TW202144423A - 抗ｏｘ４０抗體及其用途 - Google Patents

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李雄
周雷
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Abstract

本發明提供了抗OX40抗體或其抗原結合片段、其製備方法及用於治療OX40相關的疾病或病徵的用途。

Description

抗OX40抗體及其用途
本申請基於並要求2020年4月17日遞交的中國申請CN 202010304381.8的優先權，該中國申請特此為所有目的完整併入本文作為參考。
本發明涉及抗體，更具體地涉及抗OX40抗體及其抗原結合片段、和製備該抗體的方法和使用其治療或預防OX40相關疾病或病徵的用途。
OX40(也稱CD134、TNFRSF4和ACT35)是腫瘤壞死因子超家族的一個成員，主要表現在激活的CD4+ T細胞、CD8+ T細胞以及調節性T細胞表面，在自然殺傷細胞(NK細胞)表面也有表現。在活化的T細胞內，OX40L-OX40所介導的共刺激信號可以刺激輔助T細胞產生和分泌細胞因子，刺激效應T細胞釋放顆粒酶和穿孔素，並引起效應T細胞和記憶T細胞的增殖。同時，OX40L-OX40信號還可以抑制調節性T細胞的分化和活性、降低調節性T細胞的免疫抑制功能，從而進一步增強免疫反應。OX40在T細胞免疫應答中的重要作用使OX40激動劑成為腫瘤免 疫治療的重要靶點，而OX40抑制劑則在炎症、過敏性疾病和自身免疫性疾病方面具有潛在應用價值。
近年來，隨著單抗製備技術的廣泛應用，已經出現了特異性結合OX40的單株抗體，包括OX40激動劑和OX40抑制劑兩類。生理條件下，OX40藉由與其配體OX40L的結合並三聚化，進而激活細胞內相應的信號通路。因此，OX40激動型單抗通常需要借助其它手段使抗體交聯才能發揮激動性抗體功能。在體外和體內條件下，抗體交聯可以分別藉由抗體包被和Fc受體來實現。Fc受體是一類特異性結合抗體Fc段的受體蛋白。其中的Fcγ受體，可以特異性的與IgG結合並發揮如ADCC、ADCP等功能。Fcγ受體主要包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA、FcγRIIIB等，表現於多種血細胞表面：包括B淋巴細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、肥大細胞、血小板等。在生理條件下，Fcγ受體可以同時結合一個或多個IgG分子的Fc段，在激活受體介導相應的功能的同時，實現IgG分子的交聯作用。OX40的激動型抗體，借助於Fcγ受體的結合與交聯作用，起到了激活OX40分子的功能。而OX40的抑制性抗體，則藉由阻斷OX40L和OX40的結合，使OX40無法三聚化，從而抑制了OX40的激活引起的T細胞的激活及相關的炎症反應。
腫瘤細胞可以藉由多種機制逃避免疫系統的識別和攻擊從而實現免疫逃逸，在體內生存並過度增殖。介導腫瘤免疫逃逸的一個重要機制是腫瘤微環境中免疫細胞或腫瘤細胞高表現的共刺激分子，即免疫檢查點。根據免疫檢查點的功能，這些檢查點可以被分為抑制性免疫檢查點， 以PD-1、PD-L1和CTLA-4等為代表；和激動性免疫檢查點，以OX40，4-1BB為代表。針對抑制性的免疫檢查點，可以用抗體等藥物阻斷其抑制功能，這就像鬆開了免疫細胞上的刹車，使免疫細胞可以發揮作用殺傷腫瘤細胞。其中以PD-1、PD-L1以及CTLA-4為代表的腫瘤免疫治療正在成為一種非常重要的治療手段，並在臨床應用中表現出令人興奮的治療效果。而使用激動劑激活激動性免疫檢查點，就像在鬆開刹車的基礎上又踩了一下油門，進一步增加免疫細胞的活性的功能，使其更有效的殺傷腫瘤細胞，最終起到更廣效、更有效的對腫瘤的治療作用。
研究發現OX40在多種腫瘤浸潤的T細胞中均有表現，且OX40陽性的腫瘤患者相對生存期更長，表明其在腫瘤免疫中的功能。在多種臨床前的動物模型中，激活OX40的功能，均表現出刺激T細胞增殖，增強效應T細胞功能，並抑制調節性T細胞功能的結果。在一項使用OX40激動劑(9B12)治療實體瘤轉移病人的臨床試驗中，在病人體內觀察到顯著的免疫上調的現象，而且在30例患者中有12例出現了轉移病灶的縮小。並且OX40抗體治療的腫瘤患者均表現出良好的耐受性。目前，多個OX40激動劑單抗，如：MOXR0916、PF-04518600、BMS 986178、GSK3174998、MEDI0562和MEDI6469等，都藉由單藥或者與其他免疫調節劑合併用藥的方式開展臨床治療試驗。
自身免疫病同樣是當今人類面臨的重大醫學難題，OX40抑制劑有望成為治療自身免疫病的潛在治療手段。臨床前研究顯示，OX40或OX40L缺陷的小鼠在過敏性哮喘的模型裡表現出明顯Th2細胞功能的減弱。OX40L抑制劑可以使小鼠哮喘模型出現與T細胞功能抑制相關的症狀 緩解，該結果可在猴的體內實驗中得以重現。此外，阻斷OX40-OX40L信號通路在其他的多種經典炎症和自身免疫疾病模型中均表現出免疫抑制、症狀緩解的現象，這些模型包括實驗性變態反應性腦脊髓炎模型(EAE)、類風濕關節炎模型(RA)以及結腸炎、移植抗宿主病、第一型糖尿病等由CD4+或者CD8+T細胞發揮主要功能的模型。目前，OX40拮抗劑單抗藥物的臨床實驗也取得了初步的結果。由Glenmark公司開發的GRB830，是一個人源化的人IgG1單抗。該抗體藉由結合在OX40的第二個富含半胱胺酸結構域，阻斷OX40與OX40L的結合，進而抑制由OX40L引起的T細胞激活。GBR830在一項正在進行中的，針對中、重度特異性皮膚炎的臨床試驗中(Phage IIa，NCT02683928)，表現出一定的療效。另外，由日本Kyowa Hakko公司開發的OX40拮抗劑單抗KHK4083，在針對特異性皮膚炎的一期臨床試驗中，表現出了良好的耐受性和療效，並於2018年10月啟動了針對中、重度特異性皮膚炎的二期臨床實驗(NCT03703102)。
截至目前，仍未有藥效明確的抗OX40抗體獲批用於人類任何疾病的治療，進一步開發該類藥物以滿足巨大的臨床需求具有非常重大的意義。
本發明提供了抗OX40抗體或其抗原結合片段，及其製備和使用的方法，包括治療OX40相關疾病或病徵的方法。
一方面，本發明提供分離的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含選自重鏈可變區(VH)的HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一個至三個，其中該VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：1、2、3、4或5所示。
一方面，本發明提供分離的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含選自輕鏈可變區(VL)的LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一個至三個，其中該VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：6、7、8、9或10所示。
在一些實施方案中，本發明提供了分離的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)的三個CDR，即HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及輕鏈可變區(VL)的三個CDR，即LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：1、2、3、4或5所示，且該VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：6、7、8、9或10所示。
在一些實施方案中，本發明提供了分離的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)的三個CDR，即HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及輕鏈可變區(VL)的三個CDR，即LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中該VH和VL選自：
(1)VH包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列和VL包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列；
(2)VH包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列和VL包含SEQ ID NO：7或9所示的胺基酸序列；
(3)VH包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列和VL包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列；或
(4)VH包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列和VL包含SEQ ID NO：7或8所示的胺基酸序列。
一方面，本發明提供了分離的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈互補決定區(HCDRs)，HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一個至三個，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列。
一方面，本發明提供了分離的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈互補決定區(LCDRs)，LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一個至三個，其中該LCDR1包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈互補決定區(HCDRs)，HCDR1、HCDR2和HCDR3和輕鏈互補決定區(LCDRs)，LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列和LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本發明提供的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)，其中該VH包含與選自SEQ ID NO：1、 2、3、4或5所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本發明提供的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變區(VL)，其中該VL包含與選自SEQ ID NO：6、7、8、9或10所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本發明提供的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含與選自SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列，其中該VL包含與選自SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本發明提供的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含與選自SEQ ID NO：2、3、4或5所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列，其中該VL包含與選自SEQ ID NO：7、8、9或10所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本發明提供的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列和其中該VL包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本發明提供的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含與SEQ ID NO：2、3、4或5所示的胺基酸序列和其中該VL包含SEQ ID NO：7、8、9或10所示的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本發明提供的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列和其中該VL包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本發明提供的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含與SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列和其中該VL包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本發明提供的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含與SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列和其中該VL包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本發明提供的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含與SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列和其中該VL包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本發明提供的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含與SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列和其中該VL包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本發明提供的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其是鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。在一些實施方式中，本發明提供了抗OX40抗體或其抗原結合片段，其是全長抗體、單域抗體例(如VHH)、Fab、Fab’、Fab’-SH、(Fab’)2、單鏈抗體例如scFv、Fv、dAb(domain antibody)或雙(多)特異性抗體。
在一些實施方案中，本發明提供的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含Fc區。在一些實施方案中，Fc區的胺基酸序列與人IgG1、IgG2或IgG4的Fc區序列一致或為其變體。
另一方面，本發明提供了抗OX40抗體激動劑，其包含本發明所提供的抗體的CDR並包含具有與FcγR結合的Fc區。在一些實施方式中，該抗OX40抗體激動劑的Fc區與人IgG1或IgG2的Fc區胺基酸序列一致。
另一方面，本發明提供了抗OX40抗體拮抗劑，其包含本發明所提供的抗體的CDR。在一些實施方式中，該抗OX40抗體拮抗劑包含Fc區變體，該變體降低或消除Fc區與FcγR的結合作用。在一些實施方式中，該抗OX40抗體拮抗劑包含Fc區變體，該變體為IgG1 N297A。
在一個較佳的實施方案中，本發明提供了一種分離的抗OX40抗體，其包含
(1)重鏈互補決定區(HCDRs)，HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列和該HCDR3包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列；
(2)輕鏈互補決定區(LCDRs)，LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1包含SEQ ID NO：14的所示胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列和該LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列；和
(3)Fc區變體，其為人IgG1 N297A。較佳地，該Fc區變體與FcγR的結合作用降低或消除。在一些實施方案中，該抗體包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列和其中該VL包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。在一個實施方案中，該抗體是全長抗體。在另一些實施方案中，該抗體與人OX40結合的親和力(KD)低於10nM。在再一些實施方案中，該抗體是一種OX40抗體拮抗劑，具有阻斷OX40介導的信號轉導活性。
另一方面，本發明提供了一種分離的核酸，其編碼本發明提供的任一的抗體或其片段，較佳地，該核酸編碼本發明抗體的重鏈或輕鏈，或重鏈可變區或輕鏈可變區。
另一方面，本發明提供了一種重組載體或表現載體，其包含一個或多個本發明提供的核酸，其中該載體適合用於重組產生本發明提供的任一的抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，該載體是表現載體。
另一方面，本發明提供了一種宿主細胞，其包含一個或多個本發明提供的核酸、重組載體或表現載體。
另一方面，本發明提供了一種免疫綴合物或免疫融合物，其包含本發明提供的抗OX40抗體或其抗原結合片段。
另一方面，本發明提供了一種醫藥組成物，其包含本發明提供的抗OX40抗體或其抗原結合片段、核酸、載體、或宿主細胞，以及任選地包含至少一種藥學上可接受的輔料(例如藥用載體或藥用賦形劑)。
另一方面，本發明還提供了本發明的抗OX40抗體或其抗原結合片段、核酸、載體、宿主細胞、免疫綴合物或免疫融合物在製備用於治療OX40相關疾病或病徵的藥物中的用途。
另一方面，本發明還提供了本發明的抗OX40抗體激動劑在製備用於治療癌症的藥物中的用途。
另一方面，本發明還提供了本發明的抗OX40抗體拮抗劑在製備用於治療炎症和/或自身免疫性疾病的藥物中的用途。
另一方面，本發明提供了治療或預防OX40相關疾病或病徵的方法，其包括對該個體施用有效量的本發明提供的任一項的抗體或其抗原結合片段、核酸、載體、宿主細胞、免疫綴合物或免疫融合物或包含其的醫藥組成物。在一些實施方案中，該OX40相關疾病或病徵為炎症和/或自身免疫性疾病，例如移植物抗宿主病。在一些實施方案中，該OX40相關疾病或病徵為癌症，例如黑色素瘤，較佳地為轉移性黑色素瘤。
本發明的抗OX40抗體或其抗原結合片段還能與其他治療劑或治療方式組合，用於治療或預防OX40相關疾病或病徵。
另一方面，本發明還提供了一種使用本發明的抗OX40抗體或其抗原結合片段檢測樣品中OX40的方法，用以診斷/檢測OX40相關的疾病或病徵。
本發明還涵蓋本文所述的任何實施方案的任意組合。本文所述的任何實施方案或其任何組合適用於本文所述的發明的任何和所有抗OX40抗體或其片段、方法和用途。
圖1顯示了Hu38E11-IgG2抗體促進抗CD3抗體活化的人T細胞分泌IFNγ。
圖2顯示了ELISA檢測抗體Hu38E11阻滯OX40與OX40L結合能力。
圖3顯示了ELISA檢測Hu38E11(IgG1 N297A)阻滯OX40L對T細胞的激活作用。
圖4顯示了基於螢光素酶報告基因測定法評估的抗OX40抗體Hu38E11(IgG1 N297A)的拮抗劑活性和抗體Hu38E11的激動劑活性。
圖5顯示了Hu38E11(IgG1 N297A)對hPBMC誘導的移植物抗宿主病的影響。
發明詳述
本發明提供了抗OX40抗體或其抗原結合片段，其特徵在於具有獨特的CDR序列，與人類OX40結合具有高親和力和高特異性。本發明提供的抗OX40抗體或其抗原結合片段可作為獨立的療法或與其它療法用於諸如癌症、炎症或自身免疫性疾病等OX40相關的疾病或病症的治療。
定義
除非另有說明，本發明的實施將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的一般技術，這些都在本領域的技術範圍內。
為了可以更容易地理解本發明，某些科技術語具體定義如下。除非本文其它部分另有明確定義，否則本文所用的科技術語都具有本發明所屬技術領域具有通常知識者通常理解的含義。關於本領域的定義及術語，專業人員具體可參考Current Protocolsin Molecular Biology(Ausubel)。胺基酸殘基的縮寫是本領域中所用的指代20個常用L-胺基酸之一的標準3字母和/或1字母代碼。本文(包括申請專利範圍)所用單數形式包括其相應的複數形式，除非文中另有明確規定。
術語“約”是指如所屬技術領域中具有通常知識者所確定的特定值或組成的可接受誤差範圍內的值或組成，其部分取決於如何測量或確定該值或組成，即測量系統的限制。譬如，“約”可以是指根據本領域中的實踐在1個或大於1個標準偏差內。或者，“約”可以是指多達5%、10%或20%的範圍(即，±5%、±10%或±20%)。
術語“和/或”當用於連接兩個或多個可選項時，應理解為意指可選項中的任一項或可選項中的任意兩項或更多項。
如本文中所用，術語“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中，當使用術語“包含”或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由所述及的要素、整數或步驟組成的情形。例如，當提及“包含”某個具體序列的抗體可變區時，也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。
本文術語“OX40”，指約50KD的I型跨膜糖蛋白，其是腫瘤壞死因子受體超家族的成員，OX40也稱為ACT35，CD134或TNFRSF4。在本文中，該術語是指來自任何脊椎動物(包括哺乳動物如靈長類動物(例如人)和囓齒類動物(例如，小鼠和大鼠)的任何天然OX40，除非另有說明。該術語涵蓋“全長”未加工的OX40以及由細胞內加工產生的任何形式的OX40或其任何片段。該術語還包括天然存在的OX40的變體，例如，剪接變體或等位變體。在一些實施方案中，OX40是指來自人的OX40全長或其片段(諸如其缺乏信號肽的成熟片段)。在一些實施方案中，人OX40是指與Uniprot# P43489胺基酸序列一致的成熟OX40(胺基酸殘基1-28為前導肽)或其片段(如其胞外結構域)。在一些實施方案中，該術語也涵蓋包含OX40或其片段(如其胞外結構域)的融合蛋白，如包含人OX40胞外結構域和Fc區的融合蛋白。
本文術語“OX40配體”或“OX40L”是指OX40的唯一配體，也稱為gp34，CD252或TNFSF4。人OX40配體與uniprot# P23510胺基酸序列一致或是其變體。OX40L在細胞表面自然形成同源的三聚體複合物，主要在活化的抗原呈遞細胞(APC)上表現，包括活化的B細胞、成熟的一般樹突狀細胞(DC)、漿細胞樣樹突細胞(pDC)、巨噬細胞和朗 格漢斯細胞，並可以在其他細胞類型上表現，例如NK細胞，肥大細胞，活化T細胞的子集以及血管內皮細胞和平滑肌細胞。
本文術語“親和力”指分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另有指示，如本文中使用的，“結合親和力”指反映結合對的成員(例如抗體和抗原)之間1：1相互作用的內在結合親和力。分子X對其配偶體Y的親和力通常可以用解離常數(KD)來表述。本領域中已知測定結合親和力的分析的實例包括表面等離子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如，ForteBio)。
本文術語“OX40拮抗劑”或“OX40抑制劑”或“OX40拮抗型抗體”或“拮抗性OX40抗體”或“OX40抗體拮抗劑”在本文中可以互換使用，包括能夠抑制和/或中和OX40介導的生物學信號轉導活性的抗體。在一些實施方案中，例如藉由阻斷OX40與OX40配體的結合或實質上降低OX40與OX40配體的結合，OX40拮抗型抗體抑制或降低由OX40觸發的信號轉導途徑，和/或抑制或降低OX40介導的細胞應答如淋巴細胞增殖、細胞因子表現或淋巴細胞存活。
本文術語“OX40激動劑”或“OX40激動型抗體”或“OX40激動性抗體”或“OX40抗體激動劑”在本文中可以互換使用，包括能夠促進和/或增強OX40介導的生物學信號轉導活性的抗體。在一些實施方案中，例如藉由交聯抗體結合OX40並激活OX40介導的生物學信號，OX40激動型抗體促進或增強由OX40觸發的信號轉導途徑，和/或促進或增強OX40介導的細胞應答如淋巴細胞增殖、細胞因子表現或淋巴細胞存活。
本文術語“OX40相關疾病或病徵”是指，與OX40的表現或功能或活性相關或與OX40介導的信號轉導活性相關的非生理狀態，包括但不限於癌症、炎症和自身免疫性疾病。在一些實施方案中，該疾病將受益於阻斷OX40介導的信號轉導。在另一些實施方案中，該疾病將受益於激活OX40介導的信號轉導。
本文術語“免疫應答”或“免疫反應”可互換使用，是指由例如淋巴細胞、抗原呈現細胞、吞噬細胞、粒細胞和由上述細胞或肝產生可溶性大分子(包括抗體、細胞因子和補體)的作用，該作用導致從人體選擇性損害、破壞或清除侵入的病原體、感染病原體的細胞或組織、癌細胞或者在自體免疫或病理性炎症的情況下的正常人細胞或組織。在一些實施方案中，本發明的OX40抗體拮抗劑可以抑制或降低免疫反應，例如在移植物抗宿主病中降低免疫排斥。在一些實施方案中，本發明的OX40抗體激動劑可以增強抗腫瘤免疫反應。
本文術語“信號轉導”是指通常由蛋白質間相互作用，諸如OX40L(配體)對OX40(受體)的結合啟動的生化因果關係，該關係導致信號從細胞的一部分傳遞至細胞的另一部分。一般地，傳遞包括引起信號轉導的系列反應中的一種或多種蛋白質上的一個或多個酪胺酸、絲胺酸或蘇胺酸殘基的特定磷酸化。倒數第二過程通常包括細胞核事件，從而導致基因表現的變化。
本文術語“增強T細胞功能”或“T細胞激動活性”包括誘導、引起或刺激效應或記憶T細胞的更新，和/或維持或放大、和/或誘導、引起或刺激效應或記憶T細胞的生物學功能。增強T細胞功能的例子包括：相對於干預前的此類水平，升高的來自CD8+效應T細胞的γ-干擾素(INF-γ)分泌，升高的來自CD4+記憶和/或效應T細胞的γ-干擾素(INF-γ)分泌，升高的CD4+效應和/或記憶T細胞增殖，升高的CD8+效應T細胞增殖，升高的抗原響應性(例如清除)。在一個實施方案中，相對於干預前，增強的水平是至少50%，或者60%，70%，80%，90%，100%，120%，150%，200%，300%，500%或更高。測量此增強的方式是本領域普通技術人員已知的。在一些實施方案中，藉由在本發明抗體存在下檢測活化T細胞釋放的炎性因子IFNγ，評估本發明抗體對T細胞的激動活性。在一些實施方案中，測定本發明抗體促進T細胞釋放IFNγ的EC50值，該值越低表明抗體具有更高的T細胞激動活性。在一些實施方案中，與對照OX40激動劑抗體(例如OX40mAb24)相比，本發明抗體具有更高的T細胞激動活性。
本文術語“降低T細胞功能”或“T細胞抑制活性”包括降低、阻滯、或減少效應或記憶T細胞的更新，和/或降低、阻滯、或減少效應或記憶T細胞的生物學功能。降低T細胞功能的例子包括：相對於干預前的此類水平，降低的來自CD8+效應T細胞的γ-干擾素(INF-γ)分泌，降低的來自CD4+記憶和/或效應T細胞的γ-干擾素(INF-γ)分泌，降低的CD4+效應和/或記憶T細胞增殖，降低的CD8+效應T細胞增殖，降低的抗原響應性(例如清除)。在一個實施方案中，相對於干預前，降低的水平 是至少50%，或者60%，70%，80%，90%，100%，120%，150%，200%,300%,500%或更高。測量此降低的方式是本領域普通技術人員已知的。在一些實施方案中，藉由在本發明抗體和OX40配體OX40L存在下檢測活化T細胞釋放的炎性因子IFNγ，評估本發明抗體對T細胞的抑制活性。在一些實施方案中，測定本發明抗體阻滯OX40-OX40L介導的T細胞釋放IFNγ的IC50值，該值越低表明抗體具有更高的T細胞抑制活性。在一些實施方案中，與對照OX40拮抗劑抗體(例如GBR830)相比，本發明抗體具有更高的T細胞抑制活性。
本文術語“活性”或“生物活性”，或術語“生物性質”或“生物特徵”此處可互換使用，並包括但不局限於表位/抗原親和力和特異性、在體內或體外中和或拮抗OX40活性的能力、在體內或體外增強或激活OX40的能力、T細胞激動活性、阻滯OX40與OX40L結合的IC50、阻滯OX40-OX40L介導的T細胞激活的IC50、抗體的體內穩定性和抗體的免疫原性質。本領域公知的抗體的其它可鑑定的生物學性質或特徵包括，例如，交叉反應性(即通常與靶定肽的非人同源物，或與其它蛋白質或組織的交叉反應性)，和保持哺乳動物細胞中抗體高表現水平的能力。可以使用本領域公知的技術觀察、測定或評估前面提及的性質或特徵，該技術包括但不局限於ELISA、FACS或BIACORE等離子體共振分析、體外或體內中和測定、受體結合、細胞因子或生長因子的產生和/或分泌、信號轉導和不同來源(包括人類、靈長類或任何其它來源)的組織切片的免疫組織化學。
本文術語“抗體”是指具有所需生物活性的任何形式的抗體。因此，其以最廣義使用，具體包括但不限於單株抗體(包括全長單株抗體)、 多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人源化抗體、完全人抗體、嵌合抗體、CrossMab抗體、或駱駝源化單結構域抗體。
術語“全抗體”、“全長抗體”和“完整抗體”在本文中可互換地用來指包含由二硫鍵相互連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白。每條重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由3個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH區和VL區可以進一步再劃分為超變區(為互補決定區(CDR)，其間插有較保守的區域(為構架區(FR))。“互補決定區”或“CDR區”或“CDR”是抗體可變結構域中在序列上高變並且形成在結構上確定的環(“超變環”)和/或含有抗原接觸殘基(“抗原接觸點”)的區域。CDR主要負責與抗原表位結合。重鏈和輕鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3，從N-端開始順序編號。位於抗體重鏈可變結構域內的CDR依次被稱作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位於抗體輕鏈可變結構域內的CDR依次被稱作LCDR1、LCDR2和LCDR3。每個VH和VL由三個CDR和4個FR組成，從胺基端到羧基端以如下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是顯示出多種效應子功能。
在一個給定的VH或VL胺基酸序列中，各CDR的精確胺基酸序列邊界可以使用許多公知方案的任意一種方案或其組合確定，該方案包括例如：Chothia方案(Chothia等人，Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,196,901-917(1987))；Kabat方案(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)和Contact(University College London)；North方案(North等人，A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations”,Journal of Molecular Biology,406,228-256(2011))。本發明中的抗OX40抗體的CDR可以根據本領域的任何方案或其組合及人為評估確定邊界。
抗體的輕鏈可以基於其恆定結構域的胺基酸序列歸入兩種類型(稱為kappa(κ)和lambda(λ))中的一種。抗體的重鏈可以根據其重鏈恆定區的胺基酸序列而劃分為主要5種不同的類型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，並且這些類型中的幾種可以進一步劃分成亞類，如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1以及IgA2。
“IgG形式的抗體”是指抗體的重鏈恆定區所屬的IgG形式。例如，IgG2形式的抗體是指其重鏈恆定區來自IgG2。
本文術語抗體的“抗原結合片段”包括抗體的片段或衍生物。通常該抗原結合片段包括該抗體的抗原結合區或可變區的至少一個片段(例如一個或多個CDR)，並保持該抗體的至少一些結合特性。抗原結合片段的實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，例如sc-Fv；由抗體片段形成的奈米抗體(nanobody)和多特異性抗體。當抗原的結合活性在莫耳濃度基礎上表示時，結合片段或衍生物通常保持其來源抗體的抗原結合活性的至少10%。較佳結合片段或衍 生物保持其來源抗體的抗原結合活性的至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更高。
可以預期抗體或其抗原結合片段可包括不明顯改變其生物活性的保守或非保守胺基酸取代(稱為抗體的“保守變體”或“功能保守變體”)。在一個較佳的方面，保守取代來自以下表A中所示的保守取代殘基，較佳地為表A中所示較佳的保守胺基酸取代殘基。
Figure 110113782-A0202-12-0021-1
Figure 110113782-A0202-12-0022-2
表位是抗體所結合的抗原區域。表位可以由連續的胺基酸形成或者藉由蛋白的三級折疊而並置的非連續胺基酸形成。
本文術語“分離的抗OX-40抗體或抗原結合片段”是指抗OX-40抗體或抗原結合片段的純化狀態。例如，“分離的”可以指該分子基本不含其它生物分子，例如核酸、蛋白質、脂質、糖或其它物質例如細胞碎片和生長培養基。然而，如所屬技術領域中具有通常知識者所知悉，術語“分離(的)”並非意指完全不存在這類物質或不存在水、緩衝液或鹽，除非它們以明顯干擾本文該抗體的實驗或治療應用的量存在。在一些實施方案中，分離的抗體或抗原結合片段可以具有大於95%，大於96%，大於97%，大於98%或大於99%的純度，該純度藉由例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或色譜(例如，離子交換或反相HPLC)確定。關於評價抗體純度的方法的綜述，參見，例如，Flatman，S.等，J.Chrom.B 848(2007)79-87。
本文術語“單株抗體”是指獲自基本均質抗體群的抗體，即組成該群的各個抗體除可少量存在的可能天然存在的突變之外是相同的。單 株抗體是高度特異性的，針對單一抗原表位。相比之下，一般(多株)抗體製備物通常包括大量針對不同表位(或對不同表位有特異性)的抗體。修飾語“單株”表明獲自基本均質抗體群的抗體的特徵，且不得解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。
本文術語“嵌合抗體”是具有第一抗體的可變結構域和第二抗體的恆定結構域的抗體，其中第一抗體和第二抗體來自不同物種。通常可變結構域獲自囓齒動物等實驗動物的抗體，而恆定結構域序列獲自人抗體，使得與該實驗動物抗體相比，所得嵌合抗體在人受試者中誘導不良免疫應答的可能性較低。
本文術語“人源化抗體”是指含有來自人和非人(例如鼠、大鼠)抗體的序列的抗體形式。一般而言，人源化抗體包含至少一個、通常兩個可變結構域，其中所有或基本所有的超變環相當於非人免疫球蛋白的超變環，而所有或基本所有的構架(FR)區是人免疫球蛋白的構架區。人源化抗體任選可包含至少一部分的人免疫球蛋白恆定區(Fc)。在一些情況下，如所屬技術領域中具有通常知識者所知悉，可以在人源化抗體(例如，可變結構域、構架區、和/或恆定區(如果存在))中引入胺基酸突變，例如以改善抗體的某些性質；這樣的抗體形式也仍落入本發明“人源化抗體”的範疇。
如所屬技術領域中具有通常知識者所屬技術領域中具有通常知識者，抗體可以具有用於生產該抗體的細胞的糖鏈形式。例如，當在小鼠中、在小鼠細胞中或在來源於小鼠細胞的融合瘤中產生時，抗體可含有 小鼠糖鏈。或者，如果在大鼠中、在大鼠細胞中或在來源於大鼠細胞的融合瘤中產生時，抗體可含有大鼠糖鏈。
本文中的術語“Fc區”用於定義免疫球蛋白重鏈中至少含有恆定區一部分的C端區。該術語包括天然序列Fc區和Fc區變體。天然序列Fc區涵蓋天然存在的各種免疫球蛋白Fc序列，例如各種Ig亞型以及其同種異型的Fc區(Gestur Vidarsson等，IgG subclasses and allotypes：from structure to effector functions，20 October 2014,doi：10.3389/fimmu.2014.00520.)在一個實施方案中，人IgG重鏈Fc區自Cys226，或自Pro230延伸至重鏈的羧基端。然而，Fc區的C端賴胺酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有規定，Fc區或恆定區中的胺基酸殘基的編號方式依照EU編號系統，又稱作EU索引，如描述於Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991。
本文中的術語“Fc區變體“或“變體Fc區”在本文中可互換使用，指相對於天然序列Fc區包含修飾的Fc區多肽。本發明的Fc區變體按照組成它們的胺基酸修飾來定義。因此，例如，N297A是相對於親本多肽在297位用天冬醯胺取代丙胺酸的Fc區變體，其中編號按照EU索引。例如，人IgG1 N297A是指這樣的Fc區變體，其具有其上帶有N297A取代的人IgG1 Fc區的序列。修飾可以是添加，缺失或取代。取代可以包括天然存在的胺基酸和非天然存在的胺基酸。變體可以包含非天然胺基酸。
本文中的術語"Fc受體"或"FcR"描述結合抗體Fc區的受體。在一些實施方案中，FcR是天然人FcR。在一些實施方案中，FcR是FcγR(γ 受體)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，也包括那些受體的等位變體和可變剪接形式。FcγRII包括FcγRIIA("活化受體")和FcγRIIB("抑制受體")，它們具有相似的胺基酸序列，區別主要在於其胞質結構域。活化受體FcγRIIA在其胞質結構域中包含基於酪胺酸的活化基序(ITAM)的免疫受體。抑制受體FcγRIIB在其胞質結構域中包含基於酪胺酸的抑制基序(ITIM)的免疫受體(參見例如Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997)。FcR的綜述參見例如Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel et al.,Immunomethods 4：25-34(1994)；And de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。術語"FcR"在本文中涵蓋其它FcR，包括那些未來將會鑑定的。術語"Fc受體"或"FcR"還包括新生兒受體，FcRn，其負責將母體IgG轉移給胎兒(Guyer et al.,J.Immunol.117：587(1976)和Kim et al.,J.Immunol.24：249(1994))和調節免疫球蛋白的體內穩態。測量對FcRn的結合的方法是已知的(參見例如Ghetie and Ward.,Immunol.Today 18(12)：592-598(1997)；Ghetie et al.,Nature Biotechnology,15(7)：637-640(1997)；Hinton et al.,J.Biol.Chem.279(8)：6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton et al.))。可測定人FcRn高親和力結合多肽與人FcRn的體內結合和血清半衰期，例如在表現人FcRn的轉基因小鼠或經轉染的人細胞系中，或者在施用了具有變異Fc區的多肽的靈長類動物中。WO 2000/42072(Presta)記載了對FcR的結合提高或降低的抗體變體。還可參見例如Shields et al.,J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。
術語“藥學上可接受的輔料”指與活性物質一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全的))、藥用賦形劑、藥用載體或穩定劑等。
術語“醫藥組成物”指這樣的組成物，其以允許包含在其中的活性成分的生物學活性有效的形式存在，並且不包含對施用該組成物的受試者具有不可接受的毒性的另外的成分。
在本文中，“免疫綴合物”是與一個或多個其它物質(包括但不限於細胞毒性劑或標記)綴合的抗體。“免疫融合物”是與一個或多個其它的肽或多肽藉由共價連接而融合的抗體。
本文該術語“治療劑”涵蓋在預防或治療相關疾病，例如癌症中有效的任何物質。
術語“細胞毒性劑”用在本發明中指抑制或防止細胞功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質。
“化療劑”包括在治療癌症或免疫系統疾病中有用的化學小分子藥物。
術語“小分子藥物”是指低分子量的能夠調節生物過程的化合物。“小分子”被定義為分子量小於10kD、通常小於2kD和較佳小於1kD的分子。小分子包括但不限於無機分子、有機分子、含無機組分的有機分子、含放射性原子的分子、合成分子、肽模擬物和抗體模擬物。作為治療劑，小分子可以比大分子更能透過細胞、對降解更不易感和更不易於引發免疫應答。
本文使用的術語“免疫調節劑”指調節(例如，抑制或增強)免疫應答的天然或合成活性劑或者藥物。免疫應答可以是體液應答或細胞應答。在一些實施方案中，免疫調節劑包含抑制免疫應答的免疫抑制劑，例如有利於在炎症和自身免疫性疾病治療中抑制免疫應答的免疫抑制劑。在一些實施方案中，免疫調節劑包含增強免疫應答的活性劑或藥物，例如，有利於在癌症治療中增強抗癌免疫應答的活性劑或藥物。
術語“癌”及“癌症”指或描述哺乳動物中特徵通常為細胞生長不受調控的生理疾患。此定義中包括良性和惡性腫瘤以及休眠腫瘤或微轉移。癌症包括但不限於實體瘤和血液癌。各種癌症的實例包括但不限於癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白血病。
“炎症和/或自身免疫性疾病”是指廣泛地包括任何炎症或免疫相關病症(例如，病理性炎症和自身免疫性疾病)。"自身免疫性疾病"是起因於並針對個體自身組織或器官的疾病或病症或其共分離或表現或從其產生的病況。自身免疫性疾病可以指由具有對正常身體組織和抗原起反應的抗體的B細胞的產生導致或加重的病況。同樣，自身免疫性疾病可以是可牽涉對來自自身抗原(例如核抗原)的表位特異的自身抗體分泌的疾病。
本文術語“載體”是指任何重組多核苷酸構建體，該構建體可用於轉化的目的(即將異源DNA引入到宿主細胞中)。一種類型的載體為“質粒”，是指環狀雙鏈DNA環，可將額外DNA區段連接至該環中。另一類型的載體為病毒載體，其中可將額外DNA區段連接至病毒基因組中。某些載體能夠在被引入到的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點 的細菌載體及游離型哺乳動物載體)。在引入到宿主細胞中後，其他載體(例如，非游離型哺乳動物載體)整合至宿主細胞的基因組中，且因此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠導引被操作性連接的基因的表現。本文將此類載體稱為“表現載體”，表現載體是指能夠在轉化、轉染或轉導至宿主細胞中時複製及表現目的基因的核酸。表現載體包含一或多個表型選擇標記及複製起點，以確保維護載體及以在需要的情況下於宿主內提供擴增。
本文術語“受試者”或“患者”或“個體”包括任何人或非人動物。術語“非人動物”包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，諸如非人靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。
本文術語“治療有效量”、“治療有效劑量”和“有效量”是指本發明的抗OX40抗體或其抗原結合片段當單獨或與其它治療藥物組合給予細胞、組織或受試者時，有效預防或改善一種或多種疾病或病況的症狀或該疾病或病況的發展的量。治療有效劑量還指足以導致症狀改善的抗體或其抗原結合片段的量，例如治療、治癒、預防或改善相關醫學病況或者提高這類病況的治療、治癒、預防或改善的速度的量。當對個體施用單獨給予的活性成分時，治療有效劑量僅是指該成分。當組合施用時，治療有效劑量是指引起治療效果的活性成分的綜合量，不論是組合、依次給予還是同時給予。治療劑的有效量將導致診斷標準或參數提高至少10%，通常至少20%，較佳至少約30%，更佳至少40%，最佳至少50%。
在本文中，“治療”包括1)治療性措施，該措施治癒、減緩、減輕經診斷的病理狀況或疾患的症狀及/或停止該經診斷的病理狀況或疾 患的進展及2)預防性或防範性措施，該措施預防及/或減緩病理狀況或疾患的發展。因此，治療者包括已罹患疾患的個體、易於罹患疾患的個體，以及欲預防疾患的個體。在一些實施方案中，本發明涉及疾病或病徵的治療；在另一些實施方案中，本發明涉及疾病或病徵的預防。
在根據本發明的一些實施方案中，疾病或病徵的“治療”是指改善疾病或病徵(即，減緩或阻止或減少疾病的進展或其臨床症狀的至少一個)。在另一些實施方案中，“治療”是指緩解或改善至少一個身體參數，包括可能不能被患者辨別出的那些物理參數。在另一些實施方案中，“治療”是指在身體上(例如，可辨別的症狀的穩定)、生理上(例如，身體參數的穩定)或在這兩方面調節疾病或病徵。除非在本文中明確描述，否則用於評估疾病的治療和/或預防的方法在本領域中通常是已知的。
在根據本發明的再一些實施方案中，疾病或病徵的“預防”包括對疾病或病徵或特定疾病或病徵的症狀的發生或發展的抑制。在一些實施方式中，具有癌症家族病史的受試者是預防性方案的候選。通常，在癌症的背景中，術語“預防”是指在癌症的病徵或症狀發生前，特別是在具有癌症風險的受試者中發生前的藥物施用。
在某些實施方式中，經本發明的方法"治療"癌症，若病患個體顯示下列一或多項，則認為該個體獲得了成功治療：癌細胞的數量減少或完全消失；腫瘤大小減少；抑制或缺乏癌細胞浸潤至外圍器官包括例如癌擴散至軟組織及骨；抑制或缺乏腫瘤轉移；抑制或缺乏腫瘤生長；緩解一或多種與該特定癌相關的症狀；減少發病率及死亡率；改善生活質量；減少腫瘤的腫瘤發生性、腫瘤發生頻率或腫瘤發生能力；減少腫瘤中的癌 幹細胞的數量或頻率；使腫瘤發生細胞分化成非腫瘤發生狀態；或一些效應的組合。
“抑制腫瘤生長”是指腫瘤細胞生長可藉以被抑制的任何機制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長藉由延緩腫瘤細胞增生而被抑制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長藉由停止腫瘤細胞增生而被抑制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長藉由殺死腫瘤細胞而被抑制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長系由誘導腫瘤細胞凋亡而被抑制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長系由誘導腫瘤細胞分化而被抑制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長系由剝奪腫瘤細胞養分而被抑制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長藉由預防腫瘤細胞移動而被抑制。在某些實施方式中，腫瘤細胞生長藉由預防腫瘤細胞入侵而被抑制。
在本文中，“序列同一性”是指在比較窗中以逐個核苷酸或逐個胺基酸為基礎的序列相同的程度。可以藉由以下方式計算“(百分比)序列同一性”：將兩條最佳比對的序列在比較窗中進行比較，確定兩條序列中存在相同核酸堿基(例如，A、T、C、G、I)或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即，窗大小)，並且將結果乘以100，以產生序列同一性百分比。為了確定序列同一性百分數而進行的最佳比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例如，使用可公開獲得的計算機軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)軟件。所屬技術領域中具有通常知識者可以確定用於比對序列的適宜參數，包括 為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何算法。在本發明中，就抗體序列而言，胺基酸序列同一性百分數藉由將候選抗體序列與參考抗體序列最佳比對後，在一個較佳方案中按照Kabat編號規則進行最佳比對後，予以確定。
本文中“GBR830”是根據專利WO 2013008171中公開的VH6/VL9重鏈和輕鏈序列，瞬時表現獲得的OX40拮抗型抗體；“OX40mAb24”是指根據專利WO 2016057667中公開的OX40mAb24抗體重鏈和輕鏈序列，瞬時表現獲得的OX40激動型抗體；“11D4”是指根據專利WO 2009079335中公開的11D4抗體的重鏈和輕鏈序列，瞬時表現獲得的OX40激動型抗體。
抗OX40抗體及其產生
本發明的抗體可採用用於產生抗體的任何合適方法來產生。任何合適形式的OX40都可用作產生抗體的免疫原(抗原)。藉由舉例而非限制，任何OX40變體或其片段都可用作免疫原。在一些實施方式中，產生鼠源的單株抗人OX40抗體的融合瘤細胞可藉由本領域公知的方法產生。這些方法包括但不限於最初由Kohler等(1975)(Nature 256：495-497)研發的融合瘤技術。較佳根據標準方案，分離出小鼠脾細胞，用PEG或藉由電融合與小鼠骨髓瘤細胞株融合。然後藉由篩選分泌抗體具有OX40結合等活性的融合瘤細胞。本發明的融合瘤細胞免疫球蛋白可變區的DNA序列可利用基於簡並引子PCR的方法測定。
來源於囓齒動物(如小鼠)的抗體在體內用作治療藥物時可引起不需要的抗體免疫原性，重複使用導致人體產生針對治療性抗體的免 疫應答，這類免疫應答至少導致喪失治療功效，而嚴重的則導致潛在致死過敏反應。降低囓齒動物抗體的免疫原性的一種方法包括嵌合抗體的產生，其中將小鼠可變區與人恆定區融合(Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-43)。然而，嵌合抗體中的完整囓齒動物可變區的保留仍可在患者中引起有害的免疫原性。
將囓齒動物可變區的CDR移植到人構架上(即人源化)已被用於進一步將囓齒動物序列減至最低。本發明該人源化抗體，可以使用本領域已知的方法將鼠源CDR區插入人種系框架區。參見Winter等人的美國專利No.5,225,539及Queen等人的美國專利US5,530,101；US5,585,089；US5,693,762和US6,180,370。
本發明的抗體可變區CDR的精確胺基酸序列邊界可使用許多公知的方案(例如Kabat、Chothia、AbM、Contact或North)的任何方案來確定。應該注意，基於不同的定義系統獲得的同一抗體的可變區的CDR的邊界可能有所差異。即不同指派系統下定義的同一抗體可變區的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本發明定義的具體CDR序列限定抗體時，該抗體的範圍還涵蓋了這樣的抗體，其可變區序列包含該具體CDR序列，但是由於應用了不同的方案(例如不同的指派系統或組合)而導致其所聲稱的CDR邊界與本發明所定義的具體CDR邊界不同。
具有不同特異性(即，針對不同抗原的不同結合位點)的抗體具有不同的CDR。然而，儘管CDR在抗體與抗體之間是不同的，但是CDR內只有有限數量的胺基酸位置直接參與抗原結合。使用Kabat、Chothia、AbM、Contact和North方法中的至少兩種，可以確定最小重疊區域，從而 提供用於抗原結合的“最小結合單位”。最小結合單位可以是CDR的一個子部分。正如所屬技術領域中具有通常知識者明瞭，藉由抗體的結構和蛋白折疊，可以確定CDR序列其餘部分的殘基。因此，本發明也考慮本文所給出的任何CDR的變體。在一些實施方式中，本發明的抗OX40抗體或其抗原結合片段在一個CDR的變體中，最小結合單位的胺基酸殘基可以保持不變，而根據Kabat或IMGT定義的其餘CDR殘基可以被保守胺基酸殘基替代。
在一些實施方案中，本發明提供抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含選自重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一個至三個，其中該HCDR1包含與選自SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列一致或與之相比具有至少1個且不超過3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)的胺基酸序列，HCDR2包含與選自SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列一致或與之相比具有至少1個且不超過3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)的胺基酸序列，HCDR3包含與選自SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列一致或與之相比具有至少1個且不超過3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本發明提供抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含選自輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一個至三個，其中該LCDR1包含與SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列一致或與之相比具有至少1個且不超過3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)的胺基酸序列，LCDR2包含與SEQ ID NO：15所示的胺基 酸序列一致或與之相比具有至少1個且不超過3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)的胺基酸序列，LCDR3包含與SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列一致或與之相比具有至少1個且不超過3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗OX40抗體或其抗原結合片段還涵蓋這樣的抗體或其抗原結合片段，其中在重鏈可變區的三個CDR上，相對於本文具體公開的三個CDR，共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)，和/或在輕鏈可變區的三個CDR上，相對於本文具體公開的三個CDR，共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸取代，較佳保守取代)。
在一些實施方案中，本發明提供的抗OX40抗體或其抗原結合片段還涵蓋這樣的抗體或其抗原結合片段，其中與本文具體公開抗體的重鏈可變區和/或輕鏈可變區相比，該重鏈可變區和/或輕鏈可變區有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過6、5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸取代，更佳胺基酸保守取代)的胺基酸序列，較佳地，該胺基酸改變不發生在CDR區中。
在一些實施方案中，本發明提供的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(VH)，其中該VH包含與SEQ ID NO：1、2、3、4或5所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明提供的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變區(VL)，其中該VL包含與SEQ ID NO：6、7、8、9或10所示的胺基酸序列一致或具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。
在本發明的一個實施方案中，本文所述的胺基酸改變包括胺基酸的取代、插入或缺失。較佳的，本文所述的胺基酸改變為胺基酸取代，較佳地保守取代。
在較佳的實施方案中，本發明所述的胺基酸改變發生在CDR外的區域(例如在FR中)。更較佳地，本發明所述的胺基酸改變發生在重鏈可變區外和/或輕鏈可變區外的區域。在一些實施方案中，胺基酸改變發生在重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區。
在一些實施方案中，包含胺基酸改變的本發明的抗體與本文所公開的具體抗體具有相當或相似的性質。
在一些實施方案中，本發明的抗OX40抗體包括對CDR、輕鏈可變區、重鏈可變區、輕鏈或重鏈的翻譯後修飾。
在一些實施方案中，本發明所提供的抗OX40抗體，其是全長抗體、單域抗體例如VHH、Fab、Fab’、Fab’-SH、(Fab’)2、單鏈抗體例如scFv、Fv、dAb(domain antibody)或雙(多)特異性抗體。
在一些實施方案中，本發明所提供的抗OX40抗體，是任何IgG同種型形式的抗體，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4形式的抗體。
在一些實施方案中，本發明還提供效應子功能改變的抗體。術語“效應子功能”是指，可歸因於抗體的Fc區的那些生物活性，其隨抗體類別而改變。存在五種主要的抗體類別：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，並 且這些中的一些可以進一步分為亞類(同種型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。抗體的效應子功能包括例如但不限於：C1q結合和補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性的細胞介導的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；免疫細胞的募集；經由Fc區與細胞表面FcR受體結合介導的抗體交聯。如所屬技術領域中具有通常知識者理解的，可以根據需要，例如是否需要募集免疫系統來殺傷靶細胞、是否需要藉由與FcR的相互作用來誘導抗體的交聯等因素，來選擇合適的抗體Fc區序列。例如，在免疫系統募集和靶細胞殺傷是期望的目的抗體期望性質時，可以選擇或進一步改造抗體的Fc區以提供與活化FcγR受體和/或補體的增強結合來促進例如ADCC或CDC效應子功能。再例如，在不期望募集免疫系統的情況下，可以選擇或進一步修飾抗體的Fc區以降低該效應子功能，例如可以使用人IgG2或IgG4亞型的Fc區，或者使用帶有突變如N297A的IgG1亞型的Fc區。此外，可以藉由選擇或突變Fc區，有選擇地提供抗體與一種或多種Fc受體的結合，而降低或消除與另一種或多種FcR的結合，從而實現抗體效應子功能的調整，例如增強抗體交聯的同時改變ADCC活性強度。參見例如Xinhua Wang等，IgG Fc engineering to modulate antibody effector functions,Protein Cell 2018,9(1)：63-73，DOI 10.1007/s13238-017-0473-8；Shields RL,High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgG1 for FcγRI,FcγRII,FcγRIII and FcRn and Design of IgG1 Variants with Improved Binding to the FcγR,2001,J Biol Chem.2001 Mar 2；276(9)：6591-604.Epub 2000 Nov 28.
本發明提供擁有一些但不是所有效應子功能的抗體變體，該效應子功能使其成為如下應用的期望候選物，其中抗體的體內半衰期是重要的，而某些效應子功能(諸如補體和ADCC)是不必要的或有害的。可以進行體外和/或體內細胞毒性測定法以確認CDC和/或ADCC活性的降低/消減。例如，可以進行Fc受體(FcR)結合測定法以確保抗體缺乏Fc γ R結合(因此有可能缺乏ADCC活性或抗體交聯活性)，但是保留FcRn結合能力。介導ADCC的主要細胞NK細胞僅表現Fc γ RIII，而單核細胞表現Fc γ RI，Fc γ RII和Fc γ RIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Tmmunol.9：457-492(1991)的第464頁上的表3中匯總了造血細胞上的FcR表現。已繪製了人IgG1上與FcγRI，FcγRII，FcγRIII和FcRn的結合位點，並且已經描述了具有改善的結合的變體(參見Shields等，J.Biol.Chem.276：6591-6604，2001)。
在一些實施方案中，本發明提供的抗體的Fc區可引入一個或多個胺基酸修飾，以此產生Fc區變體。Fc區變體可包含在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如置換)的人Fc區序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區)。例如在Bruhns和Jönsson發表在Immunol Rev.2015 Nov；268(1)：25-51的文章中，在第44頁上，總結了多個對人IgG1進行的改造以增強或降低其對FcγR的結合及增強或降低相應的功能。
在一些實施方式中，本發明提供的抗體包含人IgG1Fc區變體，該Fc區變體具有降低或缺乏的Fc γ R結合活性(如抗體交聯活性)。在一些實施方式中，該人IgG1Fc區變體包含一個或多個胺基酸替代，具體 地，該胺基酸替代可以選自免疫球蛋白重鏈E233、L234、L235、N297和P331的位置處的胺基酸替代。在一些實施方案中，該人IgG1Fc區變體包含選自E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297G、N297D和P331S中的一個或多個的胺基酸替代。在一些實施方式中，該人IgG1Fc區變體的胺基酸替代為N297A。
一方面，本文中所提供的抗體經改變以增加或降低抗體經糖基化的程度。對抗體的糖基化位點的添加或缺失可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點而方便地實現。糖基化可以被改變以例如增加抗體對“抗原”的親和力。可以藉由例如改變抗體序列內一個或多個糖基化位點來完成這種碳水化合物的修飾。例如，可以進行一個或多個胺基酸取代，其導致消除一個或多個可變區框架糖基化位點，從而消除該位點的糖基化。這種無糖基化可以增加抗體對抗原的親和力。這樣的方法在例如美國專利No.5,426,300中有所描述。當抗體包含Fc區時，可以改變附著於其的糖類。在一些應用中，除去不想要的糖基化位點的修飾可以是有用的，例如除去岩藻糖模塊以提高抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)功能。在其它應用中，可以進行半乳糖苷化修飾以修飾補體依賴性細胞毒性(CDC)。
在一些實施方式中，可能需要產生經半胱胺酸工程改造的抗體，例如“硫代MAb”，其中抗體的一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。
在一些實施方式中，本文中所提供的抗體可進一步經修飾為含有本領域中已知且輕易獲得的其他非蛋白質部分。適合抗體衍生作用的部分包括，但不限於，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括， 但不限於，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。
在一些實施方案中，本發明的抗體具有以下一個或多個特性：
(i)以高親和力，例如以小於100nM，例如小於50nM，例如小於30nM，較佳小於10nM或5nM的KD值，與人OX40結合，尤其是與人OX40胞外域結合，其中較佳地KD值採用表面等離子共振測定法進行測量；
(ii)以高親和力，例如以小於100nM，例如小於50nM，例如小於40nM， 較佳小於20nM，更較佳小於10或5nM的EC50值，與細胞(如T細胞)表面表現的人OX40結合，其中較佳地EC50值採用FACS測定法進行測量；
(iii)阻滯人OX40及其配體OX40L結合，例如，以ELISA方法測定，抑制率達到至少50%、例如，至少60%、70%、80%、85%或90%，且較佳地IC50值小於10nM，更較佳小於1nM；
(iv)顯示與表2所列任一抗體相同或相似的結合親和力和/或特異性；
(v)抑制(例如，競爭性抑制)表2所示的任一抗體分子，與OX40的結合；
(vi)與表2所示的任一抗體結合相同或重疊的表位；
(vii)與表2所示的任一抗體具有相同或相似的生物活性。
在一些實施方案中，本發明的OX40抗體為激動型抗體，其包含具有與FcR例如FcγR結合的Fc區，例如人IgG1、IgG2或IgG4 Fc區或其變體，較佳地人IgG1或IgG2 Fc區或其變體。該變體較佳地具有與親本Fc區(例如天然序列Fc區)相當的或更強FcγR結合親和力。較佳地，該抗體藉由其Fc區與細胞表面表現的FcγR的結合並實現交聯。較佳地，該抗體包含如SEQ ID NO：21或22所示的恆定區序列的人IgG1或IgG2Fc區序列，或包含與如SEQ ID NO：21或22所示的恆定區序列的Fc區序列具有至少95%，96%，97%或99%同一性，或與如SEQ ID NO：21或22所示的恆定區序列的Fc區序列具有不超過10個、5個或1-3個胺基酸修飾的人IgG1或IgG2 Fc區變體。
在一些實施方案中，本發明的OX40激動型抗體具有如下一個或多個特性：
(i)以高親和力，例如小於10nM，更佳小於5nM的KD值，結合人OX40，其中較佳地KD值採用表面等離子共振測定法進行測量；
(ii)以高親和力，例如小於10nM，更較佳小於5nM的EC50值，與細胞(例如激活的CD4+ T細胞)表面表現的人OX40結合，其中較佳地EC50值採用FACS測定法進行測量；
(iii)激活OX40介導的信號傳導活性；
(iv)具有T細胞激動活性，例如可以藉由檢測抗體存在下由活化的T細胞釋放的細胞因子如IFNγ來評估抗體對T細胞的激動活性，在一些實施方案中，抗體的EC50值小於10nM，較佳小於5nM；
(v)抑制腫瘤生長，例如抑制黑素瘤細胞的生長。
在一些實施方案中，本發明的OX40抗體為拮抗型抗體。在一些實施方案中，該抗體包含Fc區變體，其中，例如相對於親本Fc區(例如天然序列Fc區)，該Fc區變體與FCγR的結合親和力降低或基本上消除。在一些實施方案中，本發明的抗體與細胞表面表現的FcγR基本不結合，不發生由FcγR介導的抗體交聯。在一些實施方案中，包含Fc區變體的本發明抗體，相對於包含親本Fc區(例如天然序列Fc區)的相應抗體，具有降低的或消除的由FcγR介導的效應子功能。較佳地，該抗體的Fc區包含選自以下的突變：E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297G、N297D、P331S或其組合。更較佳地，該抗體的Fc區為包含N297A突變的人IgG1 Fc區。在一些實施方案中，該抗體包含如SEQ ID NO：21所示的人IgG1恆定區序列的Fc區序列，或包含與如SEQ ID NO：21所示的恆定區序列的Fc區序列具有至少95%，96%，97%,98%或99%同一性，或與如SEQ ID NO：21所示的恆定區序列的Fc區序列具有不超過10個、5個或1-3個胺基酸修飾的人IgG1 Fc區變體，且包含降低Fc區與FcγR結合親和力的突變，較佳地N297突變，更佳地N297A。
在一些實施方案中，本發明的OX40拮抗型抗體具有如下一個或多個特性：
(i)以高親和力，例如小於10nM，更佳小於5nM的KD值，結合人OX40，其中較佳地KD值採用表面等離子共振測定法進行測量；
(ii)以高親和力，例如小於10nM，更佳小於5nM的EC50值，與細胞(例如激活的CD4+ T細胞)表面表現的人OX40結合，其中較佳地EC50值採用FACS測定法進行測量；
(iii)阻滯OX40及其配體OX40L結合，例如，以ELISA方法測定，抑制率達到至少70%、較佳至少80%、85%或90%，且較佳地IC50值小於10nM，更佳小於1nM；
(iv)阻斷OX40介導的信號傳導活性；
(v)具有T細胞抑制活性，例如可以藉由檢測在抗體和配體OX40L存在下由T細胞釋放的細胞因子如IFNγ來評估抗體對OX40L介導的T細胞激活的阻滯作用，在一些實施方案中，抗體的IC50值小於5nM，較佳小於1nM；
(vi)表現出抗免疫排斥活性，例如在移植物抗宿主病中降低免疫排斥。
抗體表現
本發明涉及包含一種或多種表現載體的宿主細胞以及用於產生本發明的任何抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包括培養該宿主細胞、純化和回收該抗體或抗原結合片段。
在一方面，本發明提供了編碼以上任何抗OX40抗體或其抗原結合片段的核酸。例如，本發明提供了編碼包含本文該重鏈、輕鏈、可變區或互補決定區的區段的核酸。在一些方面，編碼重鏈可變區的核酸與SEQ ID NO：17或18的所示核酸序列具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。在一些方面，編碼輕鏈可變區的核酸與SEQ ID NO：19或20所示的核酸序列具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。
在一方面，提供包含該核酸的一個或多個載體。在一些實施方案中，載體是表現載體。表現載體的選擇取決於載體要在其中表現的預期宿主細胞。通常，表現載體包含與編碼抗OX40抗體或其抗原結合片段的核酸可操作地連接的啟動子和其他調節序列(例如，增強子)。在一些實施方案中，該表現載體還包含編碼該抗體恆定區的序列。
在一方面，本發明提供用於表現本發明的重組抗體的宿主細胞，包括原核或真核的。在一些實施方式中，大腸桿菌是一種可用於純株和表現本發明的核酸的原核宿主。其他適用的微生物宿主包括桿菌，例如枯草芽孢桿菌，以及其他腸桿菌科，例如沙門氏菌、沙雷氏菌和各種假單胞菌。在這些原核宿主中，還可以製備表現載體，其通常包含與宿主細胞相容的表現控制序列(例如，複製起點)。在一些實施方式中，哺乳動物宿主細胞用於表現和產生本發明的抗OX40抗體多肽。例如，它們可以是表現內源性免疫球蛋白基因的融合瘤細胞株，也可以是具有外源性表現載體的哺乳動物細胞株，包括正常人細胞，或永生的動物或人細胞。例如，已經開發了許多能夠分泌完整免疫球蛋白的合適宿主細胞株，包括CHO細胞株、各種COS細胞株、HEK293細胞、骨髓瘤細胞株、轉化的B細胞和融合瘤。
在一方面，本發明提供製備抗OX40抗體的方法，其中該方法包括，將表現載體導入哺乳動物宿主細胞中，藉由將宿主細胞培養足夠的一段時間，以允許抗體在宿主細胞中表現，或者更較佳抗體分泌到宿主細胞生長的培養基中，來產生抗體。可採用標準蛋白質純化方法從培養基中回收抗體。如本文該製備的抗體分子可以藉由已知的現有技術如高效液相 色譜、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、大小排阻層析等純化。用來純化特定蛋白質的實際條件還取決於淨電荷、疏水性、親水性等因素，並且這些對所屬技術領域中具有通常知識者是顯而易見的。可以藉由多種熟知分析方法中的任一種方法確定本發明的抗體分子的純度，該熟知分析方法包括尺寸排阻層析、凝膠電泳、高效液相色譜等。
由不同細胞株表現或在轉基因動物中表現的抗體彼此間很可能具有不同的糖基化。然而，由本文提供的核酸編碼的或包含本文提供的胺基酸序列的所有抗體是本發明的組成部分，而不論抗體的糖基化如何。
測定法
可以藉由本領域中已知的多種測定法對本文中提供的抗OX40抗體鑑定，篩選，或表徵其物理/化學特性和/或生物學活性。一方面，對本發明的抗體測試其抗原結合活性，例如藉由已知的方法諸如ELISA，Western印跡等來進行。可使用本領域已知方法來測定對OX40的結合，本文中公開了例示性方法。
本發明還提供了用於鑑定具有生物學活性的抗OX40抗體的測定法。生物學活性可以包括例如與OX40(例如結合人OX40)的結合，提高OX40介導的信號轉導(例如提高NFkB介導的轉錄)，增強T效應細胞功能(例如藉由提高效應T細胞增殖和/或提高效應T細胞的細胞因子生成(例如γ干擾素))，等。還提供了在體內和/或在體外具有此類生物學活性的抗體。
在某些實施方案中，對本發明的抗體測試此類生物學活性。
供任何上述體外測定法使用的細胞包括天然表現OX40或經改造而表現OX40細胞株，例如腫瘤細胞株。此類細胞還包括表現OX40和並非正常情況下表現OX40的轉染了編碼OX40的DNA的細胞株。
可以理解的是，能夠使用本發明的免疫綴合物或免疫融合物替換或補充抗OX40抗體來進行任何上述測定法。
可以理解的是，能夠使用抗OX40抗體和別的活性劑的組合來進行任何上述測定法。
免疫綴合物和免疫融合物
在一些實施方案中，本發明提供了免疫綴合物，其包含本文中提供的任何抗OX40抗體或其抗原結合片段和其它物質。在一個實施方案中，該其它物質為例如細胞毒性劑。
在一些實施方案中，本發明提供包含提供的任何抗OX40抗體或其抗原結合片段的免疫融合物。
在一些實施方案中，該免疫綴合物和該免疫融合物用於預防或治療OX40相關疾病或病徵。
醫藥組成物
本發明的醫藥組成物可包括本發明的抗體和藥學上可接受的輔料。在一些實施方案中，本發明醫藥組成物可包括於藥盒中，在另一些實施方案中，本發明的醫藥組成物可以包括在試劑盒中，如診斷試劑盒。
如本文所用，“藥用載體”包括生理上相容的任何和全部溶劑、分散介質、等滲劑和吸收延遲劑等。適用於本發明的藥用載體可以是無菌液體，如水和油，包括那些具有石油、動物、植物或合成來源的，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用醫藥組成物時，水是 較佳的載體。還可以將鹽水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液體載體，特別是用於可注射溶液。
合適的藥用賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、乾燥的脫脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。對於賦形劑的使用及其用途，亦參見“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第五版，R.C.Rowe，P.J.Seskey和S.C.Owen，Pharmaceutical Press，London，Chicago。該組成物還可以含有少量的潤濕劑或乳化劑，或pH緩衝劑。這些組成物可以採用溶液、懸浮液、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、粉末、緩釋劑等形式。口服配製劑可以包含標準載體，如藥用級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精等。
本發明提供了包括一種或多種結合OX40的單株抗體或其抗原結合片段、核酸、載體或宿主細胞或免疫綴合物或免疫融合物的醫藥組成物。應理解，本發明提供的抗OX40抗體或其抗原結合片段、核酸、載體或宿主細胞或免疫綴合物或或融合物在醫藥組成物中可以整合製劑中合適的藥用載體、賦形劑和其他試劑以聯合給藥，從而提供改善的轉移、遞送、耐受等。
可以藉由將具有所需純度的本發明的抗OX40抗體或其抗原結合片段與一種或多種任選的藥學上可接受的輔料混合來製備包含本文該抗OX40抗體的藥物製劑，較佳地以水溶液或凍乾製劑的形式。示例性的凍乾抗體製劑描述於美國專利號6,267,958。水性抗體製劑包括美國專利 號6,171,586和WO2006/044908中該那些，後一種製劑包括組胺酸-乙酸鹽緩衝劑。
本發明的醫藥組成物或製劑還可以包含一種或多種其它活性成分，該活性成分是治療特定疾病所需的，較佳具有不會不利地影響彼此的互補活性的那些活性成分。例如，理想的是還包含其它治療劑。在一些實施方案中，該其它治療劑為化療劑、放療劑、細胞因子、疫苗、其他抗體、免疫調節劑或者其他生物大分子藥物。
在一些實施方式中，本發明的醫藥組成物還包含編碼抗OX40抗體或其抗原結合片段的核酸的組成物。
方法或用途
本發明提供預防、診斷或治療OX40相關疾病或病徵的方法。該方法包括向需要的患者施用有效量的抗OX40抗體或其抗原結合片段或包含其的免疫綴合物或免疫融合物或醫藥組成物，或者本文該核酸、載體或宿主細胞。
在一方面，本發明提供抗OX40抗體或其抗原結合片段或包含其的免疫綴合物或免疫融合物或醫藥組成物在生產或製備用於預防或治療受試者OX40相關疾病或病徵的藥物的用途。
在一方面，本發明提供的抗OX40抗體及其抗原結合片段和包含其的醫藥組成物可以用作治療劑，用於預防或治療受試者OX40相關疾病或病徵。針對藉由使用標準方法鑑定的受試者中OX40相關的疾病或病徵，可以施用本發明公開的抗OX40抗體及其抗原結合片段和包含其的 醫藥組成物或免疫綴合物或免疫融合物，或者本文該核酸、載體或宿主細胞。
在一些實施方案中，本文該方法和用途還包括向該個體施用有效量的至少一種另外的治療劑或治療方式。在一些實施方案中，該治療劑例如化療劑、放療劑、細胞因子、疫苗、其他抗體、免疫調節劑或者其他生物大分子藥物。在一些實施方案中，治療方式包括外科手術；放射療法、局部照射或聚焦照射等。
上述聯合療法包括組合給藥(其中兩種以上治療劑被包含在相同或分開的製劑中)和分別給藥，其中，本發明的抗OX40抗體或其抗原結合片段的給藥可以發生在另外的治療劑和/或佐劑和/或治療方式的給藥前、同時和/或之後。
在一些實施方案中，本發明該OX40相關疾病或病徵指與受試者中OX40表現、活性和/或信號傳導異常相關的疾病或病徵，包括但不限於癌症、炎症和自身免疫性疾病。在一些實施方案中，在與OX40相關的疾病或病徵中，編碼OX40的核酸(水平或含量)升高，或OX40表現升高，或OX40蛋白質水平或活性升高，或由OX40介導的信號傳導增強。在另一些實施方案中，在與OX40相關的疾病或病徵中，編碼OX40的核酸(水平或含量)減少，或OX40表現降低，或OX40蛋白質水平活性降低，或由OX40介導的信號傳導減少。
在一些實施方案中，該疾病或病徵的治療將受益於抑制核酸或蛋白質水平的OX40、或受益於阻斷OX40與其配體的結合、或抑制OX40介導的信號傳導。
在另一些實施方案中，該疾病或病徵的治療將受益於增加核酸或蛋白質水平的OX40、或受益於增強OX40介導的信號傳導。
在一些實施方案中，OX40相關疾病或病徵是癌症。具體地，癌症包括但不限於實體瘤、乳腺癌、尿路上皮癌、黑色素瘤、腎癌、卵巢癌、頭頸癌、胃癌、肝癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、皮膚癌、間皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、前列腺癌、淋巴性白血病和肉瘤。較佳地，用於預防、診斷或治療與OX40相關的癌症的抗體是OX40激動劑。
在一些實施方案中，OX40相關疾病或病徵是炎症和/或自身免疫性疾病。在一些實施方案中，與OX40相關的炎症和/或自身免疫性疾病選自特發性皮膚炎、類風濕性關節炎、哮喘(例如過敏性哮喘)、COPD、自身免疫性葡萄膜炎、多發性硬化、狼瘡(例如如系統性紅斑狼瘡)、潰瘍性結腸炎、硬皮病和移植物抗宿主病(GVHD)。較佳地，用於治療或預防與OX40相關的炎症和/或自身免疫性疾病的抗體是OX40拮抗劑。
在一些實施方案中，受試者可以是哺乳動物，例如，靈長類，較佳地，高級靈長類，例如，人類(例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的風險的個體)。在一個實施方案中，受試者患有本文所述疾病(例如，癌症)或具有患有本文所述疾病的風險。在某些實施方案中，受試者接受或已經接受過其它治療，例如化療治療和/或放射療法。
本發明的抗體或抗原結合片段可以藉由任何合適的方式給藥，包括經口、腸胃外，肺內和鼻內給藥，並且如果需要局部治療，則可以病灶內給藥。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下給藥。給藥可以藉由任何合適的途徑進行，例如藉由注射，例如靜脈內或皮 下注射，部分取決於給藥是短暫的還是長期的。本文考慮了各種給藥方案，包括但不限於在各個時間點上的單次或多次給藥，推注給藥和脈衝輸注。
本發明的抗體或抗原結合片段將以與良好醫學實踐一致的方式配製，給藥和施用。在此情況下考慮的因素包括正在治療的特定疾病，正在治療的特定哺乳動物、個體患者的臨床狀況、疾病的原因、藥物的遞送部位、給藥方法、給藥時間表以及其他從業人員已知的因素。任選地，該抗體與目前用於預防或治療該疾病的一種或多種試劑一起配製。這些其他試劑的有效量取決於製劑中存在的抗體的量、病徵或治療的類型以及上面討論的其他因素。
為了預防或治療疾病，本發明的抗體或抗原結合片段的合適劑量(當單獨使用或與一種或多種其他額外的治療劑組合使用時)將取決於要治療的疾病的類型、抗體的類型、疾病的嚴重程度和病程、施用抗體是出於預防還是治療目的、先前的療法、患者的臨床病史和對抗體的響應以及主治醫師的判斷力而施用。將抗體適當地以一次或一系列治療施用於患者。
在某些實施方案中，本文中提供的任何抗OX40抗體或其抗原結合片段可以用於檢測OX40在生物樣品中的存在。術語“檢測”用於本文中時，包括定量或定性檢測。在某些實施方案中，生物樣品是血、血清或生物來源的其他液體樣品。在某些實施方案中，生物樣品包含細胞或組織。在一些實施方案中，生物樣品來自過度增生性或癌性病灶相關病灶。
在一個實施方案中，可以使用本發明抗體或其抗原結合片段診斷OX40相關的疾病或病徵，例如癌症，例如評價(例如，監測)個體中本 文所述疾病的治療或進展、其診斷和/或分期。在某些實施方案中，提供標記的抗OX40抗體或其抗原結合片段。標記包括但不限於，被直接檢測的標記或部分(如螢光標記、發色團標記、電子緻密標記、化學發光標記和放射性標記)，以及被間接檢測的部分，如酶或配體，例如，藉由酶促反應或分子相互作用。在一些實施方案中，本文提供用於診斷OX40相關的疾病的試劑盒，其包含本發明的抗體或其抗原結合片段。
在本文中提供的一些實施方案中，樣品是在用抗OX40抗體或其抗原結合片段治療之前獲得的。在一些實施方案中，樣品是在用其他療法之前獲得的。在一些實施方案中，樣品是在用其他療法治療過程中，或者用其他療法治療後獲得的。
本發明包括本文所述的特定實施方案的任何組合。應當理解，儘管描述了特定的內容和實施例來表明本發明較佳的實施方案，但是這僅僅是說明性的，用於舉例，本發明還涵蓋對所屬技術領域中具有通常知識者來說顯而易見的針對本發明的較佳實施方案進行修改的實施方案。出於所有目的，包括引文在內的本文所引用的所有公開物、專利及專利申請將以引用的方式全部併入本文作為參考。
實施例
實施例1 融合瘤抗體的製備與篩選
利用融合瘤技術獲得OX40抗體，採用Fc標簽的人OX40胞外結構域的重組蛋白OX40-Fc(R&D，Cat 3388-OX)作為抗原免疫小鼠。簡言之，將OX40-Fc與完全或不完全弗氏佐劑(Sigma-Aldrich)混合並乳化後，免疫C57BL/6和BALB/c小鼠。小鼠經過1輪免疫(完全弗氏佐 劑)以及兩輪加強免疫(不完全弗氏佐劑)後，並於每次加強免疫後取血，分別藉由ELISA技術檢測免疫後小鼠血清與重組人OX40-His(R&D Systems，Cat 9969-OX)蛋白結合活性，同時藉由流式細胞技術(FACS)檢測小鼠血清與過表現人OX40的CHO細胞(GenScript構建)的結合效價。選取血清效價高的小鼠進行融合。在融合前4天，人OX40胞外結構域的重組蛋白OX40-Fc腹腔注射小鼠以加強免疫。融合當天，將小鼠安樂死後，取小鼠脾臟進行勻質化以獲得單細胞懸液。使用電融合儀將小鼠脾臟細胞與鼠骨髓瘤細胞株SP2/0細胞(購自ATCC)進行融合。將融合後的細胞重新懸浮於含HAT(次黃嘌呤、胺基蝶呤和胸腺嘧啶脫氧核苷，GIBCO，Cat 21060017)的培養基中並接種到96孔盤。在37℃下培養7天。用OX40相關的功能平臺(諸如與人的OX40結合特異性、對T細胞活化功能)，鑑定融合瘤分泌上清活性，陽性的融合瘤純株進行單輪或多輪亞選殖以得到單純株。經篩選，38E11為最終選定的較佳融合瘤純株(其分泌的抗體稱為38E11)。
將候選融合瘤細胞38E11擴大培養，經過7至10天培養後，收集上清，離心並過濾以除去細胞及碎片。將上清流過proteinA的純化管柱(Genscript)，繼而用含0.05M Tris和1.5M NaCl(pH8.0)的緩衝液清洗平衡後，用0.1M檸檬酸鈉(pH3.5)沖提，並立刻用九分之一體積的1M Tris-HCl(pH9)中和，然後用PBS緩衝液透析。最終得到融合瘤抗體38E11用於進一步表徵。
1.1 ELISA檢測抗體與OX40胞外結構域蛋白的結合活性
將重組人OX40-His(R&D,Cat 9969-OX)包被到96孔盤，封閉後加入梯度稀釋的小鼠血清或抗體並培養，用含有0.5%的Tween20的PBS洗盤後加入HRP標記的抗鼠IgG的二抗培養，並用TMD進行顯色，藉由酶標儀讀取OD450。
如表1所示，最終得到的融合瘤抗體38E11與人OX40蛋白具有高結合活性，EC50為0.276nM。
1.2 FACS檢測抗體與活化T細胞上OX40的結合活性
從健康人全血中，用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare，Cat 17-1440-02)密度梯度離心的方法，收集中間層，並用PBS洗滌3次，獲得原代PBMC。進一步用Pan T Cell Isolation Kit(Miltenyi biotec，Cat 130-096-535)按照說明書推薦的方法，藉由磁珠法分離獲得T細胞。將T細胞重新懸浮於RPMI 1640(含10%FBS和青黴素/鏈黴素雙抗)培養基中，加入PHA-L和IL-2(或Con-A和hIL-2)，刺激2天，誘導T細胞表現OX40。將活化的T細胞用含2%FBS的PBS洗滌1次，加入梯度稀釋的OX40抗體，4℃培養30分鐘。用含2%FBS的PBS洗滌兩次，加入PE標記的抗人IgG二抗(Biolegend，Cat 409304)(或PE標記的抗鼠IgG二抗(Biolegend，Cat 405307))和APC-CY7標記的抗人CD4抗體(Biolegend，Cat 300518)。藉由BD CantoII流式細胞儀檢測CD4陽性T細胞表面OX40抗體的結合情況。根據平均螢光強度值擬合曲線並計算EC50。
如表1所示，融合瘤抗體38E11與人活化T細胞上的OX40具有結合活性，EC50為0.8nM。
1.3 抗體對T細胞的激動活性測定
藉由檢測T細胞活化後由T細胞釋放的細胞因子IFNγ，評估抗體對T細胞的激動活性。簡言之，從健康人全血中，用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare，Cat 17-1440-02)密度梯度離心的方法，收集中間層，並用PBS洗滌3次，獲得原代PBMC。進一步用Pan T Cell Isolation Kit(Miltenyi biotec，Cat 130-096-535)按照說明書推薦的方法，藉由磁珠法分離獲得人原代T細胞。將T細胞重新懸浮於RPMI 1640(含10%FBS和青黴素/鏈黴素雙抗)培養基中。將抗CD3抗體(eBioscience，Cat 16-0037-85)和梯度稀釋的OX40抗體混合後，按照每孔100ul加入到96孔盤中，於37℃包被2h。用PBS洗去未包板的抗體，在孔中加入分離獲得的T細胞，培養3天後收集上清，按照說明書推薦的標準檢測方法，用ELISA(R&D，Ct SIF50)檢測上清中IFNγ濃度。
如表1所示，融合瘤抗體38E11促進T細胞分泌IFNγ，其EC50值為1.4nM。
在表1中也顯示了，藉由瞬時表現獲得的對照抗OX40抗體11D4和OX40mAb24的功能活性。
Figure 110113782-A0202-12-0054-3
實施例2 融合瘤抗體人源化改造
2.1 測定融合瘤抗體可變區序列
利用融合瘤測序的方法，將融合瘤純株38E11的細胞進行擴大培養並利用TRIzol(購自Ambio)提取總RNA，利用抗體特異性的引子將其反轉錄為DNA(Takara,PrimerScript 1stStrand cDNA Synthesis Kit)，並使用抗體特異性引子對編碼鼠免疫球蛋白V-區域的基因片段進行擴增並選殖，藉由序列測定分析，得到可變區序列，38E11重鏈可變區的核苷酸序列如SEQ.ID No.：17所示，輕鏈可變區的核苷酸序列如SEQ.ID No.：18所示。
2.2 融合瘤抗體人源化設計
對於抗體的人源化，首先在PDB Antibody database搜尋與鼠源抗體可變區的序列高度同源的人類種系免疫球蛋白基因。其中38E11重鏈可變區和輕鏈可變區分別與人germline IGHV1-46*01和人germline IGKV4-1*01有較高序列同源性。再藉由Kabat編號系統定義可變區CDR的胺基酸序列及其精確邊界。原則上將與鼠源抗體可變區具有高同源性的人類IGVH及IGVk選為人源化模板，藉由CDR嫁接實施人源化。
為了保持人源化抗體的活性，一般還可利用計算機模擬技術，應用分子對接分析可變區及其周邊的框架胺基酸序列，考察其空間立體結合方式。藉由計算靜電力、范德華力、親疏水性和熵值，分析各候選的抗體基因序列中可與OX40作用以及維護空間構架的關鍵胺基酸個體，將其嫁接回已經選擇的人抗體基因框架，並在此基礎上標配出必須保留的框架區胺基酸位點，合成人源化抗體。在38E11抗體重鏈可變區選定7個位點做回復突變：V20L、M48I、R67K、M70L、R72V、V79A和T91S。根據回復突變數目和排列，分別設計出VH1(SEQ.ID No.：2)、VH2(SEQ. ID No.：3)、VH3(SEQ.ID No.：4)、和VH4(SEQ.ID No.：5)四條不同的人源化重鏈。在38E11抗體輕鏈可變區選定3個位點做相應的回復突變：M4L，V62I和L82V，分別設計出VL1(SEQ.ID No.：7)、VL2(SEQ.ID No.：8)、VL3(SEQ.ID No.：9)、和VL4(SEQ.ID No.：10)四條不同的人源化輕鏈。由此，共設計出38E11人源化抗體Hu38E11及其變體Hu38E11-v1、Hu38E11-v2、Hu38E11-v3和Hu38E11-v4，並進行進一步表徵。各抗體包含的胺基酸序列見表2和3。
2.3 人源化抗體表現
將來源於融合瘤抗體38E11的可變區或其人源化序列擴增並選殖至包含表現人IgG恆定區的載體中以得到表現的質粒。抗體的重鏈恆定區可以選自來源於任何亞型的人IgG(如人IgG1，重鏈恆定區胺基酸序列如SEQ.ID No.：21所示，人IgG2的重鏈恆定區胺基酸序列如SEQ.ID No.：22所示)或其變體，除特殊標記，Hu38E11及其變體的重鏈恆定區與人IgG1的重鏈恆定區序列一致。將包含重鏈和輕鏈的表現載體共轉染293細胞，於37℃培養4-6天後，收集上清，根據前述方法，藉由proteinA親和純化，得到重組抗體用於抗體的進一步表徵。
Figure 110113782-A0202-12-0056-4
Figure 110113782-A0202-12-0057-5
實施例3 FACS檢測人源化抗體與活化T細胞上OX40的結合活性
如前述實施例1.2所描述的檢測方法，利用FACS分析候選人源化抗體與活化的人T細胞上OX40的結合活性。
結果：如表4，人源化抗體Hu38E11及其變體與活化的人T細胞表面OX40具有較好的結合活性。
Figure 110113782-A0202-12-0057-6
實施例4 人源化抗體對T細胞的激動活性測定
如前述實施例1.3所描述的方法，藉由檢測在抗體存在下活化T細胞釋放的炎性因子IFNγ評估人源化抗體對T細胞的激動活性。
如表5所示，人源化抗體Hu38E11及其變體均能有效促進活化T細胞釋放IFNγ，即對T細胞具有激動活性。相比對照抗體OX40mAb24，人源化抗體Hu38E11及其變體的促進T細胞釋放IFNγ的EC50值更低，激動活性更明顯。
Figure 110113782-A0202-12-0058-7
實施例5 Biacore檢測人源化抗體與人OX40的結合活性
Biacore藉由測量表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)進行結合動力學參數的測定。此技術檢測抗體與抗原的結合(ka)和解離(kd)的微觀速率常數，藉由計算得到抗體與抗原的親和力數值。Biacore儀器及試劑均購自GE Healthcare。具體的，將抗人Fc抗體固定於sensor chip CM5。將含有抗體的表現上清或純化的抗體稀釋於流動相緩衝液中(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05% Tween-20,pH 7.4)，流過包板了抗人Fc抗體的CM5芯片。然後將梯度稀釋過的人OX40-His融合蛋白流過檢測芯片以測量抗原與抗體的結合， 進而將流動相緩衝液流過芯片以檢測抗原與抗體的解離。收集不同濃度下，抗原與抗體的結合和解離信號數據，藉由1：1 Langmuir模型擬合，計算抗原與抗體的親和力。
如表6所示，Hu38E11與人OX40高親和力結合，KD值為2.36E-09(M)。
Figure 110113782-A0202-12-0059-8
實施例6 人源化抗體Hu38E11對T細胞的激動活性
如前述實施例1.3所描述的方法，藉由檢測T細胞釋放的細胞因子IFNγ評估抗體亞型為IgG2的Hu38E11(IgG2)對T細胞的激動活性。
結果：如圖1所示，在抗體包板情況下，Hu38E11(IgG2)同樣具有T細胞激動活性，其EC50為1.6nM，相對對照抗體11D4(EC50=5.3nM)更低。
實施例7 人源化抗體阻滯OX40與OX40L結合作用
本實驗可藉由ELISA的方法測定抗體Hu38E11阻滯OX40與其配體OX40L的結合。簡言之，將OX40(R&D systems，Cat 3388-OX)用PBS稀釋後，加入到96孔盤中，4℃包被過夜。用含0.5% Tween-20的PBS洗盤3次洗去未包被的蛋白，再每孔200ul加入含1%BSA的 PBS，室溫封閉1h。用含0.5% Tween-20的PBS洗盤3次後，以100ul每孔的量將梯度稀釋後的抗OX40抗體加入96孔盤中，室溫培養1h。用含0.5% Tween-20的PBS洗盤3次後。加入終濃度為50ng/ml的OX40L(R&D systems，Cat 1054-OX)，室溫培養1h。洗盤3次後，加入生物素標記的抗OX40L抗體(R&D systems，Cat BAF1054)，室溫培養1h後洗盤，再加入HRP標記的鏈黴親和素(R&D systems，Cat DY998)室溫培養1h，洗盤後。每孔加200ul TMB顯色液顯色，並用2N H2SO4終止。在酶標儀上，以570nM光吸收值為背景，檢測波長為450nM。
如圖2所示，Hu38E11(IgG1 N297A)阻滯OX40與OX40L結合，可以達到最高90%的抑制率，高於對照抗體GBR830和OX40mAb24的50%的最大抑制率。其中Hu38E11(IgG1 N297A)和GBR830的IC50值均在0.3nM附近，OX40mAb24的IC50值約為1.2nM。
實施例8 人源化抗體阻滯OX40-OX40L介導的T細胞激活
從健康人血中，用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare，Cat 17-1440-02)密度梯度離心的方法，收集中間層，並用PBS洗滌3次，獲得原代PBMC。進一步用Pan T Cell Isolation Kit(Miltenyi Biotec，Cat 130-096-535)按照說明書推薦的方法，藉由磁珠法分離獲得人原代T細胞。將T細胞重新懸浮於RPMI 1640(含10%FBS和青黴素/鏈黴素雙抗)培養基中。將抗CD3抗體OKT3(eBioscience，Cat 16-0037-85)按照每孔100ul加入到96孔盤中，於37℃包被2h，用PBS洗去未包板的抗體。將梯度稀釋的OX40抗體與終濃度為664ng/ml的OX40L(R&D systems,Cat 1054-OX)混合後，加入包被好的96孔盤中，並在在孔中加入分離獲得的T細胞，培養3天後收集上清，按照說明書推薦的標準檢測方法，用ELISA(R&D，Cat SIF50)檢測上清中IFNγ濃度。
Hu38E11(IgG1 N297A)阻斷OX40L-OX40相互作用的功能性實驗：抗CD3抗體包板，加入OX40的天然配體OX40L刺激T細胞，同時，在培養體系中加入游離的抗OX40抗體，來檢測抗體阻滯OX40L與OX40的結合介導的功能。由於抗體未包板，在缺少交聯的情況下，抗OX40抗體的分子無法刺激T細胞分泌IFNγ。另外抗OX40藉由結合細胞表面的OX40，阻滯了OX40L與OX40的結合，便可阻斷OX40L引起的T細胞分泌IFNγ。
根據圖3的結果顯示，抗體Hu38E11(IgG1 N297A)在較高濃度下可抑制OX40L引起的IFNγ分泌。表明了抗體阻滯OX40L激活T細胞的作用。與GBR830相比，Hu38E11(IgG1 N297A)阻滯OX40L介導的T細胞激活作用更強，且IC50值更小(Hu38E11(IgG1 N297A)為0.3nM，GBR830為1.1nM)。
實施例9 人源化抗體Fc區對抗體的T細胞激動活性的影響
可藉由在螢光素酶報告基因測定法中測量NF-κB介導的轉錄活化的促進來評估具有不同Fc結構的Hu38E11的T細胞激動活性。構建過表現人OX40及具有受NF-κB基因調控的螢光素酶報告基因(Luc)的重組Jurkat細胞(Jurkat-OX40-NF-κB-Luc；購自Chempartner)。簡言之，將抗CD3抗體(eBioscience，Cat 16-0037-85)按照每孔100ul加入到96孔盤中，於4℃包被過夜。用PBS洗去未包板的抗體。再將Jurkat-OX40-NF-κB-Luc與Raji細胞按照1：1的比例混合後加入到包被了的96孔盤中，再加入梯度稀釋的Hu38E11(IgG1)、Hu38E11(IgG1 N297A)或hIgG1。經過5小時培養後，加入Steady-Glo(Promega)檢測試劑測定螢光素酶的相對表現量。
本實驗中，Hu38E11(IgG1)在Raji表面的FcγR受體交聯下，開啟OX40的下游信號，引起受NF-κB調節的報告基因的表現(EC50=0.70nM)。相反的，由於N297A突變，Hu38E11(IgG1 N297A)無法交聯和不能與FcγR受體結合，因而無法激活OX40下游信號，另外藉由阻滯OX40與Raji表面表現的OX40L結合，該抗體表現出明顯的抑制受NF-κB調節的螢光素酶報告基因的表現(IC50=0.20nM)(如圖4所示)。
實施例10 人源化抗體Hu38E11抑制B16F10皮下移植瘤生長
在表現人源OX40的C57BL/6-Tnfrsf4em1Clin(hTBFRSF4)轉基因小鼠上建立B16-F10皮下腫瘤模型，研究本發明抗體的抗腫瘤活性。
用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基培養小鼠黑色素瘤細胞B16-F10(ATCC® CRL-6475TM)。將腫瘤細胞懸浮於RPMI1640中，按1×105細胞/隻的劑量植入雌性轉基因小鼠(江蘇集萃藥康生物科技有限公司)右脅皮下。
在腫瘤細胞接種當天(第1天)，將小鼠按體重隨機分成3組，其中，第一組(h-IgG2)12隻，第二組(11D4(hIgG2))13隻，第三組(Hu38E11(hIgG2))13隻。用DPBS稀釋各組抗體，以10mg/kg的劑量單次腹腔注射給藥，定期測量腫瘤體積(腫瘤體積=0.5×長徑×短徑2)、小鼠體重。統計給藥後第15天或第16天抗體治療組的腫瘤抑制率。
腫瘤抑制率計算公式為：[(對照組腫瘤體積-給藥組腫瘤體積)/對照組腫瘤體積]×100%。小鼠相對體重計算公式為：(測量當天小鼠體重/分組時小鼠體重)×100%。
結果：在10mg/kg給藥劑量下，對照抗體11D4和本發明抗體Hu38E11(IgG2)對腫瘤生長的抑制率分別為33.2%和48.1%。此外，觀察期間各組小鼠體重增長迅速，行為正常，提示動物耐受性良好。
實施例11 人源化抗體Hu38E11(IgG1 N297A)的抗免疫排斥活性
在免疫缺陷NOD-Prkdcem26Cd52I12rgem26Cd22/Nju(NCG)小鼠上移植健康志願者外周血原代單個核細胞(human peripheral blood mononuclear cell，hPBMC)建立的移植物抗宿主病模型(graft-verus-host disease，GVHD)，研究本發明抗體的抗免疫排斥活性。
藉由Ficoll-Paque密度梯度離心從健康人全血中分離單個核細胞，將原代PBMC懸浮於磷酸緩衝液(PBS)中。
在PBMC移植前一天(第-1天)，將小鼠按體重隨機分成7組，分組見表7。在移植當天(第0天)，所有小鼠接受單次1.5Gy全身137Cs γ射線照射(total body irradiation，TBI)，然後用PBS稀釋Hu38E11(IgG1 N297A)和GBR830抗體，以1mg/kg的劑量，5mL/kg容積每週一次尾靜脈注射給藥，最後以0.2mL/隻單次尾靜脈注射2.5×107細胞/mL PBMC。每天觀察小鼠生存狀態，定期測量小鼠體重，以相對體重下降20%為安樂死終點，記錄生存時間。
小鼠相對體重計算公式為：(測量當天小鼠體重/分組時小鼠體重)×100%。
Figure 110113782-A0202-12-0064-9
實驗結果如圖5所示。在該實驗中，模型對照組(hPBMC+ hIgG1組)實驗第48天小鼠全部死亡，中位生存時間為32.5天；本發明 抗體Hu38E11(IgG1 N297A)1mg/kg實驗第64天處理小鼠全部存活，不能計算中位生存時間，與模型對照組(hPBMC+ hIgG1組)比較具有統計學差異(**：p<0.01)。陽性對照抗體GBR830 1mg/kg處理小鼠實驗第64天存活率66.7%，不能計算中位生存時間，與模型對照組無統計學差異。
序列表描述
Figure 110113782-A0202-12-0065-10
Figure 110113782-A0202-12-0066-11
Figure 110113782-A0202-12-0067-12
Figure 110113782-A0202-12-0068-13
<110> 和記黃埔醫藥(上海)有限公司(HUTCHISON MEDIPHARMA LIMITED)
<120> 抗OX40抗體及其用途(ANTI-OX40 ANTIBODY AND USES THEREOF)
<130> PF210197TWI
<160> 22
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
Figure 110113782-A0202-12-0069-14
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
Figure 110113782-A0202-12-0070-15
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成
<400> 3
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Figure 110113782-A0202-12-0071-17
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成
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<210> 5
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<213> 人工序列
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<223> 合成
<400> 5
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<210> 6
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<213> 人工序列
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<223> 合成
<400> 6
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<210> 7
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<213> 人工序列
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<223> 合成
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Figure 110113782-A0202-12-0074-23
<210> 8
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<213> 人工序列
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<223> 合成
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<210> 9
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成
<400> 9
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<210> 10
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 10
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<210> 11
<211> 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 11
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<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成
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Figure 110113782-A0202-12-0076-30
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成
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<210> 14
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成
<400> 15
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<223> 合成
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Figure 110113782-A0202-12-0079-38
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<223> 合成
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<210> 19
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成
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<223> 合成
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<210> 21
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Figure 110113782-A0202-12-0085-47
Figure 110113782-A0202-12-0086-48
<210> 22
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 22
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Figure 110113782-A0202-12-0087-50

Claims (16)

  1. 一種分離的抗OX40抗體，其包含
    (1)重鏈互補決定區(HCDRs)，HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列和該HCDR3包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列；
    (2)輕鏈互補決定區(LCDRs)，LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1包含SEQ ID NO：14的所示胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列和該LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列；和
    (3)Fc區變體，其為人IgG1 N297A。
  2. 如請求項1所述的抗體，其包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列和其中該VL包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。
  3. 如請求項1至2中任一項所述的抗體，其為全長抗體。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的抗體，其與人OX40結合的親和力(KD)低於10nM。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的抗體，其是一種OX40抗體拮抗劑，具有阻斷OX40介導的信號轉導活性。
  6. 如請求項5所述的抗體，其中該Fc區變體與FcγR的結合作用降低或消除。
  7. 一種分離的核酸，其編碼如請求項1至6中任一項所述的抗體。
  8. 一種重組載體或表現載體，其包含一個或多個如請求項7所述的核酸，其中該載體適合用於重組產生如請求項1至6中任一項所述的抗體。
  9. 一種宿主細胞，其包含一個或多個如請求項8所述的重組載體或表現載體。
  10. 一種免疫綴合物或免疫融合物，其包含如請求項1至6中任一項所述的抗體。
  11. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至6中任一項所述的抗體、如請求項7所述的核酸、如請求項8所述的載體、如請求項9所述的宿主細胞、或如請求項10所述的免疫綴合物或免疫融合物，以及任選地包含至少一種藥學上可接受的輔料。
  12. 一種如請求項1至6中任一項所述的抗體、如請求項7所述的核酸、如請求項8所述的載體、如請求項9所述的宿主細胞、或如請求項10所述的免疫綴合物或免疫融合物在製備用於治療或預防OX40相關疾病或病徵的藥物中的用途。
  13. 一種如請求項12所述的用途，其中該OX40相關疾病或病徵為炎症和/或自身免疫性疾病，例如移植物抗宿主病。
  14. 一種治療或預防OX40相關疾病或病徵的方法，其包括對該個體施用有效量的如請求項1至6中任一項所述的抗體、如請求項7所 述的核酸、如請求項8所述的載體、如請求項9所述的宿主細胞、或如請求項10所述的免疫綴合物或免疫融合物。
  15. 如請求項14所述的方法，其中該OX40相關疾病或病徵為炎症和/或自身免疫性疾病，例如移植物抗宿主病。
  16. 一種檢測樣品中OX40的方法，包括：
    (a)將該樣品與如請求項1至6中任一項所述的抗體、如請求項10所述的免疫綴合物或免疫融合物接觸；和
    (b)檢測該抗體或免疫綴合物或免疫融合物和OX40蛋白之間複合物的形成。
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