) 림프종에서 높은 수준으로 발현되는 것으로 관찰된 바 있다. 예컨대, Mazzucchelli et al., J Clin Invest 104:R49-R54 (1999)를 참조한다. 아울러, 헬리코박터 필로리-유발성 위염 샘플들 모두에서 CXCL13 (BCA-1)의 발현이 확인되었다. 헬리코박터 헤일만니이(H. heilmannii)에 감염된 야생형 마우스의 위 점막에서, 림프 조직 (MALT 포함)의 조직화에 참여하는 것으로 알려져 있는 CXCL13의 mRNA 발현 수준이 무감염 마우스에 비해 현저하게 높았다. 이에 대해서는 Nobutani et al., FEMS Immunol Med Microbiol 60:156-164 (2010)를 참조한다.
CXCL13-매개 신호전달 경로를 표적으로 하는 치료제에 대한 필요성이 최근 몇년간 점점 뚜렷해지고 있다. 이러한 치료제의 작용 기전은, 예를 들어, CXCL13과 이의 수용체의 상호작용 차단과 그로 인한 B 세포의 개입, 염증이 생긴 조직으로의 여포 B-헬퍼 T 세포의 이동 및 배 중심 형성 (예, 자가면역 질환의 경우), 그리고 암 세포 증식과 암 질환 전파력의 저해일 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2 및 3C9로 이루어진 군으로부터 선택되는 기준 단일클론 항체(reference monoclonal antibody)와 동일한 CXCL13 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 항원 결합 분자에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 항원 결합 분자는 MAb 5261 및 MAb 5378과 동일한 CXCL13 에피토프에 특이적으로 결합한다.
다른 측면에서, 본 발명은, CXCL13에 대한 특이적인 결합에 대해 MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2 및 3C9로 이루어진 군으로부터 선택되는 기준 단일클론 항체를 경쟁적으로 저해하며, CXCL13에 특이적으로 결합하는, 분리된 항원 결합 분자에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 항원 결합 분자는 MAb 5261과 MAb 5378을 경쟁적으로 저해한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 단편은 MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2 및 3C9로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일 구현예에서, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CXCL13에 특이적으로 결합하며, 상기 항체 또는 이의 단편의 중쇄 가변부 (VH)는 서열번호 13 및 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 단편의 경쇄 가변부 (VL)는 서열번호 15, 17 및 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CXCL13에 특이적으로 결합하며, 상기 항체 또는 이의 단편의 VH는 20개 이하의 보존적인 아미노산 치환을 제외하고는 서열번호 13 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 단편의 VL은 20개 이하의 보존적인 아미노산 치환을 제외하고는 서열번호 15, 17 및 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CXCL13에 특이적으로 결합하며, 상기 항체 또는 이의 단편의 VH와 VL은 (a) 각각 서열번호 13 및 서열번호 15; (b) 각각 서열번호 13 및 서열번호 17; 및 (c) 각각 서열번호 3 및 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH 및 VL 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CXCL13에 특이적으로 결합하되, 상기 항체 또는 이의 단편의 VH 및 VL은 각각 20개 이하의 보존적인 아미노산 치환을 제외하고는 (a) 각각 서열번호 13 및 서열번호 15; (b) 각각 서열번호 13 및 서열번호 17; 및 (c) 각각 서열번호 3 및 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH 및 VL 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CXCL13에 특이적으로 결합하며, 상기 항체 또는 이의 단편의 VH는 2개 이하의 아미노산 치환을 제외하고는 서열번호 4와 동일한 코티아-카바트 중쇄 상보성 결정부-1 (VH-CDR1) 아미노산 서열; 4개 이하의 아미노산 치환을 제외하고는 서열번호 5와 동일한 카바트 중쇄 상보성 결정부-2 (VH-CDR2) 아미노산 서열; 2개 이하의 아미노산 치환을 제외하고는 서열번호 6과 동일한 카바트 중쇄 상보성 결정부-3 (VH-CDR3) 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체 또는 이의 단편의 VL은 4개 이하의 아미노산을 제외하고는 서열번호 16 또는 9와 동일한 카바트 경쇄 상보성 결정부-1 (VL-CDR1); 2개 이하의 아미노산을 제외하고는 서열번호 10과 동일한 카바트 경쇄 상보성 결정부-2 (VL-CDR2); 또는 2개 이하의 아미노산을 제외하고는 서열번호 11과 동일한 카바트 경쇄 상보성 결정부-3 (VL-CDR3)을 포함한다.
특정 구현예에서, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CXCL13에 특이적으로 결합하며, 상기 항체 또는 이의 단편의 VH는 VH-CDR들 중 하나 이상에서 4개 이하의 아미노산 치환을 제외하고는 각각 서열번호 4, 5 및 6을 포함하는 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CXCL13에 특이적으로 결합하며, 상기 항체 또는 이의 단편의 VL은 VL-CDR들 중 하나 이상에서 4개 이하의 아미노산 치환을 제외하고는 각각 서열번호 16 또는 9, 10 및 11을 포함하는 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 CXCL13 수용체와의 결합에 대해 CXCL13을 저해한다. 특정 구현예에서, CXCL13 수용체는 CXCR5이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 인간화되거나, 영장류화되거나 또는 키메라된 것이다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 항체 또는 이의 단편 및 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 항체 VH 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하되, 상기 VH 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 서열번호 12 및 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과의 동일성이 90% 이상인 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 발명은, 항체 VL 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하되, 상기 VL 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 서열번호 7 및 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과의 동일성이 90% 이상이며, 상기 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 CXCL13에 특이적으로 결합하는, 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
일 구현예에서, 분리된 폴리뉴클레오티드는 항체 VH 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하되, 상기 VH 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 20개 이하의 보존적인 아미노산을 제외하고는 서열번호 2 및 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 동일하다. 다른 구현예에서, 분리된 폴리뉴클레오티드는 항체 VL 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하되, 상기 VL 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 20개 이하의 보존적인 아미노산 치환을 제외하고는 서열번호 7, 14 및 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 동일하고; 상기 VL 폴리펩타이드를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 CXCL13에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 다른 측면은 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 항체 또는 이의 단편을 회수하는 단계를 포함하는 CXCL13에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은, 분리된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물 또는 본 발명의 조성물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물에서 CXCL13을 중화하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구현예는, 분리된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물 또는 본 발명의 조성물; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료가 필요한 동물에서 자가면역 질환, 염증 질환 또는 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예들에서, 자가면역 질환 또는 염증 질환은 다발성 경화증, 전신 홍반 루푸스 (SLE) 또는 관절염, 예컨대 류마티스 관절염이다.
본 발명의 다른 측면은, 본 발명의 분리된 항체 또는 이의 단편 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물에서 위 림프 여포(lymphoid follicle)를 감소 또는 저해하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 다른 구현예는, 본 발명의 분리된 항체 또는 이의 단편 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 예방 또는 치료가 필요한 동물에서 점막-연관 림프 조직 (MALT) 림프종 또는 위나 십이지장 궤양의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 동물은 헬리코박터 박테리아에 감염된 적 있는 동물이다. 일 구현예에서, 헬리코박터 박테리아는 헬리코박터 필로리(H. pylori) 또는 헬리코박터 헤일만니이(H. heilmannii)이다.
도 1. 항체 대조군 대비 (마우스 MAb 801 및/또는 랫 MAb 470) 재조합 인간 CXCL13 (1A), 재조합 마우스 CXCL13 (1B), 및 재조합 시노몰구스 원숭이 CXCL13 (1C)에 대한 마우스 항-인간 CXCL13 항체 (3D2 및 3C9)의 결합성을 보여주는 특이 ELISA 결과. EC50 값을 나타내며, 4-파라미터 시그모이드형 곡선 피트로 수득하였다 (곡선은 그래프에 표시하며; EC50 값을 구한 곡선의 R2는 0.99임).
도 2. 경쟁자가 없는 경우 또는 MAb 801의 결과와 비교하여 인간 CXCL13에 대한 바이오틴화된 3D2 결합 저해율을 보여주는 에피토프 경쟁 ELISA 결과.
도 3. 천연 또는 재조합 인간 CXCL13 (3A)에 대한 바이오틴-3C9 결합 및 천연 또는 재조합 마우스 CXCL13 (3B)에 대한 바이오틴-3D2 결합의 3D2 저해를 보여주는, 캡처 에피토프 경쟁 ELISA 결과. 곡선은 4-파라미터 시그모이드형 곡선 피트를 이용하여 피팅하였다 (곡선은 그래프에 표시하며; R2는 0.99임). EC50 수치 차이는 unpaired t-test로 분석하였으며, P>0.05인 것으로 확인되었다.
도 4. 인간 CXCL13 유발성 인간 pre-B-697-hCXCR5 세포의 이동 (4A) 및 인간 SDF-1α 유발성 pre-B-697-hCXCR4 세포의 이동 (4B)에 대한 3D2 및 3C9의 효과를 보여주는 B 세포 이동 결과. MAb 801은 인간 CXCL13 이동 저해에 대한 양성 대조군으로 사용하였고, MAb 87A는 인간 SDF-1α-유발성 이동 저해에 대한 양성 대조군으로 사용하였다.
도 5. C57Black/6에서 3D2, MAb 470, 마우스 IgG (대조군), 또는 랫 IgG (대조군) (5A)에 의한, 및 SJL/J에서 3D2, 3C9, MAb 470, 또는 마우스 IgG (대조군) (5B)에 의한 비장세포 이동의 저해율. 결과는 2번의 독립적인 실험 (C57Black/6 이동)의 평균 +/- SD와 3번의 독립적인 실험 (SJL/J 이동)의 평균 +/- SD로 나타낸다. C57Black/6 및 SJL/J의 이동에 대한 3D2의 효과는 unpaired t-test로 분석하였고, P 값은 >0.05이었다 (5C). 곡선은 4-파라미터 시그모이드형 곡선 피트를 이용하여 피팅하였다 (곡선은 그래프에 표시됨; R2 = 0.99).
도 6. 3D2 또는 대조군 (MAb 470 및/또는 마우스 IgG)에 의한 인간 및 마우스 CXCR5 수용체의 인간 CXCL13-매개 엔도사이토시스 (6A) 및 마우스 CXCL13-매개 엔도사이토시스 (6B)에 대한 CXCL13-매개 엔도사이토시스 결과. 인간 및 마우스 CXCL13-매개 엔도사이토시스 EC50 값의 비교는 시그모이드형 용량 반응 곡선으로부터 계산하였고, R2 값은 1 (마우스 엔도사이토시스) 및 0.994 (인간 엔도사이토시스)였으며, 이를 나타낸다 (6C). 인간 및 마우스 수용체 엔도사이토시스에 대한 3D2 효과를 비교한 데이타는 unpaired t-test로 분석하였고, P 값은 > 0.05이었다.
도 7. 3D2 (0일에 개시), 3D2 (스코어 > 1에서 개시), 또는 마우스 IgG 대조군으로 처리된 마우스에서의 EAE 질환 경과 (RR-EAE-1 실험). 각 데이타 포인트는 9마리의 마우스로부터 취한 스코어의 평균을 나타낸다. 그룹의 평균 (GMS)은 일원식 ANOVA와 본페로니의 다중 비교 포스트 테스트를 이용하여 비교하였다.
도 8. 3D2 (0일에 개시), 3D2 (6일에 개시), 3D2 (> 2일에 개시), 또는 마우스 IgG 대조군으로 처리된 마우스에서의 EAE 질환의 경과 (RR-EAE-2 실험). 각 데이타 포인트는 9마리의 마우스로부터 취한 스코어의 평균을 나타낸다. 그룹의 평균 (GMS)은 일원식 ANOVA와 본페로니의 다중 비교 포스트 테스트를 이용하여 비교하였다.
도 9. 3D2 또는 마우스 IgG (대조군) 처리 후 진행성 루푸스 신염을 가진 마우스의 신장 병태 (SLE-1 실험). 사구체 신염, 간질성 신염 및 혈관염에서의 단백뇨 수치 (9A)와 신장 병태 수치 (9B), 각 데이타 포인트는 10번의 측정값의 평균이다.
도 10. 3D2 및 마우스 IgG (대조군) 처리 후 초기 루푸스 질환에 걸린 마우스의 신장 병태 (SLE-2 실험). 사구체신염 및 간질성 신염의 단백뇨 수치 (10A)와 신장 병태 수치 (10B)에 대해, 각 데이타 포인트는 3D2-처리군의 마우스 7마리와 마우스 IgG-처리군의 마우스 9마리를 나타낸다.
도 11. 루푸스 마우스 비장의 배 중심 (GC) 및 1차 여포의 갯수에 대한 3D2 효과를 보여주는 조직 단편들. 비장 조직 단편을 GL-7 (GC 염색), B220 항체 (B 세포 마커), 또는 3D2-처리 (11A) 및 마우스 IgG-처리한 (11B) NZB/NZWF1 마우스 유래 여포 수지상 세포 (FDC)에 대한 항체로 염색하였다.
도 12. 3D2 처리한 루푸스 마우스의 비장에서의 1차 여포 및 GC의 크기. 수치는 그룹 당 마우스 5마리에 대한 평균 +/- SEM으로 표시한다. 3D2 ("tx") 처리 마우스에서는 1차 : 1차 (GC) 여포의 비율로 표시하는 경우 GC의 수가 감소되는 경향이 나타났으며 (p=0.19) (12A), GC 크기가 현저하게 감소되는 경향이 있었다 (p=0.03) (12B).
도 13. 3D2 가변성 중쇄 (H1609) 및 가변성 경쇄 (L0293)의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열. 상보성 결정부 (CDR)는 밑줄로 표시된다.
도 14. 가변성 중쇄 H1609 -> H2177로의 변환 (14A)과 가변성 경쇄 L0293 -> L5055 -> L5140로의 변환(14B)을 나타낸 키메라 3D2의 인간화를 위한 아미노산 서열. 당화 추정 부위와 상보성 결정부 (CDR)는 박스로 표시된다.
도 15. MAb 5261 가변성 중쇄 및 경쇄 (H2177/L5140)와 MAb 5080 가변성 중쇄 및 경쇄 (H2177/L5055)의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열. 상보성 결정부 (CDR)는 밑줄로 표시된다.
도 16. 재조합 인간 (16A), 시노몰구스 원숭이 (16B) 및 마우스 (16C) CXCL13와의 결합에 대한 MAb 5261, MAb 5080, MAb 1476, 및 인간 이소형 대조군의 특이 ELISA 결과. EC50 값은 4-파라미터 시그모이드형 곡선 피트로부터 계산하였다 (곡선은 그래프에 표시됨; EC50 값을 구한 곡선의 R2는 0.99임). NB = 결합성 없음.
도 17. 천연 인간 (17A) 및 천연 마우스 (17B) CXCL13와의 결합에 대한 MAb 5261, MAb 5080, 및 3D2의 캡쳐 에피토프 경쟁 ELISA 결과. 각 데이타 포인트는 3번 이상의 독립적인 실험들 중 한가지 실험에서 2번 측정한 결과의 평균이다. 곡선은 4-파라미터 시그모이드형 곡선 피트를 이용하여 피팅하였다 (곡선은 그래프에 표시됨; R2 = 0.99).
도 18. MAb 5261에 의한 인간 pre-B-697-hCXCR5 (18A) 및 인간 편도선 세포 (18B)의 이동 저해율. 데이타는 3가지 이상의 실험들 중 한가지 실험에서 구한 3번 측정의 평균 +/- SEM을 나타낸다. 곡선은 4-파라미터 시그모이드형 곡선 피트를 이용하여 피팅하였다 (곡선은 그래프에 표시됨; R2 = 0.98-0.99).
도 19. MAb 5261에 의한 SJL/J (19A) 및 C57Black/6 (19B) 비장세포 이동의 저해율. 각 실험의 데이타는 2번 측정치의 평균 +/- SD으로 나타낸다.
도 20. MAb 5261 및 이소형 대조군에 의한 인간 CXCR5 수용체의 인간 CXCL13-매개 내재화의 저해율. 데이타는 3가지 이상의 독립적인 실험들 중 한가지 실험에서 행한 3번의 측정 결과를 평균한 것이다. 곡선은 4-파라미터 시그모이드형 곡선 피트를 이용하여 피팅하였다 (곡선은 그래프에 표시됨; R2 = 0.99).
도 21. MAb 5378 가변성 중쇄 (H5188) 및 가변성 경쇄 (L5153)의 폴리뉴클레오티드 서열과 아미노산 서열. 상보성 결정부 (CDR)는 밑줄 표시된다.
도 22. MAb 5378, MAb 5261 및 MAb 470의 에피토프 경쟁 ELISA 결과
도 23. MAb 5378, 3D2 및 마우스 이소형 대조군의 재조합 인간 (23A), 시노몰구스 원숭이 (23B) 및 마우스 (23C) CXCL13과의 결합에 대한 특이 ELISA 결과. EC50 값은 4-파라미터 시그모이드형 커브 피트로부터 계산하였다 (곡선은 그래프에 표시됨; EC50을 나타내는 곡선의 R2는 0.99임).
도 24. MAb 5261 또는 MAb 5378 (24A-B) 및 MAb 5378 또는 3D2 (24C)에 의한 인간 pre-B-697-hCXCR5 (24A), 인간 편도선 세포 (24B) 및 C57Black6 마우스 비장세포 (24C)의 이동 저해율. 데이타는 3가지 이상의 실험들 중 한 실험의 3회 측정치의 평균 +/- SEM이다. 곡선은 4-파라미터 시그모이드형 곡선 피트를 이용하여 피팅하였다 (곡선은 그래프에 표시됨; R2 = 0.99).
도 25. MAb 5378, MAb 5261, 3D2, 마우스 이소형 대조군, 또는 인간 이소형 대조군에 의한 인간 CXCR5 수용체의 인간 CXCL13-매개 내재화 저해율. 5261 및 5378에 대한 데이타 포인트는 2종 이상의 독립적인 실험들에서 수득한 결과의 평균이다. 3D2 및 이소형 대조군에 대한 데이타 포인트는 한가지 실험에서의 3회 측정치의 평균이다. 곡선은 4-파라미터 시그모이드형 커브 피트를 이용하여 피팅하였다 (곡선은 그래프에 표시됨; R2 = 0.99). NE = 효과 없음.
도 26. MAb 5376, 에타너셉트(etanercept), 또는 마우스 IgG (대조군) (CIA-1 실험)로 처리한 마우스에서의 콜라겐-유발성 관절염 (CIA) 질환 경과. 각 데이타 포인트는 마우스 10마리에서 수득한 수치의 평균이다. 그룹 평균을 일원식 ANOVA와 본페로니의 다중 비교 포스트 테스트를 이용하여 비교하였다.
도 27. MAb 5378, 에타너셉트, MAb 470, 또는 마우스 IgG (대조군) (CIA-2 실험)로 처리한 마우스에서의 콜라겐-유발성 관절염 (CIA) 질환 경과. 각 데이타 포인트는 마우스 10마리에서 수득한 수치의 평균이다. 그룹 평균을 일원식 ANOVA와 본페로니의 다중 비교 포스트 테스트를 이용하여 비교하였다.
도 28. MAb 5378 또는 마우스 이소형 대조군 처리하거나 또는 무처리한 NP-CGG 면역화된 마우스에서의 배 중심 형성 (GC-1 실험). 각 비장에 대한 데이타 포인트는 마우스 3마리에서 측정한 수치의 평균이다. 각 림프절애 대한 데이타 포인트는 마우스 3마리에서 수집한 세포 풀에서 수득한 단일 수치이다.
도 29. 마우스의 헬리코박터 헤일만니이 감염 및 항체 투여의 치료 스케줄
도 30. 이소형 대조군 항체 처리 및 항-CXCL13 항체 처리를 비롯하여 헬리코박터 헤일만니이 감염 마우스로부터 수득한 모든 위 샘플에서 헬리코박터 헤일만니이 특이 16s rRNA 유전자로 증폭시켰다. 양성 대조군 (P)과 음성 대조군 (N)도 표시한다.
도 31. 실시간 정량 PCR로 측정한, 감염 후 1달 (31A) 및 3달 (31B) 경과시 헬리코박터 헤일만니이 (HH)로 감염된 야생형 (WT)의 위 점막에서의 CXCL13 mRNA 발현 수준 (수치는 각 샘플에서의 마우스 베타-액틴 발현 수준으로 표준화하였음).
도 32. 이소형 대조군 항체 또는 항-CXCL13 항체 처리 후 헬리코박터 헤일만니이로 감염된 마우스의 위에서의 CXCL13 mRNA 및 베타-액틴의 발현 (상위 패널). 무감염 마우스의 위에서의 CXCL13 mRNA 및 베타-액틴의 발현 (하위 패널). 양성 대조군 (P)과 음성 대조군 (N)도 표시한다.
도 33. 헬리코박터 헤일만니이 감염 후 3달 경과시 이소형 대조군 항체로 처리된 마우스 (상위 좌측 패널)과 항-CXCL13 항체로 처리된 마우스 (상위 우측 패널)에서 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색한 위 샘플. 하위 패널은 이소형 대조군 항체 및 항-CXCL13 항체 처리 마우스로부터 취한 위 샘플에서 확인된 위 림프 여포의 갯수를 나타낸다.
I. 정의
용어 "하나 (a, an)"는 하나 이상을 지칭함에 유념하여야 하며; 예를 들어 "항-CXCL13 항체"는 하나 이상의 항-CXCL13 항체를 지칭하는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "하나 (a 또는 an)", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에 상호 호환적으로 사용할 수 있다.
본원에서, 용어 "종양"은 악성 또는 양성이던 모든 신생물 세포 생장과 증식, 그리고 모든 암성 및 전암성 세포와 조직을 지칭한다.
용어 "암" 또는 "암성"은 전형적으로 세포 증식의 조절 이상이 특징적인 포유류의 생리학적 병태를 지칭하거나 설명한다. 암의 예로는 암종, 림프종 및 백혈병이 있으나, 이로 한정되지 않는다.
본원에서, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 하나의 "폴리펩타이드" 뿐만 아니라 복수의 "폴리펩타이드"를 포괄하는 것으로 의도되며, 아미드 결합 (또한, 펩타이드 결합이라고도 함)으로 선형 연결된 단량체(아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩타이드"는 2 이상의 아미노산으로 구성된 모든 체인 또는 체인들을 지칭하나, 산물의 특정 길이를 의미하는 것은 아니다. 따라서, 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 올리고펩타이드, "단백질", "아미노산 체인" 또는 그외 2 이상의 아미노산으로 구성된 체인 또는 체인들을 지칭하는데 사용되는 임의 용어는, 상호 대체하거나 또는 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 또한, 용어 "폴리펩타이드"는 비제한적으로 당화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질 분해에 의한 절단 또는 비천연 아미노산에 의한 변형 등의, 폴리펩타이드의 발현 후 변형 산물을 지칭하기 위한 의도이다. 폴리펩타이드는 재조합 기법을 통해 제조되거나 천연 생물원으로부터 유래될 수 있지만, 지정된 핵산 서열로부터 반드시 번역되는 것은 아니다. 화학 합성을 비롯한 모든 방식으로 제조할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 크기가 아미노산 약 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 500개 이상, 1000개 이상, 또는 2000개 이상일 수 있다. 폴리펩타이드는 정의된 3차 구조를 반드시 취하는 것은 아니지만 이러한 구조를 취할 수 있다. 정의된 3차 구조를 취한 폴리펩타이드를 폴딩된 것으로 지칭하며, 정의된 3차 구조를 가지지 않고 여러가지 다른 구조를 취할 수 있는 것을 미폴딩된 것으로 지칭한다. 본원에서, 용어 당단백질은 아미노산 잔기, 예컨대 세린 잔기 또는 아스파라긴 잔기의 산소-함유 또는 질소-함유 측쇄를 통해 단백질에 부착된 하나 이상의 탄수화물 모이어티가 커플링된 단백질을 지칭한다.
"분리된" 폴리펩타이드 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체는 천연 환경에 있지 않은 폴리펩타이드를 지칭한다. 특정한 정제 수준이 요구되는 것은 아니다. 예컨대, 분리된 폴리펩타이드는 천연 또는 자연 환경으로부터 취해질 수 있다. 재조합에 의해 제조된 숙주 세포에서 발현되는 폴리펩타이드 및 단백질은, 임의의 적합한 기법에 의해 분리, 분획화 또는 부분 또는 실질적으로 정제되어진 천연 또는 재조합 폴리펩타이드와 같이, 본 발명의 목적에 따라 분리된 것으로 간주된다.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 전술한 폴리펩타이드의 단편, 유도체, 유사체 또는 변이체 및 이의 모든 조합을 포괄한다. 용어 "단편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 항-CXCL13 항체 또는 항체 폴리펩타이드를 지칭하는 경우, 본 발명의 대응되는 항체 또는 항체 폴리펩타이드의 항원-결합 특성을 적어도 일부 보유하는 임의의 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드의 단편은, 본원의 도처에 논의되는 특이 항체의 단편 외에도, 단백질 분해 단편 뿐만 아니라 결손 단편 (deletion fragment)을 포함한다. 본 발명의 항-CXCL13 항체 및 항체 폴리펩타이드의 변이체는 전술한 단편을 포함하며, 또한 아미노산 치환, 결손 또는 삽입으로 인해 아미노산 서열이 변이된 폴리펩타이드를 포함한다. 변이체는 천연 또는 비천연일 수 있다. 비천연 변이체는 당해 기술 분야에 공지된 돌연변이 유발 기법으로 제조할 수 있다. 변이 폴리펩타이드는 보존적인 또는 비보존적인 아미노산 치환, 결손 또는 부가를 포함할 수 있다. 또한, 변이 폴리펩타이드는 본원에서 "폴리펩타이드 유사체"로도 언급될 수 있다. 본원에서, 항-CXCL13 항체 또는 항체 폴리펩타이드의 "유도체"는 기능성 측기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 잔기를 가진 대상 폴리펩타이드를 지칭한다. 또한, "유도체"는 20개의 표준 아미노산 중 하나 이상의 천연 아미노산 유도체를 함유하는 펩타이드를 포함한다. 예컨대, 4-하이드록시프롤린은 프롤린을 대체할 수 있으며; 5-하이드록시라이신은 라이신을 대체할 수 있으며; 3-메틸히스미딘은 히스티딘을 대체할 수 있으며; 호모세린은 세린을 대체할 수 있으며; 오르니틴은 라이신을 대체할 수 있다. 본 발명의 항-CXCL13 항체 및 항체 폴리펩타이드의 유도체는, 본 발명의 기준 항체 또는 항체 폴리펩타이드에서는 확인되지 않는 부가적인 특징을 나타내도록 변형된 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 하나의 핵산 뿐만 아니라 복수의 핵산을 포괄하며, 분리된 핵산 분자 또는 구조체, 예컨대, 메신저 RNA (mRNA) 또는 플라스미드 DNA (pDNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 일반적인 포스포다이에스터 결합 또는 비-통상적인 결합 (예, 펩타이드 핵산(PNA)에서 나타나는 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 단편, 예를 들어 DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다. "분리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 천연 환경으로부터 취해진 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의도한다. 예를 들어, 벡터에 포함된, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 목적에 따라 분리된 것으로 간주된다. 분리된 폴리뉴클레오티드에 대한 다른 예로는 이종 숙주 세포에 유지되는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중의 (부분 또는 실질적으로) 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 분리된 RNA 분자는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체를 포함한다. 본 발명에 따른 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성에 의해 제조된 상기한 분자를 추가로 포함한다. 아울러, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 프로모터, 리보좀 결합부 또는 전사 종결인자와 같은 조절 인자이거나 이를 포함할 수 있다.
본원에서, "코딩부"는 아미노산으로 번역되는 코돈으로 이루어진 핵산부이다. "정지 코돈" (TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되진 않지만, 코딩부의 일부로 간주할 수 있으며, 임의의 측면 서열, 예를 들어, 프로모터, 리보좀 결합부, 전사 종결인자, 인트론 등은 코딩부의 일부가 아니다. 본 발명의 2 이상의 코딩부는 예를 들어 단일 벡터 상의 하나의 폴리뉴클레오티드 구조체로 또는 예컨대 분리된 (다른) 벡터 상의 분리된 폴리뉴클레오티드 구조체로서 존재할 수 있다. 아울러, 임의의 벡터는 하나의 코딩부를 포함할 수 있거나, 2 이상의 코딩부를 포함할 수 있으며, 예를 들어 하나의 벡터가 면역글로불린 중쇄 가변부와 면역글로불린 경쇄 가변부를 분리하여 코딩할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 항-CXCL13 항체 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 코딩하는 핵산이 융합되거나 융합되지 않은 이종 코딩부를 코딩할 수 있다. 이종 코딩부는 분비 신호 펩타이드 또는 이종 기능성 도메인과 같은 특수 인자 또는 모티프를 비제한적으로 포함한다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. DNA의 경우, 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 하나 이상의 코딩부와 작동가능하게 조합된 프로모터 및/또는 기타 전사 또는 번역 조절 인자를 포함할 수 있다. 작동가능한 조합은, 유전자 산물, 예컨대 폴리펩타이드에 대한 코딩부가 조절 서열(들)의 통제 하에 또는 영향 하에 유전자 산물의 발현을 배치시키는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 조합된 것이다. 프로모터 기능의 도입으로 원하는 유전자 산물을 코딩하는 mRNA가 전사되고, 2개의 DNA 단편들 간의 결합 특성이 유전자 산물의 발현을 지시하는 발현 조절 서열의 능력이나 DNA 주형이 번역되는 역량을 방해하지 않는다면, 2개의 DNA 단편 (예, 폴리펩타이드 코딩부 및 이와 조합된 프로모터)은 "작동가능하게 조합"된 것이다. 따라서, 프로모터 영역은 프로모터가 핵산의 전사를 수행할 수 있다면 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산과 작동가능하게 조합된 것일 것이다. 프로모터는 미리 정해진 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 지시하는 세포 특이 프로모터일 수 있다. 기타 전사 조절 인자들, 프로모터 이외에, 예를 들어, 인핸서, 오퍼레이터, 억제인자 및 전사 종결 신호는 세포-특이적인 전사를 지시하도록 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 조합될 수 있다. 적정 프로모터와 그외 전사 조절부들은 본원에 기술되어 있다.
다양한 전사 조절부들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 이러한 것으로는, 비제한적으로, 척추 동물 세포에서 작동하는 전사 조절부, 예컨대, 비제한적으로, 사이토메갈로바이러스 (인트론 -A와 연결된 최초기 프로모터), 시미언(simian) 바이러스 40(초기 프로모터) 및 레트로바이러스 (예, Rous 사코마 바이러스) 유래 프로모터 및 인핸서 부분이 있다. 그외 전사 조절부로는 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 베타-글로빈 뿐만 아니라 그외 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 서열 등의 척추 동물 유전자 유래의 것을 포함한다. 추가적인 적합한 전사 조절부로는 조직-특이적인 프로모터 및 인핸서 뿐만 아니라 림포카인-유발성 프로모터 (예, 인터페론 또는 인터루킨에 의해 유도되는 프로모터)가 있다.
마찬가지로, 다양한 번역 조절 인자들이 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지되어 있다. 이러한 것으로는 리보좀 결합부, 번역 개시 코돈, 번역 종결 코돈 및 피코르나바이러스 유래 인자 (특히 내부 리보좀 도입부, 또는 IRES, 이는 또한 CITE 서열로 지칭됨)가 있으나, 이로 한정되지 않는다.
다른 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA, 예를 들어 메신저 RNA (mRNA) 형태의 RNA이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩부는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 분비 또는 신호 펩타이드를 코딩하는 추가적인 코딩부와 조합될 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유류 세포에 의해 분비되는 단백질은 조면 소포체를 관통하여 자라는 단백질의 유출이 개시된 후 성숙한 단백질로부터 절단되는 신호 펩타이드 또는 분비 리더 서열을 가진다. 당해 기술 분야의 당업자는, 척추 동물 세포에 의해 분비되는 폴리펩타이드가 일반적으로 완전한 또는 "전장" 폴리펩타이드로부터 절단되어 분비된 또는 "성숙한" 형태의 폴리펩타이드가 제조되는, 폴리펩타이드의 N-말단에 융합된 신호 펩타이드를 가진다는 것을 인지하고 있다. 특정 구현예에서, 천연 신호 펩타이드, 예컨대 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩타이드가 사용되거나 또는 이와 작동가능하게 조합된 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 능력을 보유한 서열의 기능성 유도체가 사용된다. 다른 예로, 이종 포유류 신호 펩타이드 또는 이의 기능성 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성인자 (TPA) 또는 마우스 베타-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환될 수 있다.
본 발명의 "결합 분자" 또는 "항원 결합 분자"는 광의의 의미로 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 일 구현예에서, 결합 분자는 CXCL13 (BCA-1이라고도 함)에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예컨대 항-CXCL13 항체이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 항체 분자의 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 하나 이상의 항원 분자 유래 2 이상의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명에서 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자 유래의 3 이상의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자 유래의 4개 이상의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자 유래의 5개 이상의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 하나 이상의 항체 분자 유래의 6개 이상의 CDR을 포함한다. 특정 구현예에서, CDR들 중 하나 이상은 MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2, 또는 3C9이다.
본 발명은 특정 항-CXCL13 항체, 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 관한 것이다. 천연 항체 등의 전장 항체가 구체적으로 언급되지 않은 한, 용어 "항-CXCL13 항체"는 전장 항체 뿐만 아니라 상기 항체의 항원-결합 단편, 변이체, 유사체 또는 유도체, 예컨대 천연 항체, 면역글로불린 분자, 조작된 항체 분자 또는 항체 분자와 유사한 방식으로 항원에 결합하는 단편을 망라한다.
본원에서, "인간" 또는 "완전한 인간" 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 구비한 항체를 포함하며, 인간 면역글로불린 라이브러리 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대한 형질전환 동물로부터 분리된 항체를 포함하며, 전술한 바와 같이, 예를 들어 Kucherlapati 등의 미국 특허 5,939,598에 기술된 바와 같이 내인성 면역글로불린을 발현하진 않는 것이다. "인간" 또는 "완전한 인간" 항체는 또한 적어도 중쇄의 가변 도메인 또는 중쇄 및 경쇄의 적어도 가변 도메인을 포함하는 항체이며, 이때 가변성 도메인(들)은 인간 면역글로불린 가변 도메인(들)의 아미노산 서열을 가진다.
"인간" 또는 "완전한 인간" 항체는 또한 전술한 바와 같이, 본원에 기술된 항체 분자 (예, VH 영역 및/또는 VL 영역)의 변이체 (유도체 포함)로 필수적으로 구성되거나 구성되거나 포함하는 "인간" 또는 "완전한 인간" 항체를 포함하며, 항체 또는 이의 단편은 CXCL13 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체에 면역특이적으로 결합한다. 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 표준 기법을 이용하여, 비제한적으로, 아미노산 치환을 수행하는 부위-특이적인 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발 등의, 인간 항-CXCL13 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입할 수 있다. 바람직하게는, 변이체 (유도체 포함)는, 기준 VH 영역, VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VL 영역, VLCDR1, VLCDR2 또는 VLCDR3에 대한, 아미노산 50개 미만의 치환, 아미노산 40개 미만의 치환, 아미노산 30개 미만의 치환, 아미노산 25개 미만의 치환, 아미노산 20개 미만의 치환, 아미노산 15개 미만의 치환, 아미노산 10개 미만의 치환, 아미노산 5개 미만의 치환, 아미노산 4개 미만의 치환, 아미노산 3개 미만의 치환, 아미노산 2개 미만의 치환을 코딩한다.
특정 구현예에서, 아미노산 치환은 아래에서 추가적으로 기술되는 보존적인 아미노산 치환이다. 다른 예로, 돌연변이는 포화 돌연변이 유발에 의해서와 같이 코딩 서열 전체 또는 일부에 랜덤 도입될 수 있으며, 제조되는 돌연변이체는 활성 (예, CXCL13 폴리펩타이드, 예컨대 인간, 뮤라인 또는 인간과 뮤라인의 CXCL13에 대한 결합력)을 보유한 돌연변이체를 동정하기 위해 생물 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. "인간" 또는 "완전한 인간(fully human)" 항체에 대한 이러한 변이체 (또는 이의 유도체)는, 또한, "최적화된" 또는 "항원 결합에 대해 최적화된" 인간 또는 완전한 인간 항체로서 지칭될 수 있으며, 항원에 대해 개선된 친화성을 가지는 항체를 포함할 수 있다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원에서 상호호환적으로 사용된다. 항체 또는 면역글로불린은 적어도 중쇄의 가변 도메인을 포함하며, 통상 적어도 중쇄의 가변 도메인과 경쇄의 가변 도메인을 포함한다. 척추동물 시스템에서의 기본적인 면역글로불린 구조는 상대적으로 잘 해명되어 있다. 예로, Harlow et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)을 참조한다.
아래에서 보다 상세하게 기술된 바와 같이, 용어 "면역글로불린"은 생화학적으로 구분할 수 있는 매우 다양한 유형의 폴리펩타이드를 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자는, 중쇄가 일부 아군(예, γ1-γ4)을 포함하는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론 (γ, μ, α, δ, ε)으로 분류된다는 것을 알 것이다. 이는 IgG, IgM, IgA IgG 또는 IgE로 각각 항체의 "클래스"를 결정하는 체인의 특성이다. 면역글로불린 아군 (이소형), 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등이 잘 특정화되어 있으며, 기능적인 전문성을 부여하는 것으로 알려져 있다. 당업자는 본 개시내용에 비추어 이들 클래스 및 이소형 각각에 대한 변형 버전들을 쉽게 인지할 것이며, 따라서 이들은 본 발명의 범위에 포함된다. 면역글로불린 클래스들은 모두 본 발명의 범위에 명백하게 포함되며, 아래 내용은 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 클래스에 대한 것일 것이다. IgG와 관련하여, 표면 면역글로불린 분자는 분자량이 대략 23,000 달톤인 2개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드와, 분자량이 대략 53,000-70,000인 2개의 동일한 중쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 이들 체인 4개는, 경쇄가 "Y"의 벌어진 부분에서 시작하여 가변부로 이어지는 중쇄에 덧대어 있는 "Y" 구조로 이황화 결합에 의해 통상 연결되어 있다.
경쇄는 카파 또는 람다 (κ, λ)로 분류된다. 각 중쇄 클래스는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유적으로 결합되며, 2개의 중쇄의 "꼬리" 부분은 이황화 공유 결합, 또는 면역글로불린이 하이브리도마, B-세포 또는 유전자 조작된 숙주 세포에 의해 제조되는 경우에는, 비공유 결합에 의해 서로 결합된다. 중쇄에서는, 아미노산 서열은 Y 구조의 포크 끝에 위치한 N-말단에서, 각 체인의 하부에 위치한 C-말단으로 이어진다.
경쇄 및 중쇄는 구조 및 기능적 상동성 영역들로 나뉘어진다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이런 점에서, 경쇄의 가변 도메인 (VL 또는 VK) 및 중쇄의 가변 도메인 (VH)이 항원 인지와 특이성을 결정하는 것으로 이해될 것이다. 반대로, 경쇄의 불변 도메인 (CL)과 중쇄의 불변 도메인 (CH1, CH2 또는 CH3)은 분비, 태반을 통한 이동성(transplacental mobility), Fc 수용체 결합, 보체 결합 등과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. 관례상, 불변부 도메인은 항체의 항원 결합부 또는 아미노 말단에서 멀어질수록 번호가 높아진다. N-말단부는 가변부이고, C-말단부는 불변부이며; CH3 및 CL 도메인은 실제 중쇄 및 경쇄 각각의 카르복시-말단을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 가변부는 항체가 항원의 에피토프를 선택적으로 인지하여, 특이적으로 결합할 수 있게 한다. 즉, 항원의, VL 도메인 및 VH 도메인, 또는 이들 가변 도메인내 상보성 결정부 (CDR)의 서브세트가 조합하여, 3차원의 항원 결합부를 정의하는 가변부를 형성한다. 이러한 항원의 4차원 구조는 Y의 각 팔의 끝부분에 존재하는 항원 결합부를 형성한다. 보다 구체적으로는, 항원 결합부는 VH 및 VL 체인들 각각에서의 3개의 CDR에 의해 규정된다. 일부 예들에서, 예컨대, 카멜리드(camelid) 종으로부터 유래되거나 카멜리드 면역글로불린을 기초로 조작된 임의 면역글로불린 분자, 완전한 면역글로불린 분자는 중쇄로만 구성될 수 있으며, 경쇄는 포함하지 않는다. 예로, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)을 참조한다.
천연 항체에서, 각 항원 결합 도메인에 존재하는 6개의 "상보성 결정부" 또는 "CDR"은, 항체가 수계 환경에서 3차원 구조를 취하면서, 항원 결합 도메인을 형성하도록 특이적으로 배치된, 짧고, 비-인접한 아미노산 서열들이다. 항원 결합 도메인에서 나머지 아미노산들은 "프래임워크" 영역으로 지칭되며, 분자간 가변성이 거의 없다. 이 프래임워크 영역은 대게 베타-시트 구조를 취하며, CDR은, 베타-시트의 구조를 연결하고, 일부 경우에는 베타-시트 구조의 일부를 형성한다. 즉, 프래임워크 영역은 체인간 비-공유 상호작용에 의해 올바른 배향으로 CDR을 배치시키는 스캐폴드가 형성되도록 작용한다. 배치된 CDR들로 형성된 항원 결합 도메인은 면역반응성 항원의 에피토프에 대한 표면 상보성을 형성한다. 이러한 상보성 표면은 항체가 이의 동족 에피토프에 비-공유 결합하도록 만든다. CDR 및 프래임워크 영역을 각각 포함하는 아미노산들은, 정확하게 파악되어 있어, 당해 기술 분야의 당업자가 임의의 소정의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인들을 쉽게 동정할 수 있다 (하기 참조).
당해 기술분야에서 사용되거나 및/또는 허용되는 용어에 대해 2가지 이상의 정의가 존재하는 경우, 본원에서 용어에 대한 정의는 명확하게 반대로 언급되지 않은 한 이러한 의미들을 모두 포함하는 것으로 의도된다. 구체적인 예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 가변부에서 확인되는 비-인접한 항원 조합 부위들을 설명하는데 용어 "상보성 결정부" ("CDR")를 사용하는 것이다. 이러한 특정 부위는 Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" 및 Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)에 의해 개시된 바 있으며, 이들 문헌에서의 정의에는 서로 비교하였을 때 중복되거나 서브세트의 아미노산 잔기들이 포함되며, 상기 문헌들은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 그럼에도 불구하고, 항체의 CDR 또는 이의 변이체를 언급하기 위한 어떤 정의의 사용은, 정의되며 본원에 사용되는 용어 범위에 포함되는 것으로 의도된다. 전술한 각각의 참조문헌에서 정의되는 CDR을 포함하는 적합한 아미노산 잔기들을 비교하기 위해 아래 표 1에 열거한다. 특정 CDR을 포함하는 실제 잔기의 수는 CDR 서열과 사이즈에 따라 달라질 것이다. 당해 기술 분야의 당업자는, 항체의 가변부 아미노산 서열을 감안하여, 잔기가 특정 CDR을 포함하는지를 일상적으로 결정할 수 있다.
표 1. CDR 정의1
Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1표 1에서, CDR 정의에서의 넘버링은 Kabat 등에 의해 설명되는 넘버링 협약에 따른다 (아래 참조).
또한, Kabat 등은 임의의 항체에 적용가능한 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 규정한다. 당해 기술의 당업자는, 서열 자체 이외의 어떠한 실험 데이타에 의존하지 않고도, 임의의 가변 도메인 서열에 "Kabat 넘버링" 시스템을 자명하게 부여할 수 있다. 본원에서, "Kabat 넘버링"은 Kabat et al. (1983) U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest"에 기술된 넘버링 시스템을 지칭한다. 구체적으로 언급되어 있지 않은 한, 본 발명의 항-CXCL13 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에서의 특정 아미노산 잔기 위치에 대한 넘버링에 대한 언급에서는 Kabat 넘버링 시스템을 따른다.
본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유사체는, 다클론 항체, 단일클론 항체, 다중특이 (multispecific) 항체, 인간 항체, 인간화 항체(humanized antibody), 영장류화 항체(primatized antibody) 또는 키메라 항체(chimeric antibody), 단쇄 항체, 에피토프-결합 단편, 예컨대, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fvs, 단쇄 Fvs(scFv), 이황화 연결된 Fvs(sdFv), VL 또는 VH 도메인 중 어느 하나를 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에서 제조된 단편, 및 항-이디오타입(항-Id) 항체(예, 본원에 기술된 항-CXCL13 항체에 대한 항-Id 항체 포함)를 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. ScFv 분자는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 미국 특허 5,892,019에 언급되어 있다. 본 발명의 면역글로불린 또는 항체 분자는 면역글로불린 분자의 임의 타입(예, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2, 등) 또는 서브클래스일 수 있다.
본원에서, 용어 "중쇄 부분"은 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 중쇄 부분을 포함하는 폴리펩타이드는 CH1 도메인, 힌지(예, 상, 중 및/또는 하위 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 그의 변이체 또는 단편 중 하나 이상을 포함한다. 예컨대, 본 발명에 사용하기 위한 결합 폴리펩타이드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 체인; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부분 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 체인; CH1 도메인과 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 체인; CH1 도메인, 힌지 도메일의 적어도 일부분 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 체인, 또는 CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부분, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 체인을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 체인을 포함한다. 아울러, 본 발명에 사용하기 위한 결합 폴리펩타이드는 CH2 도메인의 적어도 일부분 (예, CH2 도메인의 전체나 일부)이 없을 수 있다. 전술한 바와 같이, 당업자라면, 이들 도메인 (예, 중쇄 부분들)이, 천연 면역글로불린 분자 유래 아미노산 서열을 수정하도록 변형시킬 수 있음을 알 것이다.
본원에 기술된 임의 항-CXCL13 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 있어서, 다량체의 하나의 폴리펩타이드 체인에서 중쇄 부분은 다량체의 제2 폴리펩타이드 체인의 중쇄 부분과 동일하다. 다른 예로, 본 발명의 중쇄 부분-함유성 단량체들은 동일하지 않다. 예컨대, 각 단량체는 여러가지 타겟 결합부를 포함하여, 예컨대 2중 특이적인 항체를 형성할 수 있다.
본 발명에 기술된 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 결합 분자의 중쇄 부분은 상이한 면역 분자들로부터 유래될 수 있다. 예컨대, 폴리펩타이드의 중쇄 부분은 IgG1 분자로부터 유래된 CH1 도메인과 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 예로, 중쇄 부분은 부분적으로 IgG1 분자로부터, 그리고 부분적으로 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 예로, 중쇄 부분은 부분적으로 IgG1 분자로부터, 그리고, 부분적으로 IgG4 분자로부터 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.
본원에서, 용어 "경쇄 부분"은 면역글로불린 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열, 예컨대 카파 또는 람다 경쇄를 포함한다. 바람직하기로는, 경쇄 부분은 VL 또는 CL 도메인 중 하나 이상을 포함한다.
본원에 기술된 항-CXCL13 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는, 항원, 예컨대 인지하여 특이적으로 결합하는 본원에 기술된 타겟 폴리펩타이드(CXCL13)의 에피토프(들) 또는 일부분(들)이라는 측면으로 기술되거나 구체적으로 명시될 수 있다. 항체의 항원 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 타겟 폴리펩타이드의 부분이 "에피토프" 또는 "항원 결정기"이다. 타겟 폴리펩타이드는 하나의 에피토프를 포함할 수 있지만, 전형적으로는 2 이상의 에피토프를 포함하며, 항원의 크기, 구조 및 타입에 따라 임의 갯수의 에피토프를 포함할 수 있다. 아울러, 타겟 폴리펩타이드 상의 "에피토프"는 비-폴리펩타이드 요소이거나 이를 포함할 수 있으며, 예컨대 에피토프는 탄수화물 측쇄를 포함할 수 있다.
항체의 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프의 최소 크기는 아미노산 약 4 내지 5개인 것으로 생각된다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프는 바람직하게는 적어도 7개, 더 바람직하게는 적어도 9개, 가장 바람직하게는 적어도 약 15개 내지 약 30개의 아미노산을 포함한다. CDR은 이의 3차 구조에서 항원성 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인지할 수 있기 때문에, 에피토프를 구성하는 아미노산들은 인접한 아미노산일 필요는 없으며, 어떤 경우에는 동일한 펩타이드 체인 상에 있지 않을 수도 있다. 본 발명의 항-CXCL13 항체에 의해 인지되는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프는, CXCL13의 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 더 바람직하게는 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 또는 약 15개 내지 약 30개의 연속적인 또는 비연속적인 아미노산들로 구성된 서열을 포함할 수 있다.
"특이적으로 결합한다"는 것은 일반적으로 항체가 이의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하고, 이 결합이 항원 결합 도메인과 에피토프 간에 일부 상보성을 수반함을 의미한다. 이러한 정의에 따라, 항체는 랜덤한, 관련없는 에피토프에 결합하는 것 보다는 훨씬 용이하게 이의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합할 때, 에피토프에 "특이적으로 결합한다"라고 한다. 용어 "특이성"은 본원에서 특정 에피토프에 특정 항체가 결합하는 상대적인 친화성을 나타내는 것이다. 예컨대, 항체 "A"는 항체 "B" 보다 소정의 에피토프에 대해 보다 높은 특이성을 가지는 것으로 판단할 수 있거나, 또는 항체 "A"가 동족 에피토프 "D" 보다 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합할 수 있다고 할 수 있다.
"선호적으로 결합한다"는, 항체가 관련된, 비슷한, 상동적인 또는 유사한 에피토프에 결합하는 것 보다 훨씬 용이하게 에피토프에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 즉, 소정의 에피토프에 "선호적으로 결합하는" 항체는 이러한 항체가 동족의 에피토프와 교차-반응할 수 있더라도, 동족 에피토프 보다 상기 에피토프에 결합할 가능성이 더 높을 것이다.
비제한적인 예로서, 항체가 제2 에피토프의 항체의 해리 상수(KD) 보다 낮은 KD로 제1 에피토프에 결합한다면, 항체가 제1 에피토프에 선호적으로 결합하는 것으로 간주할 수 있다. 다른 비제한적인 예로, 항체가 제2 에피토프에 대한 항체의 KD 보다 적어도 10 정도로 낮은 KD로 제1 에피토프에 결합한다면, 항체는 제1 항원에 선호적으로 결합하는 것으로 생각할 수 있다. 다른 비제한적인 예로, 항체가 제2 에피토프에 대한 항체의 KD 보다 적어도 100 수준으로 낮은 KD로 제1 에피토프에 결합한다면, 항체는 제1 항원에 선호적으로 결합하는 것으로 생각할 수 있다.
다른 비제한적인 예로, 항체가 제2 에피토프에 대한 항체의 오프율 (off rate, k(off)) 보다 낮은 k(off)로 제1 에피토프에 결합한다면, 항체는 제1 에피토프에 선호적으로 결합하는 것으로 생각할 수 있다. 다른 비제한적인 예로, 항체가 제2 에피토프에 대한 항체의 k(off) 보다 적어도 10 이하의 k(off)로 제1 에피토프에 결합한다면, 항체는 제1 항원에 선호적으로 결합하는 것으로 생각할 수 있다. 다른 비제한적인 예로, 항체가 제2 에피토프에 대한 항체의 k(off) 보다 적어도 100배 이하의 k(off)로 제1 에피토프에 결합한다면, 항체는 제1 항원에 선호적으로 결합하는 것으로 생각할 수 있다. 본원에 기술된 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 5 X 10-2 sec-1, 10-2 sec-1, 또는 5 X l0-3 sec-1 이하의 오프율 (k(off))로, 본원에 기술된 타겟 폴리펩타이드 (예, CXCL13, 예컨대, 인간, 뮤라인 또는 인간 및 뮤라인의 CXCL13) 또는 그의 단편이나 변이체에 결합하다고 칭할 수 있다. 특정 구현예에서, k(off)는 약 3 X 10-2 이하이며, 예컨대, 항체는 3D2이고 CXCL13은 인간 또는 마우스 유래이다. 다른 구현예에서, k(off)는 약 3 X 10-3이하이며, 예컨대, 항체는 MAb 5261이고, CXCL13은 인간 또는 마우스 유래이다. 다른 구현예에서, k(off)는 약 4 X 10-3 이하이며, 예컨대, 항체는 MAb 5378이고, CXCL13은 인간 또는 마우스 유래이다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 본원에 기술된 타겟 폴리펩타이드 (예, CXCL13, 예컨대, 인간 CXCL13, 뮤라인 CXCL13, 또는 인간 및 뮤라인 CXCL13), 또는 이의 단편 또는 변이체에, 5 X 10-4 sec-1, 10-4 sec-1, 5 X 10-5 sec-1, or 10-5 sec-1, 5 X 10-6 sec-1, 10-6 sec-1, 5 X 10-7 sec-1 또는 10-7 sec-1 이하의 오프율 (k(off))로 결합하는 것일 수 있다.
본원에 기술된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는, 본원에 기술된 타겟 폴리펩타이드 (예, CXCL13, 예컨대, 인간 CXCL13, 뮤라인 CXCL13, 또는 인간 및 뮤라인 CXCL13) 또는 이의 단편 또는 변이체에, 103 M-1 sec-1, 5 X 103 M-1 sec-1, 104 M-1 sec-1, 5 X 104 M-1 sec-1, 105 M-1 sec-1, 5 X 105 M-1 sec-1, 106 M-1 sec-1 또는 5 X 106 M-1 sec-1의 on rate (k(on))로 결합하는 것일 수 있다. 특정 구현예에서, k(on)은 약 5 X 105 이상이며, 예컨대, 항체는 3D2이고, CXCL13은 인간 유래이거나; 또는 k(on)은 약 1 X 105 이상이며, 예컨대, 항체는 3D2이고, CXCL13은 마우스 유래이다. 다른 구현예에서, k(on)은 약 1 X 106 이상이며, 예컨대, 항체는 MAb 5261이고, CXCL13은 인간 또는 마우스 유래이다. 다른 구현예에서, k(on)은 약 1 X 106 이상이며, 예컨대, 항체는 MAb 5378이고, CXCL13은 인간 또는 마우스이다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 본원에 기술된 타겟 폴리펩타이드 (예, CXCL13, 예컨대, 인간 CXCL13, 뮤라인 CXCL13, 또는 인간 및 뮤라인 CXCL13), 또는 이의 단편 또는 변이체에, 105 M-1 sec-1, 5 X 105 M-1 sec-1, 106 M-1 sec-1, 5 X 106 M-1 sec-1 또는 107 M-1 sec-1의 on rate (k(on))로 결합하는 것일 수 있다.
에피토프에 대한 기준 항체의 결합을 어느 정도 차단하는 수준으로 소정의 에피토프에 선호적으로 결합한다면, 항체가, 소정의 에피토프에 대한 기준(reference) 항체의 결합을, 예컨대 본원에 기술된 항-CXCL3 항체, 예컨대, MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2 또는 3C9의 결합을 경쟁적으로 저해한다고 한다. 경쟁적인 저해는 당업계에 공지된 모든 방법, 예컨대 경쟁적인 ELISA 분석으로 측정할 수 있다. 항체는, 소정의 에피토프에 대한 기준 항체의 결합성을 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50%로 경쟁적으로 저해하는 것일 수 있다.
본원에서, 용어 "친화성"은 면역글로불린 분자의 CDR과 각 에피토프의 결합 세기의 값이다. 예컨대, Harlow et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.) pages 27-28을 참조한다. 본원에서, 용어 "화합성(avidity)"은 면역글로불린 집단과 항원 간의 복합체의 전체적인 안정성, 즉, 면역글로불린 혼합물과 항원의 기능적인 조합 세기를 의미한다. 예로, Harlow 문헌의 29-34 페이지를 참조한다. 화합성은 특이적인 에피토프를 가진 집단에서의 개별 면역글로불린 분자들의 친화성과, 또한 면역글로불린과 항원의 결합가(valency) 둘다와 관련있다. 예를 들어, 이가 단일클론 항체와 반복성이 높은 에피토프 구조를 가진 항원, 예컨대 폴리머 간의 상호작용이 한가지의 높은 화합성일 것이다.
본원의 항-CXCL13 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 그것의 교차-반응성 측면에서 기술되거나 또는 명시될 수 있다. 본원에서, 용어 "교차-반응성"은 하나의 항원에 특이적인 항체가 제2 항원과 반응하는 능력을 의미하며, 2개의 다른 항원성 물질들 간의 관련성의 척도이다. 따라서, 항체가 이의 형성을 유도한 것이 아닌 다른 에피토프에 결합한다면, 항체는 교차 반응성인 것이다. 교차 반응성 에피토프는 일반적으로 유도성 에피토프와 동일한 상보적인 구조적 특징을 다수 포함할 수 있으며, 어떤 경우에는 오리지널 보다 실제 더 잘 맞을 수 있다.
예컨대, 어떤 항체는 어느 정도의 교차-반응성을 가지며, 즉, 이는, 동족이지만 동일하진 않은 에피토프, 예컨대 참조 에피토프에 대해 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55%, 및 적어도 50% 이상의 동일성 (당업계에 공지된 방법과 본원에 기술된 방법을 이용하여 계산함)을 가진 에피토프에 결합한다. 항체가 참조 에피토프에 대해 95% 미만, 90%% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만의 동일성 (당업계에 공지된 방법과 본원에 기술된 방법을 이용하여 계산함)을 가진 에피토프에 결합하지 않는다면, 항체는 교차-반응성이 거의 또는 전혀 없다고 할 수 있다. 항체가 특정 에피토프의 임의의 다른 유사체, 오소로그 (ortholog) 또는 상동체에 결합하지 않는다면, 항체는 상기 에피토프에 "고특이적인" 것으로 간주될 수 있다.
본 발명의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는, 본 발명의 폴리펩타이드, 예컨대, CXCL13, 예컨대, 인간 CXCL13, 뮤라인 CXCL13, 또는 인간 및 뮤라인 CXCL13에 대한 이들의 결합 친화성 측면에서 기술되거나 또는 명시될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 결합 친화성은 해리 상수 또는 Kd가 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, 또는 10-15 M 이하인 것을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항원 또는 이의 항원 결합 단편은, 인간 CXCL13에, Kd 약 5 x 10-9 M - 약 5 x 10-10 M으로 결합하며, 예로, 항체는 MAb 5261이고, Kd는 약 5 x 10-9 M 이하이다. 다른 구현예에서, 본 발명의, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 뮤라인 CXCL13에 Kd 약 5 x 10-7 M - 약 9 x 10-9 M으로 결합하며, 예로, 항체는 MAb 5261이고, Kd는 약 8 x 10-9 M 이하이다.
본 발명의 항-CXCL13 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 "다중 특이적", 예컨대 2중 특이적, 3중 특이적 또는 그 이상의 다중 특이적일 수 있으며, 이는 동시에 하나 이상의 다른 항원 (예, 단백질)에 존재하는 2 이상의 상이한 에피토프를 인지하여 결합하는 것을 의미한다. 즉, 항-CXCL13 항체가 "단일 특이적"이거나 또는 "다중 특이적", 예컨대 "2중 특이적"인지는, 결합 폴리펩타이드와 반응하는 상이한 에피토프의 수를 나타낸다. 다중 특이적인 항체는 본원에 기술된 타겟 폴리펩타이드의 여러가지 에피토프에 대해 특이적일 수 있거나, 또는 이는 타겟 폴리펩타이드 뿐만 아니라 이종의 폴리펩타이드나 또는 고형 지지 물질 등의 이종의 에피토프에 대해 특이적일 수 있다.
본원에서, 용어 "결합가(valency)"는 결합 펩타이드 또는 CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 존재하는 잠재적인 결합 도메인의 수, 예컨대 항원 결합 도메인의 수를 나타낸다. 각 결합 도메인은 하나의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 결합 폴리펩타이드 또는 CXCL13 결합 분자가 1 보다 많은 수의 도메인을 포함한다면, 각 결합 도메인은 2개의 결합 도메인을 가진 "2가 단일 특이적"인 항체에서는 동일한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나, 또는 2개의 결합 도메인을 가진, 즉 "2가 이중 특이적"인 항체에서는 상이한 에피토프들에 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 각 특이성에 대해 2중 특이적이며 2가일 수 있다 ("2중 특이적인 4가 항체"라 함). 다른 구현예에서, 4가 미니바디(minibody) 또는 도메인이 결손된 항체가 제조될 수 있다.
2중 특이적인 2가 항체 및 이의 제조 방법은, 예컨대 미국 특허 5,731,168; 5,807,706; 5,821,333; 및 미국 출원 공개번호 2003/020734와 2002/0155537에 설명되어 있으며, 이들 문헌 모두 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 2중 특이적인 4가 항체 및 이의 제조 방법은, 예컨대 WO 02/096948과 WO 00/44788에 설명되어 있으며, 이들 문헌 모두 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 일반적으로, PCT 공개공보 WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69 (1991); 미국 특허 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)을 참조한다.
전술한 바와 같이, 다양한 면역글로불린 클래스의 서브유닛 구조와 불변 영역의 3차 구조는 잘 알려져 있다. 본원에서, 용어 "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단의 가변 도메인을 포함하며, 용어 "CH1 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 첫번째 (아미노 최말단) 불변 영역 도메인을 포함한다. CH1 도메인은 VH 도메인과 인접하며, 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 아미노 말단이다.
본원에서, 용어 "CH2 도메인"은 예컨대 통상적인 넘버링 체계로 항체의 약 244번 잔기에서 360번 잔기까지 이어지는 중쇄 분자의 일부 (잔기 244 - 360, Kabat numbering system; 및 잔기 231-340, EU 넘버링 시스템; Kabat EA et al. 참조)을 포함한다. CH2 도메인은 다른 도메인과 밀접하게 쌍을 이루지 않은 유일한 것이다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 체인이 온전한 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 끼여 있다. CH3 도메인이 CH2 도메인에서 IgG 분자의 C-말단까지 연장되고 약 108개의 잔기를 포함하는 것으로 잘 알려져 있다.
본원에서, 용어 "힌지 영역"은 CH1 도메인과 CH2 도메인을 연결하는 중쇄 분자의 일부분이다. 힌지 영역은 약 25개의 잔기를 포함하며, 유연하므로, 따라서 2개의 N-말단 항원 결합 영역들이 독립적으로 움직일 수 있도록 해준다. 힌지 영역은 3개의 구별되는 도메인, 상위, 중위 및 하위 힌지 도메인으로 다시 나눌 수 있다 (Roux et al. J. Immunol. 161:4083 (1998)).
본원에서, 용어 "이황화 결합"은 2개의 황 원자 사이에 형성된 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 2번째 티올기와 이황화 결합 또는 브릿지를 형성할 수 있는 티올기를 포함하고 있다. 대부분의 천연 IgG 분자들의 경우, CH1과 CL 영역들은 이황화 결합에 의해 연결되어 있으며, 2개의 중쇄는 Kabat 넘버링 시스템에 따른 239 및 242에 대응되는 위치 (226 또는 229번 위치, EU 넘버링 시스템)에서 이황화 결합에 의해 연결되어 있다.
본원에서, 용어 "키메라 항체"는 면역반응성 영역 또는 부위가 제1 종으로부터 수득 또는 유래되었고, 불변 영역 (온전한, 부분적인 또는 본 발명에 따라 변형될 수 있음)은 제2 종으로부터 수득되는, 임의의 항체를 의미한다. 특정 구현예에서, 타겟 결합 영역 또는 부위는 인간을 제외한 소스 (예, 마우스 또는 영장류)로부터 유래될 것이며, 불변 영역은 인간 유래 (예, 본원에 기술된 단일클론 항체 (MAb) 1475)이다.
본원에서, 용어 "조작된 항체"는, 중쇄, 경쇄 또는 이 둘다 중 어느 하나에 있는 가변 도메인으로 공지 특이성을 구비한 항체로부터 하나 이상의 CDR을 적어도 부분적으로 치환함으로써, 필요에 따라서는, 프래임워크 영역의 적어도 부분적인 치환 및 서열 변동에 의해, 변이된, 항체를 의미한다. CDR은 프래임워크 영역이 유래된 항체와 동일한 클래스 또는 심지어는 서브클래스의 항체로부터 유래될 수도 있지만, CDR은 상이한 클래스의 항체로부터, 바람직하게는 상이한 종으로부터 유래된 항체로부터 유래될 수 있다. 공지된 특이성의 인간 이외의 종에 대한 항체로부터 유래된 하나 이상의 "공여" CDR이, 인간 중쇄 또는 경쇄의 프래임워크 영역에 그래프트된 조작된 항체를, 본원에서는 "인간화 항체"라고 한다. 반드시, 모든 CDR을 공여체의 가변 도메인 유래의 전체 CDR로 치환하여, 하나의 가변 도메인이 다른 것에 항원 결합하는 능력을 전달할 필요는 없을 수 있다. 오히려, 타겟 결합 부위의 활성을 유지하는데 필수적인 잔기를 전달하는 것만 필요할 수도 있다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 공여체의 가변 중쇄 도메인 유래의 CDR 1, 2 또는 3개를 포함한다. 다른 구현예에서, 인간화 항체는 공여체의 가변성 경쇄 모데인 유래의 CDR 1, 2 또는 3개를 포함한다.
인간화 항체 (예, MAb 5080 또는 5261)의 프래임워크 영역을 "전체 인간 프래임워크 영역"이라고 칭하는 경우, 인간화 항체의, 경쇄, 중쇄 또는 이 둘다에서, 가변 도메인내 프래임워크 영역은, 인간 기원의 잔기만 포함할 수 있다는 것으로 이해된다. 다른 예로, 공여체의 가변 도메인의 프래임워크 영역(들)을 구성하는 하나 이상의 잔기는, 필요에 따라 CXCL13 항원에 대한 결합성을 강화하거나 또는 적절한 결합성을 유지하기 위해, 인간화 항체의 중쇄, 경쇄 또는 이 둘다의 가변 도메인의 인간 프래임워크 영역(들)에서의 대응되는 위치로 조작할 수 있다. 이러한 방식으로 조작된 인간 프래임워크 영역은, 따라서, 인간 및 공여체의 프래임워크 잔기들의 혼합을 포함할 것이며, 이를 본원에서는 "부분적인 인간 프래임워크 영역"이라고 한다.
예컨대, 항-CXCL13 항체의 인간화는 윈터 및 동료에 의해 기술된 방법 (Jones et al. Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988))으로, 설치류나 돌연변이 설치류의 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항-CXCL13 항체의 대응되는 서열로 치환함으로써, 기본적으로 수행할 수 있다. 예로, 미국 특허 5,225,539; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 및 5,859,205를 참조하며, 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 제조되는 인간화 항-CXCL13 항체는 인간화 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인의 전체 인간 프래임워크 영역내에 위치된 하나 이상의 설치류 또는 돌연변이 설치류의 CDR을 포함하게 될 것이다. 어떤 경우에는, 인간화 항-CXCL13 항체의 하나 이상의 가변 도메인의 프래임워크 영역내 잔기가 대응되는 비-인간계(예, 설치류) 잔기로 치환되며 (예, 미국 특허 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 및 6,180,370), 이 경우, 제조되는 인간화 항-CXCL13 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인에 부분적인 인간 프래임워크 영역을 포함할 수 있다.
아울러, 인간화 항체는 수여 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능 (예, 원하는 친화성을 얻기 위해)을 추가로 강화한다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나 이상 및 전형적으로, 전체 또는 실질적으로 전체 CDR이 비-인간 면역글로불린의 것에 대응되고, 전체 또는 실질적으로 전체 프래임워크 영역이 인간 면역글로불린 서열의 프래임워크 영역인, 2개의 가변 도메인 전체를 실질적으로 포함할 것이다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 일부를 적어도, 전형적으로 인간 면역글로불린의 면역글로불린 불변 영역(Fc)을 포함할 것이다. 추가적인 내용은, Jones et al. Nature 331:522-525 (1986); Riechmann et al. Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)을 참조하며, 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 전체 인간 가변 도메인 보다는 실질적으로 작은 부분이 비-인간 종 유래의 대응 서열로 치환된, 항체를 포함할 수 있다. 실제, 인간화 항체는 일부 또는 전체 CDR 잔기들과, 어쩌면 일부 프래임워크 잔기들이 설치류 항체내 유사한 부위로부터 유래된 잔기로 치환된, 전형적인 인간 항체이다. 예로, 미국 특허 5,225,539; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 5,859,205를 참조한다. 또한, 미국 특허 6,180,370 및 국제 공개번호 WO 01/27160을 참조하며, 여기에는 미리 결정된 항원에 대해 향상된 친화성을 가진 인간화 항체를 제조하기 위한 기법과 인간화 항체가 기술되어 있다.
본원에서, 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합"은 상호 호환적으로 사용된다. 이들 용어는 화학적 접합 또는 재조합 수단 등의 어떠한 수단에 의해 2 이상의 요소나 구성을 함께 연결하는 것을 의미한다. "프래임내 융합(in-frame fusion)"은 오리지날 ORF의 정확한 번역 리딩 프래임을 유지하는 방식으로 연속적으로 2 이상의 폴리펩타이드 오픈 리딩 프래임(ORF)의 연결하여 보다 긴 ORF를 형성하는 것을 의미한다. 따라서, 재조합 융합 단백질은 오리지날 ORF에 의해 코딩되는 폴리펩타이드에 대응되는 2 이상의 세그먼트를 포함하는 (세그먼트들이 통상적으로 그렇게 본래 연결되지 않은) 단일 단백질이다. 즉, 리딩 프래임은 융합된 세그먼트들 전체가 연속적으로 생성되지만, 세그먼트는 예컨대 프래임내 링커 서열에 의해 물리적으로 또는 구조적으로 분리될 수 있다. 예컨대, 면역글로불린 가변 영역의 CDR을 코딩하고 있는 폴리뉴클레오타이드는 프래임내로 융합되지만, "융합된" CDR이 연속적인 폴리펩타이드의 일부분으로서 함께 번역되는 한, 하나 이상의 면역글로불린 프래임워크 영역 또는 추가적인 CDR 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 분리되어 있을 수 있다.
폴리펩타이드와 관련하여, "선형 서열" 또는 "서열"은 서열에서 서로 이웃한 잔기들이 폴리펩타이드의 1차 구조에서 인접한, 아미노에서 카르복시 말단 방향으로의, 폴리펩타이드에서의 아미노산의 순서이다.
용어 "발현"은, 본원에서, 유전자가 생화학 물질, 예컨대 폴리펩타이드를 제조하는 공정을 지칭한다. 공정은 유전자 낫다운 뿐만 아니라 일시적인 발현 및 안정적인 발현 등을 비제한적으로 포함하며, 세포내 유전자의 기능적 존재를 나타내는 임의 표명을 포함한다. 유전자의 메신저 RNA(mRNA)로의 전사와 이 mRNA의 폴리펩타이드(들)로의 번역을 비제한적으로 포함한다. 원하는 최종 산물이 생화학적 산물인 경우, 발현은 그러한 생화학적 산물과 임의 전구체의 생성을 포함한다. 유전자의 발현은 "유전자 산물"을 만들어낸다. 본원에서, 유전자 산물은 핵산, 예컨대 유전자의 전사에 의해 제조되는 메신저 RNA, 또는 전사체로부터 번역된 폴리펩타이드 중 어느 하나일 수 있다. 본원에 기술된 유전자 산물은 추가적으로 전사 후 변형, 예컨대 폴리아데닐화, 또는 번역 후 변형, 예컨대 메틸화, 당화, 지질의 부가, 그외 단백질 서브유닛의 조합, 단백질분해성 절단 등이 실시된 폴리펩타이드를 포함한다.
본원에서, 용어 "치료한다" 또는 "치료"는 치료학적 처치 및 예방학적 또는 예방적 처치 모두를 의미하며, 그 목적은 다발성 경화증, 루푸스, 관절염 또는 암의 진행 등의, 바람직하지 않은 생리학적 변화나 장애를 예방하거나 감퇴(약화)시키고자 하는 것이다. 유익하거나 또는 바람직한 임상 결과로는, 검출가능하거나 또는 검출불가하던지 상관없이, 증상의 완화, 질병의 범위 축소, 질병의 안정기 (즉, 악화되지 않음) 상태, 질병 진행의 지연 또는 서행, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 (부분적으로 또는 전반적으로) 진정을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. "치료"는 또한 치료를 시술받지 않은 경우에 예상되는 생존성에 비해 생존성 연장을 의미할 수 있다. 치료가 필요한 개체는 병태나 장애를 이미 가진 개체 뿐만 아니라 병태나 장애에 걸리기 쉬운 개체, 또는 병태나 장애가 예방되어야 할 개체를 포함한다.
"개체" 또는 "개개인" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유류"는, 진단, 예후 또는 치료가 바람직한 모든 개체, 특히 포유류 개체를 의미한다. 포유류 개체로는 인간, 가축 동물, 농장 동물, 및 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 랫, 마우스, 말, 소, 황소 등의 동물원, 스포츠 또는 애완 동물을 포함한다.
본원에서, "항-CXCL13 항체의 투여가 유익할 개체" 및 "치료가 필요한 동물" 등의 표현은, 예컨대 (예, 진단을 위한) 항-CXCL13 폴리펩타이드의 검출, 및/또는 치료, 즉 항-CXCL13 항체로 질병의 완화 또는 예방에 사용되는 항-CXCL13 항체의 투여시 유익할, 포유류 개체 등의 개체를 포함한다. 본원에 보다 상세하게 기술된 바와 같이, 항-CXCL13 항체를, 예컨대 약물, 프로드럭 또는 동위 원소에 접합되지 않은 상태로 사용할 수 있으며, 또는 접합될 수 있다.
II. 타겟 폴리펩타이드에 대한 기술
본원에서, 용어 "CXCL13" 및 "CXCL13 폴리펩타이드"는 상호호환적으로 사용된다. 특정 구현예에서, CXCL13는 전장 크기의 CXCL13 또는 이의 단편, 또는 CXCL13 변이체 폴리펩타이드를 포함하되, 상기 CXCL13 또는 CXCL13 변이체 폴리펩타이드의 단편은 전장 크기의 CXCL13의 기능적 특성을 일부 또는 모두 유지한다. 인간 CXCL13 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오티드 서열 (각각 서열번호 19 및 20)이 개시되었으며, 예로, Legler, et. al., J. Exp. Med. 187(4):655-660 (1998)을 참조한다. 마우스 CXCL13 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오티드 서열 (각각 서열번호 21 및 22)이 개시되었으며, 예로, Gunn, et. al., Nature 391(6669):799-803 (1998)을 참조한다. 아울러, 시노몰구스 원숭이 CXCL13 폴리펩타이드 서열은 서열번호 23에 나타낸 바와 같이 개시되었다.
III. 항-CXCL13 항체
CXCL13에 결합하는 상업적인 항체들, 예컨대 랫 항-마우스 MAb 470 (R & D Systems) 및 마우스 항-인간 MAb 801 (R & D Systems)이 당해 기술 분야에 개시되어 있다. 또한, 미국 공개번호 2008 0227704 A1에 뮤라인 항-CXCL13 항체가 개시되어 있다.
본 발명의 항체는, 항-CXCL13 항체, 또는 CXCL13에 결합하는, 항원-결합 단편, 이의 단편, 변이체 또는 유도체, 예컨대, MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2, 또는 3C9를 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CXCL13 항체는 인간 CXCL13, 영장류 CXCL13, 뮤라인 CXCL13 또는 인간 및 뮤라인 CXCL13 둘다에 결합한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-CXCL13 항체는 인간화된다. 다른 구현예에서, 항-CXCL13 항체는 CXCL13가 이의 수용체, 예컨대, CXCR5에 결합하는 것을 차단한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-CXCL13 항체는 MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2, 3C9 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체이다.
일 구현예에서, 본 발명은, 기준 항체와 동일한 CXCL13 에피토프에 특이적으로 결합하는, 분리된 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 및 유도체, 예컨대, MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2 또는 3C9를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은, CXCL13에 특이적으로 결합하며, CXCL13, 예컨대 인간 CXCL13, 영장류 CXCL13, 뮤라인 CXCL13 또는 인간과 뮤라인의 CXCL13 둘다와의 특이적인 결합에 대해 기준 항체, 예컨대, MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2 또는 3C9를 경쟁적으로 저해하는, 분리된 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 결합 분자는 기준 항-CXCL13 항체 분자에 대해 적어도 약 80%, 약 85%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94% 또는 약 95%의 아미노산 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 가진다. 다른 구현예에서, 결합 분자는 기준 항체와 적어도 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100%의 서열 동일 동일성을 공유한다. 특정 구현예에서, 기준 항체는 MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2 또는 3C9이다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 (VH 도메인)을 포함하거나, 이로 필연적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지되, 상기 VH 도메인의 CDR들 중 적어도 하나가 서열번호 3 또는 13의 CDR1, CDR2 또는 CDR3와 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 가진, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 (VH 도메인)을 포함하거나, 이로 필연적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지되, 상기 VH 도메인의 CDR들 중 적어도 하나가 서열번호 4, 5 또는 6과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 가진, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 (VH 도메인)을 포함하거나, 이로 필연적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지되, 상기 VH 도메인은 서열번호 3 또는 13과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 가진, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 (VH 도메인)을 포함하거나, 이로 필연적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지되, 상기 VH 도메인의 CDR들 중 적어도 하나가 서열번호 3 또는 13의 CDR1, CDR2 또는 CDR3와, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 보존적인 아미노산 치환을 제외하고는, 동일한 아미노산 서열을 가진, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 (VH 도메인)을 포함하거나, 이로 필연적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지되, 상기 VH 도메인의 CDR들 중 적어도 하나가 서열번호 4, 5 또는 6과, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 보존적인 아미노산 치환을 제외하고는, 동일한 아미노산 서열을 가진, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 서열번호 3 또는 13과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가진 VH 도메인을 포함하거나, 이로 필연적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지되, 코딩된 VH 도메인을 포함하는 항-CXCL13 항체가 CXCL13에 특이적으로 또는 선호적으로 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 (VL 도메인)을 포함하거나, 이로 필연적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지되, 상기 VL 도메인의 CDR들 중 적어도 하나가 서열번호 8, 15 또는 17의 CDR1, CDR2 또는 CDR3와 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 가진, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 (VL 도메인)을 포함하거나, 이로 필연적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지되, 상기 VL 도메인의 CDR들 중 적어도 하나가 서열번호 9, 16, 10 또는 11과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 가진, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 (VL 도메인)을 포함하거나, 이로 필연적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지되, 상기 VL 도메인이 서열번호 8, 15 또는 17과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 가진, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 (VL 도메인)을 포함하거나, 이로 필연적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지되, 상기 VL 도메인의 CDR들 중 적어도 하나가 서열번호 8, 15 또는 17의 CDR1, CDR2 또는 CDR3와, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 보존적인 아미노산 치환을 제외하고는, 동일한 아미노산 서열을 가진, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 (VL 도메인)을 포함하거나, 이로 필연적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지되, 상기 VL 도메인의 CDR들 중 적어도 하나가 서열번호 9, 16, 1 또는 11과, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 보존적인 아미노산 치환을 제외하고는, 동일한 아미노산 서열을 가진, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 서열번호 8, 15 또는 17과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가진 VL 도메인을 포함하거나, 이로 필연적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지되, 코딩된 VL 도메인을 포함하는 항-CXCL13 항체가 CXCL13에 특이적으로 또는 선호적으로 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
항-CXCL13 항체에 대한 생물학적으로 활성 형태의 적정 변이체를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 이러한 변이체는 모체 항-CXCL13 항체의 바람직한 결합 특성을 보유할 것이다. 항체 변이체의 제조 방법은 당업계에서 일반적으로 이용가능하다.
돌연변이 유발 및 뉴클레오티드 서열 변형 방법들이 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예로, Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985); Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y.); 미국 특허 4,873,192; 및 문헌의 참조문헌을 참조하며, 이들 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 대상 폴리펩타이드의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 가이드는 Dayhoff et al. (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), pp. 345-352에 기재된 모델에서 확인할 수 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. Dayhoff 등의 모델에서는, PAM (Point Accepted Mutation) 아미노산 유사성 매트릭스 (PAM 250 matrix)를 사용하여, 적합한 보존적인 아미노산 치환을 결정한다. 하나의 아미노산을 특성이 유사한 다른 아미노산으로 교체하는 등의 보존적인 치환이 바람직할 수 있다. Dayhoff 등의 PAM 250 매트릭스에 의해 기술된 보존적인 아미노산 치환의 예로는 Gly ↔ Ala, Val ↔ Ile ↔ Leu, Asp ↔ Glu, Lys ↔ Arg, Asn ↔ Gln, 및 Phe ↔ Trp ↔ Tyr이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
대상 항-CXCL13 결합 분자의 변이체, 예컨대, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 대상 폴리펩타이드를 구축함에 있어, 변이체가 계속적으로 원하는 특성, 예컨대 CXCL13, 예로, 인간, 영장류, 뮤라인, 또는 인간 및 뮤라인 CXCL13에 특이적으로 결합할 수 있는 특성을 가지도록, 변형이 이루어진다. 명백하게는, 변이체 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA에 행해지는 모든 돌연변이들은 리딩 프래임 이외 서열에 위치되어서는 안되며, 바람직하게는 mRNA의 이차 구조를 형성할 수 있는 상보적인 영역을 형성해서는 안될 것이다. 유럽 특허 번호 EP0075444 B1을 참조한다.
항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체 또는 항원-결합 단편, 결합 특이성을 측정하는 방법은, 비제한적인 예로서, 표준 경쟁 결합 분석, T 세포 또는 B 세포에 의한 면역글로불린 분비 모니터링 분석, T 세포 증식 분석, 세포자살 분석, ELISA 분석 등을 포함한다. 예를 들어, WO 93/14125; Shi et al., Immunity 13:633-642 (2000); Kumanogoh et al., J Immunol 169:1175-1181 (2002); Watanabe et al., J Immunol 167:4321-4328 (2001); Wang et al., Blood 97:3498-3504 (2001); 및 Giraudon et al., J Immunol 172(2):1246-1255 (2004)에 기술된 상기한 분석들을 참조하며, 이들 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본원에 기술된 불변부, CDR, VH 또는 VL 도메인을 포함하여, 임의의 특정 폴리펩타이드가, 다른 폴리펩타이드와 적어도 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100%의 동일성을 가지는 지에 대해 본원에서 기술되는 경우, 동일성 %는 비제한적인 예로서 BESTFIT 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711) 등의 당해 기술 분야에 공지된 컴퓨어 프로그램/소프트웨어와 방법을 이용하여 결정할 수 있다. BESTFIT는 Smith 및 Waterman (1981)(Adv. Appl. Math. 2:482-489)의 국소 상동성 알고리즘을 이용하여, 2개의 서열 간의 최상의 상동성 세그먼트를 검색한다. BESTFIT 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 이용하여 특정 서열이 본 발명에 따른 기준 서열과 예컨대 95% 동일한지를 결정하는 경우, 자명하게, 동일성%가 기준 폴리펩타이드 서열의 전장에 대해 계산되고, 기준 서열에서 아미노산 총 수에 대한 최대 5%로 상동성 갭을 허용하도록, 파라미터가 설정된다.
본 발명의 목적에서, 서열 동일성%는 갭 오픈 패널티 12, 갭 연장 패널티 2, BLOSUM 매트릭스 62의 어파인 갭 검색(affine gap search)을 이용한 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘으로 결정할 수 있다. Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘은 Smith 및 Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489에 기재되어 있다. 예컨대, 변이체는 기준 항-CXCL13 항체(예, MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2 또는 3C9)와, 적게는 1-15개의 아미노산 잔기가, 적게는 1-10개의 아미노산 잔기가, 예컨대 6-10, 적게는 5개, 적게는 4, 3, 2 또는 심지어 1개의 아미노산 잔기가 다를 수 있다.
CXCL13에 특이적으로 결합할 수 있으며 바람직한 CXCL13 차단 활성을 보유하고 있는, 폴리펩타이드의 정확한 화학 구조는, 여러가지 인자에 의해 결정된다. 이온화가능한 아미노기와 카르복시기가 분자에 존재하기 때문에, 특정 폴리펩타이드는 산성 염 또는 염기성 염, 또는 중성 형태로서 수득할 수 있다. 적정 환경 조건에 놓여졌을 때 그것의 생물학적 활성을 유지하는 그러한 모든 조제물은, 본원에 기술된 항-CXCL13 항체의 정의에 포함된다. 아울러, 폴리펩타이드의 1차 아미노산 서열은 당 모이어티를 이용한 유도체화에 의해 (당화) 또는 그외 지질, 인산, 아세틸기 등의 추가적인 분자에 의해 늘어날 수 있다. 또한, 사카라이드와의 접합에 의해서도 커질 수 있다. 이러한 증대에 대한 임의 측면은 생산 숙주의 번역 후 프로세싱 시스템을 통하여 달성되며, 그외 그러한 변형은 시험관내에서 도입될 수 있다. 임의 경우에, 이러한 변형은 항-CXCL13 항체의 바람직한 특성이 파괴되지 않는 한 본원에 사용되는 항-CXCL13 항체의 정의에 포함된다. 이러한 변형은 다양한 분석에서 폴리펩타이드의 활성 강화 또는 약화에 의해, 활성에 정량적으로 또는 질적으로 영향을 미칠 수 있을지가 예측된다. 또한, 체인내 개개 아미노산 잔기들은 산화, 환원 또는 그외 유도체화에 의해 변형될 수 있으며, 폴리펩타이드를 잘라 활성을 보유한 단편을 수득할 수 있다. 원하는 활성 (즉, CXCL13에 대한 결합 특이성, 결합 친화성, 및/또는 항-CXCL13 차단 활성)을 파괴하지 않는 이러한 변형은, 본원에 기술된 대상 항-CXCL13 항체의 정의로부터 폴리펩타이드 서열을 배제하지 않는다.
당업계에서는 폴리펩타이드 변이체의 제조 및 이용에 대한 실질적인 지침을 제공한다. 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체의 제조에 있어, 당업자는 천연 단백질의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에 대한 변형으로 본 발명의 방법에 사용되는 약학 조성물의 치료학적 활성 성분으로서 사용하기 적합한 변이체를 만들 수 있을지를 쉽게 결정할 수 있다.
항-CXCL13 항체의 불변부는 여러가지 방식으로 작동자 기능을 변형시키도록 변형할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 6,737,056B1 및 미국 출원 공개번호 2004/0132101A1을 참조하며, 이들 문헌에는 Fc 수용체에 해단 항체 결합성을 최적화한 Fc 돌연변이들이 기술되어 있다.
임의의 항-CXCL13 항체에서, Fc 부분은 당업계에 공지된 기법으로 작동자의 기능이 감소되도록 돌연변이시킬 수 있다. 예컨대, 불변부 도메인의 결손 또는 불활성화 (점 돌연변이나 그외 수단을 통해)는 순환성 변형 항체의 Fc 수용체 결합성을 떨어뜨려, 따라서 종양 국지화(tumor localization)를 높일 수 있다. 다른 경우에, 본 발명에 상응하는 불변 영역 변형이 보체 결합성을 완화하여, 따라서 혈청 반감기와 접합된 세포독소의 비특이적인 조합을 낮출 수 있다. 불변 영역에 대해 또다른 변형을 적용하여, 항원 특이성 또는 항체 가용성 증가로 인한 국지화를 높일 수 있는 이황화 결합 또는 올리고사카라이드 모이어티를 변형시킬 수 있다. 변형에 대한, 종양 국지화, 생물분배 (biodistribution) 및 혈청 반감기 등의, 수득되는 생리학적 프로파일, 생체이용성 및 그외 생화학적 효과는 쉽게 측정할 수 있으며, 과도한 실험없이도 잘 알려져 있는 면역학적 기법을 이용하여 정량할 수 있다.
본 발명의 항-CXCL13 항체는, 또한, 예컨대 공유 부착이 항체가 이의 동족 에피토프(cognate epitope)에 특이적으로 결합하도록 방지하지 못하도록, 항체에 임의 타입의 분자를 공유 부착함으로써, 변형되어진 유도체를 포함한다. 예컨대, 비제한적으로, 항체 유도체는, 예컨대 당화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해성 절단, 세포 리간드 또는 그외 단백질로의 연결 등에 의해 변형되어진 항체를 포함한다. 임의의 다수 화학적 변형은, 비제한적으로, 특이적인 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화 등의 공지 기법으로 수행할 수 있다. 또한, 유도체는 하나 이상의 비-고전적인 아미노산을 포함할 수 있다.
"보존적인 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 전하를 띤 측쇄를 가진 아미노산 잔기로의 치환이다. 유사한 전하를 띄는 측쇄를 가진 아미노산 잔기 패밀리는 당업계에 명시되어 있다. 이들 패밀리는, 염기성 측쇄를 가진 아미노산 (예, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가진 아미노산 (예, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄를 가진 아미노산 (예, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인), 무극성 측쇄를 가진 아미노산 (예, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄를 가진 아미노산 (예, 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향족 측쇄를 가진 아미노산 (예, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 다른 예로, 포화 돌연변이 유발 (saturation mutagenesis) 등에 의해 코딩 서열의 전체 또는 일부에 무작위로 돌연변이를 도입할 수 있으며, 제조되는 돌연변이는 생물학적 활성에 대해 스크리닝하여, 활성 (즉, CXCL13에 대한 결합 특이성, 결합 친화성, 및/또는 CXCL13 차단 활성)을 가진 돌연변이를 동정할 수 있다.
예컨대, 돌연변이를 항체 분자의 프래임워크 영역에만 또는 CDR 영역에만 도입하는 것도 가능한다. 도입된 돌연변이는 침묵 또는 중성의 미스센스 돌연변이 (neutral missense mutation), 즉 항체의 항원 결합력에 대해 효과가 없거나 또는 거의 없을 수 있다. 이러한 타입의 돌연변이는 코돈 용법(codon usage)을 최적화하거나 또는 하이브리도마의 항체 생산을 향상시키는데 유용할 수 있다. 또는, 비-중성의 미스센스 (non-neutral missense) 돌연변이는 항체의 항원 결합력을 변형시킬 수 있다. 대부분의 침묵 및 중성의 미스센스 돌연변이의 위치는 프래임워크 영역내일 가능성이 있지만, 대부분의 비-중성의 미스센스 돌연변이의 위치는 절대적인 요건은 아니지만 CDR내일 수 있다. 당업자는, 항원 결합 활성에 대한 비변형 또는 결합 활성에 대한 변형 없음 (예, 항원 결합 활성 개선 또는 항체 특이성 변화) 등의 바람직한 특성을 가진 돌연변이 분자를 제작 및 테스트할 수 있을 것이다. 돌연변이 유발 후, 코딩된 단백질을 통상적으로 발현시킬 수 있으며, 코딩된 단백질의 기능적 및/또는 생물학적 활성 (예, CXCL13 폴리펩타이드의 하나 이상의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 능력)을 본원에 기술된 기법을 이용하거나 또는 당업계에 공지된 기법으로 통상적으로 변형시켜, 확인할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항-CXCL13 항체는 상보성 결정부 (CDR) 하나 이상을 포함한다. "최적화된 CDR"은, CDR이 최적화된 CDR을 포함하는 항-CXCL13 항체에 부여되는, 지속된 또는 개선된 결합 친화성 및/또는 항-CXCL13 활성을 토대로, CDR이 서열 변형되고 최적화되었다는 것이다. "항-CXCL13 활성" 또는 "CXCL13 차단 활성"은 CXCL13와 관련된 하기 활성들 중 한가지 이상을 조절하는 활성을 포함할 수 있다: CXCL13가 이의 수용체와의 상호작용을 차단하여, B 세포와 여포 B-헬퍼 T 세포의 염증이 발생된 조직으로 이동함 및 배중심 (germinal center) 형성 (예, 자가면역 질환의 경우); 암 세포 증식 및 종양 장애 전파력의 저해; 또는 CXCL13-발현 세포와 관련된 그외 임의 활성. 또한, 항-CXCL13 활성은 CXCL13 발현과 관련된 질환, 비제한적인 예로서, 임의 타입의 자가면역 질환 (예, 다발성 경화증, 관절염 (예, 류마티스 관절염), 만성 위염, 위성 림프종, 이식 거부 반응, 쇼그렌 증후군 (SS), 전신 루푸스 홍반증 (SLE), C형 간염 바이러스 감염에서의 활성형의 혼성 한랭글로불린혈증 (active mixed cryoglobulinemia) (MC) 혈관염, 소아기 피부근염 및 중증 근무력증) 및 특정 암 (예, 버킷 림프종, 비-호지킨 림프종, MALT 림프종 (예, 위성 MALT 림프종), 암종 (예, 대장, 전립선, 유방, 위, 식도 및 췌장), 및 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 뿐만 아니라 헬리코박터 감염 유발성 염증 질환 등의 기타 염증 질환, 예컨대 위염, 궤양 및 위 점막 병변의 발병 또는 중증도 감소의 원인일 수 있다.
IV. 항-CXCL13 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
또한, 본 발명은 본 발명의 항-CXCL13 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유사체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 (VH 도메인)을 코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 필연적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지되, 상기 VH 도메인의 CDR들 중 적어도 하나가 서열번호 2 또는 12의 CDR1, CDR2 또는 CDR3로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 가진, 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 면역글로불린 VH 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 필연적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지되, 상기 VH 도메인의 CDR들 중 적어도 하나가 (a) 서열번호 4로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열번호 6로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3로 이루어진 군으로부터 선택되는, 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 서열번호 3 또는 13을 포함하는 기준 VH 도메인 폴리펩타이드 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가진 VH 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 필연적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 코딩된 VH 도메인을 포함하는 항-CXCL13 항체는 CXCL13에 특이적으로 또는 선호적으로 결합한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, VH 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 필연적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지되, 서열번호 2 또는 12를 포함하는 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 코딩된 VH 도메인을 포함하는 항-CXCL13 항체는 CXCL13에 특이적으로 또는 선호적으로 결합한다.
일 구현예에서, 본 발명은, 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 (VL 도메인)을 코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 필연적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지되, 상기 VL 도메인의 CDR들 중 적어도 하나가 서열번호 8, 15 또는 17의 CDR1, CDR2 또는 CDR3의 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 가진, 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 면역글로불린 VL 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 필연적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지되, 상기 VL 도메인의 CDR들 중 적어도 하나가 (a) 서열번호 9 또는 16으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (b) 서열번호 10으로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 (c) 서열번호 11로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, 서열번호 8, 15 또는 17을 포함하는 기준 VL 도메인 폴리펩타이드 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 가진 VL 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 필연적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 코딩된 VL 도메인을 포함하는 항-CXCL13 항체는 CXCL13에 특이적으로 또는 선호적으로 결합한다.
다른 구현예에서, 본 발명은, VL 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하거나, 이로 필연적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지되, 서열번호 7, 14 또는 18을 포함하는 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 코딩된 VL 도메인을 포함하는 항-CXCL13 항체는 CXCL13에 특이적으로 또는 선호적으로 결합한다.
전술한 폴리뉴클레오타이드 모두 부가적인 핵산, 예컨대, 코딩된 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 신호 펩타이드, 본원에 기술된 항체 불변 영역, 또는 본원에 기술된 그외 이종의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 더 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서의 도처에 보다 상세하게 기술된 바와 같이, 본 발명은 전술한 폴리뉴클레오타이드 중 1종 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 제1 폴리뉴클레오타이드가 전술한 VH 도메인을 코딩하고, 제2 폴리뉴클레오타이드가 본원에 기술된 VL 도메인을 코딩하는, 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 포함한다. 구체적으로, 조성물은, 서열번호 2 또는 12에 기재된, VH 도메인-코딩 폴리뉴클레오타이드와, VL 도메인-코딩 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 서열번호 7, 14 또는 18에 기재된 VL 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 필수적으로 구성되거나 또는 이로 구성된다.
또한, 본 발명은 본원의 도처에 기술된 바와 같이 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 단편을 포함한다. 추가적으로, 본원에 기술된 바와 같이 융합 폴리펩타이드, Fab 단편 및 그의 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 역시 본 발명에서 고려된다.
폴리뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 임의 방법에 의해 제조 또는 생산할 수 있다. 예컨대, 항체의 뉴클레오타이드 서열이 공지된 경우, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 화학 합성한 올리고뉴클레오타이드들로부터 조립할 수 있으며(예, Kutmeier et al., Bio Techniques 17:242 (1994)), 간략하게는, 항체를 코딩하는 서열의 일부를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 중첩시키고, 어닐링하고, 이들 올리고뉴클레오타이드를 연결한 다음, 연결된 올리고뉴클레오타이드를 PCR로 증폭시켜 합성하는 것을 포함한다.
다른 예로, 본 발명의 항-CXCL13 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 적합한 소스로부터 유래된 핵산으로부터 제조할 수 있다. 특정 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 클론을 이용할 수 없지민, 항체 분자의 서열이 공지되어 있다면, 항체를 코딩하는 핵산은, 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성가능한 합성 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해, 또는 예컨대 항체 또는 다른 항-CXCL13 항체를 코딩하는 cDNA 라이브러리로부터 cDNA 클론을 동정하기 위해 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용한 클로닝에 의해, 적정 소스(예, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 항체를 발현하기 위해 선택된 하이브리도마 세포 등의 항체 또는 그외 항-CXCL13 항체를 발현하는 임의 조직 또는 세포로부터, 제조된 cDNA 라이브러리, 또는 분리된 핵산, 바람직하게는 폴리 A+RNA)로부터 화학 합성 또는 수득할 수 있다. PCR로 제조한 증폭시킨 핵산은 그 후 당업계에 공지된 임의 방법을 이용하여 복제가능한 클로닝 벡터에 클로닝할 수 있다.
항-CXCL13 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의, 뉴클레오타이드 서열과 대응되는 아미노산 서열이 일단 결정되면, 이의 뉴클레오타이드 서열을 당업계에 잘 알려져 있는 뉴클레오타이드 서열 조작 방법으로, 예컨대 재조합 DNA 기법, 부위 특이적 돌연변이 유발, PCR 등 (예, Sambrook et al. (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) 및 Ausubel et al., eds. (1998) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY)에 기술된 기법, 상기 문헌들은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨)의 방법으로 조작하여, 아미노산 서열이 상이한 항체를 제조할 수 있으며, 예컨대 아미노산 치환, 결손 및/또는 삽입을 수행할 수 있다.
항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는, 비변형 RNA 또는 DNA나 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는, 임의의 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 예컨대, 항-CXCL13 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 단일- 및 이중 가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일 가닥일 수 있거나 또는 보다 전형적으로는 이중 가닥인, 또는 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는, DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자로 구성될 수 있다. 아울러, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA 둘다를 포함하는 3중 가닥 영역으로 구성될 수 있다. 또한, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 안정성이나 또는 다른 이유로 변형된 1종 이상의 변형된 염기, DNA 또는 RNA 벡본을 포함할 수 있다. "변형된" 염기는, 예컨대 트리틸이 도입된 염기와 이노신 등의 특이한 염기를 포함한다. 다양한 변형을 DNA 및 RNA에 가하여, 따라서 "폴리뉴클레오타이드"는 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태를 포함한다.
면역글로불린으로부터 유래된 폴리펩타이드의 비-천연 변이체를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 (예, 면역글로불린 중쇄 부분 또는 경쇄 부분)를, 하나 이상의 아미노산의 치환, 부가 또는 결손이 코딩된 단백질에 도입되도록 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 부가 또는 결손을 면역글로불린의 뉴클레오타이드 서열에 도입함으로써 만들 수 있다. 부위 특이적인 돌연변이 및 PCR 매개 돌연변이 등의 표준 기법에 의해 돌연변이를 도입할 수 있다. 바람직하게는, 보존적인 아미노산 치환을 하나 이상의 비-필수 아미노산 잔기에 만든다.
V. 융합 단백질 및 항체 접합체
본원 도처에서 보다 상세하게 논의되어 있는 바와 같이, 본 발명의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를, 추가로 N-또는 C- 말단에 이종의 폴리펩타이드가 재조합으로 융합하거나, 또는 폴리펩타이드나 그외 조성물에 화학적으로 접합 (공유 및 비-공유 접합 포함)할 수 있다. 예컨대, 항-CXCL13 항체를 검출 분석에서 표지물질로 이용가능한 분자 및 이종의 폴리펩타이드, 약물, 방사성 핵종 또는 독소 등의 작동자 분자에 재조합으로 융합 또는 접합시킬 수 있다. 예컨대, PCT 공개공보 WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; 미국 특허 5,314,995; 및 EP 396,387을 참조한다.
본 발명의 항-CXCL13 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는, 즉 공유 부착이 CXCL13의 항체 결합성을 방해하지 않도록 항체에 임의 타입의 분자를 공유 부착함으로써, 변형된 유도체를 포함한다. 예컨대, 비제한적으로, 항체 유도체는 예컨대 당화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해성 절단, 세포 리간드나 다른 단백질에 연결 등에 의해, 변형된 항체를 포함한다. 임의의 다수 화학 변형을 공지된 기법으로 수행할 수 있으며, 그 예로는 비제한적으로 특이적인 화학 절단, 아세틸화, 포르밀화 등을 포함한다. 부가적으로, 유도체는 하나 이상의 비-고전적인 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 펩타이드 결합 또는 변형된 펩타이드 결합에 의해 서로 연결되는 아미노산, 즉 펩타이드 이소스테르(peptide isostere)로 구성될 수 있으며, 20개의 유전자-코딩 아미노산를 제외한 다른 아미노산을 포함할 수 있다. 항-CXCL13 항체는 번역후 프로세싱 등의 자연적인 프로세스, 또는 당업계에 잘 알려져 있는 화학 변형 기법에 의해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형은, 기초 문헌에 잘 기술되어 있으며, 전공 논문과 다양한 연구 논문에 상세하게 기재되어 있다. 변형은, 펩타이드 벡본, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복시 말단이나 탄화수소 등의 모이어티 등의 항-CXCL13 항체의 모든 부위에서도 이루어질 수 있다. 동일한 타입의 변형이 소정의 항-CXCL13 결합 분자의 여러 부위에 동일하거나 다양한 수준으로 존재할 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 수종의 항-CXCL13 결합 분자는 수많은 타입의 변형을 포함할 수 있다. 항-CXCL13 항체는 예컨대 유비퀴닌화의 결과로서 분지 형성될 수 있으며, 이는 분지가 있거나 없는 환형일 수 있다. 환형, 분지형 및 분지형의 환형 항-CXCL13 결합 분자가 번역 후 천연 프로세스로부터 만들어질 수 있거나, 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 변형은, 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 교차 연결, 환화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유 교차 연결 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복시화, 당화, GPI 앵커 형성, 수산화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화, 단백질분해 과정, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 설페이트화, 단백질에 수송-RNA 매개 아미노산 부가, 예컨대 아르지닐화 및 유비퀴틴화를 포함한다 (예, Proteins--Structure and Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, NY; 2nd ed. (1993); Johnson, ed. (1983) Posttranslational Covalent Modification of Proteins (Academic Press, NY), pgs. 1-12; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann. NY Acad. Sci. 663:48-62 (1992)).
또한, 본 발명은 항-CXCL13 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체, 및 이종의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 항체가 융합된 이종의 폴리펩타이드는, 기능적으로 유용할 수 있거나, 또는 항-CXCL13 폴리펩타이드를 발현하는 세포을 타겟화하는데 유용하다.
일 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은, 본 발명의 항체의 VH 도메인 중 임의의 하나 이상의 아미노산 서열 또는 본 발명의 항체의 VL 도메인 중 임의의 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 또는 그의 단편이나 변이체, 및 이종의 폴리펩타이드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다.
다른 구현예로, 본원에 기술된 진단 및 치료 방법에서 사용하기 위한 융합 단백질은, 항-CXCL13 항체, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체의 VH 도메인의 CDR들 중 임의의 1, 2, 3 개의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 또는 항-CXCL13 항체, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체의 VL 도메인의 CDR들 중 임의의 1, 2, 3개의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 및 이종의 폴리펩타이드 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 본 발명의 항-CXCL13 항체의 하나 이상의 VH 도메인의 아미노산 서열, 본 발명의 항-CXCL13 항체, 또는 그의 단편, 유도체 또는 변이체의 하나 이상의 VL 도메인의 아미노산 서열, 및 이종의 폴리펩타이드 서열을 가진 폴리펩타이드를 포함한다. 바람직하게는, VL 도메인 및 VH 도메인은, CXCL13의 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 단일 소스의 항체 (또는 scFv 또는 Fab 단편)에 대응된다. 또다른 구현예에서, 본원에 기술된 진단 및 치료 방법에 사용하기 위한 융합 단백질은 항-CXCL13 항체의 VH 도메인의 임의의 1, 2, 3개 이상의 CDR들의 아미노산 서열 및 항-CXCL13 항체, 또는 그의 단편, 변이체의 VL 도메인의 임의의 1, 2, 3개 이상의 CDR들의 아미노산 서열과, 이종의 폴리펩타이드 서열을 가진 폴리펩타이드를 포함한다. 바람직하게는, VH 도메인 또는 VL 도메인의 2, 3, 4, 5 또는 6개 이상의 CDR(들)은 본 발명의 단일 소스의 항체 (또는 scFv 또는 Fab 단편)에 대응된다. 또한, 이들 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자도 본 발명에 포함된다.
문헌에 보고된 융합 단백질의 예로는, T 세포 수용체의 융합 (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2936-2940 (1987)); CD4 (Capon et al., Nature 337:525-531 (1989); Traunecker et al., Nature 339:68-70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9:347-353 (1990); 및 Byrn et al., Nature 344:667-670(1990)); L-셀렉틴(homing receptor)(Watson et al., J. Cell. Biol. 110:2221-2229 (1990); 및 Watson et al., Nature 349:164-167 (1991)); CD44 (Aruffo et al., Cell 61:1303-1313 (1990)); CD28 및 B7(Linsley et al., J. Exp. Med. 173:721-730 (1991)); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174:561-569 (1991)); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66:1133-1144 (1991)); TNF receptor (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27:2883-2886 (1991); 및 Peppel et al., J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991)); 및 IgE 수용체 a(Ridgway and Gorman, J. Cell. Biol. Vol. 115, Abstract No. 1448 (1991))를 포함한다.
본원에 도처에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 이종의 폴리펩타이드에 융합시켜, 폴리펩타이드의 생체내 반감기를 증가시키거나, 또는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 면역 분석에 사용할 수 있다. 예컨대, 일 구현예로, PEG를 본 발명의 항-CXCL13 항체에 접합시켜, 이의 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다. Leong et al., Cytokine 16:106 (2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531 (2002); or Weir et al., Biochem. Soc. Transactions 30:512 (2002)를 참조한다.
아울러, 본 발명의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를, 이의 정제 또는 검출을 용이하게 하는 펩타이드 등의 마커 서열에 융합시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 마커 아미노산 서열은 상업적으로 구입가능한 다수의 물질들 중에서도, pQE 벡터 (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311)에 제시된 테그(tag) 등의 헥사-히스티딘 펩타이드이다. 예컨대, Gentz et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989)에 기재된 바와 같이, 헥사-히스티딘이 융합 단백질의 용이한 정제를 제공한다. 정제에 사용가능한 그외 펩타이드 테그로는, 인플루엔자 헴어글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 해당하는 "HA" 테그 (Wilson et al. Cell 37:767 (1984)) 및 "flag" 테그가 있으나, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
융합 단백질은 당업계에 잘 공지된 방법으로 제조할 수 있다 (예, 미국 특허 5,116,964 및 5,225,538). 융합이 이루어지는 정확한 부위는 융합 단백질의 분비 또는 결합 특성을 최적화하기 위해 실험을 통해 선정될 수 있다. 그런 후, 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 발현용 숙주 세포에 형질감염시킨다.
본 발명의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 비-접합된 형태로 사용하거나, 또는 예컨대 분자의 치료 특성을 향상시키기 위해, 타겟 검출을 용이하게 하기 위해, 또는 환자에서의 영상화 또는 치료를 위해, 다양한 분자들 중 적어도 하나과 접합시킬 수 있다. 본 발명의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는, 정제 전, 후, 또는 정제시 표지 또는 접합시킬 수 있다.
특히, 본 발명의 항-CXCL13 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를, 치료 물질, 프로드럭, 펩타이드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 변형제, 약학적 물질 또는 PEG에 접합시킬 수 있다.
당업자는, 접합체를, 접합되는 선택 물질에 따라 다양한 기법을 이용하여 조립할 수 있음을 인지할 것이다. 예컨대, 결합성 폴리펩타이드를 바이오틴 N-하이드록시숙신이미드 에스테르 등의 바이오틴의 활성화된 에스테르와 반응시켜, 바이오틴이 접합된 접합체를 제조한다. 이와 유사하게, 플루오레센트 마커가 있는 접합체는, 커플링제, 예컨대 본원에 기재된 물질의 존재하에 또는 이소티오시아네이트, 바람직하게는 플루오레세인-이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 항-CXCL13 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 접합체는 유사한 방식으로 제조한다.
본 발명은, 진단 또는 치료 물질이 접합된, 본 발명의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대. 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 추가로 포함한다. 항-CXCL13 항체는, 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 비롯하여, 임상적인 테스트 과정의 일부로서 질환의 발병 또는 진행을 모니터링하는데, 예컨대 주어진 치료 및/또는 예방 용법의 효능을 결정하는데 진단학적으로 이용할 수 있다. 예를 들어, 검출은 항-CXCL13 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 검출가능한 물질과 커플링함으로써 용이하게 수행할 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는, 다양한 효소, 보결기 (prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생발광 물질, 방사성 물질, 다양한 양전자 방출 토모그래피를 이용한 양전자 방출성 금속 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함한다. 예컨대, 본 발명에 따른 진단제로서의 용도로서, 항체에 접합시킬 수 있는 금속 이온에 대해서는, 미국 특허 4,741,900을 참조한다. 적합한 효소의 예로는, 호르세라디시 페록시다제, 알카리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제가 있으며, 적합한 보결기 복합체의 예로는 스트렙트아미딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴이 있으며, 적합한 형광 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 있으며, 발광 물질의 예로는 루미놀이 있으며, 생발광 물질의 예로는 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿠오린이 있으며, 적합한 방사성 물질의 예로는 125I, 131I, 111In, 90Y, 또는 99Tc가 있다.
항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를, 세포독소, 치료성 물질 또는 방사성 금속 이온과 같은 치료 모이어티에 접합시킬 수 있다. 세포독소 또는 세포독성 물질로는 세포에 유해한 모든 물질을 포함한다.
또한, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를, 화학발광 화합물과 이를 커플링시켜, 검출가능하게 표지할 수 있다. 그 후, 화학발광체가 테깅된 항-CXCL13 결합 분자의 존재를, 화학 반응을 수행하는 동안에 발생하는 발광의 존재를 검출함으로써 검출한다. 특히 이용가능한 화학발광체 표지성 화합물로는 루미놀, 이소루미놀, 테로마틱 아크리디늄 에스테르 (theromatic acridinium ester), 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르가 있다.
항-CXCL13 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 검출가능하게 표지할 수 있는 한가지 방법은, 효소에 이를 연결하고, 연결된 산물을 효소 면역분석(EIA)으로 이용함으로써에 의한 것이다 (Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)" Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md.; Diagnostic Horizons 2:1-7 (1978); Voller et al., J. Clin. Pathol. 31:507-520 (1978); Butler, Meth. Enzymol. 73:482-523 (1981); Maggio, ed. (1980) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla.; Ishikawa et al., eds. (1981) Enzyme Immunoassay (Kgaku Shoin, Tokyo). 항-CXCL13 항체에 결합된 효소는, 예컨대 분광광도계, 형광측정 또는 가시적 수단에 의해 검출할 수 있는 화학 모이어티를 생성시키기 위한 방식으로, 적합한 기질, 바람직하게는 발색성 물질과 반응시킨다. 항체를 검출가능하게 표지하기 위해 사용할 수 있는 효소로는, 말레이트 탈수소 효소, 스타필로코코스 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라제, 효모 알코올 탈수소 효소, 알파-글리세로포스페이트 탈수소 효소, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 호르세라디시 페록시다제, 알카리 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 유레아제, 카탈라제, 글루코스-6-포스페이트 탈수소 효소, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린에스테라제가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 부가적으로, 검출은 효소에 대한 발색성 기질을 사용하는 색도계 방법에 의해 달성할 수 있다. 또한, 검출은 유사하게 준비한 표준 물질과 비교하여, 기줄의 효소 반응 정도를 가시적으로 비교함으로써 달성할 수 있다.
또한, 검출은 그외 다양한 면역분석 방법들 중 임의의 방법을 이용하여 달성할 수 있다. 예로, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 방사능으로 표지함으로써, 방사면역분석 (RIA)을 통한 항체 검출이 가능하다 (예, Weintraub (March, 1986) Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques (The Endocrine Society), 본 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 비제한적으로, 감마 카운터, 신틸레이션 카운터 또는 오토라디오그래피 등의 수단으로 방사성 동위원소를 검출할 수 있다.
또한, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는 152Eu 또는 그외 란탄족 원소 등의 플루오레센스 방출 금속들을 이용하여 검출가능하게 표지할 수 있다. 이들 금속들은 디에틸렌트리아민펜트아세트산 (DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)으로서 이러한 금속 킬레이트화 그룹을 이용하여 항체에 부착시킬 수 있다.
항체, 예컨대, 항-CXCL13 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체에 다양한 모이어티를 접합하는 기법들은 잘 공지되어 있으며, 예컨대, Amon et al. (1985) "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-56; Hellstrom et al. (1987) "Antibodies for Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2nd ed.; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623-53); Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al., pp. 475-506; "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al., Academic Press, pp. 303-16 (1985); 및 Thorpe et al. , Immunol. Rev. 62:119-58 (1982)을 참조한다.
VI. 항체 폴리펩타이드의 발현
항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 서열은, 역전사효소와 DNA 중합효소를 이용하여 잘 알려져 있는 방법에 따라 동시에 또는 각각 제조할 수 있다. PCR은 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA와 아미노산 서열을 기초로 보다 특이적인 프라이머에 의해 또는 콘센서스 불변 영역 프라이머에 의해 개시할 수 있다. 전술한 바와 같이, 또한, PCR은 항체 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 분리하기 위해 사용할 수도 있다. 이럴 경우, 콘센서스 프라이머나 마우스 불변 영역 프로브와 같이 더 큰 상동성 프로브에 의해 라이브러리를 스크리닝할 수 있다.
DNA, 전형적으로 플라스미드 DNA는 당업계에 공지된 기법을 이용하여 세포로부터 분리할 수 있으며, 예컨대 재조합 DNA 기법과 관련있는 전술한 참조문헌에 상세하게 기재된 잘 알려져 있는 기법의 표준 방법에 따라 제한 맵핑 및 서열 분석을 수행할 수 있다. 또한, 분리 과정이나 이후의 분석 과정 중에 임의 시점에 본 발명에 따라 DNA를 합성할 수 있다.
본 발명의 항-CXCL13 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 제공하기 위한 분리한 유전자 물질의 조작 이후에, 항-CXCL13 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 통상 항-CXCL13 항체의 바람직한 양을 제조하기 위해 사용할 수 있는 숙주 세포로 도입하기 위한 발현 벡터에 삽입한다.
항체, 또는 그의 단편, 유도체 또는 유사체, 예컨대 본원에 기술된 타겟 분자, 예컨대 CXCL13에 결합하는 항체의 중쇄나 경쇄의 재조합 발현에는, 항체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터의 구축이 필요하다. 본 발명의, 항체 분자나 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 그의 일부분 (바람직하게는 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인 포함)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 일단 수득되면, 항체 분자를 생산하기 위한 벡터는 당업계에 잘 공지되어 있는 기법을 이용하여 재조합 DNA 기법에 의해 제조할 수 있다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열을 코딩하는 항체를 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 발현에 의해 단백질을 제조하는 방법은 본원에 기술되어 있다. 당업자들에게 잘 알려져 있는 방법들을 이용하여 항체 코딩 서열과 적절한 전사 및 번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이러한 방법으로는, 예컨대, 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체 분자, 그의 중쇄나 경쇄, 또는 중쇄나 경쇄의 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 프로모터에 작동가능하게 연결되게 포함하는, 복제가능한 벡터를 제공한다. 이러한 벡터들은 항체 분자의 불변 영역과 항체의 가변 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있으며, 항체의 가변 도메인을 경쇄 또는 중쇄 전체를 발현하기 위한 벡터에 클로닝할 수 있다 (예컨대, PCT 공개공보 WO 86/05807; PCT 공개공보 WO 89/01036; 및 미국 특허 5,122,464).
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 본원에서는 숙주 세포에 원하는 유전자를 도입하여 발현시키기 위한 비히클로서 본 발명에서 사용되는 벡터를 의미한다. 당업자들에게 공지된 바와 같이, 이러한 벡터들은 플라스미드, 파지, 바이러스 및 레트로바이러스로 이루어진 군으로부터 쉽게 선택할 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 사용가능한 벡터는 선별 마커, 원하는 유전자의 클로닝을 용이하게 하기 위한 적절한 제한 부위 및 진핵 또는 원핵 생물의 세포로의 도입 및/또는 복제할 수 있는 능력을 포함할 것이다.
본 발명의 목적에서, 다수의 발현 벡터 시스템들을 사용할 수 있다. 벡터의 일 클래스는, 예컨대, 소 파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 백시나 바이러스, 베큘로바이러스, 레트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스 등의 동물 바이러스로부터 유래한 DNA 요소를 이용한다. 그외에, 내부 리보좀 결합 부위를 가진 폴리시스트론 시스템을 이용한다. 부가적으로, DNA가 세포의 염색체에 삽입된 세포는, 형질감염된 숙주 세포의 선별이 가능한 하나 이상의 마커 도입에 의해 선별할 수 있다. 마커는 영양 요구성 숙주에 대한 원영양성(prototrophy), 살생물제 내성(예, 항생제) 또는 구리 등의 중금속 내성을 제공할 수 있다. 선별 마커 유전자는 발현할 DNA 서열에 직접 연결되거나, 또는 공동-형질전환에 의해 동일한 세포에 도입될 수 있다. 또한, mRNA의 최적 합성을 위해 추가적인 요소들이 필요할 수 있다. 이러한 요소들로는, 신호 서열, 스플라이스 신호 뿐만 아니라 전사 프로모터, 인핸서 및 종결 신호를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 클로닝된 가변 영역 유전자를 전술한 바와 같이 합성한 중쇄 및 경쇄의 불변 영역 유전자 (예, 인간)와 함께 발현 벡터에 삽입한다. 물론, 진핵생물의 세포에서 발현을 도출할 수 있는 모든 발현 벡터를 본 발명에 사용할 수 있다. 적합한 벡터의 예로는, 플라스미드 pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF 1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, pZeoSV2 (Invitrogen, San Diego, Calif.), 및 플라스미드 pCI (Promega, Madison, Wis.)가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 일반적으로, 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 적정하게 높은 수준으로 발현하는 형질전환된 다수 세포를 스크리닝하는 것은, 예컨대 로봇 시스템에 의해 수행할 수 있는 통상적인 실험이다.
보다 일반적으로, 항-CXCL13 항체의 단량체 서브유닛을 코딩하는 벡터 또는 DNA 서열이 일단 제조되면, 발현 벡터를 적정 숙주 세포에 도입할 수 있다. 숙주 세포로의 플라스미드의 도입은, 당업자들에게 잘 알려져 있는 다양한 기법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 방법으로는, 형질감염 (전기영동 및 전기천공 포함), 원형질체 융합, 칼슘 포스페이트 침강, 외피로 둘러싸인 DNA와의 세포 융합, 미세주입 및 완전 바이러스의 감염이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. Ridgway (1988) "Mammalian Expression Vectors" in Vectors, ed. Rodriguez and Denhardt (Butterworths, Boston, Mass.), Chapter 24.2, pp. 470-472를 참조한다. 전형적으로, 숙주로의 플라스미드의 도입은 전기천공을 통해 이루어진다. 발현 벡터를 가지고 있는 숙주 세포는 경쇄 및 중쇄의 제조에 적합한 조건 하에서 키우고, 경쇄 및/또는 중쇄 단백질 합성에 대해 분석한다. 분석 기법의 예로는, 효소-연결된 면역흡착 분석 (ELISA), 방사면역분석 (RIA) 또는 형광-활성화된 세포 분류 분석 (FACS), 면역조직화학방법 등이 있다.
발현 벡터는 통상적인 기법에 의해 숙주 세포로 전달되며, 형질감염된 세포는 통상적인 기법으로 배양하여 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 항체를 생산한다. 즉, 본 발명은 본 발명의 항체, 또는 그의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 이종의 프로모터에 작동가능하게 연결되게 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 2-체인형 항체의 발현에 있어 바람직한 구현예로, 중쇄 및 경쇄 둘다를 코딩하는 벡터를 전체 면역글로불린 분자를 발현하기 위한 숙주 세포에서 하기에서 상세히 기술되는 바와 같이, 공동-발현시킬 수 있다.
본원에서, "숙주 세포"는 재조합 DNA 기법으로 구축되었고 하나 이상의 이종의 유전자를 코딩하는, 벡터를 가지고 있는 세포를 지칭한다. 재조합 숙주로부터 항체를 분리하기 위한 과정에 대한 설명에서, 용어 "세포" 및 "세포 배양물"은 명확하게 명시되어 있지 않은 한, 항체의 소스를 나타내기 위해 상호호환적으로 사용된다. 다시 말해, "세포"로부터 폴리펩타이드의 회수는 스핀 다운한 전체 세포 또는 배지와 현탁된 세포 둘다를 포함하는 세포 배양물로부터의 회수를 의미할 수 있다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 이용하여 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한 항체 분자를 발현시킬 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 대상 코딩 서열을 제조한 다음, 정제되는 비히클을 의미하며, 또한 적절한 뉴클레오타이드 코딩 서열이 형질전환 또는 형질감염되었을 때 정 위치(in situ)에서 본 발명의 항체 분자를 발현할 수 있는 세포를 의미한다. 이러한 것으로는, 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아 (예, E. coli, B. subtilis); 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (예, 사카로마이세스, 피키아); 항체 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예, 베쿨로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체 코딩 서열을 포함하는, 재조합 바이러스 발현 벡터 (예, cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV) 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예, Ti plasmid)로 감염된 식물 세포 시스템; 또는 포유류 세포의 게놈 (예, 메탈로티온인 프로모터(metallothionein promoter)) 또는 포유류 바이러스 (예, 아데노바이러스 후기 프로모터, 벡시나 바이러스 7.5K 프로모터)로부터 유래된 프로모터를 포함하는 재조합 발현 구조체를 가지고 있는 포유류 세포 시스템 (예, COS, CHO, BLK, 293, 3T3 세포) 등의 미생물이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 특정 구현예에서, 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현에는, 에셔리키아 콜리(Escherichia coli) 등의 박테리아 세포, 및 다른 구현예에서 진핵 세포가 재조합 항체 분자 발현을 위해 사용된다. 예로, 중국 햄스터 난소 세포(CHO) 등의 포유류 세포는, 인간 사이토메갈로바이러스 유래의 주요 즉시 초기 유전자 프로모터 인자 등의 벡터와 함께, 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이다 (Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)).
단백질 발현에 사용되는 숙주 세포주는 흔히 포유류 기원이며, 당업자는 발현시킬 원하는 유전자 산물에 가장 적합한 특정 숙주 세포주를 선호적으로 결정할 수 있는 능력을 가진 것으로 인정된다. 숙주 세포주의 예로는, CHO (중국 햄스터 난소), DG44 및 DUXB11 (중국 햄스터 난소 세포주, DHFR minus), HELA (인간 경부 종양), CVI (원숭이 신장 세포주), COS (SV40 T 항원을 가진 CVI 유도체), VERY, BHK (베이비 햄스터 신장), MDCK, 293, WI38, R1610 (중국 햄스터 섬유모세포) BALBC/3T3 (마우스 섬유모세포), HAK (햄스터 신장 세포주), SP2/O (마우스 골수종), P3.times.63-Ag3.65 (마우스 골수종), BFA-1c1BPT (소 내피세포), RAJI (인간 림프구) 및 293 (인간 신장)이 있으나 이들로 한정되는 것은 아니다. 숙주 세포주는 전형적으로 상업적인 서비스, 미국 조직 배양 콜렉션 또는 공개된 문헌으로부터 이용가능한다.
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 바람직한 특이적인 양상으로 유전자 산물을 변형 및 가공하는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 단백질 산물에 대한 이러한 변형 (예, 당화) 및 가공 (예, 절단)은 단백질 기능에 중요할 수 있다. 여러가지 숙주 세포들이, 단백질 및 유전자 산물의 번역 후 가공 및 변형에 있어 특징적으로 특이적인 기전을 가지고 있다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택하여 발현되는 외래 단백질의 정확한 변형과 가공을 보장할 수 있다. 이를 위해, 유전자 산물의 일차 전사, 당화 및 인산화에 대한 적절한 가공을 진행하기 위한 세포 장치를 가지고 있는 진핵 숙주 세포를 사용할 수 있다.
재조합 단백질을 장기간 고수율로 생산하기 위해서는, 안정적인 발현이 바람직하다. 예를 들면, 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주를 조작할 수 있다. 바이러스 복제 기원을 가지고 있는 발현 벡터를 이용하기 보다는, 숙주 세포에, 적절한 발현 조절 요소 (예, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선별 마커에 의해 조절되는 DNA를 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA를 도입한 다음, 조작된 세포를 농화 배지에서 1-2일간 생장하게 한 다음 선별 배지로 교체한다. 재조합 플라스미드에 포함된 선별 마커는 선택에 대한 내성을 부여하여, 세포에서 플라스미드가 안정적으로 염색체내로 삽입되어 증식하여, 포시(foci)를 형성할 수 있게 하며, 이후 클로닝하여 세포주로 증식시킬 수 있다. 이러한 방법은 안정적으로 항체 분자를 발현하는 세포주를 조작하는데 유익하게 사용할 수 있다.
비제한적인 예로서, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), 하이폭산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Szybalska and Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) 유전자 등의 다수의 선별 시스템을, 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에 사용할 수 있다. 또한, 항대사산물 내성을 하기 유전자들의 선별 기준으로서 사용할 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt (Mulligan and Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo (Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); 및 Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); TIB TECH 11(5):155-215 (May, 1993); 및 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro (Santerre et al., Gene 30:147 (1984). 이용가능한 재조합 DNA 기법 분야에 통상적으로 알려져 있는 방법들은 Ausubel et al. (1993) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY); Kriegler (1990) "Gene Transfer and Expression" in A Laboratory Manual (Stockton Press, NY); Dracopoli et al. (eds) (1994) Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons, NY) Chapters 12 and 13; Colberre-Garapin et al. (1981) J. Mol. Biol. 150:1에 기술되어 있으며, 이들 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭을 통해 증가시킬 수 있다 (Bebbington and Hentschel (1987) "The Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning" (Academic Press, NY) Vol. 3). 항체를 발현하는 벡터 시스템에서 마커가 증폭가능한 경우, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 저해제의 수준 증가는 마커 유전의 카피 수를 증가시킬 것이다. 증폭되는 영역이 항체 유전자와 조합되어 있기 때문에, 항체의 제조 역시 증가될 것이다 (Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983)).
시험관내 생산은 원하는 폴리펩타이드를 대량으로 제공하는 규모 확대가 가능하다. 조직 배양 조건하에서의 포유류 세포 배양 기법들은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 에어리프트 반응기나 연속 교반기 반응기에서 균질적인 현탁 배양, 또는 예컨대 중공사, 마이크로캡슐, 아가로즈 마이크로비드나 세라믹 카트리지에서의 고정 또는 포획성 세포 배양이 있다. 필연적이거나 및/또는 필요에 따라, 폴리펩타이드의 용액을 일반적인 크로마토그래피 방법, 예컨대, 젤 여과, 이온 교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로즈에서의 크로마토그래피, 또는 (면역-)친화성 크로마토그래피에 의해, 합성 힌지 영역 폴리펩타이드의 선호적 합성한 후, 또는 본원에 기술된 HIC 크로마토그래피 전이나 후에 정제할 수 있다.
본 발명의 항-CXCL13 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 유전자는, 또한, 박테리아, 효모 또는 식물 세포 등의 포유류 이외의 세포에서 발현시킬 수 있다. 핵산을 쉽게 받아들이는 박테리아로는, 에셔리키아 콜리 또는 살모넬라 (Salmonella) 균주 등의 엔테로박테리아과 (enterobacteriaceae); 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) 등의 바실러스과; 뉴모코커스 (Pneumococcus); 스트렙토코커스 (Streptococcus) 및 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae)에 속하는 균주를 포함한다. 박테리아에서 발현시켰을때, 이종의 폴리펩타이드는 전형적으로 봉입체(inclusion body) 일부가 됨을 추가적으로 인지할 것이다. 이종의 폴리펩타이드는 분리 및 정제한 다음 기능성 분자로 조립되어야 한다. 3가 형태의 항체가 바람직한 경우, 서브유닛들을 3가 항체로 자가-조립시킨다(WO　02/096948A2).
박테리아 시스템에서, 발현 중인 항체 분자의 의도한 용도에 따라 다수의 벡터를 적합하게 선택할 수 있다. 예컨대, 항체 분자의 약학 조성물 제조를 위해 다량의 단백질을 제조하여야 하는 경우, 쉽게 정제되는 융합 단백질 산물을 고수준으로 발현시키는 벡터가 바람직할 수 있다. 그러한 벡터로는, 항체 코딩 서열이 lacZ 코딩 영역의 프래임 내로 각각 벡터에 삽입되어 융합 단백질이 제조될 수 있는, E. coli 발현 벡터 pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2:1791 (1983)); pIN 벡터 (Inouye and Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke and Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)) 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 pGEX 벡터를 사용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 매트릭스 글루타티온-아가로스 비드에 흡착 및 결합시킨 다음 유리 글루타티온의 존재하에 용리시킴으로써 용혈된 세포로부터 쉽게 정제할 수 있다. pGEX 벡터는, 트롬빈 또는 팩터 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 제작되어, 클로닝한 타겟 유전자 산물을 GST 모이어티로부터 분리시킬 수 있다.
원핵 외에도, 진핵 미생물도 사용할 수 있다. 다수의 다른 균주들, 예컨대 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 일반적으로 사용할 수 있지만, 진핵 미생물들 중에서도 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)나 일반적인 빵 효모가 가장 흔히 사용된다.
사카로마이세스에서의 발현을 위해, 예로, 플라스미드 YRp7 (Stinchcomb et al., Nature 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene 10:157 (1980))가 가장 일반적으로 사용된다. 이 플라스미드에는 이미 트립토판에서 증식하는 능력이 결핍된 돌연변이 효모 균주, 예 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1 ((Jones, Genetics 85:12 (1977))에 대한 선별 마터를 제공하는, TRP1 유전자가 포함되어 있다. 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서 trpl 부위의 존재는 트립토판 부재하에 증식시켜 형질전환을 검출하는데 유효한 환경을 제공한다.
곤충 시스템의 경우, 오토그라파 캘리포르니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcNPV)가 외래 유전자 발현을 위한 벡터로 통상적으로 사용되고 있다. 이 바이러스는 스포돕테라 프루기페라드(Spodoptera frugiperda) 세포에서 증식한다. 항체 코딩 서열을 바이러스의 비-필수 영역(예, 폴리헤드린 유전자)에 각각 클로닝하여, AcNPV 프로모터(예, 폴리헤드린 프로모터)의 통제 하에 위치시킬 수 있다.
본 발명의 항체 분자가 재조합으로 발현되면, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 면역글로불린 분자 정제 방법으로, 예컨대 크로마토그래피 (예, 이온 교환, 친화성, 특히, 특이 항원에 대한 친화성 및 후속적인 단백질 A에 대한 친화성 및 크기차 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 용해도 차이 (differential solubility), 또는 그외 표준적인 단백질 정제 기법으로 정제할 수 있다. 다른 예로, 본 발명의 항체 친화성을 높이는 방법들이 미국 특허 공개번호 2002 0123057 A1에 기재되어 있다.
VII. 치료학적 항-CXCL13 항체를 이용한 치료 방법
림프성 케모카인 CXCL13은 소포성 수지상 세포 (FDC) 및 대식세포에서 발현된다. 다양한 면역 세포들 (예, B 세포, 소포성 헬퍼 T 세포 및 막 활성화된 T 세포)에서 발견되는, 이의 수용체인 CXCR5를 통해, CXCL13은 면역 시스템 항상성 유지, 림프성 기관 형성(lymphoid organogenesis), 백혈구 이동(leukocyte trafficking) 및 주화성 이동 뿐만 아니라 2차 림프 조직 (예, 배중심)의 발생에 필연적인 세포내 변화를 유도한다. CXCL13과 이의 수용체 CXCR5의 과다발현은 다양한 자가면역 질환과 관련되어 있다 (예, 다발성 경화증 (예, Corcione et al., PNAS 101(30):11064-11069 (2004); Serafini et al., Brain Pathol. 14:164-174 (2004); Magliozzi et al., Brain 130: 1089-1104 (2007)), 관절염 (예, 류마티스 관절염 (예, Rioja et al., Arthritis & Rheumatism 58(8):2257-2267 (2008); Shi et al., J. Immuno. 166:650-655 (2001); Schmutz et al., Arthritis Restearch and Therapy 7:R217-R229 (2005); Hjelmstrom et al., J. Leukocyte Bio. 69:331-339 (2001)), 만성 위염 (예, Hjelmstrom et al.; Mazzucchelli et al., Brain 130:1089-1104 (2007)), 위 림프종(예, id.; Nobutani et al., FEMS Immunol Med Microbiol 60:156-164 (2010)), 이식 거부반응 (예, Steinmetz et al., Kidney International 67:1616-1621 (2005)), 쇼그렌 증후군 (SS) (예, Barone et al., J. Immuno. 180:5130-5140 (2008); Hjelmstrom et al.), 전신 루푸스 홍반증 (SLE) (예, Steinmetz et al., Lee et al., J. Rheum. 37(1):45-52 (2010); Schiffer et al., J. Immun. 171:489-497 (2003)), C형 간염 바이러스 감염에서의 활성형의 혼성 한랭글로불린혈증 (MC) 혈관염 (예, Sansonno et al., Blood 112(5):1620-1627 (2008)), 소아기 피부근염 (예, de Padilla et al., Arthritis & Rheumatism 60(4):1160-1172 (2009)), 및 중증 근무력증 (예, Matsumoto et al., J. Immuno. 176:5100-5107 (2006); Meraouna et al., Blood 108(2):432-440 (2006); Saito et al., J. Neuroimmunol 170:172-178 (2005)) 및 특정 암 (예, 버킷 림프종 (예, Forster et al., Blood 84:830-840 (1994); Forster et al., Cell 87:1037-1047 (1996)), 비-호지킨 림프종 (예, Trentin et al., Ann.Rev.Immunol. 6:251-81 (1988); Gong et al., J. Immunol. 174: 817-826 (2005); Hamaguchi et al., J. Immunol. 174:4389-4399 (2005)), 암종 (예, 대장암 및 췌장암) (예, Gunther et al., Int. J. Cancer 116:726-733 (2005); Meijer et al., Cancer Res. 66: 9576-9582 (2006)), 유방암 (예, Panse et al., British Journal of Cancer 99:930-938 (2008)), 만성 림프성 백혈병 (CLL) (예, Biirkle et al., Blood 110:3316-3325 (2007)), 및 전립선암 (예, Singh et al., Cancer Letters 283 (1):29-35 (2009)). 본 발명의 CXCL13 활성 저해 방법은 전술한 질환에 대해 치료학적 효과를 나타낼 것으로 예상된다.
본 발명의 일부 방법들은 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체의, 이의 항원-결합 단편, 변이체 및 유도체 등의, CXCL13-발현 세포, 예컨대 CXCL13-발현 세포와 관련된 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 용도에 관한 것이다. "CXCL13-발현 세포"는 CXCL13 항원을 발현하는 정상 세포와 악성 세포를 의미한다. 세포에서 CXCL13 발현을 검출하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 비제한적인 예로서 PCR 기법, 면역조직화학법, 유세포 측정법, 웨스턴 블롯, ELISA 등을 포함한다.
하기 내용은 본 발명의 항-CXCL13 항체를 이용한 다양한 질병 및 장애의 진단법 및 치료법에 관한 것이지만, 본원에 기술된 방법들은 또한 본 발명의 항-CXCL13 항체의 바람직한 특성, 즉 CXCL13, 예컨대 인간 CXCL13, 영장류 CXCL13, 마우스 CXCL13 또는 인간 및 마우스의 CXCL13에 특이적으로 결합할 수 있으며, CXCL13 중화 활성을 가진, 이들 항-CXCL13 항체의 항원-결합 단편, 변이체 및 유도체에도 적용가능한다.
일 구현예에서, 치료는, 환자에게, 본 발명의, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 적용 또는 투여, 또는 환자로부터 분리된 조직 또는 세포주로의 항-CXCL13 결합 분자의 적용 또는 투여를 포함하며, 이때 상기 환자는 질환, 질환 증상 또는 질환에 걸릴 소인을 가지고 있다. 다른 구현예에서, 치료는, 또한, 본 발명의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물의 환자에게로 적용 또는 투여, 또는 환자로부터 분리된 조직 또는 세포주로의 항-CXCL13 결합 분자를 포함하는 약학 조성물의 적용 또는 투여를 포괄하는 것으로 의도되며, 상기 환자는 질환, 질환 증상 또는 질환에 걸릴 소인을 가진다.
본 발명의, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다양한 악성 및 비-악성 종양을 치료하는데 유용하다. "항-종양 활성"은 악성 CXCL13-발현성 세포의 증식율 또는 축적율의 감소와, 그로 인한 기존 종양 또는 치료 중에 생긴 종양의 증식율 감소, 및/또는 기존 신생물 (종양) 세포 또는 신생 신생물 세포의 파괴, 및 그에 따른 치료 중이 종양의 전체 크기 감소를 의미한다. 예를 들어, 하나 이상의 항-CXCL13 항체를 이용한 치료는 인간에서 CXCL13-발현 세포와 관련된 질병 상태를 치료하는데 유리한 생리학적 반응을 야기한다.
일 구현예에서, 본 발명은, 약제로서 사용하기 위한, 특히 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 또는 전암성 상태 또는 병변에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 결합 단편, 예를 들어, MAb 5261은 CXCL13을 과다 발현하는 암을 치료하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CXCL13을 발현 또는 과다 발현하는 백혈병, 림프종 (예, MALT 림프종), 대장암, 췌장암, 위암, 식도암, 유방암 또는 전립선암을 치료하는데 사용된다. 일 구현예에서, 본 발명의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 암종, 예컨대 대장 암종 또는 전립선 암종의 치료에 사용된다. 일 구현예에서, 본 발명의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CXCR5을 발현 또는 과다 발현하는 암의 치료에 사용된다.
암을 치료 또는 예방하는데 있어, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 효능은, 동물 모델을 이용하여 입증할 수 있다. 예를 들어, 전립선암을 치료 또는 예방하는데 있어, 본 발명의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 효능은, 전립선암 동물 모델, 예컨대, PC3-luc 인간 전립선 암종을 주입하고 본 발명의 항-CXCL13 결합 분자를 처리한 마우스를 이용하여 입증할 수 있다. 다른 예로, 대장암을 치료 또는 예방하는데 있어, 본 발명의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 효능은, 대장암의 동물 모델, 예컨대, CT26대장 암종 세포를 주입하고 본 발명의 항-CXCL13 결합 분자를 처리한 마우스를 이용하여 입증할 수 있다. 다른 예로, MALT 림프종을 치료 또는 예방하는데 있어, 본 발명의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 효능은, 위 MALT 림프종의 동물 모델, 예컨대, 헬리코박터 박테리아 (Nobutani et al. (2010))를 감염시키고 본 발명의 항-CXCL13 결합 분자를 처리한 마우스를 이용하여 입증할 수 있다. 또한, Nobutani 등의 모델을 이용하여, 헬리코박터-감염된 조직의 위 림프성 소포의 감소에 대한 본 발명의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 효능을 평가할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 본원의 도처에 기술된, 하나 이상의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 악성 인간 세포에 대해 긍정적인 치료 반응을 일으키는데 사용된다. 암 치료에서 "긍정적인 치료 반응"은 이들 결합 분자, 예로, 항체 또는 그 단편의 항-종양 활성과 관련된 질환의 개선 및/또는 질병 관련 증상의 개선을 의미한다. 즉, 항-증식 효과, 추가적인 종양 생장의 예방, 종양의 크기 감소, 종양 혈관 감소, 암 세포의 수적 감소 및/또는 질병과 관련있는 한가지 이상의 증상의 감소를 관찰할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 질병 개선은 완전 관해(complete response)로 특정될 수 있다. "완전 관해"는 임상적으로 검출할 수 있는 질환이 존재하지 않으며, 기존의 임의의 비정상적인 방사선촬영 실험 결과, 골수 및 뇌척수액(CSF)의 정상화를 의미한다. 이러한 반응은 본 발명의 방법에 따라 치료한 후 적어도 1달 동안 지속되어야 한다. 다른 예로, 질환 개선은 부분 관해로서 분류될 수 있다. "부분 관해"는 새로운 병소 발생 없이 적어도 1달간 지속되는, 모든 측정가능한 종양 부하 (즉, 개체에 존재하는 종양 세포의 수)의 적어도 약 50%의 감소를 의미한다. 이러한 반응은 측정가능한 종양에만 적용가능하다.
종양 반응은 생발광 영상화, 예컨대 루시퍼라제 영상화, 골 스캔 영상화 및 골수 천자 (BNA) 등의 종양 생검 샘플링 방법을 이용한 종양의 형태적 (즉, 총 종양 부하, 종양 크기 등) 변화로 평가할 수 있다. 이러한 긍정적인 치료 반응 뿐만 아니라, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 이용한 치료를 진행중인 개체는 질병과 관련된 증상 개선에 이로운 효과를 경험할 수 있다. 예를 들어, 개체는 소위 B 증상, 예컨대 야간 발한, 열, 체중 감소 및/또는 두드러기에서의 완화를 경험할 수 있다.
또한, 본원에 기술된 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 염증 질환 및 CXCL13 발현 세포와 관련있는 면역 시스템의 결함 또는 장애를 치료 또는 예방하는데 용도를 가질 수 있다. 염증 질환은 염증 및 조직 파괴 또는 이의 조합이 특징적이다. "항-염증 활성"은 염증의 완화 또는 예방을 의미한다. "염증 질환"은 면역 반응의 개시 현상 또는 타겟에 예컨대 동종항원, 이종항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 미확인 항원 또는 알레르기 유발원 등의 비-자가 항원(들)이 관여하는, 모든 염증성 면역-매개 과정을 포함한다.
일 구현예에서, 염증 질환은, 박테리아 감염, 예컨대, 헬리코박터 감염, 예를 들어, 헬리코박터 필로리 (H. pylori), 헬리코박터 헤일만니이 (H. heilmannii), 헬리코박터 액시노니키스 (H. acinonychis), 헬리코박터 안세리스 (H. anseris), 헬리코박터 아우라티 (H. aurati), 헬리코박터 바쿨리포르미스 (H. baculiformis), 헬리코박터 빌리스 (H. bilis), 헬리코박터 비조제로니이 (H. bizzozeronii), 헬리코박터 브란테이 (H. brantae), 헬리코박터 칸다덴시스 (H. candadensis), 헬리코박터 카니스 (H. canis), 헬리코박터 콜레시스투스 (H. cholecystus), 헬리코박터 시나에디 (H. cinaedi), 헬리코박터 시노가스트리쿠스 (H. cynogastricus), 헬리코박터 에퀴오룸 (H. equorum), 헬리코박터 팰리스 (H. felis), 헬리코박터 패낼리이 (H. fenelliae), 헬리코박터 간마니 (H. ganmaii), 헬리코박터 헤파티쿠스 (H. hepaticus), 헬리코박터 메소트리세토룸 (H. mesocricetorum), 헬리코박터 마르모테이 (H. marmotae), 헬리코박터 무리다룸 (H. muridarum), 헬리코박터 무스텔레이 (H. mustelae), 헬리코박터 파메텐시스 (H. pametensis), 헬리코박터 풀로룸 (H. pullorum), 헬리코박터 라피니 (H. rappini), 헬리코박터 로덴티움 (H. rodentium), 헬리코박터 살로모니스 (H. salomonis), 헬리코박터 수이스 (H. suis), 헬리코박터 트로곤툼 (H. trogontum), 헬리코박터 티플로니우스 (H. typhlonius) 및 헬리코박터 윙해멘시스 (H. winghamensis) 감염과 관련있다. 특정 구현예에서, 헬리코박터 감염은 헬리코박터 필로리 또는 헬리코박터 헤일만니이 감염이다. 다른 구현예에서, 헬리코박터-관련 염증 질환은 MALT 림프종, 위암 (예, 식도암 또는 위장암), 위 또는 십이지장 궤양, 위염 (위장 라이닝의 염증) 또는 위 병변 (예, Chen et al., J Clin Pathol 55(2):133-7 (2002); Genta et al., Hum Pathol 24(6):577-83 (1993); Okiyama et al., Pathol Int 55(7):398-404 (2005))이다.
일 구현예에서, 염증 질환은 말초 또는 중추 신경계의 염증 장애이다.
아울러, 본 발명의 목적으로, 용어 "염증 질환(들)"은 비제한적으로 "자가면역 질환(들)"을 포함한다. 본원에서, 용어 "자가면역성"은 일반적으로 "자기" 항원이 관여된 염증성 면역-매개 프로세스를 포괄하는 것으로 이해된다. 자가면역 질환에서, 자기 항원(들)은 숙주 면역 반응을 촉발한다.
일 구현예에서, 본 발명의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체 또는 항원 결합 단편을 이용하여 다발 경화증 (MS)를 치료 또는 예방한다. MS는 산재성 경화증 또는 파종성 뇌척수염 (encephalomyelitis disseminata)이라고도 하며, 면역계가 중추 신경계를 공격하여 탈수초화를 유도하는 자가면역 증상이다. 명칭 "다발 경화증"은 신경에서 형성되는 병변 (경화증, 또한 자반 또는 병소라고도 함)으로도 지칭된다. MS 병변은 통상적으로 소뇌, 뇌간, 기저핵 또는 척수 및 안 신경의 공간에 근접한 백색질에서 이루어진다. MS는 마이엘린 시트 (myelin sheath) 형성 및 유지에 관여하는 세포인 희돌기 교세포를 파괴한다. MS는 마이엘린의 박막화 또는 전체 소실을 야기하며, 질환이 진행됨에 따라 축색 돌기의 절단을 야기한다.
신경학적 증상은 MS에 따라 다양할 수 있으며, 질환은 통상 신체적 및 인지적 불능으로 진행된다. MS는 몇가지 형태가 있는데, 새로운 증상들은 개별 공격 (재발 형태)으로 또는 경시적으로 서서히 누적 (진행형)되는 양상으로 이루어진다. 공격 사이에 증상들은 완전히 없어질 수 있지만, 영구적인 신경 손상이 발생되며, 특히 질환이 진행됨에 따라 발병할 수 있다.
실험적 자가면역성 뇌척수염 (EAE: Experimental Autoimmune Encephalomyelitis)은 널리 용인되고 있는 다발 경화증 동물 모델이다. EAE는 염증이 먼저 척수를 타겟팅하여 상향식으로 마비가 점차적으로 확대되는 CNS의 탈수초 질환이다. 이 질환은 유도 방식 및 사용 동물의 타입에 따라 급성, 만성 또는 재발-완화성으로 추정할 수 있다. Bagaeva 등은, B-세포 및 CXCL13-발현성 수지상 세포를 함유한 여포가 질환 경로에 따라 점차적으로 CXCL13 발현 수준이 증가하면서 재발-완화 EAE 마우스의 염증이 발생된 수막에 형성된다는 것을 확인하였다. CXCL13-결핍 마우스는 질환을 약하게 앓으며 재발율이 낮고, CXCL13를 항-CXCL13 MAb로 차단시 B10.PL 마우스에서 수동적으로 유도된 EAE에 대한 질환 감퇴를 유도하였다. Bagaeva et al., J. Immuno. 176:7676-7685 (2006).
CXCL13를 본 발명의 항-CXCL13 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어 MAb 5261로 중화하는 방법을 사용하여, 몇가지 여러 기전, 예컨대 CXCL13와 이의 수용체의 상호작용을 차단하여, 예컨대 B 및 여포 B-헬퍼 T 세포의 염증이 발생된 조직으로의 이동 및 배중심 형성을 방해하는 기전을 통해 MS의 중증도를 낮출 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여, 전신 루푸스 홍반증 (SLE 또는 루푸스)을 치료 또는 예방한다. SLE에는 복수의 장기가 관여하며, 자발적인 이소성 배 중심 형성 및 다수의 핵 항원에 대한 오토항체 생산으로 특정되는, 자가면역 질환이다. SLE 대부분은 심장, 관절, 피부, 폐, 혈관, 간, 신장 및 신경계에 작용한다.
활성화된 T 세포, B 세포 및 이의 이동-촉구성 케모카인 CXCL13는, SLE 등의 복수의 자가면역 장애들의 이소성 발병 부위에서 관찰되는 조직화된 림프구성 조직의 형성에 중추적인 역할을 수행한다. 루푸스-소인의 New Zealand Black X New Zealand White F1 (NZB/NZWF1) 마우스에서는 자발적으로 고역가의 항-dsDNA 항체와 신장 사구체내 면역 복합체의 형성에 의해 야기되는 중증 증식성 사구체신염이 발생한다. 이들 모델에서의 루푸스-유사 증상 발병은 신장 및 흉선의 수지상 세포에 의한 CXCL13 발현 증가에 수반된다 (Ishikawa et al., J. Exp. Med. 193(12):1393-1402 (2001); Schiffer et al., J. Immun. 171:489-497 (2003)).
본 발명의 항-CXCL13 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예컨대 MAb 5261을 이용한 CXCL13의 중화 방법을 이용하여, 몇가지 여러 기전, 예컨대 CXCL13와 이의 수용체의 상호작용을 차단하여, 예컨대 B 및 여포 B-헬퍼 T 세포의 염증이 발생된 조직으로의 이동 및 배중심 형성을 방해하는 기전을 통해 SLE의 중증도를 낮출 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체 또는 항원 결합 단편을 이용하여, 관절염, 예컨대 류마티스 관절염을 치료 또는 예방한다. 류마티스 관절염 (RA)는 미국 인구의 2-4%에서 발생하는 가장 일반적인 자가면역 질환 중 하나이다. 이는 윤활 관절의 융합, 연골 부식 및 골 파괴가 특징적인 만성, 진행성, 전신 염증 장애이다. RA에서, T 세포, B 세포, 대식세세포 및 수지상 세포 (DC)는 윤활층에 축적되어 판누스(pannus) (연골 및 골에 침식된 활막 침습 부위)를 만든다. 아울러, 윤활 병변내 T 세포와 B 세포는 오토항체 (류마티스 요인) 생산을 뒷받침하여, 질환 발병에 직접 기여하는, 림프성 배 중심-유사 구조로 조직화된다 (Takemura et al., J. Immuno. 167:1072-1080 (2001); Shi et al., J. of Immuno. 166:650-655 (2001)).
림프구성 케모카인 CXCL13는 활막 섬유모세포, 선택된 내피 세포, 활막 항원-유발성 T 헬퍼 세포 및 FDC에 의해 생산되며 (Takemura et al. (2001); Shi et al. (2001); Manzo et al., Arthritis & Rheumatism 58(11):3377-3387 (2008)), CXCR5-양성의 림프구 세포 (주로 B 세포 및 여포 T 헬퍼 세포)가 염증 발생된 활막으로의 이동을 지시함으로써, 활막 조직내 배중심 형성에 중요한 역할을 수행한다.
임상적으로, RA 환자에서의 혈장내 CXCL13 수준은, 활성형 RA 환자의 혈장에서의 CXCL13의 수준이 대조군 및 잠복 질환자에 비해 현저하게 높기 때문에, 질환 중증도와 상관성이 있다 (Rioja et al., Arthritis & Rheumatism 58(8):2257-2267 (2008)). 아울러, CXCL5 수용체는 RA 환자의 활막에서 상향 조절되며, 침윤성 B 및 T 세포와 또한 대식세포 및 내피세포 상에 존재한다 (Schmutz et al., Arthritis Research Therapy 7:R217-R229 (2005)).
마우스 및 랫에서의 콜라겐-유발성 관절염 (CIA)은 잘 확립되어 있는 인간 류마티스 관절염(RA) 모델이다. 이 질환은 전형적으로 CFA (Complete Freund's Adjuvant)에 에멀젼화한 II형 소 콜라겐을 진피내 주사함으로써 유도되며, 마우스 콜라겐 항체 생산 및 후속적으로 발에서의 점진적인 관절염 발생이 특징적이다. Stannard 등은 CXCL13을 랫 항-뮤라인 CXCL13 항체로 중화하면, 관절염 DBA/1 마우스에서 관절염 스코어 및 관절 파괴 심각도가 현저하게 감소됨을 확인하였다. Stannard et al., "Neutralization of CXCL13 impacts B-cell trafficking and reduces severity of established experimental arthritis," Presented at American College of Rheumatology 2008 Annual Scientific Meeting (2008).
본 발명의 항-CXCL13 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예컨대, MAb 5261을 이용한 CXCL13의 중화를 이용하여, 몇가지 다른 기전을 통해, 예컨대, CXCL13와 이의 수용체의 상호작용을 차단하여, 예컨대 B 및 여포 B-헬퍼 T 세포의 염증이 발생된 조직으로의 이동 및 배중심 형성을 방해하는 기전을 통해 관절염, 예컨대 류마티스 관절염의 중증도를 낮출 수 있다. 아울러, 본 발명의 항-CXCL13 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예컨대, MAb 5261을 이용하여, 예컨대 RANKL 과다발현 환자에서 RANKL 발현 및 골 감소를 완화시킬 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 본원의 도처에 정의된, 하나 이상의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하여, 자가면역 질환 및/또는 염증 질환의 치료 또는 예방에 대한 긍정적인 치료 반응을 발생시킨다. 자가면역 질환 및/또는 염증 질환에서 "긍정적인 치료 반응"은 이들 항체의 항-염증 활성, 항-혈관형성 활성, 항-세포자살 활성 등에 의한 질환의 개선, 및/또는 상기 질환 관련 증상의 개선을 의미한다. 즉, 항-증식 효과, CXCL13-발현 세포의 추가적인 증식 예방, 염증 반응 감소, 비제한적인 예로서, 염증성 사이토카인, 부착 분자, 프로테아제, 면역글로불린 (예, CXCL13를 가진 세포가 B 세포인 경우), 이들의 조합 등의 분비 감소, 항-염증 단백질의 생산 증가, 자기반응성 세포의 수 감소, 면역 허용성 증가, 자기반응성 세포 생존성 저해, 세포자살 감소, 내피세포 이동 감소, 자발성 단핵구 이동 증가, CXCL13-발현 세포의 자극화에 의해 매개되는 한가지 이상의 증상의 완화 및/또는 감소를 관찰할 수 있다. 이러한 긍정적인 치료 반응은 투여 경로에 제한되지 않으며, 공여체, 공여체 조직 (예, 장기 관류), 숙주, 이들의 임의 조합 등으로의 투여를 포함할 수 있다.
임상 반응은 자기 공명 영상화(MRI) 스캔, X-방사선촬용 영상화, 컴퓨터 토모그래프(CT) 스캔, 유세포 측정 또는 형광-활성화된 세포 분류(FACS) 분석, 조직, 육안 병리 검사 및 혈액 화학법 등의 스크리닝 기법으로 평가할 수 있으며, 비제한적으로 ELISA, RIA, 크로마토그래피 등을 포함한다. 이러한 긍정적인 치료 반응 외에도, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 이용한 치료를 받고 있는 개체는 질환과 관련된 증상 개선에 유익한 효과를 경험할 수 있다.
본 발명의 다른 예는, 임상 테스트 과정의 일부분으로서, 예컨대 해당 치료 요법의 효능 확인을 위해, 조직내 단백질 수준을 진단학적으로 모니터링함에 있어, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 사용이다. 예를 들어, 검출은 검출가능한 물질을 항체에 커플링시켜 용이하게 실시할 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는, 다양한 효소, 보결기, 형광물질, 발광 물질, 생발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적정 효소의 예로는, 호르세라디시 퍼옥시다제, 알카리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제가 있으며; 적합한 보결기 복합체로는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴이 있으며; 적합한 형광 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 있으며; 발광 물질의 예로는 루미놀이 있으며; 생발광 물질의 예로는 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿠오린이 있으며, 적합한 방사성 물질로는 125I, 131I, 35S, 또는 3H가 있다.
VIII. 약학 조성물 및 투여 방법
본 발명의, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 제조 방법 및 필요한 개체에 투여하는 방법은 당업자에 잘 알려져 있거나 또는 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 투여 경로는, 예컨대, 구강, 비경구, 흡입 또는 국소일 수 있다. 본원에서 용어 "비경구"는 예컨대, 정맥내, 동맥내, 복막내, 근육내, 피하, 직장, 또는 질 투여를 포함한다. 이들 모든 형태의 투여는 본 발명의 범위내인 것으로 명백히 인지되지만, 투여 형태의 예는 주사용, 특히 정맥내 또는 동맥내 주사용 용액, 또는 드립(drip) 용액일 수 있다. 통상, 주사하기에 적합한 약학 조성물은 완충제 (예, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충제), 계면활성제 (예, 폴리소르베이트), 선택적으로 안정제 (예, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 기술된 방법과 상용가능한 다른 방법에 있어서, 본 발명의, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체를 직접 유해한 세포 집단 부위에 전달하여, 병에 걸린 조직을 치료제에 대한 노출을 높일 수 있다.
본원에 언급한 바와 같이, 본 발명의, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체는, 특정 타입의 암, 자가면역 질환 및 중추 신경계 (CNS) 및 말초 신경계 (PNS) 염증 질환을 비롯한 염증 질환 등의 CXCL13-발현 세포-매개 질환의 생체내 치료를 위해 제약학적 유효량으로 투여할 수 있다. 이런 점에서, 본 발명의 기술된 결합 분자들은 활성제의 투여를 쉽게하고 안정성을 강화하도록 제형화된다는 것은 인지할 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 제약학적으로 허용가능한, 무독성, 무균 담체, 예컨대 생리 식염수, 무독성 완충제, 보존제 등을 포함한다. 본 발명의 목적에서, 접합되거나 접합되지 않은, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체의 약학적 유효량은, 타겟에 대한 효과적인 결합을 달성하여 이로운 효과를 성취, 예컨대 질병이나 장애의 증상을 완화시키거나 또는 물질이나 세포를 검출하는데 충분한 함량을 의미하는 것으로 사용될 것이다.
본 발명에 사용되는 약학 조성물은, 예컨대, 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질, 포스페이트와 같은 완충제 물질, 글리신, 소르브산, 포타슘 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 포타민 설페이트와 같은 전해질, 디소듐 하이드로겐 포스페이트, 포타슘 하이드로겐 포스페이트, 소듐 클로라이드, 아연 염, 콜로이드형 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스계 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 폴리머, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 등을 비롯한 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
비경구 투여용 조제물은 무균 수계 또는 비수계 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수계 용매의 예로는, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸 올레이트와 같은 주사용 유기 에스테르가 있다. 수계 담체로는, 염수 및 완충화된 매질을 비롯한, 물, 알콜성/수계 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 본 발명에서, 약제학적으로 허용가능한 담체로는, 0.01-0.1　M의, 예컨대 0.05　M의 포스페이트 완충액 또는 0.8% 염수가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 그외 통상적인 비경구 비히클로는, 소듐 포스페이트 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 소듐 클로라이드, 락테이트화된 링거 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클로는, 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제, 예컨대 링거 덱스트로스를 기본으로 한 비히클 등을 포함한다. 예컨대 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제, 및 불활성 가스 등과 같은 보존제 및 그외 첨가제도 존재할 수 있다.
보다 구체적으로는, 주사용으로 적합한 약학 조성물은 무균 수용액 (수용성) 또는 분산액 및 무균 주사용액이나 분산액의 즉석 제조용 무균 분말을 포함한다. 그러한 경우에서, 조성물은 무균성이어야 하며, 주사성이 용이한 범위로 유동적이어야 한다. 제조 및 저장 조건 하에서 안정적이어야 하며, 바람직하게는 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염이 방지될 것이다. 담체는, 예컨대 물, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 용액 등), 및 이들의 적정 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예컨대, 레시틴과 같은 코팅제의 이용에 의해, 분산액의 경우 필수 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해, 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 본원에 기술된 치료 방법에 사용하기에 적합한 제형들은 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980)에 기재되어 있다.
미생물의 작동 예방은, 다양한 항세균제 및 항진균제, 예컨대, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성할 수 있다. 어떤 경우들에서는, 등장성 물질, 예컨대 당, 만니톨과 같은 폴리알코올, 소르비톨 또는 소듐 클로라이드를 조성물내에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 장기 흡수는, 조성물에 흡수를 지연시키는 물질, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써, 이룰 수 있다.
임의 경우에, 무균 주사용액은 활성 화합물 (예, 항-CXCL13 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체, 그 자체 또는 다른 활성 물질과의 조합)을 적절한 용매 중에 필요한 함량으로, 본원에 기재된 하나의 성분이나 성분들의 조합과 함께 병합하고, 필요에 따라 여과 멸균이 후속됨으로써, 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은, 활성 화합물을, 염기성의 분산 매질과 전술한 성분들 중 그외 필요한 성분이 포함된, 무균 비히클에 병합함으로써, 제조한다. 무균 주사용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조이며, 이러한 방법으로 활성 성분과 미리 멸균-여과한 용액 유래 임의의 추가적인 바람직한 성분들로 구성된 분말이 제조된다. 당업계에 공지된 방법에 따라, 주사용 조제물을 가공하고, 앰플, 백, 병, 주사기 또는 바이얼 등의 용기에 충진한 다음, 무균 조건하에서 밀봉한된다. 아울러, 조제물은 미국 특허 출원번호 09/259,337에 개시된 바와 같이, 키트 형태로 포장 및 판매할 수 있다. 이러한 제조 물품에는, 바람직하게는, 첨부된 조성물이 질병 또는 장애를 앓고 있거나 소인이 있는 개체를 치료하는데 유용함을 기재한 라벨 또는 패키지 삽입물이 포함될 것이다.
비경구 제형은 1회 볼루스 투약, 주입 또는 부하 볼루스 투약 (loading bolus dose) 후 유지 용량 투여일 수 있다. 이들 조성물은 특정 고정된 또는 가변적인 간격으로, 예컨대 하루에 1회 또는 "필요할 때" 투여할 수 있다.
본 발명에 사용되는 임의의 약학 조성물은, 예컨대 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 수용액 등의, 허용가능한 투약 형태로 경구 투여할 수 있다. 또한, 임의의 약학 조성물은 코 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 생체이용성을 증진시키기 위해 벤질 알코올 또는 그외 적합한 보존제, 흡수 촉매제 및/또는 그외 통상적인 가용화제 또는 분산제를 사용하여, 염수 중의 용액으로서 제조할 수 있다.
담체 물질과 조합하여 단일 투약 형태(single dosage form)로 제조할 수 있는, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체의 함량은, 치료되는 숙주와 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 조성물은 1회 투약, 다회 용량으로 투여하거나, 또는 주입시 정해진 기간동안 투여할 수 있다. 또한, 투약 요법은 바람직한 최적 반응 (예, 치료 반응 또는 예방 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다.
본 명세서의 범위내에서, 본 발명의, 항-CXCL13 항체, 또는 이의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체는 치료 효과를 형성하는데 충분한 함량으로 전술한 치료 방법으로 인간 또는 그외 동물에 투여할 수 있다. 본 발명의, 항-CXCL13 항체, 또는 이의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체는 본 발명의 항체, 예컨대 MAb 5261을 통상적인 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 공지 기법에 따라 조합하여 제조한 통상적인 투약 형태로 인간 또는 그외 동물에게 투여할 수 있다. 당업자라면, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제의 형태 및 특징이 조합되는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 그외 잘 알려져 있는 변수에 의해 지정된다는 것을 인지할 것이다. 당업자는, 본 발명의, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대, 항체 또는 이의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체 중 하나 이상을 포함하는 칵테일이 특히 효과적임을 입증할 수 있다는 것을 잘 알 것이다.
"치료학적 유효량 또는 치료학적 양" 또는 "유효량"은 투여하였을 때 치료할 질환을 앓고 있는 환자의 치료에 대해 긍정적인 치료 반응을 일으키는, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 양이다.
특정 유형의 암, 예컨대, 백혈병, 림프종 (예, MALT 림프종), 대장암, 유방암, 식도암, 위장암 및 전립선암; 자가면역 질환, 예컨대, 루푸스, 관절염, 다발성 경화증, 및 염증 질환, 예컨대 중추 신경계 (CNS) 및 말초 신경계 (PNS) 염증 질환 등의, CXCL13-발현 세포-매개 질환을 치료하기 위한, 본 발명의 조성물의 치료학적 유효량은, 투여, 타겟 부위, 환자의 생리 상태, 환자가 인간 또는 동물인지, 다른 약제의 투여, 및 치료가 예방학적이거나 치료학적인지 등의 수단을 비롯한 다수의 여러 인자들에 따라 달라진다. 일반적으로, 환자는 인간이나, 형질전환 포유류 등의 비-인간 포유류도 치료될 수 있다. 치료 용량은 안전성과 효능을 최적화하기 위해 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 일반적인 방법으로 적정할 수 있다.
하나 이상의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편의 투여량은 과도한 실험없이도 본 발명의 개시 내용을 고여하여 당해 기술 분야의 당업자가 쉽게 결정한다. 투여 방식 및 하나 이상의 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 각 함량에 영향을 미치는 인자로는, 질환의 중증도, 병력 및 치료 중인 개체의 연령, 키, 체중, 체중 및 신체 상태를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 마찬가지로, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 투여량은, 개체가 이들 물질을 1회 투여받거나 다회 투여받을지와 투여 방식에 따라 결정될 것이다.
또한, 본 발명은, 예를 들어 MS, 관절염, 루푸스, 위염, 궤양 또는 암을 비롯한 자가면역 질환 및/또는 염증 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 항-CXCL13 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 결합 단편, 변이체 또는 유도체의 용도를 제공한다.
IX. 진단
본 발명은, 개체에서 조직 또는 다른 세포 또는 체액에서 CXCL13 단백질 또는 전사체의 발현 수준을 측정하고, 측정한 발현 수준을 정상 조직 도는 체액에서의 각 발현 수준과 비교하여, 기준 대비 발현 수준 증가는 장애의 표시인, 자가면역 질환을 비롯한 특정 유형의 암 및 염증 질환과 같은 CXCL13-발현 세포-매개 질환을 진단하는데 유용한 진단 방법을, 추가로 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-CXCL13 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 및 유도체, 예컨대, MAb MAb 5261, MAb 5378, MAb 5080, MAb 1476, 3D2 또는 3C9는 암, 다발성 경화증, 관절염 또는 루푸스를 진단하는데 사용된다.
본 발명의 항-CXCL13 항체 및 이의 항원 결합 단편, 변이체 및 유도체를 사용하여, 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 고전적인 면역조직 방법을 이용하여 생물 샘플에서 CXCL13 단백질 수준을 분석할 수 있다 (예, Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen et al., J. Cell Biol. 105:3087-3096 (1987)). CXCL13 단백질 발현 검출에 사용가능한 그외 항체-기반의 방법으로는, 효소 결합된 면역흡착 분석(ELISA), 면역침강 또는 웨스턴 블롯팅과 같은 면역분석법을 포함한다. 적합한 분석법은 본원의 도처에 보다 상세하게 기재되어 있다.
"CXCL13 폴리펩타이드의 발현 수준 분석"은 제1 생물학적 샘플에서 CXCL13 폴리펩타이드의 수준을 직접 (예, 단백질의 절대 수치를 결정 또는 추정함으로써) 또는 상대적으로 (예, 제2 생물학적 샘플에서의 질병과 연관된 폴리펩타이드의 수준을 비교함으로써) 정량 또는 정성 측정 또는 추정하는 것을 의미한다. 일 구현예에서, 제1 생물학적 샘플에서의 CXCL13 폴리펩타이드의 발현 수준을 측정 또는 추정하고, 장애가 없는 개체 집단의 수치를 평균화하여 결정되거나, 또는 장애가 없는 개체로부터 수득한 제2 생물학적 샘플로부터 취한 기준인, 기준 CXCL13 폴리펩타이드 수치와 비교한다. 당업계에 자명한 바와 같이, "기준" CXCL13 폴리펩타이드 수준이 구해지면, 이를 비교용 기준으로서 반복적으로 사용할 수 있다.
"생물학적 샘플"은 개체로부터 수득한 모든 생물학적 샘플, 세포주, 조직 배양물 또는 CXCL13을 발현할 가능성이 있는 그외 세포 소스를 의미한다. 포유류로부터 조직 생검 및 체액을 수득하는 방법들은 당업계에 잘 알려져 있다.
X. 면역분석
본 발명의, 항-CXCL13 항체, 또는 이의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체는 당업계에 공지된 임의 방법으로 면역특이적 결합을 분석할 수 있다. 사용할 수 있는 면역분석법으로는, 웨스턴 블롯, 방사면역분석, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), "샌드위치" 면역분석, 면역침강 분석, 침강소 반응, 겔 확산 침강 반응, 면역확산 분석, 어글루틴화 분석, 보체-고정 분석, 면역방사측정 분석, 형광 면역분석, 단백질 A 면역분석 등과 같은 기법을 이용한 경쟁적 및 비-경쟁적 분석 시스템이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이러한 분석법은 통상적이며, 당업계에 잘 알려져 있다 (예, Ausubel et al., eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol. 1을 참조하며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
경쟁적인 결합 분석에 의해 항체의 항원 결합 친화성 및 항체-항원 상호작용의 오프율을 측정할 수 있다. 경쟁적인 결합 분석의 일 예는, 비표지 항원의 양을 증가시키는 조건 하에 표지된 항원 (예, 3H 또는 125I)을 대상 항체와 인큐베이션하는 단계 및 상기 표지된 항원에 결합된 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 방사면역분석이다. 대상 항체의 특정 항원에 대한 친화성 및 결합 오프율은 스케차드 플롯 분석(scatchard plot analysis)에 의해 데이타로부터 결정할 수 있다. 또한, 2차 항체와의 경쟁은 방사면역분석을 이용하여 결정할 수 있다. 이 경우, 항원은 비표지 2차 항체의 양을 증가시키는 조건 하에 표지된 화합물 (예, 3H 또는 125I)이 접합된 대상 항체와 인큐베이션한다.
항-CXCL13 항체, 또는 이의 항원-결합성 단편, 변이체 또는 유도체의 소정의 로트 (lot)의 결합 활성도 잘 공지된 방법으로 결정할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자는 일반적인 실험을 수행하여 각 측정에 대한 작동가능하며 최적인 분석 조건을 정할 수 있을 것이다.
항체-항원 상호작용의 친화성을 측정하기 위해 이용가능한 다양한 방법들이 있지만, 속도 상수(rate constant)를 결정하는 방법은 비교적 적은 편이다. 대부분의 방법들은 항체 또는 항원의 표지 방법들 중 어느 한가지 방법에 따르는데, 불가피하게도 통상적인 측정을 복잡하게 만드며 측정된 수치에 불확실성을 부가한다.
BIAcore®에서 수행되는 바와 같은 표면 플라스몬 공명(SPR)은 항체-항원 상호작용의 친화성을 측정하는 기존의 방법에 비해 다수의 장점들을 제공하며, 그 예로는, (i) 항원 또는 항체를 표지할 필요가 없으며; (ii) 항체를 미리 정제할 필요가 없으며, 세포 배양 상층액을 직접 사용할 수 있으며; (iii) 여러가지 단일클론 항체의 상호작용에 대한 신속한 반-정량적 분석을 가능하게 하며 많은 평가 목적에 충분한, 실시간 측정; (iv) 생물특이적인 표면을 재생할 수 있어, 여러가지 단일클론 항체 시리즈를 동일한 조건에서 쉽게 비교할 수 있으며; (v) 분석 과정 전체가 자동화되어 있고, 광범위한 시리즈 측정을 사용자의 개입없이 수행할 수 있다. BIAapplications Handbook, version AB (reprinted 1998), BIACORE® code No. BR-1001-86; BIAtechnology Handbook, version AB (reprinted 1998), BIACORE® code No. BR-1001-84. SPR을 기초로한 결합 실험에서는, 센서 표면 상에 결합 쌍을 구성하는 구성원 하나가 고정되어야 한다. 고정된 결합 파트너를 리간드라고 한다. 용액 중의 결합 파트너를 분석물이라고 한다. 어떤 경우들에서는, 리간드는 포획 분자라고 하는 다른 고정된 분자에 결합을 통해 표면에 간접적으로 부착된다. SPR 반응은 분석물이 결합 또는 해리됨에 따라 검출기 표면에서의 질량 농도(mass concentration)의 변화를 나타낸다.
SPR을 기초로, 실시간 BIAcore® 측정은 현상 진행에 따라 직접적으로 상호작용을 모니터링한다. 이 기법은 역학적 파라미터의 결정에 매우 적합하다. 상대적인 친화성 랭킹은 수행하기 매우 간단하며, 역학 상수 및 친화성 상수 모두 센서그람(sensorgram) 데이타로부터 추출할 수 있다.
분석물을 리간드 표면을 통해 이산 펄스(discrete pulse)로 주입하였을 때, 수득되는 센서그람을 3단계의 필연적인 단계(essential phase)로 나뉠 수 있다: (i) 샘플의 주입 중의 분석물과 리간드의 조합; (ii) 샘플의 주입 중의 평형 또는 정상 상태(steady state)로, 분석물의 결합 속도는 복합체로부터의 해리와 균형을 이룸; (iii) 완충액이 흐르는 동안 표면으로부터 분석물의 해리.
조합 단계 및 해리 단계에서는, 분석물-리간드 상호작용의 카이네틱스에 대한 정보 (ka 및 kd, 복합체 형성 및 해리 속도, kd/ka = KD)가 제공된다. 평형 상태에서는 분석물-리간드 상호작용의 친화성 (KD)에 대한 정보가 제공된다.
BIA평가 소프트웨어는, 수치 적분 및 전체적인 피팅 알고리즘(global fitting algorithm) 둘다를 이용하여, 곡선 피팅을 위한 포괄적인 수단을 제공한다. 데이타에 대한 적절한 분석으로, 분리 속도 및 상호작용에 대한 친화성 상수를 간단한 BIAcore® 조사로 구할 수 있다. 이러한 기법에 의해 측정가능한 친화성 범위는 mM 내지 pM으로 매우 넓다.
에피토프 특이성은 단일클론 항체의 주된 특징이다. 방사면역분석, ELISA 또는 그외 표면 흡착 방법을 이용한 통상적인 기법과는 대조적으로, BIAcore®를 이용한 에피토프 맵핑에는 표지 또는 정제된 항체가 필요 없으며, 수개의 단일클론 항체 서열을 이용한 다중-부위 특이성 테스트가 가능하다. 아울러, 많은 수의 분석을 자동적으로 처리할 수 있다.
페어와이즈(Pair-wise) 결합 실험은 2개의 MAb가 동시에 동일한 항원에 결합할 수 있는 능력을 조사한다. 개별 에피토프에 대한 MAb는 독립적으로 결합하겠지만, 동일하거나 또는 매우 근친한 에피토프에 대한 MAb는 서로의 결합을 간섭할 것이다. BIAcore®를 이용한 이러한 결합 실험은 간단하게 수행된다.
예를 들면, 포획 분자를 이용하여 1차 Mab에 결합한 다음, 항원과 2차 MAb를 순차적으로 첨가할 수 있다. 센소그람으로, (1) 1차 Mab에 몇개의 항원에 결합하는지, (2) 2차 MAb가 표면-부착된 항원에 결합하는 정도, (3) 2차 Mab가 결합하지 않는다면, 페어와이즈 테스트의 순서를 반대로하였을 때 결과를 변화시키는 지를, 알 수 있을 것이다.
펩타이드의 저해는 에피토프 맵핑에 사용되는 다른 기법이다. 이 방법은 페어-와이즈 항체 결합 연구를 보완할 수 있으며, 항원의 일차 서열을 알고 있을 경우 기능성 에피토프를 구조적 특징과 연관시킬 수 있다. 펩타이드 또는 항원 단편은 고정된 항원에 대한 여러가지 MAb의 결합 저해를 테스트한다. 소정의 MAb의 결합을 방해하는 펩타이드는, 상기 Mab에 의해 제한된 에피토프와 구조적으로 관련성이 있는 것으로 추측된다.
본 발명의 실시는, 별도의 언급이 없는 한, 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학 등의, 당업계의 기술내에 있는 통상적인 기술을 이용할 것이다. 이러한 기법들은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예로, Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); 및 Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)를 참조한다.
항체 조작의 일반적인 원칙은 Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2nd ed.; Oxford Univ. Press)에 기술되어 있다. 단백질 조작에 대한 일반적인 원칙은 Rickwood et al., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.)에 기술되어 있다. 항체 및 항체-헵텐 결합에 대한 일반적인 원칙은 Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2nd ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); 및 Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.)에 기술되어 있다. 또한, 당업계에 공지되어 있으며 구체적으로 기술되지 않은, 면역학과 관련된 표준 방법들은, 일반적으로, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8th ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) and Mishell and Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY)를 따른다.
면역학의 일반적인 원칙이 기재되어 있는 표준 참조 문헌으로는, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett et al., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al., (Elsevere, Amsterdam); Goldsby et al., eds. (2000) Kuby Immunnology (4th ed.; H. Freemand & Co.); Roitt et al. (2001) Immunology (6th ed.; London: Mosby); Abbas et al. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5th ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann and Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlan); Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall2003); Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach and Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press)가 있다.
상기에서 인용된 문헌들과 그 문헌에 원용된 참고문헌들은 모두 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
하기 실시예들은 예시하기 위한 것으로 제공되며, 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
인간 CXCL13에 특이적인 마우스 항체의 선별 및 특정화
하이브리도마 제조. 스위스 웹스터 마우스를 키홀 림페트 헤모시아닌 (KLH: Keyhole limpet hemocyanin)-접합된 인간 CXCL13로 면역화하였다. 3회 면역화한 후, 최고 항-CXCL13 역가를 보이는 마우스에서 비장을 취하고, 비장 세포를 SP2/0 골수종 세포와 표준 공정으로 융합하여 하이브리도마를 제작하였다.
하이브리도마 클론을 인간 및 마우스 CXCL13 단백질에 대한 결합성에 대하여 ELISA로 스크리닝하였다. ELISA 플레이트를 약 100 nM의 인간 (Peprotech: #300-47) 또는 마우스 (Peprotech: #250-24) CXCL13 단백질로 밤새 실온 (RT)에서 코팅하였다. 플레이트를 세척 및 블롯킹한 후, 표준 항-CXCL13 항체 (R&D Systems: 랫 항-마우스 MAb 470 및 마우스 항-인간 MAb 801) 희석물 또는 하이브리도마 상층액을 첨가하여, RT에서 1시간 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 이차 항체 (하이브리도마 상층액 및 MAb 801의 경우, 염소 항-마우스 IgG-HRP; MAb 470의 경우, 당나귀 항-랫 IgG-HRP)를 첨가하여, RT에서 1시간 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질 시약 A 및 B (BD Biosciences: #555214)를 동일 부피로 혼합하여 15분간 암조건에서 발색시키고, 450/570 파장에서 판독하였다. "3D2" 및 "3C9"으로 표시한, 둘다 마우스 IgG1 항체에 대한 2개의 양성 하이브리도마 클론을 추가적인 특정화를 위해 선택하였다.
하이브리도마에서 생산되는 마우스 항-인간 항체, 즉 3D2 및 3C9의 특이성을, 재조합 케모카인 (Peprotech: 마우스 및 인간 CXCL13, 인간 IL-8/CXCL8 (#200-08), 인간 IP-10/CXCL10 (#200-10), 인간 MIG/CXCL9 (#300-26), 인간 SDF-1alpha/CXCL12 (#300-28A) 및 시노몰구스 원숭이 CXCL13)과 수개의 비특이 대조군 항원 (재조합 인간 C35, 스트렙타비딘 (Thermo: #21122), 소 혈청 알부민 (BSA) (SeraCore: #AP-4510-01)), 인간 혈청 알부민 (HAS) (Sigma: #A8763), 인슐린 (Gibco: #12585-014), 및 헤모글로빈 (Sigma: #H7379))이 포함된 패널에서의 (전술한 바와 같이) ELISA에 의해 분석하였다. 시판 항체 MAb 470과 MAb 801 (R&D Systems)을 각각 마우스 및 인간/시노몰구스 원숭이 CXCL13 결합에 대한 양성 대조군으로 사용하였다.
3D2과 3C9는 CXCL13에 특이적으로 결합하는 것으로 확인되었다. 3D2 및 3C9 클론들은 재조합 인간, 마우스 및 시노몰구스 원숭이 CXCL13에 결합하였으므로, 다수-종에 대한 CXCL13 특이성이 입증되었다 (도 1A-1C). 도 1은 3가지 이상의 실험에 대한 2회 측정 결과를 나타낸다. 3D2 항체는 재조합 인간, 마우스 및 원숭이 CXCL13에 강하게 결합하는 것으로 확인되었다. 구체적으로, 3D2는 3C9 및 MAb 801에 비해 재조합 CXCL13에 더 강하게 결합하였다. 3D2를 시험관내 및 생체내에서 추가로 특정화하였다 (결과는 아래에 나타냄). 3D2 항체를 또한 키메라 및 인간화된 CXCL13 항체들을 제조하기 위한 원형체로서 사용하였다 (결과는 아래에 나타냄). 3C9 항체는 3D2, MAb 470 및 MAb 801에 비해 재조합 CXCL13에 대한 결합성이 가장 높은 것으로 확인되었다. 3C9와 3D2는 생물분석 개발 (예, 하기 에피토프 경쟁 ELISA)에 시약으로 사용하였다.
BIACORE ® 에 의한 3D2 친화성 측정. 재조합 인간 및 마우스 CXCL13에 대한 3D2, 3C9, MAb 801 및 MAb 470의 친화성을 BIACORE®로 측정하였다. C1 칩에 아세테이트 완충액 (pH=5) 중에서 인간 CXCL13 1 ㎍/ml, 마우스 CXCL13 0.3 ㎍/ml, 및 음성 대조군 SDF-알파 0.5 ㎍/ml을 이용하여, 케모카인을 고정하였다. 3D2 및 3C9를 HBS-EP 완충액으로 100 nM에서 0.78 nM, 그리고 38 nM에서 0.594 nM로 2배 희석하였다. MAb 801과 MAB 470을 50 nM에서 0.78 nM로, 19 nM에서 0.594 nM로 2배 희석하였다. 인간 및 마우스 CXCL13 상에서의 3D2에 대한 친화성 측정치 (nM)는 시판 항체 MAb 801 및 MAb 470 각각에 비해 현저하게 낮은 것으로 확인되었다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.
표 2. 친화성 측정치1
항체 Fc 친화성, nM
인간 CXCL13 마우스 CXCL13
3D2 마우스 IgG1 12.9 159.3
3C9 마우스 IgG1 2.5 NB
MAb 801 마우스 IgG1 1.3 NB
MAb 470 랫 IgG2a NB 5.4
1 친화성은 재조합 인간 및 마우스 CXCL13에 대한 것임; NB = 결합 안함.
3D2 에피토프 맵핑. 에피토프 맵핑 실험은 에피토프 경쟁 ELISA를 이용하여 수행하였다. 플레이트를 100 nM 재조합 인간 CXCL13로 코팅하고, 0.033 nM의 바이오틴화된 3D2와 인큐베이션한 후, 과잉의 3D2 중에 다양한 농도의 경쟁적인 비표지 항체를 첨가하였다. 각 실험의 결과는 도 2에 나타낸다. 그 결과, 3C9는 인간 CXCL13와의 결합에 대해 3D2와 경쟁하지만, MAb 801은 인간 CXCL13와의 결합에 대해 3D2와 경쟁하지 않았다.
천연 CXCL13에 대한 3D2의 결합. 포획 에피토프 경쟁 ELISA를 이용하여, 천연 인간 및 마우스 CXCL13에 대한 3D2 결합성을 분석하였다. 본 분석에서, 천연 인간 CXCL13은 인간 IFN-감마-자극된 THP-1 세포로부터 수집한 상층액으로부터 수득하였다. 인간 CXCL13 (THP1 상층액의 1:4 희석 또는 0.097 nM (1 ng/ml) rhuCXCL13)을 6.6 nM MAb 801로 포착하고, 0.66 nM 바이오틴-3C9로 검출하였다. 적절한 항원을 제시하기 위해, 조직 배양 상층액 (또는 대조군으로서 사용된 재조합 인간 CXCL13)으로부터 수득한 케모카인을 MAb 801에 의해 ELISA 플레이트 상에서 포착하였다. 그런 후, 플레이트를 비표지 3D2가 다양한 양으로 존재하는 조건에서 바이오틴화된 3C9와 함께 인큐베이션하였다. 바이오틴화된 3C9의 결합을 감소시키는 인간 CXCL13과의 결합에 대한 경쟁을 스트렙타비딘-HRP로 검출하였다. 도 3A에서 입증되는 바와 같이, 3D2는 천연 및 재조합 인간 CXCL13 둘다와 강하게 결합하였으며, 통계적으로 비슷한 EC50 값이 구해졌다.
TNF-알파 형질전환 마우스로부터의 마우스 CXCL13이 풍부한 장기 추출물을 천연 마우스 CXCL13의 소스로서 사용하였다. 마우스 CXCL13 (TNF-Tg 장기 추출물의 1:40 희석 또는 0.5 nM rmuCXCL13)를 33 nM MAb 470로 포착하고, 3.3 nM 바이오틴-3D2로 검출하였다. 추출물로부터 수득한 케모카인 (및 대조군으로 사용된 재조합 마우스 CXCL13)을 MAb 470에 의해 ELISA 플레이트에서 포착하였다. 그 후, 플레이트를 비표지 3D2가 다양한 양으로 존재하는 조건 하에 바이오틴화된 3D2와 인큐베이션하였다. 바이오틴화된 3D2의 결합을 감소시키는 마우스 CXCL13과의 결합에 대한 경쟁성을 스트렙타비딘-HRP로 검출하였다. 도 3B에서 알 수 있는 바와 같이, 3D2는 자신의 바이오틴화된 버전과 경쟁하지 않으며, 천연 마우스 CXCL13 및 재조합 마우스 CXCL13 둘다에 동일한 수준으로 결합할 수 있었다.
도 3A 및 3B에서, 각 데이타 포인트는 3회 이상의 독립적인 실험들 중 한가지 실험에서 수득한 2회 측정치의 평균이다. 곡선은 4-매개변수 시그모이드 곡선 피트 (R2 = 0.99)를 이용하여 피팅하였다. EC50 수치 차이를 unpaired t-테스트로 분석하였고, 유의하지 않았다 (P>0.05). 이 결과는, 마우스 항-인간 3D2 항체가 제조한 재조합 케모카인 뿐만 아니라 천연 인간 및 마우스 케모카인에도 결합함을 보여준다.
실시예 2
인간 B 세포 이동에 대한 항-CXCL13 항체의 저해
CXCL13 기능, 예컨대 B 세포 이동 저해를 인간 시스템과 마우스 시스템에서의 B 세포 이동을 시뮬레이션하는 확립된 모델을 이용하여 평가하였다. 비-CXCL13 케모카인, SDF-1α (a.k.a. CXCL12) 쪽으로의 이동을 B 세포 이동 저해에 대한 항-CXCL13 항체 특이성을 검증하기 위한 대조군으로서 사용하였다. 이에, 항-CXCL13 항체를 인간 CXCL13-유도성 이동의 저해와 SDF-1α 유도성 이동 부재에 대해 테스트하였다.
인간 CXCL13 쪽으로의 인간 B 세포 이동의 저해. 인간 CXCL13-유도성 B 세포 이동에 대한 3D2, 3C9 및 MAb 801의 효과를 테스트하였다.
2종의 클론 세포주, 즉 인간 pre-B-697-hCXCR5와 인간 pre-B-697-hCXCR4에서 각각 재조합 인간 CXCL13-의존적인 이동 및 재조합 인간 SDF-1α 의존적인 이동에 대한 항-CXCL13 항체의 효과들을 분석하였다. 트랜스웰 조직 배양물을 처리한, 포어 크기 8 ㎛에 직경 6.5 mm인 플레이트 (Corning Costar: 3422)를 사용하였다. rhCXCL13-유도성 이동에 대해서는 인간 pre-B-697-hCXCR5 세포를 사용하였고, rhSDF-1-유도성 이동 (음성 대조군)에 대해서는 인간 pre-B-697-hCXCR4 세포를 사용하였다. 세포를 케모탁시스 완충액 ((RPMI 1640 + l-글루타민, 10 mM HEPES, PennStrep 및 0.5 % BSA), 미리 RT로 가열)에 5 x 106/ml로 현탁하고, 30분간 37℃로 다시 이동시켰다. 희석한 케모카인 (케모탁시스 완충액 중의, 97 nm (1 ㎍/ml) rhCXCL13 또는 12.5 nM (0.1 ㎍/ml) rhSDF-1α) +/- 항체를 하부 챔버에 590 ㎕/웰로 넣고, 30분간 RT에서 예비-인큐베이션하였다. 세포를 100 ㎕ (5 x 105) 세포/상부 챔버로 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후, 인서트를 빼고, 웰 당 60 ㎕로 Alamar blue를 첨가한 다음, 플레이트를 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 형광을 530 nm 및 590 nm 파장에서 측정하였다.
이동 지수(Migration index)를 다음과 같은 각 조건에서 계산하였다: ((이동 지수 [이소형 대조군] - 이동 지수 [항체])*100)/(이동 지수 [이소형 대조군]). 이동 저해율 %을 Graphpad Prism 5를 이용하여 log[항체 nM]에 대해 그래프를 작성하여, 적정 곡선(titration curve)을 수득하였다. 인간 CXCL13-유도성 이동 결과를 도 4A에 나타낸다. 이 결과는 2가지 hCXCL13-유도성 이동과 3가지 hSDF-1-유도성 이동에 대한 독립적인 실험의 평균 +/- SEM으로 제시한다.
3D2, 3C9 및 MAb 801 간에, 인간 CXCL13-유도성 이동에 대한 저해 정도의 차이는 인간 CXCL13에 대한 친화성 차이에 해당된다 (상기 표 2 참조). 따라서, 케모카인에 대한 최저 친화성의 항체 (3D2)는 인간 pre-B-hCXCR5의 최저 저해제인 것으로 보인 반면, 친화성이 더 높은, 거의 동일한 친화성을 가진 항체 (MAb 801 및 3C9)는 세포 이동 저해율 %가 높았다 (도 4A). 항-인간 CXCL13 항체 (3D2, 3C9 또는 MAb 801)들은 인간 pre-B-hCXCR4 (5) 세포의 인간 SDF-1α 매개 케모탁시스에 대해 어떠한 효과도 나타내지 않았다 (도 4B). 반면, 양성 대조군인 염소 항-인간 SDF-1α 항체 (MAb 87A)는 SDF-1α 의존적인 이동을 강하게 저해하였다.
마우스 비장 세포에서의 마우스 CXCL13-의존적인 이동의 저해. 항-CXCL13 항체를 (기계적으로 취한 비장으로부터 수득한) 마우스 비장세포의 재조합 마우스 CXCL13-매개 케모탁시스에 대한 저해력을 테스트하였다. 본 분석은, 485 nM (5 ㎍/ml) rmuCXCL13, 포어 크기가 더 작은 트랜스웰 플레이트 (즉, 트랜스웰 조직 배양물로 처리된 포어 크기 5 ㎛에 직경이 6.5 mm인 플레이트 (Corning Costar: #3421)) 및 웰 당 더 많은 수 (106)의 세포의 이용을 비롯하여, 최소한으로 변형시켜, 인간 CXCL13-의존적인 B 세포 이동 분석에 대해 전술한 바와 같이 기본적으로 동일한 프로토콜로 수행하였다. 2개의 상이한 마우스 균주, 즉 C57/BL6 및 SJL 유래 비장세포의 이동에 대한 시험 항체들의 효과를 도 5A와 5B에 각각 나타낸다. MAb 470을 양성 대조군으로 사용하였다. 랫 및 마우스 IgG 뿐만 아니라 인간 CXCL13-특이적인 마우스 항체 3C9를 음성 대조군으로서 포함시켰다. 도 5A 및 5B에 나타낸 바와 같이, MAb 470과 3D2는 저해 패턴이 상이하였다. 특히, 3D2는 적정가능한 방식으로 케모탁시스를 저해한 반면, MAb 470의 효과는 항체 최고 농도 396 nM에서만 확인되었다. C57Black/6 및 SJL/J 이동에 대한 3D2의 효과를 비교한 데이타를 unpaired t-테스트로 분석하였고, P 값 >0.05를 구하였으며, 이는 2개의 곡선 간에 유의한 차이가 없는 것으로 확인되었다. 곡선은 4-매개변호 시그모이드 곡선 피트 (R2 = 0.99)로 피팅하였다. SJL/J 및 C57Black/6 비장 세포 이동에 대한 3D2 효과를 비교하여 도 5C에 나타낸다. 2 종의 마우스 균주 간에는 3D2 저해 프로파일의 유의한 차이가 없는 것으로 확인되었다.
실시예 3
인간 CXCR5의 CXCL13-매개 엔도사이토시스에 대한 항-CXCL13 항체의 저해
항-CXCL13 항체를 이용한 CXCL13 케모카인의 기능, 예컨대 CXCR5 수용체의 CXCL13-매개 엔도사이토시스의 저해를, 잘 확립된 인간 CXCR5 수용체의 인간 CXCL13-매개의 엔도사이토시스 모델을 이용하여 평가하였다 (Burke et al., Blood 110:2216-3325 (2007)).
인간 CXCR5 수용체의 CXC13-매개 엔도사이토시스의 저해. 케모타인이 이의 케모타인 수용체에 결합하면, 리간드-수용체 복합체가 내재화되고, 후속적으로 세포내 시그널링 케스케이드가 활성화된다 (Neel et al., Chemokine and Growth Factor Reviews 16:637-658 (2005)). Burkle 등에 개시된 흐름을 기반으로 한 방법을 적용하여, CXCL13-매개 CXCR5 수용체의 인간 및 마우스 세포내로의 내재화를 저해하는 3D2의 능력을 확인하였다. 인간 CXCL13-매개 엔도사이토시스를 위해, hCXCL13을 3D2, MAb 470 또는 마우스 IgG (농도 0, 33, 66, 132, 264 및 528 nM)와 혼합하여, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 세포를 희석제 (RPMI + 0.5% BSA)에 107 세포/ml로 현탁하였다. 세포를 10 ㎍/ml 항-인간 Fc로 15분간 37℃에서 사전-블롯킹하였다. 그 후, 세포를 CXCL13/항체 믹스 (50 ㎕ 세포 : 50 ㎕ 믹스)와 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 항-인간 CXCR5 항체 (BDPharmingen: #558113)로 30분간 4℃에서 염색한 후, 유세포 측정으로 분석하였다. 마찬가지로, 마우스 CXCL13-매개 엔도사이토시스를 mCXCL13를 3D2 또는 마우스 IgG (농도 0, 20, 59, 198, 및 528 nM)와 조합 사용하여 분석하였다. 엔도사이토시스 저해는 다음과 같이 계산하였다: 저해율 % = 100 - [100*(0 CXCL13 - geomean)/(0 CXCL13 - 0 mAB)].
도 6은 인간 및 마우스 CXCL13 실험의 결과 데이타를 보여준다. 도 6A는 인간 CXCL13 485 nM (5 ㎍/ml)을 처리한 인간 pre-B-697-hCXCR5 세포의 표면 상에서의 인간 CXCR5 수용체 발현에 대한 3D2 항체 효과를 보여준다. 도 6B는 마우스 CXCL13 1000 nM (10 ㎍/ml)과 예비-인큐베이션한 Wehi-231 세포에서의 마우스 CXCR5 수용체 내재화에 대한 3D2-매개 저해를 나타낸 것이다. 2가지 경우에, 3D2는 효과적으로 적정가능한 방식으로 CXCR5 수용체의 CXCL13-유도성 하향 조절을 방해하였다. 도 6C는 시드모이드형 용량 반응 곡선으로부터 계산한 (그래프 상에 표시됨) EC50 값을 나타낸 것으로, R2 값은 1 (마우스 엔도사이토시스) 및 0.994 (인간 엔도사이토시스)이다. 인간 및 마우스 수용체 엔도사이토시스에 대한 3D2 효과를 비교한 데이타를 unpaired t-테스트로 분석하였고, p 값 > 0.05를 구하였으며, 이는 인간 CXCL13 곡선과 마우스 CXCL13 곡선 간에 유의한 차이가 없다는 의미이다.
실시예 4
마우스 다발성 경화증 질병 모델에서의 항-CXCL13 항체 평가
다발성 경화증의 뮤라인 모델. 실험적 자가면역성 뇌척수염 (EAE: Experimental Autoimmune Encephalomyelitis)은 널리 용인되고 있는 다발 경화증 동물 모델이다. EAE는 염증이 먼저 척수를 타겟팅하여 상향식으로 마비가 점차적으로 확대되는 CNS의 탈수초 질환이다. 이 질환은 유도 방식 및 사용 동물의 타입에 따라 급성, 만성 또는 재발-완화성 경로로 추정할 수 있다. 즉, EAE는 CNS의 구성성분, 펩타이드를 이용하여 유발하거나 (활성 유도), 또한 세포 이동을 통해 한 동물에서 다른 동물로 유발할 수 있다 (수동적 유도). CFA (Complete Freund's Adjuvant)는 추출물 또는 펩타이드와 함께 사용되며, 백일해 독소와 함께 종종 사용된다.
RR-EAE-1: SJL 마우스에서의 재발-완화형 EAE에 대한 3D2의 효과. 3D2 항체를 EAE의 활성 면역 모델을 이용하여 테스트하였다. "RR-EAE-1" 실험에서, 열에 의해 불활성화한 미코박테리움 튜베룰로시스 균주 H37RA 5 mg으로 강화한 1 mg/ml CFA 중의 프로테오지질 단백질 (PLP)139-151 펩타이드 에피토프(HSLGKWLGHPDKF; 서열번호 1)로 피하 면역화하여, 재발-완화형 (RR) 질환을 SJL/J 마우스에 유도하였다. 본 실험에는 아래 치료군을 포함시켰다:
A. 대조군 (마우스 IgG) 0일에 개시
B. 3D2 0일에 개시
C. 3D2 점수 ≥1에서 개시
마우스에 주당 2회 항체 0.3 mg (15 mg/kg)을 복막내 주입하였다. A 군과 B 군의 경우 0일에 치료를 개시하였고, C 군은 임상 점수 ≥1에서 개시하였다 (점수 평가 시스템은 아래 표 3에 설명됨).
표 3. EAE 임상 신호 평가 요약
점수 신호 설명
0 정상 행동 신경학적 증상 없음
1 꼬리 말단 쳐짐 꼬리 원위부가 쳐지고, 늘어짐
1.5 꼬리 전체 쳐짐 꼬리 전체가 쳐치고, 늘어짐
2 정위반사 동물을 등을 위로하고 눕혔을때, 발로 롤링하기 어려움
3 운동실조증 걸음이 흔들림 - 마우스가 걸을 때 뒷다리가 불안정함
4 초기 마비 마우스가 뒷다리로 서 있기 어렵지만, 운동성은 남아있음
5 완전 마비 마우스가 자신의 다리로 전혀 움직이지 못함, 마루고 쇠약해 보임
6 죽어감/사망
도 7에 나타낸 바와 같이, 3D2 처리로 질환이 완화되는 결과가 나타났다. 각 데이타 포인트는 마우스 9마리에서 구한 평균값이다. 그룹 평균 (GMS)은 일원식 ANOVA를 이용하여 비교한 다음, 본페로니의 사후 다중 비교를 수행하였다. 통계적으로 유의한 차이가 대조군 (마우스 IgG)과 각 3D2 처리군 간에 관찰되었지만 (P<0.05), 3D2 처리군 2군 간에는 그렇지 않았다 (P>0.05). 마우스에서 활성 질환이 확인될 때까지 치료를 시작하지 않았을 때에도 질환의 약화가 관찰되었다 (그룹 C).
RR-EAE-2: SJL 마우스에서의 재발-완화형 EAE에 대한 3D2 효과. 이차 실험 ("RR-EAE-2")을 유도 프로토콜로 백일해 독소를 이용하여 행하여, 보다 중증인 실험 모델에서 3D2를 테스트하였다. 이러한 2차 재발-완화형 EAE 실험을 위해, SJL/J 마우스를 열에 의해 불활성화된 미코박테리움 투베르쿨로시스 균주 H37RA 5 mg으로 강화한 1 mg/ml CFA 중의 PLP139-151로 피하 면역화하였고, 백일해 독소 100 ng을 면역화 0일과 면역화 후 2일째에 복막내 투여하였다. 치료에는 하기 군으로 분류된 0.3 mg (15 mg/kg) 항체의 격주 복막내 주사를 포함시켰다:
A. 대조군 (마우스 IgG) 0일에 개시
B. 3D2 0일에 개시
C. 3D2 7일에 개시
D. 3D2 EAE 발병시 개시 (점수 ≥ 2)
RR-EAE-2에 대한 결과를 도 8에 나타낸다. 각 데이타 포인트는 일원식 ANOVA를 이용하여 비교한 다음, 본페로니의 사후 다중 비교를 수행하였다. 통계적으로 유의한 차이가 대조군 (마우스 IgG)과 각 3D2 처리군 간에 관찰되었지만 (P<0.05), 3D2 처리군 3군 간에는 그렇지 않았다 (P>0.05). 다시 말해, 3D2 처리군은 EAE 증상 발병이 개시시 치료를 시작하였을 때에도, 점수 ≥ 2 (그룹 D), 질환 중증도에 대해 통계적으로 유의한 효과를 나타내었다 .
실시예 5
마우스 루푸스 질환 모델에서의 항-CXCL13 항체 평가
전신 루푸스 홍반증 뮤라인 모델 (SLE). SLE는 복수의 장기들에서 나타나는 자가면역 질환으로서, 자발적인 이소성 배 중심 형성과 다수의 핵 항원에 대한 자기항체 생산이 특징적이다. 항-CXCL13 3D2 항체를 뮤라인 루푸스 모델에서 테스트하였다. 루푸스-소인의 New Zealand Black X New Zealand White F1 (NZB/NZWF1) 마우스에서는 자발적으로 고역가의 항-dsDNA 항체와 신장 사구체내 면역 복합체의 형성에 의해 야기되는 중증 증식성 사구체신염이 발생한다.
SLE-1: 진행형 질환의 치료. "SLE-1" 실험에서는, 단백뇨 ≥2 (단백뇨 점수 평가 체계는 아래 표 4에 기술됨)의 24 - 30주령의 NZB/NZWF1 마우스 로 개시하였고, 치료는 8주 동안 지속하였다. 치료에는 0.3 mg (15 mg/kg) of 3D2 또는 마우스 IgG (대조군)의 격주 복막내 주사를 포함시켰다.
표 4. 단백뇨 수치
단백뇨 수치 뇨내 [단백질], mg/dl
1+ 30
2+ 100
3+ 300
도 9A에 도시된 바와 같이, 3D2 치료는 단백뇨 진행을 정지시켰다. 잘 확립된 점수 평가 시스템을 이용한 신장 조직 분석 (표 5)에서도, 사구체신염 (GN), 간질성 신염 (IN) 및 혈관염 (VI) 병리 점수가 대조군 (마우스 IgG)에 비해 3D2-처리군에서 더 낮아, 항-CXCL13 치료의 유익한 효과가 입증되었다. 도 9B를 참조한다.
표 5. 신장 병리 점수
점수 사구체신염 간질성 신염 혈관
0-1+ 국소, 경도의 또는 초기 증식성 간헐적인, 국소 또는 소형 MNC 포켓 (세포 10-15개) 간헐적인 혈관주위 침윤
1-2+ 보통 또는 한정된 증식성; 매트릭스 증가 국소 침윤 (세포 15-30개) 몇 군데 혈관주위 국소 침윤; 괴사 없음
2-3+ 미만성 및 국소 또는 미만성 증식 다중 국소적인 광범위한 침윤; 괴사 수반 다중 국소성 혈관주위; 보다 광범위적임; +/- 괴사 (3+)
3-4+ 중증 미만성 증식, 초승달형/경화증 광범위한 괴사를 동반한 중증 질환 다중 국소 또는 미만성; 광범위한 괴사 부위
단백뇨 점수 (도 9A)와 신장 병리 점수 (도 9B)의 경우, 각 데이타 포인트는 10번의 측정치의 평균이다. 이원식 ANOVA 및 후속적인 본페로닌의 다중 사후 비교에서 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었고 (P>0.05), 통계적 유의한 차이가 결정되었다 (P<0.05).
SLE-2: 초기 질환 (자기항체 유도 후 및 현저한 단백뇨 발생 전)에 걸린 마우스에서의 예방 실험. "SLE-2" 실험에서, 치료는 20주령의 NZB/NZWF1 마우스에서 개시하였고, 12주간 지속하였다. 치료에는 3D2 또는 마우스 IgG (대조군) 0.3 mg (15 mg/kg)을 격주 복막내 주사를 포함시켰다. 도 10A에 나타낸 바와 같이, 3D2 처리시 특히 처리 첫 8주간 단백뇨 진행에 대한 통계적으로 유의한 저해가 나타났다. 8주 후, 3D2 처리군의 경우 마우스 7마리 중 0마리 (0%)와 대조군의 경우 9마리 중 4마리 (44%)는 단백뇨 점수가 >2+이었다. 12주간의 처리 종료 시, 3D2 처리군의 평균 뇨 단백질은 2.1+/-0.2이었으며, 마우스 IgG (대조군) 항체의 경우에는 3.1+/-0.15이었다.
또한, 신장 병리학적 점수를 3D2 처리군과 마우스 IgG 처리군의 마우스들에서 측정하였다. 사구체신염 (GN) 및 간질성 신염 (IN)의 병리학적 점수를 도 10B에 나타낸다.
단백뇨 수준 (도 10A)과 신장 병리학적 점수 (도 10B)를 3D2 처리군의 마우스 7마리와 마우스 IgG 처리군의 마우스 9마리에서 측정하였다. 단백뇨 점수는 그룹들 간에 유의하게 차이가 있었다 (P=0.0042; 이원식 ANOVA 및 본페로니의 다중 비교 검사). 신장 병리학적 점수에는 유의한 차이가 없었다 (P>0.05). 평균 병리 점수에는 유의한 차이가 없었지만, 3D2 처리군 마우스 7마리 중 2마리 (29%)에서 중증 신장 질환의 조직 증거가 확인되었고, 대조군 마우스 9마리 중 4마리 (44%)에서는 중증 질환의 증거가 확인되었다. 3D2에 의한 CXCL13 차단이 자기항체의 발생을 방지하지 못한다는 것에 주목하게 되었다 (데이타 미기재).
루푸스 마우스의 비장내 배 중심 (GC) 및 일차 여포의 갯수에 대한 3D2 처리 효과를 평가하였다. 비장 절편을 GL-7 (GC 염료), B220 항체 (B 세포 마커) 또는 3D2-처리 및 마우스 IgG-처리 (대조군) NZB/NZWF1 마우스 유래 여포 수지상 세포(FDC)에 대한 항체로 염색하였다. 비장 림프성 구조에 대한 CXCL13 저해 효과를 도 11A-B에 나타낸다. 일차 여포는 손상없이 유지되었다. 3D2 처리 마우스에서는 비장내 자발적인 배 중심 (GC)의 크기 와 수에 현저한 감소가 확인되었다. 3D2 처리 마우스 ("tx")에서는, 일차 : 이차 (GC) 여포의 비율로서 표시한 경우, GC의 수가 감소되는 추세가 나타났으며 (p=0.19) (도 12A), GC 크기의 유의한 감소가 나타났다 (p=0.03) (도 12B). 수치는 그룹 당 마우스 5마리에 대한 평균 +/- SEM으로 표시한다.
전술한 SLE 결과는, 3D2 항체에 의한 CXCL13의 저해가 루푸스 NZB/NZWF1 마우스 모델에서 특히 질환 초기 단계에서 신염을 감소시키고, 비장 구조에 영향을 미칠 수 있는 것으로 보여진다.
실시예 6
키메라 및 인간화 항-CXCL13 단일클론 항체의 제조
3D2 하이브리도마 V 유전자 분리 및 키메라 3D2 항체 클로닝. 마우스 3D2 항체를 키메라 항-CXCL13 단일클론 항체를 제조하기 위한 원형체로서 사용하였다. 가변 (V) 유전자를 표준 방법을 이용하여 3D2 하이브리도마로부터 분리하였다. 3D2의 중쇄 (H1609) 및 경쇄 (L0293)의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 13에 나타낸다. VH 및 VK 상보성 결정부 (CDR)는 밑줄 표시한다 (각각 서열번호 4, 5, 6, 9, 10 및 11).
가변성 중쇄 (VH) 유전자를 인간 감마 1 중쇄 유전자가 함유된 포유류 발현 벡터에 클로닝하여, 전장 키메라 중쇄를 구축하였다. 가변성 경쇄 (VK) 유전자를 인간 카파 불변 유전자가 포함된 포유류 발현 벡터에 클로닝하여, 전장 키메라 경쇄를 구축하였다. 키메라 항체를 제조하기 위해, 키메라 중쇄 및 키메라 경쇄가 포함된 발현 벡터를 CHO-S 세포에 공동-형질감염시켰다. 생산되는 단일클론 항체 (MAb)를 세포에서 분비시켜, 3 - 6일 발현 기간 경과 후 회수하였다. 수득되는 MAb를 단백질 A 크로마토그래피로 정제하고, 특정화하였다. 제조되는 키메라 IgG1 항체 ("MAb 1476")는 ELISA에 의해 인간 및 마우스 CXCL13에 특이적인 것으로 확인되었고, 마우스 및 인간 CXCL13에 대해 유사한 친화성을 가지는 것으로 입증되었으며, 마우스 모 항체, 3D2와 비슷한 기능적 활성을 가지는 것으로 입증되었다 (데이타 미기재). 아울러, MAb 1476은 에피토프 경쟁 ELISA에서 마우스 및 인간 CXCL13과의 결합에 대해 바이오틴화된 3D2 및 3C0와 경쟁할 수 있었다 (데이타 미기재).
키메라 3D2의 인간화 (MAb 1476). 키메라 3D2 항체의 인간화는 하기에 요약 기술한다. 키메라 MAb 1476 유래 중쇄 (H1609) 및 경쇄 (L0293)의 프래임워크 영역 (FWR)에 도입한 변형을 각각 도 14A 및 14B에 도시한다. H1609에서 추정의 N-연결된 당화부 (Asn-Leu-Thr)를 Ser-Leu-Thr로 치환하였다 (도 14A). 돌연변이는 항체 친화성 (표 6)에 영향을 미치지 않았으며, "MAb 5080"가 제조되었다. MAb 5080의 친화성과 기능성을 개선시키기 위해, 다수의 가변부 돌연변이를 제작하여, 인간 CXCL13에 대한 IC50 ELISA로 스크리닝하였다. L5055-CDR1의 31번 위치에서 세린 (S) -> 메티오닌 (M)으로의 단일 돌연변이와, 경쇄 프래임워크 영역에 대한 변형 (도 14B 및 15)으로, "MAb 5261"을 제조하였으며, 3D2 및 MAb 5080에 비해 현저한 친화성 개선을 확인하였다 (표 6). H1609 (서열번호 3) 및 H2177 (서열번호 13)의 아미노산 서열 비교를 도 14A에 나타내고, L0293 (서열번호 8), L5055 (서열번호 17) 및 L5140 (서열번호 15)의 비교를 도 14B에 나타낸다.
표 6. 재조합 인간 및 마우스 CXCL13에 대한 항체 친화성
항체 Fc 중쇄 (VH) 경쇄 (VK) 친화성 (Biacore), nM
인간 CXCL13 마우스 CXCL13
3D2 마우스 IgG1 H1609 L0293 13 159
MAb 1476
(키메라 3D2)		 인간 IgG1 H1609 L0293 11.4 NA
MAb 5080 인간 IgG1 H2177 L5055 14.5 59.2
MAb 5261
(친화성 개선된 MAb 5080)		 인간 IgG1 H2177 L5140
(L5055 M31a)		 5.1 8.1
MAb 5080 VH 및 VK: H2177 (서열번호 13) 및L5055 (서열번호 17), 각각; MAb 5261 VH 및 VK: H2177 (서열번호 12) 및 L5140 (서열번호 15) 각각의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 15에 나타낸다.
CXCL13에 대한 MAb 5261 특이성: 3D2와 마찬가지로, 재조합 케모카인 (재조합 마우스, 인간 및 시노몰구스 원숭이 CXCL13, 인간 IL-8/CXCL8; 인간 IP-10/CXCL10, 인간 MIG/CXCL9 및 인간 SDF-1alpha/CXCL12); 천연 인간 및 마우스 CXCL13; 및 다양한 비특이 항원 (재조합 인간 C35, 스트렙타비딘, 소 혈청 알부민 (BSA), 인간 혈청 알부민 (HAS), 인슐린 및 헤모글로빈)이 포함된 패널에 대한 특이성 ELISA 및 포획 에피토프 경쟁 ELISA에 의해, MAb 5261의 특이성을 평가하엿다.
특이 ELISA를 위해, 재조합 인간, 시노몰구스 원숭이 및 마우스 CXCL13을 100 nM로 각각 코팅하였다. MAb 5261에서는 CXCL13에 대한 다중-종 특이성이 확인되었다 (도 16A-C). 재조합 인간 (도 16A) 및 시노몰구스 원숭이 CXCL13 (도 16B)에 대한 MAb 5261의 결합성은 이의 직접 "모", MAb 5080의 결합성과 비슷한 수준이었고, MAb 1476 (키메라 3D2)의 결합성 보다 강하였다. MAb 5261은 MAb 1476 및 MAb 5080에 비해 재조합 마우스 CXCL13에 대한 결합성이 현저하게 우수하였다 (도 16C). 각 케모카인에 대한 데이타 포인트는 3회 측정치의 평균이다. EC50 값은 4-매개변수 시그모이드형 곡선 피트로부터 계산하였다 (EC50 값을 구하는 곡선의 R2는 0.99임).
천연 인간 및 마우스 CXCL13에 대한 MAb 5261 결합성을 포착 에피토프 경쟁 ELISA로 측정하였다. 인간 ELISA에서는, 인간 CXCL13 (THP1 상층액 1:4 희석 또는 0.097 nM)는 6.6 nM MAb 801로 포착되었고, 0.66 nM 바이오틴-3C9로 검출되었다. 마우스 ELISA의 경우, 마우스 CXCL13 (TNF-Tg 장기 추출물의 1:40 희석)는 33 nM MAb 470으로 포착되었고, 3.3 nM 바이오틴-3D2로 검출되었다. 각 데이타 포인트는 3회 이상의 독립적인 실험들 중 한 실험의 2번 측정치의 평균이다. 천연 인간 (도 17A) 및 CXCL13 (도 17B)에 대한 포착 에피토프 경쟁 ELISA로 테스트하였을 때, MAb 5261이 인간 및 마우스 천연 CXCL13과의 결합에 있어 3D2 및 5080 항체들 보다 우수한 것으로 확인되었다. 도 17A-B에 나타낸 그래프는 4-매개변수 시그모이드형 곡선 피트를 이용하여 피팅하였다 (R2 = 0.99).
실시예 7
항-CXCL13 MAb 5261의 기능 특정화
인간 및 마우스 B 세포 이동의 저해. 인간 CXCL13-유도성 인간 B 세포 케모탁시스에 대한 MAb 5261 저해력을 안정적인 세포주 인간 pre-B-697-hCXCR5와 일차 인간 편도선 세포 둘다에서 테스트하였다.
안정적인 세포주 인간 pre-B-697-hCXCR5에 대한 인간 CXCL13-유도성 인간 B 세포 케모탁시스의 MAb 5261 저해를 상기 실시예 2에 기술된 프로토콜을 이용하여 테스트하였다. MAb 5261에 의한 인간 pre-B-697-hCXCR5 세포의 이동 저해를 도 18A에 나타낸다. 인간 일차 편도선 세포 실험에서, 조직을 기계적으로 해리하여, 편도선 세포를 수득하였다. 세포 (106/5-㎛ 트랜스웰 플레이트의 상부 챔버)를 37℃에서 2시간 동안 5 ㎍/ml 인간 CXCL13 쪽으로 이동하게 하였다. MAb 5261에 의한 인간 일차 편도선 세포 이동의 저해는 도 18B에 나타낸다. 도 18A-B의 결과는 3가지 이상의 실험들 중 한가지 실험의 3회 측정치 평균 +/- SEM이다. 곡선은 4-파라미터 시그모이드형 곡선 피트를 이용하여 피팅하였다 (R2 = 0.98-0.99).
마우스 CXCL13-매개 마우스 B 세포 케모탁시스에 대한 MAb 5261의 효과를 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 C57Black/6 및 SJL/J 마우스 유래 마우스 비장세포에서 평가하였다. 인간 또는 뮤라인 SDF-1α (0.1 ㎍/ml) 쪽으로의 이동을 항체 작용의 CXCL13 특이성을 확인하기 위한 음성 대조군으로 사용하였다 (데이타 미기재). MAb 5261에 의한 비장세포 이동 저해는 도 19에 나타낸다 (각 실험의 데이타는 2회 측정치의 평균 +/- SD로 나타냄). 이동 저해 값은 대응되는 이소형 대조군으로 수득한 값을 토대로 계산하였다.
도 18 및 19에 나타낸 바와 같이, MAb 5261은 인간 및 마우스 CXCL13-의존적인 케모탁시스를 둘다 저해하였다. 배양 세포와 일차 세포 간의 EC50 차이 (도 18)는 인간 CXCL13 농도 차이가 원인일 수 있으며, 예컨대, 인간 pre-B-697-hCXCR5 세포 이동에 97 nM (1 ㎍/ml)을 사용하고, 인간 편도선 세포 이동에는 485 nM (5 ㎍/ml)을 사용하였다.
인간 CXCR5 수용체의 인간 CXCL13-매개 엔도사이토시스 저해. 본 실험은 상기 실시예 3에 기술된 방법에 따라 인간 CXCL13으로 처리된 인간 pre-B-697-hCXCR5 세포를 이용하여 수행하여, 인간 CXCR5 수용체의 엔도사이토시스를 유도하였다. 인간 CXCL13의 양은 2 μM이며, 이는 실시예 3에 나타낸 3D2 엔도사이토시스 분석에서 사용한 양(즉, 0.485 μM) 보다 많았으며, 따라서, EC50 값에 차이가 관찰되었다. MAb 5261에 의한 CXCR5 수용체 엔도사이토시스의 저해는 도 20에 나타낸다. 결과는 3회 이상의 독립적인 실험들 중 한가지 실험의 3회 측정치의 평균으로 나타낸다. 곡선을 4-매개변수 시그모이드형 곡선 피트를 이용하여 피팅하였다 (R2 = 0.99).
실시예 8
항-CXCL13 MAb 5261의 뮤라인 버전의 제조 및 특정화
MAb 5261은 인간 중쇄 및 경쇄 가변부와 인간 IgGamma1-F 알로타입 뿐만 아니라 인간 카파를 포함한다. 뮤라인 카운터파트 ("MAb 5378")를 마우스 IgG2a (Gamma 2a 체인)로 조작하였다. IgG2a 이소형은 보체에 고정하여 Fc 수용체에 결합하는 능력 등을 비롯하여 인간 IgG1에 매우 유사성을 가진다. MAb 5378은 MAb 5261과 동일한 인간 중쇄 및 경쇄 가변 유전자를, 마우스 IgG2a 불변 및 마우스 카파 각각과 함께 포함한다.
중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드들에서 공통 제한 효소 부위를 이용하여 이소형을 바꿀 수 있다. 이소형 종들의 제조는 제한효소 절단, 라이게이션 및 형질전환을 통해 달성하였다. 구체적으로, MAb 5261 중쇄의 경우, 유전자의 가변부를 제한효소 엔도뉴클레아제로 절단하고, MAb 5378 (H5188)에 대한 중쇄를 제조하기 위해, 마우스 IgG2a 불변부를 함유한 발현 플라스미드의 상응하는 부위에 라이게이션하였다. 마찬가지로, MAb 5261 경쇄의 경우, 유전자의 가변부를 제한효소 엔도뉴클레아제로 절단하고, MAb 5378 (L5153)에 대한 경쇄를 제조하기 위해, 마우스 IgKappa 불변부가 포함된 발현 플라스미드의 상응하는 부위에 라이게이션하였다. MAb 5378 경쇄 및 중쇄의 가변부의 폴리펩타이드 및 아미노산 서열은 MAb 5261과 동일하며, 이를 도 21에 나타낸다. VH 및 VK 상보성 결정부 (CDR)를 밑줄 표시한다 (각각 서열번호 4, 5, 6, 16, 10 및 11).
MAb 5378 친화성 측정. 재조합 인간 및 마우스 CXCL13에 대한 MAb 5378의 친화성 측정은 실시예 1에 기술된 방법과 유사한 방법을 이용하여 BIACORE®로 측정하였다. 재조합 인간 및 마우스 CXCL13에 대한 Mab 5378의 친화성을 MAb 5261 및 3D2와 비교하였다. 표 7에 나타낸 바와 같이, 인간 및 마우스 케모타인에 대한 MAb 5261 및 MAb 5378의 친화성 측정값 (nM)은 3D2에 비해 현저하게 향상되었다.
표 7. 재조합 인간 및 마우스 CXCL13에 대한 5261, 5378 및 3D2의 친화성
항체 Fc 친화성, nM
인간 CXCL13 마우스 CXCL13
5261 인간 IgG1 5.1 8.1
5378 마우스 IgG2a 4.5 4.2
3D2 마우스 IgG1 13 159
MAb 5378 에피토프 맵핑. 에피토프 경쟁 ELISA 실험을 수행하여, MAb 5378이 마우스 CXCL13의 결합 에피토프를 MAb 5261과 공유하는지를 확인하였다. 재조합 마우스 CXCL13를 MAb 470, 5378 또는 5261 (대조군) 1 ㎍/ml로 사용하여 플레이트 상에 포착하였다. 항체/케모카인 상호작용을 바이오틴화된 MAb 5261 0.5 ㎍/ml (3.3 nM)과 이후 스트렙타비딘-HRP를 이용하여 검출하였다. 시판 랫 항-마우스 항체 MAb 470도 본 실험에 포함시켰다. MAb 470 또는 5378와 예비-인큐베이션한 마우스 CXCL13이 바이오틴화된 MAb 5261에 결합하는 능력을 에피토프 경쟁 ELISA로 평가하였다. MAb 5378은 마우스 CXCL13 결합 에피토프를 MAb 5261과는 공유하지만 MAb 470과 공유하지 않는 것으로 확인되었다 (도 22). 따라서, MAb 5378이 에피토프 결합성 및 친화성을 보유하는 것으로 입증되었으며, 이는 MAb 5378을 제작하는데 동물 모델 실험에서 MAb 5261에 대한 서로게이트로서 이용하여야 한다. 아울러, 실시예들에서 기술된 에피토프 결합 결과는, 3D2, 3C9, MAb 1476, MAb 5080, MAb 5261 및 MAb 5378이 모두 인간 CXCL13의 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 요약될 수 있다.
CXCL13에 대한 MAb 5378의 특이성. MAb 5378의 특이성은 재조합 인간, 마우스 및 시노몰구스 원숭이 CXCL13 (도 23)과 재조합 케모카인 및 다양한 항원 패널 (재조합 케모카인 (마우스, 인간 및 시노몰구스 원숭이 CXCL13, 인간 IL-8/CXCL8, 인간 IP-10/CXCL10, 인간 MIG/CXCL9, 및 인간 SDF-1alpha/CXCL12); 천연 인간 및 마우스 CCL13; 및 다양한 비특이 항원 (재조합 인간 C35, 스트렙타비딘, 소 혈청 알부민 (BSA), 인간 혈청 알부민 (HAS), 인슐린, 헤모글로빈)에서 평가하였다 (데이타 미기재). 실시예 1에 기술된 바와 같이 특이성 ELISA를 수행하였다. 특히, 각 케모카인을 100 nM로 코팅하였다. 도 23에 나타낸 바와 같이, MAb 5378을 마우스 항체 3D2 및 대조군 (마우스 IgG)과 비교하였다. MAb 5378은, 3가지 종들의 케모카인에 대한 결합에 대해 다양한 수준으로 3D2 보다 우수하였다. 결합에서의 가장 현저한 차이는 마우스 CXCL13에서 관찰되었는데, 동물 실험에서 MAb 5378이 3D2 보다 잠재적으로 유익한 것으로 확인되었다. 각 데이타 포인트는 3회 측정치의 평균이다. EC50 값은 4-매개변수 시그모이드형 곡선 피트로부터 계산하였다 (EC50을 수득한 곡선의 R2는 0.99임).
MAb 5378의 인간 및 마우스 B 세포의 이동 저해성을 테스트하였다. 마우스 및 인간 B 세포의 CXCL13-의존적인 케모탁시스를 저해하는 MAb 5378의 저해력을, 실시예 2, 7 및 2에 기술된 각 방법을 이용하여, 배양 세포 (인간 pre-B-697-hCXCR5 세포; 도 24A) 및 일차 (인간 편도선 세포; 도 24B) 인간 세포 뿐만 아니라 마우스 비장세포 (도 24C)를 이용한 이동 분석으로 테스트하였다. 케모카인 농도는 다음과 같다: 인간 pre-B-697-huCXCR5 이동의 경우, huCXCL13 97 nM; 인간 편도선 세포 이동의 경우, huCXCL13 485 nM; 및 마우스 비장세포 이동의 경우, muCXCL13 500 nM. 인간 또는 무라인 SDF-1α 쪽으로의 이동을 음성 대조군으로 사용하였다 (기재 안함). 이동 저해 값은 대응되는 이소형 대조군으로 수득한 값을 토대로 계산하였다. 도 24A-C에 나타낸 결과는 3가지 이상의 실험들 중 한가지 실험에 대한 3회 측정치의 평균 +/- SEM으로 나타낸다. 곡선은 4-파라미터 시그모이드형 곡선 피트를 이용하여 피팅하였다 (R2 = 0.99). 인간 이동 분석에서는, MAb 5378을 MAb 5261과 비교하였고, 마우스 이동 분석에서는 MAb 5378을 3D2와 비교하였다. 양 경우에, MAb 5378은 CXCL13-유도성 인간 및 마우스 세포 이동을 MAb 5261과 비슷한 수준으로, 그리고 3D2 보다는 약간 높은 수준으로 성공적으로 저해하였다.
인간 CXCR5 수용체의 인간 CXCL13-매개 엔도사이토시스의 저해. 실시예 3에 기술된 방법을 이용한 인간 CXCL13-매개 인간 CXCR5 수용체 내재화 분석에서, MAb 5378을 이의 원형체 MAb 5261 및 마우스 항-인간 CXCL13 항체 3D2와 비교하였다. 도 25에 나타낸 바와 같이, MAb 5378은, 인간 CXCR5 수용체 내재화를 저해하는 능력에 대해서, MAb 5261과 동일하였고, 3D2보다 현저하게 우수하였다. MAb 5261 및 MAb 5378에 대한 데이타 포인트는 2가지 독립적인 실험들에서 수득한 측정치들의 평균이다. 3D2 및 이소형 대조군의 데이타 포인트는 단일 실험에서 수득한 3회 측정치의 평균이다. 곡선을 4-매개변수 시그모이드형 곡선 피트를 이용하여 피팅하였다 (R2 = 0.99).
실시예 8
류마티스 관절염에 대한 마우스 질환 모델에서의 항-CXCL13 항체의 평가
류마티스 관절염의 뮤라인 모델. 마우스 및 랫에서 콜라겐-유발성 관절염 (CIA)은 잘 확립된 인간 류마티스 관절염 (RA) 모델이다. 이 질환은 전형적으로 CFA (Complete Freund's Adjuvant) 중에 에멀젼한 소 II형 콜라겐을 진피내 주사함으로써 유발되며, 마우스 콜라겐 항체 생산 및 후속적인 발에서의 점진적인 관절염 발생이 특징적이다.
CIA-1: DBA1/J 마우스를 이용한 CIA 모델에서의 MAb 5378의 항-관절염 효능. 이 질환은 열에 의해 사멸시킨 미코박테리움 투베르쿨로시스 H37Ra 100 mg으로 강화한 CFA 중의 II형 소 콜라겐 100 mg으로 피하 면역화한 다음, 21일에 IFA (Incomplete Freunds' Adjuvant) 중의 II형 소 콜라겐 100 mg을 부스팅 접종함으로써, DBA1/J 마우스에서 유도하였다. 관절염에 대한 거시적인 징후로 동물의 점수를 매주 3회 평가하고 (표 8), 관절염 지수 (AI)를 개별 발 점수를 추가하여 계산하였다 (임의의 해당 동물에서 달성될 수 있는 최대 관절염 지수는 16임).
표 8. 마우스에서 CIA에 대한 거시적인 징후
관절염 점수 설명
0 가시적인 관절염 효과는 없음
1 손가락 1개에 부종 및/또는 홍반
2 손가락 2개에 부종 및/또는 홍반
3 손가락 3개 이상에 부종 및/또는 홍반
4 전체 발과 손가락에 심각한 관절염
부스트 면역화하기 전날, 즉 유도 후 20일째에, 2-6의 AI가 낮은 동물에서 예방적인 처리를 개시하였으며, 아래 치료군으로 구성하였다 (그룹 당 마우스 10마리):
A. 마우스 IgG 이소형 (대조군)
B. MAb 5378
C. 에타너셉트(etenercept) (TNF 저해제; 양성 대조군)
마우스에, 3주간 주당 2번 항체 0.6 mg (30 mg/kg)을 복막내 (마우스 IgG 및 MAb 5378) 또는 피하 (에타너셉트) 주사하였다. 본 실험은 유도 후 41일째에 종결하였다.
도 26에 나타낸 바와 같이, MAb 5378을 이용한 예방적 처리로 질병 발생율이 감소되고 질환 중증도가 현저하게 저해되었으며, 이는 실험 종료시에 명확해졌다. 통계적으로 유의한 차이는 마우스 IgG 및 MAb 5378 처리군 (P<0.05)과 마우스 IgG 및 에타너셉트 처리군 (P<0.05) 간에 실험 종료시 (41일)에 관찰되었다. MAb 5378의 저해 효과는 양성 대조군 제제인 에타너셉트의 저해 효과와 통계적으로 상이하지 않았다 (P>0.05).
CIA-2: DBA1/J 마우스의 CIA 모델에서 MAb 5378의 항-관절염 효과. MAb 5378을 이용한 2차 CIA 실험, "CIA-2"를 수행하였다. 본 실험에서, 전술한 CIA-1에 기술된 바와 같이 DBA1/J 마우스에서 질병을 유도하였다. AI가 2-6으로 낮은 동물에서, 유도 후 20일째에, 부스트 면역화하기 전날 다시 예방적인 치료를 개시하였다. 에타너셉트 외에도, 시판 랫 항-뮤라인 CXCL13 항체 MAb 470을 대조군으로 사용하였다. 즉, 본 실험에는 아래 군이 포함된다:
A. 마우스 IgG 이소형 대조군
B. MAb 5378
C. 에타너셉트 (TNF 저해제; 양성 대조군)
D. MAb 470
마우스에, 3주간 매주 2회씩 항체 0.6 mg (30 mg/kg)을 복막내 (마우스 IgG, MAb 470 및 MAb 5378) 또는 피하 (에타너셉트) 주사하였다. 실험은 유도 후 42일째에 종결하였다.
도 27에 명확하게 나타낸 바와 같이, Mab 5378을 예방적으로 처리하면, 전체 실험 동안과 종결 시점 (42일)에 질병 발생율 감소 및 질환 중증도의 현저한 저해가 재확인되었다. 통계적 유의한 차이는 마우스 IgG와 MAb 5378 처리 (P<0.05) 및 마우스 IgG와 MAb 470 처리군 (P<0.05) 사이에서 관찰되었다. MAb5378의 저해 효과는 에타너셉트 및 랫 항-뮤라인 CXCL13 항체 MAb 470에 대한 양성 대조군의 저해 효과와 통계적으로 상이하지 않았다 (P>0.05).
GC-1: 면역화된 BALB/c 마우스에서 배 중심 생성에 대한 MAb 5378의 효능. 동물 자가면역 모델에서의 항-CXCL13 항체의 성공적인 효능을 감안하여, 이소성 배 중심 생성 파괴에 관여하는 잠재적인 작동 기전을 테스트하였다. 알룸 100 ㎕에 침강시킨 4-하이드록시-3-니트로페닐아세틸-닭-g-글로불린 (NP-CGG) 100 ㎍으로 면역화한 MAb 5378-처리 BALB/C 마우스에서 배 중심에 대해 테스트하였다. 이 동물에, 마우스 이소형 대조군 (매주 0.6-mg 주입) 또는 MAb 5378 (격주 0.3-mg 주입)을 한주에 총 0.6 mg (30 mg/kg)으로 복막내 주사하였다. 주사는 NP-GCC 면역화하기 1주일 전에 시작하여, 면역화한 후 1주 동안 계속 수행하였다. 배 중심 생성은 접종 후 10일째에 평가하였다. 다양한 B 세포 (활성화된 GC B 세포; 여포 및 주변부 B 세포) 및 B 세포 (CD4+ 및 CD8+) 서브세트의 존재에 대해 유세포 측정으로 비장 및 림프절 유래 단일 세포 현탁물을 분석하였다. MAb 5378은 T 세포 또는 여포 및 주변부 B 세포에 대해 효과를 발휘하지 않았지만 (데이타 미기재), 배 중심 B 세포 (B220+/CD38low/PNA+)은 비장과 림프절에서 각각 43% 및 41%로 감소되었다 (도 28). 비장 그룹의 평균을 unpaired 스튜던트 t-테스트를 이용하여 비교하였다. BC-B 세포에서의 감소는, 마우스 IgG 처리군에 비해 MAb 5378 처리 비장에서 통계학적으로 유의하였다 (P<0.05). 림프절에서 회수한 세포들은 수가 매우 적었으며, 따라서 이를 모았다 (그 결과, 림프절에서 수득한 데이타로는 통계 분석을 수행하지 않았음).
실시예 9
헬리코박터 감염에 대한 마우스 모델에서 항-CXCL13 항체의 효능 평가
뮤라인 헬리코박터 감염 모델. 헬리코박터 헤일만니이 및 헬리코박터 필로리 등의 헬리코박터 속 균주는 환자에서 위 MALT 림프종을 유도한다. 헬리코박터 유발성 위 림프성 여포에 대한 마우스 모델은 Nobutani et al., FEMS Immunol Med Microbiol 60:156-164 (2010)에 기술되어 있으며, 이 문헌은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. Nobutani 등의 마우스 모델을 사용하여, 위 림프 여포 감소에 대한 항-CXCL13 항체 효과를 테스트하였다. 헬리코박터 헤일만이이 감염에 대한 치료 스케줄과 본 실시예에서 사용한 항체 투여는 도 29에 나타낸다.
구체적으로, C57BL/6J 마우스에 헬리코박터 헤일만니이를 감염시켰다. 감염 후 1주째에 시작하여, 마우스에 이소형 항체 대조군 또는 항-CXCL13 항체 (MAb 5378)을 12주간 매주 투여하였다. 항-CXCL13 MAb 5378 (마우스 IgG2a 이소형)을 PBS, pH 7.2에 3 mg/ml로 제형화하였다. 감염 후 7일부터 매주 복막내로 200 ㎕(600 ㎍)을 마우스에 주사하였다. 이소형 대조군은 독립적인 단일클론 마우스 IgG2a 항체였다.
마우스의 위 샘플에서 감염을 검증하기 위해 헬리코박터 헤일만니이 특이 16S rRNA의 발현을 PCR로 조사하였다. PCR 증폭 반응에는 1x 반응 완충액 [20 mM Tris/HCl (pH8.0), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1mM DTT, 0.5% Tween-20, 0.5% Nonidet P40, 및 50% 글리세롤] + 1 unit의 Taq DNA 중합효소 (TOYOBO, Osaka, Japan); 각 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 10 nmol; 각 올리고뉴클레오티드 프라이머 10 pmol; 및 희석한 DNA 1 ㎕가 총 부피 50 ㎕로 포함되며, 희석한 DNA는 DNA 농도가 약 20-100 ng/㎕인 오리지널 샘플을 1:10으로 희석하여 준비하였다. 16s rRNA 반응의 사이클링 조건은, 94℃에서 30초, 56℃에서 30초 및 72℃에서 30초로 이루어진 사이클 35회이다.
헬리코박터 헤일만니이의 16s rRNA 유전자 PCR 프라이머를 아래에 나타낸다:
F: 5'-TTGGGAGGCTTTGTCTTTCCA-3' (서열번호 24)
R: 5'-GATTAGCTCTGCCTCGCGGCT-3' (서열번호 25)
헬리코박터 헤일만니이에 감염된 마우스로부터 수득한 위 샘플들 모두에서 증폭시킨 헬리코박터 헤일만니이의 16s rRNA 유전자의 발현 결과를 도 30에 나타낸다. 이들 결과는 헬리코박터 헤일만니이 감염에 대해 테스트한 마우스 모두 양성으로 나타났다.
헬리코박터로 감염된 마우스의 위 점막에서의 CXCL13의 발현. 헬리코박터 헤일만니이로 감염된 마우스 및 비감염 마우스의 위 점막에서의 CXCL13 mRNA 발현 수준을 실시간 정량적인 PCR에 의해 측정하였다. 감염 후 1달 및 3달 후 헬리코박터 헤일만니이에 감염된 마우스에서의 위 점막내 CXCL13 mRNA 발현을 비감염된 야생형 대조군 마우스와 비교하여 도 31A와 31B에 각각 도시한다. 이들 결과는 헬리코박터 헤일만니이에 감염된 마우스에서의 CXCL13의 발현 증가를 보여준다.
항체가 처리된 헬리코박터 감염 마우스의 위 점막에서의 CXCL13의 발현. 헬리코박터 헤일만니이에 감염된 마우스의 위 점막에서의, 이소형 대조군 또는 항-CXCL13 항체 처리 후, CXCL13의 mRNA 발현 수준을 역전사 PCR로 측정하였다. 위의 점막층과 점막 아래층을 근육층과 장막으로부터 취한 다음, 1 ml 트리졸 시약 (Invitrogen)으로 균질화하였다. 제조사의 지침에 따라 균질물로부터 RNA를 추출하였다. RNA는 고성능 cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 역전사 반응을 수행하였다. PCR 증폭용 반응물에는 1x 반응 완충액 [20 mM Tris/HCl (pH8.0), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1mM DTT, 0.5% Tween-20, 0.5% Nonidet P40, 및 50% 글리세롤] + 1 unit의 Taq DNA 중합효소 (TOYOBO, Osaka, Japan); 각 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 10 nmol; 각 올리고뉴클레오티드 프라이머 10 pmol; 및 희석한 DNA 1 ㎕가 총 부피 50 ㎕로 포함되며, 희석한 DNA는 DNA 농도가 약 100 ng/㎕인 오리지널 샘플을 1:10으로 희석하여 준비하였다. CXCL13 및 베타-액틴 반응의 사이클링 조건은, 94℃에서 2분 둔 후, 94℃에서 30초 -> 55℃에서 30초 -> 72℃에서 1분으로 이루어진 사이클을 35회 반복하는 것이다.
도 32는 이소형 대조군 또는는 항-CXCL13 항체 처리 후 헬리코박터 헤일만니이 감염 마우스의 위장에서의 CXCL13 및 베타-액틴 대조군 mRNA의 발현을 도시한 것이다. 이 결과는, CXCL13이 비감염 야생형 마우스에서는 발현되지 않지만, 헬리코박터 헤일만니이 감염 마우스 모두에서는 발현된다는 것을 보여준다.
항-CXCL13 항체 처리는 헬리코박터 감염 마우스에서 위의 림프 여포를 감소시킨다. 헬리코박터 헤일만니이 감염 후 3달 후 마우스의 위를 절제하여, 대만부(greater curvature)에서 개복하였다. 위의 절반을 파라핀 왁스로 포매하고, 파라핀 포매된 조직을 절편으로 잘라 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하였다. 도 33은 이소형 대조군 (좌측 패널) 및 항-CXCL13 항체 (우측 패널) 처리 마우스의 위의 H & E 염색 사진이다. 위의 림프 여포의 수를 이소형 대조군과 항-CXCL13 항체 샘플에서 계수하였다. 결과는 도 33의 하단 패널에 나타낸다. 이들 결과는 항-CXCL13 항체를 처리한 헬리코박터 헤일만니이 감염 마우스에서 위 여포가 대조군 처리에 비해 감소됨을 보여준다.
구체적인 구현예에 대한 전술한 설명들은 본 발명의 전반적인 특성을 충분히 나타냄으로써, 당해 기술 분야의 당업자 수준에서의 지식을 적용하여, 과도한 실험없이도, 본 발명의 포괄적인 개념으로부터 이탈되지 않는 범위내에서, 제3자가 상기한 구체적인 구현예와 같은 다양한 용도를 쉽게 변형 및/또는 적응시킬 수 있을 것이다. 따라서, 이러한 적응 및 변형은 본원에 제시된 교시 내용과 지침을 토대로 기술된 구현예와 등가의 의미와 범위에 포함되는 것으로 의도된다. 본원의 표현 또는 용어는, 본 발명의 용어나 표현이 교시 내용과 지침에 비추어 당해 기술 분야의 당업자에게 이해되도록, 설명하기 위한 목적일 뿐 제한하고자 하는 것은 아니다.
본 발명의 범위와 규모는 전술한 예시적인 임의의 구현들로 한정되지 않으며, 첨부된 청구항과 이의 등가의 내용으로만 한정되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Vaccinex, Inc. KLIMATCHEVA, Ekaterina PARIS, Mark SMITH, Ernest S. <120> ANTI-CXCL13 ANTIBODIES AND METHODS OF USING THE SAME <130> 1843.0610001/EJH/BNC <140> To be assigned <141> Herewith <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLP139-151 <400> 1 His Ser Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe 1 5 10 <210> 2 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1609 <400> 2 gaggtgcagc ttcaggagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcaatctg 60 acttgttctt tctctggatt ttcactgagc acttttggta tgggtgtagg ctggattcgt 120 cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgataggagg 180 tataacccag ccctgaagag tcggctcaca atctccaagg aaacctccaa aaaccaggtg 240 ttcctcaaga tcgccaatgt ggacactgca gatactgcca catactactg tactcgaata 300 gcggggtatt atggtagtag agactggttt gcttactggg gccaagggac cacggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 3 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1609 <400> 3 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln 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ttcccttatc cctgctctgg attttagttt tgtgcttagt 480 taaatctttt ccaggaaaaa gaacttcccc atacaaataa gcatgagact atgtaaaaat 540 aaccttgcag aagctgatgg ggcaaactca agcttcttca ctcacagcac cctatataca 600 cttggagttt gcattcttat tcatcaggga ggaaagtttc tttgaaaata gttattcagt 660 tataagtaat acaggattat tttgattata tacttgttgt ttaatgttta aaatttctta 720 gaaaacaatg gaatgagaat ttaagcctca aatttgaaca tgtggcttga attaagaaga 780 aaattatggc atatattaaa agcaggcttc tatgaaagac tcaaaaagct gcctgggagg 840 cagatggaac ttgagcctgt caagaggcaa aggaatccat gtagtagata tcctctgctt 900 aaaaactcac tacggaggag aattaagtcc tacttttaaa gaatttcttt ataaaattta 960 ctgtctaaga ttaatagcat tcgaagatcc ccagacttca tagaatactc agggaaagca 1020 tttaaagggt gatgtacaca tgtatccttt cacacatttg ccttgacaaa cttctttcac 1080 tcacatcttt ttcactgact ttttttgtgg ggggcggggc cggggggact ctggtatcta 1140 attctttaat gattcctata aatctaatga cattcaataa agttgagcaa acattttact 1200 taaaaaaaaa aaaaaaaaa 1219 <210> 21 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Met Arg Leu Ser Thr Ala Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ser Cys Leu 1 5 10 15 Ser Pro Gly His Gly Ile Leu Glu Ala His Tyr Thr Asn Leu Lys Cys 20 25 30 Arg Cys Ser Gly Val Ile Ser Thr Val Val Gly Leu Asn Ile Ile Asp 35 40 45 Arg Ile Gln Val Thr Pro Pro Gly Asn Gly Cys Pro Lys Thr Glu Val 50 55 60 Val Ile Trp Thr Lys Met Lys Lys Val Ile Cys Val Asn Pro Arg Ala 65 70 75 80 Lys Trp Leu Gln Arg Leu Leu Arg His Val Gln Ser Lys Ser Leu Ser 85 90 95 Ser Thr Pro Gln Ala Pro Val Ser Lys Arg Arg Ala Ala 100 105 <210> 22 <211> 1162 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 22 gagctaaagg ttgaactcca cctccaggca gaatgaggct cagcacagca acgctgcttc 60 tcctcctggc cagctgcctc tctccaggcc acggtattct ggaagcccat tacacaaact 120 taaaatgtag gtgttctgga gtgatttcaa ctgttgtcgg tctaaacatc atagatcgga 180 ttcaagttac gccccctggg aatggctgcc ccaaaactga agttgtgatc tggaccaaga 240 tgaagaaagt tatatgtgtg aatcctcgtg ccaaatggtt acaaagatta ttaagacatg 300 tccaaagcaa aagtctgtct tcaactcccc aagctccagt gagtaagaga agagctgcct 360 gaagccacta tcatctcaaa agacacacct gcaccttttt ttttatccct gctctgaatt 420 ttagatatgt tcttagttaa agaatttcca agaaaataac tcccctctac aaacaaacat 480 gactgtaggt aaaacaaagc aaaaacaaac aagcaaacaa acaaactaaa aaaaacccaa 540 tcctgcagga gctgagaggg aatgctcaag ctccgttgca tacccaaccc acatccttgt 600 tccttaagaa aggctatttg agaacaggca tttagtgaca acccacttca gatgcatgtg 660 gtaatagatc tgttgtttaa tgttaaacta tcctagattg tcgaggaatg aaaaacctac 720 atgtcaaatg tgaacttgta gctcgtacta acaagaggtt tgcgagatgg acttcagtta 780 ttttgcaccc ttgtaaaacg caggcttcca aaatagtctc cagaaggttc ctgggaagct 840 ggtgcaatgc catcatgagg tggtgcaaag caggtctcct ttagagaaaa gcttcctggg 900 ggaaacagtc ctactttgaa aggttgcttg tataagattt attgtcttgc attaaaacca 960 gtaacaattg aaagatcctc agcttaaagg tccaggctct tcagcagtat acaaatatat 1020 tcctttgcac tgtgaccctg atgatctatt tttattattc atatctttca cacagacaaa 1080 ataccagcct cttgtatcag attctttaat gtttcctatt catctggtgt cattcaataa 1140 atgtaatcaa atgttttgct ta 1162 <210> 23 <211> 82 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 23 Val Leu Glu Val Tyr Tyr Thr His Leu Arg Cys Arg Cys Val Gln Glu 1 5 10 15 Ser Ser Val Phe Ile Pro Arg Arg Phe Ile Asp Arg Ile Gln Ile Ser 20 25 30 Pro Arg Gly Asn Gly Cys Pro Arg Lys Glu Ile Ile Val Trp Lys Lys 35 40 45 Asn Lys Ser Val Val Cys Val Asp Pro Gln Ala Glu Trp Ile Gln Arg 50 55 60 Ile Met Glu Met Leu Arg Lys Lys Ser Ser Ser Thr Pro Pro Val Pro 65 70 75 80 Val Phe <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s Forward primer <400> 24 ttgggaggct ttgtctttcc a 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s Reverse primer <400> 25 gattagctct gcctcgcggc t 21

Claims (158)

  1. a) 내지 c)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 인간, 뮤라인 및 시노몰구스 원숭이 CXCL13에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    a) 서열번호 4와 동일한 중쇄 상보성 결정부-1 (VH-CDR1) 아미노산 서열, 서열번호 5와 동일한 중쇄 상보성 결정부-2 (VH-CDR2) 아미노산 서열 및 서열번호 6과 동일한 중쇄 상보성 결정부-3 (VH-CDR3) 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및
    서열번호 16 또는 서열번호 9와 동일한 경쇄 상보성 결정부-1 (VL-CDR1) 아미노산 서열, 서열번호 10과 동일한 경쇄 상보성 결정부-2 (VL-CDR2) 아미노산 서열 및 서열번호 11과 동일한 경쇄 상보성 결정부-3 (VL-CDR3) 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)
    을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편;
    b) 항체 또는 이의 항원-결합 단편에서, VH가 서열번호 3 또는 13에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며, VL이 서열번호 8, 15 또는 17에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및
    c) 기준 단일클론 항체 (reference monoclonal antibody)를 경쟁적으로 저해하거나 또는 기준 단일클론 항체와 동일한 CXCL13 에피토프에 특이적으로 결합하며, 기준 단일클론 항체와 동일한 항원-결합부를 포함하며, 상기 기준 단일클론 항체가 상기 a) 또는 b)에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VH가 서열번호 4, 5 및 6과 각각 동일한 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열들을 포함하며,
    상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VL이 서열번호 9 또는 16, 10 및 11과 각각 동일한 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열들을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 VH가 서열번호 3 또는 13에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 VL이 서열번호 8, 15 또는 17에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 VH 및 VL이 하기 (i), (ii) 및 (iii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH 서열 및 VL 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (i) 각각 서열번호 13 및 서열번호 15;
    (ii) 각각 서열번호 13 및 서열번호 17; 및
    (iii) 각각 서열번호 3 및 서열번호 8.
  5. 분리된 VH 코딩 폴리뉴클레오티드 및 분리된 VL 코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물로서,
    상기 VH 코딩 폴리뉴클레오티드 및 상기 VL 코딩 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 CXCL13에 특이적으로 결합하고,
    상기 VH 코딩 폴리뉴클레오티드가 서열번호 4, 5 및 6으로 각각 이루어진 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 아미노산 서열들을 포함하는 VH 폴리펩타이드를 코딩하고,
    상기 VL 코딩 폴리뉴클레오티드가 서열번호 9 또는 16, 10 및 11로 각각 이루어진 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 아미노산 서열들을 포함하는 VL 폴리펩타이드를 코딩하는, 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 VH 코딩 폴리뉴클레오티드 및 상기 VL 코딩 폴리뉴클레오티드가 하나의 벡터에 포함된, 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 VH 코딩 폴리뉴클레오티드가 제1 벡터에 포함되고;
    상기 VL 코딩 폴리뉴클레오티드가 상기 제1 벡터와 동일하지 않은 제2 벡터에 포함된, 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 제1 벡터와 상기 제2 벡터가 단일 숙주 세포에 포함된, 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 제1 벡터와 상기 제2 벡터가 개별 숙주 세포에 포함된, 조성물.
  10. 제6항에 따른 조성물의 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  11. 제8항에 따른 조성물의 제1 벡터 및 제2 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  12. CXCL13에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법으로서,
    제10항 또는 제11항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및
    항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 제조 방법.
  13. CXCL13에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법으로서,
    제9항에 따른 조성물의 제1 벡터 및 제2 벡터가 포함된 개별 숙주 세포들을 공동-배양하는 단계, 및
    항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 제조 방법.
  14. CXCL13에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법으로서,
    제9항에 따른 조성물의 제1 벡터 및 제2 벡터가 포함된 개별 숙주 세포들을 각각 배양하는 단계, 및
    VH 코딩 폴리펩타이드와 VL 코딩 폴리펩타이드를 조합하는 단계, 및
    항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 제조 방법.
  15. 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 치료학적 유효량으로 포함하는,
    치료가 필요한 동물에서 암, 자가면역 질환 또는 염증성 질환을 치료하기 위한 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 자가면역 질환 또는 상기 염증성 질환이 다발성 경화증, 전신 루푸스 홍반증 (SLE) 또는 관절염인, 약학 조성물.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 암이 전립선암 또는 대장암인, 약학 조성물.
  18. 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 유효량으로 포함하는,
    치료가 필요한 동물에서 헬리코박터(Helicobacter) 감염 관련 염증 질환을 치료하기 위한 약학 조성물로서.
    상기 질환은 림프종, 위암, 위 또는 십이지장 궤양, 또는 위염이고,
    상기 조성물은 위의 림프 여포를 저해하는 것인, 약학 조성물.
  19. 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 유효량으로 포함하는,
    치료 또는 예방이 필요한 동물에서 점막-연관 림프 조직 (mucosa-associated lymphoid, MALT) 림프종을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물.
  20. 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 유효량으로 포함하는,
    치료 또는 예방이 필요한 동물에서 위 궤양 또는 십이지장 궤양을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서,
    상기 동물이 헬리코박터 (Helicobacter) 박테리아에 감염된 적이 있는, 약학 조성물.
  22. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 동물이 인간인, 약학 조성물.
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