JP4524181B2 - Cd16a結合タンパク質および免疫障害治療のための使用 - Google Patents
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Description
別段の定義がない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語、表記法、および他の科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって共通に理解されている意味をもつものとする。本明細書において、場合によっては、共通に理解されている意味をもつ用語が、明確さを目的として、および/または参照の容易さを目的として定義されているが、本明細書にそのような定義が含まれていても、必ずしも当技術分野で一般に理解されている意味との実質的な相違を表すものと解釈するべきではない。本発明の実施は、別段の指示がない限り、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生理学、生化学、核酸化学、および免疫学における従来技術を使用するものであり、それらは当技術分野の技術に含まれる。そのような技術は、Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.、eds.、1999、including supplements through 2001);Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.、eds.、1987、including supplements through 2001);Molecular Cloning:A Laboratory Manual、third edition(Sambrook and Russel、2001);PCR:The Polymerase Chain Reaction、(Mullis et al.、eds.、1994);The Immunoassay Handbook(D.Wild、ed.、Stockton Press NY、1994);Bioconjugate Techniques(Greg T.Hermanson、ed.、Academic Press、1996);Methods of Immunological Analysis(R.Masseyeff、W.H.Albert、and N.A.Staines、eds.、Weinheim:VCH Verlags gesellschaft mbH、1993);Harlow and Lane、Using Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1999;およびBeaucage et al.eds.、Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry、John Wiley & Sons,Inc.、New York、2000)などの文献に十全に説明されている。
FcγRIIIA受容体、すなわちCD16Aは、細胞傷害抗体および免疫複合体抗体をエフェクター反応と共役させる役割を果たしている。自己免疫疾患および他の疾患状態では、FcγRIIIA受容体と免疫グロブリン凝集(例えば、免疫複合体)との相互作用が生じ、それによって、対象における有害な炎症反応が引き起こされると考えられている。特定の機構に拘泥するものではないが、この炎症反応は、FcγRIIIA受容体(本明細書において、通常、「CD16A」または「CD16A受容体」と呼ぶ)と、免疫グロブリン凝集との相互作用を減弱させることによって、緩和されるものと考えられている。同様に特定の機構に拘泥するものではないが、CD16Aと免疫グロブリン凝集との相互作用を減少させる方法の1つは、抗CD16A抗体、または他のCD16A結合タンパク質を使用して、この相互作用を阻害することであると考えられている。
本発明の方法において、様々なCD16A結合タンパク質を使用することができる。適当なCD16A結合タンパク質には、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、およびCD16A結合タンパク質断片(例えば、scFv抗体、単鎖抗体、Fab断片、低分子抗体)、ならびに、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、または、これら両方との相互作用を介してCD16Aに結合する他の抗体様タンパク質が含まれる。
本発明の実施において使用できるCD16A結合タンパク質には、マウスモノクローナル抗体3G8のCDR配列に由来する(例えば、それらに同一または類似の配列をもつ)CDR配列を含むタンパク質が含まれる。マウス3G8モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする相補的なcDNAを、CDRをコードする配列も含めて、実施例に記載されるように、クローニングし、さらに配列決定した。3G8の核酸配列およびアミノ酸配列は下記に提供されており、配列番号1および2(VL)、ならびに配列番号3および4(VH)と指定されている。マウス可変領域配列およびCDR配列を用いて、3G8 CDRに由来する相補性決定領域を含む、多数のキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体を生成し、それらの特性を分析した。CD16Aに高い親和性で結合し、さらに他の望ましい特性をもつヒト化抗体を特定するため、3G8に由来するCDRをもつVH領域を含む抗体重鎖を生成し、3G8に由来するCDRをもつVL領域を含む抗体軽鎖と組み合わせ、分析用四量体抗体を生成した。得られた四量体抗体の特性を、下記のようにして測定した。本明細書下記にあるヒト化抗体タンパク質などの、3G8 CDR含有CD16A結合タンパク質は、下記のように、有害な免疫応答を軽減するために、本発明に従って使用することができる。
一態様において、本発明のCD16Aタンパク質は、少なくとも1つのCDR(通常3つのCDR)が、マウスモノクローナル抗体3G8重鎖の1つのCDR(より典型的には、3つのCDRすべて)の配列をもつものであり、このCD16A結合タンパク質の残部が実質上ヒト配列(1つまたは複数のヒト抗体の重鎖可変領域に由来し、かつこれに実質上類似)である重鎖可変ドメインを含むこともある。
好ましい結合特性を有する軽鎖可変ドメイン配列を特定するための同様な実験を行った。一態様において、本発明は、少なくとも1つのCDR(通常、3つのCDR)がマウスモノクローナル抗体3G8軽鎖の1つのCDR(より典型的には、3つのCDRすべて)の配列をもつ軽鎖可変領域を含むCD16A結合タンパク質であって、その残部が実質上ヒト配列(1つまたは複数のヒト抗体の軽鎖可変領域に由来し、かつ、これに実質上類似)であるCD16A結合タンパク質を提供する。
当技術分野で公知であり、さらに本明細書の他の場所に記載するように、免疫グロブリンの軽鎖と重鎖とを、両者が会合して四量体抗体を生成する条件下で、組換えによって発現させることができ、あるいは生体外で両者を混合することによって四量体抗体を生成させることができる。同様に、VLドメインおよび/またはVHドメインの混合を複数の単鎖抗体として発現することができ、さらには、VLドメインおよび/またはVHドメインを含む他のCD16A結合タンパク質を公知の方法で発現させることもできる。本明細書に記載の3G8由来VLドメインは、本明細書に記載の3G8由来VHドメインと混合してCD16A結合タンパク質を生成できるものであり、そのような組合せのすべてが考慮されることが理解されるであろう。
上述のように、本発明のCD16A結合タンパク質は、軽鎖定常領域および/または重鎖定常領域(IgG分子のCH1ドメインおよびCH2ドメインを接続するヒンジ領域を含む)を含むことができる。どのタイプ(例えば、IgM、IgG、IgD、IgAおよびIgE)の免疫グロブリンからの定常ドメインを用いてもよい。軽鎖定常ドメインはラムダでも、カッパでもよい。重鎖定常ドメインはどのイソタイプ(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4)でもよい。キメラ定常ドメイン、定常ドメインの部分、および天然存在のヒト抗体定常ドメインの変種(アミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を含む)を用いることもできる。例えば、定常ドメインのアミノ酸を改変することによって、結果として生じるポリペプチドの免疫原性または半減期を改変するなど、特性の追加、または異なる特性の提供を行うことができる。そのような改変は、少数(例えば、10未満、つまり1つ、2つ、3つなど)のアミノ酸残基の挿入、欠失、または置換に始まり、定常ドメインのかなりの改変に至るまでの広い範囲のものである。考慮される改変には、膜受容体との相互作用、補体結合、循環の持続性、および他のエフェクター機能に影響を与える改変が含まれる。例えば、米国特許第6,277,375号に記載されているように、ヒンジ領域または他の領域を改変することができる。特に、Fc領域のアミノ酸を欠失または改変することは、しばしば有益となるだろう。例えば、Fc領域を改変することによって、抗体のエフェクター機能が失われる(または、大幅に低下する)ように、FcγRIIIおよびC1q補体成分などのエフェクターリガンドへの結合性を低下もしくは消失させることができる。そのような改変Fc領域をもつ抗体は、哺乳動物に投与した際、無改変の抗体に比べ、抗体依存性細胞傷害(ADCC)および/または補体介在細胞溶解をまったく引き起こさないか、またはほとんど引き起こさない。エフェクター機能を欠失している抗体を特定するためのアッセイは、当技術分野で公知である。米国特許第6,194,551号、第6,528,624号、および第5,624,821号、欧州特許EP 0 753 065 B1、ならびに国際公開WO 00/42072を参照のこと。
上述のように、Fcドメインを含む(例えば、抗CD16Aモノクローナル抗体)本発明のCD16A結合タンパク質中のFcドメインは、所望の特性をもたらすように改変することができる。ある特定の態様において、本発明は、グリコシル化されていないFc領域を含む、ヒトまたはヒト化抗CD16Aモノクローナル抗体などの、CD16A結合タンパク質を提供する。下記実施例10に実証されるように、本発明は、予想外にも、エフェクター機能が改変されている抗CD16A抗体(非グリコシル化抗体)を投与することで、深刻な急性好中球減少症を引き起こすことなく、自己免疫障害に対する防御が得られることを発見した。この発見に基づき、危険な副作用を引き起こすことなく、自己免疫障害に対する防御を与える治療用抗CD16A抗体を設計することができる。
本発明のCD16A結合タンパク質は、新規蛋白質合成、およびCD16A結合タンパク質をコードする核酸の組換え発現を含む、当技術分野において周知の様々な方法によって、生成することができる。所望の核酸は、組換え法(例えば、所望のポリペプチドの、以前に調製した変種をPCRによって突然変異誘発する)、または固相DNA合成によって生成可能である。通常、組換え発現法が用いられる。一態様において、本発明は、本明細書に記載のCD16A結合タンパク質あるいはそのCD16A結合断片をコードする配列、例えば、本明細書に記載のVLもしくはVH、または本明細書に記載の抗体重鎖もしくは軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。遺伝暗号の縮重のため、免疫グロブリンの各アミノ酸配列は、様々な核酸配列によってコードされ、本発明は、本明細書に記載したCD16A結合タンパク質をコードするすべての核酸を含むものである。
特定の実施形態において、下記の特性をもつCD16A結合タンパク質が本発明の方法で用いられる。
CD16A結合タンパク質は、それらの結合特性および生物活性を参照して記述することができる。様々な実施形態において、本発明のCD16A結合タンパク質と、CD16Aとの相互作用に関する結合定数は、0.1nMから5nMの間、約2.5nM未満、約1nM未満、または約0.5nM未満である。通常、CD16A結合タンパク質は、3G8、または本明細書において後述する重鎖Ch3G8VHおよび軽鎖Ch3G8VLを含むキメラ抗体が同様条件下に示す結合親和性の4倍以下の結合親和性、場合によっては、2倍以下の親和性でCD16Aに結合する。一実施形態において、CD16A結合タンパク質のCD16Aに対する結合親和性は、3G8の結合親和性より高い。別の実施形態において、CD16A結合タンパク質のCD16Bに対する結合親和性は、3G8またはキメラ抗体Ch3G8の親和性より高くなく、さらに、これらの親和性より低いことが好ましい。
本発明のCD16A結合タンパク質における別の特性は、CD16Aへの免疫複合体の結合に対する阻害能(IC阻害能)をもつことである。通常、本発明のCD16A結合タンパク質は、3G8、または本明細書に記載のキメラ抗体、Ch3G8が同様条件下に示すIC阻害能の4倍以下、好ましくは、2倍以下のIC阻害能をもつ。
有害な免疫応答を軽減する、本発明のCD16A結合タンパク質の能力は、様々な動物モデルで評価することができる。モデル系の一例には、特発血小板欠乏症性紫斑病(ITP)のマウスモデルがある(Oyaizuら、1988年、J Exp.Med.167:2017-22;Mizutaniら、1993年、Blood 82:837-44参照)。後述の実施例9を参照のこと。他の適当なモデルは、当技術分野において公知である。他の動物モデルには、炎症性疾患の齧歯類モデルが含まれ、これらのモデルに関しては、例えばCurrent Protocols in Immunologyに記載されている(場合によっては、ヒトCD16Aによって形質転換された齧歯類動物を使用する変更が加えられる)。トランスジェニックマウスは、日常的手法を用いて作製可能であり、また、販売元から購入することもできる(例えば、TaconIC Inc.、German Town New York)。
ch3G8に含まれている可能性もあり、CD16A結合タンパク質を発現するのに異なる細胞系を用いることで、そのような翻訳後修飾が除去されているのかもしれない。イソタイプおよび/またはイソタイプを含む変異を組み合わせてエフェクター機能を除去することによって、Fcから炭水化物を除去するのと同様の防御効果が得られる可能性がある。
本明細書に記載したように、有害な免疫応答に特徴づけられる多数の疾病および症状を、本発明のCD16A結合タンパク質(例えば、本明細書に記載のVLドメインおよび/またはVHドメインを含み、さらに、任意選択で、本明細書に記載した、エフェクター機能を低下させる改変をもつFc領域を含む)を用いて治療することができる。一実施形態において、CD16A結合タンパク質は自己免疫疾患(即ち、自己抗体の産生によって特徴づけられる疾患)を患っている対象に投与される。自己免疫疾患でみられる病原性のIgG抗体は、これらの疾患の病原トリガーであるか、または疾患の進行に寄与し、さらに細胞性Fc受容体の不適切な活性化を通して疾患を媒介すると考えられている。凝集した自己抗体および/または自己抗原と自己抗体との複合体(免疫複合体)は活性化FcRに結合し、それによって多数の自己免疫疾患の病原性続発症(これは一部、免疫に媒介された、自己組織に対する炎症に起因する)を引き起こす。特定の作用機構に拘泥するものではないが、本明細書に記載のCD16A結合タンパク質は、自己免疫抗体とFcγRIII受容体との相互作用に干渉し、これを減弱させる。
関連する一態様において、本発明は、1つまたは複数のFc領域を含むCD16A結合タンパク質(例えば、2つのFcドメインを含む抗CD16A抗体)の治療効果を、このタンパク質を改変して、元の(無改変の)Fc領域と比べ、少なくとも1つのFcエフェクターリガンドに対する結合性を低下させることによって向上させる方法を提供する。例えば、Fc領域を改変して、Fc領域がグリコシル化されないようにすることができる。上述のように、Fc領域の改変はいくつかの方法で(例えば、遺伝的突然変異によって、Fcのグリコシル化パターンが変わるように発現系を選択することによって、および同様の方法によって)行うことができる。一実施形態において、FcエフェクターリガンドはFcγRIIIである。一実施形態において、FcエフェクターリガンドはC1q補体成分である。この文脈で用いられるように、対象のCD16A結合タンパク質が投与されたとき、好中球減少症を引き起こさない(または、引き起こした好中球減少がより軽度である)場合、対象のCD16A結合タンパク質は、好中球減少症を引き起こす標準結合タンパク質に比べて、「治療効果」が向上されているという。例えば、有害な免疫応答(例えば、ITPまたは、哺乳動物で実験的に誘導されたITP)の重篤度を低下させ、さらにこの哺乳動物における好中球レベルをx%低下させるCD16A結合タンパク質が、この哺乳動物において有害な免疫応答の重篤度を低下させ、さらに好中球レベルをy%低下させるCD16A結合タンパク質に比べて、より大きな治療効果をもつのは、yがxより大きい場合、例えば、2倍大きい場合である。一実施形態において、CD16A結合タンパク質は、改変されたタンパク質が非グリコシル化されているような変異によって改変される。
実施例
A)マウス3G8 VHおよびVL
マウス3G8抗体軽鎖をコードするcDNAをクローニングした。3G8抗体重鎖の配列はJeffry Ravetch博士によって提供された。3G8 VHおよびVLのアミノ酸配列を、表1および表3に提供する。可変部をコードする核酸配列は、下記の通りである。
ヒト定常ドメインに融合したマウス3G8 VHの発現をコードするキメラ遺伝子を生成するために、標準的な技法(オーバーラップPCR増幅を含む)を用い、シグナルペプチドをコードする配列(Orlandiら、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 86:3833-37;下記小文字下線部)、およびヒトCγ1定常領域(下記小文字)に、3G8 VHをコードする核酸を融合した。クローニングを容易にするためにSacl部位を導入し、その結果、VH FR4(ala->ser)という単一残基変化が生じた。FR4におけるこの変化は、CD16への結合性に影響を与えない。この結果得られた核酸は、下記に示す配列をもつ。VHドメインをコードする領域を大文字で示す。
ヒト定常ドメインに融合されたマウス3G8 VLをコードするキメラ遺伝子を生成するために、標準的な技法を用いて、この3G8 VL断片を、上記VH用のシグナル配列(小文字下線部)およびヒトCκ定常領域(小文字)cDNAに融合して、下記に示す配列をもつ核酸を得た。
上述のキメラタンパク質ch3G8VHおよびch3G8VLを同時発現し、ch3G8と名付けたキメラ抗体を形成させた。キメラ抗体ch3G8は、骨髄腫細胞中、または他の哺乳類細胞(例えば、CHO、BEK-293)中で発現することができる。ch3G8および変種などのCD16A結合タンパク質を発現のための操作手順の一例を、下記の実施例4に提供する。
A)ヒト化重鎖
マウス3G8 VHクローンから得たCDRをコードする配列をヒト生殖系列VH配列VH2-70に由来するフレームワーク配列に融合して、Hu3G8VHと名付けたVHをコードするポリヌクレオチドを生成した。このポリヌクレオチドは、オーバーラップPCR法で生成した。第1段階では、下記に示すプライマーおよびストラテジーを用い、マウス3G8 VHポリヌクレオチド(配列番号1)をテンプレートとして用いた。
マウス3G8 VLクローンから得たCDRをコードする配列を、ヒトB3生殖系列V-κ遺伝子に由来するフレームワーク配列に融合した。このポリヌクレオチドは、下記に示すストラテジーおよびプライマーを用い、マウス3G8 VLポリヌクレオチド(配列番号2)をテンプレートとして用いて、オーバーラップPCR法により生成した。
部位指向性突然変異によって、構成体中のVLドメインまたはVHドメインに配列変化が導入されている発現構成体を、追加構成体として生成した。典型的な突然変異生成反応は、容積0.05mlに、プラスミドDNA(E.coliのメチル化可能株から単離)10ng、それぞれ所定の変異を含有する順向プライマーおよび逆向プライマー各125ng、反応緩衝液、ならびにdNTPを含む。2.5ユニットのPfuTurbo DNAポリメラーゼ(Stratagene)を添加し、反応液を、95℃、30秒;55℃、1分;68℃、12分で15サイクル処理した。その後、PCR産物をDpnIエンドヌクレアーゼで消化し、制限酵素処理されたDNAを用いて、E.coli株XL-10 Goldを形質転換した。DpnIはメチル化されたDNAのみを消化するので、この酵素によって、変異していない親プラスミドが消化され、所定の変異を含有する新規合成の非メチル化産物が支配的分子種として残されるであろう。
組換え四量体抗体(即ち、2つの重鎖と、2つの軽鎖とを含む)の一過性発現のために、EEK-293細胞中に、様々な組合せの重鎖発現プラスミドおよび軽鎖発現プラスミド(例えば、上述のヒトCγ1定常ドメインおよびCκ定常ドメインに融合されたキメラ、ヒト化、および変異VLドメインおよびVHドメインを含む)を同時導入した。このような組換え四量体抗体は、本明細書において、時々「組換え抗体」と呼ばれる。トランスフェクションは、メーカーの指示に従い、6ウェルプレートにおいてLipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて行った。
可溶型CD16Aに対する抗体の結合を検出するために、サンドイッチELISA行った。
可溶型ヒトCD16Aを、膜貫通領域のすぐ手前で切断されたCD16A遺伝子を含むpcDNA3.1由来発現ベクターを用いて、HEK-293細胞で発現させた。ベクターを構築するために、CD16AをコードするcDNAを、プライマー3Aleft[gttggatcctccaactgctctgctacttctagttt](配列番号27)および3Aright[gaaaagcttaaagaatgatgagatggttgacact](配列番号28)を用いて増幅し、BamHIおよびHindIIIで消化し、ポリリンカーのBamHI/HindIII部位で、ベクターpcDNA3.1(Novagen)にクローニングした。構成体は、BEK-293細胞を一過的に形質移入するのに用いた。アッセイによっては、ヒトIgGセファロースカラムにおけるアフィニティークロマトグラフィーを用いて、分泌産物を培養上清から精製した。また、いくつかのアッセイでは、培養上清中のsCD16Aの量を定量し、未精製のsCD16Aを用いた。ELISA捕獲抗体(LNK16 mAb)は、この抗原に特異的に結合するため、精製の必要はなく、洗浄ステップで、夾雑物を除去することが可能であった。
プレートはまず、炭酸緩衝液中の抗CD16 mAb LNK16(Advanced Immuno Chemical、Long Beach CA;5th Human Lymphocyte Differentiation Antigens Workshopを参照)を100ng/ウェルを用いて、室温で2時間コーティングした。3G8の結合を阻害しないどの抗sCD16A抗体でも、用いることができる。PBS-T-BSAで30分間ブロッキングを行った後、sCD16A培養上清を1/10希釈で添加し、室温で16時間インキュベートした。あるいは、精製したsCD16を用いた場合、精製sCD16をPBS-T-BSAで50ng/mlの濃度に希釈した。各ウェルに0.05mlを添加し、少なくとも2時間室温でインキュベートした。
この実施例は、CD16Aへの結合に関する、ヒト化抗CD16A抗体の結合特性が、キメラ3G8抗体の結合特性と同じであるか、または類似であることを示す。
CHO-K1細胞で発現されたCD16Aに対する、選択されたヒト化抗体の結合を、直接結合競合アッセイによって測定した。
FITC-BSAに対する4-4-20結合のアッセイ
FITC-BSAに対するch4-4-20またはch4-4-20(D265A)の結合をELISAによって評価した。(Ch4-4-20は、3G8のVH領域およびVL領域の代わりに、4-4-20のVH領域およびVL領域をそれぞれ含有していることを除いて、Ch3G8と同一である。したがって、Ch4-4-20は、ハプテンフルオレセインに対する高親和性および特異性を保持している。4-4-20に関しては、Bedzyk et al.、1989、J Biol Chem 264:1565-9に記載されている)。Nuncマキシソーブイムノプレート(maxisorb immunoplates)を、炭酸緩衝液中のFITC-BSA(1μg/ml、50ng/ウェル)でコーティングし、約16時間置いて結合させた。BSAでブロッキングを行った後、Ch4-4-20の希釈液をウェルに加え、室温に1時間置き、結合させた。結合していないMAbを洗い落とした後、HRP結合のヤギ抗ヒトIg二次抗体を加えた。1時間後に二次抗体を除去、洗浄し、TMB基質で発色させた。酸性停止液を加え、続いて450nmでプレートを読み取った。ch4-4-20およびch4-4-20(D265A)の両方が、FITC-BSAに高い親和性で結合した(データは示されていない)。
ELISAプレート上で、ch4-4-20とFITC-BSAとの間で形成された免疫複合体(IC)に対するsFcRsの結合をアッセイするのにも、同じ方式を用いた。この場合、ビオチン化されたsFcR、またはビオチン化された抗ヒトG2 Mabを二次試薬として用い、これに続き、ストレプトアビジン-BRP検出を行った。
アッセイで最大シグナルの約90パーセントが得られるように、ch4-4-20濃度、およびsFcR濃度を固定した。sCD16Aをマウス3G8、キメラ3G8、またはヒト化3G8の系列希釈液と予備混合し、免疫複合体を含むプレートに加える前に、1時間インキュベートした。ヒト化3G8、またはキメラ3G8の系列希釈は、sCD16A-G2-ビオチンと一時間インキュベートした。この混合液は、その後、ヒトIgG1キメラ型の抗フルオレセインMab4-4-20と、FITC-BSAとの間の免疫複合体を含むELISAウェルに加えた。1時間後に、ICに対する可溶性受容体の結合を、ストレプトアビジン-HRP結合体とTMB発色を用いて検出した。この結果を図4に示す。このアッセイは、ヒト化抗CD16A抗体が、免疫複合体におけるCD16AのIgGへの結合に対する有効な阻害剤であることを示す。
標準的方法を用いて、マウスをsCD16Aで免疫処置し、さらに追加免疫した後、一団のハイブリドーマを生成した。sCD16Aで直接コーティングされたプレート上で結合活性を示す抗体を得るために、ELISAによって、8枚の96ウェルプレートをスクリーニングした。これらのうち93が陽性シグナルを示し、これらをさらに増殖させた。これらのうち37は、ヒト血球との結合に関して、FACSで陽性を示した。これらの上清が、次に、CD16Aおよび免疫複合体の相互作用に対して阻害能を示すか、また、3G8の結合部位(エピトープ)に類似した結合部位をもつか分析した。アッセイは、キメラ3G8を用いた捕獲ELISA、およびsRIIIa-Igに対する免疫複合体結合の阻害を含んでいた。これらのアッセイに基づき、3G8に類似の結合特性および阻害特性をもつ抗体が単離され、同様に、3G8とは異なる結合特性および/または阻害特性をもつMabsも単離された。
自己免疫疾患の動物モデルを用いることで、自家抗体によって誘導されたヒトFc-FcγRIII相互作用を阻害するCD16A結合タンパク質の生体内活性を評価することができる。適当なモデルの1つは、ITPおよび抗血小板mAb 6A6の「受動的マウスモデル(passive mouse model)」である(Oyaizu et al.、1988、J Exp.Med.167:2017-22;Mizutani et al、1993、Blood 82:837-44参照)。6A6は、NZW x BSXBのF1個体に由来するIgG2aイソタイプmAbである。6A6の投与によって、muFcγRIII -/-、huFcγRIIIAトランスジェニックマウスでは、血小板欠乏症が起きるが、ヒト導入遺伝子をもたないmuFcyRIII-/-マウスでは起きない。Samuelsson et al.、2001、Science 291:484-86を参照のこと。6A6の代わりに、他の抗血小板モノクローナル抗体を用いることもできる。あるいは、ポリクローナル抗血小板抗体を用いることもできる。
実験的ITPにおいて血小板欠乏症を軽減するCD16A結合タンパク質の効果は、下記のようにしてアッセイすることができる。muFcγRIII -/-、huFcγRIIIAトランスジェニックマウスの群に、リン酸緩衝溶液(PBS)中のCD16A結合タンパク質を、0.5、1、2または5μg/gの濃度で静脈内(i.v.)投与した。対照は、PBSのみ、無関係のヒトIgG1(陰性対照)、またはヒト静脈内免疫グロブリン(IVIG;陽性対照)であった。CD16A結合タンパク質または対照の投与後1時間に、0.1μg/g ch6A6を各動物に静脈内投与、または腹腔内投与することによって、ITPを誘導した。ch6A6の投与後、2時間、5時間、24時間、および48時間に動物から血液を抜いた。、血漿血小板数は、上述のCoulter Z2粒子計数器、およびサイズ分析器を用いて測定し、投与された結合タンパク質の各濃度において、時間に対する血小板数をプロットすることによって、データを分析した。
Ch3G8-γ1の非グリコシル化型は、ch3G8-γ1をコードする発現ポリヌクレオチドに、残基297がアスパラギン(N)からグルタミン酸(Q)に変わる変異を導入し、コードしている抗体を発現させることによって調製した。残基297はN-結合型グリコシル化部位にあり、この変異によって、この部位でのFcドメインのグリコシル化が阻止される。この非グリコシル化抗体、即ちch3G8 N297Qを、ch3G8-γ1に関する記載(上記実施例4を参照)と同様にして、HEK-293細胞で生成した。ch6A6介在性血小板欠乏症に対して防御するch3G8-N297Qの能力を、上記のプロトコルを用いてテストした。
好中球レベルに対する非グリコシル化CD16A結合タンパク質の効果をテストし、グリコシル化CD16A結合タンパク質の効果と比較した。リン酸緩衝溶液(PBS)中で5μg/gの濃度のCD16A結合タンパク質、または無関係のヒトIgG1(陰性対照)もしくはマウス抗体RB6-8C5(陽性対照)などの対照を、muFcγRIII -/-、huFcγRIIIAトランスジェニックマウスの群に投与した。別の陰性対照は、PBSのみで投与された。24時間後に、マウスを安楽死させ、血液、脾臓、および骨髄を採取した。好中球は、FACSによって分析した。染色実験は、3%のFCSを含むRPMIで行った。マウス細胞は、FITC結合3G8(PharMingen)およびR-PE結合RB6-8C5(PharMingen)を用いて染色した。試料は、FACS Calibur(Becton DICkinson)を用いたフロー部位メトリーによって分析した。
この実施例は、CD16A結合タンパク質の投与によって、自己免疫溶血性貧血モデルにおける赤血球減少が阻止されることを実証する。
この実施例は、ヒト化3G8変種がマウス3G8の活性に類似した活性をもち、生体外でADCCを阻害することを実証する。
この実施例は、抗CD16A抗体の投与が、CD32Aに媒介されたITPに対する防御を与えることを示す。FcγRIII-/-、hCD16Aマウスと同様に、FcyRIII-/-、hCD32Aトランスジェニックマウスにおいても、ch6A6抗体の投与によってITPが誘導される。0.1μg/gのch6A6を腹腔内注射した5時間後に、約80%の血小板が欠乏していた(データは示されていない)。血小板数は、ch6A6注射の後24時間低いままであったが、ch6A6注射の48時間後に、急激に増加して、正常な血小板数に戻った。予想通り、ch6A6注射の1時間前にhu3G8-5.1(0.5μg/g)を静脈内注射しても、ITPに対する防御をFcγRIII-/-、hCD32Aマウスに与えることはなかった(データは示されていない)。
Hu3G8-5.1-N297QをCHO-S細胞系で生成した。Fc-yRIII-/-、hCD16A単一トランスジェニックマウスにおいて、ITPに対する防御を与える、この抗体の能力は、実施例13に記載した操作手順を用いて測定した。図15に示すように、ch6A6の腹腔内注射の1時間前に、CHO-S細胞で生成したHu3G8-5.1-N297Qを0.5mg/kg以上投与することによって、マウスをITPから完全に防御する。
上述の通り、時間0に0.1μg/gのch6A6を腹腔内注射することによって、ITPを誘導した。2時間後に、血漿中の血小板数を測定して、ITPの存在を確認した。ch6A6を腹腔内注射した3時間後に、異なった濃度のhu3G8-5.1 N297Qをマウスに静脈内注射した(矢印)。結果(図16A)は、無処理のマウスにおける血小板数が低いままであったのに対し、Hu3G8-5.1-N297Q注射後には、血小板数が急速に正常に戻ることを示している。これらの結果は、hu3G8-5.1-N297Q抗体の投与を用いることで、マウスモデルにおけるITPが治癒されうることを実証する。
この実験では、0日目に、50μgのマウス抗RBC IgG2a Mab 34-3Cを腹腔内注射することによって、AHAを誘発した。1日目に、血中のRBC数を測定して、AHAの存在を確認した。2時間後に、様々な濃度のHu3G8-22.1-N297Qをマウスに静脈内注射した(矢印)。結果は、無処理のマウスにおけるRBC数が低下し続けたのに対し、Hu3G8-22.1-N297Q注射後には、RBC数が安定し続けたことを示している(図17)。Hu3G8-22.1-N297Qの至適濃度は0.5μg/gである。RBC数は、7日目にすべてのマウスで正常に戻った。RBC数に対する反復出血の効果を測定するために、対照マウスには注射を行わず、血液を毎日抜いた。マウスモデルにおけるこれらの結果は、Hu3G8-22.1-N297Qを用いることで、AHAを治癒しうることを示している。Hu3G8-22.1-N297Qは、自家抗体によるさらなるRBC減少を阻止し、したがって、マウスを貧血からも防御する。
Claims (23)
- 配列番号35のアミノ酸配列を有する相補性決定領域(CDR)1、配列番号39のアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号59のアミノ酸配列を有するCDR3を含むVHドメインと、配列番号67のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号75のアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号88のアミノ酸配列を有するCDR3を含むVLドメインとを含むマウス3G8抗体に由来する6つ全てのCDRを含むヒト又はヒト化抗CD16A抗体であって、
前記CDRの少なくとも1つが、V H ドメインにおいては、CDR1内の34位にあるVal、CDR2内の50位にあるLeu、CDR2内の52位にあるPhe、CDR2内の54位にあるAsn、CDR2内の60位にあるSer、CDR2内の62位にあるSer、CDR3内の99位にあるTyr及びCDR3内の101位にあるAsp、並びにV L ドメインにおいては、CDR1内の24位にあるArg、CDR1内の25位にあるSer、CDR1内の32位にあるTyr、CDR1内の33位にあるLeu、CDR2内の50位にあるAsp、Trp又はSer、CDR2の51位にあるAla、CDR2内の53位にあるSer、CDR2内の55位にあるAla又はGln、CDR2内の56位にあるThr、CDR3内の92位にあるTyr、CDR3内の93位にあるSer及びCDR3内の94位にあるThrから成る群から選択される少なくとも1つの位置で、対応するマウスCDRと相違し、V H CDR1の34位がValでない限りはV H ドメインの94位にArg及びV H CDR3の101位にAspを同時に含まないか、又はV H CDR2内の50位にLeu及び54位にAsnを同時に含まないか、又はV L CDR3内の92位にTyr、93位にSer及び94位にThrを同時に含まず、
天然のFc領域と比較してFc領域のアミノ酸配列の改変に起因してFc受容体及び補体のC1q成分に結合しないヒトIgG 1 Fc領域を含み、ここで前記改変は前記Fc領域の残基297に対応するアミノ酸の非グリコシル化(aglycosylation)を含む、
前記抗体。 - 配列番号35のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号39のアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号59のアミノ酸配列を有するCDR3を含むVHドメインと、配列番号67のアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号75のアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号88のアミノ酸配列を有するCDR3を含むVLドメインとを含むヒト又はヒト化抗CD16A抗体であって、
天然のFc領域と比較してFc領域のアミノ酸配列の改変に起因してFc受容体及び補体のC1q成分に結合しないヒトIgG 1 Fc領域を含み、ここで前記改変は前記Fc領域の残基297に対応するアミノ酸の非グリコシル化を含む、
前記抗体。 - 配列番号109又は104の配列を有するVHドメインと、配列番号96の配列を有するVLドメインとを含む、請求項1又は2に記載の抗体。
- 配列番号113の配列を有するVHドメインを含む、請求項1に記載の抗体。
- 配列番号96、100又は118の配列を有するVLドメインを含む、請求項1に記載の抗体。
- 配列番号113の配列を有するVHドメインと、配列番号96、100又は118の配列を有するVLドメインとを含む、請求項1に記載の抗体。
- 配列番号98の配列を有する軽鎖を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列番号104の配列を有するVHドメインを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列番号109の配列を有するVHドメインを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列番号118の配列を有するVLドメインを含む、請求項1に記載の抗体。
- 配列番号66の配列を有するFR1ドメイン、配列番号74の配列を有するFR2ドメイン、配列番号87の配列を有するFR3ドメイン及び配列番号94の配列を有するFR4ドメインを含むVLドメインを含む、請求項1〜4、8及び9のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列番号51の配列を有するFR3ドメインを含むVHドメインを含む、請求項1〜3、5、7及び9〜11のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列番号31の配列を有するFR1ドメイン、配列番号38の配列を有するFR2ドメイン及び配列番号64の配列を有するFR4ドメインを含むVHドメインをさらに含む、請求項12に記載の抗体。
- 前記Fc領域の残基297に対応するアミノ酸がアスパラギンではない、請求項1〜13のいずれか1項に記載の抗体。
- 配列番号111の配列を有する重鎖を含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の抗体。
- 単鎖抗体である、請求項1〜15のいずれか1項に記載の抗体。
- 四量体抗体である、請求項1〜16のいずれか1項に記載の抗体。
- 請求項1〜17のいずれか1項に記載の抗体を非ヒト哺乳動物に投与することを含む、非ヒト哺乳動物において有害な免疫応答を軽減する方法。
- 請求項1〜17のいずれか1項に記載の抗体を非ヒト哺乳動物に投与することを含む、非ヒト哺乳動物で中程度の好中球減少症又は重度の好中球減少症を引き起こすことなく、非ヒト哺乳動物において有害な免疫応答を治療する方法。
- 前記有害な免疫応答が、自己免疫疾患によって引き起こされる炎症性応答である、請求項18又は19に記載の方法。
- 前記有害な免疫応答が、抗体介在性の血小板欠乏症である、請求項18又は19に記載の方法。
- 前記有害な免疫応答が特発血小板欠乏症性紫斑病又は自己免疫溶血性貧血である、請求項18又は19に記載の方法。
- 請求項1〜17のいずれか1項に記載の抗体と薬剤として許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
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