CN117264072A - 一种抗sn38单抗及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于抗体偶联药物领域，提供了与SN38具有高亲合力的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和/或轻链可变区；重链可变区包括HCDR1~3，HCDR1氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，HCDR2氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，HCDR3氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，LCDR1氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，LCDR2氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，LCDR3氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。抗SN38鼠单克隆抗体能广泛应用于抗体偶联药物研发领域，特别是应用于抗体偶联药物的药代动力学分析及免疫原性分析。

Description

一种抗SN38单抗及其应用
技术领域
本发明属于抗体偶联药物领域，具体而言，本发明中的一系列抗体能特异性地结合 SN38小分子药物，以及涉及这些抗体在抗体偶联药物临床和非临床药物开发中的应用。
背景技术
SN-38是一种抗肿瘤药物。它是伊立替康(一种类似喜树碱的拓扑异构酶I抑制剂)的活性代谢物，但其活性是伊立替康本身的1000倍, 其与拓扑异构酶Ⅰ及DNA形成的复合物能引起DNA单链断裂，阻止DNA复制及抑制RNA合成，为细胞周期S期特异性。拓扑异构酶I在多种肿瘤细胞如结肠癌、宫颈癌、卵巢癌中有高表达，含量大大高于正常组织或细胞的含量，并且在S期肿瘤细胞中活性大幅提高，因此针对拓扑异构酶I的活性抑制剂可选择性抑制增殖期肿瘤细胞DNA复制。SN38小分子可被用作抗体-药物偶联物（ADC）的细胞毒性组分，用于治疗多种类型的癌症。ADC经靶点介导的内吞作用进入细胞内。ADC在溶酶体中被组织蛋白酶切断连接子，释放出毒性小分子，达到特异性杀灭肿瘤细胞的作用，同时避免对正常细胞造成损伤。
然而，现有技术中缺乏可以有效应用于抗体偶联药物研发领域，特别是应用于抗体偶联药物的药代动力学分析及免疫原性分析等的特异性识别SN38的抗体，同时也缺少研究这些内容的方法。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供了特异性识别SN38小分子的单克隆抗体，可以广泛应用于抗体偶联药物研发领域，特别是应用于抗体偶联药物的药代动力学分析及免疫原性分析。
本发明提供了抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和/或轻链可变区；所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；所述轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示，所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示，所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
抗体的抗原结合片段可以通过化学试剂和基因工程的方法获得。化学试剂片段是通过打断铰链区的二硫键或者是用蛋白酶，包括胃蛋白酶和木瓜蛋白酶，消化抗体后产生的。基因工程产生的片段提供大量的片段，每一个都能有特异性的结合区和功能特质。
免疫球蛋白轻链和重链靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区，可变区（variable region，V区） 位于轻链靠近N端的1/2（约含108～111个氨基酸残基）和重链靠近N端的1/5或1/4（约含118个氨基酸残基）。每个可变区中均有一个由链内二硫键连接形成的肽环，每个肽环约含67～75个氨基酸残基。可变区氨基酸的组成和排列随抗体结合抗原的特异性不同有较大的变异。由于可变区中氨基酸的排列顺序千变万化，故可形成许多种具有不同结合抗原特异性的抗体。
重链可变区和轻链可变区中各含有3个氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域，称为高变区（hypervariable region，HVR）或互补决定区（complementarity determiningregion，CDR）， 包括HVR1（CDR1）、HVR2（CDR2）和HVR3（CDR3），其中，HVR3（CDR3）变化程度更高。重链可变区的3个高变区分别位于29～31、49～58和95～102位氨基酸，而轻链可变区的3个高变区分别位于28～35、49～56和91～98位氨基酸。重链可变区和轻链可变区的3个CDR共同组成Ig的抗原结合部位（antigen-binding site），决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。在可变区中，CDR之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对保守，称为骨架区（framework region，FR）。
SN38为伊立替康（Irinotecan）的代谢产物，伊立替康为半合成水溶性喜树碱类衍生物。SN38为DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂，其与拓扑异构酶Ⅰ及DNA形成的复合物能引起DNA单链断裂，阻止DNA复制及抑制RNA合成，具有细胞周期S期特异性。
本发明的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段，重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别具有与SEQ ID No. 1~3所示序列90%以上的同源性，例如可以是90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的同源性。
同源性指两种核酸分子的核苷酸顺序之间，或两种蛋白质的氨基酸顺序之间相似的程度。完成序列同源性或相似性分析需要用到两两序列比较算法，常用的程序包括BLAST、FASTA等，可采用BLAST进行两段序列的同源性比对。BLAST是由美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）开发的一个基于序列相似性的数据库搜索程序，其比对结果会列出与查询序列相似性较高、符合限定条件的序列。
本发明的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列分别具有与SEQ ID No. 4~6所示序列90%以上的同源性，例如可以是90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的同源性。
作为本发明的某些实施方案，所述抗SN38单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 8所示。
本发明的所述抗SN38单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列具有与SEQ ID No. 7所示序列90%以上的同源性，例如可以是90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的同源性。
本发明的所述抗SN38单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列具有与SEQ ID No. 8所示序列90%以上的同源性，例如可以是90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的同源性。
作为本发明的某些实施方案，所述的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段包括鼠、人、兔或猴抗体恒定区，所述鼠抗体恒定区包括鼠IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG2C 或IgG3的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区，所述人抗体恒定区包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区。
恒定区（constant region，C区）位于轻链靠近C端的1/2（约含105个氨基酸残基）和重链靠近C端的3/4区域或4/5区域（约从119位氨基酸至C末端）。重链每个功能区约含110多个氨基酸残基，含有一个由二硫键连接的50～60个氨基酸残基组成的肽环。这个区域氨基酸的组成和排列在同一种属动物Ig同型轻链和同一类重链中都比较恒定，如人抗白喉外毒素IgG与人抗破伤风外毒素的抗毒素IgG，它们的可变区不相同，只能与相应的抗原发生特异性的结合，但其恒定区的结构是相同的，即具有相同的抗原性。这是制备第二抗体，应用荧光、酶、同位素等标记抗体的重要基础。
作为本发明的某些实施方案，所述抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段的结构选自免疫球蛋白、Fab、Fab’、F(ab’)2、和Fv；所述Fv结构选自ScFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、双-scFv、mini抗体、Fab2、和Fab3。
抗体经过化学试剂处理和蛋白酶消化可以得到抗原结合片段（Fab）, 其来源于IgG 和 IgM 亚型抗体的可变区。抗原结合片段包括了Fab，Fab'，F(ab')2，和Fv。这些片段能够结合抗原，但是它们缺少Fc段，其包括重链的恒定区CH2和CH3。当抗体被木瓜蛋白酶消化后，两个独立的F(ab)片段从Fc区域分离下来。而用胃蛋白酶消化后，一个带有小部分的Fc铰链区的 F(ab')2 片段从抗体中分离下来。
单价的F(ab) 片段只有一个抗原结合区，然而多价的F(ab')2 片段有两个抗原结合区，它们通过二硫键结合在一起。F(ab')2 片段产生2个单价的Fab' 片段和一个游离的巯基，其能够用于其他分子的结合。
Fv 片段是IgG和IgM类型抗体通过酶法分析后产物中最小的片段。Fv片段抗原结合区，其由VH和VC区域组成，但是它们缺少CH1和CL区域。重链可变区 和轻链可变区通过非共价键在Fv 片段里结合在一起。
单链可变区（ScFv）是Fv类型片段，其包括了通过易弯曲多肽链接在一起的VH和VL区域。如果结合区至少有12个残基的长度，ScFv片段就是单抗。 通过操作V-结构域和铰链区的长度可以创作不同形式的Fv分子。 连接体由3-11残基组成的scFv分子不能折叠成有功能的Fv结构域。这些分子和其他的scFv分子一起可以创作出一个双价的双特异性抗体。如果连接体的长度小于3个残基，scFv 分子相互作用后能够产生三特异性或者四特异性抗体。多价的scFvs与对应的单价的抗体相比具有更强的结合抗原的亲和力。
Mini抗体是scFv-CH3融合蛋白，被装进到双价的二聚体中。 Bis-scFv 片段是双特异性的。 小型化的ScFv片段能够通过两个不同的可变区产生，能够让这些Bis-scFv分子同时结合两个不同的表位。通过基因学方法可以产生双特异性的Fab 二聚体（Fab2）和三特异性的Fab 三聚体（Fab3）。这些抗体片段同时能够结合2 个（Fab2）或者3个（Fab3）不同的抗体。
作为本发明的某些实施方案，所述抗SN38单克隆抗体重链氨基酸序列如SEQ IDNo. 9所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示。
本发明还提供了一种核酸，所述核酸编码所述的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包括所述的核酸。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含有所述的表达载体或其重组有所述的核酸。
本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括所述的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段、所述的核酸、所述的表达载体、和/或所述的宿主细胞。
本发明还提供了所述的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段、所述的核酸、所述的表达载体、宿主细胞、和/或所述的试剂盒在制备检测SN38或SN38衍生物的检测产品、SN38毒素结合型ADC稳定性分析、药代动力学分析或免疫原性分析产品中的应用。
作为本发明的某些实施方案，所述SN38衍生物为抗体偶联药物。
作为本发明的某些实施方案，所述抗体偶联药物为SN38毒素结合型ADC。
作为本发明的某些实施方案，所述检测SN38或SN38衍生物的检测产品、SN38毒素结合型ADC稳定性分析、药代动力学分析产品适于定性或定量分析SN38或SN38衍生物；所述免疫原性分析产品以所述的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段为阳性对照。
作为本发明的某些实施方案，所述应用为抗SN38单克隆抗体在检测SN38毒素结合型ADC血浆稳定性中的应用；优选地，所述应用为抗SN38单克隆抗体在检测SN38毒素结合型ADC猴血浆稳定性中的应用。
在药物发现过程中，先导化合物的代谢稳定性（包括肝代谢稳定性和血浆稳定性等）是影响其成药性的关键因素。代谢稳定性研究是寻找候选药物过程中不可或缺的一项重要内容。尽管化合物的肝代谢稳定性被普遍认为是药物发现过程中所面临的最主要的挑战之一，但是化合物的血浆稳定性仍然是新药研发过程中一个重要的影响因素。血浆中含有各种各样的水解酶，容易催化化合物中特定的官能团的水解，比如酯基、酰胺、内酯、内酰胺和磺酰胺，而不稳定的化合物常常具有较高的清除率和较短的半衰期, 从而导致体内药动学和药效学性质不佳。
作为本发明的某些实施方案，所述应用为抗SN38单克隆抗体在SN38毒素结合型ADC体内药代分析中的应用。
优选地，所述应用为抗SN38单克隆抗体在SN38毒素结合型ADC大鼠体内药代分析中的应用。
体内药代分析是通过分析人或动物体液及各组织器官中药物及其代谢物浓度，了解药物在体内数量和质量的变化，获得药物代谢动力学的各种参数和转变，以及代谢的方式、途径等信息，从而有助于药物的研究、临床合理应用等。
作为本发明的某些实施方案，所述应用为抗SN38单克隆抗体在制备分析SN38结合型ADC的免疫原性的产品中的应用。
免疫原性（immunogenicity）是治疗性蛋白产品诱导机体产生免疫应答（针对治疗性蛋白本身或其相关蛋白）或诱导临床相关免疫不良反应的特性。免疫原性是ADCs药物评价指标之一，一般通过检测体液免疫产生的抗药抗体（anti-drug antibody，ADA）评价ADCs大分子药物的免疫原性。抗SN38单克隆抗体是一种特殊的抗药抗体，通过阻断产品到达其靶标或干扰受体/配体结合，从而干扰药物的体内活性。因此，抗SN38单克隆抗体作为抗药抗体的一个子集，是构成免疫原性研究和评价的重要部分。
本发明还提供了一种用于非疾病诊断或治疗目的的检测样品中SN38或其衍生物的方法，所述方法包括：
(a)使样品接触所述的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段；
(b) 检测是否存在SN38或其衍生物与所述的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段的免疫复合物，以定性分析样品中是否存在SN38或其衍生物；或检测所述免疫复合物的量，以定量分析样品中的SN38或其衍生物。
作为本发明的某些实施方案，步骤(a)中，使所述抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段直接或间接固定化至固相支持物。
作为本发明的某些实施方案，步骤(b)中，检测所述免疫复合物的存在或检测所述免疫复合物的量是采用选自如下的方法实现：
i. 经由直接或间接连接到所述抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段的可检测标记物实现；
ii. 经由结合所述抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段的其他试剂实现，所述其他试剂直接或间接连接有可检测标记物；
iii. 经由另一种抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段实现，所述另一种抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段直接或间接连接有可检测标记物；
iv. 经由另一种与所述SN38或其衍生物结合的物质实现，所述另一种与所述SN38或其衍生物结合的物质直接或间接连接有可检测标记物。
根据抗原抗体结合形成免疫复合物的性状与活性特点，对样品中的抗原进行定性、定位或定量的检测。定性和定位检测是用已知的所述的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段和待检样品混合，经过一段时间，若有免疫复合物形成的现象发生，就说明待检样品中有相应的抗原存在。若无预期的现象发生，则说明样品中无相应的抗原存在。基于对于样品中的抗原进行定性、定位检测，可以对SN38或其衍生物进行临床前药代分析，例如SN38或其衍生物（如靶向Trop2的抗体偶联SN38药物）在体内的吸收、分布和转运。
对抗原进行定量检测时，反应中加入所述的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段的浓度与形成免疫复物的浓度呈函数关系，可以是根据免疫复合物产生的多少来推算样品中抗原的含量：在一定的反应条件下，加入的所述的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段的浓度一定，反应产生的免疫复合物多少与待检样品中含有相应抗原量成正比。抗原的量可经由检测标记物的量而确定。可用实验性标准曲线推算出样品中抗原（或抗体）的含量。如免疫单向扩散试验、免疫比浊试验和酶联免疫检测。因此可以对SN38或其衍生物进行药代动力学分析，例如在体内药物浓度随时间变化的规律。
作为本发明的某些实施方案，步骤(b)中，所述样品中的SN38衍生物为靶向Trop2的抗体偶联SN38药物。
靶向Trop2的抗体偶联SN38药物是指靶向Trop-2的的抗体偶联药物（ADC），由靶向TROP-2抗原的人源化IgG1抗体与化疗药物伊立替康（一种拓扑异构酶I抑制剂）的代谢活性产物SN-38偶联而成。
作为本发明的某些实施方案，步骤(b)中，所述样品为血清。
如上所述，本发明的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段、核酸、表达载体、宿主细胞、试剂盒、应用和方法，具有以下有益效果：
本发明的抗SN38单克隆抗体具有高的亲合力；
本发明的抗SN38单克隆抗体用于检测临床前药代ADC，其检测体系的精密度与准确度均在接受范围内，且总误差均低于20.3%，抗SN38鼠单克隆抗体开发的分析方法可以应用于临床前药代ADC药物浓度的检测；
抗SN38单克隆抗体作为捕获抗体测试ADC-1在猴血浆中37℃条件下的稳定性，在猴血浆37℃条件下高中低浓度样品的ADC测量浓度与理论浓度的比值随时间延长逐渐降低，可以用于检测ADC测量浓度，检测其在血浆中稳定性；
抗SN38单克隆抗体作为捕获抗体来测试ADC-1在SD大鼠体内的浓度，结果显示在SD大鼠体内ADC-1浓度随时间延长逐渐降低，可以用于ADC-1在体内的药代动力学分析。
附图说明
图1显示为本发明临床前药代ADC检测体系标准曲线。
图2 显示为本发明SN38结合型ADC药物在猴血浆中的浓度-时间变化曲线图。
图3 显示为本发明SN38结合型ADC药物浓度-时间变化曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。
除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的及相关领域的常规技术。
实施例1、抗SN38鼠单克隆抗体的制备和鉴定
1、免疫原制备：将BSA通过游离巯基偶联SN38小分子，制备BSA-SN38样品。
2、动物免疫：使用BSA偶联的SN38样品分别免疫5只 Balb/c品系小鼠，每只免疫3次，每次周期为3周。免疫后的小鼠血清与相应的免疫原要有特异性结合，抗血清效价应在1：10，000以上。
3、杂交瘤筛选：选取免疫的小鼠中效价最高的1-2只小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞开始融合。筛选时取同一孔培养物上清，用另一种偶联SN38的ADC检测。扩增培养杂交瘤细胞，取上清检测ELISA效价及抗体亚型，选取针对相应抗原呈阳性的细胞进行克隆。为保证杂交瘤细胞株的阳性率和稳定地产生抗体，进行3-4次克隆，每次克隆间隔1-2周，3-4次均为100%阳性克隆后，获得抗体特异性的杂交瘤细胞。
4、抗体制备：采用免疫动物腹水纯化或者杂交瘤基因测序重组表达等方式获得单克隆抗体。
SN38小分子结构式
表1 ELISA法检测SN38鼠单克隆杂交瘤上清效价
5、抗SN38鼠单克隆抗体基因测序
提取细胞总RNA，反转录获得cDNA。PCR扩增获得抗体的重链和轻链可变区基因，测序并进行序列的生物信息学分析，剔除非功能的抗体基因。抗体按照其来源的细胞克隆命名，重链和轻链及其可变区的氨基酸序列如下：
抗SN38鼠单克隆抗体（S-37-1）
重链如SEQ ID NO.9所示：
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGNTFSNYQMHWVKQKPGQGLEWIGYIDPYYDVTKYNEKSKGKAT LTSDKSSNTAYMELSILTSEDSAVYYCTRWDDNNGYWGQGTTLVVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
其中，重链可变区如SEQ ID NO:7所示：
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGNTFSNYQMHWVKQKPGQGLEWIGYIDPYYDVTKYNEKSKGKAT LTSDKSSNTAYMELSILTSEDSAVYYCTRWDDNNGYWGQGTTLVVSS
轻链如SEQ ID NO.10所示：
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRAQGNIHNFLAWYQQKQGKSPQLLVYNAYHLADGVPSRFSGSGSGT QYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFYNTPYTFGGGTRLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
其中，轻链可变区如SEQ ID NO:8所示：
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRAQGNIHNFLAWYQQKQGKSPQLLVYNAYHLADGVPSRFSGSGSGT QYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFYNTPYTFGGGTRLEIKRA
抗体CDR（根据KABAT命名系统定义）的序列如表2：
表2 抗SN38鼠单克隆抗体S-37-1 的CDRs和序列号
可将表2中的抗SN38鼠单克隆抗体S-37-1的重链可变区序列和其它来源（例如人源或鼠源）的重链恒定区序列拼接在一起，构建到表达载体中，将轻链可变区序列和其他来源（例如人源或鼠源）的轻链恒定区序列拼接在一起，构建到表达载体中。构建好的抗SN38抗体的重链载体和轻链载体配对混合，使用聚乙烯亚胺转染HEK293细胞，7天后收集细胞上清，使用ProteinA纯化得到抗SN38抗体。
实施例2、抗SN38鼠单克隆抗体与SN38小分子的结合性能测试
1.材料信息
表3 材料信息
2.主要仪器设备
表4主要仪器设备
3.试验步骤
3.1包被：将ADC-1、抗体-1和BSA-SN38分别4℃包被过夜，包被浓度为1 μg/mL，100μl/孔；
3.2封闭：PBST洗板3次后拍干，加入3% BSA/PBST溶液，室温孵育2h；
3.3样品稀释及加样：
将抗 SN38鼠单克隆抗体（克隆号S-37-1）用1%BSA/PBST稀释至1μg/ml，再依次4倍稀释共8个浓度。PBST洗板3次后拍干，将上述样品以100 μl/孔加入酶标板中，室温孵育2h；
3.4 加入检测二抗：PBST洗板4次后拍干。将羊抗鼠IgG-HRP用1 % BSA/PBST按1:5000稀释，100 μl/孔分别加入对应酶标板中，室温孵育1 h；
3.5显色：PBST洗板3次后拍干，TMB底物以100 μl/孔加入酶标板，室温避光孵育10min左右；
3.6 终止：100 μl/孔加入1 M H3PO4终止反应；
3.7 读板：终止显色反应后，以650 nm为参比波长，读取450 nm波长处OD值。
4. 试验结果
结果表5所示，抗SN38鼠单抗（S-37-1）能与SN38小分子特异性结合，说明它是抗SN38的特异性抗体。
表5 SN38鼠单克隆与SN38小分子结合结果
实施例3、抗SN38鼠单抗在临床前药代ADC检测中的应用
1.材料信息
表6材料信息
2. 主要仪器设备
表7主要仪器设备
3.试验方法
3.1 试验步骤
3.1.1包被：将抗SN38鼠单克隆抗体（S-37-1）4℃包被过夜，包被浓度为2 μg/mL，100 μl/孔；
3.1.2封闭：PBST洗板3次后拍干，加入3% BSA/PBST溶液，室温孵育2h；
3.1.3样品稀释及加样：
标曲稀释：将ADC-1用10% PMP稀释至500 ng/ml作为起始浓度，2倍梯度稀释，以10% PMP作为0点，即标准曲线浓度点为：500 ng/ml（ULOQ）、250 ng/ml、125 ng/ml、62.5ng/ml、31.25 ng/ml、15.625 ng/ml、7.81 ng/ml、3.9 ng/ml （LLOQ）、1.95 ng/ml（锚定点）。
样品稀释：将ADC-1用10% PMP稀释成质控样品,分别是500 ng/ml（ULOQ）、400 ng/ml（HQC）、150 ng/ml（MQC）、10 ng/ml（LQC）、3.9 ng/ml（LLOQ），PBST洗板3次后拍干，将上述样品以100 μl/孔加入酶标板中，室温孵育2 h；
3.1.4加入检测试剂（Trop2-Biotin）：PBST洗板6次后拍干。将Trop2-Biotin用1 %BSA/PBST稀释至2μg/mL，100 μl/孔分别加入对应酶标板中，室温孵育1 h；
3.1.5加入Streptavidin-HRP：PBST洗板6次后拍干。将Streptavidin-HRP用1 %BSA/PBST按1：40000稀释，100 μl/孔分别加入对应酶标板中，室温孵育1 h；
3.1.6显色：PBST洗板3次后拍干，TMB底物以100 μl/孔加入酶标板，室温避光孵育10 min左右；
3.1.7终止：100 μl/孔加入1 M H3PO4终止反应；
3.1.8读板：终止显色反应后，以650 nm为参比波长，读取450 nm波长处OD值。
4试验结果
结果如图1和表8所示，图1显示了临床前药代ADC检测体系的标准图谱，表8显示了临床前药代ADC检测体系的精密度与准确度数据。数据显示：各浓度水平质控样品的准确度偏差在-14.1%~-0.9%之间，批内精密度在1.8%~7.2%之间，批间精密度在4.1%~14.6%之间，且总误差均低于20.3%，说明以该抗SN38鼠单克隆抗体开发的分析方法可以应用于临床前药代ADC药物浓度的检测。
表8 临床前药代ADC检测体系的精密度与准确度
实施例4、抗SN38单克隆抗体在SN38毒素结合型ADC猴血浆稳定性中的应用
1.材料信息
表9材料信息
2.主要仪器设备
表10主要仪器设备
3.样品准备
将100%混合猴血浆(PMP)用0.22μm滤膜过滤，分别配制含1000µg/ml （HPC）、100µg/ml（MPC）和10µg/ml（LPC）的ADC-1猴血浆样品，将样品放置于37℃，分别于0、12h、1天、3天、5天、7天、10天和14天取样进行检测。
4.试验步骤
4.1包被：将抗SN38鼠单克隆抗体（S-37-1）4℃包被过夜，包被浓度为2 μg/mL，100μl/孔；
4.2封闭：将ELISA板拍干，以200μl/孔的PBST冲洗ELISA板3次；将ELISA板拍干，200μl/孔加入3% BSA/PBST溶液，室温孵育2h；
4.3加样：封闭后的酶标板拍干，用Washing buffer冲洗酶标板3次，200 μl/孔。
标曲稀释：将标准品用10%混合猴血浆（PMP）稀释至500 ng/ml作为起始浓度，2倍梯度稀释共10个点，以10%PMP作为0点。
质控样品稀释：将标准品用10%PMP稀释作为质控样品，分别为ULOQ：500 ng/ml，HQC：400 ng/ml，MQC：150 ng/ml，LQC：10 ng/ml，LLOQ：3.9 ng/ml。
样品稀释:将高浓度样品（HPC）、中浓度样品（MPC）和低浓度样品（LPC）先用1%BSA/PBST稀释10倍，随后用10%PMP继续稀释至150 ng/ml。
将上述样品以100 μl/孔加入酶标板中，设复孔，室温孵育2 h；
4.4加入检测试剂（Trop2-Biotin）：PBST洗板6次后拍干。将Trop2-Biotin用1 %BSA/PBST稀释至2μg/mL，100 μl/孔分别加入对应酶标板中，室温孵育1 h；
4.5加入Streptavidin-HRP：PBST洗板6次后拍干。将Streptavidin-HRP用1 %BSA/PBST按1：40000稀释，100 μl/孔分别加入对应酶标板中，室温孵育1 h；
4.6显色：反应后的酶标板拍干，用Washing buffer冲洗酶标板6次，200 μl/孔。TMB底物以100 μl/孔加入酶标板，室温避光孵育10 min左右；
4.7终止：100 μl/孔加入1 M H3PO4终止反应；
4.8读板：终止显色反应后，以650 nm为参比波长，读取450 nm波长处OD值。
5试验结果
将抗SN38鼠单克隆抗体作为捕获抗体测试ADC-1在猴血浆中37℃条件下的稳定性，结果如表11所示，ADC测量浓度与理论浓度的比值随时间变化的曲线如图2所示。
结果显示：在猴血浆37℃条件下高中低浓度样品的ADC测量浓度与理论浓度的比值随时间延长逐渐降低。
表11 SN-38结合型ADC药物浓度-时间变化曲线数据
实施例5、抗SN38单克隆抗体在SN38毒素结合型ADC大鼠体内药代分析中的应用
1.材料信息
表12材料信息
2.主要仪器设备
表13主要仪器设备
3.样品准备
采用单次给药方案。剂量为60mg/kg，给药前取血样，并在1小时、6小时、24小时、72小时、120小时、168小时、240小时、336小时时间点取血采样。
4. 试验步骤
4.1包被：将抗SN38鼠单克隆抗体（S-37-1）4℃包被过夜，包被浓度为2 μg/mL，100μl/孔；
4.2封闭：将ELISA板拍干，以200μl/孔的PBST冲洗ELISA板3次；将ELISA板拍干，200μl/孔加入3% BSA/PBST溶液，室温孵育2h；
4.3加样：封闭后的酶标板拍干，用Washing buffer冲洗酶标板3次，200 μl/孔。
标曲稀释：将标准品用10%空白SD大鼠血浆稀释至500 ng/ml作为起始浓度，2倍梯度稀释共10个点，以10%空白SD大鼠血浆作为0点。
质控样品稀释：将标准品用10%空白SD大鼠血浆稀释作为质控样品，分别为ULOQ：500 ng/ml，HQC：400 ng/ml，MQC：150 ng/ml，LQC：10 ng/ml，LLOQ：3.9 ng/ml。
样品稀释:将高浓度样品（HPC）、中浓度样品（MPC）和低浓度样品（LPC）先用1%BSA/PBST稀释10倍，随后用10%空白SD大鼠血浆继续稀释相应倍数。
将上述样品以100 μl/孔加入酶标板中，设复孔，室温孵育2 h；
4.4加入检测试剂（Trop2-Biotin）：PBST洗板6次后拍干。将Trop2-Biotin用1 %BSA/PBST稀释至2μg/mL，100 μl/孔分别加入对应酶标板中，室温孵育1 h；
4.5加入Streptavidin-HRP：PBST洗板6次后拍干。将Streptavidin-HRP用1 %BSA/PBST按1：40000稀释，100 μl/孔分别加入对应酶标板中，室温孵育1 h
4.6显色：反应后的酶标板拍干，用Washing buffer冲洗酶标板6次，200 μl/孔。TMB底物以100 μl/孔加入酶标板，室温避光孵育10 min左右；
4.7终止：100 μl/孔加入1 M H3PO4终止反应；
4.8读板：终止显色反应后，以650 nm为参比波长，读取450 nm波长处OD值。
5试验结果
将抗SN38鼠单克隆抗体作为捕获抗体来测试ADC-1在SD大鼠体内的浓度，结果如表14所示，ADC测量浓度随时间变化的曲线如图3所示。
结果显示：在SD大鼠体内ADC-1浓度随时间延长逐渐降低。结果表明抗SN38单克隆抗体可用于SN38毒素结合型ADC在体内的药代分析。
表14 SN-38结合型ADC药物SD大鼠毒代数据
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (16)

1.抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和/或轻链可变区；
所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID No.3 所示；
所述轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示，所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示，所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
2.如权利要求1所述的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗SN38单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 8所示。
3.根据权利要求1~2任一项所述的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段包括鼠、人、兔或猴抗体恒定区，所述鼠抗体恒定区包括鼠IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG2C 或IgG3的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区，所述人抗体恒定区包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区。
4.根据权利要求1~2任一项所述的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段的结构选自免疫球蛋白、Fab、Fab’、F(ab’)2、和Fv；所述Fv结构选自ScFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、双-scFv、mini抗体、Fab2、和Fab3。
5.根据权利要求1所述的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗SN38单克隆抗体重链氨基酸序列如SEQ ID No. 9所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示。
6.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1~5任一项所述的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段。
7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求6所述的核酸。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含有权利要求7所述的表达载体或其重组有权利要求6所述的核酸。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1~5任一项所述的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求6所述的核酸、权利要求7所述的表达载体和/或权利要求8所述的宿主细胞。
10.权利要求1~5任一项所述的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求6所述的核酸、权利要求7所述的表达载体、权利要求8所述的宿主细胞和/或权利要求9所述的试剂盒在制备检测SN38或SN38衍生物的检测产品、SN38毒素结合型ADC稳定性分析、药代动力学分析或免疫原性分析产品中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述SN38衍生物为抗体偶联药物。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述抗体偶联药物为SN38毒素结合型ADC。
13.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述检测SN38或SN38衍生物的检测产品、SN38毒素结合型ADC稳定性分析、药代动力学分析产品适于定性或定量分析SN38或SN38衍生物；所述免疫原性分析产品以所述的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段为阳性对照。
14.一种用于非疾病诊断或治疗目的的检测样品中SN38或其衍生物的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)使样品接触权利要求1~5中任一项所述的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段；
(b) 检测是否存在SN38或其衍生物与所述的抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段的免疫复合物，以定性分析样品中是否存在SN38或其衍生物；或检测所述免疫复合物的量，以定量分析样品中的SN38或其衍生物。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，使所述抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段直接或间接固定化至固相支持物。
16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，检测所述免疫复合物的存在或检测所述免疫复合物的量是采用选自如下的方法实现：
i. 经由直接或间接连接到所述抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段的可检测标记物实现；
ii. 经由结合所述抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段的其他试剂实现，所述其他试剂直接或间接连接有可检测标记物；
iii. 经由另一种抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段实现，所述另一种抗SN38单克隆抗体或其抗原结合片段直接或间接连接有可检测标记物；
iv. 经由另一种与所述SN38或其衍生物结合的物质实现，所述另一种与所述SN38或其衍生物结合的物质直接或间接连接有可检测标记物。
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