KR20210060477A - 항-klrg1 항체 - Google Patents

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KR20210060477A
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스테파노 브이. 굴라
케니스 에반 톰슨
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압큐로, 인크.
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Abstract

본 발명은 살해 세포 렉틴-유사 수용체 G1 (KLRG1)에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 이러한 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 암 치료를 포함한 다양한 치료 또는 진단 목적에 유용하고 백신의 효과를 증가시킨다.

Description

항-KLRG1 항체
기술 분야
본 기술 분야는 림프구 공동-억제 수용체 살해 세포 렉틴-유사 수용체 서브패밀리 G 멤버 1 (KLRG1)의 억제에 관한 것이다.
배경
림프구 공동-억제 수용체는 T 세포 수용체 (TCR)에 결합하는 주조직 적합성 복합체 (MHC)와 관련하여 항원 펩티드와 같은 활성화 신호에 반응하여 적응 면역계, 예를 들어, T 세포 및 NK 세포의 작용을 조절한다. 공동-억제 수용체에는 PD-1, LAG-3, TIM-3 및 CTLA4가 포함된다. 공동-억제 수용체의 작용은 일반적으로 리간드를 공동-억제 수용체의 세포외 도메인에 결합시킨 다음, 공동-억제 수용체의 세포내 도메인에 위치한 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM)에 의해 세포내 포스파타제를 동원함으로써 수행된다. 공동-억제 수용체의 작용은 일반적으로 TCR 관여 면역 반응을 약화시키는 것이다. 최근에는 공동-억제 수용체의 활성을 차단하는 제제가 암과 전염병에 효과적인 치료제로 사용될 수 있음이 밝혀졌다.
살해 세포 렉틴-유사 수용체 G1 (KLRG1)은 T 및 NK 세포의 활성을 조절하여 공동-억제 수용체로 작용하는 II형 막관통 단백질이다. 이의 세포외 부분은 알려진 리간드가 캐드헤린(cadherins)인 C-타입 렉틴 도메인을 포함하고, 세포내 부분은 T 세포 수용체 (TCR) 매개 신호전달의 공동-억제를 담당하는 면역 수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM) 도메인을 포함한다. KLRG1 리간드는 E-캐드헤린, N-캐드헤린, R-캐드헤린, 또는 이들의 조합일 수 있다.
수용체 살해 세포 렉틴-유사 수용체 G1 (KLRG1)은 상피 및 중간엽 세포 상의 리간드에 결합하며 T 및 NK 세포에서 발현된다. KLRG1에 대한 리간드는 E-캐드헤린, N-캐드헤린 및 R-캐드헤린인 것으로 기재된 바 있다.
인간에서 KLRG1 발현은 면역계의 세포 그리고 특히 CD8 양성 T 세포, NK 세포에 그리고 그보다 낮은 정도로 CD4 양성 T 세포에 한정된다. KLRG1 발현은 후기 분화 표현형과 관련되어 있다. 항원 특이적 T 세포가 분화함에 따라 이들은 세포독성 분자의 발현이 증가되고 그리하여 세포독성 잠재력이 증가한다. KLRG1의 생물학적 기능은 이러한 T 세포의 세포독성과 증식을 억제하는 것이다. 암 및 전염병에서 T 세포 활성을 회복시키는 것이 유익한 것으로 나타났다.
일반적으로 암이나 전염병에 대한 안전하고 효과적인 치료 방법을 제공할 필요가 있다. 이러한 장애와 관련된 세포독성 (또는 CD8+) T 및 NK 세포 활성화의 조절은 KLRG1 경로의 조작에 의해 달성 될 수 있다.
요약
본 발명은 KLRG1의 세포외 도메인 (ECD)에 결합하고 리간드 E-캐드헤린, N-캐드헤린 및 R-캐드헤린과의 상호작용을 억제하는 새로운 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 특성화를 제공한다. 본원에 기재된 항체는 마우스 하이브리도마 기술에 의해 유도되었으며, 인간 프레임워크에 상보성 결정 영역 (CDR)을 이식하여 인간화될 수 있다. 본 발명은 또한 CD8+ 세포독성 T 및 NK 세포를 조절 (예를 들어, 활성화)하고 KLRG1과 그의 리간드 사이의 상호작용을 조절 (예를 들어, 중화)함으로써 이를 수행하는 항체 또는 결합 단편을 제공한다. 본원에 기재된 항체는 단일요법으로 또는 다른 면역요법제 (가령, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체 또는 항-CTLA4 항체)와 조합하여 또는 화학요법제 또는 암 백신과 조합하여 암 치료를 위한 효과적인 치료제로서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 항체는 감염성 질환에 대한 효과적인 치료제로 사용되거나 또는 감염성 질환에 대한 백신의 효과를 향상시키는데 사용될 수 있다.
항체의 비제한적인 예시적 구체예는 ABC_HG1N01, ABC_HG1N02, ABC_HG1N07, ABC_G1N01, ABC_G1N02, ABC_G1N03, ABC_G1N04, ABC_G1N05, ABC_G1N06, ABC_G1N07, 또는 ABC_G1N08로 지칭된다. 다른 구체예는 ABC_HG1N01, ABC_HG1N02, ABC_HG1N07, ABC_G1N01, ABC_G1N02, ABC_G1N03, ABC_G1N04, ABC_G1N05, ABC_G1N06, ABC_G1N07, 또는 ABC_G1N08의 Fv 단편의 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다. 추가 구체예들은 임의의 이들 VH 및 VL 도메인의 하나 이상의 CDR을 포함한다. 다른 구체예는 ABC_HG1N01, ABC_HG1N02, ABC_HG1N07, ABC_G1N01, ABC_G1N02, ABC_G1N03, ABC_G1N04, ABC_G1N05, ABC_G1N06, ABC_G1N07, 및 ABC_G1N08의 VH 도메인의 H3 단편을 포함한다.
본 발명은 또한 KLRG1 항체를 포함하는 조성물, 및 인간 또는 동물을 치료하는 방법을 포함하는 면역 반응을 조절하는 방법에서의 이들의 용도를 제공한다. 특정 구체예에서, 항-KLRG1 항체는 CD8+ 세포독성 T 및 NK 세포를 활성화함으로써 암을 치료하거나 예방하는데 사용된다. 본 발명의 조성물을 사용한 치료에 민감한 장애는 암 및 감염성 질환을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
추가로, 항-KLRG1 항체는 생물학적 샘플에서 KLRG1 또는 그 단편을 검출하기 위해 진단적으로 사용될 수 있다. 검출된 KLRG1의 양은 KLRG1의 발현 수준과 상관 될 수 있으며, 이는 차례로 대상체에서 림프구 (예를 들어, 세포독성 T 세포 또는 자연 살해 세포)의 활성화 상태와 상관된다.
본 발명은 또한 ABC_HG1N01, ABC_HG1N02, ABC_HG1N07, ABC_G1N01, ABC_G1N02, ABC_G1N03, ABC_G1N04, ABC_G1N05, ABC_G1N06, ABC_G1N07, 및 ABC_G1N08의 Fv 단편의 VH 또는 VL 도메인을 인코딩하는 서열을 포함하는, 단리된 핵산을 제공한다. 또한, 현재 개시된 VH 및 VL 도메인 중 임의의 것으로부터 하나 이상의 CDR을 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산이 제공된다. 본 발명은 또한 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 추가로 ABC_HG1N01, ABC_HG1N02, ABC_HG1N07, ABC_G1N01, ABC_G1N02, ABC_G1N03, ABC_G1N04, ABC_G1N05, ABC_G1N06, ABC_G1N07, 및 ABC_G1N08의 VH 또는 VL 도메인으로부터 유래한 도메인 모두 또는 일부를 포함하는 새로운 VH 또는 VL 도메인 및/또는 기능적 항체의 제조 방법을 제공한다.
추가적인 양상들은 하기 상세한 설명의 일부분에 설명될 것이며, 일부는 상세한 설명으로부터 자명할 것이며, 또는 본 발명의 실시에 의해 알 수 있을 것이다. 본 발명은 첨부된 청구범위에 제시되고 구체적으로 개시되며, 본 명세서는 어떠한 식으로든 청구범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 하기 상세한 설명은 본 발명의 다양한 구체예들의 예시적 설명을 포함하며, 이들은 청구범위와 같이 본 발명을 제한하는 것이 아니다. 첨부된 도면은 본 명세서의 일부를 구성하고, 상세한 설명과 함께 단지 다양한 실시 예를 예시하는 역할을 하며 본 발명을 제한하지 않는다. 참고 문헌의 인용은 이러한 참고 문헌이 본 발명의 선행 기술이라는 것을 인정하는 것이 아니다.
도 1은 항-KLRG1 항체가 CD8+ 인간 T 세포를 활성화한다는 것을 입증하는 인터페론-감마 (IFNγ) 분비 분석의 결과를 보여준다.
도 2는 항-KLRG1 항체가 CD8+ T 세포의 증식을 유도함을 입증하는 CD8+ T 세포 증식 분석의 결과를 보여준다.
도 3은 항-KLRG1 항체로 처리된 CD8+ T 세포에서의 IFNγ분비 분석 결과와 항체의 차단 활성 (IC50으로 표시) 사이의 관계를 보여준다.
상세한 설명
정의
본 명세서에서 사용된 용어 “항체”는 면역글로불린 또는 이의 단편 또는 유도체를 지칭하고, 시험관내 또는 생체내 생성 여부에 관계없이 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 이 용어는 다클론, 단일클론, 단일특이적, 다중특이적, 비특이적, 인간화, 단쇄, 키메라, 합성, 재조합, 하이브리드, 돌연변이 및 이식된 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 “온전한 항체”에서와 같이 용어 “온전한”에 의해 달리 변형되지 않는 한, 용어 “항체”는 또한 항원-결합 기능, 즉, KLRG1에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편, 가령, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, 및 기타 항체 단편들을 포함한다. 전형적으로, 이러한 단편들은 항원-결합 도메인을 포함할 것이다.
용어 “항원-결합 도메인”, “항원-결합 단편”및 “결합 단편”은 항체와 항원 사이의 특이적 결합을 담당하는 아미노산을 포함하는 항체 분자의 일부를 지칭한다. 항원이 큰 경우 항원-결합 도메인은 항원의 일부에만 결합 할 수 있다. 항원-결합 도메인과의 특이적 상호작용을 담당하는 항원 분자의 일부는 “에피토프” 또는 “항원 결정인자”로 지칭된다.
항원-결합 도메인은 전형적으로 항체 경쇄 가변 영역 (VL) 및 항체 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함하지만, 반드시 둘 다 포함 할 필요는 없다. 예를 들어, 소위 Fd 항체 단편은 VH 도메인으로만 구성되지만 여전히 온전한 항체의 일부 항원-결합 기능을 보유한다.
용어 “레퍼토리”는 발현된 면역글로불린을 인코딩하는 서열로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유래된 유전적으로 다양한 뉴클레오티드 집합을 지칭한다. 서열들은, 예를 들어 H 사슬의 경우 V, D 및 J 세그먼트 및 예를 들어, L 사슬의 경우 V 및 J 세그먼트의 생체내 재배열에 의해 생성된다. 대안적으로, 서열은 재배열이 발생하는 것에 반응하여 시험관내 자극에 의해 세포주로부터 생성될 수 있다. 대안적으로, 서열의 일부 또는 전부는, 예를 들어, 뉴클레오티드 합성, 무작위 돌연변이유발, 및 예를 들어 미국 특허 제 5,565,332호에 개시된 다른 방법에 의해, 예를 들어, 재배열되지 않은 V 세그먼트를 D 및 J 세그먼트와 조합함으로써 수득 될 수 있다.
용어 “특이적 상호작용” 및 “특이적 결합”은 생리학적 조건하에서 비교적 안정한 복합체를 형성하는 두 분자를 지칭한다. 특이적 결합은 높은 친화성 그리고 낮은 내지 보통의 용량으로 특징되는데, 이는 통상적으로 낮은 친화성 그리고 보통 내지 높은 용량을 가지는 비특이적 결합과 구별된다. 일반적으로, 결합은 친화도 상수 KA가 106 M-1 보다 높은 경우 또는 보다 바람직하게는 108 M-1 보다 높은 경우 특이적인 것으로 간주된다. 필요한 경우, 결합 조건을 변경하여 특이적 결합에 실질적으로 영향을 주지 않고 비특이적 결합을 감소시킬 수 있다. 항체 농도, 용액의 이온 강도, 온도, 결합 허용 시간, 차단제 (예컨대, 혈청 알부민, 우유 카제인)의 농도 등과 같은 적절한 결합 조건은 일반적인 기술을 사용하여 당업자에 의해 최적화 될 수 있다.
“실질적으로 제시된”라는 문구는 본 발명의 관련 CDR, VH, 또는 VL 도메인이 그 서열이 제시되어 있는 특정 영역들 (예컨대, CDR)에서 동일하거나 또는 비실질적인 차이만을 가짐을 의미한다. 비실질적인 차이는 미세한 아미노산 변화, 가령, 특정된 영역의 서열에서 임의의 5개 아미노산 중 1 또는 2개의 치환을 포함한다.
용어 “KLRG1 활성”은 KLRG1과 관련된 하나 이상의 림프구 공동-억제 활성을 지칭한다. 예를 들어, KLRG1 활성은 세포독성 T 및 NK 세포 활성화의 조절을 의미 할 수 있다.
용어 “조절하다” 및 이의 동의어는 항-KLRG1 항체와의 상호작용으로 인한, T 세포 및 NK 세포의 활성화와 관련된 KLRG1의 활성의 감소 또는 증가를 지칭하며, 여기서 감소 또는 증가는 동일한 항체의 부재시 KLRG1의 활성에 상대적이다. 활성의 감소 또는 증가는 바람직하게는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상이다. KLRG1 활성이 감소 될 때, 용어 “조절” 및 “조절하다”는 용어 “억제” 및 “억제하다”와 호환적이다. KLRG1 활성이 증가 될 때, 용어 “조절” 및 “조절하다”는 용어 “활성화” 및 “활성화하다”와 호환적이다. KLRG1의 활성은 실시예 6에 기재된 바와 같이 T 세포 및 NK 세포 활성화 분석을 사용하여 정량적으로 결정될 수 있다.
용어 “치료” 및 “치료 방법”은 치료적 치료 및 예방적/예방 조치 둘 다를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 사람은 이미 특정 의학적 장애를 앓고 있는 개체, 뿐만 아니라 궁극적으로 이러한 장애를 앓을 수 있는 사람 (즉, 예방 조치가 필요한 사람)을 포함 할 수 있다.
용어 “유효량”은 KLRG1의 활성을 감소시켜 환자의 증상을 개선시키거나 원하는 생물학적 결과, 예컨대, KLRG1의 활성 감소, 림프구 공동-억제 반응의 조절, 세포독성 T 및 NK 세포의 활성화 증가, 또는 세포독성 T 세포 또는 NK 세포에 의한 IFNγ의 방출 증가를 구현하기에 충분한 용량 또는 양을 지칭한다.
용어 “분리된”은 자연 환경이 실질적으로 없는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 분리된 단백질은 그것이 유래된 세포 또는 조직 출처의 세포 물질 또는 다른 단백질이 실질적으로 없다. 용어 “분리된”은 또한 분리된 단백질이 약학 조성물로 투여하기에 충분히 순수한, 또는 적어도 70-80% (w/w) 순수한, 보다 바람직하게는 적어도 80-90% (w/w) 순수한, 훨씬 더 바람직하게는 90-95% 순수한; 그리고 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% (w/w) 순수한 제제를 지칭한다.
항-KLRG1 항체
본 발명은 새로운 항원-결합 단편을 포함하는 항-KLRG1 항체를 제공한다.
일반적으로, 항체는 예를 들어 전통적인 하이브리도마 기술 (Kohler 및 Milstein (1975) Nature, 256: 495-499), 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제 4,816,567) 또는 항체 라이브러리로 수행되는 파지 디스플레이 (Clackson 외. (1991) Nature, 352 : 624-628; Marks 외. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597)를 사용하여 만들 수 있다. 다른 항체 생산 기술에 대해서는 Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow 외의 문헌, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988을 참고하라. 본 발명은 임의의 특정 출처, 원료 종 또는 생산 방법에 제한되지 않는다.
면역글로불린으로도 알려진 무손상 항체는 일반적으로 각각 약 25kDa의 두 개의 경(L) 쇄 및 각각 약 50kDa의 두 개의 중 (H) 쇄로 구성된 사량체 글리코실화 단백질이다. λ사슬과 κ사슬로 지칭되는 두 가지 유형의 경쇄가 항체에서 발견된다. 중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 면역글로불린은 5가지 주요 분류: A, D, E, G, 및 M로 할당 될 수 있으며, 이들 중 몇 가지는 하위분류 (아이소형), 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 더욱 세분될 수 있다.
상이한 면역글로불린 분류의 하위단위 구조 및 삼차원 입체구조들은 해당 분야에 널리 공지되어 있다. 항체 구조에 대한 검토는 상기 Harlow 외의 문헌을 참고하라. 간단히 말해서, 각 경쇄는 N-말단 가변 도메인 (VL)과 불변 도메인 (CL)으로 구성된다. 각 중쇄는 N-말단 가변 도메인 (VH), 3개 또는 4개의 불변 도메인 (CH) 및 힌지 영역으로 구성된다. VH에 가장 가까운 CH 도메인은 CH1으로 지정된다. VH 및 VL 도메인은 프레임워크 영역 (FR1, FR2, FR3 및 FR4)이라고 하는 상대적으로 보존된 서열의 4개 영역으로 구성되며, 상보성 결정 영역 (CDR)이라고 하는 초가변 서열의 3개 영역에 대한 스캐폴드를 형성한다. CDR은 항원과의 특정 상호작용을 담당하는 대부분의 잔기를 포함한다. 세 개의 CDR을 CDR1, CDR2 및 CDR3이라고 한다. 따라서 중쇄의 CDR 구성 요소는 H1, H2 및 H3로 지칭되고 경쇄의 CDR 구성 요소는 L1, L2 및 L3로 지칭된다. CDR3 및 특히 H3는 항원-결합 도메인 내 분자 다양성의 가장 큰 원천이다. 예를 들면, H3는, 두 개의 아미노산 잔기만큼 짧거나 또는 26개 이상 일 수 있다.
Fab 단편 (단편 항원-결합)은 불변 영역들 사이의 이황화 결합에 의해 공유결합된 VH-CH1 및 VL-CL 도메인으로 구성된다. Fv에서 비공유결합된 VH 및 VL 도메인이 숙주 세포에서 공동-발현 될 때 해리되는 경향을 극복하기 위해 소위 단쇄 (sc) Fv 단편 (scFv)을 제작할 수 있다. scFv에서, 가요성이고 적절한 길이의 폴리펩티드는 VH의 C-말단을 VL의 N-말단에 연결하거나 VL의 C-말단을 VH의 N-말단에 연결한다. 가장 일반적으로, 15-잔기 (Gly4Ser)3 펩티드가 링커로 사용되지만 다른 링커도 당업계에 공지되어 있다.
항체 다양성은 가변 영역을 인코딩하는 여러 생식계열 유전자와 다양한 체세포 사건의 조합적 어셈블리의 결과이다. 체세포 사건은 완전한 VH 영역을 만들기 위한 다양성 (D) 및 결합 (J) 유전자 세그먼트를 갖는 가변 유전자 세그먼트의 재조합과 완전한 VL 영역을 만들기 위한 가변 및 결합 유전자 세그먼트의 재조합을 포함한다. 재조합 과정 자체는 부정확하여 V(D)J 접합시 아미노산의 손실 또는 추가가 발생한다. 이러한 다양성 메커니즘은 항원에 노출되기 전에 발달중인 B 세포에서 발생한다. 항원 자극 후 B 세포에서 발현된 항체 유전자는 체세포 돌연변이를 거친다.
추정된 생식계열 유전자 세그먼트 수, 이러한 세그먼트의 무작위 재조합 및 무작위 VH-VL 페어링을 기반으로 최대 1.6×107 개의 서로 다른 항체를 생산할 수 있다 (Fundamental Immunology, 3rd ed., ed. Paul, Raven Press, New York, NY, 1993). 항체 다양성에 기여하는 다른 과정 (가령, 체세포 돌연변이)을 고려하면 1×1010개 이상의 상이한 항체들이 잠재적으로 생성 될 수 있다고 생각된다 (Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio 외의 문헌, Academic Press, San Diego, Calif., 1995). 항체 다양성과 관련된 많은 과정들로 인해, 독립적으로 생성된 항체들이 CDR에서 동일한 아미노산 서열을 가질 가능성은 거의 없다.
본 발명은 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 유래된 새로운 CDR을 제공한다. CDR을 운반하기 위한 구조는 일반적으로 항체 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 일부일 것이며, 여기서 CDR은 자연 발생 VH 및 VL의 CDR에 대응하는 위치에 위치한다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 예를 들어, Kabat 외의 문헌, Sequences of Proteins of Immunological Interest, No. 91-3242, National Institutes of Health Publications, Bethesda, Md., 1991에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
인간화 항-KLRG1 항체의 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열은 서열 목록에 제시되어 있으며 표 1에 나열되어 있다.
표 1: 인간화 항-KLRG1 항체에 대한 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00001
항체의 특정한 비 제한적 예시 구체예는 ABC_HG1N01, ABC_HG1N02 및 ABC_HG1N07로 지칭된다. 예시적인 구체예의 VH 및 VL 도메인 내 CDR의 아미노산 서열은 서열 목록에 제시되고 표 2에 나열된다.
표 2. 인간화 항-KLRG1 항체에 대한 CDR 아미노산 서열
Figure pct00002
마우스 항-KLRG1 항체의 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열은 서열 목록에 제시되어 있으며 표 3에 나열되어 있다.
표 3: 마우스 항-KLRG1 항체에 대한 가변 영역 아미노산 서열
Figure pct00003
Figure pct00004
항체의 특정한 비제한적인 예시적 구체예는 ABC_G1N01, ABC_G1N02, ABC_G1N03, ABC_G1N04, ABC_G1N05, ABC_G1N06, ABC_G1N07, 및 ABC_G1N08로 지칭된다. 예시적인 구체예의 VH 및 VL 도메인 내 CDR의 아미노산 서열은 서열 목록에 제시되고 표 4에 나열된다.
표 4: 마우스 항-KLRG1 항체에 대한 CDR 아미노산 서열
Figure pct00005
Figure pct00006
항-KLRG1 항체는 선택적으로 항체 불변 영역 또는 이의 일부를 포함 할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 인간 Cκ또는 Ck 사슬을 포함하는 항체 경쇄 불변 도메인을 그 C 말단에 부착했을 수 있다. 유사하게, VH 도메인에 기초한 특정 항원-결합 도메인은 항체 동위 원소, 예를 들어 IgG, IgA, IgE 및 IgM 그리고, IgG1 및 IgG4를 비롯한 (그러나 이에 제한되지는 않음) 임의의 동위원소 하위분류로부터 유래된 면역글로불린 중쇄의 전부 또는 일부를 부착했을 수 있다. 예시적 구체예에서, ABC_HG1N01, ABC_HG1N02, ABC_HG1N07, ABC_G1N01, ABC_G1N02, ABC_G1N03, ABC_G1N04, ABC_G1N05, ABC_G1N06, ABC_G1N07, 및 ABC_G1N08 항체들은 인간 IgG1k 또는 IgG1x의 중쇄 및 경쇄의 C-말단 단편들을 포함한다. C-말단 단편에 대한 DNA 및 아미노산 서열은 당업계에 잘 알려져 있다 (예컨대, Kabat 외의 문헌, Sequences of Proteins of Immunological Interest, No. 91-3242, National Institutes of Health Publications, Bethesda, Md., 1991 참고).
특정 구체예들은 ABC_HG1N01, ABC_HG1N02, ABC_HG1N07, ABC_G1N01, ABC_G1N02, ABC_G1N03, ABC_G1N04, ABC_G1N05, ABC_G1N06, ABC_G1N07, 및 ABC_G1N08의 Fv 단편의 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다. 추가 구체예는 임의의 이들 VH 및 VL 도메인 중 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 및 서열 번호: 38에 제시된 CDR 서열들 중 적어도 하나를 포함하는 항체들은 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, 한 구체예는 ABC_HG1N01, ABC_HG1N02, ABC_HG1N07ABC_G1N01, ABC_G1N02, ABC_G1N03, ABC_G1N04, ABC_G1N05, ABC_G1N06, ABC_G1N07, 및 ABC_G1N08 중 적어도 하나로부터 선택된 항체의 VH 도메인의 H3 단편을 포함한다.
특정 구체예에서, VH 및/또는 VL 도메인은 생식계열화 될 수 있다, 즉, 이들 도메인의 프레임워크 영역 (FR)은 통상적인 분자 생물학 기술을 사용하여 생식계열 세포에 의해 생성된 것과 일치하도록 돌연변이된다. 다른 구체예에서, 프레임워크 서열들은 공통 생식계열 서열들로부터 분지화된 채로 남아있다.
특정 구체예에서, 항체는 KD로 표현되는, 적어도 약 2 nM, 1nm, 100 pM, 10 pM 또는 5 pM의 친화도로 인간 또는 마우스 KLRG1의 ECD 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 인간 및 시노몰구스 KLRG1의 ECD의 아미노산 서열은 표 6에 나열된 바와 같이 서열 번호: 89 및 서열 번호: 90에 제시되어 있다.
본 발명의 항체는 또한 예를 들어 KLRG1의 전부 또는 일부를 포함하는 재조합 단백질을 포함하는 다른 단백질과 결합 할 수 있는 것으로 간주된다.
당업자는 본 발명의 항체가 KLRG1과 다소 다른 단백질을 검출, 측정 및 억제하는데 사용될 수 있음을 알고 있을 것이다. 이들 항체는, 표적 단백질이 서열 번호: 89 또는 서열 번호: 90에 제시된 서열의 연속 아미노산 중 적어도 130, 100, 80, 60, 40, 또는 20개의 임의의 서열에 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상 동일한 서열을 포함하는 한, 결합 특이성을 보유하는 것으로 예상된다. 퍼센트 동일성은 표준 정렬 알고리즘, 가령, 예를 들어 Altshul 외, (1990) J. Mol. Biol., 215: 403-410에 설명된 베이직 로컬 정렬 툴 (BLAST, Basic Local Alignment Tool), Needleman 외. (1970) J. Mol. Biol., 48 : 444-453의 알고리즘, 또는 Meyers 외. (1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17의 알고리즘에 의해 결정된다.
서열 상동성 분석에 더하여, 에피토프 매핑 (예를 들어, Epitope Mapping Protocols, ed. Morris, Humana Press, 1996 참조) 및 2차 및 3차 구조 분석을 수행하여, 개시된 항체 및 이들의 항원과의 복합체에 의해 추정되는 특정 3D 구조를 확인할 수 있다. 이러한 방법들은, X-선 결정학 (Engstom (1974) Biochem. Exp. Biol., 11:7-13) 및 본원에 개시된 항체들의 가상 표현에 관한 컴퓨터 모델링 (Fletterick 외의 문헌 (1986) Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
유도체
본 발명은 또한 KLRG1에 특이적인 항체를 얻는 방법을 제공한다. 이러한 항체들의 CDR은 표 1 및 3에 제시된 VH 및 VL의 특정 서열에 제한되지 않으며, KLRG1에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 이들 서열의 변이체를 포함 할 수 있다. 이러한 변이체는 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여 당업자에 의해 표 1 및 3에 나열된 서열들로부터 유도 될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가는 FR 및/또는 CDR에서 이루어질 수 있다. FR의 변화는 일반적으로 항체의 안정성과 면역원성을 향상시키도록 설계되지만 CDR의 변화는 일반적으로 표적에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 설계된다. FR의 변이체들은 또한 자연 발생 면역글로불린 동종이형을 포함한다. 이러한 친화성 증가 변화는 CDR을 변경하고 그 표적에 대한 친화성 항체를 테스트하는 것을 포함하는 관례적인 기술에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 개시된 CDR 중 어느 하나 내에서 이루어질 수 있다. Antibody Engineering, 2nd ed., Oxford University Press, ed. Borrebaeck, 1995에 기재된 방법들에 따라 다양한 변경이 이루어질 수 있다. 이들은 서열 내에서 기능적으로 동등한 아미노산 잔기를 코딩하는 상이한 코돈들의 치환에 의해 변경되어 “침묵” 변화를 생성하는 뉴클레오티드 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 비극성 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 포함된다. 양으로 하전된 (염기성) 아미노산에는 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 포함된다. 음으로 하전된 (산성) 아미노산에는 아스파르트산과 글루탐산이 포함된다. 서열 내의 아미노산에 대한 치환은 아미노산이 속하는 분류의 다른 구성원으로부터 선택 될 수 있다 (표 5 참조). 더욱이, 폴리펩티드의 임의의 천연 잔기는 또한 알라닌으로 치환 될 수 있다 (예를 들어, MacLennan 외의 문헌 (1998) Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67; Sasaki 외의 문헌 (1998) Adv. Biophys. 35:1-24 참조).
표 5: 보존적 치환 예시:
Figure pct00007
본 발명의 항체의 유도체 및 유사체는 재조합 및 합성 방법을 포함한, 당업계에 널리 공지된 다양한 기술들에 의해 제조될 수 있다 (Maniatis (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 및 Bodansky 외의 문헌 (1995) The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed., Spring Verlag, Berlin, Germany).
한 구체예에서, 본 발명의 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인의 제조 방법은 본원에 개시된 VH 도메인의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산을 부가, 결실, 치환 또는 삽입하는 단계, 선택적으로 이렇게 생성된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하는 단계, 및 VH 도메인 또는 VH/VL 조합 또는 조합들을 KLRG1에 대한 특이적 결합에 대해 테스트하는 단계, 선택적으로 이러한 항원-결합 도메인의 KLRG1 활성 조절 능력을 테스트하는 단계를 포함한다. VL 도메인은 표 1 및 3에 따라 제시된 것과 동일한 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본원에 개시된 VL 도메인의 하나 이상의 서열 변이체들이 하나 이상의 VH 도메인과 조합되어 있는 유사한 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 추가 양상은 KLRG1과 특이적으로 결합하는 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 다음을 포함한다:
(a) 대체될 CDR3을 포함하거나 CDR3 인코딩 영역이 없는 VH 도메인을 인코딩하는 핵산의 시작 레퍼토리를 제공하는 단계;
(b) 상기 레퍼토리를 VH CDR3 (즉, H3)에 대해 본원에 실질적으로 제시된 아미노산 서열을 인코딩하는 공여자 핵산과 조합하고, 그리하여 공여자 핵산이 레퍼토리의 CDR3 영역 내부에 삽입되어, VH 도메인을 인코딩하는 핵산들의 생성물 레퍼토리를 제공하는 단계;
(c) 생성물 레퍼토리의 핵산들을 발현시키는 단계;
(d) KLRG1에 특이적인 결합 단편을 선택하는 단계; 그리고
(e) 상기 특이적 결합 단편 또는 이를 인코딩하는 핵산을 회수하는 단계.
또한, 본 발명의 VL CDR3 (즉, L3)가 대체될 CDR3을 포함하거나 CDR3 인코딩 영역이 없는 VL 도메인을 인코딩하는 핵산들의 레퍼토리와 조합되는 유사한 방법이 사용될 수 있다. 공여자 핵산은 실질적으로 서열 번호: 7-24 및 41-88에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산으로부터 선택 될 수 있다.
본 발명의 CDR (예컨대, CDR3)을 인코딩하는 서열은, 재조합 DNA 기술을 사용하여, 예를 들면, Marks 외의 문헌 (Bio/Technology (1992) 10: 779-783)에 기재된 방법을 사용하여, 각각의 CDR (예컨대, CDR3)가 없는 가변 도메인의 레퍼토리 내부에 도입될 수 있다. 특히, 가변 도메인 영역의 5' 말단에 또는 이에 인접한 공통 프라이머는 CDR3가 없는 VH 가변 도메인의 레퍼토리를 제공하기 위해 인간 VH 유전자의 제 3 프레임워크 영역에 대한 공통 프라이머와 함께 사용될 수 있다. 레퍼토리는 특정 항체의 CDR3과 조합 될 수 있다. 유사한 기술을 사용하여, CDR3-유래 서열은 CDR3이 없는 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리와 셔플 될 수 있고, 셔플된 완전한 VH 또는 VL 도메인은 동족 VL 또는 VH 도메인과 조합되어 본 발명의 KLRG1-특이적 항체를 제조 할 수 있다. 레퍼토리는 적합한 항원-결합 단편이 선택 될 수 있도록 적합한 숙주 시스템, 가령, WO92/01047에 기재된 바와 같은 파지 디스플레이 시스템에서 디스플레이될 수 있다.
유사한 셔플링 또는 조합 기술은 또한 Stemmer의 문헌에 개시되어 있는데 (Nature (1994) 370: 389-391), 그는 β-락타마제 유전자와 관련하여 기술을 설명하지만 이러한 접근법이 항체 생성에 사용될 수 있음을 관찰한다.
추가 구체예에서, 하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자의 무작위 돌연변이유발을 사용하여 본원에 개시된 서열로부터 유래된 하나 이상의 서열을 보유하는 새로운 VH 또는 VL 영역을 생성 할 수 있다. 이러한 기술 중 하나인 에러-프론 PCR은, Gram 외의 문헌 (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89: 3576-3580)에 기재되어 있다.
사용될 수 있는 또 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR에 돌연변이유발을 지시하는 것이다. 이러한 기술은 Barbas 외의 문헌 (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1994) 91: 3809-3813) 및 Schier 외의 문헌 (J. Mol. Biol. (1996) 263: 551-567)에 개시되어 있다.
유사하게, 하나 이상 또는 3개의 CDR 모두 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리에 이식 될 수 있으며, 이어서 KLRG1에 특이적인 항원-결합 단편에 대해 스크리닝된다.
면역글로불린 가변 도메인의 일부는 실질적으로 본원에 제시된 CDR 중 적어도 하나, 그리고 선택적으로 본원에 제시된 scFv 단편으로부터의 개재 프레임워크 영역을 포함 할 것이다. 이 부분은 FR1 및 FR4 중 하나 또는 둘 모두의 적어도 약 50%를 포함할 수 있으며, 50%는 FR1의 C-말단 50% 및 FR4의 N-말단 50%이다. 가변 도메인의 실질적인 부분의 N-말단 또는 C-말단의 추가 잔기는 일반적으로 자연 발생 가변 도메인 영역과 연관되지 않은 잔기들 일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기술에 의한 항체 구성은 클로닝 또는 기타 조작 단계들을 용이하게 하기 위해 도입된 링커에 의해 인코딩된 N- 또는 C- 말단 잔기들을 도입할 수 있다. 다른 조작 단계는 면역글로불린 중쇄 불변 영역, 다른 가변 도메인 (예를 들어, 디아바디의 생산에서), 또는 하기에 더 상세히 논의되는 단백질성 표지를 포함하는 또 다른 단백질 서열들에 가변 도메인을 연결하기 위한 링커들의 도입을 포함한다.
실시예에 예시된 구체예들은 VH 및 VL 도메인의 “매칭” 쌍을 포함하지만, 당업자는 대안적인 구체예들이 VL 또는 VH 도메인의 단일 CDR만을 함유하는 항원-결합 단편들을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 단일 사슬 특이적 결합 도메인 중 어느 하나를 사용하여, 예를 들어, KLRG1에 결합 할 수 있는 2-도메인 특이적 항원-결합 단편을 형성 할 수 있는 상보적 도메인들을 스크리닝 할 수 있다. 스크리닝은 WO92/01047에 개시된 소위 계층적 이중 조합 접근법을 사용하는 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 구현 될 수 있으며, 여기서 H 또는 L 사슬 클론을 포함하는 개별 콜로니는 다른 사슬 (L 또는 H)을 인코딩하는 클론의 완전한 라이브러리를 감염시키는 데 사용되고 생성된 2-사슬 특이적 결합 도메인은 기재된 바와 같이 파지 디스플레이 기술에 따라 선택된다.
본원에 기재된 항-KLRG1 항체는 또 다른 기능 분자, 예를 들어, 또 다른 펩티드 또는 단백질 (알부민, 또 다른 항체 등), 독소, 방사성 동위원소, 세포독성 또는 세포증식 억제제에 연결될 수 있다. 예를 들어, 항체는 화학적 가교 또는 재조합 방법에 의해 연결될 수 있다. 항체들은 또한 미국 특허 제 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; 또는 4,179,337에 제시된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체들 중 하나, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌에 연결될 수도 있다. 항체는 예를 들어 순환 반감기를 증가시키기 위해 중합체에 대한 공유 결합에 의해 화학적으로 변형 될 수 있다. 예시적 중합체 및 이들을 부착하는 방법 또한 미국 특허 제 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285, 및 4,609,546에 제시되어 있다.
개시된 항체들은 또한 고유한 패턴과 상이한 글리코실화 패턴을 가지도록 변경될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 탄수화물 모이어티가 결실 될 수 있고 및/또는 원래 항체에 하나 이상의 글리코실화 부위가 추가 될 수 있다. 본원에 개시된 항체에 대한 글리코실화 부위의 추가는 당업계에 공지된 글리코실화 부위 공통 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 구현 될 수 있다. 폴리펩티드의 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 또 다른 수단은 항체의 아미노산 잔기들에 화학 또는 효소적으로 글리코시드를 커플링하는 것이다. 이러한 방법은 WO 87/05330 및 Aplin 외의 문헌 (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 22: 259-306에 기재되어 있다. 항체로부터 임의의 탄수화물 모이어티의 제거는 예를 들어, Hakimuddin 외의 문헌 (1987) Arch. Biochem. Biophys., 259: 52; 및 Edge 외의 문헌 (1981) Anal. Biochem., 118: 131 및 Thotakura 외의 문헌 (1987) Meth. Enzymol., 138: 350에 기재된 바와 같이 화학적으로 또는 효소적으로 구현될 수 있다. 항체는 또한 검출가능한 또는 기능적 표지로 태그될 수 있다. 검출가능한 표지에는 방사성표지, 가령, 131I 또는 99mTc가 포함되며, 이는 기존의 화학을 사용하여 항체들에 부착될 수도 있다. 검출가능한 표지는 또한 효소 표지, 가령, 홀스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제를 포함한다. 검출가능한 표지는 비오틴과 같은 화학적 모이어티를 추가로 포함하며, 이는 특정한 동족의 검출가능한 모이어티, 예컨대, 표지된 아비딘에 대한 결합을 통해 검출될 수 있다.
CDR 서열들이 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 또는 서열 번호: 40에 제시된 것들과 비실질적으로만 상이한 항체들은 본 발명의 범위에 포함된다. 일반적으로 아미노산은 유사한 전하, 소수성 또는 입체화학적 특성을 갖는 관련 아미노산으로 치환된다. 이러한 치환은 당업자의 통상의 능력 범위에 속할 것이다. CDR에서와는 달리, 항체의 결합 특성에 악영향을 주지 않고 FR에서 더 실질적인 변화를 일으킬 수 있다. FR에 대한 변경에는 비인간 유래의 인간화 또는 항원 접촉 또는 결합 부위 안정화에 중요한 특정 프레임 워크 잔기의 조작, 예컨대, 불변 영역의 분류 또는 하위분류 변경, 미국 특허 제 5,624,821 및 5,648,260 그리고 Lund 외의 문헌 (1991) J. Immun. 147: 2657-2662 및 Morgan 외의 문헌 (1995) Immunology 86: 319-324에 기재된 바와 같은, 이펙터 기능, 가령, Fc 수용체 결합을 변화시킬 수 있는 특정 아미노산 잔기들의 변경, 또는 불변 영역이 유래되는 종들의 변경이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
당업자는 상기 변형들이 모두를 포함하는 것은 아니며, 본원의 개시내용에 비추어 다른 많은 변형들이 당업자에게 명백할 것임을 이해할 것이다.
핵산, 클로닝 및 발현 시스템
본 발명은 개시된 항체들을 인코딩하는 분리된 핵산을 추가로 제공한다. 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함 할 수 있으며 전체적으로 또는 부분적으로 합성 또는 재조합 될 수 있다. 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열에 대한 언급은 특정 서열을 갖는 DNA 분자를 포함하고, 문맥에서 달리 요구하지 않는 한, U가 T로 치환된 특정 서열을 갖는 RNA 분자를 포함한다.
본원에 제공된 핵산은 본원에 개시된 CDR, VH 도메인 및/또는 VL 도메인에 대한 코딩 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 CDR, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 인코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 플라스미드, 벡터, 파지미드, 전사 또는 발현 카세트 형태의 구조체를 제공한다.
본 발명은 상기와 같은 하나 이상의 구조체를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다.
또한 임의의 CDR (H1, H2, H3, L1, L2 또는 L3), VH 또는 VL 도메인을 인코딩하는 핵산 및 인코드된 생성물의 제조 방법이 제공된다. 상기 방법은 인코딩 핵산으로부터 인코드된 생성물을 발현시키는 것을 포함한다. 발현은 핵산을 포함하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건하에서 배양함으로써 구현 될 수 있다. 발현에 의한 생산 후, VH 또는 VL 도메인, 또는 특이적 결합 구성원은 임의의 적합한 기술을 사용하여 분리 및/또는 정제된 다음 적절하게 사용될 수 있다.
항원-결합 단편, VH 및/또는 VL 도메인, 및 인코딩 핵산 분자 및 벡터는 자연 환경에서 실질적으로 순수하거나 균질한 형태로, 핵산의 경우 필요한 기능을 가지는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열 이외의 원래 유전자들 또는 핵산이 없는 또는 실질적으로 없는 형태로 분리 및/또는 정제 될 수 있다.
다양한 상이한 숙주 세포에서 폴리펩티드의 클로닝 및 발현을 위한 시스템은 당 업계에 잘 알려져 있다. 항체 생산에 적합한 세포에 대해서는 Gene Expression Systems, Academic Press, eds. Fernandez 외, 1999를 참조하라. 간단히 말해서, 적합한 숙주 세포는 박테리아, 식물 세포, 포유류 세포 및 효모 및 배큘로바이러스 시스템을 포함한다. 이종 폴리펩티드의 발현을 위해 당업계에서 이용가능한 포유류 세포주는 중국 햄스터 난소 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 신장 세포, NS0 마우스 골수종 세포 및 기타 많은 것을 포함한다. 일반적인 박테리아 숙주는 대장균이다. 본 발명에 적합한 임의의 단백질 발현 시스템을 사용하여 개시된 항체를 생산할 수 있다. 적합한 발현 시스템은 Gene Expression Systems, Academic Press, eds. Fernandez 외의 문헌, 1999에 기재되어 있는 유전자삽입 동물들을 포함한다.
적절한 벡터는 프로모터 서열, 종결인자 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 기타 적절한 서열을 포함하는 적절한 조절 서열을 포함하도록 선택되거나 제작 될 수 있다. 벡터는 플라스미드 또는 바이러스, 예컨대, 파지 또는 파지미드 일 수 있다. 보다 자세한 내용은, 예를 들어, Sambrook 외의 문헌, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989를 참고하라. 예를 들어, 핵산 조작, 예를 들어, 핵산 구조체의 제조, 돌연변이유발, 시퀀싱, 세포로의 DNA 도입 및 유전자 발현, 그리고 단백질 분석을 위한 많은 공지 기술 및 프로토콜은 Current Protocols in Molecular Biology, 2nd Edition, eds. Ausubel 외, John Wiley & Sons, 1992에 상세히 설명되어 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 본원에 개시된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 또 다른 양상은 이러한 핵산을 숙주 세포에 도입하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 이러한 도입은 이용가능한 모든 기술을 사용할 수 있다. 진핵 세포의 경우, 적합한 기술은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공, 리포좀-매개 형질감염 및 레트로바이러스 또는 기타 바이러스, 예를 들어, 백시니아 또는, 곤충 세포의 경우, 배큘로바이러스를 사용한 형질도입을 포함 할 수 있다. 박테리아 세포의 경우 적합한 기술은 염화칼슘 형질전환, 전기천공 및 박테리오파지를 사용한 형질감염을 포함 할 수 있다. 세포 내부로의 핵산 도입은, 예를 들어, 유전자 발현을 위한 조건하에서 숙주 세포를 배양함으로써 핵산으로부터 발현을 유발 또는 허용 할 수 있다.
사용 방법
본 발명의 항-KLRG1 항체는 면역 반응의 KLRG1-관련 조절을 조절할 수 있다. 특정 구체예에서, 세포독성 T 및 NK 세포의 활성화는 KLRG1 신호전달의 조절에 의해 매개된다. 본 발명의 항체는 사용 방법에 따라 KLRG1의 효현제 또는 길항제로서 작용할 수 있다. 항체는 포유류, 특히 인간의 의학적 장애를 예방, 진단 또는 치료함에 사용할 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 KLRG1 또는 KLRG1-발현 세포를 분리하는데 사용될 수 있다. 또한, 항체는 비정상적인 KLRG1 발현 또는 기능과 관련된 장애의 위험이 있거나, 이에 취약하거나 이러한 장애를 갖는 대상체를 치료함에 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 예를 들어, 특정 유형의 암 및 감염성 질환에서 세포독성 T 및 NK 세포 활성화의 조절이 바람직 할 수 있는 상황에서 사용될 수 있다.
감소된 림프구 활성화가 바람직한 경우, 본 발명의 항-KLRG1 항체는 KLRG1에 대한 효현제로서 사용되어, 세포독성 (또는 CD8+) T 및 NK 세포 활성화의 KLRG1-관련 감쇠를 향상시킬 수 있다.
특정 상황에서는 암이나 전염병을 치료하기 위해 환자의 면역 반응을 유도하거나 향상시키는 것이 바람직 할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 치료 또는 예방되는 장애는 미생물 (예컨대, 박테리아), 바이러스 (예컨대, 인플루엔자와 같은 전신 바이러스 감염, 헤르페스 또는 대상포진과 같은 바이러스 피부 질환) 또는 기생충에 의한 감염; 및 암 (예컨대, 흑색종 및 전립선 암)이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
항-KLRG1 항체를 사용한 세포독성 T 및 NK 세포 활성화는 T 및 NK 세포 반응을 향상시킨다. 이러한 경우, 항체는 KLRG1의 길항제로 작용한다. 따라서, 일부 구체예들에서, 항체는 KLRG1과 연관된 하향조절 활성, 즉, 세포독성 T 및 NK 세포 활성화의 하향조절과 관련된 활성을 억제하거나 감소시킴에 사용될 수 있다. 실시예에서 입증된 바와 같이, 길항성 항-KLRG1 항체와 KLRG1 E-캐드헤린 상호작용의 차단은 향상된 T 세포 증식 반응 및 이들 세포에 의한 IFNγ분비를 초래하며, 이는 세포독성 T 및 NK 세포 활성화에서 KLRG1 경로에 대한 하향조절 역할과 일치한다. 다양한 구체예에서, 항체는 KLRG1에 대한 E-캐드헤린의 결합을 약 50 nM 미만, 더욱 바람직하게는 약 40, 30, 20, 10 또는 5 nM 미만의 IC50으로 억제한다. E-캐드헤린 결합의 억제는 실시예 6에 기재된 바와 같이 또는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 측정 될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 조성물은 치료적 유효량으로 투여된다. 일반적으로, 치료적 유효량은 대상체의 연령, 병태 및 성별, 뿐만 아니라 대상체의 의학적 병태의 중증도에 따라 달라질 수 있다. 항체의 치료적 유효량은 약 0.001 내지 약 30mg/kg 체중, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 25mg/kg 체중, 약 0.1 내지 약 20mg/kg 체중, 또는 약 1 내지 약 10mg/kg 범위이다. 투여량은 관찰된 치료 효과에 맞게 필요에 따라 조정될 수 있다. 적절한 용량은 임상 징후에 따라 치료 의사에 의해 선택된다.
항체는 투여 후 최대 길이의 시간 동안 항체의 순환 수준을 최대화하기 위해 볼루스 투여로 제공 될 수 있다. 볼루스 투여 후 연속 주입을 사용할 수도 있다.
면역 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)는 또한 환자로부터 분리되어 본 발명의 항체와 함께 생체외에서 배양 될 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포 및 NK 세포 활성화는 대상체로부터 면역 세포를 제거하고 이러한 면역 세포를 시험관내에서 본 발명의 항-KLRG1 항체와 접촉시킴으로써 조절 될 수 있다. 이러한 구체예에서, 항-KLRG1 항체는 면역 세포 표면상의 KLRG1 분자가 이러한 항체에 결합 할 때 “가교”되도록 다가 형태로 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-KLRG1 항체는 비드와 같은 고체 지지체에 결합되거나 2차 항체를 통해 가교 될 수 있다. 이어서, 면역 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 분리되어 환자에게 재이식 될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 항체는 KLRG1을 발현하는 세포에 또 다른 치료제 또는 세포독성제 (예를 들어, 독소)를 전달하기 위한 표적화제로서 사용될 수 있다. 이 방법은 치료제 또는 세포독성제에 결합된 항-KLRG1 항체를 투여하거나 KLRG1에 대한 이러한 항체의 결합을 허용하는 조건하에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 항체는 또한 생물학적 샘플에서 KLRG1의 존재를 검출하는데 사용될 수도 있다. 검출된 KLRG1의 양은 KLRG1의 발현 수준과 상관 될 수 있으며, 이는 차례로 대상체에서 면역 세포 (예를 들어, 활성화된 T 세포 또는 NK 세포)의 활성화 상태와 상관된다.
항체를 사용하는 검출 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, ELISA, 방사성면역분석, 면역블롯, 웨스턴 블롯, 면역형광법, 면역침전법을 포함한다. 항체는 KLRG1을 검출하기 위해 이러한 기술 중 하나 이상을 통합하는 진단 키트에 제공 될 수 있다. 이러한 키트에는 기타 구성요소, 포장재, 지침 또는 단백질 검출을 보조하는 기타 재료가 포함될 수 있다.
항체들이 진단을 목적으로 하는 경우, 이들을, 예를 들어, 리간드 그룹 (예컨대, 비오틴) 또는 검출가능한 마커 그룹 (예컨대, 형광그룹, 방사성동위원소 또는 효소)으로 변형하는 것이 바람직 할 수 있다. 필요에 따라, 본 발명의 항체는 통상적인 기술을 사용하여 표지 될 수 있다. 적합한 검출가능한 표지는 예를 들어, 형광단, 발색단, 방사성 원자, 전자-밀도 시약, 효소 및 특이적 결합 파트너를 갖는 리간드를 포함한다. 효소는 일반적으로 활성에 의해 검출된다. 예를 들어, 홀스래디쉬 퍼옥시다제는 테트라메틸벤지딘 (TMB)을, 분광광도계로 정량화가능한 청색 안료로 전환하는 능력에 의해 검출될 수 있다. 검출에 있어서, 적합한 결합 파트너는 비오틴 및 아비딘 또는 스트렙타비딘, IgG 및 단백질 A, 및 당업계에 공지된 수많은 수용체-리간드 커플을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 치환 및 가능성은 당업자에게 용이하게 명백 할 것이며, 본 발명의 범위에 속하는 균등물로 간주된다.
본 발명의 항체는 치료제로서 효과적인 KLRG1 경로의 억제제를 확인하기 위한 스크리닝 방법에 사용될 수 있다. 이러한 스크리닝 분석에서, 제 1 결합 혼합물은 KLRG1과 본 발명의 항체를 조합하여 형성되고; 제 1 결합 혼합물 내 결합량 (M0)이 측정된다. 제 2 결합 혼합물은 또한 KLRG1, 항체 및 스크리닝할 화합물 또는 제제를 조합하여 형성되고, 제 2 결합 혼합물 내 결합량 (M1)이 측정된다. 테스트될 화합물은 실시예에 예시된 바와 같이, 또 다른 항-KLRG1 항체 일 수 있다. 제 1 및 제 2 결합 혼합물 내 결합량은 예를 들어 M1/M0 비율을 계산하여 비교된다. 상기 화합물 또는 제제는 제 1 결합 혼합물과 비교하여 제 2 결합 혼합물에서 결합 감소가 관찰되는 경우 면역 반응의 KLRG1-관련 하향조절을 조절할 수 있는 것으로 간주된다. 결합 혼합물의 제제화 및 최적화는 당업자의 기술 수준 범위이며, 이러한 결합 혼합물은 또한 결합을 향상시키거나 최적화하는데 필요한 완충제 및 염을 함유 할 수 있으며, 추가 대조 분석이 본 발명의 스크리닝 분석에 포함될 수 있다. 따라서 KLRG1-항체 결합을 적어도 약 10% (즉, M1/M0 <0.9), 바람직하게는 약 30% 이상 감소시키는 것으로 밝혀진 화합물을 확인한 다음, 필요한 경우 다음에 설명된 다른 분석 또는 동물 모델에서 장애를 개선하는 능력에 대해 2차 스크리닝 될 수 있다. KLRG1과 항체 사이의 결합 강도는, 예를 들어, 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA), 방사- 면역분석 (RIA), 표면 플라즈몬 공명-기반 기술 (예컨대, Biacore)을 사용하여 측정 될 수 있으며, 상기 기술들 모두 당업계에 잘 알려진 기술이다.
이어서 화합물은 실시예 또는 동물 모델에서 기재된 바와 같이 시험관내 테스트 될 수 있다. 예를 들어, 동물 테스트에 따라 결정된 예비 용량 및 인간 투여를 위한 용량 스케일링은 당업계에서 인정되는 관행에 따라 수행된다. 독성 및 치료 효능은 세포 배양 또는 실험 동물의 표준 제약 절차에 의해 결정될 수 있다. 세포 배양 분석 또는 동물 연구로부터 얻은 데이터는 사람에서 사용하기 위한 용량 범위를 계산하는데 사용될 수 있다. 한 동물 모델에서 구현된 치료적 유효 투여량은 인간을 포함한 또 다른 동물에서 사용하기 위해 당업계에 공지된 변환 인자를 사용하여 변환 될 수 있다 (예를 들어, Freireich 외의 문헌. (1966) Cancer Chemother. Reports, 50(4): 219-244 참고).
약학 조성물 및 투여 방법
본 발명은 항-KLRG1 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 약학적 사용 및 환자에 대한 투여에 적합 할 수 있다. 조성물은 전형적으로 본 발명의 하나 이상의 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 문구 “약학적으로 허용되는 부형제”는 약학적 투여와 양립가능한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제들의 사용은 해당 기술 분야에 널리 공지이다. 조성물은 또한 보충, 추가 또는 강화된 치료 기능을 제공하는 다른 활성 화합물을 함유 할 수도 있다. 상기 약학 조성물은 투여 지침과 함께 용기, 팩 또는 디스펜서(dispenser)에 포함될 수도 있다.
본 발명의 약학 조성물은 의도된 투여 경로와 양립할 수 있도록 제형화된다. 투여를 수행하는 방법은 당업자에게 알려져있다. 투여는 예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 공동내, 피하 또는 경피 일 수 있다. 국소 또는 경구 투여 될 수 있거나 점막을 통해 전달 될 수 있는 조성물을 얻는 것도 가능할 수 있다.
진피내, 또는 피하 투여에 사용되는 용액 또는 현탁액은 전형적으로 다음 성분들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 무균 희석제, 가령, 주사용 물, 식염수 용액, 고정유(fixed oils), 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 그 외 합성 용매; 항박테리아제, 가령, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 가령, 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트; 킬레이트제, 가령, 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 가령, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 및 긴장성(tonicity) 조절을 위한 제제, 가령, 염화 나트륨 또는 포도당. pH는 산 또는 염기, 가령, 염산 또는 수산화 나트륨를 이용하여 조정될 수 있다. 이러한 제제들은 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 휴대용 주사기 또는 다회 투여 바이얼에 봉입될 수 있다.
주사용으로 적합한 약학 조성물에는 무균 주사 용액 또는 분산물의 즉석 조제를 위한 무균 수용액 또는 분산물 및 무균 분말이 포함된다. 정맥내 투여를 위하여, 적합한 담체는 생리학적 염수, 정균수, Cremophor EL (BASF, Parsippany, N.J.) 또는 인산염 완충된 염수 (PBS)를 포함한다. 모든 경우에 상기 조성물은 무균이어야 하며 용이하게 주사될 수 있을 정도로 유체이어야 한다. 이는 제조 및 보관 조건들하에서 안정하여야 하며 미생물, 가령, 세균 및 진균의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 미생물 작용은 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 및 이와 유사한 것들과 같은 다양한 항균 및 항진균제에 의해 방지될 수 있다. 많은 경우에 있어서, 등장 물질, 예를 들면 당류, 폴리알코올, 이를 테면, 만니톨, 솔비톨, 및 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이와 유사한 것들) 그리고 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질로 존재할 수 있다. 예를 들면, 코팅, 가령, 레시틴을 사용함으로써, 분산액의 경우 필요한 입경을 유지함으로써, 및/또는 계면활성제를 사용함으로써 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 주사가능한 조성물의 장기 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 이루어질 수 있다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이는 젤라틴 캡슐에 봉입되거나 정제로 압축 될 수 있다. 경구 투여를 위해 항체는 부형제와 조합되어 정제, 트로키제 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 약학적으로 적합한 결합제 및/또는 보조제 물질이 조성물의 일부로 포함될 수 있다. 정제, 환약, 캡슐, 트로키제 등은 임의의 다음 성분 또는 유사한 성질의 화합물; 미결정 셀룰로오스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 또는 락토스와 같은 부형제, 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아 레이트 또는 스테로테스와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화 규소와 같은 활택제; 수 크로스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 착향제와 같은 착향제를 함유 할 수 있다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의해 이루어질 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 침투해야 하는 장벽에 적합한 침투제가 이 제제에서 사용된다. 이러한 침투제는 당업계에 일반적으로 알려져 있으며, 예를 들어, 세제, 담즙 염 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 예를 들어 로젠지제, 비강 스프레이, 흡입기 또는 좌약의 사용을 통해 수행 될 수 있는데, 예를 들어, Fc 부분을 포함하는 항체의 경우, 조성물은 장, 입 또는 폐의 점막을 통과하여 (예를 들어, 미국 특허 제 6,030,613에 기재된 바와 같은 FcRn 수용체-매개 경로를 통해) 전달 될 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물은 당업계에 일반적으로 공지된 연고(ointments), 살베스(salves), 겔 또는 크림으로 제형화될 수 있다. 흡입에 의한 투여를 위하여, 항체들은 적합한 추진제, 예컨대, 기체, 가령, 이산화탄소를 함유하는 가압 용기 또는 분배기 또는 분무기(nebulizer)로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달될 수 있다.
특정 구체예들에서, 본원에 개시된 항체들은 이를 테면 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 비롯한, 방출 제어 제형과 같은, 이러한 화합물을 신체로부터 신속하게 제거되지 않도록 보호하는 담체와 함께 제조된다. 생분해가능한, 생체적합성 폴리머, 이를 테면 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드리드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르소에스테르, 및 폴리락트산이 이용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당업자들에게 자명할 것이다. 본원에 개시된 항체를 함유하는 리포좀 현탁액은 또한 약학적으로 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은, 예를 들면, 미국 특허 제 4,522,811에서 설명된 바와 같은 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조 될 수 있다.
투여의 용이함 및 투여량(dosage)의 균일성을 위하여, 투약 단위 형태 (dosage unit form)로 경구 또는 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “투약 단위 형태”는 치료할 대상을 위한 일원화된 투약형으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각 단위는 요구되는 약학적 담체와 조합되어 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된, 예정된 양의 활성 화합물을 포함한다.
본원 발명의 조성물의 독성 및 치료 효능은, 예를 들어, LD50 (모집단의 50%에 대한 치사 용량) 및 ED50 (모집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량)을 결정하기 위한, 세포 배양 또는 실험 동물들에서 표준 약학적 절차들에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과간의 용량 비율이 치료 지수이며 이는 LD50/ED50 비율로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 조성물이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 임의의 조성물에 있어서, 치료적 유효량은 세포 배양 분석으로부터 먼저 추정될 수 있다. 적합한 생물분석법의 예는 DNA 복제 분석, 사이토카인 방출 분석, 전사-기반 분석, KLRG1/캐드헤린 결합 분석, 면역학적 분석, 예를 들어, 실시예에 기재된 기타 분석을 포함한다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 사람에서 사용하기 위한 용량 범위를 계산하는데 사용될 수 있다. 동물 모델에서 IC50 (즉, 증상의 최대 절반 억제를 달성하는 항체의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 구현하기 위한 용량이 공식화될 수 있다. 순환 혈장 내 수준은, 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다. 임의의 특정 투여량의 효과는 적합한 생물분석법으로 모니터링 될 수 있다. 이러한 용량은 바람직하게는 거의 또는 전혀 독성이 없이 순환 농도 범위에 속한다. 용량은 사용되는 투약형 및 이용되는 투여 경로에 따라 달라질 수 있다.
다음 실시예는 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 당업자는 본 발명의 사상 또는 범위를 변경하지 않고 수행 될 수 있는 수많은 수정 및 변화를 알고 있을 것이다. 이러한 수정 및 변화는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: 재조합 단백질의 제조
재조합 단백질은 표준 분자 클로닝에 의해 생산되었으며, 발현 프로토콜은 인간 KLRG1 ECD (서열 번호: 89), 시노몰구스 KLRG1 ECD (서열 번호: 90), 및 인간 E-캐드헤린 (서열 번호: 91)을 포함하고, 이들의 아미노산 서열들은 아래 표 6에 제시되어 있다. 재조합 단백질은 각각의 cDNA를 pCDNA4 벡터 (Invitrogen)로 클로닝하고 포유류 HEK293에서 일시적 형질감염에 의해 FC 융합 또는 HIS 태그 버전으로 생산되었다. 발현된 단백질의 정제는 FC 융합 버전의 경우 단백질 A 친화성 수지 그리고 HIS 태그된 단백질의 경우 니켈-NTA 수지를 사용하여 크로마토그래피에 의해 수행되었다. 모든 정제된 단백질은 순도와 분자량을 확인하기 위해 SDS-PAGE 전기영동으로 특성화되었다.
표 6: 인간 및 시노몰구스 KLRG1 ECD 및 인간 E-캐드헤린의 아미노산 서열
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전장 항원에 대한 항체의 결합을 테스트하기 위한 면역화 항원으로 그리고 기능적 T 세포 분석에서 표적 세포로 사용하기 위해 안정적인 세포주가 개발되었다. 개발된 세포주는 전장 인간 KLRG1을 발현하는 CHO 및 전장 시노몰구스 KLRG1을 발현하는 CHO를 포함한다. 관심있는 pCDNA4 플라스미드 코딩 단백질이 있는 형질감염 CHO 세포에 의해 안정한 세포주를 유도하였다. 형질감염 후, 세포를 500ug/ml의 G418에 노출시켜 안정하게 통합된 플라스미드를 선택하였다. 세포주들을 발현에 관하여 FACS에 의해 추가로 특성화하고 균질하고 안정한 발현에 관해 선별되도록 분류되었다.
CD3 효현제 및 E-캐드헤린으로 이중 형질감염된 안정한 CHO 세포를 KLRG1 인간 T 세포의 차단 효과를 입증하기 위한 기능 분석에 사용하였다. CD3 효현제와 E-캐드헤린의 공동-발현을 적절한 항체를 사용하여 2색 FACS로 확인하였다.
실시예 2: 항-KLRG1 항체의 생성
항체 ABC_HG1N01, ABC_HG1N02 및 ABC_HG1N07은 KLRG1의 세포외 도메인에 대한 인간화 IgG1 항체이다. 인간 KLRG1에 대한 마우스 단론 항체 (MAB)는 인간 및 시노몰구스 KLRG1로 암컷 BALB/c 마우스 및 SJL 마우스를 표준 면역화한 후, 하이브리도마 스크리닝하여 생성되었다. 다양한 수의 항체 히트를 생성하기 위해 여러 면역화 전략이 사용되었다. 간단히 말해서, SJL 및 Balb/c 마우스는 관심 항원을 발현하는 cDNA, 재조합 항원 또는 CHO 세포로 반복적으로 면역화되었다. 항원 특이적 항체 역가는 ELISA에 의해 주기적으로 모니터되었으며, 일반적으로 1:1000 내지 1:10000 희석 배수의 적절한 역가에 도달되었을 때 동물들을 희생시켰다. 희생된 마우스의 비장 세포를 마우스 골수종 세포에 융합하여 하이브리도마 세포를 생성한 후 배양하여 단일 세포에 서브클로닝하였다. 안정한 클론을 확장하고 조건 배지를 수확하고 항-KLRG1 항체의 발현에 대해 ELISA 및 FACS에 의해 테스트하였다.
실시예 3: 항-KLRG1 차단 항체의 선택
하이브리도마 생산 항체는 인간 KLRG1 ECD 및 시노몰구스 KRG1 ECD에 대한 결합에 대해 스크리닝되었다. KLRG1과 E-캐드헤린 사이의 상호작용을 중화하는 항체들의 능력을 결정하기 위해 두 항원들 사이에 교차 반응성이 있는 항체들을 선택하여 다음 스크리닝 단계로 보냈다. 항체는 인간 및 cyno KLRG1에 대한 이들의 결합 EC50에 따라 순위를 결정하였으며 추가로 E-캐드헤린 경쟁 분석에서 이들의 IC50에 따라 우선순위를 정하였다. 이 기준에 따라 총 48개의 항체가 선택되었다. 8개의 항체가 세포 기반 분석에서 기능적 특성화에 대해 우선순위가 정해졌다. 표 3은 선택된 8개 마우스 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 요약하고 표 4는 선택된 8개 마우스 항체에 대한 CDR 영역을 보여준다. 항체들은 추가로 표 7에 요약된 서열 책임 모티프의 존재에 따라 순위가 지정되었다. ABC_G1N01 및 ABC_G1N02의 CDR-L1에서 약물 물질의 안정성 제조가능성 및 활성에 영향을 미칠 수 있는 탈아마이드화 부위 (NG)가 발견되었다. 이러한 가능한 책임을 제거하기 위해 일련의 돌연변이체를 제작하고 테스트하였다. 구체적으로, NG 모티프는 결합의 손실없이 NA, QG 및 KG 서열로 치환될 수 있다. 마우스 항체는 CDR 영역을 인간 프레임워크에 이식하여 인간화될 수 있다. 표 1은 ABC_G1N01 (ABC_HG1N01), ABC_G1N02 (ABC_HG1N02) 및 ABC_G1N07 (ABC_HG1N07)에 대한 인간화 구조체들의 가변 영역 서열들의 예를 보여준다. 또한 친화성, 효능 또는 생물물리학적 특성을 개선하기 위해 CDR 영역에 보존적 돌연변이를 만들 수 있다. 표 5는 CDR 영역에 만들 수 있는 보존적 돌연변이의 목록을 요약한다. 단일클론 항체는 서로 경쟁하는 이들의 능력에 따라 에피토프 비닝 (epitope binned)되었다. 항체는 3개의 서로 다른 빈들로 그룹화 될 수 있음이 밝혀졌으며, BIN1에는 다음이 포함된다: ABC_G1N01, ABC_G1N02, ABC_G1N03, ABC_G1N04, ABC_G1N05. BIN2에는 다음이 포함된다: MAB25, MAB031. BIN3에는 다음이 포함된다: ABC_G1N07, ABC_G1N08. 항체는 가변 마우스 영역을 인간 IgG 불변 프레임워크에 클로닝함으로써 키메라로 생산되었고, 인간 T 세포에 대한 기능적 활성을 결정하기 위한 그리고 본원에 기재된 기능적 분석에서 테스트되었다.
표 7: 항체를 잠재적 제조가능성 문제에 관하여 스크리닝하기 위해 사용되는 서열 책임 모티프
Figure pct00009
실시예 4: KLRG1에 대한 항체 결합 (EC50) 및 KLRG1/E-캐드헤린 상호작용의 억제(IC50)에 관한 FACS에 의한 특성화
세포 발현된 인간 및 시노몰구스-KLRG1에 대한 항-KLRG1 단일클론 항체의 결합이 FACS에 의해 수행되었다. 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포를 안정적으로 형질감염시켜 전장 인간 KLRG1 (CHO-인간-KLRG1) 및 시노몰구스 KLRG1 (CHO-시노몰구스-KLRG1)을 발현시켰다. EC50 값은 1-100nM 범위의 다양한 농도의 항-KLRG1 단일클론 항체를 배양하고 형광 프로브와 직접 접합된 항-마우스 검출 항체를 사용하여 표지된 세포의 형광을 측정하여 결정되었다.
E-캐드헤린/KLRG1 결합을 억제하는 단일클론 항체의 능력은 FACS에 의해 측정되었다. E-캐드헤린의 CHO-hKLRG1 세포에 대한 결합은 먼저 KLRG1 발현 세포를 다양한 농도의 HIS 태그된 재조합 E-캐드헤린과 함께 배양하여 결정되었으며 항-HIS 검출 항체를 사용하여 FACS에 의해 검출되었다. E-캐드헤린/KLRG1 상호작용의 EC50은 이 방법에 의해 1μM인 것으로 결정되었다. 각 단일클론 항체에 대한 IC50 값은 0.1로부터 100 nM까지 단일 클론 항체의 농도를 변화시키는 함수로서 E-캐드헤린 결합의 손실을 모니터하여 결정되었다. EC50 및 IC50 값은 SigmaPlot 소프트웨어를 사용하여 계산되며 표 8에 요약되어 있다.
표 8: FACS에 의해 측정된 MAB의 결합 EC50 및 E-캐드헤린 억제 IC50.
Figure pct00010
실시예 5: 결합 동역학 측정
인간 및 시노몰구스 KLRG1에 대한 인간화 항체의 결합 동역학은 OCTET® 측정에 의해 결정되었다. OCTET® 시스템은 생물-층 간섭계 (Bio-Layer Interferometry, BLI) 기술을 사용하여 단백질 및 기타 생체 분자의 이들의 파트너에 대한 직접 결합을 실시간으로 모니터링하고, 동역학 결합 상수 분석을 제공한다. https://www.fortebio.com/bli-technology.html을 참조, 이의 내용은 이와 관련된 모든 링크 및 하위 링크를 포함하여 그 전문이 본원에 참고문헌으로 포함된다. 실험 셋업은 스트렙타비딘 OCTET® 센서에 비오틴화된 재조합 항원 (인간-KLRG-ECD 또는 시노몰구스-KLRG1-ECD)을 고정시켜 항원 로드된 센서를 생성하는 것으로 구성된다. 로드된 센서는 항체/항원 복합체의 결합 동역학 (Kon)을 측정하기 위해 OCTET® 기기에서 100 내지 0.1 nM의 각 인간화 항체의 다양한 농도에 노출되며, 데이터는 600초 동안 수집되었다. 후속 단계에서 이들 센서는 해리 동역학 (Koff)을 관찰하기 위해 항체가 없는 1 X 인산염 완충 식염수 (PBS) 완충액에 600초 동안 노출된다. 이후 생성된 데이터를 ForteBio® 분석 소프트웨어를 사용하여 1:1 결합 동역학 모델에 적합시켜 KD를 계산한다. 이 방법에 의해 유도된 3개의 인간화 항체에 대한 동역학 결합 매개변수들이 표 9에 요약되어 있다.
표 9: OCTET ® 에 의해 측정된 선택된 MAB들의 결합 친화도:
Figure pct00011
실시예 6: KLRG1 차단 항체의 기능적 활성 특성화
IFNγ의 생산 및 T 세포의 증식에 대한 항체 매개 KLRG1 신호전달 차단의 효과를 측정 (증식 지수)함으로써 KLRG1과 그 리간드의 상호작용을 차단하는 것이 인간 CD8+ T 세포에 대한 활성화 효과를 가짐이 결정되었다. 면역계의 세포에 대한 KLRG1 차단 효과를 입증하기 위해, CD8+ T 세포들을 건강한 공여자로부터 분리하고 CD3 효현제 및 E-캐드헤린 (eAPC)을 공동-발현하는 CHO 세포주와 공동-배양하여 테스트하였다. 이 분석은 CD3 자극이 E-캐드헤린의 억제 효과에 의해 상쇄되는, 2개의 경쟁 신호들을 T 세포에 제공함으로써 이루어진다. 항-KLRG1 항체에 의해 KLRG1 신호가 차단되면 억제 신호가 방해받고 T 세포는 세포 표면에서 발현되는 CD3 효현제와의 상호작용에 따라 활성화된다. IFNγ분비는 ELISA에 의해 측정되고 결과는 표 10 및 도 1에 요약되어 있다.
표 10: 인간 CD8+ T 세포에서 KLRG1 차단 항체에 의한 IFNγ방출의 복원
Figure pct00012
이 데이터는 E-캐드헤린이 인간 T 세포에 대한 억제 효과를 가지고 있으며 이는 차단 항체로 KLRG1 신호를 차단함으로써 역전될 수 있음을 입증한다.
표 11 및 도 2에 제시된 데이터는 eAPC에 대한 반응으로 증식 지수를 측정함으로써 KLRG1/E-캐드헤린 상호작용의 차단이 인간 CD8+ T 세포를 증식시킴을 입증한다. 이 분석에서 eAPC는 h-E캐드헤린 및 CD3 효현제를 사용하여 CHO 세포를 안정적으로 형질도입하여 생산되었다. 이렇게 생성된 eAPC는 10 마이크로그램/ml의 테스트 항체 또는 아이소형 대조군의 존재하에 건강한 지원자로부터 새로 분리된 CD8+ T 세포와 함께 3일 동안 공동배양되었다. 양성 대조 샘플은, 항-CD3를 안정적으로 발현하지만 억제 리간드 E-캐드헤린의 발현이 없는 CHO 세포와 함께 CD8+ T 세포를 배양하여 CHO 세포에서 발현된 항-CD3에 의해 CD8+ T 세포 자극을 억제하지 않음으로써 준비되었다. 결과는 예상대로 CD3 자극에 반응하여 CD8+ T 세포가 증식하고 eAPC에서 억제 리간드 E-캐드헤린 공동-발현이 CD8+ T 세포의 증식을 억제한다는 것을 보여준다. 또한, CD8+ T 세포 증식은 항체를 중화하여 KLRG1을 차단함으로써 회복 될 수 있다.
표 11: KLRG1 차단이 CD8+ T 세포 증식에 미치는 영향
Figure pct00013
표 12 및 도 3에 제시된 데이터는 IFNγ분비 분석에서 T 세포 활성과 항-KLRG1 중화제 항체의 차단 활성 사이의 상관관계를 보여준다. 각 항체에 대한 IC50 값은 E-캐드헤린 결합 억제 연구에서 유도되었으며 CD8+ T 세포 IFNγ방출 분석에서 측정된 IFNγ생산 수준에 대해 플롯되었다. 상관관계는 IC50 값이 더 낮은 항체 (예컨대, KLRG1/E-캐드헤린 결합의 더 강력한 차단제)가 CD8+ T 세포에 의해 더 높은 수준의 IFNγ를 방출함을 보여준다. 이 데이터는 KLRG1의 항체 차단이 E-캐드헤린 의존 방식으로 T 세포 활성을 회복시킴을 보여준다.
표 12: E-캐드헤린 IC50 경쟁 값과 IFNγ분비의 상관관계
Figure pct00014
SEQUENCE LISTING <110> ABCURO INC. <120> ANTI-KLRG1 ANTIBODIES <130> 117872-4 <160> 91 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized mouse antibody partial sequence <400> 1 Gln Val Ile Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Phe 20 25 30 Gly Met Gly Ile Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asn Asp Asp Lys Ser Tyr Asn Ser Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Thr Ile Tyr Tyr Gly Asn Tyr Leu Thr Phe Tyr Ala Met 100 105 110 Glu His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized mouse antibody partial sequence <400> 2 Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 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Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 30 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Val Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Phe Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Asp His Ile Tyr Asn Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ile Ser Leu Gln Thr 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Asn Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 31 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Thr Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Ser Ile Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 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Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Ser Gly Arg Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Asn Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Val Ser Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Thr Gly Val Thr Thr Val Val Phe Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 34 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Ser 20 25 30 Leu Asn Trp Leu Gln Gln Gly Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Ser Thr Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Val Ala Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Leu Ser Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 35 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr His 20 25 30 Ala Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Leu Leu Leu Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 36 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Thr Ser Ser Val Ser Ser Thr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Arg 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Arg Arg Ser Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 37 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Glu Ser Gly Asn Tyr Asn Asn Tyr Pro Asp Asn Val 50 55 60 Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Leu Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Asp Asp Trp Glu Gly Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 38 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38 Gly Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Arg Asp Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Val Asp Tyr Phe Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 39 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 39 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Phe Leu His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Met Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Cys Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Val Ser Ser Leu Thr Tyr Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Ile Gly Tyr Trp Asp Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 40 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 40 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Thr Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Met Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Asp Leu Lys 100 105 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 41 Gly Phe Ser Leu Thr Thr Phe Gly Met 1 5 <210> 42 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 42 Trp Trp Asn Asp Asp 1 5 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 43 Thr Ile Tyr Tyr Gly Asn Tyr Leu Thr Phe Tyr Ala Met Glu His 1 5 10 15 <210> 44 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 44 Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 45 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 46 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Pro Thr 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 47 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Phe Gly Met 1 5 <210> 48 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 48 Trp Trp Asp Asp Asp 1 5 <210> 49 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 49 Val Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Ser Ala Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 50 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 50 Lys Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly His Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 52 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Val Thr 1 5 <210> 53 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 53 Gly Asp Thr Phe Thr Thr Tyr Asp Ile Thr 1 5 10 <210> 54 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 54 Tyr Pro Lys Asp Gly Arg 1 5 <210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 55 Arg Gly Gln Phe Gly Pro Tyr Phe Asp His 1 5 10 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 56 Arg Ala Ser Asp His Ile Tyr Asn Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 57 Gly Ala Thr Ser Leu Glu Thr 1 5 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 58 Arg Gly Gln Phe Gly Pro Tyr Phe Asp His 1 5 10 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 59 Gly Phe Ser Phe Ser Thr Phe 1 5 <210> 60 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 60 Ser Ser Gly Ser Tyr Ser 1 5 <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 61 Thr Arg Thr Arg Asp Ser Gly Ser Ser Pro His Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 62 Arg Ala Ser Lys Ser Val Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn 1 5 10 15 <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 63 Gly Ala Ser Asn Arg Gly Ser 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 64 Gln Gln Ser Lys Glu Gly Pro Phe Thr 1 5 <210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 65 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 1 5 <210> 66 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 66 Ser Ser Ser Gly Arg Tyr 1 5 <210> 67 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 67 Thr Gly Val Thr Thr Val Val Phe Thr Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 68 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 68 Ser Gln Asp Ile Gly Asn Ser 1 5 <210> 69 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 69 Ser Ser Leu Asp Ser 1 5 <210> 70 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 70 Leu Gln Tyr Leu Ser Ser Pro Pro Thr Phe 1 5 10 <210> 71 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 71 Gly Phe Ser Leu Thr Thr His 1 5 <210> 72 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 72 Trp Ser Gly Gly Asn 1 5 <210> 73 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 73 Leu Leu Leu Pro Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 74 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 74 Thr Ala Thr Ser Ser Val Ser Ser Thr Tyr Leu His 1 5 10 <210> 75 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 75 Ser Thr Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 76 His Gln Tyr Arg Arg Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210> 77 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 77 Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr 1 5 <210> 78 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 78 Ser Glu Ser Gly Asn Tyr 1 5 <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 79 Asp Asp Trp Glu Gly Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 80 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 80 Arg Ala Ser Arg Asp Ile Gly Ser Ser Leu Asn 1 5 10 <210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 81 Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 82 Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 83 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 1 5 <210> 84 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 84 Asn Pro Ser Ser Gly Tyr 1 5 <210> 85 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 85 Asp Arg Ile Gly Tyr Trp Asp Phe Asp Val 1 5 10 <210> 86 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 86 Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 87 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 87 Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 88 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 88 Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Leu Thr 1 5 <210> 89 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Leu Cys Gln Gly Ser Asn Tyr Ser Thr Cys Ala Ser Cys Pro Ser Cys 1 5 10 15 Pro Asp Arg Trp Met Lys Tyr Gly Asn His Cys Tyr Tyr Phe Ser Val 20 25 30 Glu Glu Lys Asp Trp Asn Ser Ser Leu Glu Phe Cys Leu Ala Arg Asp 35 40 45 Ser His Leu Leu Val Ile Thr Asp Asn Gln Glu Met Ser Leu Leu Gln 50 55 60 Val Phe Leu Ser Glu Ala Phe Cys Trp Ile Gly Leu Arg Asn Asn Ser 65 70 75 80 Gly Trp Arg Trp Glu Asp Gly Ser Pro Leu Asn Phe Ser Arg Ile Ser 85 90 95 Ser Asn Ser Phe Val Gln Thr Cys Gly Ala Ile Asn Lys Asn Gly Leu 100 105 110 Gln Ala Ser Ser Cys Glu Val Pro Leu His Trp Val Cys Lys Lys Val 115 120 125 Arg Leu 130 <210> 90 <211> 130 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 90 Leu Cys Gln Gly Ser Lys Tyr Ser Thr Cys Ala Ser Cys Pro Ser Cys 1 5 10 15 Pro Asp His Trp Met Lys Tyr Gly Asn His Cys Tyr Tyr Phe Ser Val 20 25 30 Glu Lys Lys Asp Trp Ile Ser Ser Leu Glu Phe Cys Leu Ala Arg Asp 35 40 45 Ser His Leu Leu Met Ile Thr Asp Lys Gln Glu Met Ser Leu Leu Gln 50 55 60 Asp Phe Leu Ser Glu Ala Phe His Trp Val Gly Leu Arg Asn Asn Ser 65 70 75 80 Gly Trp Arg Trp Glu Asp Gly Ser Pro Leu Asn Phe Ser Arg Ile Tyr 85 90 95 Ser Asn Ser Leu Val Gln Thr Cys Gly Ala Ile Asn Lys Asn Ser Leu 100 105 110 Gln Ala Ser Ser Cys Glu Val Ser Leu Gln Trp Val Cys Lys Lys Val 115 120 125 Ser Pro 130 <210> 91 <211> 728 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Asp Trp Val Ile Pro Pro Ile Ser Cys Pro Glu Asn Glu Lys Gly Pro 1 5 10 15 Phe Pro Lys Asn Leu Val Gln Ile Lys Ser Asn Lys Asp Lys Glu Gly 20 25 30 Lys Val Phe Tyr Ser Ile Thr Gly Gln Gly Ala Asp Thr Pro Pro Val 35 40 45 Gly Val Phe Ile Ile Glu Arg Glu Thr Gly Trp Leu Lys Val Thr Glu 50 55 60 Pro Leu Asp Arg Glu Arg Ile Ala Thr Tyr Thr Leu Phe Ser His Ala 65 70 75 80 Val Ser Ser Asn Gly Asn Ala Val Glu Asp Pro Met Glu Ile Leu Ile 85 90 95 Thr Val Thr Asp Gln Asn Asp Asn Lys Pro Glu Phe Thr Gln Glu Val 100 105 110 Phe Lys Gly Ser Val Met Glu Gly Ala Leu Pro Gly Thr Ser Val Met 115 120 125 Glu Val Thr Ala Thr Asp Ala Asp Asp Asp Val Asn Thr Tyr Asn Ala 130 135 140 Ala Ile Ala Tyr Thr Ile Leu Ser Gln Asp Pro Glu Leu Pro Asp Lys 145 150 155 160 Asn Met Phe Thr Ile Asn Arg Asn Thr Gly Val Ile Ser Val Val Thr 165 170 175 Thr Gly Leu Asp Arg Glu Ser Phe Pro Thr Tyr Thr Leu Val Val Gln 180 185 190 Ala Ala Asp Leu Gln Gly Glu Gly Leu Ser Thr Thr Ala Thr Ala Val 195 200 205 Ile Thr Val Thr Asp Thr Asn Asp Asn Pro Pro Ile Phe Asn Pro Thr 210 215 220 Thr Tyr Lys Gly Gln Val Pro Glu Asn Glu Ala Asn Val Val Ile Thr 225 230 235 240 Thr Leu Lys Val Thr Asp Ala Asp Ala Pro Asn Thr Pro Ala Trp Glu 245 250 255 Ala Val Tyr Thr Ile Leu Asn Asp Asp Gly Gly Gln Phe Val Val Thr 260 265 270 Thr Asn Pro Val Asn Asn Asp Gly Ile Leu Lys Thr Ala Lys Gly Leu 275 280 285 Asp Phe Glu Ala Lys Gln Gln Tyr Ile Leu His Val Ala Val Thr Asn 290 295 300 Val Val Pro Phe Glu Val Ser Leu Thr Thr Ser Thr Ala Thr Val Thr 305 310 315 320 Val Asp Val Leu Asp Val Asn Glu Ala Pro Ile Phe Val Pro Pro Glu 325 330 335 Lys Arg Val Glu Val Ser Glu Asp Phe Gly Val Gly Gln Glu Ile Thr 340 345 350 Ser Tyr Thr Ala Gln Glu Pro Asp Thr Phe Met Glu Gln Lys Ile Thr 355 360 365 Tyr Arg Ile Trp Arg Asp Thr Ala Asn Trp Leu Glu Ile Asn Pro Asp 370 375 380 Thr Gly Ala Ile Ser Thr Arg Ala Glu Leu Asp Arg Glu Asp Phe Glu 385 390 395 400 His Val Lys Asn Ser Thr Tyr Thr Ala Leu Ile Ile Ala Thr Asp Asn 405 410 415 Gly Ser Pro Val Ala Thr Gly Thr Gly Thr Leu Leu Leu Ile Leu Ser 420 425 430 Asp Val Asn Asp Asn Ala Pro Ile Pro Glu Pro Arg Thr Ile Phe Phe 435 440 445 Cys Glu Arg Asn Pro Lys Pro Gln Val Ile Asn Ile Ile Asp Ala Asp 450 455 460 Leu Pro Pro Asn Thr Ser Pro Phe Thr Ala Glu Leu Thr His Gly Ala 465 470 475 480 Ser Ala Asn Trp Thr Ile Gln Tyr Asn Asp Pro Thr Gln Glu Ser Ile 485 490 495 Ile Leu Lys Pro Lys Met Ala Leu Glu Val Gly Asp Tyr Lys Ile Asn 500 505 510 Leu Lys Leu Met Asp Asn Gln Asn Lys Asp Gln Val Thr Thr Leu Glu 515 520 525 Val Ser Val Cys Asp Cys Glu Gly Ala Ala Gly Val Cys Arg Lys Ala 530 535 540 Gln Pro Val Glu Ala Gly Leu Gln Ile Pro Ala Ile Leu Gly Ile Leu 545 550 555 560 Gly Gly Ile Leu Ala Leu Leu Ile Leu Ile Leu Leu Leu Leu Leu Phe 565 570 575 Leu Arg Arg Arg Ala Val Val Lys Glu Pro Leu Leu Pro Pro Glu Asp 580 585 590 Asp Thr Arg Asp Asn Val Tyr Tyr Tyr Asp Glu Glu Gly Gly Gly Glu 595 600 605 Glu Asp Gln Asp Phe Asp Leu Ser Gln Leu His Arg Gly Leu Asp Ala 610 615 620 Arg Pro Glu Val Thr Arg Asn Asp Val Ala Pro Thr Leu Met Ser Val 625 630 635 640 Pro Arg Tyr Leu Pro Arg Pro Ala Asn Pro Asp Glu Ile Gly Asn Phe 645 650 655 Ile Asp Glu Asn Leu Lys Ala Ala Asp Thr Asp Pro Thr Ala Pro Pro 660 665 670 Tyr Asp Ser Leu Leu Val Phe Asp Tyr Glu Gly Ser Gly Ser Glu Ala 675 680 685 Ala Ser Leu Ser Ser Leu Asn Ser Ser Glu Ser Asp Lys Asp Gln Asp 690 695 700 Tyr Asp Tyr Leu Asn Glu Trp Gly Asn Arg Phe Lys Lys Leu Ala Asp 705 710 715 720 Met Tyr Gly Gly Gly Glu Asp Asp 725

Claims (31)

  1. 서열 번호: 9, 서열 번호: 15, 서열 번호: 21, 서열 번호: 43, 서열 번호: 49, 서열 번호: 55, 서열 번호: 61, 서열 번호: 67, 서열 번호: 73, 서열 번호: 79, 또는 서열 번호: 85에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 항체는 인간 살해 세포 렉틴-유사 수용체 서브패밀리 G 멤버 1 (KLRG1)의 세포외 도메인 및 시노몰구스 원숭이 KLRG1의 세포외 도메인에 특이적으로 결합함을 특징으로 하는 항체.
  3. 청구항 1에 있어서, 실질적으로 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 또는 서열 번호: 40에 제시된 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 항체.
  4. 청구항 1에 있어서, 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 및 서열 번호: 40으로 구성된 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 항체.
  5. 청구항 1에 있어서, 항체는 서열 번호: 89 및 서열 번호: 90으로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 하나의 서열의 적어도 100개의 연속 아미노산 서열에 적어도 95% 동일한 아미노산 서열에 특이적으로 결합함을 특징으로 하는 항체.
  6. 청구항 5에 있어서, 항체는 KD로 표현되는, 적어도 약 2 nM, 약 1 nM, 약 100 pM, 약 10 pM, 또는 약 5 pM의 친화도로 KLRG1의 세포외 도메인에 특이적으로 결합함을 특징으로 하는 항체.
  7. 청구항 5에 있어서, 항체는 약 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 또는 10 nM 미만의 IC50으로 KLGR1에 대한 E-캐드헤린의 결합을 억제함을 특징으로 하는 항체.
  8. 청구항 1에 있어서, 항체는 인간화됨을 특징으로 하는 항체.
  9. 청구항 1에 있어서, 항체는 IgG1 또는 IgG4임을 특징으로 하는 항체.
  10. 청구항 9에 있어서, 항체는 IgG1λ 또는 IgG1κ임을 특징으로 하는 항체.
  11. 청구항 1에 있어서, 항체는 ABC_HG1N01, ABC_HG1N02, ABC_HG1N07, ABC_G1N01, ABC_G1N02, ABC_G1N03, ABC_G1N04, ABC_G1N05, ABC_G1N06, ABC_G1N07, 또는 ABC_G1N08임을 특징으로 하는 항체.
  12. 청구항 1의 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  13. 청구항 12의 약학 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 약학 조성물은 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여됨을 특징으로 하는 방법.
  15. 청구항 13에 있어서, 대상체는 인간임을 특징으로 하는 방법.
  16. 인간 프레임워크 영역을 포함하는 항체로서, 이 때 상기 항체는 KLRG1에 특이적으로 결합하고, 그리고 항체는 인간 또는 시노몰구스 원숭이 KLRG1과 E-캐드헤린 사이의 결합을 차단할 수 있는, 항체.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 항체는 ABC_HG1N01, ABC_HG1N02, ABC_HG1N07, ABC_G1N01, ABC_G1N02, ABC_G1N03, ABC_G1N04, ABC_G1N05, ABC_G1N06, ABC_G1N07, 또는 ABC_G1N08에서 유래한 CDR을 포함함을 특징으로 하는 항체.
  18. 청구항 1의 항체를 인코드하는 분리된 핵산.
  19. 청구항 18의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  20. 청구항 19의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  21. 청구항 20에 있어서, 숙주 세포는 다음에서 선택됨을 특징으로 하는 숙주 세포: 대장균 박테리아, 중국 햄스터 난소 세포, HeLa 세포, 및 NS0 세포.
  22. 청구항 18에 있어서, 핵산은 서열 번호: 1, 서열 번호: 2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 또는 서열 번호: 40에 제시된 아미노산 서열을 인코드함을 특징으로 하는 핵산.
  23. 다음을 포함하는, 인간 및 시노몰구스 원숭이 KLRG1의 세포외 도메인과 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편의 제조 방법:
    (a) 대체될 CDR3를 포함하거나 또는 CDR3 인코딩 영역이 없는 가변 도메인을 인코드하는 핵산들의 시작 레퍼토리를 제공하는 단계;
    (b) 실질적으로 서열 번호: 9, 서열 번호: 15, 서열 번호: 21, 서열 번호: 43, 서열 번호: 49, 서열 번호: 55, 서열 번호: 61, 서열 번호: 67, 서열 번호: 73, 서열 번호: 79, 또는 서열 번호: 85에 제시된 아미노산 서열을 인코드하는 공여자 핵산과 상기 레퍼토리를 조합하고, 그리하여 공여자 핵산이 레퍼토리의 CDR3 영역에 삽입되어, 가변 도메인을 인코드하는 핵산들의 생성물 레퍼토리를 제공하는 단계;
    (c) 생성물 레퍼토리의 핵산들을 발현시키는 단계;
    (d) 단계 (c)로부터 인간 및 시노몰구스 원숭이 KLRG1의 상기 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 가변 도메인, 또는 이의 단편을 인코드하는 핵산을 선택하는 단계; 및
    (e) 가변 도메인, 또는 이의 단편, 또는 (d)의 상기 가변 도메인 또는 이의 단편을 인코드하는 핵산을 회수하는 단계.
  24. 청구항 23의 방법에 의해 생산된 항체.
  25. 림프구를 항-KLRG1 항체 또는 이의 단편과 접촉시키는 것을 포함하는 CD8+ T 및 NK 세포 활성화의 조절 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 림프구는 T 세포 또는 NK 세포임을 특징으로 하는 방법.
  27. 청구항 25에 있어서, 항체는 청구항 1과 같음을 특징으로 하는 방법.
  28. 청구항 25에 있어서, 항체는 청구항 24와 같음을 특징으로 하는 방법.
  29. 청구항 25에 있어서, 항-KLRG1 항체는 CD8+ T 및 NK 활성화를 조절하고 인간 및 시노몰구스 원숭이 KLGR1에 대한 E-캐드헤린의 결합을 억제함을 특징으로 하는 방법.
  30. 청구항 1의 항체와 교차 경쟁하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  31. 청구항 1의 항체를 포함하는 조성물.
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