JP4691650B2 - ニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法、および当該生産方法によって生産されるニワトリ型モノクローナル抗体 - Google Patents
ニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法、および当該生産方法によって生産されるニワトリ型モノクローナル抗体 Download PDFInfo
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なお、上記配列番号3または配列番号4または配列番号6または配列番号7に示される各プライマーの塩基配列は、目的の遺伝子を増幅することができるものであれば当該塩基配列に限られるのもではなく、配列番号3または配列番号4または配列番号6または配列番号7に示される塩基配列のうち、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記それぞれの塩基配列の相補配列であってもよい。
本発明において生産する「ニワトリ型抗体」とは、ニワトリが有する免疫機能によって、抗原に対してニワトリが生産する抗体(IgM,IgG,IgA)のことである。そのうち特に抗原の特定部分だけを認識する単一の抗体のことを「ニワトリ型モノクローナル抗体」という。後の説明において単に「ニワトリ型抗体」と記せばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体両方を含む意味であり、「ニワトリ型モノクローナル抗体」と記せばモノクローナル抗体のみを含む意味である。ただし、本発明においては「ニワトリ型抗体(モノクローナル抗体)」とは、ニワトリ自身が生産する天然抗体と同様の構造を有する抗体であればよく、例えばニワトリ以外の宿主細胞にニワトリ型抗体をコードする遺伝子を導入して得られた形質転換細胞によって生産される抗体、公知のファイージディスプレイ法により生産される抗体をも含む意味である。また抗体の一部のアミノ酸が欠失・置換されたものであってよく、またアミノ酸が付加されたもの(構造改変ニワトリ型抗体(モノクローナル抗体))であってもよい。ニワトリ型抗体分子は、哺乳類動物型抗体(IgG)より分子量が大きいため、用途如何によっては不要なアミノ酸を欠失させた構造改変ニワトリ型抗体(モノクローナル抗体)が好ましい場合があるからである。
本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法(以下本生産方法と称する)は、ターゲットとなるニワトリ型モノクローナル抗体をコードする遺伝子を任意の発現用ベクターによって宿主細胞に導入し、当該導入によって得られた形質転換細胞を培養することによってターゲットのニワトリ型抗体を生産する方法である。したがって、まずターゲットとなるニワトリ型モノクローナル抗体をコードする遺伝子を取得する必要がある。抗体分子はL鎖とH鎖が会合した2組のペプチドで構成されているため、L鎖をコードする遺伝子(L鎖遺伝子)とH鎖をコードする遺伝子(H鎖遺伝子)のそれぞれが必要となる。上記遺伝子の取得方法については特に限定されるものではないが、簡便かつ迅速に大量の遺伝子を取得できるという理由で公知のPCR法等の増幅反応を用いて取得することが好適である。本生産方法においては、特にPCR法等の増幅反応により、L鎖遺伝子およびH鎖遺伝子を取得している。
かかるPCR法は、目的遺伝子の塩基配列情報から設計したセンスプライマー(フォアードプライマー)およびアンチセンスプライマー(リバースプライマー)のセットを用いて、ゲノムDNA等を鋳型として目的遺伝子を増幅する。したがって本生産方法を行なうためには、まず目的の遺伝子(L鎖遺伝子、H鎖遺伝子)を増幅するためのプライマーを設計する必要がある。なおL鎖遺伝子を増幅するためのプライマーをL鎖プライマー、該セットをL鎖プライマーセットといい、H鎖遺伝子を増幅するためのプライマーをH鎖プライマー、該セットをH鎖プライマーセットという。
一方鋳型DNAは、例えば所望の抗原に対するニワトリ型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマからRNAを抽出し、公知の方法(例えばOligo-dTプライマー法等)によりcDNAを合成し、それを鋳型とすればよい。
上記説示した方法によって取得したL鎖遺伝子およびH鎖遺伝子を宿主細胞に導入し、該細胞内でL鎖およびH鎖を発現させるためのベクター(以下L鎖発現用ベクターおよびH鎖発現用ベクターと称する)、およびそれらの構築方法について説明する。
上記L鎖発現用ベクターおよびH鎖発現用ベクターを用いて、宿主細胞の形質転換を行なう。なお抗体分子はL鎖およびH鎖がS−S結合によって形成される複合体(L鎖―H鎖複合体)が2分子結合した2量体である。したがって宿主細胞には、L鎖遺伝子およびH鎖遺伝子の両者を導入する必要がある。
次に上記で取得した形質転換細胞を用いてニワトリ型モノクローナル抗体の生産を行なう。より具体的には、上記形質転換細胞を培養し、その培養物から目的のニワトリ型モノクローナル抗体を精製すればよい。ここで形質転細胞の培養方法・培養条件等は、該形質転換細胞の培養に好適な方法を用いればよく、特に限定されるものではない。例えば動物細胞を培養する場合は、浮遊培養法・担体付着培養法・ホローファイバー培養法等が好適である。特に浮遊培養法は、適応できる細胞がリンパ系の細胞等に限られるが、ジャーファーメンターを利用することができ、スケールアップが容易であるためより好ましい。後述する実施例において採用した形質転換CHO細胞は、既に述べたとおり浮遊培養が可能な細胞である。また動物細胞を培養する際の培地としては、限定されるわけではないが、アミノ酸、ビタミン類、ブドウ糖、塩類に、血清が加えられている場合がある。その他、緩衝液として重炭酸/炭酸ガス系緩衝液が用いられており、培養器として、CO2インキュベーターが利用可能である。またpHのモニター用にフェノールレッドを添加する場合がある。培養条件は、一般的には37℃で培養するが、細胞株によっては、28℃、40℃の場合がある。なお後述する実施例においては、形質転換CHO細胞の培養には、10% fetal bovine serum (FBS) を含むF12 media (GIBCO BRL社) を用いて、5% CO2、37℃の条件で3日間培養を行なっている。
本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体は、上記説示した本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法によって生産されたものであり、例えば、Full抗体、Δ7aa抗体、ΔCH2抗体、ΔFc抗体が挙げられる。Full抗体に加えて、構造改変ニワトリ型モノクローナル抗体(Δ7aa抗体、ΔCH2抗体、ΔFc抗体)を生産する理由は、ニワトリ型抗体分子は、哺乳類動物型抗体(IgG)より分子量が大きいため、用途如何によっては不要なアミノ酸を欠失させるが好ましい場合があるからである。例えば、分子を小さくすることにより、細胞膜を通過することができ、膜内の抗原に関しても検出することができるようになる。
一例としてヒトプリオンタンパク質(PrP)に対するニワトリ型モノクローナル抗体の生産を行なった。
L鎖遺伝子およびH鎖遺伝子は、抗PrPニワトリモノクローナル抗体から合成したcDNAを鋳型としてPCR法によって調製した。より具体的には以下のようにした。
L鎖発現用ベクターおよびH鎖発現用ベクターの構築方法の概略図を図7に示す。なお図7(a)がL鎖発現用ベクターの構築方法であり、図7(b)がH鎖発現用ベクター(FullH鎖発現用ベクター)の構築方法である。
約2×105のCHO細胞((財)ヒューマンサイエンス振興財団)に、L鎖発現用ベクター(pcCKL−1)およびH鎖発現用ベクター(pcCKH−1)各2.5μgをPlyFect Transfection Reagent (Qiagen社)を用いてトランスフェクションを行なった。トランスフェクションの方法については、操作マニュアルにしたがって行なった。
各抗PrPニワトリ型モノクローナル抗体生産CHO細胞を上記培養条件にて培養を行なった。細胞数約1×106/plateにそろえ、3日間培養した。当該培養液上清について、抗原に対する反応性をELISA法によって調べた。
上記ELISA法で用いた同様の培養液上清にサンプルバッファーを加え,10分間煮沸し、7.5%ゲルにてSDS−PAGEを行なった。泳動終了後、ウエットタイプブロッターを用い、Immuno-Blot PVDF membrane(Bio-RAD社製)へ転写した。転写後、5%スキムミルクおよび0.05% Tween 20 を含むPBSでブロッキングを行なった。洗浄後、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ニワトリIgG Fab fragment(Bethyl社製)と室温で1時間反応させた。反応終了後、ECL plus(Amersham Pharmacia社)を用いて発色させた。そのシグナルは、イメージアナライザー(富士フィルム社製)により解析した。
Full−PrP抗体生産CHO細胞の該抗体の生産量をELISA法によりにより測定し、HUC2−13のそれと比較した。
上記実施例1において、HLの単量体が見られたFull−PrP抗体とΔFc−PrP抗体について、ニッケルカラムによる精製を行なった。ニッケルカラムによる精製は、生産した各ニワトリ型モノクローナル抗体H鎖のC末端にヒスチジンタグを付加しているために行なうことができる。方法は以下のとおりにした。
Claims (8)
- 配列番号1に示される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号2に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のL鎖をコードする遺伝子が挿入されてなるL鎖発現用ベクター、および、
配列番号3に示される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号4に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のH鎖をコードする遺伝子が挿入されてなるH鎖発現用ベクターを用いて動物由来細胞を形質転換する工程を含むことを特徴とするニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法。 - 上記動物由来細胞が、CHO細胞であることを特徴とする請求項1に記載のニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法。
- 上記L鎖発現用ベクターおよび/またはH鎖発現用ベクターが精製用タグを有することを特徴とする請求項1または2に記載のニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法。
- 配列番号1に示される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号2に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のL鎖をコードする遺伝子が挿入されてなり、ニワトリ型抗体のL鎖を発現させるために用いられるL鎖発現用ベクター、および、
配列番号3に示される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号4に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のH鎖をコードする遺伝子が挿入されてなり、ニワトリ型抗体のH鎖を発現させるために用いられるH鎖発現用ベクターからなる、ニワトリ型モノクローナル抗体生産用のベクターセット。 - 上記L鎖発現用ベクターおよびH鎖発現用ベクターが精製用タグを有することを特徴とする請求項4に記載の、ニワトリ型モノクローナル抗体生産用のベクターセット。
- 配列番号1に示される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号2に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせであり、ニワトリ型抗体のL鎖をコードする遺伝子を増幅するために用いられるL鎖用プライマーセット、および、
配列番号3に示される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号4に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせであり、ニワトリ型抗体のH鎖をコードする遺伝子を増幅するために用いられるH鎖用プライマーセットからなる、ニワトリ型モノクローナル抗体生産用のプライマーセット。 - ニワトリ型モノクローナル抗体を生産するために用いられる、動物由来の形質転換細胞であって、以下の(a)または(b)のL鎖発現用ベクターが導入され、かつ以下の(c)または(d)のH鎖発現用ベクターが導入されていることを特徴とする、動物由来の形質転換細胞。
(a)ニワトリ型抗体のL鎖を発現させるために用いられる発現用ベクターであって、
配列番号1に示される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号2に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のL鎖をコードする遺伝子が挿入されてなるL鎖発現用ベクター。
(b)上記(a)に記載のL鎖発現用ベクターであって、精製用タグを有するベクター。
(c)ニワトリ型抗体のH鎖を発現させるために用いられる発現用ベクターであって、
配列番号3に示される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号4に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のH鎖をコードする遺伝子が挿入されてなるH鎖発現用ベクター。
(d)上記(c)に記載のH鎖発現用ベクターであって、精製用タグを有するベクター。 - 上記動物由来の形質転換細胞がCHO細胞であることを特徴とする、請求項7に記載の細胞。
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