CN112752580A - 抗klrg1抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及与杀伤细胞凝集素样受体G1(KLRG1)特异性结合的抗体或其抗原结合片段。此类抗体或其抗原结合片段可用于包括治疗癌症的各种治疗或诊断目的以及用于增加疫苗的有效性。
Description
技术领域
本技术领域涉及抑制淋巴细胞共抑制受体杀伤细胞凝集素样受体亚家族G成员1(KLRG1)。
背景技术
响应于激活信号诸如在主要组织相容性复合体(MHC)与T细胞受体(TCR)结合的情况下的抗原肽，淋巴细胞共抑制受体调节适应性免疫系统(例如T细胞和NK细胞)的作用。共抑制受体包括PD-1、LAG-3、TIM-3和CTLA4。共抑制受体的作用通常是通过使配体与共抑制受体的细胞外结构域结合，然后通过位于共抑制受体的细胞内结构域的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)募集细胞内磷酸酶来进行的。共抑制受体的作用通常是抑制TCR接合的免疫反应。近年来，已显示阻断共抑制受体活性的剂可用作癌症和传染病的有效治疗。
杀伤细胞凝集素样受体G1(KLRG1)是通过调节T细胞和NK细胞的活性而起共抑制受体作用的II型跨膜蛋白。它的细胞外部分含有已知配体为钙粘蛋白的C型凝集素结构域，并且它的细胞内部分含有负责共抑制T细胞受体(TCR)介导的信号传导的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)结构域。KLRG1配体可为E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、R-钙粘蛋白或其组合。
受体杀伤细胞凝集素样受体G1(KLRG1)在T细胞和NK细胞上表达，与上皮细胞和间充质细胞上的配体结合。KLRG1的配体已被描述为E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白和R-钙粘蛋白。
在人体内，KLRG1表达限于免疫系统的细胞，并且特别是CD8阳性T细胞、NK细胞和较小程度的CD4阳性T细胞。KLRG1表达与晚期分化表型有关。当抗原特异性T细胞分化时，它们获得增加的细胞毒性分子表达，并因此具有增加的细胞毒性潜力。KLRG1的生物学功能是抑制这些T细胞的细胞毒性和增殖。在癌症和传染病中，已显示其对于恢复T细胞活性是有益的。
通常，需要提供用于癌症或传染病的安全且有效的治疗方法。这些病症中涉及的细胞毒性(或CD8+)T细胞和NK细胞激活的调节可通过操纵KLRG1途径来完成。
发明内容
本公开提供了结合KLRG1的细胞外结构域(ECD)并抑制其与配体E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白和R-钙粘蛋白相互作用的新的抗体或其抗原结合片段的表征。此处描述的抗体已通过小鼠杂交瘤技术获得，并且可通过将其互补决定区(CDR)移植到人框架中来进行人源化。本公开还提供了调节(例如激活)CD8+细胞毒性T细胞和NK细胞并通过调节(例如中和)KLRG1与其配体之间的相互作用来实现此目的的抗体或结合片段。此处描述的抗体可作为单一疗法或与其他免疫治疗剂(诸如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗CTLA4抗体)组合或与化学治疗剂或癌症疫苗组合来用作治疗癌症的有效治疗剂。此处描述的抗体可用作传染病的有效治疗或增强针对传染病的疫苗的有效性。
抗体的非限制性说明性实施方案被称为ABC_HG1N01、ABC_HG1N02、ABC_HG1N07、ABC_G1N01、ABC_G1N02、ABC_G1N03、ABC_G1N04、ABC_G1N05、ABC_G1N06、ABC_G1N07或ABC_G1N08。其他实施方案包含ABC_HG1N01、ABC_HG1N02、ABC_HG1N07、ABC_G1N01、ABC_G1N02、ABC_G1N03、ABC_G1N04、ABC_G1N05、ABC_G1N06、ABC_G1N07或ABC_G1N08的Fv片段的VH和/或VL结构域。其他实施方案包含这些VH和VL结构域中任一者的一个或多个CDR。其他实施方案包含ABC_HG1N01、ABC_HG1N02、ABC_HG1N07、ABC_G1N01、ABC_G1N02、ABC_G1N03、ABC_G1N04、ABC_G1N05、ABC_G1N06、ABC_G1N07和ABC_G1N08的VH结构域的H3片段。
本公开还提供了包含KLRG1抗体的组合物，及其在调节免疫反应的方法中的用途，包括治疗人或动物的方法。在特定的实施方案中，抗KLRG1抗体通过激活CD8+细胞毒性T细胞和NK细胞用于治疗或预防癌症。易于用本发明的组合物治疗的病症包括但不限于癌症和传染病。
另外，抗KLRG1抗体可用于诊断检测生物样品中的KLRG1或其片段。检测到的KLRG1的量可与KLRG1的表达水平相关，而KLRG1的表达水平又与受试者中淋巴细胞(例如，细胞毒性T细胞或自然杀伤细胞)的激活状态相关。
本公开还提供了分离的核酸，其包含编码来自ABC_HG1N01、ABC_HG1N02、ABC_HG1N07、ABC_G1N01、ABC_G1N02、ABC_G1N03、ABC_G1N04、ABC_G1N05、ABC_G1N06、ABC_G1N07和ABC_G1N08的Fv片段的VH或VL结构域的序列。还提供了分离的核酸，其包含编码来自目前公开的VH和VL结构域中任一者的一个或多个CDR的序列。本公开还提供了包含此类核酸的载体和宿主细胞。
本公开还提供了一种产生新的VH和VL结构域和/或包含此类结构域中的全部或一部分的功能性抗体的方法，所述结构域衍生自ABC_HG1N01、ABC_HG1N02、ABC_HG1N07、ABC_G1N01、ABC_G1N02、ABC_G1N03、ABC_G1N04、ABC__G1N05、ABC_G1N06、ABC_G1N07和ABC_G1N08的VH或VL结构域。
本公开的另外的方面将在下面的描述中部分列出，并且部分将由描述而变得显而易见，或可通过实践本发明来学习。在所附权利要求书中列出并特别指出了本发明，并且本公开不应被解释为以任何方式限制权利要求书的范围。以下详细描述包括本发明的各种实施方案的示例性表示，其不限制如所要求保护的本发明。附图构成本说明书的一部分，并且与说明书一起仅用于说明各种实施方案而不限制本发明。参考文献的引用并非承认这些参考文献是本发明的现有技术。
附图说明
图1示出干扰素-γ(IFNγ)分泌测定的结果，证明抗KLRG1抗体激活CD8+人T细胞。
图2示出CD8+ T细胞增殖测定的结果，证明抗KLRG1抗体诱导CD8+ T细胞的增殖。
图3示出用抗KLRG1抗体处理的CD8+ T细胞中IFNγ分泌测定的结果与抗体的阻断活性(以IC50的形式示出)之间的关系。
具体实施方式
定义
如本公开中使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白或其片段或衍生物，并且涵盖任何包含抗原结合位点的多肽，无论其是在体外还是在体内产生。术语包括但不限于多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、非特异性、人源化、单链、嵌合、合成、重组、杂交、突变和移植抗体。出于本公开的目的，除非术语“完整”以其他方式修饰，如在“完整抗体”中，否则术语“抗体”还包括抗体片段，诸如Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、dAb和保留抗原结合功能(即特异性结合KLRG1的能力)的其他抗体片段。通常，此类片段将包含抗原结合结构域。
术语“抗原结合结构域”、“抗原结合片段”和“结合片段”是指抗体分子的一部分，其包含负责抗体与抗原之间特异性结合的氨基酸。在抗原较大的情况下，抗原结合结构域可仅与抗原的一部分结合。负责与抗原结合结构域的特异性相互作用的抗原分子的一部分被称为“表位”或“抗原决定簇”。
抗原结合结构域通常包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)，但不一定必须同时包含两者。例如，所谓的Fd抗体片段仅由VH结构域组成，但仍保留完整抗体的某些抗原结合功能。
术语“库(repertoire)”是指完全或部分衍生自编码所表达的免疫球蛋白的序列的核苷酸的遗传多样性集合。这些序列是通过H链的例如V、D和J区段以及L链的例如V和J区段的体内重排产生的。替代地，序列可通过响应于发生重排的体外刺激而从细胞系产生。替代地，序列的部分或全部可通过将例如未重排的V区段与D和J区段组合、通过核苷酸合成、随机诱变和其他方法(例如美国专利号5,565,332中所公开)获得。
术语“特异性相互作用”和“特异性结合”是指形成在生理条件下相对稳定的复合物的两个分子。特异性结合的特征在于高亲和力和低至中等容量，与通常具有低亲和力和中等至高容量的非特异性结合不同。通常，当亲和常数KA高于106M-1或更优选高于108M-1时，结合被认为是特异性的。如果必要的话，可通过改变结合条件来减少非特异性结合，而基本上不影响特异性结合。适当的结合条件，诸如抗体的浓度、溶液的离子强度、温度、允许结合的时间、阻断剂(例如血清白蛋白、牛奶酪蛋白)的浓度等，可由技术人员使用常规技术进行优化。
短语“基本上如所述”意指本发明的相关CDR、VH或VL结构域将与所述序列的指定区(例如，CDR)相同或仅具有非实质性差异。非实质性差异包括较小的氨基酸变化，诸如取代指定区的序列中任何5个氨基酸中的1个或2个。
术语“KLRG1活性”是指与KLRG1相关的一种或多种淋巴细胞共抑制活性。例如，KLRG1活性可能意味着对细胞毒性T细胞和NK细胞激活的调节。
术语“调节”及其同源词是指由于KLRG1与抗KLRG1抗体的相互作用而引起的与T细胞和NK细胞的激活相关的KLRG1活性的降低或增加，其中降低或增加是相对于在不存在相同抗体的情况下KLRG1的活性。活性的降低或增加优选地为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。当KLRG1活性降低时，术语“调节(modulatory/modulate)”与术语“抑制(inhibitory/inhibit)”可互换。当KLRG1活性增加时，术语“调节(modulatory/modulate)”与术语“激活(activating/activate)”可互换。KLRG1的活性可使用诸如实施例6中所述的T细胞和NK细胞激活测定来定量测定。
术语“治疗”和“治疗方法”是指治疗方法和预防(prophylactic/preventative)措施。需要治疗者可包括已患有特定医学病症的个体以及可能最终获得所述病症的个体(即需要预防措施的个体)。
术语“有效量”是指足以降低KLRG1活性以导致患者症状改善或达到期望的生物学结果的剂量或量，所述期望的生物学结果例如，降低KLRG1活性、调节淋巴细胞共抑制反应、增加细胞毒性T细胞和NK细胞的激活或增加细胞毒性T细胞或NK细胞的IFNγ释放。
术语“分离的”是指基本上没有自然环境的分子。例如，分离的蛋白质基本上没有来自其所来源的细胞或组织来源的细胞物质或其他蛋白质。术语“分离的”还指制剂，其中分离的蛋白质足够纯以作为药物组合物施用，或至少70％-80％(w/w)纯，更优选至少80％-90％(w/w)纯，甚至更优选90％-95％纯；并且最优选至少95％、96％、97％、98％、99％或100％(w/w)纯。
抗KLRG1抗体
本公开提供了包含新的抗原结合片段的抗KLRG1抗体。
通常，可例如使用传统杂交瘤技术(Kohler和Milstein(1975)Nature，256：495-499)、重组DNA方法(美国专利号4,816,567)或用抗体文库进行噬菌体展示(Clackson等人(1991)Nature，352：624-628；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.，222：581-597)来制备抗体。对于其他抗体产生技术，另外参见Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow等人编，ColdSpring Harbor Laboratory，1988。本发明不限于任何特定来源、起源物种或产生方法。
完整抗体(也称为免疫球蛋白)通常为四聚体糖基化蛋白，由两条分别为大约25kDa的轻(L)链和两条分别为大约50kDa的重链(H)组成。在抗体中发现了两种类型的轻链，命名为λ链和κ链。根据重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为五种主要类别：A、D、E、G和M，并且这些中的几种可被进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是本领域中众所周知的。对于抗体结构的综述，参见Harlow等人，同上。简而言之，每条轻链由N端可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)组成。每条重链由N端可变结构域(VH)、三个或四个恒定结构域(CH)和铰链区组成。最接近VH的CH结构域命名为CH1。VH和VL结构域由相对保守的序列的四个区域(称为框架区(FR1、FR2、FR3和FR4))组成，所述四个区域形成高变序列的三个区域(称为互补决定区(CDR))的支架。CDR含有负责与抗原特异性相互作用的大多数残基。三个CDR称为CDR1、CDR2和CDR3。因此，重链上的CDR成分称为H1、H2和H3，而轻链上的CDR成分称为L1、L2和L3。CDR3，并且特别是H3，是抗原结合结构域内分子多样性的最大来源。例如，H3可短至两个氨基酸残基或大于26个。
Fab片段(抗原结合片段)由通过恒定区之间的二硫键共价连接的VH-CH1和VL-CL结构域组成。为了克服在宿主细胞中共表达时Fv中非共价连接的VH和VL结构域解离的趋势，可构建所谓的单链(sc)Fv片段(scFv)。在scFv中，柔性且足够长的多肽将VH的C端连接到VL的N端或将VL的C端连接到VH的N端。最通常地，使用15个残基的(Gly4Ser)3肽作为接头，但是其他接头也是本领域中已知的。
抗体多样性是编码可变区的多个种系基因和各种体细胞事件的组合组装的结果。体细胞事件包括可变基因区段与多样性(D)和连接(J)基因区段的重组以形成完整的VH区，以及可变基因区段与连接基因区段的重组以形成完整的VL区。重组过程本身是不精确的，从而导致V(D)J连接处氨基酸的丢失或增加。这些多样性机制存在于抗原暴露之前的发育中的B细胞中。抗原刺激后，B细胞中所表达的抗体基因发生体细胞突变。
基于种系基因区段的估计数量、这些区段的随机重组以及随机VH-VL配对，可产生多达1.6×107个不同的抗体(Fundamental Immunology，第3版，Paul编，Raven Press，NewYork，N.Y.，1993)。当考虑到有助于抗体多样性的其他过程(诸如体细胞突变)时，人们认为有可能产生超过1×1010个不同的抗体(Immunoglobulin Genes，第2版，Jonio等人编，Academic Press，San Diego，Calif.，1995)。由于涉及抗体多样性的许多过程，独立产生的抗体极不可能在CDR中具有相同的氨基酸序列。
本公开提供了衍生自人免疫球蛋白基因文库的新的CDR。用于携带CDR的结构通常为抗体重链或轻链或其一部分，其中CDR位于对应于天然存在的VH和VL的CDR的位置。免疫球蛋白可变结构域的结构和位置可例如如Rabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第91-3242期，National Institutes of HealthPublications，Bethesda，Md.，1991中所述来确定。
人源化抗KLRG1抗体的VH和VL结构域的氨基酸序列在序列表中列出，并如表1所示列举。
表1：人源化抗KLRG1抗体可变区的氨基酸序列
抗体的特定非限制性说明性实施方案称为ABC_HG1N01、ABC_HG1N02和ABC_HG1N07。说明性实施方案的VH和VL结构域内CDR的氨基酸序列在序列表中列出，并如表2所示列举。
表2.人源化抗KLRG1抗体的CDR氨基酸序列
小鼠抗KLRG1抗体的VH和VL结构域的氨基酸序列在序列表中列出，并如表3所示列举。
表3：小鼠抗KLRG1抗体的可变区氨基酸序列
抗体的特定非限制性说明性实施方案被称为ABC_G1N01、ABC_G1N02、ABC_G1N03、ABC_G1N04、ABC_G1N05、ABC_G1N06、ABC_G1N07和ABC_G1N08。说明性实施方案的VH和VL结构域内CDR的氨基酸序列在序列表中列出，并如表4所示列举。
表4：小鼠抗KLRG1抗体的CDR氨基酸序列
抗KLRG1抗体可任选地包含抗体恒定区或其部分。例如，VL结构域可在其C端连接抗体轻链恒定结构域，包括人C K或Ck链。类似地，基于VH结构域的特异性抗原结合结构域可能连接了衍生自任何抗体同型(例如IgG、IgA、IgE和IgM)和任何同型亚类(包括但不限于IgG1和IgG4)的免疫球蛋白重链的全部或部分。在示例性实施方案中，ABC_HG1N01、ABC_HG1N02、ABC_HG1N07、ABC_G1N01、ABC_G1N02、ABC_G1N03、ABC_G1N04、ABC_G1N05、ABC_G1N06、ABC_G1N07和ABC_G1N08抗体包含人IgG1k或IgG1x的重链和轻链的C端片段。C端片段的DNA和氨基酸序列是本领域中众所周知的(参见例如，Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第91-3242期，National Institutes of HealthPublications，Bethesda，Md.，1991)。
某些实施方案包含来自ABC_HG1N01、ABC_HG1N02、ABC_HG1N07、ABC_G1N01、ABC_G1N02、ABC_G1N03、ABC_G1N04、ABC_G1N05、ABC_G1N06、ABC_G1N07和ABC_G1N08的Fv片段的VH和/或VL结构域。其他实施方案包含这些VH和VL结构域中任一者的至少一个CDR。包含在以下中列出的CDR序列中的至少一个的抗体涵盖在本发明的范围内：SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQID NO：38。例如，一个实施方案包含选自以下中的至少一个的抗体的VH结构域的H3片段：ABC_HG1N01、ABC_HG1N02、ABC_HG1N07ABC_G1N01、ABC_G1N02、ABC_G1N03、ABC_G1N04、ABC_G1N05、ABC_G1N06、ABC_G1N07和ABC_G1N08。
在某些实施方案中，可将VH和/或VL结构域种系化，即，使用常规分子生物学技术使这些结构域的框架区(FR)突变以匹配由种系细胞产生的那些。在其他实施方案中，框架序列与共有种系序列保持不同。
在某些实施方案中，抗体特异性结合人或小鼠KLRG1的ECD内的表位，其亲和力以KD表示为至少约2nM、1nm、100pM、10pM或5pM。人和食蟹猴KLRG1的ECD的氨基酸序列在SEQID NO：89和SEQ ID NO：90中列出，如表6所示。
设想本发明的抗体还可与其他蛋白质结合，所述其他蛋白质包括例如包含KLRG1的全部或部分的重组蛋白质。
本领域普通技术人员将认识到，本发明的抗体可用于检测、测量和抑制与KLRG1有所不同的蛋白质。只要靶蛋白包含的序列与SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：90中列出的序列中至少130个、100个、80个、60个、40个或20个连续氨基酸的任何序列具有至少约60％、70％、80％、90％、95％或更高同一性，就预期抗体保留结合的特异性。同一性百分比通过标准比对算法来确定，例如像，Altshul等人(1990)J.Mol.Biol.，215：403-410中描述的基本局部比对工具(BLAST)、Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.，48：444-453的算法或Meyers等人(1988)Comput Appl.Biosci.，4：11-17的算法。
除了序列同源性分析之外，可进行表位作图(参见例如，Epitope MappingProtocols，Morris编，Humana Press，1996)以及二级和三级结构分析，以鉴定由所公开抗体及其与抗原的复合物假定的特定3D结构。此类方法包括但不限于X射线晶体学(Engstom(1974)Biochem.Exp.Biol.，11：7-13)和当前所公开抗体的虚拟表示的计算机建模(Fletterick等人(1986)Computer Graphics and Molecular Modeling，in CurrentCommunications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，N.Y.)。
衍生物
本公开还提供了一种用于获得对KLRG1具有特异性的抗体的方法。此类抗体中的CDR不限于表1和表3中鉴定的VH和VL的特定序列，并且可包括这些序列的保留特异性结合KLRG1的能力的变体。此类变体可由技术人员使用本领域中众所周知的技术从表1和表3中列出的序列中衍生。例如，可在FR和/或CDR中进行氨基酸取代、缺失或添加。通常将FR的变化设计为改善抗体的稳定性和免疫原性，而通常将CDR的变化设计为增加抗体对其靶标的亲和力。FR的变体还包括天然存在的免疫球蛋白同种异型(allotype)。可通过涉及改变CDR并测试抗体针对其靶标的亲和力的常规技术来凭经验确定此类亲和力增加的变化。例如，可在所公开的CDR中的任一种内进行保守性氨基酸取代。可根据Antibody Engineering，第2版，Oxford University Press，Borrebaeck编，1995中描述的方法进行各种改变。这些包括但不限于通过取代编码序列内功能上等效的氨基酸残基的不同密码子从而产生“沉默的”变化而改变的核苷酸序列。例如，非极性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。序列内氨基酸的取代者可选自所述氨基酸所属类别的其他成员(参见表5)。此外，多肽中的任何天然残基也可被丙氨酸取代(参见例如，MacLennan等人(1998)Acta Physiol.Scand.增刊643：55-67；Sasaki等人(1998)Adv.Biophys.35：1-24)。
表5：示例性保守性取代：
| 残基 | 保守性取代 |
| Ala(A) | Ser(S) |
| Arg(R) | Lys(K) |
| Asn(N) | Gln(Q)；His(H) |
| Asp(D) | Glu(E) |
| Cys(C) | Ser(S) |
| Gln(Q) | Asn(N) |
| Glu(E) | Asp(D) |
| Gly(G) | Pro(P) |
| His(H) | Asn(N)、Gln(Q) |
| Ile(I) | Leu(L)、Val(V) |
| Leu(L) | Ile(I)、Val(V) |
| Lys(K) | Arg(R)、Gin(Q) |
| Met(M) | Leu(L)、Ile(I) |
| Phe(F) | Met(M)、Leu(L)、Tyr(Y) |
| Ser(S) | Thr(T)；G1y(G) |
| Thr(T) | Ser(S)、Va1(V) |
| Trp(W) | Tyr(Y) |
| Tyr(Y) | Trp(W)、Phe(F) |
| Val(V) | Ile(I)、Leu(L) |
| Pro(P) | - |
本发明抗体的衍生物和类似物可通过本领域中众所周知的各种技术来产生，包括重组和合成方法(Maniatis(1990)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，以及Bodansky等人(1995)ThePractice of Peptide Synthesis，第2版，Spring Verlag，Berlin，Germany)。
在一个实施方案中，一种用于制备作为本发明的VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域的方法包括在当前公开的VH结构域中添加、删除、取代或插入一个或多个氨基酸的步骤，任选地将由此提供的VH结构域与一个或多个VL结构域组合，以及测试VH结构域或一个或多个VH/VL组合与KLRG1的特异性结合，并且任选地测试此种抗原结合结构域调节KLRG1活性的能力。VL结构域可具有与表1和表3相同或基本上如表1和表3所述的氨基酸序列。
可采用类似的方法，其中将本文所公开的VL结构域的一个或多个序列变体与一个或多个VH结构域组合。
本公开的另一方面提供了一种制备与KLRG1特异性结合的抗原结合片段的方法。所述方法包括：
(a)提供编码VH结构域的核酸的起始库，所述VH结构域包含要替代的CDR3或缺少CDR3编码区；
(b)将库与编码针对VH CDR3(即，H3)基本上如本文所述的氨基酸序列的供体核酸组合，使得供体核酸被插入库中的CDR3区中，以便提供编码VH结构域的核酸的产物库；
(c)表达产物库的核酸；
(d)选择对KLRG1具有特异性的结合片段；以及
(e)回收特异性结合片段或编码它的核酸。
再次，可采用类似的方法，其中将本发明的VL CDR3(即，L3)与编码VL结构域的核酸的库组成，所述VL结构域包括要替代的CDR3或缺少CDR3编码区。供体核酸可选自编码基本上如SEQ ID NO：7-24和41-88所述的氨基酸序列的核酸。
编码本发明的CDR(例如，CDR3)的序列可使用重组DNA技术，例如，使用Marks等人描述的方法(Bio/Technology(1992)10：779-783)引入到缺少相应CDR(例如，CDR3)的可变结构域的库中。特别地，可将针对可变结构域区域5′端或邻近可变结构域区域5′端的共有引物与人VH基因的第三框架区的共有引物结合使用，以提供缺乏CDR3的VH可变结构域的库。所述库可与特定抗体的CDR3组合。使用类似技术，CDR3衍生的序列可用缺乏CDR3的VH或VL结构域的库改组，并且将经改组的完整VH或VL结构域与同源VL或VH结构域组合以制备本发明的KLRG1特异性抗体。然后可在合适的宿主系统诸如噬菌体展示系统(诸如WO92/01047中所述)中展示所述库，使得可选择合适的抗原结合片段。
Stemmer(Nature(1994)370：389-391)也公开了类似的改组或组合技术，他描述了与β-内酰胺酶基因有关的技术，但观察到所述方法可用于产生抗体。
在其他实施方案中，可使用一种或多种选择的VH和/或VL基因的随机诱变来产生携带衍生自本文所公开的序列的一个或多个序列的新的VH或VL区。Gram等人(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.(1992)89：3576-3580)描述了一种这样的技术，即易错PCR。
可使用的另一种方法是将诱变引导至VH或VL基因的CDR。由Barbas等人(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.(1994)91：3809-3813)和Schier等人(J.Mol.Biol.(1996)263：551-567)公开了此类技术。
类似地，可将一个或多个或所有三个CDR移植到VH或VL结构域的库中，然后筛选对KLRG1具有特异性的抗原结合片段。
免疫球蛋白可变结构域的一部分将包含基本上如本文所述的CDR中的至少一个，以及任选地来自如本文所述的scFv片段的介入框架区。所述部分可包括FR1和FR4中的一者或两者的至少约50％，所述50％为FRI的C端50％和FR4的N端50％。在可变结构域的实质部分的N端或C端的其他残基可为通常不与天然存在的可变结构域区域相关的那些残基。例如，通过重组DNA技术构建抗体可导致由被引入以促进克隆或其他操作步骤的接头编码的N端或C端残基的引入。其他操作步骤包括引入接头以将可变结构域连接到其他蛋白质序列，包括免疫球蛋白重链恒定区、其他可变结构域(例如，在双抗体的产生中)或蛋白质标记，如下文进一步详细讨论。
尽管实施例中所示的实施方案包含一对“匹配的”VH和VL结构域，但是技术人员将认识到，替代实施方案可包含仅含有来自VL或VH结构域的单个CDR的抗原结合片段。单链特异性结合结构域中的任一者都可用于筛选能够形成能够例如与KLRG1结合的两个结构域特异性抗原结合片段的互补结构域。可使用WO92/01047中公开的所谓的分级双重组合方法，通过噬菌体展示筛选方法来完成筛选，其中使用含有H链或L链克隆的单个菌落来感染编码另一条链(L或H)的克隆的完整文库，并且根据如所述的噬菌体展示技术选择所得的两条链特异性结合结构域。
本文所述的抗KLRG1抗体可连接到另一种功能分子，例如，另一种肽或蛋白质(白蛋白、另一种抗体等)、毒素、放射性同位素、细胞毒性或细胞抑制剂。例如，抗体可通过化学交联或通过重组方法来连接。也可以美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中列出的方式将抗体与多种非蛋白质聚合物中的一种连接，所述非蛋白质聚合物例如，聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。抗体可通过与聚合物共价缀合来进行化学修饰，以例如增加其循环半衰期。示例性聚合物和连接它们的方法也显示于美国专利号4,766,106；4,179,337；4,495,285和4,609,546中。
还可将所公开的抗体改变为具有不同于天然模式的糖基化模式。例如，可删除一个或多个糖部分和/或将一个或多个糖基化位点添加到原始抗体。可通过改变氨基酸序列以含有本领域中已知的糖基化位点共有序列来实现将糖基化位点添加到目前公开的抗体。增加抗体上糖部分数量的另一种方式是通过糖苷与抗体氨基酸残基的化学或酶促偶联。此类方法描述于WO 87/05330和Aplin等人(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.，22：259-306中。从抗体中去除任何糖部分可通过化学或酶促方法完成，例如，如Hakimuddin等人(1987)Arch.Biochem.Biophys.，259：52；和Edge等人(1981)Anal.Biochem.，118：131以及Thotakura等人(1987)Meth.Enzymol.，138：350所述。抗体也可用可检测的或功能性标记来加标。可检测的标记包括放射性标记，诸如131I或99Tc，也可使用常规化学方法将其连接到抗体。可检测的标记还包括酶标记，诸如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。可检测的标记还包括化学部分，诸如生物素，其可通过与特定同源可检测部分(例如经标记的亲和素)结合而被检测。
CDR序列与以下中列出的那些只有非实质性差异的抗体涵盖在本发明的范围内：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：40。通常，氨基酸被具有相似电荷、疏水性或立体化学特征的相关氨基酸取代。此类取代将在技术人员的普通技术之内。与在CDR中不同，在FR中可进行更多实质性变化，而不会不利地影响抗体的结合特性。对FR的改变包括但不限于使非人衍生的框架人源化或工程化对于抗原接触或稳定结合位点重要的某些框架残基，例如，改变恒定区的类别或亚类、改变可能更改效应子功能(诸如Fc受体结合)的特定氨基酸残基，例如，如美国专利号5,624,821和5,648,260以及Lund等人(1991)J.Immum.147：2657-2662和Morgan等人(1995)Immunology 86：319-324中所述，或改变恒定区所来源的物种。
本领域技术人员将理解，上述修改不是完全详尽的，并且根据本公开的教导，许多其他修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
核酸、克隆和表达系统
本公开还提供编码所公开的抗体的分离的核酸。核酸可包含DNA或RNA，并且可为全部或部分合成或重组的。除非上下文另外要求，否则对如本文所述的核苷酸序列的引用涵盖具有指定序列的DNA分子，并且涵盖具有其中U取代T的指定序列的RNA分子。
本文提供的核酸包含本文所公开的CDR、VH结构域和/或VL结构域的编码序列。
本公开还提供了呈质粒、载体、噬菌粒、转录或表达盒形式的构建体，其包含至少一种编码本文所公开的CDR、VH结构域和/或VL结构域的核酸。
本公开还提供了一种宿主细胞，其包含一个或多个上述构建体。
还提供了编码任何CDR(H1、H2、H3、L1、L2或L3)、VH或VL结构域的核酸，以及制备编码产物的方法。所述方法包括从编码核酸表达编码产物。表达可通过在适当条件下培养含有核酸的重组宿主细胞来实现。通过表达产生后，可使用任何合适的技术分离和/或纯化VH或VL结构域或特异性结合成员，然后适当使用。
抗原结合片段、VH和/或VL结构域以及编码核酸分子和载体可从其自然环境中以基本上纯的或均质的形式分离和/或纯化，或者在核酸的情况下，不含或基本上不合除了编码具有所需功能的多肽的序列之外的核酸或起源基因。
在多种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是本领域中众所周知的。对于适合产生抗体的细胞，参见Gene Expression Systems，Academic Press，Fernandez等人编，1999。简而言之，合适的宿主细胞包括细菌、植物细胞、哺乳动物细胞以及酵母和杆状病毒系统。本领域可供用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼年仓鼠肾细胞、NSO小鼠骨髓瘤细胞和许多其他细胞。常见的细菌宿主为大肠杆菌。与本发明相容的任何蛋白质表达系统都可用于产生所公开的抗体。合适的表达系统包括描述于Gene Expression Systems，Academic Press，Fernandez等人编，1999中的转基因动物。
可选择或构建合适的载体，使得其包含适当的调控序列，包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其他适当的序列。适当时，载体可为质粒或病毒，例如噬菌体或噬菌粒。对于更多细节，参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。在CurrentProtocols in Molecular Biology，第2版，Ausubel等人编，John Wiley&Sons，1992中详细描述了许多已知技术和方案，用于例如，在制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达以及蛋白质分析中操纵核酸。
本公开的另一方面提供了一种宿主细胞，其包含如此处所公开的核酸。另一方面提供了一种方法，其包括将此种核酸引入宿主细胞中。引入可采用任何可用的技术。对于真核细胞，合适的技术可包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录病毒或其他病毒(例如牛痘或对于昆虫细胞为杆状病毒)的转导。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。将核酸引入细胞中之后，可引起或允许从核酸表达，例如，通过在表达基因的条件下培养宿主细胞。
使用方法
所公开的抗KLRG1抗体能够调节KLRG1相关的免疫应答调节。在特定的实施方案中，细胞毒性T细胞和NK细胞的激活是通过调节KLRG1信号传导来介导的。所公开的抗体可充当KLRG1的激动剂或拮抗剂，这取决于它们的使用方法。所述抗体可用于预防、诊断或治疗哺乳动物、特别是人的医学病症。本发明的抗体也可用于分离KLRG1或KLRG1表达细胞。此外，所述抗体可用于治疗处于病症风险或易患病症或患有与异常KLRG1表达或功能相关的病症的风险或易患所述病症或患有所述病症的受试者。
本发明的抗体可用于例如在某些类型的癌症和传染病中可能期望调节细胞毒性T细胞和NK细胞激活的情况。
当期望减弱的淋巴细胞激活时，本发明的抗KLRG1抗体可用作KLRG1的激动剂，以便增强KLRG1相关的细胞毒性(或CD8+)T细胞和NK细胞激活的衰减。
在某些情况下，可能期望引发或增强患者的免疫反应，以便治疗癌症或传染病。通过所公开的方法治疗或预防的疾病包括但不限于微生物(例如细菌)、病毒(例如全身性病毒感染诸如流感、病毒性皮肤病诸如疱疹或带状疱疹)或寄生虫的感染；以及癌症(例如，黑色素瘤和前列腺癌)。
抗KLRG1抗体对细胞毒性T细胞和NK细胞的激活增强T细胞和NK细胞反应。在此类情况下，抗体充当KLRG1的拮抗剂。因此，在一些实施方案中，抗体可用于抑制或减少与KLRG1相关的下调活性，即与细胞毒性T细胞和NK细胞激活的下调相关的活性。如实施例中所证实的，阻断KLRG1/E-钙粘蛋白与拮抗性抗KLRG1抗体的相互作用导致这些细胞的T细胞增殖反应和IFNγ分泌增强，这与细胞毒性T细胞和NK细胞中KLRG1途径的下调作用一致。在各种实施方案中，抗体以小于约50nM、并且更优选小于约40nM、30nM、20nM、10nM或5nM的IC50抑制E-钙粘蛋白与KLRG1的结合。E-钙粘蛋白结合的抑制可如实施例6中所述或使用本领域已知的技术来测量。
本发明的抗体或抗体组合物以治疗有效量施用。通常，治疗有效量可随受试者的年龄、状况和性别以及受试者的医学病状的严重性而变化。抗体的治疗有效量为约0.001mg/kg体重至约30mg/kg体重、优选约0.01mg/kg体重至约25mg/kg体重、约0.1mg/kg体重至约20mg/kg体重或约1mg/kg体重至约10mg/kg体重。可根据需要调整剂量，以适应所观察到的治疗效果。基于临床指征治疗医师选择合适的剂量。
抗体可以推注剂量给药，以在给药后的最大时间长度内最大化抗体的循环水平。推注剂量后还可使用连续输注。
免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)也可从患者中分离并用本发明的抗体离体孵育。在一些实施方案中，可通过从受试者去除免疫细胞，使免疫细胞在体外与本发明的抗KLRG1抗体接触来调节T细胞和NK细胞的激活。在此类实施方案中，抗KLRG1抗体可以多价形式使用，使得免疫细胞表面上的KLRG1分子在与此类抗体结合后变成“交联的”。例如，抗KLRG1抗体可结合至固体载体诸如珠粒，或通过第二抗体交联。然后可使用本领域已知的方法分离免疫细胞并将其重新植入患者体内。
在另一方面，本发明的抗体可用作靶向剂，用于将另一种治疗剂或细胞毒性剂(例如，毒素)递送至表达KLRG1的细胞。所述方法包括施用与治疗剂或细胞毒性剂偶联的抗KLRG1抗体，或在允许抗体与KLRG1结合的条件下施用。
本发明的抗体还可用于检测生物样品中KLRG1的存在。检测到的KLRG1的量可与KLRG1的表达水平相关，而KLRG1的表达水平又与受试者中免疫细胞(例如，激活的T细胞或NK细胞)的激活状态相关。
采用抗体的检测方法是本领域中众所周知的，并且包括例如ELISA、放射免疫测定、免疫印迹、蛋白质印迹、免疫荧光、免疫沉淀。可在结合了这些技术中的一种或多种以检测KLRG1的诊断试剂盒中提供抗体。此种试剂盒可含有其他组分、包装、说明书或其他材料，以帮助检测蛋白质。
当抗体用于诊断目的时，可能期望例如用配体基团(诸如生物素)或可检测的标记基团(诸如荧光基团、放射性同位素或酶)来修饰它们。若需要，可使用常规技术标记本发明的抗体。合适的可检测标记包括例如，荧光团、发色团、放射性原子、电子致密试剂、酶和具有特异性结合伴侣的配体。酶通常通过它们的活性来检测。例如，辣根过氧化物酶可通过其将四甲基联苯胺(TMB)转化为蓝色颜料的能力来检测，所述能力可用分光光度计定量。对于检测，合适的结合伴侣包括但不限于生物素和亲和素或链霉亲和素、IgG和蛋白A以及本领域中已知的众多受体-配体对。对于本领域普通技术人员而言，其他排列和可能性将是显而易见的，并且被视为本发明范围内的等效物。
本发明的抗体可用于筛选方法中以鉴定作为治疗剂有效的KLRG1途径抑制剂。在此种筛选测定中，通过将KLRG1和本发明的抗体组合形成第一结合混合物；并测量第一结合混合物中的结合量(M0)。还通过将KLRG1、抗体和待筛选的化合物或剂组合形成第二结合混合物，并测量第二结合混合物中的结合量(M1)。如实施例所示，待测试的化合物可为另一种抗KLRG1抗体。然后例如通过计算M1/M0比，比较第一结合混合物和第二结合混合物中的结合量。如果观察到与第一结合混合物相比第二结合混合物中的结合减少，则认为所述化合物或剂能够调节KLRG1相关的免疫反应下调。结合混合物的配制和最优化在本领域技术水平内，此类结合混合物还可含有增强或优化结合所必需的缓冲液和盐，并且另外的对照测定可包括在本发明的筛选测定中。因此，可鉴定据发现将KLRG1抗体结合降低至少约10％(即，M1/M0＜0.9)，优选大于约30％的化合物，并且然后，若需要，在如下所述的其他测定或动物模型中针对改善病症的能力进行二次筛选。KLRG1与抗体之间的结合强度可使用例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、基于表面等离激元共振的技术(例如，Biacore)来测量，所有技术都是本领域中众所周知的技术。
然后可如实施例中所述在体外或在动物模型中测试化合物。例如根据动物试验确定初步剂量，并且根据本领域公认的惯例进行人施用的剂量缩放。毒性和治疗功效可通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定。由细胞培养测定或动物研究获得的数据可在配制用于人的剂量范围中使用。可使用本领域中已知的转化因子将在一种动物模型中获得的治疗有效剂量转化为用于另一种动物，包括人(参见例如，Freireich等人(1966)Cancer Chemother.Reports，50(4)：219-244)。
药物组合物和施用方法
本公开提供了包含抗KLRG1抗体的组合物。此类组合物可适于药物用途和施用于患者。组合物通常包含本发明的一种或多种抗体和药学上可接受的赋形剂。短语“药学上可接受的赋形剂”包括可与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。用于药物活性物质的此类介质和剂的使用是本领域中众所周知的。组合物也可含有提供补充的、另外的或增强的治疗功能的其他活性化合物。药物组合物也可与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。
本发明的药物组合物被配制成与其预期的施用途径相容。完成施用的方法是本领域普通技术人员已知的。施用可为例如静脉内、腹膜内、肌内、腔内、皮下或经皮施用。也可能获得可局部或口服施用或可能能够跨粘膜传输的组合物。
用于皮内或皮下应用的溶液或悬浮液通常包含以下组分中的一种或多种：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的剂，诸如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱，诸如盐酸或氢氧化钠调节pH。此类制剂可封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合注射的药物组合物包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、CremophorEL(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须为无菌的且应当为易于注射的流体。组合物在制造和储存条件下应当稳定且必须在贮存中防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现防止微生物作用。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如糖；多元醇诸如甘露糖醇、山梨糖醇和氯化钠。载剂可为溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣、通过在分散体的情况下保持所需的颗粒大小和/或通过使用表面活性剂，可保持适当的流动性。可通过在组合物中包含例如单硬脂酸铝和明胶的延长吸收的剂来实现可注射组合物的延长吸收。
口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载剂。它们可封装在明胶胶囊中或压成片剂。对于口服施用，可将抗体与赋形剂组合并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。药学上相容的结合剂和/或佐剂材料可作为组合物的一部分包括在内。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有以下成分中的任一种或性质相似的化合物；粘合剂，诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖；崩解剂，诸如海藻酸、普利莫吉尔(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁或斯特罗特斯(Sterotes)；助流剂，诸如胶体二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或调味剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙调味剂。
全身施用也可通过经粘膜或经皮方式进行。对于经粘膜或经皮施用，在制剂中使用适于要渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂通常在本领域中是已知的，并且包括例如洗涤剂、胆盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可例如通过使用锭剂、鼻喷雾剂、吸入剂或栓剂来完成；例如，在包含Fc部分的抗体的情况下，组合物可能能够跨肠、口或肺中的粘膜传输(例如，通过如美国专利号6,030,613中所述的FcRn受体介导的途径)。对于经皮施用，可将活性化合物配制成软膏、药膏、凝胶或乳剂，如本领域通常已知的。对于吸入施用，抗体可以气溶胶喷雾的形式从含有合适推进剂(例如气体，诸如二氧化碳)的加压容器或分配器、或喷雾器中递送。
在某些实施方案中，将目前公开的抗体与防止化合物从体内快速消除的载剂一起制备，诸如包含植入物和微囊化递送系统的控释制剂。可使用生物可降解、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酯和聚乳酸。此类制剂的制备方法对本领域技术人员而言是显而易见的。含有目前公开的抗体的脂质体悬浮液也可用作药学上可接受的载剂。这些可根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如，如美国专利号4,522,811中所述。
以易于施用和实现剂量均匀性的单位剂量形式配制口服或肠胃外组合物可以是有利的。如本文所用，术语“剂量单位形式”是指适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理上离散单位；每个单位含有经计算可与所需药物载剂结合产生期望治疗效果的预定量的活性化合物。
本发明的组合物的毒性和治疗功效可通过细胞培养物或实验动物中例如用于确定LD50(50％群体致死剂量)和ED50(50％群体有效治疗剂量)的标准药物程序来确定。毒性作用与治疗作用之间的剂量比为治疗指数并且它可表示为LD50/ED50比。表现出高治疗指数的组合物为优选的。
对于本发明中使用的任何组合物，治疗有效剂量最初可由细胞培养测定来估计。合适的生物测定的实例包括DNA复制测定、细胞因子释放测定、基于转录的测定、KLRG1/钙粘蛋白结合测定、免疫学测定、例如描述于实施例中的其他测定。由细胞培养测定和动物研究获得的数据可在配制用于人的剂量范围中使用。可在动物模型中配制剂量来实现包括IC50(即，实现症状的半最大抑制的抗体浓度)的循环血浆浓度范围。可例如通过高效液相色谱法测量血浆中的循环水平。可通过合适的生物测定来监测任何特定剂量的作用。剂量优选处于具有极小或无毒性的循环浓度的范围内。剂量可取决于所采用的剂型和所利用的施用途径而变化。
以下实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域普通技术人员将认识到，可在不改变本发明的精神或范围的情况下进行多种修改和变化。此类修改和变化涵盖在本发明的范围内。本申请引用的所有参考、专利和公开的专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。
实施例
实施例1：重组蛋白的产生
重组蛋白通过标准分子克隆产生，并且表达方案包括人KLRG1 ECD(SEQ ID NO：89)、食蟹猴KLRG1 ECD(SEQ ID NO：90)和人E-钙粘蛋白(SEQ ID NO：91)，其氨基酸序列如下表6所示。重组蛋白通过将相应的cDNA克隆到pCDNA4载体(Invitrogen)中并在哺乳动物HEK293中进行瞬时转染，以FC融合蛋白或HIS加标形式产生。所表达的蛋白质的纯化通过对于FC融合蛋白形式使用蛋白A亲和树脂且对于HIS加标蛋白使用镍-NTA树脂的色谱法进行。所有纯化的蛋白质均通过SDS-PAGE电泳进行表征，以验证纯度和分子量。
表6：人和食蟹猴KLRG1 ECD和人E-钙粘蛋白的氨基酸序列
开发了稳定的细胞系作为免疫抗原以测试抗体与全长抗原的结合，并作为在功能性T细胞测定中的靶细胞。开发的细胞系包括表达全长人KLRG1的CHO和表达全长食蟹猴KLRG1的CHO。通过用编码感兴趣的蛋白质的pCDNA4质粒转染CHO细胞来获得稳定的细胞系。转染后，将细胞暴露于500ug/ml的G418以选择稳定整合的质粒。将细胞系通过FACS进一步针对表达进行表征，并分类以选择均质和稳定的表达。
用CD3激动剂和E-钙粘蛋白双重转染的稳定CHO细胞在功能测定使用，用于证明对人T细胞中KLRG1的阻断作用。CD3激动剂和E-钙粘蛋白的共表达通过使用适当抗体的二色FACS进行验证。
实施例2：抗KLRG1抗体的产生
抗体ABC_HG1N01、ABC_HG1N02和ABC_HG1N07是针对KLRG1的细胞外结构域的人源化IgG1抗体。通过用人和食蟹猴KLRG1对雌性BALB/c小鼠和SJL小鼠进行标准免疫，随后进行杂交瘤筛选，产生针对人KLRG1的小鼠单克隆抗体(MAB)。已经采用了几种免疫策略来产生各种抗体命中。简而言之，用cDNA、重组抗原或表达感兴趣的抗原的CHO细胞对SJL和Balb/c小鼠进行重复免疫。抗原特异性抗体的滴度通过ELISA进行定期监测，并且当达到适当的滴度(通常在1∶1000与1∶10000稀释因子之间)时处死动物。将来自处死小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞，然后进行培养并将其亚克隆成单细胞。将稳定的克隆扩大规模并收获条件培养基，并且通过ELISA和FACS测试抗KLRG1抗体的表达。
实施例3：抗KLRG1阻断抗体的选择
针对与人KLRG1 ECD和食蟹猴KRG1 ECD的结合对杂交瘤产生的抗体进行筛选。选择在两种抗原之间具有交叉反应性的抗体进入下一筛选阶段，以确定它们中和KLRG1与E-钙粘蛋白之间相互作用的能力。根据抗体与人和食蟹猴(cyno)KLRG1的结合EC50对抗体进行排名，并在E-钙粘蛋白竞争测定中根据其IC50进行进一步排序。根据这些标准，总共选择48种抗体。优先在基于细胞的测定中对八种抗体进行功能表征。表3总结了所选择的8种小鼠抗体的可变区氨基酸序列，并且表4示出了所选择的8种小鼠抗体的CDR区。根据表7中概述的序列责任(liability)基序的存在，对抗体进行进一步排名。在ABC_G1N01和ABC_G1N02的CDR-L1中发现了脱酰胺位点(NG)，这可能影响药物材料的稳定性、可制造性和活性。为了去除这种潜在的责任，构建并测试了一系列突变体。具体地，NG基序可被NA、QG和KG序列取代，而不失去结合。可通过将CDR区移植到人框架中来使小鼠抗体人源化。表1示出了ABC_G1N01(ABC_HG1N01)、ABC_G1N02(ABC_HG1N02)和ABC_G1N07(ABC_HG1N07)的人源化构建体的可变区序列的实例。此外，可对CDR区进行保守性突变以改善亲和力、效力或生物物理特征。表5总结了可对CDR区进行的保守性突变的列表。根据单克隆抗体相互竞争的能力，对它们进行表位分仓。发现可将抗体分为3个不同的仓；BIN1包括：ABC_G1N01、ABC_G1N02、ABC_G1N03、ABC_G1N04、ABC_G1N05。BIN2包括：MAB25、MAB031。BIN3包括：ABC_G1N07、ABC_G1N08。通过将可变小鼠区克隆到人IgG恒定框架上来产生嵌合形式的抗体，并在功能测定中测试以确定它们对人T细胞的功能活性，如本文中所述。
表7：用于针对潜在的可制造性问题对抗体进行筛选的序列责任基序
实施例4：通过FACS表征抗体与KLRG1的结合(EC50)和对KLRG1/E-钙粘蛋白相互作用的抑制(IC50)
通过FACS进行抗KLRG1单克隆抗体与细胞表达的人和食蟹猴KLRG1的结合。稳定转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞以表达全长人KLRG1(CHO-人-KLRG1)和食蟹猴KLRG1(CHO-食蟹猴-KLRG1)。通过在1-100nM的浓度范围内孵育各种浓度的抗KLRG1单克隆抗体，并使用与荧光探针直接缀合的抗小鼠检测抗体测量经标记细胞的荧光，确定EC50值。
通过FACS测量单克隆抗体抑制E-钙粘蛋白/KLRG1结合的能力。E-钙粘蛋白与CHO-hKLRG1细胞的结合首先是通过将KLRG1表达细胞与不同浓度的HIS加标的重组E-钙粘蛋白一起孵育，并且使用抗HIS检测抗体通过FACS检测来确定的。通过此方法确定E-钙粘蛋白/KLRG1相互作用的EC50为1μM。通过随着从0.1nM至100nM改变单克隆抗体的浓度监测E-钙粘蛋白结合的损失来确定每种单克隆抗体的IC50值。使用SigmaPlot软件计算EC50和IC50值，并总结于表8中。
表8：通过FACS测量的MAB的结合EC50和E-钙粘蛋白抑制IC50。
实施例5：结合动力学的测量
人源化抗体对人和食蟹猴KLRG1的结合动力学通过
测量来确定。
系统使用生物层干涉(BLI)技术直接实时监测蛋白质和其他生物分子与其伙伴的结合，从而提供动力学结合常数的分析。参见https：//www.fortebio.com/bli- technology.html，其内容(包括与其关联的所有链接和子链接)以引用的方式整体并入本文。实验设置包括将生物素化重组抗原(人-KLRG-ECD或食蟹猴-KLRG1-ECD)固定在的链霉亲和素
传感器上，以产生加载抗原的传感器。经加载的传感器在
仪器中暴露于100nM至0.1nM的不同浓度的每种人源化抗体，并收集600秒的数据以测量抗体/抗原复合物的缔合动力学(Kon)。在接下来的步骤中，将传感器暴露于不合抗体的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲溶液中600秒，以观察解离动力学(Koff)。然后使用
分析软件将所得的数据拟合到1∶1结合动力学模型，以计算KD。表9中总结了通过此方法得到的三种人源化抗体的动力学结合参数。
表9：通过
测量所选择的MAB的结合亲和力：
实施例6：KLRG1阻断抗体的功能活性的表征
通过测量抗体介导的KLRG1信号传导阻断对IFNγ产生和对T细胞增殖(增殖指数)的影响，阻断KLRG1与其配体的相互作用对人CD8+ T细胞具有激活作用。为了证明KLRG1阻断对免疫系统细胞的作用，从健康供体中分离出CD8+ T细胞，并与共表达CD3激动剂和E-钙粘蛋白的CHO细胞系(eAPC)进行共培养测试。测定通过向T细胞提供2种竞争信号来运行，其中CD3刺激被E-钙粘蛋白的抑制作用抵消。当KLRG1信号传导被抗KLRG1抗体阻断时，抑制信号被破坏，并且T细胞根据其与细胞表面上表达的CD3激动剂的相互作用而被激活。通过ELISA测量IFNγ分泌，并且结果总结在表10和图1中。
表10：KLRG1阻断抗体在人CD8+ T细胞中对IFNγ释放的恢复
此数据表明E-钙粘蛋白对人T细胞具有抑制作用，所述抑制作用可通过用阻断抗体阻断KLRG1信号传导来逆转。
表11和图2中呈现的数据表明，通过测量响应于eAPC的增殖指数，阻断KLRG1/E-钙粘蛋白相互作用导致人CD8+ T细胞的增殖。在此测定中，通过用h-E钙粘蛋白和CD3激动剂稳定转导CHO细胞来产生eAPC。然后将由此产生的eAPC与来自健康志愿者的新鲜分离的CD8+ T细胞在10微克/毫升测试抗体或同种型对照存在下共孵育3天。通过将CD8+ T细胞与稳定表达抗CD3但缺乏抑制性配体E-钙粘蛋白表达的CHO细胞一起孵育来制备阳性对照样品，从而使CHO细胞上表达的抗CD3不受抑制地刺激CD8+ T细胞。结果显示，CD8+ T细胞如预期那样响应于CD3刺激而增殖，并且eAPC上的抑制性配体E-钙粘蛋白共表达抑制了CD8+ T细胞的增殖。此外，可通过中和抗体阻断KLRG1来恢复CD8+ T细胞的增殖。
表11：KLRG1阻断对CD8+ T细胞增殖的影响
表12和图3中呈现的数据显示了抗KLRG1中和剂抗体在IFNγ分泌测定中的T细胞活性与抗体的阻断活性之间的相关性。每种抗体的IC50值均来自E-钙粘蛋白结合抑制研究，并针对在CD8+ T细胞IFNγ释放测定中测得的IFNγ产生水平作图。相关性显示，具有较低IC50值的抗体(例如，更有效的KLRG1/E-钙粘蛋白结合阻断剂)导致CD8+ T细胞的更高水平的IFNγ释放。此数据表明，抗体阻断KLRG1导致T细胞活性以E-钙粘蛋白依赖性方式恢复。
表12：E-钙粘蛋白IC50竞争值与IFNγ分泌之间的相关性
| mAb | IFNγ(pg/ml) | IC50(nM) |
| ABC_G1N07 | 1512.76 | 4.21 |
| ABC_G1N02 | 1484.66 | 9.6 |
| ABC_G1N01 | 1365.7 | 5 |
| MAB034 | 1201.44 | 11.2 |
| MAB024 | 1129.8 | 15.4 |
| ABC_G1N05 | 1082.62 | 12.3 |
| ABC_G1N08 | 1047.75 | 23 |
| MAB036 | 1038.52 | 10 |
| MAB031 | 975.34 | 18 |
| 同种型 | 799.27 | 390 |
Claims (31)
1.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含如以下中列出的氨基酸序列：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：49、SEQ IDNO：55、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：85。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体特异性结合人杀伤细胞凝集素样受体亚家族G成员1(KLRG1)的细胞外结构域和食蟹猴KLRG1的细胞外结构域。
3.如权利要求1所述的抗体，所述抗体包含基本上如以下中列出的氨基酸序列：SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：40。
4.如权利要求1所述的抗体，所述抗体包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40。
5.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体特异性结合与选自由SEQ ID NO：89和SEQID NO：90组成的组中的至少一个序列的至少100个连续氨基酸的任何序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的抗体，其中所述抗体特异性结合KLRG1的细胞外结构域，其亲和力以KD表示为至少约2nM、约1nM、约100pM、约10pM或约5pM。
7.如权利要求5所述的抗体，其中所述抗体抑制E-钙粘蛋白与KLGR1的结合，其IC50小于约50nM、40nM、30nM、20nM或10nM。
8.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体为人源化的。
9.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体为IgG1或IgG4。
10.如权利要求9所述的抗体，其中所述抗体为IgG1λ或IgG1κ。
11.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体为ABC_HG1N01、ABC_HG1N02、ABC_HG1N07、ABC_G1N01、ABC_G1N02、ABC_G1N03、ABC_G1N04、ABC_G1N05、ABC_G1N06、ABC_G1N07或ABC_G1N08。
12.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1所述的抗体和药学上可接受的载剂。
13.一种治疗方法，所述方法包括施用有效剂量的如权利要求12所述的药物组合物。
14.如权利要求13所述的方法，其中将所述药物组合物施用于需要治疗或预防癌症或传染病的受试者。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述受试者为人。
16.一种包含人框架区的抗体，其中所述抗体特异性结合KLRG1，并且其中所述抗体能够阻断人或食蟹猴KLRG1与E-钙粘蛋白之间的结合。
17.如权利要求16所述的抗体，其中所述抗体包含衍生自以下的CDR：ABC_HG1N01、ABC_HG1N02、ABC_HG1N07、ABC_G1N01、ABC_G1N02、ABC_G1N03、ABC_G1N04、ABC_G1N05、ABC_G1N06、ABC_G1N07或ABC_G1N08。
18.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码如权利要求1所述的抗体。
19.一种表达载体，所述表达载体包含如权利要求18所述的核酸。
20.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求19所述的载体。
21.如权利要求20所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自：大肠杆菌细菌、中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞和NSO细胞。
22.如权利要求18所述的核酸，其中所述核酸编码以下中列出的氨基酸序列：SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：40。
23.一种与人和食蟹猴KLRG1的细胞外结构域特异性结合的抗体或其片段的制备方法，所述方法包括：
(a)提供编码可变结构域的核酸的起始库，所述可变结构域包含要替代的CDR3或缺少CDR3编码区；
(b)将所述库与编码基本上如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：73、SEQ IDNO：79或SEQ ID NO：85中列出的氨基酸序列的供体核酸组合，使得所述供体核酸被插入所述库中的CDR3区中，以便提供编码可变结构域的核酸的产物库；
(c)表达所述产物库的核酸；
(d)从步骤(c)中选择编码可变结构域或其片段的核酸，所述可变结构域或其片段特异性结合人和食蟹猴KLRG1的所述细胞外结构域；以及
(e)回收(d)的所述可变结构域或其片段、或编码所述可变结构域或其片段的核酸。
24.一种抗体，所述抗体通过如权利要求23所述的方法产生。
25.一种调节CD8+T细胞和NK细胞激活的方法，所述方法包括使淋巴细胞与抗KLRG1抗体或其片段接触。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述淋巴细胞为T细胞或NK细胞。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述抗体如权利要求1所述。
28.如权利要求25所述的方法，其中所述抗体如权利要求24所述。
29.如权利要求25所述的方法，其中所述抗KLRG1抗体调节CD8+T和NK激活并抑制E-钙粘蛋白与人和食蟹猴KLGR1的结合。
30.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与如权利要求1所述的抗体交叉竞争。
31.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的抗体。
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