JP5699424B2 - 抗変性アルブミン抗体、当該抗体の製造方法、およびその利用 - Google Patents
抗変性アルブミン抗体、当該抗体の製造方法、およびその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5699424B2 JP5699424B2 JP2009173259A JP2009173259A JP5699424B2 JP 5699424 B2 JP5699424 B2 JP 5699424B2 JP 2009173259 A JP2009173259 A JP 2009173259A JP 2009173259 A JP2009173259 A JP 2009173259A JP 5699424 B2 JP5699424 B2 JP 5699424B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- albumin
- antibody
- normal
- denatured
- urine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 title claims description 342
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 title claims description 342
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 95
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 85
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 50
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 47
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims description 46
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims description 46
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims description 46
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 41
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 41
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 41
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 35
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 22
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 claims description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 17
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 15
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 10
- 206010027525 Microalbuminuria Diseases 0.000 claims description 3
- 201000001474 proteinuria Diseases 0.000 claims description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 52
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 45
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 30
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 23
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 20
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 19
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 15
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 13
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 9
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 7
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 7
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 4
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 4
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000010517 secondary reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 3
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000001426 native polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CPMKYMGGYUFOHS-FSPLSTOPSA-N Asp-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CPMKYMGGYUFOHS-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 2
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- -1 p-toluidinyl salt Chemical class 0.000 description 2
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000693922 Bos taurus Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 101001060288 Homo sapiens Alpha-2-HS-glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 102000012005 alpha-2-HS-Glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 108010075843 alpha-2-HS-Glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 1
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 108010054176 apotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 102000055634 human AHSG Human genes 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
(a)変性アルブミンを含有する尿から、正常アルブミンおよびトランスフェリンを除去する工程;
(b)上記工程(a)で得られた試料からクロマトグラフィーにより変性アルブミンを得る工程。
(a)変性アルブミンを含有する尿から、正常アルブミンおよびトランスフェリンを除去する工程;
(b)上記工程(a)で得られた試料からクロマトグラフィーにより変性アルブミンを得る工程;
(c)上記工程(b)で得られた変性アルブミンをニワトリに免疫する工程;
(d)上記工程(c)で免疫したニワトリから変性アルブミンに特異的に結合するファージ抗体を得る工程;
(e)上記工程(d)で得られたファージ抗体のうち、正常アルブミンおよび断片化された正常アルブミンには結合しない抗体を選抜する工程。
(a)変性アルブミンを含有する尿から、正常アルブミンおよびトランスフェリンを除去する工程;
(b)上記工程(a)で得られた試料からクロマトグラフィーにより変性アルブミンを得る工程;
(c)上記工程(b)で得られた変性アルブミンをニワトリに免疫する工程;
(d)上記工程(c)で免疫したニワトリから変性アルブミンに特異的に結合する抗体を得る工程;
(e)上記工程(d)で得られた抗体のうち、正常アルブミンおよび断片化された正常アルブミンには結合しない抗体を選抜する工程。
(d)上記免疫したニワトリから変性アルブミンに特異的に結合するファージ抗体を得る工程;
(e)上記工程(d)で得られたファージ抗体のうち、正常アルブミンおよび断片化された正常アルブミンには結合しない抗体を選抜する工程。
(a)変性アルブミンを含有する尿から、正常アルブミンおよびトランスフェリンを除去する工程;
(b)上記工程(a)で得られた試料からクロマトグラフィーにより変性アルブミンを得る工程。
本発明に係る抗体は、変性アルブミンに特異的に結合し、且つ正常アルブミンおよび断片化された正常アルブミンには結合しない抗体である。本明細書において、上記「抗体」は、免疫グロブリン(IgA、IgD、IgE、IgY、IgG、IgMおよびこれらのFabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fcフラグメント)を意味し、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体等の二価抗体;一本鎖可変領域断片(single chain FV(scFv))等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。
本発明に係る抗体の製造方法は、変性アルブミンに特異的に結合する抗体を製造する方法であって、(a)変性アルブミンを含有する尿から、正常アルブミンおよびトランスフェリンを除去する工程と、(b)上記工程(a)で得られた試料からクロマトグラフィーにより変性アルブミンを得る工程と、(c)上記工程(b)で得られた変性アルブミンをニワトリに免疫する工程と、(d)上記工程(c)で免疫したニワトリから変性アルブミンに特異的に結合する抗体を得る工程と、(e)上記工程(d)で得られた抗体のうち、正常アルブミンおよび断片化された正常アルブミンには結合しない抗体を選抜する工程と、を含むことを特徴としている。上記「抗体」は、一本鎖可変領域断片または二価抗体であることが好ましい。以下に、それぞれの工程について説明する。
工程(a)は、変性アルブミンを含有する尿から、正常アルブミンおよびトランスフェリンを除去する工程である。変性アルブミンを含有する尿であるか否かを確認する方法については、上記の「1.本発明に係る抗体」で説明したとおりである。変性アルブミンを含有する尿であれば、採取元の個体の性別、年齢、人種等は特に限定されない。
工程(b)は、上記工程(a)で得られた試料からクロマトグラフィーにより変性アルブミンを得る工程である。正常アルブミンおよびトランスフェリンを除去した試料からクロマトグラフィーにより変性アルブミンを得る方法としては、変性アルブミンを精製することができれば特に限定されない。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等によって変性アルブミンを得ることができる。中でも、サイズ排除クロマトグラフィーを行なうことが好ましい。クロマトグラフィーの条件は、用いるカラムの種類、移動相の種類、流速、サンプルのアプライ量等に応じて適宜設定することができる。
工程(c)は、上記工程(b)で得られた変性アルブミンをニワトリに免疫する工程である。変性アルブミンをニワトリに投与する方法は特に限定されない。例えば、変性アルブミンを腹腔内に投与してもよいし、変性アルブミンを静脈内に投与してもよい。また、変性アルブミンの免疫原性を高める観点から、初回免疫は、変性アルブミンと免疫賦活剤とを等量混合して投与することが好ましい。上記「免疫賦活剤」としては、例えば、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムゲルアジュバント等のこの分野で通常用いられるものを利用することができる。
工程(d)は、上記工程(c)で免疫したニワトリから変性アルブミンに特異的に結合する抗体を得る工程である。変性アルブミンに特異的に結合する抗体を得る方法は特に限定されない。例えば、モノクローナル抗体を作製する方法(特開2005−278633号公報の記載を参照)、ファージディスプレイ法によりニワトリ型ファージ抗体を作製する方法(特許3908257号公報の記載を参照)等によって製造することができる。後述する実施例では、簡便且つ効率よく抗体を製造できることから、ファージディスプレイ法を用いている。
工程(e)は、上記工程(d)で得られた変性アルブミンに特異的に結合する抗体のうち、正常アルブミンおよび断片化された正常アルブミンには結合しない抗体をさらに選抜する工程である。
(a)変性アルブミンを含有する尿から、正常アルブミンおよびトランスフェリンを除去する工程;
(b)上記工程(a)で得られた試料からクロマトグラフィーにより変性アルブミンを得る工程。
本発明に係るキットは、試料中に含まれる変性アルブミンを検出するためのキットであって、少なくとも本発明に係る抗体を備えている。本発明に係る抗体については、「1.本発明に係る抗体」で説明したとおりであるので、ここでは省略する。
本発明に係る変性アルブミンを検出する方法は、試料中に含まれる変性アルブミンを検出する方法であって、本発明に係る抗体と、試料とを反応させる工程を含む。本発明に係る抗体については、「1.本発明に係る抗体」で説明したとおりであるので、ここでは省略する。上記「試料」としては、特に限定されるものではないが、尿であることが好ましい。
本発明に係る腎疾患の発症または発症の可能性を検出する方法は、本発明に係る抗体と、尿とを反応させる工程を含む。本発明に係る抗体については、「1.本発明に係る抗体」で説明したとおりであるので、ここでは省略する。
(1)尿検体の再調製
特許文献1に記載のHPLC法を用いて、変性アルブミンが含まれていることを予め確認した尿検体200mLを準備した。まず、検体中に浮遊している未溶解物を溶解させた。具体的には、遠心装置KN−70(久保田製作所社製)を用い、約25℃、3,000rpm(1210×g)で10分間遠心分離を行ない、検体中に浮遊している未溶解物を沈殿させ、上清を回収した。沈殿物に1.5M Tris−HCl緩衝液(pH8.8)を20mL加え、沈殿を溶解させた後、回収した上清を再度混合させることにより220mLの尿検体を調製した。
次いで、後述する抗体カラムの通過を効率よく行なうために、濃縮器具を用いて上記「(1)尿検体の再調製」で調製した尿検体を濃縮した。濃縮器具は、アミコンウルトラ−15(MILLIPORE社製、24本入り、型番:UFC9 030 24)を用いた。濃縮中には、検体の量と同じ量の1.5M Tris−HCl緩衝液(pH8.8)を添加した。濃縮作業は2回行なった。最終的な検体量は5mLとした。
次いで、上記「(2)検体の濃縮」で得られた尿検体から正常アルブミンおよびトランスフェリンを除去するための抗体カラムを作製した。
次いで、上記「(3)正常アルブミンおよびトランスフェリン除去用抗体カラムの作製」で作製したカラムに、上記「(2)検体の濃縮」で調製した尿検体を通過させて、尿検体中に含まれる正常アルブミンおよびトランスフェリンを除去した。
次いで、上記「(4)正常アルブミンおよびトランスフェリンの除去」で得られた尿検体をHPLC法によってさらに精製した。具体的には、HPLCのカラムは、球状シリカ剤を充填したカラムを用い、移動相は、リン酸緩衝液(pH7.0)を用いた。尿検体のアプライ量100μL、流速0.5mL/minの条件で、アプライ開始から5分20秒から6分までの区画を約0.3mL回収した。この区画には、変性アルブミンが多く含まれていると推測された。この作業を180回行なうことにより、約50mLの精製尿検体を得た。得られた精製尿検体約50mL中に含まれるタンパク質量をHPLC法によって定量した。その結果、精製尿検体50mL中に含まれるタンパク質の総量は、3.16mgであった。
次いで、上記「(5)HPLC法による精製およびタンパク質の定量」で得られた精製尿検体における、変性アルブミン以外のタンパク質の含有量を測定した。具体的には、α2−グリコプロテインの量をELISA法により定量した。ELISA法は、ASSAYPRO社製のAssaymax Human alpha 2-HS-glycoprotein ELISA Kit(製品名)を用いて行った。
次いで、上記「(5)HPLC法による精製およびタンパク質の定量」で得られた精製尿検体に含まれる変性アルブミンの純度を確認した。具体的には、Native−PAGE法によって電気泳動を行った後に、メンブレンに転写を行ない、得られたメンブレンをCBB染色を行なうことにより確認した。転写は、BIORAD社製のTrans-BlotR SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell(製品名)を用いた。
レーン2:精製尿検体(0.5μg)
レーン3:正常アルブミン(和光純薬工業株式会社製、製品名:アルブミン、ヒト血清由来)(1.5μg)
レーン4:トランスフェリン(メルク社製、製品名:Apotransferrin)(1.5μg)
レーン5:α2−グリコプロテイン(SIGMA-ALDRICH社製、製品名:α2-hs-Glycoprotein from human plasma)(1.5μg)
レーン6:分子量マーカー(インビトロジェン社製、製品名:NativeMark Unstained Protein Standard) 5μL
図2に示されるように、アルブミンと同じの分子量付近に単一のバンドが確認された。このバンドは、分子量から変性アルブミンであると推測された。図2の結果から、精製尿検体に含まれる変性アルブミンの純度は比較的高いことが確認できた。
(2−1)変性アルブミンの免疫
1ヶ月齢のニワトリ3羽(A、B、およびC)に一次免疫を行った。一次免疫は、1個体あたり185μgの変性アルブミンを免疫賦活剤(製品名:Alum、ナカライテスク社製)と共に腹腔内に投与した。
ニワトリ型ファージ抗体の作製は、特許3908257号公報に記載の方法に準じて行った。
固相抗原:変性アルブミン、ヒト血清アルブミン(HSA)、25% Block Ace(陰性対照)、0.5% BSA(陰性対照)
一次反応:各パニングサイクル培養上清サンプル(ファージ抗体)、2×YT培地(陰性対照)、PBS(陰性対照)
二次反応:HRP標識 抗ニワトリIgG Fab
発色基質:OPD
発色時間:3分間(変性アルブミン)、10分間(対照抗原)。
固相抗原:変性アルブミン、ビオチン化変性アルブミン、HSA、ビオチン化HSA、トランスフェリン、α2−グリコプロテイン、0.5% BSA(陰性対照)
一次反応:大腸菌の培養上清、免疫ニワトリ血清(×200)(陽性対照)、4thパニング液(陽性対照)、2×YT培地(陰性対照)、PBS(陰性対照)
二次反応:HRP標識 抗ニワトリIgG Fab
発色基質:OPD
発色時間:3分(変性アルブミン)、10分(ヒト血清アルブミン、トランスフェリン、α2−グリコプロテイン、25% Block Ace、0.5% BSA)
ELISAの結果、11クローンの反応性のあるクローンが得られた。これらの各クローンについてシーケンス解析を行ったところ、4クローン(クローン名:M1、M4、M5、2M7)に収束していた。
固相抗原:変性アルブミン、ヒト血清アルブミン、トランスフェリン、α2−グリコプロテイン、断片化アルブミン(色素入り)、断片化アルブミン(尿素入り)、0.5% BSA(陰性対照)
一次反応:可溶型scFv抗体(培養上清)、免疫ニワトリ血清(×200)(陽性対照)、2×YT培地(陰性対照)、PBS(陰性対照)
二次反応:HRP標識 抗ニワトリIgY Fab
発色基質:OPD
発色時間:5分間
なお、固相抗原として用いた「断片化アルブミン」は、トリプシン処理によって調製したものを用いた。
上記「(2−2)ファージ抗体の作製」で得られた4種類の変性アルブミンに結合する可溶型scFv抗体について、組換えニワトリ型二価抗体を作製した。組換えニワトリ型二価抗体の作製は、国際公開第2006/093080号パンフレットに記載の方法に準じて行った。以下にクローン名M1−1についての一例を説明する。
軽鎖遺伝子は、抗変性アルブミンファージ抗体M1−1の発現用プラスミドを鋳型としてPCRにより調製した。
l(final conc.1.6mM);プライマー(10μM)各2.5μL(final conc.0.5μM);鋳型DNA1μL;KOD−plus(東洋紡株式会社製)1μLであり、最終的に蒸留水で50μLにメスアップした。また反応は、(1)94℃、2分間;(2)94℃、15秒間;(3)55℃、30秒間;(4)68℃、2分間の条件で、(1)の後、(2)〜(4)を30サイクル行なった。
重鎖可変領域遺伝子は、抗変性アルブミンファージ抗体M1−1の発現用プラスミドを鋳型としてPCRにより調製した。
pcCKL−M1−1およびpcDHF−M1−1(各0.25μg)を、約1.2×105個のチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞((財)ヒューマンサイエンス振興財団)に、形質転換用試薬(製品名:PolyFect Transfection Reagent、Qiagen社製)を用いて形質転換した。形質転換の方法については、操作マニュアルにしたがって行なった。
固相抗原:変性アルブミン、ヒト血清アルブミン、トランスフェリン、α2−グリコプロテイン、断片化アルブミン(色素入り)、断片化アルブミン(尿素入り)、0.5% BSA(陰性対照)
一次反応:各クローンの培養上清、クローニング前の培養上清(陽性対照)、免疫ニワトリ血清(×200)(陽性対照)、10%FBS/F12培地(陰性対照)
二次反応:HRP標識 抗ニワトリIgG H+L
発色基質:OPD
発色時間:5分間(変性アルブミン)、10分間(変性アルブミン以外の抗原)
結果を図4に示す。図4は、ニワトリ型二価抗体の反応性を確認したELISAの結果を表す図である。図4の(a)はM1−1クローン、(b)はM4−4クローン、(c)はM5−2クローン、(d)は2M7−2クローンの結果を表す。図4(a)〜(d)に示すように、総てのクローンの培養上清で、クローニング前と比較して、変性アルブミンに対する反応性が上昇することを確認した。
上記「2.ニワトリ型抗体の取得」で得られた抗体の反応性を従来公知のドットブロット法により評価した。抗原は、上記「1.変性アルブミンの調製」で精製した変性アルブミンを含有する精製尿検体(濃度:300、100、50、30、10mg/L)、および正常アルブミン(和光純薬工業株式会社製、濃度:300、100、50mg/L)を用いた。また、一次抗体としては、上記「2.ニワトリ型抗体の取得」で得られた抗体、またはビオチン標識正常アルブミン抗体(American-Qualex社製)を用いた。また、上記「2.ニワトリ型抗体の取得」で得られた抗体に対する二次抗体としては、アルカリホスファターゼ標識抗IgY抗体(SIGMA-ALDRICH社製、製品名:Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Alkaline Phosphatase antibody produced in rabbit)を用いた。一方、ビオチン標識正常アルブミン抗体に結合するための発色用酵素としては、ストレプトアビジン標識アルカリホスファターゼ(CEDARLANE LABORATORIES LTD社製、製品名:Streptavidin)を用いた。
レーン2:100mg/L 精製尿検体
レーン3:50mg/L 精製尿検体
レーン4:30mg/L 精製尿検体
レーン5:10mg/L 精製尿検体
レーン6:300mg/L 正常アルブミン
レーン7:100mg/L 正常アルブミン
レーン8:50mg/L 正常アルブミン
次にDSファーマ社製のブロックエース(製品名)を4%に調製したものをメンブレンに塗布し、塗布後1時間放置することによりブロッキング処理を行った。
Claims (10)
- 変性アルブミンに特異的に結合し、
且つ正常アルブミンおよび断片化された正常アルブミンには結合しない抗体であり、
下記の(a)および(b)の工程を含む方法によって得られた変性アルブミンをニワトリに免疫して得られたことを特徴とする抗体:
(a)抗体未結合プロテインG−セファロース(登録商標)ビーズの層、トランスフェリン抗体結合ビーズの層、及び、正常アルブミン抗体結合ビーズの層を体積比が1:1:1となるように積層したカラムにより、変性アルブミンを含有する尿から、正常アルブミンおよびトランスフェリンを除去する工程;
(b)上記工程(a)で得られた試料からサイズ排除クロマトグラフィーにより変性アルブミンを得る工程。 - 下記の(a)〜(e)の工程を含む製造方法によって得られたことを特徴とする請求項1に記載の抗体:
(a)抗体未結合プロテインG−セファロース(登録商標)ビーズの層、トランスフェリン抗体結合ビーズの層、及び、正常アルブミン抗体結合ビーズの層を体積比が1:1:1となるように積層したカラムにより、変性アルブミンを含有する尿から、正常アルブミンおよびトランスフェリンを除去する工程;
(b)上記工程(a)で得られた試料からサイズ排除クロマトグラフィーにより変性アルブミンを得る工程;
(c)上記工程(b)で得られた変性アルブミンをニワトリに免疫する工程;
(d)上記工程(c)で免疫したニワトリから変性アルブミンに特異的に結合するファージ抗体を得る工程;
(e)上記工程(d)で得られたファージ抗体のうち、正常アルブミンおよび断片化された正常アルブミンには結合しない抗体を選抜する工程。 - 上記抗体は、一本鎖可変領域断片または二価抗体であることを特徴とする請求項1または2に記載の抗体。
- 変性アルブミンに特異的に結合し、且つ正常アルブミンおよび断片化された正常アルブミンには結合しない抗体を製造する方法であって、
下記の(a)〜(e)の工程を含むことを特徴とする上記方法:
(a)抗体未結合プロテインG−セファロース(登録商標)ビーズの層、トランスフェリン抗体結合ビーズの層、及び、正常アルブミン抗体結合ビーズの層を体積比が1:1:1となるように積層したカラムにより、変性アルブミンを含有する尿から、正常アルブミンおよびトランスフェリンを除去する工程;
(b)上記工程(a)で得られた試料からサイズ排除クロマトグラフィーにより変性アルブミンを得る工程;
(c)上記工程(b)で得られた変性アルブミンをニワトリに免疫する工程;
(d)上記工程(c)で免疫したニワトリから変性アルブミンに特異的に結合する抗体を得る工程;
(e)上記工程(d)で得られた抗体のうち、正常アルブミンおよび断片化された正常アルブミンには結合しない抗体を選抜する工程。 - 上記抗体は、一本鎖可変領域断片または二価抗体であることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 試料中に含まれる変性アルブミンを検出するためのキットであって、
請求項1から3のいずれか1項に記載の抗体を備えていることを特徴とする上記キット。 - 試料中に含まれる変性アルブミンを検出する方法であって、
請求項1から3のいずれか1項に記載の抗体と、試料とを反応させる工程を含むことを特徴とする上記方法。 - 上記試料は、尿であることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 腎疾患の発症または発症の可能性を検出する方法であって、
請求項1から3のいずれか1項に記載の抗体と、尿とを反応させる工程と、
変性アルブミンの濃度を算出する工程と、
正常アルブミンの濃度を算出する工程と、を含むことを特徴とする上記方法:
ここで、以下の(A)または(B)の判定を行う:
(A)上記尿中の正常アルブミン及び変性アルブミンの総量が30mg/L〜300mg/Lである場合に、微量アルブミン尿であると判断する;
(B)上記尿中の正常アルブミン及び変性アルブミンの総量が300mg/L以上である場合に、蛋白尿であると判断する。 - 下記の(a)および(b)の工程を含むことを特徴とする変性アルブミン抗原の調製方法:
(a)抗体未結合プロテインG−セファロース(登録商標)ビーズの層、トランスフェリン抗体結合ビーズの層、及び、正常アルブミン抗体結合ビーズの層を体積比が1:1:1となるように積層したカラムにより、変性アルブミンを含有する尿から、正常アルブミンおよびトランスフェリンを除去する工程;
(b)上記工程(a)で得られた試料からサイズ排除クロマトグラフィーにより変性アルブミンを得る工程。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009173259A JP5699424B2 (ja) | 2009-07-24 | 2009-07-24 | 抗変性アルブミン抗体、当該抗体の製造方法、およびその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009173259A JP5699424B2 (ja) | 2009-07-24 | 2009-07-24 | 抗変性アルブミン抗体、当該抗体の製造方法、およびその利用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011026239A JP2011026239A (ja) | 2011-02-10 |
JP5699424B2 true JP5699424B2 (ja) | 2015-04-08 |
Family
ID=43635413
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009173259A Active JP5699424B2 (ja) | 2009-07-24 | 2009-07-24 | 抗変性アルブミン抗体、当該抗体の製造方法、およびその利用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5699424B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4691650B2 (ja) * | 2004-03-04 | 2011-06-01 | 国立大学法人広島大学 | ニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法、および当該生産方法によって生産されるニワトリ型モノクローナル抗体 |
-
2009
- 2009-07-24 JP JP2009173259A patent/JP5699424B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2011026239A (ja) | 2011-02-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2012282402B2 (en) | Antibodies to phosphorylated tau aggregates | |
JP6336911B2 (ja) | アドレノメジュリンアッセイおよび成熟アドレノメジュリンの測定方法 | |
TWI283749B (en) | Antibody pair screening methods | |
US11415576B2 (en) | Method for measurement of vitamin D | |
KR20110126742A (ko) | 비타민 d를 검출하기 위한 어세이 및 항체 | |
CN111748033B (zh) | 一种与新型冠状病毒np蛋白结合的分离抗体、包含其的检测试剂盒 | |
WO2011010673A1 (ja) | インスリン測定方法 | |
JP2016505634A (ja) | 1,25−ジヒドロキシビタミンdを検出するための方法及びキット並びに関連する抗体 | |
JP7382071B2 (ja) | 糖化ヘモグロビン(%)の測定方法 | |
WO2016104439A1 (ja) | 抗活性型gip抗体 | |
AU2009312731B2 (en) | Antibodies to modified human IGF-1/E peptides | |
CN114369160B (zh) | 结合抗繆勒氏管激素amhn二聚体蛋白的高亲和力兔单抗 | |
CN110885374B (zh) | 一种抗降钙素原的高亲和力纳米抗体及其应用 | |
CN110903390B (zh) | 一种抗降钙素原的纳米抗体及其应用 | |
AU2015223840A2 (en) | Novel anti-presepsin antibody | |
WO2011137389A2 (en) | Compositions and methods for reliably detecting and/or measuring the amount of a modified target protein in a sample | |
EP2541252A1 (en) | Method of obtaining a binder to prepro-vasopressin or fragments thereof | |
JP5699424B2 (ja) | 抗変性アルブミン抗体、当該抗体の製造方法、およびその利用 | |
EP4047017A1 (en) | Monoclonal antibody, measurement reagent for cytokeratin 18 fragment, reagent kit, and measurement method | |
US20140221507A1 (en) | Biomarker of Renal Impairment | |
JP5553603B2 (ja) | 新規肝癌マーカー | |
JP5231954B2 (ja) | アルブミン測定試薬 | |
WO2023109785A1 (zh) | 一种用于检测血清中sTNFR2的抗体及试剂盒 | |
WO2023195347A1 (ja) | 抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、ヒトヘモグロビン及び/又は糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法、ヒトヘモグロビン及び/又は糖化ヒトヘモグロビンの検出キット、並びに、ペプチド | |
WO2023068248A1 (ja) | I型コラーゲン架橋n-テロペプチドの免疫測定方法及び免疫測定キット、並びに抗体又はその抗体断片 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120704 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20120704 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120817 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140121 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20140314 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20140320 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140324 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20140320 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20140930 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141212 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20141219 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150120 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150202 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5699424 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |