KR20110126742A

KR20110126742A - 비타민 ｄ를 검출하기 위한 어세이 및 항체

Info

Publication number: KR20110126742A
Application number: KR1020117023324A
Authority: KR
Inventors: 마가렛 롤러; 데이빗 프릿차드; 머도 블랙; 라즈 오닝
Original assignee: 액시스 쉴드 다이아그노스틱스 리미티드
Priority date: 2009-03-02
Filing date: 2010-03-02
Publication date: 2011-11-23
Also published as: GB0903469D0; WO2010100487A1; AU2010220215A1; CN102333790A; EP2403876A1; CA2753756A1; US20120064533A1; JP2012519208A

Abstract

본 발명은 holo-DBP를 인식하지만, apo-DBP는 인식하지 않거나 apo-DBP에 상대적으로 더 낮은 친화력을 갖는 것을 특징으로 하는 분자에 관한 것이다.

Description

비타민 Ｄ를 검출하기 위한 어세이 및 항체 {AN ASSAY FOR DETECTING VITAMIN D AND ANTIBODIES THEREFOR}

본 발명은 비타민 D를 측정하는 것, 특히 비타민 D 결합 단백질을 갖는 복합체에서, 비타민 D를 측정하는 것과 관련된다.

동물들에서, 비타민 D는 주로 혈액에 칼슘 및 인산의 순환레벨을 유지하기 위해 작용하며, 생체내에서, 다른 일반적인 세포기능뿐만 아니라, 골의 광화(bone mineralization), 근육의 수축 및 신경전도와 같은 특성/과정에 영향을 미치는 물질이다. 이와 같이, 비타민 D 농도의 변화는 골질환, 타입II 당뇨 및 암과 같은 다양한 의료 상태와 연관될 뿐만 아니라, 근육의 기능 및 면역, 신경, 심장 및 순환계통에 영향을 줄 수 있다.

비타민 D는 다양한 형태로 발견되고, 비록 그 용어가 넓게 대사물질, 유도체 및 이 물질들의 다른 유사체뿐만 아니라, 관련된 지용성 분자들의 종류를 나타내는 것으로, 당업자에 의해 인식되어질지라도, 비타민 D의 주요 2가지 형태는 D₂ 및 D₃로 생각된다. 따라서, 이하에서 비타민 D는 당해 기술분야에서 비타민 D로서 넓게 언급/묘사되는 것, 및/또는 공통적으로 알려진 분자그룹의 모든 구성들을 나타내기 위해 사용될 것이다.

비타민 D는 햇빛의 작용을 통해, 피부에서 광화학적으로 생산되거나 음식으로 얻어질 수 있다. 비타민 D₂는 동물에 의해 합성되지지 않는 것으로 알려져 있으며, 균류(fungal) 및 식물의 섭취에 의해 얻어질 수 있다. 마찬가지로, 비타민 D₃는 육식을 통해 동물에 의해 얻어지거나, 상기 언급한 바와 같이, 피부에서 새로 만들어져(de novo) 합성될 수 있다. 그러나, 이와 관계없이, 비타민 D는 주로 생체내에서 25히드록시비타민 D(25 hydroxyvitamin D)(이하에서는 25(OH)D라 한다)의 형태로 저장되며, 25(OH)D는 간에서 비타민 D의 히드록실화(hydroxylation)에 의해 생산된다. 25(OH)D는 혈액에서 발견되는 비타민 D의 주요 형태이며, 신장에서 주로 생상되는 비타민 D의 생리적 활성형태인 1,25디히드록시비타민 D(이하에서는 1,25(OH)₂D)라 한다)의 전구체이다. 1,25(OH)₂D는 비타민 D 수용기(VDR)에 결합하며, 상기 결합이 이루어지면, 그 다음에, 빠른 게놈반응 및 장기적인 게놈반응 둘다에 영향을 줄 수 있다.

비타민 D의 생물학적 활성형태는 장(intestine), 뼈(bone) 또는 신장과 같은타겟세포에서, 비타민 D 수용기(VDR)에 결합함으로써, 기능한다. 비타민 D는 물에서 잘 용해되지 못 하므로, 혈액에서 비타민 D의 타겟세포로 비타민 D의 운반이 가능하게 하기 위하여, 그룹스페시픽컴포넌트(Gc) 또는 비타민 D 결합 단백질로 알려진 용해가능한 52kDa 캐리어 단백질과 복합하여 결합된다. 비타민 D와 결합한 단백질은 변종을 포함하지만, 1S, 1F 및 2형태에 제한되지 않는다. 이하에서는, 그룹스페시픽컴포넌트(Gc) 또는 비타민 D 결합 단백질과 같은 당해 기술분야에서 알려진 모든 변종들을 포함하는 단백질 그룹은 DBP로서 언급되어질 것이다.

DBP 농도는 보통 혈액에서 비타민 D 농도의 20배이며, DBP가 비타민 D에 대해 매우 높은 결합친화력을 가지므로, 대부분의 혈액 비타민 D는 DBP에 결합된 상태(bound)에서 발견된다. 이하에서, 비타민 D-DBP 복합체는 holo-DBP로 언급된다.

결합 활성에 관하여, DBP는 다음의 상대적 친화력을 갖는 비타민 D의 형태/대사물질에 결합한다: 25 하이드록시비타민 D (25(OH)D) = 24,25 디하이드록시비타민 D(24,25(OH)₂D) > 1,25 디하이드록시비타민 D (1,25(OH)₂D) > 콜칼시페롤(cholcalciferol)

순환 25(OH)D 중에서 90%이상은 보통 DBP에 결합(bound)된 상태로 발견되며, 인간혈청알부민(human serum albumin,HSA)과 같은 다른 단백질들은 25(OH)D에 결합하는 것이 나타난 적이 있지만, 그것은 상당히 낮은 친화력을 갖는다.

건강에 관한 광범위하고 상당한 영향을 고려해 볼 때, 생체내에서 비타민 D레벨을 쉽고 정확하게 측정하기 위한 분명한 의학적 요구가 있다.

체액에서 측정될 수 있는 비타민 D의 2가지 주요형태는 25(OH)D와 1,25(OH)₂D이다. 상기에서 언급한 바와 같이, 25(OH)D는 보통 1,25(OH)₂D보다 혈액에서 더 높은 농도로 발견된다. 또한, 25(OH)D는 상대적으로 긴 반감기를 갖기 때문에, 보통 개인의 비타민 D 상태를 모니터하고, 평가하기 위해 측정된다. 게다가, 활성형태의 비타민 D이기 때문에, 1,25(OH)₂D의 혈장/혈청 레벨이 일정한 레벨에서 유지되는 경향이 있다. 그래서, 25(OH)D 레벨은 개인의 전체 순환 비타민 D 상태에 대한 더 나은 지표이다. 그러나, 1,25(OH)₂D의 레벨을 결정하는 것은 신장에서 활성형태의 화합물의 적절한 생산이 있는지에 대한 지표로서 역할을 한다.

타겟의 레벨을 알아내려고 할 때에는, 직접적으로 이를 측정하는 것이 관례이다. 따라서, 비타민 D 레벨을 결정하기 위한 현재의 어세이는 비타민 D 레벨을 측정하기 전에, 비타민 D가 초기에 그것의 DBPs로부터 분리되는 것이 필요하며, 여기서, 비타민 D는 수용성 매체에 잘 용해되지 않는다. 이러한 분리는 DBPs를 변성하고, 제거하거나 비타민 D를 얻기 위해 치환제를 사용하고, 이후에 그 결과로 생긴 프리 비타민 D를 측정함으로써, 이루어질 수 있다. DBPs의 분리를 위한 요건은 모든 비타민 D 어세이에서 이런 단계의 혼합을 명백하게 필요로 하며, 따라서, 어세이 실행의 복잡성과 시간을 증가시킨다.

비타민 D의 소수성 때문에, 예를 들면, 현재 어세이 기술은 비타민 D를 얻고, DBP를 변성시키기 위해, 용매를 사용한다. 이러한 접근은, 비타민 D의 내용물이 평가되기 전에, 용매의 추출 및 변성된 DBP의 추가분리를 필요로 한다.

더욱이, 현재 비타민 D레벨의 평가방법은, 개별 기술에 있어서나, 다른 어세이와 비교했을 때, 심각한 가변성의 문제가 있는 것으로 보고된다. 프로세스의 복잡성이 증가함에 따라서, 신뢰도와 같은 이슈들이 도전이상의 것이 된다. 부정확한 레벨은 고감도 어세이에서 매우 중요하게 되고, 기존 공정(비타민 D 이동, 액체의 첨가 및 제거, 그리고 멀티세척단계를 포함)의 다단계 특성때문에, 실수가 쌓이고, 이에 따라, 정확성이 떨어진다. 따라서, 더 낮은 부정확성을 제공할 것같은 간소화된 비타민 D 어세이를 필요로 한다.

이 이슈들을 설명하기 위해, 본 발명은 선행기술과 연관된 문제를 극복하려고 한다.

본 발명은 종래에 비해, 더 빠르고, 정확하게, 유익하게 비타민 D의 레벨을 측정하면서도, 간소화된 비타민 D를 검출하기 위한 어세이 및 항체를 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 첫번째 측면에 따르면, holo-DBP를 인식하지만, apo-DBP(또한, DBP 또는 결합없는 DBP로 알려진)는 인식하지 않거나 그것(apo-DBP)에 상대적으로 더 낮은 친화력(relatively low affinity)을 갖는 분자가 제공된다. 예를 들면, 상대적으로 낮은 친화력은 apo-DBP에 대한 교차반응성(cross-reactivity)이 10%미만이거나 바람직하게는 1%미만을 나타내는 분자로 표현될 수 있으며, 상기 분자는 apo-DBP 위의 holo-DBP에 우선적으로 결합한다.

이 인식분자(recognition molecule)는 정확하고 효율적으로 holo-DBP와 apo-DBP를 구별할 수 있을 것이다. 이 때문에, 샘플(조직 샘플 또는 체액 등)에서, 비타민 D를 검출하기 위한 테스트에서 이 분자의 사용이 가능하다. 이와 같이, DBP의 holo 및 apo형태의 선택적 결정을 허용함으로써, 본 발명은 기존의 절차에 의해 얻어지는 것보다, 더 정확하고, 빠르고, 유용하게 비타민 D레벨의 타겟측정을 수행한다.

인식분자는 주로 비타민 D를 인식할 수 있으나, holoDBP와 교차반응하여, holoDBP가 인식된다. 이런 이유로, 이 명세서에서, "인식(recognition)"(또는 그 모든 파생어(예를 들면, recognise))이라는 단어의 사용은 주요한 인식, 교차반응 또는 모든 부차적이거나 그뒤의 인식형태를 포함하는 것으로 간주된다. "인식분자"라는 용어는 모든 방식에서, 상호작용하거나 타겟과 결합되는 분자들을 포함하는 것으로 이해될 것이다.

바람직하게는, 상기 언급된 인식분자는 holo-DBP를 포획하거나 농축시키거나 분리시키거나 검출하기 위해 사용될 수 있다.

바람직하게는, 인식분자는 결합되지 않은 상태(unbounded)의 비타민 D를 인식하지 않는다. 대안으로, 인식분자는 샘플에서 holo-DBP와 함께 결합되지 않은 상태의 비타민 D를 인식할 수 있다.

바람직하게는, 인식분자는 25(OH)D 등의 비타민 D의 특정 변이주로 선택성을 표현할 수 있다.

바람직하게는, 인식분자를 발생시키고, 테스트하기 위해 사용되는 DBP는 혼합된 형태의 DBP이다. 즉, DBP는 단백질의 유전자변이주(genetic variants) 혼합물을 포함한다. 그 대신에, DBP는 DBP의 특정 유전자변이주가 될 수 있다.

편의상, 상기 언급된 인식분자는 holo-DBP에 대한 친화력을 갖는 항체(예를 들면, 단일클론 항체), 항체단편(예를 들면, F(ab), F(ab’)2, F(v), scFv), 단백질, 분자각인고분자(molecular imprint polymer,MIP), 상보성 결정영역(complementarity determining region,CDR), 올리고펩티드(oligopeptide), 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)(예를 들면, 압타머(aptamer)) 또는 작은 유기화학물질로부터 선택된다.

선택적으로, 상기 인식분자는 신호요소(signal component)를 포함하며, 상기 요소(component)는 방위성동위원소(radioisotope), 형광단(fluorophore), 발색단(chromophore), 결합한 리간드 또는 효소 기질이며, 그 결과, 상기 신호요소는 상기 조성물의 검출을 가능하게 한다. 인식분자에 결합될 수 있는 신호분자의 예들은, 홀스래디쉬(horseradish), 페록시다아제(peroxidase), 말산탈수소효소(malate dehydrogenase), 포도상구균뉴클레아제(staphylococcal nuclease), 델타-5-스테로이드 이성질체화효소(delta-5-steroid isomerase), 효모 알코올탈수소효소(yeast alcohol dehydrogenase), 알파-글리세로인산탈수소효소(alpha-glycerophosphate dehydrogenase), 3탄당인산이성질화체화효소(triose phosphate isomerase), 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase), 아스파라기나아제(asparaginase), 글루코스산화효소(glucose oxidase), 베타갈락토시다제(beta-galactosidase), 리보뉴클에아제(ribonuclease), 우레아제(urease), 카탈라아제(catalase), 포도당-6-인산탈수소효소(glucose-6-phosphate), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 및 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholine esterase)과 같은 효소, 아크리디늄에스터(acridinium ester), 적합한 형광표지화합물(fluorescent labelling compounds)과 같은 화학발광 화합물(chemiluminescent compounds)이지만, 이에 한정되지는 않는다. 적합한 형광표지화합물은, 플루오레세인이소티오시안산염(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 홍조소(phycoerythrin), 남조소(phycocyanin), 이질남조소(allophycocyanin), o-프탈알데히스(o-phthaldehyde) 및 플루오레사민(fluorescamine)를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 여기서 설명된 인식분자와 경합한 분자가 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 샘플에서 비타민 D를 검출하는 검출방법을 제공한다. 검출방법은 본 발명의 분자와 샘플을 접촉하는 단계와 샘플에 존재하는 비타민 D의 양을 결정하는 결정단계를 포함한다.

이 방법은, 비타민 D 레벨을 결정할 때, DBPs로부터 비타민 D의 분리를 필요로 하지 않으므로, 더 빠르고, 더 간단하게 비타민 D의 측정을 수행한다. 샘플에서 holo-DBP의 양은 비타민 D의 양과 직접적인 관계를 가질 것이다.

또한, 검출방법은 사용되는 인식분자에 따라, 비타민 D의 다른 형태를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 비타민 D 제조과정에서, 신장기능이 평가될 예정이라면, 1,25(OH)₂D에 대한 인식분자가 사용될 수 있다. 또는 혈액에서 비타민 D의 양이 평가될 예정이라면, DBP에 결합하는 모든 비타민 D를 인식하는 일반적인 인식분자가 사용되거나 DBP에 결합하는 혈액에서 비타민 D의 주요 형태인 25(OH)D를 인식하는 일반적인 인식분자가 사용될 수 있다.

편의상, 샘플은 모든 조직샘플 또는 체액이 될 수 있으며, 바람직하게는, 혈액, 혈청 또는 혈장이 될 수 있다.

이런 방법은 매우 다양한 다른 방식으로 수행될 수 있으며, 다른 원칙에 의할 수 있는 것으로 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들면, 사용되는 인식분자는 샘플의 나머지로부터 holo-DBP의 분리가 가능하도록 고정화시키거나 고정화시킬 수 있다. 상기 인식분자가 고정화된다면, 직접적 또는 간접적으로, 액체 크로마토그래피에서 사용하기 위한 필터 또는 튜브벽 또는 추가예로 지지대 또는 매트릭스(컬럼에 로드될 수 있는)와 같은 고체표면과 결합될 수 있다. 인식분자가 고정화될 수 있다면, 이것은 특정 결합 파트너쉽을 가진 멤버(a member of a specific binding partnership)(예를 들면, 비오틴(biotin)/스트렙타아비딘(streptavidin))에 분자를 결합함으로써 이루어질 수 있다. 그 후에, 샘플의 나머지로부터 분자를 고정화하거나 뭉치기 위해 상기 파트너쉽의 다른 멤버를 사용함으로써, 이루어질 수 있다.

당업자는 상기 검출방법이 가능한 경쟁력있거나 대체 어세이로서 수행될 수 있는 것으로 이해할 것이다. 예를 들면, 인식분자(즉, holo-DBP 경합분자)에 결합하기 위해 holo-DBP와 경합하는 분자가 사용될 수 있으며, 상기 분자는 선택적으로 표시될 수 있다. 더욱이, holo-DBP 인식분자 및/또는 holo-DBP 인식분자 복합체와 상호작용하는 추가분자는 또한 본 발명의 특정 실시예에서 사용될 수 있는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명의 다양한 실시예에서, 인식분자 및/또는 holo-DBP 경합분자를 측정하는 것이 바람직하다. 인식분자, holo-DBP 경합분자 중 하나 또는 둘다는 용액에서 고정화되거나 침전될 수 있다. 다음 실시예에서, 적당하게 표시된 holo-DBP와 경합하는 분자와 적당하게 표시된 인식분자 사이의 공간적 상호작용을 측정하는 것은 용이하다.

넓은 범위의 검출 기술이 본 발명의 다른 실시예들에서 이용될 수 있다. 질량분석법(mass spectrometry) 또는 HPLC와 같은 직접적인 측정이 사용될 수 있다. 또는, 편의상 사용된 요소(component)는 신호분자 또는 표시에 결합될 수 있다. 예를 들면, 요소는 발광성(luminescent), 화학발광성(chemiluminescent), 방사성(radioactive), 형광성(fluorescent)을 갖는 비색검출(colorimetric detection)에 적합한 결합단백질, 에피톱(epitode) 또는 효소 또는 기질이다. 게다가, 방사성 식별표시 또는 전기화학적 표시가 선택적으로 요소에 포함될 수 있다. 실제로, 본 기술분야에 알려진 모든 신호분자 또는 표시는 가능한 본 발명의 실시예에 포함될 수 있다.

당업자는 본 발명의 검출방법이 다양한 시스템에서 사용될 수 있음을 알 것이다. 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance), 표면 음향파(surface acoustic wave) 및 수정진동자저울(quartz crystal microbalance) 방법론과 같은 직접적인 어세이 포맷뿐만 아니라, 동위원소표시 단세포군항체 어세이(radioimmunometric assays,IRMA), 효소결합면역흡착 어세이(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 마이크로입자 효소면역 어세이(microparticle enzyme immunoassays), 면역침강법(immunoprecipitation) 및 액체 크로마토그래피이다.

편의상 인식분자는 비드(bead)와 같은 마이크로입자나 마이크로타이터 플레이트(microtitre plate)상에 고정된다. 상기 비드는 라텍스, 폴리스티렌, 실리카 및/또는 킬레이팅 세파로오스(chelating sepharose)을 포함하며, 자성이 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 명세서에서 설명된 인식분자를 사용하여, apo-DBP로부터 holo-DBP를 분리하는 방법이 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 비타민 D의 검출방법 또는 상기 설명된 apo-DBP로부터 holo-DBP를 분리하는 방법을 위해 본 명세서에서 설명된 분자를 포함하는 키트가 제공될 수 있다.

본 발명은 다음의 제한없는 예들에 의해 묘사될 것이다. 다음의 예들에서, holo-DBP는 25-OH-D₃의 복합체(머크화학 사의 카탈로그 NO.679102로부터 얻어짐) 및 혼합 형태의 DBP(머크화학 사의 카탈로그 NO.345802로부터 얻어짐)이지만, 동등하게, 모든 비타민 D 형태의 복합체 및 모든 DBP형태, 비타민 D의 특정형태 및 DBP의 불특정형태 또는 비타민 D의 불특정형태 및 DBP의 특정형태와 관련될 수 있다.

본 발명에 의하면, 종래에 비해, 더 빠르고, 정확하게, 유익하게 비타민 D의 레벨을 측정하면서도, 간소화된 비타민 D를 검출하기 위한 어세이 및 항체를 제공할 수 있는 장점이 있다.

본 발명은 첨부한 도면에 의하여 설명될 것이다:
도 1은 골수종세포(myeloma cell)를 갖는 비장세포(spleen cell)를 생산하는 초기 항체융합후에, holo-DBP와 apo-DBP에 대한 holo-DBP 항체의 분별결합(differential binding)을 나타낸다.
도 2는 첫번째 한계희석 후에, holo-DBP(1㎍/mL) 및 apo-DBP(1㎍/mL)에 대한 holo-DBP 항체의 분별결합을 나타낸다.
도 3은 두번째 한계희석 후에, holo-DBP(1㎍/mL) 및 apo-DBP(1㎍/mL)에 대한 holo-DBP 항체의 분별결합을 나타낸다.
도 4는 셀렉스 프로세스(SELEX process)를 나타낸다.

실험예 1

단일클론항체의 준비

holo-DBP(DBP에 복합된 비타민 D)에 대한 마우스의 단일클론항체가 쾰러와 밀스타인(G. Kohler and C. Milstein Nature, 1975256, 495) 방법의 변형에 의해 준비된다. 암컷 BaLb/C 마우스는 비결합 holo-DBP(마우스당 50㎍)의 피하주사(subcutaneous injection)에 의해 면역력을 갖게 된다.

면역원은 완전프로인트항원보강제(complete freund's adjuvant)가 주어진다. 불완전프로인트항원보강제가 주어진 추가항원들은 항체반응을 향상시키기 위해 주어진다(마우스당 부스트(boost)당 20㎍).

면역반응은 holo-DBP에 대한 고상면역측정법(solid phase immunoassay)에 의해 조사된다. 마우스는 마우스의 골수종세포(myeloma cell)와의 융합 및 비장세포(spleen cell)의 획득이전에 4 또는 5부스트(boosts)가 주어진다.

비장 림프구와 골수종세포의 융합

면역성있는 마우스 비장세포들은 PEG의 존재하에서, NSO 마우스 골수종세포들과 융합된다. 세포들은 좋은 배양접시에서 파종되며, 선택적 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 배지의 존재하에서 자라게 된다. 선택적 HAT 배지는 융합된 비장 및 골수종 세포의 선택을 수행한다. 융합된 세포들로부터 형성된 상청액(Supernatants)은 표준고상면역측정법 기술에 의해, holo-DBP 및/또는 apo-DBP에 대한 반응성을 테스트한다. (다음 실험예에 나타난다)

복수유체로부터 면역글로불린 부분의 분리

복수(ascites)유체로부터 면역글로불린 부분(fraction)을 분리시키기 위하여, 포화암모늄설페이트용액을 동일한 양으로 첨가함으로써, 4℃에서 복수유체로부터 유체 면역글로불린 부분이 먼저 침전된다. 침전물은 원심분리된 후에, 오리지널 복수 유체의 양과 동일한 양의 표준트리스완충액에서 용해되며, 그 후에, 같은 트리스완충액에 대해 투석된다. 면역글로불린 용액은 모노 Q 컬럼 및 염도구배를 사용하여 더 정제된다. 이는 면역글로불린을 녹여서 분리하기 위함이다. 그 후에, 면역글로불린 부분은 항원에 대한 면역반응을 테스트한다.

실험예 2

다중클론성 항혈청(polyclonal antisera)

holo-DBP에 대한 다중클론성 항혈청이 Methods in Enzymology(H.Van Vunatis and J.J. Langone (Eds) 1981, (729b) and 1983, 92(E))에서 설명된 방법에 따라 holo-DBP를 사용한 양 또는 토끼에서 증가될 수 있다. 또한, 본 기술분야에서 알려진 다른 종들은 다중클론성 항체를 발생시키기 위해 사용될 수 있다.

holo-DBP에 선택적인 다중클론성 항체는 친화정제(affinity purification)와 같은 당업자에게 친숙한 기술을 사용하여 분리될 수 있다. 예를 들면, 다중클론성 항혈청은 holo-DBP로 코팅된 고체상태로 배양될 수 있으며, 그 후에, 고체상태로 결합되지 않은 다중클론성 항혈청 물질은 holo-DBP에 결합할 수 있는 분자만을 남긴채로 씻겨져 버릴 수 있으며, 다중클론성 항혈청 자신이 무질서 이온(chaotropic ions)의 사용을 포함하는 많은 기술들에 의해 고체상태로부터 릴리스될 수 있다.

그 후에, 릴리즈된 항체는 apo-DBP로 코팅된 고체상태로 배양될 수 있으며, 따라서, apo-DBP상의 holo-DBP에 대한 특이성(specificity)을 보이는 그들의 항체만이 용액에 남는다.

실험예 3

파지표시 라이브러리의 패닝(Panning of Phage Display Library)

앞서 언급된 DBP에 복합되지만 비타민 D 또는 단독 DBP를 인식하지 못 하는 결합비타민 D의 특성을 갖는 항체를 선별하는 것은 파지의 표면상에서, 결합 면역글로불린 라이브러리를 사용하여 수행된다.

이는 바바스 C.F.와 레어너가 쓴 파지표면상의 결합 면역글로불린 라이브러리(phabs)(R.A (1991))에 설명되어 있다. 또한, 항원-특정 Fabs.의 빠른 선택. 방법: 효소학에서의 방법에 동반자 2: 119-124에 설명되어 있다.

(Barbas C.F. and Lerner, R.A. (1991) Combinatorial immunoglobulin libraries on the surface of phage (phabs). Rapid selection of antigen-specific Fabs. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2: 119-124.)

원하는 항체를 나타내는 파지는 "파지패닝"에 의해 선택된다. 파지패닝은 고상면역분석법과 유사한 기술이다. holo-DBP는 마이크로타이터 플레이트(microtitre plate), 비드, 자성 비드, 컬럼과 같은(그러나, 이에 한정되지 않는다) 고체표면상에 고정된다.

그 후에, 파지가 첨가되며, holo-DBP와 상호작용이 이루어진다. 모든 상호작용이 없는 물질을 제거하기 위해 세척한 후에, 결합파지는 녹여서 분리되며, 새로운 박테리아 호스트 세포에 복제됨으로써 증식된다.

holo-DBP에 대한 항체의 선택성을 향상시키기 위해, holo-DBP와 상호작용할 때, 증가된 농도의 apo-DBP가 파지용액에 첨가된다. 이 선택과정은 holo-DBP를 결합하는 항체만을 표현하는 파지의 개체군을 선택하기 위해 여러번 반복된다.

다음으로, 항체유전자가 분리되며, 용해성있는 항체단편들을 생산하기 위해 발현벡터(expression vector)에 투입된다. 항체유전자는 파지외피단백질없이 발현되어야만 한다. 이것은 표준중합효소 연쇄반응(polymerise chain reaction,PCR) 증폭 또는 제한효소를 이용함으로써, 이루어질 수 있다. 여기서, L사슬 및 H사슬에 대한 팹(Fab)유전자는 분리되며, 새로운 벡터로 복제된다. 팹단편들은, 인산완충식염수(phosphate buffered saline,PBS)에서, 5㎍/mL로 플레이트상에 덮힌 apo 또는 holo-DBP 중 하나에 대한 분별결합이 테스트된다. 팹들은 PBS에서, 0.1㎍/mL 또는 2㎍/mL 중 하나의 농도로 측정된다.

단일클론항체를 생산하기 위해, 벡터-팹 유전자는 새로운 호스트로 변형되고, 단일클론으로 분리된다. 각각의 클론들이 분리되고, 항체발현이 유도된다. 그리고 세포용해에 의해 단일클론항체의 다음 배출이 있으며, 그 용해물은 holo-DBP에 대한 항체의 존재에 대하여, 효소결합면역흡착 어세이(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)에 의해 테스트된다.

실험예 4

항체결합어세이 및 클론선택

NUNC 맥시솝 플레이트(maxisorb plates)는 pH가 9.5인 탄산완충액(carbonate buffer)에서, 1㎍/mL 농도인 holo 또는 apo-DBP 중 하나의 웰(well)당 100㎕로 하룻밤동안 코팅된다. 다음 날, 코팅하는 혼합물은 버려지고, 플레이트는 상온에서 60분동안 BSA(pH가 7.5인 인산완충식염수 2mg/mL)로 블록(block)된다. 플레이트는 한 번 PBS+0.1% 트윈(tween) 20(PBST)으로 세척된다. 샘플, 즉, PBS에서 희석된 블리드/셀(bleed/cell) 상청액 물질은 상온에서 60분동안, holo 또는 apo-DBP 중 하나로 배양된다.

또한, 증가한 과농도(즉, 적당한 단백질 코팅농도에 비하여, 10 내지 100폴드 초과, 즉, 샘플당 1㎍ 내지 10㎍)에서, holo-DBP(apo-DBP가 아닌)에 대한 특정항체의 선택을 이끌어내기 위하여, 웰 코팅된 holo-DBP에서, 배양이전에, 1시간의 사전배향동안, Apo-DBP(즉, DBP가 결핍결합된 비타민 D)가 항체용액에 첨가될 수 있다.

그 후에, 상청액은 버려지며, 플레이트는 PBST으로 3번 세척된다. PBS에서 1:5000비율로 희석하여 사용되는 2차항체(겨자무과산효소(horseradish peroxidase)에 접합되는 염소의 항-마우스 항체(goat anti-mouse antibody), Bio-Rad 카탈로그 No. 170-6516)는 상온에서 60분동안 플레이트에 배양된다.

그 후에, 플레이트는 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine,TMB) 기질(바이오판다 진단법(Biopanda Diagnostics)의 카탈로그 No. TMB Solution II)으로부터 얻어진)이 첨가되기 전에, PBST로 3번 세척된다.

반응은 2M H₂SO₄첨가됨으로써 중단된다. 450nM에서 샘플의 흡광도/광학밀도 판독은 분광광도계로 측정된다. 도 1은 골수종세포(myeloma cell)를 갖는 비장세포(spleen cell)를 생산하는 초기 항체융합후에 생산된 하나의 실험세트로부터 holo-DBP와 apo-DBP에 대한 항체의 일반적인 분별결합을 나타낸다. 표 1은 apo-DBP를 갖는 holo-DBP 항체 상청액의 교차반응성을 나타낸다.

융합 클론 (Fusion Clones)	apo-DBP를 갖는 교차반응성
1B5	84.2%
1B9	78.0%
2F12	77.0%
4E1	73.1%
10A12	33.9%

표 1. 융합후에 확인된 클론에 대하여, apo-DBP를 갖는 holo-DBP 항체의 교차반응성

apo-DBP상의 holo-DBP에 대해 더 큰 특이성을 나타내는 모든 웰들(샘플)이 더 선별된다. 항체생산세포들을 생산하는 모든 웰들로부터의 샘플은 표준 한계희석 클로닝 절차를 적어도 2회 실시함으로써, 제거되고, 복제된다. 각 회의 한계희석후에, 클론 상청액은 apo-DBP상의 holo-DBP에 대해 더 큰 특이성을 보이는 항체의 발현을 위해, 상기에 표시된 바와 같이, 테스트된다.

1회 및 2회 실시후에, holo-DBP와 apo-DBP에 대한 holo-DBP항체클론의 분별결합을 위한 실험 1세트로부터의 결과가 도 2 및 도 3에 나타난다. 한계희석에 대해 apo-DBP를 갖는 holo-DBP항체 상청액의 교차반응성이 각각 표 2 및 표 3에 나타난다. (표 2는 도 2의 샘플과 관련되며, 표 3은 도 3의 샘플과 관련된다.)

첫번째 한계희석 클론	apo-DBP를 갖는 교차반응성
1B5 1G5	5.7%
2F12 1G3	3.7%
2F12 1G4	17.8%
10A12 1C8	5.3%
10A12 2F5	0.9%
10A12 2H10	3.7%

표 2. 첫번째 한계희석클론에 대하여, apo-DBP를 갖는 holo-DBP 항체의 교차반응성

두번째 한계희석 클론	apo-DBP를 갖는 교차반응성
10A12 2F5 1G5	7.3%
10A12 2F5 1G6	4.4%
10A12 2F5 2B12	8.1%
10A12 2F5 2C5	1.6%
10A12 3C8 1B3	13.8%

표 3. 두번째 한계희석클론에 대하여, apo-DBP를 갖는 holo-DBP 항체의 교차반응성

또한, mRNA항체는 클론셀펠렛(clone cell pellets)으로부터 분리될 수 있다. mRNA는 역전사효소(reverse transcriptase)를 사용하여 cRNA로 변환된다.

단일클론항체 DNA의 가변성 H-사슬 및 L-사슬 영역을 둘다 증폭시키기 위해, 가변성 도메인 프라이머를 사용하는 PCR 반응이 수행될 수 있으며, 가변성 H-사슬 및 L-사슬(scFv) 또는 항체의 팹단편들(이들 항체단편으로 한정되지 않음)이 대장균, 효모, 포유류세포라인 또는 표준 분자생물학 기술을 사용하는 본 기술분야에서 알려진 또다른 발현시스템에서 발현될 수 있다.

가변성 H-사슬 및 L-사슬 사이의 링커길이의 조작은 다중결합(예를 들면, 이량체, 삼량체로 제한되지 않는) scFv(단일사슬 가변성 단편, Single-chain variable fragment) 항체단편의 발현을 위해 선택되는데 사용될 수 있다. 이는 Le Gall F. et al FEBS Letters, 453 (1999)164-168 and Kortt A.A. et al Biomolecular Engineering,18 (2001) 95-108에서 설명된 바와 같다.

실험예 5

압타머의 준비

DNA 또는 RNA 압타머의 분리는 생체외에서, 시험관증폭선택법(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX) 선택프로세스를 이용하여 수행된다. SELEX 프로세스에 대해서는 도 4에서 볼 수 있다.

각각 특이염기서열(unique sequence)를 갖는 약 10¹⁴의 올리고뉴클레오티드 염기서열 풀은 표준 자동화 올리고뉴클레오티드 합성법을 사용하여 발생된다. 풀을 시작하는 것은 제한되는 않으나, 일반적으로 약 60~80 뉴클레오티드 범위의 염기서열 길이를 갖는다.

그 후에, 올리고뉴클레오티드는 실험예 6에 설명된 바와 같이, 고정된 holo-DBP에 대하여, 선별된다. holo-DBP는 마이크로타이터 플레이트(microtitre plate), 비드, 자성 비드, 컬럼과 같은(그러나, 이에 한정되지 않는다) 고체표면상에 고정된다. 올리고뉴클레오티드는 증가한 apo-DBP 양의 존재하에 holo-DBP와 함께 배양하는 것이 허용된다. 낮은 친화력을 갖는 분자들은 용액에 남으며, 세척에 의해 제거될 수 있다.

모든 holo-DBP 결합 올리고뉴클레오티드(즉, 압타머)는 holo-DBP로부터 졍제되고 증폭되며, SELEX 프로세스의 다음 사이클에 사용된다. 이 사이클은 남은 올리고뉴클레오티드 개체군의 대부분이 holo-DBP에 대한 압타머일 때까지 반복된다.

최종 압타머는 보통 20~40 뉴클레오티드 범위의 길이를 가지며, 이들 압타머는 복제되고, 서열화된다.

도 4에서 나타낸 것과 같이, 압타머 형성을 위한 SELEX 프로세스가 사용되었다.

실험예 6

holo-DBP에 대한 인식분자를 사용하는 간접적인 어세이포맷

혈장/혈청 샘플에서, holo-DBP과 그에 따른 비타민 D레벨의 간접적인 측정을 위해 적합한 어세이포맷의 예들은 동위원소표시 단세포군항체 어세이(radioimmunometric assays,IRMA), 효소결합면역흡착 어세이(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 마이크로입자 효소면역 어세이(microparticle enzyme immunoassays,MEIA)를 포함한다. 경합 어세이에서, holo-DBP는 검출가능한 라벨과 함께 표시될 수 있다.

holo-DBP를 포함하는 샘플은 holo-DBP-특이성 인식분자 및 표시된 holo-DBP와 함께 배양될 수 있으며, 면역복합체의 형성, 분리 및 검출후에, 샘플에서 holo-DBP 레벨이 결정될 수 있다. holo-DBP의 양은 샘플에서 비타민 D의 농도와 관련된다.

예를 들어, 인식분자가 DBP에 대해 25(OH)D 결합 특이성이 있다면, 샘플에서 25(OH)D의 농도가 측정될 것이다.

인식분자에 결합될 수 있는 신호분자의 예들은, 홀스래디쉬(horseradish), 페록시다아제(peroxidase), 말산탈수소효소(malate dehydrogenase), 포도상구균뉴클레아제(staphylococcal nuclease), 델타-5-스테로이드 이성질체화효소(delta-5-steroid isomerase), 효모 알코올탈수소효소(yeast alcohol dehydrogenase), 알파-글리세로인산탈수소효소(alpha-glycerophosphate dehydrogenase), 3탄당인산이성질화체화효소(triose phosphate isomerase), 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase), 아스파라기나아제(asparaginase), 글루코스산화효소(glucose oxidase), 베타갈락토시다제(beta-galactosidase), 리보뉴클에아제(ribonuclease), 우레아제(urease), 카탈라아제(catalase), 포도당-6-인산탈수소효소(glucose-6-phosphate), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 및 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholine esterase)과 같은 효소, 아크리디늄에스터(acridinium ester), 적합한 형광표지화합물(fluorescent labelling compounds)과 같은 화학발광 화합물(chemiluminescent compounds)이지만, 이에 한정되지는 않는다.

적합한 형광표지화합물은, 플루오레세인이소티오시안산염(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 홍조소(phycoerythrin), 남조소(phycocyanin), 이질남조소(allophycocyanin), o-프탈알데히스(o-phthaldehyde) 및 플루오레사민(fluorescamine)를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.

그 외에는, 인식분자는 방사성 식별표시 또는 전기화학적 표시될 수 있다.

요약하면, 혈장/혈청 샘플에서, holo-DBP과 그에 따른 비타민 D레벨은 항-DBP 항체와 같이 프리코팅된 96-웰 플레이트 또는 자성 또는 라텍스 마이크로입자의 표면과 같은(이에 한정되지 않는다) 고체표면상에 holo-DBP를 포획함으로써, 측정된다. 그 후에, holo-DBP는 이전에 언급한 바와 같은 신호분자에 결합된 항-holo-DBP 항체를 사용함으로써, 측정된다. 비타민 D의 농도는 표준커브로부터 결정된다.

역으로, 마이크로타이터 플레이트(microtitre plate)나 마이크로입자(라텍스나 자성일 수 있는)는 항-holo-DBP 항체 또는 다른 인식분자로 코팅될 수 있다. 이 항체 또는 다른 인식분자는 혈청 또는 혈장 샘플에서 holo-DBP를 포획한다. 그 후에, 마이크로타이터 웰/마이크로입자는 포획된 holo-DBP와 함께 배양된 비결합 샘플물질과 표시된 항-DBP 항체, 항-비타민 D 항체, 항-holo-DBP 항체 또는 다른 인식분자를 제거하기 위해 세척된다.

필요하다면, 그 후에, 기질이 첨가되며, 라벨의 존재가 측정된다. 발생된 신호의 양은 샘플에서의 holo-DBP의 양과 직접적으로 관련된다. 샘플에서 holo-DBP의 양은 샘플에서 비타민 D의 농도와 직접적으로 관련되며, 표준커브로부터 측정될 수 있다.

실험예 7

holo-DBP에 대한 인식분자를 사용하는 직접 어세이포맷

요약하면, holo-DBP 인식분자는 또한 holo-DBP와 그에 따른 25(OH) 비타민 D의 직접적인 검출에 사용될 수 있다. 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance), 표면 음향파(surface acoustic wave) 및 수정진동자저울(quartz crystal microbalance) 방법론과 같은 기술을 사용한다. (Suzuki M, Ozawa F, Sugimoto W, Aso S. Anal Bioanal Chem 372:301-304 2002; Pearson J E, Kane J W, Petraki-Kallioti I, Gill A, Vadgama P. J Immunol Methods; 221 :81-94 1998; Weisch W, Klein C, von Schickfus M, Hunklinger S. Anal Chem; 68 2000-20004, 1996; Chou S F, Hsu W L, Huang J M, Chen C Y. Clin Chem 48:913-918, 2002)

실험예 8

근접결찰 어세이 (Proximity Ligation Assay)

근접결찰이라 칭하는 근접프로빙(proximity probing)는 근접프로브를 검출할 수 있는 기술이며, 단백질같은 매크로분자의 특이성, 민감성 및 신속한 검출을 위해 사용될 수 있다.

근접결찰은 2개의 부착분자에 의존하며, 2개의 부착분자는 각각 비중첩성 합성 올리고뉴클레오티드에 결합된 항체, 펩티드, 단백질 또는 압타머가 될 수 있다. 이는 비타민 D같은 결합타겟분자를 통해 공간근접성(spatial proximity)을 이끌어내기 위함이다.

세번째 올리고뉴클레오티드는 인접 DNA 요소(contiguous DNA element)를 완성하기 위해 DNA 리가아제를 사용하여, 2개의 비중첩성 합성 올리고뉴클레오티드를 함께 이끌어내기 위한 가교역할을 한다. 실시간 형광중합 연쇄반응(fluorometric polymerase chain reaction)은 성공적으로 함께 결찰되고 있는 DNA 단편들만의 증폭이 가능하다.

Claims

holo-DBP를 인식하지만, apo-DBP는 인식하지 않거나 apo-DBP에 상대적으로 낮은 친화력을 갖는 것을 특징으로 하는 분자
제 1항에 있어서,
apo-DBP에 대한 교차반응성이 10%미만인 것을 특징으로 하는 분자
제 2항에 있어서,
apo-DBP에 대한 교차반응성이 1%미만인 것을 특징으로 하는 분자
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
신호 요소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분자
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 분자는 비타민 D를 인식하지 않는 것을 특징으로 하는 분자
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
싱기 분자는 비타민 D를 인식하는 것을 특징으로 하는 분자
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 holo-DBP는 DBP와 연관된 25(OH)D를 포함하는 것을 특징으로 하는 분자
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 DBP는 혼합된 형태의 DBP인 것을 특징으로 하는 분자
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 분자는 항체 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 분자
샘플에서 비타민 D를 검출하는 검출방법에 있어서,
상기 검출방법은, 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 분자를 갖는 상기 샘플에 접촉하는 단계와 상기 샘플에 존재하는 비타민 D의 양을 결정하는 결정단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출방법
제 10항에 있어서,
결합 holo-DBP의 함량은 상기 샘플에서의 비타민 D의 양을 나타내는 것을 특징으로 하는 검출방법
제 10항 또는 제 11항에 있어서,
상기 샘플은 체액인 것을 특징으로 하는 검출방법
제 12항에 있어서,
성가 체액은 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 검출방법
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 상기 분자를 사용하여, apo-DBP로부터 holo-DBP를 분리하는 것을 특징으로 하는 검출방법
제 10항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 비타민 D 검출방법 또는 제 14항에 따른 apo-DBP로부터 holo-DBP를 분리하는 방법을 위한 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 상기 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트