CN115461367A - 抗ox40抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了抗OX40抗体或其抗原结合片段、其制备方法及用于治疗OX40相关的疾病或病征的用途。

Description

抗OX40抗体及其用途
本申请基于并要求2020年4月17日递交的中国申请CN 202010304381.8的优先权，该中国申请特此为所有目的完整并入本文作为参考。
技术领域
本发明涉及抗体，更具体地涉及抗OX40抗体及其抗原结合片段、和制备该抗体的方法和使用其治疗或预防OX40相关疾病或病征的用途。
背景技术
OX40(也称CD134、TNFRSF4和ACT35)是肿瘤坏死因子超家族的一个成员，主要表达在激活的CD4+T细胞、CD8+T细胞以及调节性T细胞表面，在自然杀伤细胞(NK细胞)表面也有表达。在活化的T细胞内，OX40L-OX40所介导的共刺激信号可以刺激辅助T细胞产生和分泌细胞因子，刺激效应T细胞释放颗粒酶和穿孔素，并引起效应T细胞和记忆T细胞的增殖。同时，OX40L-OX40信号还可以抑制调节性T细胞的分化和活性、降低调节性T细胞的免疫抑制功能，从而进一步增强免疫反应。OX40在T细胞免疫应答中的重要作用使OX40激动剂成为肿瘤免疫治疗的重要靶点，而OX40抑制剂则在炎症、过敏性疾病和自身免疫性疾病方面具有潜在应用价值。
近年来，随着单抗制备技术的广泛应用，已经出现了特异性结合OX40的单克隆抗体，包括OX40激动剂和OX40抑制剂两类。生理条件下，OX40通过与其配体OX40L的结合并三聚化，进而激活细胞内相应的信号通路。因此，OX40激动型单抗通常需要借助其它手段使抗体交联才能发挥激动性抗体功能。在体外和体内条件下，抗体交联可以分别通过抗体包被和Fc受体来实现。Fc受体是一类特异性结合抗体Fc段的受体蛋白。其中的Fcγ受体，可以特异性的与IgG结合并发挥如ADCC、ADCP等功能。Fcγ受体主要包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA、FcγRIIIB等，表达于多种血细胞表面：包括B淋巴细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、血小板等。在生理条件下，Fcγ受体可以同时结合一个或多个IgG分子的Fc段，在激活受体介导相应的功能的同时，实现IgG分子的交联作用。OX40的激动型抗体，借助于Fcγ受体的结合与交联作用，起到了激活OX40分子的功能。而OX40的抑制性抗体，则通过阻断OX40L和OX40的结合，使OX40无法三聚化，从而抑制了OX40的激活引起的T细胞的激活及相关的炎症反应。
肿瘤细胞可以通过多种机制逃避免疫系统的识别和攻击从而实现免疫逃逸，在体内生存并过度增殖。介导肿瘤免疫逃逸的一个重要机制是肿瘤微环境中免疫细胞或肿瘤细胞高表达的共刺激分子，即免疫检查点。根据免疫检查点的功能，这些检查点可以被分为抑制性免疫检查点，以PD-1、PD-L1和CTLA-4等为代表；和激动性免疫检查点，以OX40，4-1BB为代表。针对抑制性的免疫检查点，可以用抗体等药物阻断其抑制功能，这就像松开了免疫细胞上的刹车，使免疫细胞可以发挥作用杀伤肿瘤细胞。其中以PD-1、PD-L1以及CTLA-4为代表的肿瘤免疫治疗正在成为一种非常重要的治疗手段，并在临床应用中表现出令人兴奋的治疗效果。而使用激动剂激活激动性免疫检查点，就像在松开刹车的基础上又踩了一下油门，进一步增加免疫细胞的活性的功能，使其更有效的杀伤肿瘤细胞，最终起到更广谱、更有效的对肿瘤的治疗作用。
研究发现OX40在多种肿瘤浸润的T细胞中均有表达，且OX40阳性的肿瘤患者相对生存期更长，表明其在肿瘤免疫中的功能。在多种临床前的动物模型中，激活OX40的功能，均表现出刺激T细胞增殖，增强效应T细胞功能，并抑制调节性T细胞功能的结果。在一项使用OX40激动剂(9B12)治疗实体瘤转移病人的临床试验中，在病人体内观察到显著的免疫上调的现象，而且在30例患者中有12例出现了转移灶的缩小。并且OX40抗体治疗的肿瘤患者均表现出良好的耐受性。目前，多个OX40激动剂单抗，如：MOXR0916、PF-04518600、BMS986178、GSK3174998、MEDI0562和MEDI6469等，都通过单药或者与其他免疫调节剂合并用药的方式开展临床治疗试验。
自身免疫病同样是当今人类面临的重大医学难题，OX40抑制剂有望成为治疗自身免疫病的潜在治疗手段。临床前研究显示，OX40或OX40L缺陷的小鼠在过敏性哮喘的模型里表现出明显Th2细胞功能的减弱。OX40L抑制剂可以使小鼠哮喘模型出现与T细胞功能抑制相关的症状缓解，该结果可在猴的体内实验中得以重现。此外，阻断OX40-OX40L信号通路在其他的多种经典炎症和自身免疫疾病模型中均表现出免疫抑制，症状缓解的现象，这些模型包括实验性变态反应性脑脊髓炎模型(EAE)、类风湿关节炎模型(RA)以及结肠炎、移植抗宿主病、一型糖尿病等由CD4+或者CD8+T细胞发挥主要功能的模型。目前，OX40拮抗剂单抗药物的临床实验也取得了初步的结果。由Glenmark公司开发的GRB830，是一个人源化的人IgG1单抗。该抗体通过结合在OX40的第二个富含半胱氨酸结构域，阻断OX40与OX40L的结合，进而抑制由OX40L引起的T细胞激活。GBR830在一项正在进行中的，针对中、重度特异性皮炎的临床试验中(Phage IIa，NCT02683928)，表现出一定的疗效。另外，由日本KyowaHakko公司开发的OX40拮抗剂单抗KHK4083，在针对特异性皮炎的一期临床试验中，表现出了良好的耐受性和疗效，并于2018年10月启动了针对中、重度特异性皮炎的二期临床实验(NCT03703102)。
截至目前，仍未有药效明确的抗OX40抗体获批用于人类任何疾病的治疗，进一步开发该类药物以满足巨大的临床需求具有非常重大的意义。
发明内容
本发明提供了抗OX40抗体或其抗原结合片段，及其制备和使用的方法，包括治疗OX40相关疾病或病征的方法。
一方面，本发明提供分离的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含选自重链可变区(VH)的HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一个至三个，其中所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、2、3、4或5所示。
一方面，本发明提供分离的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含选自轻链可变区(VL)的LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一个至三个，其中所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：6、7、8、9或10所示。
在一些实施方案中，本发明提供了分离的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)的三个CDR，即HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链可变区(VL)的三个CDR，即LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、2、3、4或5所示，且所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:6、7、8、9或10所示。
在一些实施方案中，本发明提供了分离的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)的三个CDR，即HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链可变区(VL)的三个CDR，即LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中所述的VH和VL选自：
(1)VH包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和VL包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
(2)VH包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列和VL包含SEQ ID NO:7或9所示的氨基酸序列；
(3)VH包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列和VL包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；或
(4)VH包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列和VL包含SEQ ID NO:7或8所示的氨基酸序列。
一方面，本发明提供了分离的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链互补决定区(HCDRs)，HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一个至三个，其中所述的HCDR1包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
一方面，本发明提供了分离的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含轻链互补决定区(LCDRs)，LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一个至三个，其中所述的LCDR1包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链互补决定区(HCDRs)，HCDR、HCDR2和HCDR3和轻链互补决定区(LCDRs)，LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述的HCDR1包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列和LCDR3包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)，其中所述的VH包含与选自SEQ ID NO:1、2、3、4或5所示的氨基酸序列一致或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区(VL)，其中所述的VL包含与选自SEQ ID NO:6、7、8、9或10所示的氨基酸序列一致或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含与选自SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列一致或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述的VL包含与选自SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列一致或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含与选自SEQ ID NO:2、3、4或5所示的氨基酸序列一致或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中所述的VL包含与选自SEQ ID NO:7、8、9或10所示的氨基酸序列一致或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和其中所述的VL包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含SEQ ID NO:2、3、4或5所示的氨基酸序列和其中所述的VL包含SEQ ID NO:7、8、9或10所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列和其中所述的VL包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列和其中所述的VL包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列和其中所述的VL包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列和其中所述的VL包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列和其中所述的VL包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其是鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在一些实施方式中，本发明提供了抗OX40抗体或其抗原结合片段，其是全长抗体、单域抗体例(如VHH)、Fab、Fab’、Fab’-SH、(Fab’)2、单链抗体例如scFv、Fv、dAb(domain antibody)或双(多)特异性抗体。
在一些实施方案中，本发明提供的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含Fc区。在一些实施方案中，Fc区的氨基酸序列与人IgG1、IgG2或IgG4的Fc区序列一致或为其变体。
在一个方面，本发明提供分离的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不是包含人IgG1 N297A的Fc区变体的抗体或抗原结合片段。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含(1)选自重链可变区(VH)的HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一个至三个，其中所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、2、3、4或5所示；和/或(2)选自轻链可变区(VL)的LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一个至三个，其中所述VL的氨基酸序列如SEQ IDNO:6、7、8、9或10所示。在再一实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含(1)重链互补决定区(HCDR),HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中所述的HCDR1包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述的HCDR2包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列和所述的HCDR3包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；和(2)轻链互补决定区(LCDR),LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述的LCDR1包含SEQ ID NO:14的所示氨基酸序列，所述的LCDR2包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列和所述的LCDR3包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供了抗OX40抗体激动剂，其包含本发明所提供的抗体的CDR并包含具有与FCγR结合的Fc区。在一些实施方式中，该抗OX40抗体激动剂的Fc区与人IgG1或IgG2的Fc区氨基酸序列一致。
另一方面，本发明提供了抗OX40抗体拮抗剂，其包含本发明所提供的抗体的CDR。在一些实施方式中，该抗OX40抗体拮抗剂包含Fc区变体，所述变体降低或消除Fc区与FcγR的结合作用。在一些实施方式中，该抗OX40抗体拮抗剂包含Fc区变体，该变体为IgG1N297A。
另一方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码本发明提供的任一的抗体或其片段，优选地，所述核酸编码本发明抗体的重链或轻链，或重链可变区或轻链可变区。
另一方面，本发明提供了一种重组载体或表达载体，其包含一个或多个本发明提供的核酸，其中所述载体适合用于重组产生本发明提供的任一的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述载体是表达载体。
另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含一个或多个本发明提供的核酸、重组载体或表达载体。
另一方面，本发明提供了一种免疫缀合物或免疫融合物，其包含本发明提供的抗OX40抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明提供的抗OX40抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、或宿主细胞，以及任选地包含至少一种药学上可接受的辅料(例如药用载体或药用赋形剂)。
另一方面，本发明还提供了本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、宿主细胞、免疫缀合物或免疫融合物在制备用于治疗OX40相关疾病或病征的药物中的用途。
另一方面，本发明还提供了本发明的抗OX40抗体激动剂在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
另一方面，本发明还提供了本发明的抗OX40抗体拮抗剂在制备用于治疗炎症和/或自身免疫性疾病的药物中的用途。
另一方面，本发明提供了治疗或预防OX40相关疾病或病征的方法，其包括对该个体施用有效量的本发明提供的任一项的抗体或其抗原结合片段、核酸、载体、宿主细胞、免疫缀合物或免疫融合物或包含其的药物组合物。在一些实施方案中，所述的OX40相关疾病或病征为炎症和/或自身免疫性疾病，例如移植物抗宿主病。在一些实施方案中，所述的OX40相关疾病或病征为癌症，例如黑素瘤，优选地为转移性黑素瘤。
本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段还能与其他治疗剂或治疗方式组合，用于治疗或预防OX40相关疾病或病征。
另一方面，本发明还提供了一种使用本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段检测样品中OX40的方法，用以诊断/检测OX40相关的疾病或病征。
本发明还涵盖本文所述的任何实施方案的任意组合。本文所述的任何实施方案或其任何组合适用于本文所述的发明的任何和所有抗OX40抗体或其片段、方法和用途。
附图说明
图1显示了Hu38E11-IgG2抗体促进抗CD3抗体活化的人T细胞分泌IFNγ。
图2显示了ELISA检测抗体Hu38E11(IgG1 N297A)阻滞OX40与OX40L结合能力。
图3显示了ELISA检测Hu38E11(IgG1 N297A)阻滞OX40L对T细胞的激活作用。
图4显示了基于荧光素酶报告基因测定法评估的抗OX40抗体Hu38E11(IgG1N297A)的拮抗剂活性和抗体Hu38E11的激动剂活性。
图5显示了Hu38E11(IgG1 N297A)对hPBMC诱导的移植物抗宿主病的影响。
发明详述
本发明提供了抗OX40抗体或其抗原结合片段，其特征在于具有独特的CDR序列，与人类OX40结合具有高亲和力和高特异性。本发明提供的抗OX40抗体或其抗原结合片段可作为独立的疗法或与其它疗法组合用于诸如癌症、炎症或自身免疫性疾病的治疗。
定义
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。
为了可以更容易地理解本发明，某些科技术语具体定义如下。除非本文其它部分另有明确定义，否则本文所用的科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocolsin MolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。本文(包括权利要求书)所用单数形式包括其相应的复数形式，除非文中另有明确规定。
术语“约”是指如本领域普通技术人员所确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其部分取决于如何测量或确定所述值或组成，即测量系统的限制。比如，“约”可以是指根据本领域中的实践在1个或大于1个标准偏差内。或者，“约”可以是指多达5％、10％或20％的范围(即，±5％、±10％或±20％)。
术语“和/或”当用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项。
如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
本文术语“OX40”，指约50KD的I型跨膜糖蛋白，其是肿瘤坏死因子受体超家族的成员，OX40也称为ACT35，CD134或TNFRSF4。在本文中，该术语是指来自任何脊椎动物(包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)的任何天然OX40，除非另有说明。该术语涵盖“全长”未加工的OX40以及由细胞内加工产生的任何形式的OX40或其任何片段。该术语还包括天然存在的OX40的变体，例如，剪接变体或等位变体。在一些实施方案中,OX40是指来自人的OX40全长或其片段(诸如其缺乏信号肽的成熟片段)。在一些实施方案中，人OX40是指与Uniprot#P43489氨基酸序列一致的成熟OX40(氨基酸残基1-28为前导肽)或其片段(如其胞外结构域)。在一些实施方案中，该术语也涵盖包含OX40或其片段(如其胞外结构域)的融合蛋白，如包含人OX40胞外结构域和Fc区的融合蛋白。
本文术语“OX40配体”或“OX40L”是指OX40的唯一配体，也称为gp34，CD252或TNFSF4。人OX40配体与uniprot#P23510氨基酸序列一致或是其变体。OX40L在细胞表面自然形成同源的三聚体复合物，主要在活化的抗原呈递细胞(APC)上表达，包括活化的B细胞、成熟的常规树突状细胞(DC)、浆细胞样树突细胞(pDC)、巨噬细胞和朗格汉斯细胞，并可以在其他细胞类型上表达，例如NK细胞，肥大细胞，活化T细胞的子集以及血管内皮细胞和平滑肌细胞。
本文术语“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)来表述。本领域中已知测定结合亲和力的分析的实例包括表面等离子共振(例如，BIACORE)或类似技术(例如，ForteBio)。
本文术语“OX40拮抗剂”或“OX40抑制剂”或“OX40拮抗型抗体”或“拮抗性OX40抗体”或“OX40抗体拮抗剂”在本文中可以互换使用，包括能够抑制和/或中和OX40介导的生物学信号转导活性的抗体。在一些实施方案中，例如通过阻断OX40与OX40配体的结合或实质上降低OX40与OX40配体的结合，OX40拮抗型抗体抑制或降低由OX40触发的信号转导途径，和/或抑制或降低OX40介导的细胞应答如淋巴细胞增殖、细胞因子表达或淋巴细胞存活。
本文术语“OX40激动剂”或“OX40激动型抗体”或“OX40激动性抗体”或“OX40抗体激动剂”在本文中可以互换使用，包括能够促进和/或增强OX40介导的生物学信号转导活性的抗体。在一些实施方案中，例如通过交联抗体结合OX40并激活OX40介导的生物学信号，OX40激动型抗体促进或增强由OX40触发的信号转导途径，和/或促进或增强OX40介导的细胞应答如淋巴细胞增殖、细胞因子表达或淋巴细胞存活。
本文术语“OX40相关疾病或病征”是指，与OX40的表达或功能或活性相关或与OX40介导的信号转导活性相关的非生理状态，包括但不限于癌症、炎症和自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述疾病将受益于阻断OX40介导的信号转导。在另一些实施方案中，所述疾病将受益于激活OX40介导的信号转导。
本文术语“免疫应答”或“免疫反应”可互换使用，是指由例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)产生的作用，该作用导致从人体选择性损害、破坏或清除侵入的病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或者在自体免疫或病理性炎症的情况下的正常人细胞或组织。在一些实施方案中，本发明的OX40抗体拮抗剂可以抑制或降低免疫反应，例如在移植物抗宿主病中降低免疫排斥。在一些实施方案中，本发明的OX40抗体激动剂可以增强抗肿瘤免疫反应。
本文术语“信号转导”是指通常由蛋白质间相互作用，诸如OX40L(配体)对OX40(受体)的结合启动的生化因果关系，所述关系导致信号从细胞的一部分传递至细胞的另一部分。一般地，传递包括引起信号转导的系列反应中的一种或多种蛋白质上的一个或多个酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的特定磷酸化。倒数第二过程通常包括细胞核事件，从而导致基因表达的变化。
本文术语“增强T细胞功能”或“T细胞激动活性”包括诱导、引起或刺激效应或记忆T细胞的更新，和/或维持或放大、和/或诱导、引起或刺激效应或记忆T细胞的生物学功能。增强T细胞功能的例子包括:相对于干预前的此类水平，升高的来自CD8+效应T细胞的γ-干扰素(INF-γ)分泌，升高的来自CD4+记忆和/或效应T细胞的γ-干扰素(INF-γ)分泌，升高的CD4+效应和/或记忆T细胞增殖，升高的CD8+效应T细胞增殖，升高的抗原响应性(例如清除)。在一个实施方案中，相对于干预前，增强的水平是至少50％，或者60％，70％，80％，90％，100％，120％，150％，200％,300％,500％或更高。测量此增强的方式是本领域普通技术人员已知的。在一些实施方案中，通过在本发明抗体存在下检测活化T细胞释放的炎性因子IFNγ，评估本发明抗体对T细胞的激动活性。在一些实施方案中，测定本发明抗体促进T细胞释放IFNγ的EC50值，该值越低表明抗体具有更高的T细胞激动活性。在一些实施方案中，与对照OX40激动剂抗体(例如OX40mAb24)相比，本发明抗体具有更高的T细胞激动活性。
本文术语“降低T细胞功能”或“T细胞拮抗活性”包括降低、阻滞、或减少效应或记忆T细胞的更新，和/或降低、阻滞、或减少效应或记忆T细胞的生物学功能。降低T细胞功能的例子包括：相对于干预前的此类水平，降低的来自CD8+效应T细胞的γ-干扰素(INF-γ)分泌，降低的来自CD4+记忆和/或效应T细胞的γ-干扰素(INF-γ)分泌，降低的CD4+效应和/或记忆T细胞增殖，降低的CD8+效应T细胞增殖，降低的抗原响应性(例如清除)。在一个实施方案中，相对于干预前，降低的水平是至少50％，或者60％，70％，80％，90％，100％，120％，150％，200％,300％,500％或更高。测量此降低的方式是本领域普通技术人员已知的。在一些实施方案中，通过在本发明抗体和OX40配体OX40L存在下检测活化T细胞释放的炎性因子IFNγ，评估本发明抗体对T细胞的拮抗活性。在一些实施方案中，测定本发明抗体阻滞OX40-OX40L介导的T细胞释放IFNγ的IC50值，该值越低表明抗体具有更高的T细胞拮抗活性。在一些实施方案中，与对照OX40拮抗剂抗体(例如GBR830)相比，本发明抗体具有更高的T细胞拮抗活性。
本文术语“活性”或“生物活性”，或术语“生物性质”或“生物特征”此处可互换使用，并包括但不局限于表位/抗原亲和力和特异性、在体内或体外中和或拮抗OX40活性的能力、在体内或体外增强或激活OX40的能力、T细胞激动活性、阻滞OX40与OX40L结合的IC50、阻滞OX40-OX40L介导的T细胞激活的IC50、抗体的体内稳定性和抗体的免疫原性质。本领域公知的抗体的其它可鉴定的生物学性质或特征包括，例如，交叉反应性(即通常与靶定肽的非人同源物，或与其它蛋白质或组织的交叉反应性)，和保持哺乳动物细胞中抗体高表达水平的能力。可以使用本领域公知的技术观察、测定或评估前面提及的性质或特征，所述技术包括但不局限于ELISA、FACS或BIACORE等离子体共振分析、体外或体内中和测定、受体结合、细胞因子或生长因子的产生和/或分泌、信号转导和不同来源(包括人类、灵长类或任何其它来源)的组织切片的免疫组织化学。
本文术语“抗体”是指具有所需生物活性的任何形式的抗体。因此，其以最广义使用，具体包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、完全人抗体、嵌合抗体、CrossMab抗体、或骆驼源化单结构域抗体。
术语“全抗体”、“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指包含由二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH区和VL区可以进一步再划分为超变区(为互补决定区(CDR)，其间插有较保守的区域(为构架区(FR))。“互补决定区”或“CDR区”或“CDR”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。CDR主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的CDR依次被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位于抗体轻链可变结构域内的CDR依次被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。每个VH和VL由三个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是显示出多种效应子功能。
在一个给定的VH或VL氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知方案的任意一种方案或其组合确定，所述方案包括例如：Chothia方案(Chothia等人，Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,196,901-917(1987))；Kabat方案(Kabat等人,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第4版,U.S.Department of Health andHuman Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)和Contact(University College London)；North方案(North等人,A New Clustering ofAntibody CDR Loop Conformations”,Journal of Molecular Biology,406,228-256(2011))。本发明中的抗OX40抗体的CDR可以根据本领域的任何方案或其组合及人为评估确定边界。
抗体的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列归入两种类型(称为kappa(κ)和lambda(λ))中的一种。抗体的重链可以根据其重链恒定区的氨基酸序列而划分为主要5种不同的类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类型中的几种可以进一步划分成亚类，如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1以及IgA2。
“IgG形式的抗体”是指抗体的重链恒定区所属的IgG形式。例如，IgG2形式的抗体是指其重链恒定区来自IgG2。
本文术语抗体的“抗原结合片段”包括抗体的片段或衍生物。通常所述抗原结合片段包括所述抗体的抗原结合区或可变区的至少一个片段(例如一个或多个CDR)，并保持所述抗体的至少一些结合特性。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；由抗体片段形成的纳米抗体(nanobody)和多特异性抗体。当抗原的结合活性在摩尔浓度基础上表示时，结合片段或衍生物通常保持其来源抗体的抗原结合活性的至少10％。优选结合片段或衍生物保持其来源抗体的抗原结合活性的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更高。
可以预期抗体或其抗原结合片段可包括不明显改变其生物活性的保守或非保守氨基酸取代(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。在一个优选的方面，保守取代来自以下表A中所示的保守取代残基，优选地为表A中所示优选的保守氨基酸取代残基。
表A
Figure BDA0003890662890000091
Figure BDA0003890662890000101
表位是抗体所结合的抗原区域。表位可以由连续的氨基酸形成或者通过蛋白的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。
本文术语“分离的抗OX-40抗体或抗原结合片段”是指抗OX-40抗体或抗原结合片段的纯化状态。例如，“分离的”可以指该分子基本不含其它生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质、糖或其它物质例如细胞碎片和生长培养基。然而，如本领域技术人员所知悉，术语“分离(的)”并非意指完全不存在这类物质或不存在水、缓冲液或盐，除非它们以明显干扰本文所述抗体的实验或治疗应用的量存在。在一些实施方案中，分离的抗体或抗原结合片段可以具有大于95％，大于96％，大于97％，大于98％或大于99％的纯度，所述纯度通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)确定。关于评价抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman，S.等，J.Chrom.B 848(2007)79-87。
本文术语“单克隆抗体”是指获自基本均质抗体群的抗体，即组成该群的各个抗体除可少量存在的可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原表位。相比之下，常规(多克隆)抗体制备物通常包括大量针对不同表位(或对不同表位有特异性)的抗体。修饰语“单克隆”表明获自基本均质抗体群的抗体的特征，且不得解释为需要通过任何特定方法产生抗体。
本文术语“嵌合抗体”是具有第一抗体的可变结构域和第二抗体的恒定结构域的抗体，其中第一抗体和第二抗体来自不同物种。通常可变结构域获自啮齿动物等实验动物的抗体，而恒定结构域序列获自人抗体，使得与所述实验动物抗体相比，所得嵌合抗体在人受试者中诱导不良免疫应答的可能性较低。
本文术语“人源化抗体”是指含有来自人和非人(例如鼠、大鼠)抗体的序列的抗体形式。一般而言，人源化抗体包含至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本所有的超变环相当于非人免疫球蛋白的超变环，而所有或基本所有的构架(FR)区是人免疫球蛋白的构架区。人源化抗体任选可包含至少一部分的人免疫球蛋白恒定区(Fc)。在一些情况下，如本领域技术人员所知悉，可以在人源化抗体(例如，可变结构域、构架区、和/或恒定区(如果存在))中引入氨基酸突变，例如以改善抗体的某些性质；这样的抗体形式也仍落入本发明“人源化抗体”的范畴。
如本领域技术人员所知悉，抗体可以具有用于生产该抗体的细胞的糖链形式。例如，当在小鼠中、在小鼠细胞中或在来源于小鼠细胞的杂交瘤中产生时，抗体可含有小鼠糖链。或者，如果在大鼠中、在大鼠细胞中或在来源于大鼠细胞的杂交瘤中产生时，抗体可含有大鼠糖链。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区。该术语包括天然序列Fc区和Fc区变体。天然序列Fc区涵盖天然存在的各种免疫球蛋白Fc序列，例如各种Ig亚型以及其同种异型的Fc区(Gestur Vidarsson等,IgG subclassesand allotypes:from structure to effector functions，20October 2014,doi:10.3389/fimmu.2014.00520.)在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226,或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作EU索引，如描述于Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991。
本文中的术语“Fc区变体“或“变体Fc区”在本文中可互换使用，指相对于天然序列Fc区包含修饰的Fc区多肽。本发明的Fc区变体按照组成它们的氨基酸修饰来定义。因此，例如，N297A是相对于亲本多肽在297位用丙氨酸取代天冬酰胺的Fc区变体，其中编号按照EU索引。例如，人IgG1 N297A是指这样的Fc区变体，其具有其上带有N297A取代的人IgG1 Fc区的序列。修饰可以是添加，缺失或取代。取代可以包括天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸。变体可以包含非天然氨基酸。
本文中的术语"Fc受体"或"FcR"描述结合抗体Fc区的受体。在一些实施方案中，FcR是天然人FcR。在一些实施方案中，FcR是FcγR(γ受体)，包括FcγRI，FcγRII和FcγRIII亚类的受体，也包括那些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII包括FcγRIIA("活化受体")和FcγRIIB("抑制受体")，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含基于酪氨酸的活化基序(ITAM)的免疫受体。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)的免疫受体(参见例如Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)。FcR的综述参见例如Ravetch andKinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)；Capel et al.,Immunomethods 4:25-34(1994)；And de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。术语"FcR"在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。术语"Fc受体"或"FcR"还包括新生儿受体，FcRn，其负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)和Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994))和调节免疫球蛋白的体内稳态。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie and Ward.,Immunol.Today 18(12):592-598(1997)；Ghetie etal.,Nature Biotechnology,15(7):637-640(1997)；Hinton et al.,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004)；WO2004/92219(Hinton et al.))。可测定人FcRn高亲和力结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染的人细胞系中，或者在施用了具有变异Fc区的多肽的灵长类动物中。WO 2000/42072(Presta)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。还可参见例如Shields et al.,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
术语“药学上可接受的辅料”指与活性物质一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、药用赋形剂、药用载体或稳定剂等。
术语“药物组合物”指这样的组合物，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述组合物的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
在本文中，“免疫缀合物”是与一个或多个其它物质(包括但不限于细胞毒性剂或标记)缀合的抗体。“免疫融合物”是与一个或多个其它的肽或多肽通过共价连接而融合的抗体。
本文所述的术语“治疗剂”涵盖在预防或治疗相关疾病，例如癌症中有效的任何物质。
术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。
“化疗剂”包括在治疗癌症或免疫系统疾病中有用的化学小分子药物。
术语“小分子药物”是指低分子量的能够调节生物过程的化合物。“小分子”被定义为分子量小于10kD、通常小于2kD和优选小于1kD的分子。小分子包括但不限于无机分子、有机分子、含无机组分的有机分子、含放射性原子的分子、合成分子、肽模拟物和抗体模拟物。作为治疗剂，小分子可以比大分子更能透过细胞、对降解更不易感和更不易于引发免疫应答。
本文使用的术语“免疫调节剂”指调节(例如，抑制或增强)免疫应答的天然或合成活性剂或者药物。免疫应答可以是体液应答或细胞应答。在一些实施方案中，免疫调节剂包含抑制免疫应答的免疫抑制剂，例如有利于在炎症和自身免疫性疾病治疗中抑制免疫应答的免疫抑制剂。在一些实施方案中，免疫调节剂包含增强免疫应答的活性剂或药物，例如，有利于在癌症治疗中增强抗癌免疫应答的活性剂或药物。
术语“癌”及“癌症”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调控的生理疾患。此定义中包括良性和恶性肿瘤以及休眠肿瘤或微转移。癌症包括但不限于实体瘤和血液癌。各种癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤及白血病。
“炎症和/或自身免疫性疾病”是指广泛地包括任何炎症或免疫相关病症(例如，病理性炎症和自身免疫性疾病)。"自身免疫性疾病"是起因于并针对个体自身组织或器官的疾病或病症或其共分离或表现或从其产生的病况。自身免疫性疾病可以指由具有对正常身体组织和抗原起反应的抗体的B细胞的产生导致或加重的病况。同样，自身免疫性疾病可以是可牵涉对来自自身抗原(例如核抗原)的表位特异的自身抗体分泌的疾病。
本文术语“载体”是指任何重组多核苷酸构建体，该构建体可用于转化的目的(即将异源DNA引入到宿主细胞中)。一种类型的载体为“质粒”，是指环状双链DNA环，可将额外DNA区段连接至该环中。另一类型的载体为病毒载体，其中可将额外DNA区段连接至病毒基因组中。某些载体能够在被引入到的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体及游离型哺乳动物载体)。在引入到宿主细胞中后，其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)整合至宿主细胞的基因组中，且因此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够导引被操作性连接的基因的表达。本文将此类载体称为“表达载体”，表达载体是指能够在转化、转染或转导至宿主细胞中时复制及表达目的基因的核酸。表达载体包含一或多个表型选择标记及复制起点，以确保维护载体及以在需要的情况下于宿主内提供扩增。
本文术语“受试者”或“患者”或“个体”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
本文术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”和“有效量”是指本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段当单独或与其它治疗药物组合给予细胞、组织或受试者时，有效预防或改善一种或多种疾病或病况的症状或该疾病或病况的发展的量。治疗有效剂量还指足以导致症状改善的抗体或其抗原结合片段的量，例如治疗、治愈、预防或改善相关医学病况或者提高这类病况的治疗、治愈、预防或改善的速度的量。当对个体施用单独给予的活性成分时，治疗有效剂量仅是指该成分。当组合施用时，治疗有效剂量是指引起治疗效果的活性成分的综合量，不论是组合、依次给予还是同时给予。治疗剂的有效量将导致诊断标准或参数提高至少10％，通常至少20％，优选至少约30％，更优选至少40％，最优选至少50％。
在本文中，“治疗”包括1)治疗性措施，该措施治愈、减缓、减轻经诊断的病理状况或疾患的症状及/或停止该经诊断的病理状况或疾患的进展及2)预防性或防范性措施，该措施预防及/或减缓病理状况或疾患的发展。因此，治疗者包括已罹患疾患的个体、易于罹患疾患的个体，以及欲预防疾患的个体。在一些实施方案中，本发明涉及疾病或病征的治疗；在另一些实施方案中，本发明涉及疾病或病征的预防。
在根据本发明的一些实施方案中，疾病或病征的“治疗”是指改善疾病或病征(即，减缓或阻止或减少疾病的进展或其临床症状的至少一个)。在另一些实施方案中，“治疗”是指缓解或改善至少一个身体参数，包括可能不能被患者辨别出的那些物理参数。在另一些实施方案中，“治疗”是指在身体上(例如，可辨别的症状的稳定)、生理上(例如，身体参数的稳定)或在这两方面调节疾病或病征。除非在本文中明确描述，否则用于评估疾病的治疗和/或预防的方法在本领域中通常是已知的。
在根据本发明的再一些实施方案中，疾病或病征的“预防”包括对疾病或病征或特定疾病或病征的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方式中，具有癌症家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，在癌症的背景中，术语“预防”是指在癌症的病征或症状发生前，特别是在具有癌症风险的受试者中发生前的药物施用。
在某些实施方式中，经本发明的方法"治疗"癌症，若病患个体显示下列一或多项，则认为该个体获得了成功治疗：癌细胞的数量减少或完全消失；肿瘤大小减少；抑制或缺乏癌细胞浸润至外围器官包括例如癌扩散至软组织及骨；抑制或缺乏肿瘤转移；抑制或缺乏肿瘤生长；缓解一或多种与该特定癌相关的症状；减少发病率及死亡率；改善生活质量；减少肿瘤的肿瘤发生性、肿瘤发生频率或肿瘤发生能力；减少肿瘤中的癌干细胞的数量或频率；使肿瘤发生细胞分化成非肿瘤发生状态；或一些效应的组合。
“抑制肿瘤生长”是指肿瘤细胞生长可藉以被抑制的任何机制。在某些实施方式中，肿瘤细胞生长藉由延缓肿瘤细胞增生而被抑制。在某些实施方式中，肿瘤细胞生长藉由停止肿瘤细胞增生而被抑制。在某些实施方式中，肿瘤细胞生长藉由杀死肿瘤细胞而被抑制。在某些实施方式中，肿瘤细胞生长系由诱导肿瘤细胞凋亡而被抑制。在某些实施方式中，肿瘤细胞生长系由诱导肿瘤细胞分化而被抑制。在某些实施方式中，肿瘤细胞生长系由剥夺肿瘤细胞养分而被抑制。在某些实施方式中，肿瘤细胞生长藉由预防肿瘤细胞移动而被抑制。在某些实施方式中，肿瘤细胞生长藉由预防肿瘤细胞入侵而被抑制。
在本文中，“序列同一性”是指在比较窗中以逐个核苷酸或逐个氨基酸为基础的序列相同的程度。可以通过以下方式计算“(百分比)序列同一性”：将两条最佳比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同一性百分比。为了确定序列同一性百分数而进行的最佳比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。在本发明中，就抗体序列而言，氨基酸序列同一性百分数通过将候选抗体序列与参考抗体序列最佳比对后，在一个优选方案中按照Kabat编号规则进行最佳比对后，予以确定。
本文中“GBR830”是根据专利WO 2013008171中公开的VH6/VL9重链和轻链序列，瞬时表达获得的OX40拮抗型抗体；“OX40mAb24”是指根据专利WO 2016057667中公开的OX40mAb24抗体重链和轻链序列，瞬时表达获得的OX40激动型抗体；“11D4”是指根据专利WO2009079335中公开的11D4抗体的重链和轻链序列，瞬时表达获得的OX40激动型抗体。
抗OX40抗体及其产生
本发明的抗体可采用用于产生抗体的任何合适方法来产生。任何合适形式的OX40都可用作产生抗体的免疫原(抗原)。通过举例而非限制，任何OX40变体或其片段都可用作免疫原。在一些实施方式中，产生鼠源的单克隆抗人OX40抗体的杂交瘤细胞可通过本领域公知的方法产生。这些方法包括但不限于最初由Kohler等(1975)(Nature 256:495-497)研发的杂交瘤技术。优选根据标准方案，分离出小鼠脾细胞，用PEG或通过电融合与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后通过筛选分泌抗体具有OX40结合等活性的杂交瘤细胞。本发明的杂交瘤细胞免疫球蛋白可变区的DNA序列可利用基于简并引物PCR的方法测定。
来源于啮齿动物(如小鼠)的抗体在体内用作治疗药物时可引起不需要的抗体免疫原性，重复使用导致人体产生针对治疗性抗体的免疫应答，这类免疫应答至少导致丧失治疗功效，而严重的则导致潜在致死过敏反应。降低啮齿动物抗体的免疫原性的一种方法包括嵌合抗体的产生，其中将小鼠可变区与人恒定区融合(Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-43)。然而，嵌合抗体中的完整啮齿动物可变区的保留仍可在患者中引起有害的免疫原性。
将啮齿动物可变区的CDR移植到人构架上(即人源化)已被用于进一步将啮齿动物序列减至最低。本发明所述的人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠源CDR区插入人种系框架区。参见Winter等人的美国专利No.5,225,539及Queen等人的美国专利US5,530,101；US5,585,089；US5,693,762和US6,180,370。
本发明的抗体可变区CDR的精确氨基酸序列边界可使用许多公知的方案(例如Kabat、Chothia、AbM、Contact或North)的任何方案来确定。应该注意，基于不同的定义系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同。
具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。然而，尽管CDR在抗体与抗体之间是不同的，但是CDR内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。使用Kabat、Chothia、AbM、Contact和North方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是CDR的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定CDR序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何CDR的变体。在一些实施方式中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段在一个CDR的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据Kabat或IMGT定义的其余CDR残基可以被保守氨基酸残基替代。
在一些实施方案中，本发明提供抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含选自重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一个至三个，其中所述的HCDR1包含与选自SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列一致或与之相比具有至少1个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列，HCDR2包含与选自SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列一致或与之相比具有至少1个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列，HCDR3包含与选自SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列一致或与之相比具有至少1个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含选自轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一个至三个，其中所述的LCDRl包含与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列一致或与之相比具有至少1个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列，LCDR2包含与SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列一致或与之相比具有至少1个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列，LCDR3包含与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列一致或与之相比具有至少1个且不超过3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供的抗OX40抗体或其抗原结合片段还涵盖这样的抗体或其抗原结合片段，其中在重链可变区的三个CDR上，相对于本文具体公开的三个CDR，共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)，和/或在轻链可变区的三个CDR上，相对于本文具体公开的三个CDR，共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸取代，优选保守取代)。
在一些实施方案中，本发明提供的抗OX40抗体或其抗原结合片段还涵盖这样的抗体或其抗原结合片段，其中与本文具体公开抗体的重链可变区和/或轻链可变区相比，所述重链可变区和/或轻链可变区有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过6、5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸取代，更优选氨基酸保守取代)的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸改变不发生在CDR区中。
在一些实施方案中，本发明提供的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)，其中所述的VH包含与SEQ ID NO:1、2、3、4或5所示的氨基酸序列一致或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区(VL)，其中所述的VL包含与SEQ ID NO:6、7、8、9或10所示的氨基酸序列一致或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，本文所述的氨基酸改变包括氨基酸的取代、插入或缺失。优选的，本文所述的氨基酸改变为氨基酸取代，优选地保守取代。
在优选的实施方案中，本发明所述的氨基酸改变发生在CDR外的区域(例如在FR中)。更优选地，本发明所述的氨基酸改变发生在重链可变区外和/或轻链可变区外的区域。在一些实施方案中，氨基酸改变发生在重链恒定区和/或轻链恒定区。
在一些实施方案中，包含氨基酸改变的本发明的抗体与本文所公开的具体抗体具有相当或相似的性质。
在一些实施方案中，本发明的抗OX40抗体包括对CDR、轻链可变区、重链可变区、轻链或重链的翻译后修饰。
在一些实施方案中，本发明所提供的抗OX40抗体，其是全长抗体、单域抗体例如VHH、Fab、Fab’、Fab’-SH、(Fab’)2、单链抗体例如scFv、Fv、dAb(domain antibody)或双(多)特异性抗体。
在一些实施方案中，本发明所提供的抗OX40抗体，是任何IgG同种型形式的抗体，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4形式的抗体。
在一些实施方案中，本发明还提供效应子功能改变的抗体。术语“效应子功能”是指，可归因于抗体的Fc区的那些生物活性，其随抗体类别而改变。存在五种主要的抗体类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。抗体的效应子功能包括例如但不限于：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；免疫细胞的募集；经由Fc区与细胞表面FcR受体结合介导的抗体交联。如本领域技术人员理解的，可以根据需要，例如是否需要募集免疫系统来杀伤靶细胞、是否需要通过与FcR的相互作用来诱导抗体的交联等因素，来选择合适的抗体Fc区序列。例如，在免疫系统募集和靶细胞杀伤是期望的目的抗体期望性质时，可以选择或进一步改造抗体的Fc区以提供与活化FcγR受体和/或补体的增强结合来促进例如ADCC或CDC效应子功能。再例如，在不期望募集免疫系统的情况下，可以选择或进一步修饰抗体的Fc区以降低该效应子功能，例如可以使用人IgG2或IgG4亚型的Fc区，或者使用带有突变如N297A的IgG1亚型的Fc区。此外，可以通过选择或突变Fc区，有选择地提供抗体与一种或多种Fc受体的结合，而降低或消除与另一种或多种FcR的结合，从而实现抗体效应子功能的调整，例如增强抗体交联的同时改变ADCC活性强度。参见例如Xinhua Wang等，IgG Fc engineering to modulate antibody effectorfunctions,Protein Cell 2018,9(1):63-73，DOI 10.1007/s13238-017-0473-8；ShieldsRL,High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgG1 for FcγRI,FcγRII,FcγRIII and FcRn and Design of IgG1 Variants with Improved Binding tothe FcγR,2001,J Biol Chem.2001 Mar 2；276(9):6591-604.Epub 2000Nov 28.
本发明提供拥有一些但不是所有效应子功能的抗体变体，所述效应子功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应子功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性或抗体交联活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Tmmunol·9:457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。已绘制了人IgG1上与FcγRI，FcγRII，FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已经描述了具有改善的结合的变体(参见Shields等，J.Biol.Chem.276：6591-6604，2001)。
在一些实施方案中，本发明提供的抗体的Fc区可引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区)。例如在Bruhns和
Figure BDA0003890662890000161
发表在Immunol Rev.2015Nov；268(1):25-51的文章中，在第44页上，总结了多个对人IgG1进行的改造以增强或降低其对FcγR的结合及增强或降低相应的功能。
在一些实施方式中，本发明提供的抗体包含人IgG1 Fc区变体，该Fc区变体具有降低或缺乏的FcγR结合活性(如抗体交联活性)。在一些实施方式中，该人IgG1 Fc区变体包含一个或多个氨基酸替代，具体地，该氨基酸替代可以选自免疫球蛋白重链E233、L234、L235、N297和P331的位置处的氨基酸替代。在一些实施方案中，该人IgG1 Fc区变体包含选自E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297G、N297D和P331S中的一个或多个的氨基酸替代。在一些实施方式中，该人IgG1 Fc区变体的氨基酸替代为N297A。在另一实施方案中，该人IgG1 Fc区变体不是N297A。
在一些实施方案中，因此，本发明提供了抗OX40抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段不是包含人IgG1 N297A的Fc区变体的抗体或抗原结合片段。在一些情形中，例如，所述抗体或其抗原结合片段可以包含天然序列Fc区；在另一些情形中，所述抗体或其抗原结合片段可以包含变体Fc区，其中所述变体Fc区不是IgG1 N297A。在一些实施方案中，取决于抗体的Fc区序列，所述抗体可以是激动剂抗体或拮抗剂抗体。
一方面，本文中所提供的抗体经改变以增加或降低抗体经糖基化的程度。对抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以便产生或移除一或多个糖基化位点而方便地实现。糖基化可以被改变以例如增加抗体对“抗原”的亲和力。可以通过例如改变抗体序列内一个或多个糖基化位点来完成这种碳水化合物的修饰。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，其导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点的糖基化。这种无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。这样的方法在例如美国专利No.5,426,300中有所描述。当抗体包含Fc区时，可以改变附着于其的糖类。在一些应用中，除去不想要的糖基化位点的修饰可以是有用的，例如除去岩藻糖模块以提高抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)功能。在其它应用中，可以进行半乳糖苷化修饰以修饰补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在一些实施方式中，可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体，例如“硫代MAb”，其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基取代。
在一些实施方式中，本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其他非蛋白质部分。适合抗体衍生作用的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二烷、聚-1，3，6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。
在一些实施方案中，本发明的抗体具有以下一个或多个特性：
(i)以高亲和力，例如以小于100nM，例如小于50nM，例如小于30nM，优选小于10nM或5nM的KD值，与人OX40结合，尤其是与人OX40胞外域结合，其中优选地KD值采用表面等离子共振测定法进行测量；
(ii)以高亲和力，例如以小于100nM，例如小于50nM，例如小于40nM，优选小于20nM，更优选小于10或5nM的EC50值，与细胞(如T细胞)表面表达的人OX40结合，其中优选地EC50值采用FACS测定法进行测量；
(iii)阻滞人OX40及其配体OX40L结合，例如，以ELISA方法测定，抑制率达到至少50％、例如，至少60％、70％、80％、85％或90％，且优选地IC50值小于10nM，更优选小于1nM；
(iv)显示与表2所列任一抗体相同或相似的结合亲和力和/或特异性；
(v)抑制(例如，竞争性抑制)表2所示的任一抗体分子，与OX40的结合；
(vi)与表2所示的任一抗体结合相同或重叠的表位；
(vii)与表2所示的任一抗体具有相同或相似的生物活性。
在一些实施方案中，本发明的OX40抗体为激动型抗体，其包含具有与FcR例如FcγR结合的Fc区，例如人IgG1、IgG2或IgG4 Fc区或其变体，优选地人IgG1或IgG2 Fc区或其变体。所述变体优选地具有与亲本Fc区(例如天然序列Fc区)相当的或更强FcγR结合亲和力。优选地，所述抗体通过其Fc区与细胞表面表达的FcγR的结合并实现交联。优选地，所述抗体包含如SEQ ID NO:21或22所示的恒定区序列的人IgG1或IgG2 Fc区序列，或包含与如SEQID NO:21或22所示的恒定区序列的Fc区序列具有至少95％，96％，97％或99％同一性，或与如SEQ ID NO:21或22所示的恒定区序列的Fc区序列具有不超过10个、5个或1-3个氨基酸修饰的人IgG1或IgG2 Fc区变体。
在一些实施方案中，本发明的OX40激动型抗体具有如下一个或多个特性：
(i)以高亲和力，例如小于10nM，更优选小于5nM的KD值，结合人OX40，其中优选地KD值采用表面等离子共振测定法进行测量；
(ii)以高亲和力，例如小于10nM，更优选小于5nM的EC50值，与细胞(例如激活的CD4+T细胞)表面表达的人OX40结合，其中优选地EC50值采用FACS测定法进行测量；
(iii)激活OX40介导的信号传导活性；
(iv)具有T细胞激动活性，例如可以通过检测抗体存在下由活化的T细胞释放的细胞因子如IFNγ来评估抗体对T细胞的激动活性，在一些实施方案中，抗体的EC50值小于10nM，优选小于5nM；
(v)抑制肿瘤生长，例如抑制黑素瘤细胞的生长。
在一些实施方案中，本发明的OX40抗体为拮抗型抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含Fc区变体，其中，例如相对于亲本Fc区(例如天然序列Fc区)，该Fc区变体与FCγR的结合亲和力降低或基本上消除。在一些实施方案中，本发明的抗体与细胞表面表达的FcγR基本不结合，不发生由FcγR介导的抗体交联。在一些实施方案中，包含Fc区变体的本发明抗体，相对于包含亲本Fc区(例如天然序列Fc区)的相应抗体，具有降低的或消除的由FcγR介导的效应子功能。优选地，所述抗体的Fc区包含选自以下的突变：E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297G、N297D、P331S或其组合。更优选地，所述抗体的Fc区为包含N297A突变的人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，所述抗体包含与如SEQ ID NO:21所示的恒定区序列的Fc区序列一致的人IgG1 Fc区序列，或包含与如SEQ ID NO:21所示的恒定区序列的Fc区序列具有至少95％，96％，97％,98％或99％同一性、或与如SEQ ID NO:21所示的恒定区序列的Fc区序列具有不超过10个、5个或1-3个氨基酸修饰的人IgG1 Fc区变体，且包含降低Fc区与FcγR结合亲和力的突变，优选地N297突变，更优选地N297A。
在一些实施方案中，本发明的OX40拮抗型抗体具有如下一个或多个特性：
(i)以高亲和力，例如小于10nM，更优选小于5nM的KD值，结合人OX40，其中优选地KD值采用表面等离子共振测定法进行测量；
(ii)以高亲和力，例如小于10nM，更优选小于5nM的EC50值，与细胞(例如激活的CD4+T细胞)表面表达的人OX40结合，其中优选地EC50值采用FACS测定法进行测量；
(iii)阻滞OX40及其配体OX40L结合，例如，以ELISA方法测定，抑制率达到至少70％、优选至少80％、85％或90％，且优选地IC50值小于10nM，更优选小于1nM；
(iv)阻断OX40介导的信号传导活性；
(v)具有T细胞拮抗活性，例如可以通过检测在抗体和配体OX40L存在下由T细胞释放的细胞因子如IFNγ来评估抗体对OX40L介导的T细胞激活的阻滞作用，以评价抗体的T细胞拮抗活性，并且在一些实施方案中，抗体的IC50值小于5nM，优选小于1nM；
(vi)表现出抗免疫排斥活性，例如在移植物抗宿主病中降低免疫排斥。
抗体表达
本发明涉及包含一种或多种表达载体的宿主细胞以及用于产生本发明的任何抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养所述宿主细胞、纯化和回收所述抗体或抗原结合片段。
在一方面，本发明提供了编码以上任何抗OX40抗体或其抗原结合片段的核酸。例如，本发明提供了编码包含本文所述重链、轻链、可变区或互补决定区的区段的核酸。在一些方面，编码重链可变区的核酸与SEQ ID NO：17或18的所示核酸序列具有至少85％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性。在一些方面，编码轻链可变区的核酸与SEQ ID NO：19或20所示的核酸序列具有至少85％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性。
在一方面，提供包含所述核酸的一个或多个载体。在一些实施方案中，载体是表达载体。表达载体的选择取决于载体要在其中表达的预期宿主细胞。通常，表达载体包含与编码抗OX40抗体或其抗原结合片段的核酸可操作地连接的启动子和其他调节序列(例如，增强子)。在一些实施方案中，所述表达载体还包含编码所述抗体恒定区的序列。
在一方面，本发明提供用于表达本发明的重组抗体的宿主细胞，包括原核或真核的。在一些实施方式中，大肠杆菌是一种可用于克隆和表达本发明的核酸的原核宿主。其他适用的微生物宿主包括杆菌，例如枯草芽孢杆菌，以及其他肠杆菌科，例如沙门氏菌，沙雷氏菌和各种假单胞菌。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，其通常包含与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)。在一些实施方式中，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本发明的抗OX40抗体多肽。例如，它们可以是表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系，也可以是具有外源性表达载体的哺乳动物细胞系，包括正常人细胞，或永生的动物或人细胞。例如，已经开发了许多能够分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系，各种COS细胞系，HEK293细胞，骨髓瘤细胞系，转化的B细胞和杂交瘤。
在一方面，本发明提供制备抗OX40抗体的方法，其中所述方法包括，将表达载体导入哺乳动物宿主细胞中，通过将宿主细胞培养足够的一段时间，以允许抗体在宿主细胞中表达，或者更优选抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中,来产生抗体。可采用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。如本文所述制备的抗体分子可以通过已知的现有技术如高效液相色谱、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等纯化。用来纯化特定蛋白质的实际条件还取决于净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且这些对本领域技术人员是显而易见的。可以通过多种熟知分析方法中的任一种方法确定本发明的抗体分子的纯度，所述熟知分析方法包括尺寸排阻层析、凝胶电泳、高效液相色谱等。
由不同细胞系表达或在转基因动物中表达的抗体彼此间很可能具有不同的糖基化。然而，由本文提供的核酸编码的或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体是本发明的组成部分，而不论抗体的糖基化如何。
测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的抗OX40抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA，Western印迹等来进行。可使用本领域已知方法来测定对OX40的结合，本文中公开了例示性方法。
本发明还提供了用于鉴定具有生物学活性的抗OX40抗体的测定法。生物学活性可以包括例如与OX40(例如结合人OX40)的结合，提高OX40介导的信号转导(例如提高NFkB介导的转录)，增强T效应细胞功能(例如通过提高效应T细胞增殖和/或提高效应T细胞的细胞因子生成(例如γ干扰素))，等。还提供了在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。
在某些实施方案中，对本发明的抗体测试此类生物学活性。
供任何上述体外测定法使用的细胞包括天然表达OX40或经改造而表达OX40细胞系，例如肿瘤细胞系。此类细胞还包括表达OX40和并非正常情况下表达OX40的转染了编码OX40的DNA的细胞系。
可以理解的是，能够使用本发明的免疫缀合物或免疫融合物替换或补充抗OX40抗体来进行任何上述测定法。
可以理解的是，能够使用抗OX40抗体和别的活性剂的组合来进行任何上述测定法。
免疫缀合物和免疫融合物
在一些实施方案中，本发明提供了免疫缀合物，其包含本文中提供的任何抗OX40抗体或其抗原结合片段和其它物质。在一个实施方案中，所述其它物质为例如细胞毒性剂。
在一些实施方案中，本发明提供包含提供的任何抗OX40抗体或其抗原结合片段的免疫融合物。
在一些实施方案中，所述免疫缀合物和所述免疫融合物用于预防或治疗OX40相关疾病或病征。
药物组合物
本发明的药物组合物可包括本发明的抗体和药学上可接受的辅料。在一些实施方案中，本发明药物组合物可包括于药盒中，在另一些实施方案中，本发明的药物组合物可以包括在试剂盒中，如诊断试剂盒。
如本文所用，“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。适用于本发明的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些具有石油、动物、植物或合成来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。
合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第五版，R.C.Rowe，P.J.Seskey和S.C.Owen，Pharmaceutical Press，London，Chicago。所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、缓释剂等形式。口服配制剂可以包含标准载体，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精等。
本发明提供了包括一种或多种结合OX40的单克隆抗体或其抗原结合片段、核酸、载体或宿主细胞或免疫缀合物或免疫融合物的药物组合物。应理解，本发明提供的抗OX40抗体或其抗原结合片段、核酸、载体或宿主细胞或免疫缀合物或或融合物在药物组合物中可以整合制剂中合适的药用载体、赋形剂和其他试剂以联合给药，从而提供改善的转移、递送、耐受等。
可以通过将具有所需纯度的本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段与一种或多种任选的药学上可接受的辅料混合来制备包含本文所述的抗OX40抗体的药物制剂，优选地以水溶液或冻干制剂的形式。示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本发明的药物组合物或制剂还可以包含一种或多种其它活性成分，所述活性成分是治疗特定疾病所需的，优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还包含其它治疗剂。在一些实施方案中，所述其它治疗剂为化疗剂、放疗剂、细胞因子、疫苗、其他抗体、免疫调节剂或者其他生物大分子药物。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物还包含编码抗OX40抗体或其抗原结合片段的核酸的组合物。
方法或用途
本发明提供预防、诊断或治疗OX40相关疾病或病征的方法。该方法包括向需要的患者施用有效量的抗OX40抗体或其抗原结合片段或包含其的免疫缀合物或免疫融合物或药物组合物，或者本文所述的核酸、载体或宿主细胞。
在一方面，本发明提供抗OX40抗体或其抗原结合片段或包含其的免疫缀合物或免疫融合物或药物组合物在生产或制备用于预防或治疗受试者OX40相关疾病或病征的药物的用途。
在一方面，本发明提供的抗OX40抗体及其抗原结合片段和包含其的药物组合物可以用作治疗剂，用于预防或治疗受试者OX40相关疾病或病征。针对通过使用标准方法鉴定的受试者中OX40相关的疾病或病征，可以施用本发明公开的抗OX40抗体及其抗原结合片段和包含其的药物组合物或免疫缀合物或免疫融合物，或者本文所述的核酸、载体或宿主细胞。
在一些实施方案中，本文所述的方法和用途还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂或治疗方式。在一些实施方案中，所述治疗剂例如化疗剂、放疗剂、细胞因子、疫苗、其他抗体、免疫调节剂或者其他生物大分子药物。在一些实施方案中，治疗方式包括外科手术；放射疗法、局部照射或聚焦照射等。
上述联合疗法包括组合给药(其中两种以上治疗剂被包含在相同或分开的制剂中)和分别给药，其中，本发明的抗OX40抗体或其抗原结合片段的给药可以发生在另外的治疗剂和/或佐剂和/或治疗方式的给药前、同时和/或之后。
在一些实施方案中，本发明所述的OX40相关疾病或病征指与受试者中OX40表达、活性和/或信号传导异常相关的疾病或病征，包括但不限于癌症、炎症和自身免疫性疾病。在一些实施方案中，在与OX40相关的疾病或病征中，编码OX40的核酸(水平或含量)升高，或OX40表达升高，或OX40蛋白质水平或活性升高，或由OX40介导的信号传导增强。在另一些实施方案中，在与OX40相关的疾病或病征中，编码OX40的核酸(水平或含量)减少，或OX40表达降低，或OX40蛋白质水平活性降低，或由OX40介导的信号传导减少。
在一些实施方案中，所述疾病或病征的治疗将受益于抑制核酸或蛋白质水平的OX40、或受益于阻断OX40与其配体的结合、或抑制OX40介导的信号传导。
在另一些实施方案中，所述疾病或病征的治疗将受益于增加核酸或蛋白质水平的OX40、或受益于增强OX40介导的信号传导。
在一些实施方案中，OX40相关疾病或病征是癌症。具体地，癌症包括但不限于实体瘤，乳腺癌，尿路上皮癌、黑色素瘤、肾癌、卵巢癌、头颈癌、胃癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、皮肤癌、间皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、前列腺癌、淋巴性白血病和肉瘤。优选地，用于预防、诊断或治疗与OX40相关的癌症的抗体是OX40激动剂。
在一些实施方案中，OX40相关疾病或病征是炎症和/或自身免疫性疾病。在一些实施方案中，与OX40相关的炎症和/或自身免疫性疾病选自特发性皮炎，类风湿性关节炎，哮喘(例如过敏性哮喘)，COPD，自身免疫性葡萄膜炎，多发性硬化，狼疮(例如如系统性红斑狼疮)，溃疡性结肠炎，硬皮病和移植物抗宿主病(GVHD)。优选地，用于治疗或预防与OX40相关的炎症和/或自身免疫性疾病的抗体是OX40拮抗剂。
在一些实施方案中，受试者可以是哺乳动物，例如，灵长类，优选地，高级灵长类，例如，人类(例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的风险的个体)。在一个实施方案中，受试者患有本文所述疾病(例如，癌症)或具有患有本文所述疾病的风险。在某些实施方案中，受试者接受或已经接受过其它治疗，例如化疗治疗和/或放射疗法。
本发明的抗体或抗原结合片段可以通过任何合适的方式给药，包括经口、肠胃外，肺内和鼻内给药，并且如果需要局部治疗，则可以病灶内给药。肠胃外输注包括肌内，静脉内，动脉内，腹膜内或皮下给药。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射，部分取决于给药是短暂的还是长期的。本文考虑了各种给药方案，包括但不限于在各个时间点上的单次或多次给药，推注给药和脉冲输注。
本发明的抗体或抗原结合片段将以与良好医学实践一致的方式配制，给药和施用。在此情况下考虑的因素包括正在治疗的特定疾病，正在治疗的特定哺乳动物，个体患者的临床状况，疾病的原因，药物的递送部位，给药方法，给药时间表以及其他从业人员已知的因素。任选地，该抗体与目前用于预防或治疗所述疾病的一种或多种试剂一起配制。这些其他试剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量，病征或治疗的类型以及上面讨论的其他因素。
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体或抗原结合片段的合适剂量(当单独使用或与一种或多种其他额外的治疗剂组合使用时)将取决于要治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和病程、施用抗体是出于预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床病史和对抗体的响应以及主治医师的判断力而施用。将抗体适当地以一次或一系列治疗施用于患者。
在某些实施方案中，本文中提供的任何抗OX40抗体或其抗原结合片段可以用于检测OX40在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品是血、血清或生物来源的其他液体样品。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。在一些实施方案中，生物样品来自过度增生性或癌性病灶相关病灶。
在一个实施方案中，可以使用本发明抗体或其抗原结合片段诊断OX40相关的疾病或病征，例如癌症，例如评价(例如，监测)个体中本文所述疾病的治疗或进展、其诊断和/或分期。在某些实施方案中，提供标记的抗OX40抗体或其抗原结合片段。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记)，以及被间接检测的部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用。在一些实施方案中，本文提供用于诊断OX40相关的疾病的试剂盒，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段。
在本文中提供的一些实施方案中，样品是在用抗OX40抗体或其抗原结合片段治疗之前获得的。在一些实施方案中，样品是在用其他疗法之前获得的。在一些实施方案中，样品是在用其他疗法治疗过程中，或者用其他疗法治疗后获得的。
本发明包括本文所述的特定实施方案的任何组合。应当理解，尽管描述了特定的内容和实施例来表明本发明优选的实施方案，但是这仅仅是说明性的，用于举例，本发明还涵盖对本领域技术人员来说显而易见的针对本发明的优选实施方案进行修改的实施方案。出于所有目的，包括引文在内的本文所引用的所有公开物、专利及专利申请将以引用的方式全部并入本文作为参考。
实施例
实施例1杂交瘤抗体的制备与筛选
利用杂交瘤技术获得OX40抗体，采用Fc标签的人OX40胞外结构域的重组蛋白OX40-Fc(R&D，Cat 3388-OX)作为抗原免疫小鼠。简言之，将OX40-Fc与完全或不完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich)混合并乳化后，免疫C57BL/6和BALB/c小鼠。小鼠经过1轮免疫(完全弗氏佐剂)以及两轮加强免疫(不完全弗氏佐剂)后，并于每次加强免疫后取血，分别通过ELISA技术检测免疫后小鼠血清与重组人OX40-His(R&D Systems，Cat 9969-OX)蛋白结合活性，同时通过流式细胞技术(FACS)检测小鼠血清与过表达人OX40的CHO细胞(GenScript构建)的结合效价。选取血清效价高的小鼠进行融合。在融合前4天，人OX40胞外结构域的重组蛋白OX40-Fc腹腔注射小鼠以加强免疫。融合当天，将小鼠安乐死后，取小鼠脾脏进行匀质化以获得单细胞悬液。使用电融合仪将小鼠脾脏细胞与鼠骨髓瘤细胞系SP2/0细胞(购自ATCC)进行融合。将融合后的细胞重悬于含HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氧核苷，GIBCO，Cat 21060017)的培养基中并接种到96孔板。在37℃下培养7天。用OX40相关的功能平台(诸如与人的OX40结合特异性、对T细胞活化功能)，鉴定杂交瘤分泌上清活性，阳性的杂交瘤克隆进行单轮或多轮亚克隆以得到单克隆。经筛选，38E11为最终选定的优选杂交瘤克隆(其分泌的抗体称为38E11)。
将候选杂交瘤细胞38E11扩大培养，经过7至10天培养后，收集上清，离心并过滤以除去细胞及碎片。将上清流过proteinA的纯化柱(Genscript)，继而用含0.05M Tris和1.5MNaCl(pH8.0)的缓冲液清洗平衡后，用0.1M柠檬酸钠(pH3.5)洗脱，并立刻用九分之一体积的1M Tris-HCl(pH9)中和，然后用PBS缓冲液透析。最终得到杂交瘤抗体38E11用于进一步表征。
1.1ELISA检测抗体与OX40胞外结构域蛋白的结合活性
将重组人OX40-His(R&D,Cat 9969-OX)包被到96孔板，封闭后加入梯度稀释的小鼠血清或抗体并孵育，用含有0.5％的Tween20的PBS洗板后加入HRP标记的抗鼠IgG的二抗孵育，并用TMD进行显色，通过酶标仪读取OD450。
如表1所示，最终得到的杂交瘤抗体38E11与人OX40蛋白具有高结合活性，EC50为0.276nM。
1.2 FACS检测抗体与活化T细胞上OX40的结合活性
从健康人全血中，用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare，Cat 17-1440-02)密度梯度离心的方法，收集中间层，并用PBS洗涤3次，获得原代PBMC。进一步用Pan T CellIsolation Kit(Miltenyi biotec，Cat130-096-535)按照说明书推荐的方法，通过磁珠法分离获得T细胞。将T细胞重悬于RPMI 1640(含10％FBS和青霉素/链霉素双抗)培养基中，加入PHA-L和IL-2(或Con-A和hIL-2)，刺激2天，诱导T细胞表达OX40。将活化的T细胞用含2％FBS的PBS洗涤1次，加入梯度稀释的OX40抗体，4℃孵育30分钟。用含2％FBS的PBS洗涤两次，加入PE标记的抗人IgG二抗(Biolegend，Cat 409304)(或PE标记的抗鼠IgG二抗(Biolegend，Cat 405307))和APC-CY7标记的抗人CD4抗体(Biolegend，Cat300518)。通过BDCantoII流式细胞仪检测CD4阳性T细胞表面OX40抗体的结合情况。根据平均荧光强度值拟合曲线并计算EC50。
如表1所示，杂交瘤抗体38E11与人活化T细胞上的OX40具有结合活性，EC50为0.8nM。
1.3抗体对T细胞的激动活性测定
通过检测T细胞活化后由T细胞释放的细胞因子IFNγ，评估抗体对T细胞的激动活性。简言之，从健康人全血中，用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare，Cat 17-1440-02)密度梯度离心的方法，收集中间层，并用PBS洗涤3次，获得原代PBMC。进一步用Pan T CellIsolation Kit(Miltenyi biotec，Cat 130-096-535)按照说明书推荐的方法，通过磁珠法分离获得人原代T细胞。将T细胞重悬于RPMI 1640(含10％FBS和青霉素/链霉素双抗)培养基中。将抗CD3抗体(eBioscience，Cat 16-0037-85)和梯度稀释的OX40抗体混合后，按照每孔100ul加入到96孔板中，于37℃包被2h。用PBS洗去未包板的抗体，在孔中加入分离获得的T细胞，培养3天后收集上清，按照说明书推荐的标准检测方法，用ELISA(R&D，Ct SIF50)检测上清中IFNγ浓度。
如表1所示，杂交瘤抗体38E11促进T细胞分泌IFNγ，其EC50值为1.4nM。
在表1中也显示了，通过瞬时表达获得的对照抗OX40抗体11D4和OX40mAb24的功能活性。
表1杂交瘤抗体38E11的功能活性鉴定
Figure BDA0003890662890000241
*本底：未加相应抗OX40抗体的对照
实施例2杂交瘤抗体人源化改造
2.1测定杂交瘤抗体可变区序列
利用杂交瘤测序的方法，将杂交瘤克隆38E11的细胞进行扩大培养并利用TRIzol(购自Ambio)提取总RNA，利用抗体特异性的引物将其反转录为DNA(Takara,PrimerScript1stStrand cDNA Synthesis Kit)，并使用抗体特异性引物对编码鼠免疫球蛋白V-区域的基因片段进行扩增并克隆，通过序列测定分析，得到可变区序列，38E11重链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID No.:17所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQ.ID No.:18所示。
2.2杂交瘤抗体人源化设计
对于抗体的人源化，首先在PDB Antibody database搜寻与鼠源抗体可变区的序列高度同源的人类种系免疫球蛋白基因。其中38E11重链可变区和轻链可变区分别与人germline IGHV1-46*01和人germline IGKV4-1*01有较高序列同源性。再藉由Kabat编号系统定义可变区CDR的氨基酸序列及其精确边界。原则上将与鼠源抗体可变区具有高同源性的人类IGVH及IGVk选为人源化模板，藉由CDR嫁接实施人源化。
为了保持人源化抗体的活性，一般还可利用计算机模拟技术，应用分子对接分析可变区及其周边的框架氨基酸序列，考察其空间立体结合方式。通过计算静电力，范德华力，亲疏水性和熵值，分析各候选的抗体基因序列中可与OX40作用以及维护空间构架的关键氨基酸个体，将其嫁接回已经选择的人抗体基因框架，并在此基础上标配出必须保留的框架区氨基酸位点，合成人源化抗体。在38E11抗体重链可变区选定7个位点做回复突变：V20L，M48I，R67K，M70L，R72V，V79A和T91S。根据回复突变数目和排列，分别设计出VH1(SEQ.ID No.:2)、VH2(SEQ.ID No.:3)、VH3(SEQ.ID No.:4)、和VH4(SEQ.ID No.:5)四条不同的人源化重链。在38E11抗体轻链可变区选定3个位点做相应的回复突变：M4L，V62I和L82V，分别设计出VL1(SEQ.ID No.:7)、VL2(SEQ.ID No.:8)、VL3(SEQ.ID No.:9)、和VL4(SEQ.ID No.:10)四条不同的人源化轻链。由此，共设计出38E11人源化抗体Hu38E11及其变体Hu38E11-v1、Hu38E11-v2、Hu38E11-v3和Hu38E11-v4，并进行进一步表征。各抗体包含的氨基酸序列见表2和3。
2.3人源化抗体表达
将来源于杂交瘤抗体38E11的可变区或其人源化序列扩增并克隆至包含表达人IgG恒定区的载体中以得到表达的质粒。抗体的重链恒定区可以选自来源于任何亚型的人IgG(如人IgG1重链恒定区氨基酸序列如SEQ.ID No.:21所示，和人IgG2的重链恒定区氨基酸序列如SEQ.ID No.:22所示)或其变体，除特殊标记，Hu38E11及其变体的重链恒定区与人IgG1的重链恒定区序列一致。将包含重链和轻链的表达载体共转染293细胞，于37℃培养4-6天后，收集上清，根据前述方法，通过proteinA亲和纯化，得到重组抗体用于抗体的进一步表征。
表2抗OX40抗体包含的氨基酸序列
38E11及其变体 VH氨基酸序列 VL氨基酸序列
38E11 SEQ.ID No.:1 SEQ.ID No.:6
Hu38E11 SEQ.ID No.:2 SEQ.ID No.:7
Hu38E11-v1 SEQ.ID No.:3 SEQ.ID No.:9
Hu38E11-v2 SEQ.ID No.:4 SEQ.ID No.:7
Hu38E11-v3 SEQ.ID No.:2 SEQ.ID No.:9
Hu38E11-v4 SEQ.ID No.:4 SEQ.ID No.:8
表3抗OX40抗体包含的CDR氨基酸序列(Kabat定义)
CDR 氨基酸序列
HCDR1 SEQ.ID No.:11
HCDR2 SEQ.ID No.:12
HCDR3 SEQ.ID No.:13
LCDR1 SEQ.ID No.:14
LCDR2 SEQ.ID No.:15
LCDR3 SEQ.ID No.:16
实施例3FACS检测人源化抗体与活化T细胞上OX40的结合活性
如前述实施例1.2所描述的检测方法，利用FACS分析候选人源化抗体与活化的人T细胞上OX40的结合活性。
结果：如表4，人源化抗体Hu38E11及其变体与活化的人T细胞表面OX40具有较好的结合活性。
表4抗体Hu38E11及其变体与活化的T细胞上OX40结合活性
抗体 EC<sub>50</sub>,nM
OX40mAb24 6.23
Hu38E11 4.56
Hu38E11-v1 5.03
Hu38E11-v2 3.35
Hu38E11-v3 3.48
Hu38E11-v4 3.02
实施例4人源化抗体对T细胞的激动活性测定
如前述实施例1.3所描述的方法，通过检测在抗体存在下活化T细胞释放的炎性因子IFNγ评估人源化抗体对T细胞的激动活性。
如表5所示，人源化抗体Hu38E11及其变体均能有效促进活化T细胞释放IFNγ，即对T细胞具有激动活性。相比对照抗体OX40mAb24，人源化抗体Hu38E11及其变体的促进T细胞释放IFNγ的EC50值更低，激动活性更明显。
表5抗体Hu38E11及其变体对T细胞的激动活性
Figure BDA0003890662890000261
Figure BDA0003890662890000271
实施例5Biacore检测人源化抗体与人OX40的结合活性
Biacore通过测量表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)进行结合动力学参数的测定。此技术检测抗体与抗原的结合(ka)和解离(kd)的微观速率常数，通过计算得到抗体与抗原的亲和力数值。Biacore仪器及试剂均购自GE Healthcare。具体的，将抗人Fc抗体固定于sensor chip CM5。将含有抗体的表达上清或纯化的抗体稀释于流动相缓冲液中(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％Tween-20,pH 7.4)，流过包板了抗人Fc抗体的CM5芯片。然后将梯度稀释过的人OX40-His融合蛋白流过检测芯片以测量抗原与抗体的结合，进而将流动相缓冲液流过芯片以检测抗原与抗体的解离。收集不同浓度下，抗原与抗体的结合和解离信号数据，通过1:1Langmuir模型拟合，计算抗原与抗体的亲和力。
如表6所示，Hu38E11与人OX40高亲和力结合，KD值为2.36E-09(M)。
表6 Biacore检测人源化抗体结合人OX40的动力学常数
Figure BDA0003890662890000272
实施例6人源化抗体Hu38E11对T细胞的激动活性
如前述实施例1.3所描述的方法，通过检测T细胞释放的细胞因子IFNγ评估抗体亚型为IgG2的Hu38E11(IgG2)对T细胞的激动活性。
结果：如图1所示，在抗体包板情况下，Hu38E11(IgG2)同样具有T细胞激动活性，其EC50为1.6nM，相对对照抗体11D4(EC50＝5.3nM)更低。
实施例7人源化抗体阻滞OX40与OX40L结合作用
本实验可通过ELISA的方法测定抗体Hu38E11阻滞OX40与其配体OX40L的结合。简言之，将OX40(R&D systems，Cat 3388-OX)用PBS稀释后，加入到96孔板中，4℃包被过夜。用含0.5％ Tween-20的PBS洗板3次洗去未包被的蛋白，再每孔200ul加入含1％BSA的PBS，室温封闭1h。用含0.5％Tween-20的PBS洗板3次后，以100ul每孔的量将梯度稀释后的抗OX40抗体加入96孔板中，室温孵育1h。用含0.5％ Tween-20的PBS洗板3次后。加入终浓度为50ng/ml的OX40L(R&D systems，Cat 1054-OX)，室温孵育1h。洗板3次后，加入生物素标记的抗OX40L抗体(R&D systems，Cat BAF1054)，室温孵育1h后洗板，再加入HRP标记的链霉亲和素(R&D systems，Cat DY998)室温孵育1h，洗板后。每孔加200ul TMB显色液显色，并用2NH2SO4终止。在酶标仪上，以570nM光吸收值为背景，检测波长为450nM。
如图2所示，Hu38E11(IgG1 N297A)阻滞OX40与OX40L结合，可以达到最高90％的抑制率，高于对照抗体GBR830和OX40mAb24的50％的最大抑制率。其中Hu38E11(IgG1 N297A)和GBR830的IC50值均在0.3nM附近，OX40mAb24的IC50值约为1.2nM。
实施例8人源化抗体阻滞OX40-OX40L介导的T细胞激活
从健康人血中，用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare，Cat 17-1440-02)密度梯度离心的方法，收集中间层，并用PBS洗涤3次，获得原代PBMC。进一步用Pan T CellIsolation Kit(Miltenyi Biotec，Cat 130-096-535)按照说明书推荐的方法，通过磁珠法分离获得人原代T细胞。将T细胞重悬于RPMI 1640(含10％FBS和青霉素/链霉素双抗)培养基中。将抗CD3抗体OKT3(eBioscience，Cat 16-0037-85)按照每孔100ul加入到96孔板中，于37℃包被2h，用PBS洗去未包板的抗体。将梯度稀释的OX40抗体与终浓度为664ng/ml的OX40L(R&D systems,Cat 1054-OX)混合后，加入包被好的96孔板中，并在在孔中加入分离获得的T细胞，培养3天后收集上清，按照说明书推荐的标准检测方法，用ELISA(R&D，CatSIF50)检测上清中IFNγ浓度。
Hu38E11(IgG1 N297A)阻断OX40L-OX40相互作用的功能性实验：抗CD3抗体包板，加入OX40的天然配体OX40L刺激T细胞，同时，在培养体系中加入游离的抗OX40抗体，来检测抗体阻滞OX40L与OX40的结合介导的功能。由于抗体未包板，在缺少交联的情况下，抗OX40抗体的分子无法刺激T细胞分泌IFNγ。另外抗OX40通过结合细胞表面的OX40，阻滞了OX40L与OX40的结合，便可阻断OX40L引起的T细胞分泌IFNγ。
根据图3的结果显示，抗体Hu38E11(IgG1 N297A)在较高浓度下可抑制OX40L引起的IFNγ分泌。表明了抗体阻滞OX40L激活T细胞的作用。与GBR830相比，Hu38E11(IgG1N297A)阻滞OX40L介导的T细胞激活作用更强，且IC50值更小(Hu38E11(IgG1 N297A)为0.3nM，GBR830为1.1nM)。
实施例9人源化抗体Fc区对抗体的T细胞激动活性的影响
可通过在荧光素酶报告基因测定法中测量NF-κB介导的转录活化的促进来评估具有不同Fc结构的Hu38E11的T细胞激动活性。构建过表达人OX40及具有受NF-κB基因调控的荧光素酶报告基因(Luc)的重组Jurkat细胞(Jurkat-OX40-NF-κB-Luc；购自Chempartner)。简言之，将抗CD3抗体(eBioscience，Cat 16-0037-85)按照每孔100ul加入到96孔板中，于4℃包被过夜。用PBS洗去未包板的抗体。再将Jurkat-OX40-NF-κB-Luc与Raji细胞按照1:1的比例混合后加入到包被了的96孔板中，再加入梯度稀释的Hu38E11(IgG1)、Hu38E11(IgG1N297A)或hIgG1。经过5小时培养后，加入Steady-Glo(Promega)检测试剂测定荧光素酶的相对表达量。
本实验中，Hu38E11(IgG1)在Raji表面的FcγR受体交联下，开启OX40的下游信号，引起受NF-κB调节的报告基因的表达(EC50＝0.70nM)。相反的，由于N297A突变，Hu38E11(IgG1 N297A)无法交联和不能与FcγR受体结合，因而无法激活OX40下游信号，另外通过阻滞OX40与Raji表面表达的OX40L结合，该抗体表现出明显的抑制受NF-κB调节的荧光素酶报告基因的表达(IC50＝0.20nM)(如图4所示)。
实施例10人源化抗体Hu38E11抑制B16F10皮下移植瘤生长
在表达人源OX40的C57BL/6-Tnfrsf4em1Clin(hTBFRSF4)转基因小鼠上建立B16-F10皮下肿瘤模型，研究本发明抗体的抗肿瘤活性。
用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基培养小鼠黑色素瘤细胞B16-F10(
Figure BDA0003890662890000292
CRL-6475TM)。将肿瘤细胞悬浮于RPMI1640中，按1×105细胞/只的剂量植入雌性转基因小鼠(江苏集萃药康生物科技有限公司)右胁皮下。
在肿瘤细胞接种当天(第1天)，将小鼠按体重随机分成3组，其中，第一组(h-IgG2)12只，第二组(11D4(hIgG2))13只，第三组(Hu38E11(hIgG2))13只。用DPBS稀释各组抗体，以10mg/kg的剂量单次腹腔注射给药，定期测量肿瘤体积(肿瘤体积＝0.5×长径×短径2)、小鼠体重。统计给药后第15天或第16天抗体治疗组的肿瘤抑制率。
肿瘤抑制率计算公式为：[(对照组肿瘤体积-给药组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积]×100％。小鼠相对体重计算公式为:(测量当天小鼠体重/分组时小鼠体重)×100％。
结果：在10mg/kg给药剂量下，对照抗体11D4和本发明抗体Hu38E11(IgG2)对肿瘤生长的抑制率分别为33.2％和48.1％。此外，观察期间各组小鼠体重增长迅速，行为正常，提示动物耐受性良好。
实施例11人源化抗体Hu38E11(IgG1 N297A)的抗免疫排斥活性
在免疫缺陷NOD-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Nju(NCG)小鼠上移植健康志愿者外周血原代单个核细胞(human peripheral blood mononuclear cell，hPBMC)建立的移植物抗宿主病模型(graft-verus-host disease，GVHD)，用于研究本发明抗体的抗免疫排斥活性。
通过Ficoll-Paque密度梯度离心从健康人全血中分离单个核细胞，将原代PBMC悬浮于磷酸缓冲液(PBS)中。
在PBMC移植前一天(第-1天)，将小鼠按体重随机分成7组，分组见表7。在移植当天(第0天)，所有小鼠接受单次1.5Gy全身137Csγ射线照射(total body irradiation，TBI)，然后用PBS稀释Hu38E11(IgG1 N297A)和GBR830抗体，以1mg/kg的剂量，5mL/kg容积每周一次尾静脉注射给药，最后以0.2mL/只单次尾静脉注射2.5×107细胞/mL PBMC。每天观察小鼠生存状态，定期测量小鼠体重，以相对体重下降20％为安乐死终点，记录生存时间。
小鼠相对体重计算公式为:(测量当天小鼠体重/分组时小鼠体重)×100％。
表7 Hu38E11(IgG1 N297A)对hPBMC诱导的移植物抗宿主模型治疗作用分组及给药方案
Figure BDA0003890662890000291
Figure BDA0003890662890000301
实验结果如图5所示。在该实验中，模型对照组(hPBMC+hIgG1组)实验第48天小鼠全部死亡，中位生存时间为32.5天；本发明抗体Hu38E11(IgG1 N297A)1mg/kg实验第64天处理小鼠全部存活，不能计算中位生存时间，与模型对照组(hPBMC+hIgG1组)比较具有统计学差异(**:p<0.01)。阳性对照抗体GBR830 1mg/kg处理小鼠实验第64天存活率66.7％，不能计算中位生存时间，与模型对照组无统计学差异。
序列表描述
Figure BDA0003890662890000302
Figure BDA0003890662890000311
Figure BDA0003890662890000321
序列表
<110> 和记黄埔医药（上海）有限公司
<120> 抗OX40抗体及其用途
<130> PF210219CNP
<160> 22
<170> PatentIn version 3.3
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130 135 140
Ala Ala Ala Cys Thr Cys Cys Thr Cys Ala Thr Cys Thr Ala Thr Cys
145 150 155 160
Gly Thr Gly Cys Ala Thr Cys Cys Ala Ala Cys Cys Thr Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys
180 185 190
Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Thr Gly
195 200 205
Gly Gly Thr Cys Thr Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Cys Thr Thr
210 215 220
Cys Ala Cys Cys Cys Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Thr Ala Ala Thr
225 230 235 240
Cys Cys Thr Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly
245 250 255
Ala Thr Gly Thr Thr Gly Cys Ala Ala Cys Cys Thr Ala Thr Thr Ala
260 265 270
Cys Thr Gly Thr Cys Ala Gly Cys Ala Ala Ala Gly Thr Ala Ala Thr
275 280 285
Gly Ala Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Gly Thr
290 295 300
Thr Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala
305 310 315 320
Ala Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Ala
325 330
<210> 20
<211> 333
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 20
Gly Ala Thr Ala Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys
1 5 10 15
Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Gly Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr
20 25 30
Gly Gly Cys Thr Gly Thr Gly Thr Cys Thr Cys Thr Gly Gly Gly Cys
35 40 45
Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala
50 55 60
Ala Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gly Thr Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys
85 90 95
Gly Gly Cys Ala Ala Cys Thr Cys Thr Thr Thr Cys Ala Thr Gly Cys
100 105 110
Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala
115 120 125
Gly Cys Cys Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Cys Thr
130 135 140
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr Ala Cys Ala
145 150 155 160
Gly Ala Gly Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala
165 170 175
Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys Cys Cys Gly Ala Cys
180 185 190
Ala Gly Ala Thr Thr Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Thr Cys Thr Gly
195 200 205
Gly Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Ala Cys Ala Gly Ala Cys Thr Thr
210 215 220
Thr Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys
225 230 235 240
Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly
245 250 255
Ala Thr Gly Thr Gly Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Cys Thr Ala
260 265 270
Cys Thr Gly Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys
275 280 285
Gly Ala Gly Gly Ala Cys Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Thr
290 295 300
Thr Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Ala Cys Ala Ala Ala
305 310 315 320
Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Gly
325 330
<210> 21
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 21
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 22
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 22
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325

Claims (30)

1.一种分离的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含
(1)选自重链可变区(VH)的HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一个至三个，其中所述VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、2、3、4或5所示；和/或
(2)选自轻链可变区(VL)的LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一个至三个，其中所述VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:6、7、8、9或10所示，
其中所述抗体或其抗原结合片段不是包含人IgG1 N297A的Fc区变体的抗体或抗原结合片段。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3和VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述的VH和VL选自：
(1)VH包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和VL包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
(2)VH包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列和VL包含SEQ ID NO:7或9所示的氨基酸序列；
(3)VH包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列和VL包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；或
(4)VH包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列和VL包含SEQ ID NO:7或8所示的氨基酸序列。
3.一种分离的抗OX40抗体或其抗原结合片段，其包含
(1)选自重链互补决定区(HCDRs)，HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一个至三个，所述的HCDR1包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述的HCDR2包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，所述的HCDR3包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；和/或
(2)选自轻链互补决定区(LCDRs)，LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一个至三个，所述的LCDR1包含SEQ ID NO:14的所示氨基酸序列、所述的LCDR2包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，所述的LCDR3包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；
其中所述抗体或其抗原结合片段不是包含人IgG1 N297A的Fc区变体的抗体或抗原结合片段。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含
(1)重链互补决定区(HCDRs)，HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中所述的HCDR1包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述的HCDR2包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列和所述的HCDR3包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；和/或
(2)轻链互补决定区(LCDRs)，LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述的LCDR1包含SEQ ID NO:14的所示氨基酸序列，所述的LCDR2包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列和所述的LCDR3包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
5.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含
(1)重链可变区(VH)，其包含与选自SEQ ID NO:1、2、3、4或5所示的氨基酸序列一致或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和/或
(2)轻链可变区(VL)，其包含与选自SEQ ID NO:6、7、8、9或10所示的氨基酸序列一致或具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
6.如权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含选自SEQ ID NO:2、3、4或5中任一所示的氨基酸序列，所述的VL包含选自SEQ ID NO:7、8、9或10中任一所示的氨基酸序列。
7.如权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH和VL选自：
(1)VH包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和VL包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
(2)VH包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列和VL包含SEQ ID NO:7或9所示的氨基酸序列；
(3)VH包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列和VL包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；或
(4)VH包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列和VL包含SEQ ID NO:7或8所示的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述的VH包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列和其中所述的VL包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
9.如前述权利要求任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是鼠源抗体、嵌合抗体、或人源化抗体。
10.如前述权利要求任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是全长抗体、单域抗体(例如VHH)、Fab抗体、Fab’、Fab’-SH、(Fab’)2抗体、单链抗体(例如scFv)、Fv、dAb(domainantibody)或双(多)特异性抗体。
11.如前述权利要求任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含Fc区，Fc区的氨基酸序列与人IgG1、IgG2或IgG4的Fc区序列一致或为其变体。
12.如前述权利要求任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其与人OX40结合的亲和力(KD)低于10nM。
13.如前述权利要求任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其能阻滞OX40与其配体OX40L结合。
14.如权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是一种OX40抗体激动剂，具有激活OX40介导的信号转导活性。
15.如权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段，其包含具有与FcγR结合的Fc区。
16.如权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段，其包含Fc区，其中所述Fc区的氨基酸序列与人IgG1、IgG2或IgG4的Fc区序列一致。
17.如权利要求1-13中任一所述的抗体或其抗原结合片段，其是一种OX40抗体拮抗剂，具有阻断OX40介导的信号转导活性。
18.如权利要求17所述的抗体或其抗原结合片段，其包含Fc区变体，该Fc区变体与FcγR的结合作用降低或消除。
19.一种分离的核酸，其编码如权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
20.一种重组载体或表达载体，其包含一个或多个如权利要求19所述的核酸，其中所述载体适合用于重组产生权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
21.一种宿主细胞，其包含一个或多个如权利要求20所述的重组载体或表达载体。
22.一种免疫缀合物或融合物，其包含如权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
23.一种药物组合物，其包含如权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求19所述的核酸、如权利要求20所述的载体、如权利要求21所述的宿主细胞、或如权利要求22所述的免疫缀合物或免疫融合物，以及任选地包含至少一种药学上可接受的辅料。
24.一种如权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求19所述的核酸、如权利要求20所述的载体、如权利要求21所述的宿主细胞、或如权利要求22所述的免疫缀合物或免疫融合物在制备用于治疗或预防OX40相关疾病或病征的药物中的用途。
25.一种如权利要求14-16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求19所述的核酸、如权利要求20所述的载体、如权利要求21所述的宿主细胞、或如权利要求22所述的免疫缀合物或免疫融合物在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途，所述癌症为例如黑素瘤，优选地为转移性黑素瘤。
26.一种如权利要求17-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求19所述的核酸、如权利要求20所述的载体、如权利要求21所述的宿主细胞、或如权利要求22所述的免疫缀合物或免疫融合物在制备用于治疗或预防炎症和/或自身免疫性疾病的药物中的用途，所述疾病为例如移植物抗宿主病。
27.一种治疗或预防OX40相关疾病或病征的方法，其包括对该个体施用有效量的如权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求19所述的核酸、如权利要求20所述的载体、如权利要求21所述的宿主细胞、或如权利要求22所述的免疫缀合物或融合物。
28.一种如权利要求27所述的方法，其中所述OX40相关疾病或病征为炎症和/或自身免疫性疾病，例如移植物抗宿主病。
29.一种如权利要求27所述的方法，其中所述OX40相关疾病或病征为癌症，例如黑素瘤，优选地为转移性黑素瘤。
30.一种检测样品中OX40的方法，包括：
(a)将所述样品与权利要求1-18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或权利要求22所述的免疫缀合物或免疫融合物接触；和
(b)检测所述抗体或其抗原结合片段或免疫缀合物或免疫融合物和OX40蛋白之间复合物的形成。
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