WO2023195347A1 - 抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、ヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法、ヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンの検出キット、並びに、ペプチド - Google Patents
抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、ヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法、ヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンの検出キット、並びに、ペプチド Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to an anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof, a method for detecting human hemoglobin and/or glycated human hemoglobin, a detection kit for human hemoglobin and/or glycated human hemoglobin, and a peptide.
- Hb Human hemoglobin
- ⁇ subunits Human hemoglobin
- ⁇ chains, ⁇ chains, or ⁇ chains protein.
- One heme is bound to the hydrophobic pocket of each subunit, and Hb has a total of four hemes.
- Each subunit has a stabilized structure by incorporating heme (Non-Patent Document 1).
- HbF fetal hemoglobin
- HbA adult hemoglobin
- HbA0 HbA
- HbA1 In addition to this, about 7% of HbA1 exists, which is HbA bound to sugar. HbA1 is further classified into HbA1a, HbA1b, HbA1c, etc., and HbA1c is commonly used as a diagnostic index for blood sugar level management. In addition, HbA itself can be used to manage anemia by quantifying HbA in the blood, to diagnose periodontal disease by quantifying HbA in saliva, and to aid in the diagnosis of malignant tumors by quantifying HbA in feces. (Non-Patent Document 1).
- Quantitative measurement methods for HbA and/or HbA1 include HPLC method, electrophoresis method, near-infrared spectroscopic image measurement method, absorbance method, cyanmethemoglobin method, latex agglutination method, immunochromatography method, enzyme method, and immunoturbidimetry method. , immunohistochemistry, affinity method, etc. (Non-Patent Document 2).
- An object of the present invention is to provide an anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof suitable for immunoassay, and furthermore, to provide a human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof that is suitable for immunoassay. and/or a method for detecting glycated human hemoglobin, a detection kit for human hemoglobin and/or glycated human hemoglobin, and a polypeptide recognized by the anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof. purpose.
- the anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof is located at (a) 15th to 29th, or (b) 37th in the amino acid sequence of human hemoglobin ⁇ chain shown in SEQ ID NO: 1. Binds to the ⁇ 66th amino acid region.
- the above-mentioned anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof is the amino acid region of (a1) 15th to 28th or (b1) 37th to 64th in the amino acid sequence of human hemoglobin ⁇ chain shown by SEQ ID NO: 1. It may bind to (a2) the 15th to 26th amino acid region, or (b2) the 38th to 61st amino acid region in the amino acid sequence of human hemoglobin ⁇ chain shown by SEQ ID NO: 1.
- a method for detecting human hemoglobin and/or glycated human hemoglobin in a sample uses the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof to detect human hemoglobin and/or glycated human hemoglobin in a sample by immunoassay. or detecting glycated human hemoglobin.
- a detection kit for human hemoglobin and/or glycated human hemoglobin includes the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof.
- the peptide according to one aspect of the present invention consists of the amino acid sequence shown in either SEQ ID NO: 2 or 3.
- the anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof recognizes an epitope that is effective for forming immune complexes. Therefore, according to the present invention, an anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof suitable for immunoassay is provided.
- the present invention also provides a method and kit for detecting human hemoglobin and/or glycated human hemoglobin using the anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof. Furthermore, the present invention also provides a peptide recognized by the anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof.
- A is a graph showing that when mice were immunized with the peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, the antibody titer against the peptide increased.
- B is a graph showing that when mice were immunized with the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, the blood antibody titer against the peptide increased.
- A is a graph showing that the antibody titer against HbA0 increased when mice were immunized with the peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
- (B) is a graph showing that the antibody titer against HbA0 increased when mice were immunized with the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
- (A) is a graph showing the results of epitope mapping of an antibody that specifically bound to HbA0 when mice were immunized with a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
- (B) is a graph showing the results of epitope mapping of antibodies that specifically bound to HbA0 when mice were immunized with the peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
- the anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof is a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to human hemoglobin ⁇ chain.
- the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof is a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to any of the epitopes shown in FIG. 1 (that is, recognizes any epitope).
- FIG. 1 is a graph showing the antigenicity score of human hemoglobin ⁇ chain shown in SEQ ID NO: 1.
- the epitope shown in FIG. 1 is a highly antigenic region in the human hemoglobin ⁇ chain, and is an epitope that is effective in forming immune complexes.
- the anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof has the following amino acid sequence of human hemoglobin ⁇ chain shown in SEQ ID NO: 1. (a) the 15th to 29th amino acid region (SEQ ID NO: 2), or (b) the 37th to 66th amino acid region (SEQ ID NO: 3), join to.
- the human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof has the amino acid sequence of human hemoglobin ⁇ chain shown in SEQ ID NO: 1. (a1) the 15th to 28th amino acid region, or (b1) the 37th to 64th amino acid region, May be combined with (a2) the 15th to 26th amino acid region, or (b2) the 38th to 61st amino acid region, May be combined with
- “specifically” refers to human hemoglobin ⁇ chain, protein components other than human hemoglobin ⁇ chain, and anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody according to this aspect. Even if a hemoglobin ⁇ -chain monoclonal antibody does not cause an antigen-antibody reaction at a detectable level with protein components other than human hemoglobin ⁇ -chain, or even if some binding reaction or association reaction occurs, the anti-human hemoglobin ⁇ -chain monoclonal antibody This means that a reaction that is clearly weaker than the antigen-antibody reaction with hemoglobin ⁇ chain occurs.
- the expression that the anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody "binds to the m to nth regions in the amino acid sequence” means that the anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody binds to the m to nth regions of the amino acid sequence. This means binding to any of the above positions, and does not necessarily mean binding over the entire m to n-th region of the amino acid sequence.
- an anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody “binds to the 15th to 29th amino acid region of the human hemoglobin ⁇ chain amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1” means that the anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody binds to the 15th to 29th amino acid region of the human hemoglobin ⁇ chain amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It means binding to one or more arbitrary amino acids (for example, the 15th to 28th and 15th to 26th amino acids) in the th amino acid region, but does not necessarily mean binding to all of the 15th to 29th amino acids. .
- the class of anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibodies is not limited to IgG, but may be IgY, IgM, camel Ig, or Ig NAR.
- the antigen-binding fragment is not particularly limited, and may be Fab, Fab', F(ab') 2 , or single chain antibody (scFv).
- the method for producing an anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody is not particularly limited.
- an animal is immunized with a full-length human hemoglobin ⁇ chain molecule or a partial peptide thereof using a known immunological method, and the cells of the immunized animal are It can be obtained from hybridomas produced using Alternatively, the anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody can also be produced as a recombinant antibody using genetic recombination technology.
- the length of the peptide used for immunization is not particularly limited, but is preferably 5 amino acids or more, more preferably 10 amino acids or more, and even more preferably 13 amino acids or more. Peptides are degraded in vivo by antigen-presenting cells, and only a portion of them is presented as antigens. Therefore, the peptide used for immunization is a peptide with one or more extra amino acids added to the epitope shown in Figure 1 (e.g., in addition to the epitope shown in Figure 1, amino acids in the region immediately before and/or after the epitope). It is preferable that it is a peptide containing
- the human hemoglobin ⁇ chain used as an immunogen may be obtained from a human biological sample derived from blood or urine, for example, and expressed by introducing a plasmid vector incorporating DNA encoding the human hemoglobin ⁇ chain protein into host cells. It may also be obtained by
- a human hemoglobin ⁇ chain molecule or its partial peptide used as an immunogen may be fused to the human hemoglobin ⁇ chain molecule or its partial peptide used as an immunogen. That is, a human hemoglobin ⁇ chain molecule or a partial peptide thereof may be expressed as a fusion protein with another protein and used as an immunogen after or without purification.
- a carrier protein such as keyhole limpet hemocyanin (KLH) may be conjugated to the peptide.
- GST glutathione S-transferase
- MBP maltose binding protein
- TRX thioredoxin
- Nus tag S tag, HSV tag, FLRAG tag, polyhistidine tag, Strep tag, Strep-II tag
- Proteins commonly used as protein expression and/or purification tags may be used, such as Myc tag, HA tag, V5 tag, E tag, T7 tag, VSV-G tag, Glu-Glu tag, Avi tag, etc.
- these tags are cleaved using a digestive enzyme after the fusion protein is expressed.
- Anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibodies can be easily prepared from immunized animals by the well-known method of Keller et al. (Kohler, et al. Nature. 1975; 256:495-497). That is, antibody-producing cells such as splenocytes and lymphocytes are collected from immunized animals, the antibody-producing cells are fused with mouse myeloma cells to create hybridomas, and the hybridomas are cloned by limiting dilution method.
- An anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody can be prepared by selecting a monoclonal antibody that causes an antigen-antibody reaction with human hemoglobin ⁇ chain from among the monoclonal antibodies produced by each hybridoma.
- Hybridomas can be cultured in the ascites of animals such as mice or in culture media.
- Known immunoglobulin purification methods can be used to purify anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibodies from ascites fluid or culture supernatant. Examples include fractionation by salting out using ammonium sulfate or sodium sulfate, polyethylene glycol (PEG) fractionation, ethanol fractionation, DEAE ion exchange chromatography, and gel filtration.
- anti-human hemoglobin ⁇ -chain can be obtained by affinity chromatography using a carrier bound with protein A, protein G, or protein L, depending on the immunized animal species and the class of the anti-human hemoglobin ⁇ -chain monoclonal antibody.
- Monoclonal antibodies may also be purified.
- a method for detecting human hemoglobin and/or glycated human hemoglobin in a sample according to one aspect of the present invention uses an anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof according to the above aspect of the present invention.
- the method includes detecting human hemoglobin and/or glycated human hemoglobin in a sample by a quantitative measurement method.
- human hemoglobin refers to any hemoglobin containing human hemoglobin ⁇ chain as a component, and preferably adult hemoglobin (HbA; ⁇ 2 ⁇ ).
- glycated human hemoglobin is any human hemoglobin to which sugar is bound, preferably glycated adult human hemoglobin (HbA1).
- one or two of the above anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibodies or antigen-binding fragments thereof can be used.
- Samples include, for example, human or non-human animal blood, serum, plasma, urine, semen, spinal fluid, saliva, sweat, tears, ascites, amniotic fluid, and other body fluids; mucus; feces; blood vessels, organs such as the liver; Examples include biological samples that may contain human hemoglobin, such as tissues; cells; or extracts thereof.
- the sample is preferably blood (whole blood, plasma, or serum) or urine, which is easy to collect.
- the method for collecting the sample is not particularly limited, and any known method can be employed.
- immunoassay methods include known immunoassay methods such as competitive method, agglutination method, Western blotting method, immunostaining method, and sandwich method, with sandwich method being preferred.
- the sandwich method can be performed by, for example, an immunochromatography method, an ELISA method, a latex agglutination method, a CLEIA method, or the like.
- a kit for detecting human hemoglobin and/or glycated human hemoglobin according to one aspect of the present invention includes an anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof according to the above aspect of the present invention.
- the kit may contain one or two of the anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibodies or antigen-binding fragments thereof. Details of the anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof are as described above.
- the kit can further include known reagents, materials, instruments, etc. used in techniques such as immunochromatography, ELISA, latex agglutination, and CLEIA.
- One aspect of the present invention provides a peptide recognized by the anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to the above aspect of the present invention.
- the peptide consists of the amino acid sequence of either SEQ ID NO: 2 or 3.
- the peptide according to this aspect can be used, for example, as an immunogen for producing an anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody by immunological techniques.
- an immunogen for producing an anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody by immunological techniques.
- the peptide is degraded in vivo by antigen-presenting cells, and only a portion of the peptide is presented as an antigen. Therefore, the peptide is a peptide in which one or more extra amino acids are added to the epitope shown in FIG. ) is preferable.
- the polypeptide may be conjugated to a carrier protein such as KLH.
- the peptide according to this aspect can be used for the detection of human hemoglobin and/or glycated human hemoglobin by an immunological competitive method, together with the anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to the above aspect.
- one or more peptides according to this aspect are immobilized on a substrate, a sample that may contain human hemoglobin and/or glycated human hemoglobin, and a labeled anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody according to the above aspect. Human hemoglobin and/or glycated human hemoglobin can be competitively detected by contacting the antigen-binding fragment thereof with the substrate.
- another aspect of the present invention is to detect human hemoglobin and/or glycated human hemoglobin in a sample by an immunological competition method using the above-mentioned peptide and the above-mentioned anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof. Detecting human hemoglobin in a sample, and detecting human hemoglobin and/or glycated human hemoglobin, comprising the peptide and the anti-human hemoglobin ⁇ chain monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof. It can also be said that the company provides a kit for doing so.
- Example 1 The peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 3 was subjected to the MBS method (Syed Salman Lateef, et al., "An Improved Protocol for Coupling Synthetic Peptides to Carrier Proteins for Antibody Production Using DMF to Solubilize Peptides", J Biomol Tech.2007 Jul;18(3):173-176.), a peptide conjugate was prepared in which mcKLH (maliculture keyhole limpet hemocyanin) and BSA (bovine serum albumin) were individually covalently bonded.
- MBS Yellow Salman Lateef, et al., "An Improved Protocol for Coupling Synthetic Peptides to Carrier Proteins for Antibody Production Using DMF to Solubilize Peptides", J Biomol Tech.2007 Jul;18(3):173-176.
- a peptide conjugate using mcKLH as an immunizing antigen was intraperitoneally administered to three BALB/c mice at a dose of 100 ⁇ g/200 ⁇ L/mouse.
- Sigma adjuvant system registered trademark (manufactured by Sigma-Aldrich) was used as an adjuvant. Blood was collected over time during the immunization period from the tail vein, and the antibody titer was confirmed by a peptide conjugate immobilized ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) method using BSA.
- Example 2 Furthermore, the reactivity of the antibodies raised after immunization to human HbA0 was confirmed by ELISA. More specifically, 1) 100 ⁇ L/well of a human HbA0 solution diluted to 10 ⁇ g/mL with PBS was added to a 96-well immunoplate and solidified overnight at 4°C. 2) Discard the antigen (human HbA0) solution, wash twice with wash buffer (0.05% Tween (registered trademark) 20/PBS), and then dilute Blocking One (manufactured by Nacalai Tesque) 5 times with ultrapure water. Blocking was performed by adding 250 ⁇ L/well of each well and incubating at 25° C. for about 1 hour.
- FIG. Graphs A and B in FIG. 3 show the results when the peptides of SEQ ID NOs: 2 and 3 were used, respectively, and it was confirmed that the antibody titer against HbA0 increased in both cases.
- Example 3 The spleen of the individual obtained in Example 2 was removed, RNA was extracted using TRIzol (registered trademark) Plus RNA Purification Kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and RNA was extracted using SuperScript (registered trademark) III Reverse Transcription (Thermo Fisher Scientific). cDNA was obtained by reverse transcription reaction using (manufactured by Fisher Scientific). The obtained cDNA was amplified by PCR reaction using antibody gene-specific primers, and the amplified product was inserted into a vector to obtain an antibody gene library.
- TRIzol registered trademark
- Plus RNA Purification Kit manufactured by Thermo Fisher Scientific
- SuperScript registered trademark III Reverse Transcription
- Example 4 The epitope of the monoclonal antibody obtained from Example 3 was confirmed as follows. Biotinylated peptides 1 to 66 shown in Tables 1 and 2 were synthesized (outsourced to JPT Peptide Technologies) and immobilized on mutually distinguishable beads (LumAvidin® Microspheres manufactured by Luminex). 500 of each peptide-immobilized beads were added to each well of a polypropylene microplate, and a monoclonal antibody at a final concentration of 1 ⁇ g/ml was added. After incubating the microplate at 37°C for 1 hour, the supernatant was removed using a magnetic stand and the microplate was washed.
- Biotinylated peptides 1 to 66 shown in Tables 1 and 2 were synthesized (outsourced to JPT Peptide Technologies) and immobilized on mutually distinguishable beads (LumAvidin® Microspheres manufactured by Luminex). 500 of each peptide-immobilized beads were added to each well of a poly
- R-phycoerythrin-labeled goat anti-mouse IgG was added as a detection antibody and incubated at 37°C for 1 hour. After removing the supernatant using a magnetic stand and washing the microplate, the fluorescence of R-phycoerythrin was measured using Bio-Plex. Graphs A and B in FIG.
- SEQ ID NO: 2 is a peptide containing the 15th to 29th amino acids of human hemoglobin ⁇ chain (peptides 1 to 29)
- SEQ ID NO: 3 shows significantly more antibodies against peptides containing amino acids 37th to 66th of the human hemoglobin ⁇ chain (peptides 23 to 66) than peptides containing amino acids other than these. It was confirmed that they were connected. These results suggested that each monoclonal antibody specifically recognized the 15th to 29th amino acid region or the 37th to 66th amino acid region of the human hemoglobin ⁇ chain.
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Abstract
本発明の抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号１で示されるヒトヘモグロビンβ鎖のアミノ酸配列における、（ａ）１５～２９番目、又は（ｂ）３７～６６番目のアミノ酸領域に結合する。
Description
本発明は、抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、ヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法、ヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンの検出キット、並びに、ペプチドに関する。
ヒトヘモグロビン（Ｈｂ）は、２つのα鎖（αサブユニット）と、２つの非α鎖（β鎖、γ鎖又はδ鎖；β、γ又はδサブユニット）と、で構成される４量体のタンパク質である。各サブユニットの疎水性ポケットには１個のヘムが結合しており、Ｈｂは計４個のヘムを持っている。各サブユニットは、ヘムを内蔵することで安定化した構造をとっている（非特許文献１）。
出生前の胎児のヘモグロビンのほとんどは、α２γ２から構成される胎児型ヘモグロビン（ＨｂＦ）あるが、出生直後からγ鎖に代わりβ鎖の産生が優位となるためα２β２から構成される成人型ヘモグロビン（ＨｂＡ）が産生されるようになる。成人のＨｂ組成は、通常、ＨｂＡ（α２β２）：ＨｂＦ（α２γ２）：ＨｂＡ２（α２δ２：微少ヘモグロビン）＝９５～９６：１．５：２～３であり、ＨｂＡ（糖化修飾されていないＨｂＡをＨｂＡ０とも表す）がほとんどを占める。
この他に、ＨｂＡが糖と結合したＨｂＡ１が約７％存在する。ＨｂＡ１は、さらにＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＡ１ｃなどに分類され、ＨｂＡ１ｃは血糖値管理の診断指標に汎用されている。また、ＨｂＡ自体も、血液中のＨｂＡを定量することで貧血管理に、唾液中のＨｂＡを定量化することで歯周病の診断に、糞便中のＨｂＡを定量することで悪性腫瘍の診断補助に、各々用いられている（非特許文献１）。
ＨｂＡ及び／又はＨｂＡ１の定量測定法としては、ＨＰＬＣ法、電気泳動法、近赤外分光画像計測法、吸光度法、シアンメトヘモグロビン法、ラテックス凝集法、イムノクロマトグラフィー法、酵素法、免疫比濁法、免疫比ろう法、アフィニティ法等があげられる（非特許文献２）。
また、ヒトヘモグロビンに対するエピトープに関して、ＨｂＡ１ｃの糖化ハプテン（ヘモグロビンβ鎖のＮ末端糖化ペプチド部分）の報告（特許文献１）や、ヒトヘモグロビンγ鎖の報告（特許文献２）が既に成されているが、ヒトヘモグロビンβ鎖の非糖化部分に関するエピトープの報告は未だにない。
宮地隆興ら、「ヘモグロビン異常症」、臨床化学、第５巻、第４号、３５１～３５７頁、１９７７年
東野功嗣、「ＨＰＬＣ法の素敵な部分と酵素法のチャームポイント」、生物試料分析、第４３巻、第４号、２２４－２３０頁、２０２０年
本発明は、免疫学的測定法に適した抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を提供することを目的とし、さらに、かかるモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を利用する、ヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法、ヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンの検出キット、並びに、該抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片によって認識されるポリペプチドを提供することも目的とする。
これまでに抗原性を予測するアルゴリズムが複数報告されている（例えば、Chou PY, Fasman GD. "Prediction of the secondary structure of proteins from their amino acid sequence." Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 47:45-148, 1978）。しかしながら、これらのアルゴリズムは、互いに相反する指標を含んでいることから、個々のアルゴリズムでは抗原性予測の精度に乏しいという問題点があった。そこで、本発明者らは、これらのアルゴリズムの統合及び改良を行い、抗原性予測の精度を向上し得るアルゴリズムを見いだした。そして、本発明者らは、このアルゴリズムを用いて、配列番号１で示されるヒトヘモグロビンβ鎖のアミノ酸配列における各アミノ酸の抗原性の強さをスコア化した。この抗原性スコアを図１に示す。その結果、ヒトヘモグロビンβ鎖のアミノ酸配列における特定の領域において抗原性が強く、当該領域が免疫複合体の形成に効果的なエピトープであることを見いだし、本発明を完成させた。
本発明の一側面に係る抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号１で示されるヒトヘモグロビンβ鎖のアミノ酸配列における、（ａ）１５～２９番目、又は（ｂ）３７～６６番目のアミノ酸領域に結合する。上記抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号１で示されるヒトヘモグロビンβ鎖のアミノ酸配列における、（ａ１）１５～２８番目、又は（ｂ１）３７～６４番目のアミノ酸領域に結合してもよく、配列番号１で示されるヒトヘモグロビンβ鎖のアミノ酸配列における、（ａ２）１５～２６番目、又は（ｂ２）３８～６１番目のアミノ酸領域に結合してもよい。
本発明の一側面に係る試料中のヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法は、上記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いて、免疫学的測定法により試料中のヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンを検出することを含む。
本発明の一側面に係るヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンの検出キットは、上記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む。
本発明の一側面に係るペプチドは、配列番号２又は３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる。
上記抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、免疫複合体の形成に効果的なエピトープを認識する。このため、本発明によれば、免疫学的測定法に適した抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が提供される。また、本発明によれば、該抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いてヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法並びにキットも提供される。さらに、本発明によれば、該抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片によって認識されるペプチドも提供される。
＜抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片＞
本発明の一側面に係る抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、ヒトヘモグロビンβ鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である。該モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、図１に示すエピトープのいずれかに結合する（すなわち、いずれかのエピトープを認識する）モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である。上述のとおり、図１は、配列番号１で示されるヒトヘモグロビンβ鎖の抗原性スコアを示すグラフである。この図１に示すエピトープは、ヒトヘモグロビンβ鎖における抗原性の強い領域であって、免疫複合体の形成に効果的なエピトープである。
本発明の一側面に係る抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、ヒトヘモグロビンβ鎖に特異的に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である。該モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、図１に示すエピトープのいずれかに結合する（すなわち、いずれかのエピトープを認識する）モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である。上述のとおり、図１は、配列番号１で示されるヒトヘモグロビンβ鎖の抗原性スコアを示すグラフである。この図１に示すエピトープは、ヒトヘモグロビンβ鎖における抗原性の強い領域であって、免疫複合体の形成に効果的なエピトープである。
すなわち、本側面に係る抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号１で示されるヒトヘモグロビンβ鎖のアミノ酸配列における、
（ａ）１５～２９番目（配列番号２）のアミノ酸領域、又は
（ｂ）３７～６６番目（配列番号３）アミノ酸領域、
に結合する。
（ａ）１５～２９番目（配列番号２）のアミノ酸領域、又は
（ｂ）３７～６６番目（配列番号３）アミノ酸領域、
に結合する。
該ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号１で示されるヒトヘモグロビンβ鎖のアミノ酸配列における、
（ａ１）１５～２８番目のアミノ酸領域、又は
（ｂ１）３７～６４番目のアミノ酸領域、
に結合してよく、
（ａ２）１５～２６番目のアミノ酸領域、又は
（ｂ２）３８～６１番目のアミノ酸領域、
に結合してよい。
（ａ１）１５～２８番目のアミノ酸領域、又は
（ｂ１）３７～６４番目のアミノ酸領域、
に結合してよく、
（ａ２）１５～２６番目のアミノ酸領域、又は
（ｂ２）３８～６１番目のアミノ酸領域、
に結合してよい。
本明細書において、「特異的に」とは、ヒトヘモグロビンβ鎖、とヒトヘモグロビンβ鎖以外のタンパク質成分と、本側面に係る抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体とを含む液系において、該抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体がヒトヘモグロビンβ鎖以外のタンパク質成分と検出可能なレベルで抗原抗体反応を起こさないか、何らかの結合反応又は会合反応を起こしたとしても、該抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体のヒトヘモグロビンβ鎖との抗原抗体反応よりも明らかに弱い反応しか起こさないことを意味する。
本明細書において、抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体が「アミノ酸配列におけるｍ～ｎ番目の領域に結合する」とは、抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体がアミノ酸配列のｍ～ｎ番目の領域中の１以上の任意の位置に結合することを意味し、必ずしもアミノ酸配列のｍ～ｎ番目の領域の全体にわたって結合することを意味するものではない。例えば、抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体が「配列番号１で示されるヒトヘモグロビンβ鎖のアミノ酸配列における１５～２９番目のアミノ酸領域に結合する」とは、抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体が１５～２９番目のアミノ酸領域における１以上の任意のアミノ酸（例えば、１５～２８番目及び１５～２６番目のアミノ酸）に結合することを意味し、必ずしも１５～２９番目のアミノ酸の全てと結合することを意味しない。
抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体のクラスは、ＩｇＧに限定されず、ＩｇＹ、ＩｇＭ、ラクダＩｇ、又はＩｇ ＮＡＲであってもよい。また、その抗原結合性断片は、特に限定されず、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であってよい。
抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体の作製方法は、特に限定されず、例えば、公知の免疫学的手法を用いてヒトヘモグロビンβ鎖分子全長又はその部分ペプチドを動物に免疫し、免疫された動物の細胞を用いて作製したハイブリドーマから得ることができる。あるいは、抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体は、遺伝子組換え技術を用いて、組換え抗体として作製することもできる。
免疫に用いるペプチドの長さは、特に限定されないが、好ましくは５アミノ酸以上、より好ましくは１０アミノ酸以上、さらに好ましくは１３アミノ酸以上である。ペプチドは生体内で抗原提示細胞によって分解されて、その一部のみが抗原として提示される。このため、免疫に用いるペプチドは、図１に示すエピトープに、１つ以上の余分なアミノ酸が付加されたペプチド（例えば、図１のエピトープに加えて、エピトープの直前及び／又は直後の領域のアミノ酸を含むペプチド）であることが好ましい。
免疫原とするヒトヘモグロビンβ鎖は、例えば、血液又は尿に由来するヒト生体試料から得てもよく、ヒトヘモグロビンβ鎖のタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドベクターを宿主細胞に導入して発現させることにより得てもよい。
免疫原として用いるヒトヘモグロビンβ鎖分子又はその部分ペプチドには、他のタンパク質が融合されていてもよい。すなわち、ヒトヘモグロビンβ鎖分子又はその部分ペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として発現させ、精製後又は精製せずに、免疫原として用いてもよい。例えば、免疫原としてペプチドを用いる場合は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリアタンパク質をペプチドにコンジュゲートさせてもよい。上記他のタンパク質として、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、Ｎｕｓタグ、Ｓタグ、ＨＳＶタグ、ＦＬＲＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓｔｒｅｐ－ＩＩタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ｖ５タグ、Ｅタグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、Ｇｌｕ‐Ｇｌｕタグ、Ａｖｉタグ等、タンパク質発現及び／又は精製タグとして一般的に用いられるタンパク質を用いてもよいが、これらのタグは、融合タンパク質発現後に消化酵素を用いて切断することが好ましい。
免疫した動物からの抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体の調製は、ケラーらの周知の方法（Ｋｏｈｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９７５；２５６：４９５－４９７）により容易に行うことができる。すなわち、免疫した動物から、脾細胞、リンパ球等の抗体産生細胞を回収し、抗体産生細胞をマウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングし、クローニングされた各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のうち、ヒトヘモグロビンβ鎖と抗原抗体反応を起こすモノクローナル抗体を選択することにより、抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体を調製することができる。
ハイブリドーマの培養は、マウス等動物の腹水又は培地中で行うことができる。腹水又は培養上清からの抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体の精製には、公知のイムノグロブリン精製法を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウムを用いた塩析による分画法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分画法、エタノール分画法、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー法、ゲルろ過法などが挙げられる。あるいは、免疫動物種と抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体のクラスに応じて、プロテインＡ、プロテインＧ、及びプロテインＬのいずれかを結合させた担体を用いて、アフィニティクロマトグラフィー法により抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体を精製してもよい。
＜ヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンの検出方法＞
本発明の一側面に係る試料中のヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法は、本発明の上記側面に係る抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いて、免疫学的測定法により試料中のヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンを検出することを含む。
本発明の一側面に係る試料中のヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法は、本発明の上記側面に係る抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いて、免疫学的測定法により試料中のヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンを検出することを含む。
ここで、ヒトヘモグロビンは、ヒトヘモグロビンβ鎖を構成要素として含む任意のヘモグロビンを指し、好ましくは、成人型ヘモグロビン（ＨｂＡ；α２β）である。また、糖化ヒトヘモグロビンは、糖が結合した任意のヒトヘモグロビンであり、好ましくは糖化成人型ヒトヘモグロビン（ＨｂＡ１）である。
ヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンの検出には、１種又は２種の上記抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いることができる。
試料としては、例えば、ヒト又はヒト以外の動物の血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水などの体液；粘液；糞便；血管、肝臓などの臓器；組織；細胞；又はそれらの抽出液など、ヒトヘモグロビンが含まれる可能性のある生体試料が挙げられる。試料は、好ましくは採取が容易である、血液（全血、血漿、若しくは血清）又は尿である。試料を採取する方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。
免疫学的測定法としては、競合法、凝集法、ウェスタンブロット法、免疫染色法、サンドイッチ法等、公知の免疫学的測定法が挙げられ、サンドイッチ法が好ましい。サンドイッチ法は、例えば、イムノクロマト法、ＥＬＩＳＡ法、ラテックス凝集法、ＣＬＥＩＡ法などの手法により行うことができる。
＜ヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンの検出キット＞
本発明の一側面に係るヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンを検出するためのキットは、本発明の上記側面に係る抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む。該キットは、１種又は２種の上記抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含んでもよい。抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の詳細は、上述したとおりある。キットは、例えば、イムノクロマト法、ＥＬＩＳＡ法、ラテックス凝集法、ＣＬＥＩＡ法などの手法において用いられる公知の試薬、材料、器具等をさらに含むことができる。
本発明の一側面に係るヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンを検出するためのキットは、本発明の上記側面に係る抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む。該キットは、１種又は２種の上記抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含んでもよい。抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の詳細は、上述したとおりある。キットは、例えば、イムノクロマト法、ＥＬＩＳＡ法、ラテックス凝集法、ＣＬＥＩＡ法などの手法において用いられる公知の試薬、材料、器具等をさらに含むことができる。
＜抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体によって認識されるペプチド＞
本発明の一側面は、本発明の上記側面に係る抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片によって認識されるペプチドを提供する。ペプチドは、配列番号２又は３のいずれかのアミノ酸配列からなる。
本発明の一側面は、本発明の上記側面に係る抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片によって認識されるペプチドを提供する。ペプチドは、配列番号２又は３のいずれかのアミノ酸配列からなる。
本側面に係るペプチドは、例えば、免疫学的手法により抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体を作製するための免疫原として用いることができる。ペプチドを免疫原として用いる場合、ペプチドは、生体内で抗原提示細胞によって分解されて、その一部のみが抗原として提示される。このため、ペプチドは、図１に示すエピトープに、１つ以上の余分なアミノ酸が付加されたペプチド（例えば、図１のエピトープに加えて、エピトープの直前及び／又は直後の領域のアミノ酸を含むペプチド）であることが好ましい。ポリペプチドは、ＫＬＨ等のキャリアタンパク質にコンジュゲートさせてもよい。
また、本側面に係るペプチドは、上記側面に係る抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片とともに、免疫学的競合法によるヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンの検出にも用いることができる。具体的には、本側面に係る１種以上のペプチドを基板上に固相化し、ヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンを含み得る試料と、標識化した上記側面に係る抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片とを上記基板に接触させることで、競合的にヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンを検出することができる。したがって、本発明の別の側面は、上記ペプチドと、上記抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片とを用いて免疫学的競合法により試料中のヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンを検出することを含む、試料中のヒトヘモグロビンを検出する方法、並びに、上記ペプチドと、上記抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片とを含む、ヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンを検出するためのキットを提供するともいえる。
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。ただし、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞
配列番号２又は３のアミノ酸配列を有するペプチドを、ＭＢＳ法（Syed Salman Lateef, et al., " An Improved Protocol for Coupling Synthetic Peptides to Carrier Proteins for Antibody Production Using DMF to Solubilize Peptides", J Biomol Tech.2007 Jul;18(3):173-176.）に基づき、ｍｃＫＬＨ（ｍａｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）とＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）に各々個別に共有結合させたペプチドコンジュゲートを調製した。ｍｃＫＬＨを用いたペプチドコンジュゲートを免疫抗原として、それぞれ３匹ずつのＢＡＬＢ／ｃマウスに１００μｇ／２００μＬ／匹の投与量で腹腔内投与した。アジュバントとしてｓｉｇｍａ ａｄｊｕｖａｎｔ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用した。免疫期間中の経時採血は尾静脈から行い、抗体価はＢＳＡを用いたペプチドコンジュゲート固相化ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法で確認した。より具体的には、１）ＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈した各種ＢＳＡコンジュゲートペプチド溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ９６－ｗｅｌｌイムノプレートに添加し、４℃で一晩固相化した。２）該抗原（ＢＳＡコンジュゲート）溶液を捨て、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０／ＰＢＳ）で２回洗浄後、超純水で５倍希釈したＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク社製）を２５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、２５℃で１時間程度インキュベートすることによってブロッキングを行った。３）ブロッキング溶液を捨て、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄後、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで４，０００－１２８，０００倍希釈したマウス血漿を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、２５℃で２時間インキュベートした。４）血漿溶液を捨て、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄後、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで５，０００倍希釈したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ（ＤＡＫＯ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、室温で１時間インキュベートした。５）抗体溶液を捨て、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄後、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）溶液（ＤＡＫＯ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。６）２５℃で２０分間インキュベート後、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して反応を停止した。７）プレートリーダーで４５０ｎｍ及び６３０ｎｍの吸光度を測定し、４５０ｎｍの吸光度と６３０ｎｍの吸光度の差から抗体価を求めた。その結果を図２に示す。図２のグラフＡ及びＢは、それぞれ、配列番号２及び３のペプチドを用いたときの結果を示し、いずれも各ペプチドに対する抗体価が上昇することが確認された。
配列番号２又は３のアミノ酸配列を有するペプチドを、ＭＢＳ法（Syed Salman Lateef, et al., " An Improved Protocol for Coupling Synthetic Peptides to Carrier Proteins for Antibody Production Using DMF to Solubilize Peptides", J Biomol Tech.2007 Jul;18(3):173-176.）に基づき、ｍｃＫＬＨ（ｍａｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）とＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）に各々個別に共有結合させたペプチドコンジュゲートを調製した。ｍｃＫＬＨを用いたペプチドコンジュゲートを免疫抗原として、それぞれ３匹ずつのＢＡＬＢ／ｃマウスに１００μｇ／２００μＬ／匹の投与量で腹腔内投与した。アジュバントとしてｓｉｇｍａ ａｄｊｕｖａｎｔ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用した。免疫期間中の経時採血は尾静脈から行い、抗体価はＢＳＡを用いたペプチドコンジュゲート固相化ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法で確認した。より具体的には、１）ＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈した各種ＢＳＡコンジュゲートペプチド溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ９６－ｗｅｌｌイムノプレートに添加し、４℃で一晩固相化した。２）該抗原（ＢＳＡコンジュゲート）溶液を捨て、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０／ＰＢＳ）で２回洗浄後、超純水で５倍希釈したＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク社製）を２５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、２５℃で１時間程度インキュベートすることによってブロッキングを行った。３）ブロッキング溶液を捨て、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄後、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで４，０００－１２８，０００倍希釈したマウス血漿を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、２５℃で２時間インキュベートした。４）血漿溶液を捨て、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄後、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで５，０００倍希釈したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ（ＤＡＫＯ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、室温で１時間インキュベートした。５）抗体溶液を捨て、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄後、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）溶液（ＤＡＫＯ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。６）２５℃で２０分間インキュベート後、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して反応を停止した。７）プレートリーダーで４５０ｎｍ及び６３０ｎｍの吸光度を測定し、４５０ｎｍの吸光度と６３０ｎｍの吸光度の差から抗体価を求めた。その結果を図２に示す。図２のグラフＡ及びＢは、それぞれ、配列番号２及び３のペプチドを用いたときの結果を示し、いずれも各ペプチドに対する抗体価が上昇することが確認された。
＜実施例２＞
更に、免疫後に惹起した抗体のヒトＨｂＡ０への反応性をＥＬＩＳＡで確認した。より具体的には、１）ＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈したヒトＨｂＡ０溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ９６－ｗｅｌｌイムノプレートに添加し、４℃で一晩固相化した。２）該抗原（ヒトＨｂＡ０）溶液を捨て、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０／ＰＢＳ）で２回洗浄後、超純水で５倍希釈したＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク社製）を２５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、２５℃で１時間程度インキュベートすることによってブロッキングを行った。３）ブロッキング溶液を捨て、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄後、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで１，０００倍希釈したマウス血漿を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、２５℃で２時間インキュベートした。４）血漿溶液を捨て、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄後、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで５，０００倍希釈したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ（ＤＡＫＯ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、室温で１時間インキュベートした。５）抗体溶液を捨て、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄後、ＴＭＢ溶液（ＤＡＫＯ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。６）２５℃で２０分間インキュベート後、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して反応を停止した。７）プレートリーダーで４５０ｎｍ及び６３０ｎｍの吸光度を測定し、４５０ｎｍの吸光度と６３０ｎｍの吸光度の差から抗体価を求めた。その結果を図３に示す。図３のグラフＡ及びＢは、それぞれ、配列番号２及び３のペプチドを用いたときの結果を示し、いずれもＨｂＡ０に対する抗体価が上昇することが確認された。
更に、免疫後に惹起した抗体のヒトＨｂＡ０への反応性をＥＬＩＳＡで確認した。より具体的には、１）ＰＢＳで１０μｇ／ｍＬに希釈したヒトＨｂＡ０溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ９６－ｗｅｌｌイムノプレートに添加し、４℃で一晩固相化した。２）該抗原（ヒトＨｂＡ０）溶液を捨て、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０／ＰＢＳ）で２回洗浄後、超純水で５倍希釈したＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク社製）を２５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、２５℃で１時間程度インキュベートすることによってブロッキングを行った。３）ブロッキング溶液を捨て、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄後、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで１，０００倍希釈したマウス血漿を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、２５℃で２時間インキュベートした。４）血漿溶液を捨て、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄後、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで５，０００倍希釈したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ（ＤＡＫＯ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、室温で１時間インキュベートした。５）抗体溶液を捨て、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄後、ＴＭＢ溶液（ＤＡＫＯ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。６）２５℃で２０分間インキュベート後、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して反応を停止した。７）プレートリーダーで４５０ｎｍ及び６３０ｎｍの吸光度を測定し、４５０ｎｍの吸光度と６３０ｎｍの吸光度の差から抗体価を求めた。その結果を図３に示す。図３のグラフＡ及びＢは、それぞれ、配列番号２及び３のペプチドを用いたときの結果を示し、いずれもＨｂＡ０に対する抗体価が上昇することが確認された。
＜実施例３＞
実施例２から得られた個体の脾臓を摘出し、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標） Ｐｌｕｓ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いてＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを抗体遺伝子特異的なプライマーを用いたＰＣＲ反応により増幅し、増副産物をベクターに挿入して抗体遺伝子ライブラリを得た。該ライブラリ及びＨｂＡ０固定化ビーズを用いて、ファージディスプレイ法により２ラウンドのパニングを実施し、ＥＬＩＳＡ法によりＨｂＡ０に特異的に結合する抗体を確認した。ＨｂＡ０に特異的に結合する抗体の配列をそれぞれ細胞発現用ベクターに挿入してＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞にて発現させた後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｃｙｔｉｖａ）カラムを用いて精製し、モノクローナル抗体を得た。
実施例２から得られた個体の脾臓を摘出し、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標） Ｐｌｕｓ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いてＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡを抗体遺伝子特異的なプライマーを用いたＰＣＲ反応により増幅し、増副産物をベクターに挿入して抗体遺伝子ライブラリを得た。該ライブラリ及びＨｂＡ０固定化ビーズを用いて、ファージディスプレイ法により２ラウンドのパニングを実施し、ＥＬＩＳＡ法によりＨｂＡ０に特異的に結合する抗体を確認した。ＨｂＡ０に特異的に結合する抗体の配列をそれぞれ細胞発現用ベクターに挿入してＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞にて発現させた後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｃｙｔｉｖａ）カラムを用いて精製し、モノクローナル抗体を得た。
＜実施例４＞
実施例３から得たモノクローナル抗体のエピトープを以下に従って確認した。表１及び２に示すビオチン化したペプチド１～６６を合成し（ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に委託）、互いに区別可能なビーズ（ルミネックス社製のＬｕｍＡｖｉｄｉｎ（登録商標） Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）に固定化した。各ペプチド固定化ビーズを５００個ずつポリプロピレン製マイクロプレートの各ウェルに加え、終濃度１μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を加えた。マイクロプレートを３７℃で１時間インキュベートした後、磁気スタンドを用いて上清を除去し、マイクロプレートを洗浄した。検出用の抗体として、Ｒ－フィコエリスリン標識したヤギ抗マウスＩｇＧを加え、３７℃で１時間インキュベートした。磁気スタンドを用いて上清を除去し、マイクロプレートを洗浄した後、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘを用いてＲ－フィコエリスリンの蛍光を測定した。図４のグラフＡ及びＢは、それぞれ、配列番号２及び３のペプチドを用いたときの結果を示し、配列番号２はヒトヘモグロビンβ鎖の１５番目から２９番目のアミノ酸を含むペプチド（ペプチド１～２９）に対して、配列番号３はヒトヘモグロビンβ鎖の３７番目から６６番目のアミノ酸を含むペプチド（ペプチド２３～６６）に対して、これら以外のアミノ酸を含むペプチドと比べて格段に多くの抗体が結合していることが確認された。この結果から、各モノクローナル抗体は、ヒトヘモグロビンβ鎖の１５～２９番目のアミノ酸領域または、３７～６６番目のアミノ酸領域を特異的に認識することが示唆された。
実施例３から得たモノクローナル抗体のエピトープを以下に従って確認した。表１及び２に示すビオチン化したペプチド１～６６を合成し（ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に委託）、互いに区別可能なビーズ（ルミネックス社製のＬｕｍＡｖｉｄｉｎ（登録商標） Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）に固定化した。各ペプチド固定化ビーズを５００個ずつポリプロピレン製マイクロプレートの各ウェルに加え、終濃度１μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を加えた。マイクロプレートを３７℃で１時間インキュベートした後、磁気スタンドを用いて上清を除去し、マイクロプレートを洗浄した。検出用の抗体として、Ｒ－フィコエリスリン標識したヤギ抗マウスＩｇＧを加え、３７℃で１時間インキュベートした。磁気スタンドを用いて上清を除去し、マイクロプレートを洗浄した後、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘを用いてＲ－フィコエリスリンの蛍光を測定した。図４のグラフＡ及びＢは、それぞれ、配列番号２及び３のペプチドを用いたときの結果を示し、配列番号２はヒトヘモグロビンβ鎖の１５番目から２９番目のアミノ酸を含むペプチド（ペプチド１～２９）に対して、配列番号３はヒトヘモグロビンβ鎖の３７番目から６６番目のアミノ酸を含むペプチド（ペプチド２３～６６）に対して、これら以外のアミノ酸を含むペプチドと比べて格段に多くの抗体が結合していることが確認された。この結果から、各モノクローナル抗体は、ヒトヘモグロビンβ鎖の１５～２９番目のアミノ酸領域または、３７～６６番目のアミノ酸領域を特異的に認識することが示唆された。
Claims (6)
- 配列番号１で示されるヒトヘモグロビンβ鎖のアミノ酸配列における、
（ａ）１５～２９番目、又は
（ｂ）３７～６６番目
のアミノ酸領域に結合する、抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。 - 配列番号１で示されるヒトヘモグロビンβ鎖のアミノ酸配列における、
（ａ１）１５～２８番目、又は
（ｂ１）３７～６４番目
のアミノ酸領域に結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。 - 配列番号１で示されるヒトヘモグロビンβ鎖のアミノ酸配列における、
（ａ２）１５～２６番目、又は
（ｂ２）３８～６１番目
のアミノ酸領域に結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。 - 請求項１～３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いて、免疫学的測定法により試料中のヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンを検出することを含む、
試料中のヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法。 - 請求項１～３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、ヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンの検出キット。
- 配列番号２又は３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなる、ペプチド。
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|---|---|---|---|
| JP2022-062356 | 2022-04-04 | ||
| JP2022062356 | 2022-04-04 |
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|---|---|
| WO2023195347A1 true WO2023195347A1 (ja) | 2023-10-12 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2023/011456 WO2023195347A1 (ja) | 2022-04-04 | 2023-03-23 | 抗ヒトヘモグロビンβ鎖モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片、ヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンを検出する方法、ヒトヘモグロビン及び／又は糖化ヒトヘモグロビンの検出キット、並びに、ペプチド |
Country Status (1)
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|---|---|
| WO (1) | WO2023195347A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010067611A1 (ja) * | 2008-12-11 | 2010-06-17 | 積水メディカル株式会社 | ヘモグロビンβ鎖のＮ末端領域に対する抗体 |
| WO2014112318A1 (ja) * | 2013-01-16 | 2014-07-24 | 富士レビオ株式会社 | 検体中のヘモグロビンA1cの免疫測定方法 |
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2023
- 2023-03-23 WO PCT/JP2023/011456 patent/WO2023195347A1/ja unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010067611A1 (ja) * | 2008-12-11 | 2010-06-17 | 積水メディカル株式会社 | ヘモグロビンβ鎖のＮ末端領域に対する抗体 |
| WO2014112318A1 (ja) * | 2013-01-16 | 2014-07-24 | 富士レビオ株式会社 | 検体中のヘモグロビンA1cの免疫測定方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| KAZIM, A. LATIF ET AL.: "Prediction and Confirmation by Synthesis of Two Antigenic Sites in Human Haemoglobin by Extrapolation from the Known Antigenic Structure of Sperm-Whale Myoglobin", BIOCHEM. J., vol. 167, 1977, pages 275 - 278, XP009549174 * |
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