JP2012519208A

JP2012519208A - ビタミンｄを検出するためのアッセイおよびそのための抗体

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Publication number: JP2012519208A
Application number: JP2011552518A
Authority: JP
Inventors: ローラー，マーガレット; プリチャード，デーヴィッド; ブラック，マード; オルニング，ラルス
Original assignee: アクシス−シールドダイアグノスティクスリミテッド
Priority date: 2009-03-02
Filing date: 2010-03-02
Publication date: 2012-08-23
Also published as: AU2010220215A1; KR20110126742A; EP2403876A1; WO2010100487A1; CA2753756A1; US20120064533A1; GB0903469D0; CN102333790A

Abstract

ｈｏｌｏ−ＤＢＰを認識するが、ａｐｏ−ＤＢＰを認識しないかまたはそれに対する比較的低い親和性を有する分子。

Description

本発明は、ビタミンＤをアッセイすること、および特にビタミンＤ結合タンパク質との複合体におけるビタミンＤをアッセイすることに関する。

動物において、ビタミンＤは主に、血中のカルシウムおよびリン酸塩、特性／プロセス、例えば骨ミネラル化、筋収縮および神経伝導ならびに他の一般的な細胞機能にインビボで影響する物質の循環濃度を維持する機能を果たす。そのように、ビタミンＤ濃度の変動は、筋肉機能ならびに免疫、神経、心臓および循環系に対して影響し、かつ多様な医学的状態、例えば骨疾患、ＩＩ型糖尿病および癌と関連し得る。

ビタミンＤは、種々の形態において見出され、その主要な２種は、Ｄ_２およびＤ_３であると考えられるが、用語は、関連する脂肪に可溶な分子ならびに代謝物、誘導体およびこれらの物質の他の類似体のファミリーを広く指すように当業者によって認識されている。したがって、以下ではビタミンＤを、集合的に知られており、かつ／または当該分野においてビタミンＤとして広く記載／言及される分子の群のすべてのメンバーを指すのに用いる。

ビタミンＤを、食事において得るか、または皮膚において日光の作用によって光化学的に生産することができる。ビタミンＤ_２は、動物によって合成されることが知られておらず、菌類および植物の供給源から食事において得られる。ビタミンＤ_３を同様に、動物によって肉食性の食事を介して得ることができるか、または上記のように皮膚において新たに合成することができる。しかし、その供給源とは無関係に、ビタミンＤは、主に２５−ヒドロキシビタミンＤ（以下２５（ＯＨ）Ｄ）形態でインビボで貯蔵され、それは、肝臓においてビタミンＤの水酸化によって生産される。２５（ＯＨ）Ｄは、血中に見出されるビタミンＤの主要な形態であり、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（以下１，２５（ＯＨ）_２Ｄ）、即ち主に腎臓において生産されるビタミンＤの生理学的に活性な形態の前駆体である。１，２５（ＯＨ）_２Ｄは、ビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）に結合し、それはその後、前記結合の際に迅速かつ長期にわたるゲノム応答を媒介することができる。

ビタミンＤの生物学的に活性な形態は、例えば腸、骨または腎臓中の標的細胞においてビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）に結合することによって機能する。ビタミンＤは、水への可溶性が乏しく、したがって、血液中でのその標的細胞へのその輸送を可能にするために、それは、ビタミンＤ結合タンパク質または群特異性構成要素（Ｇｃ）として知られている可溶性５２ｋＤａ担体タンパク質と、複合体において結合している。ビタミンＤ結合タンパク質は、タイプ１Ｓ、１Ｆおよび２を含むがこれらには限定されない変種を有する。以下では、当該分野においてビタミンＤ結合タンパク質またはＧｃとして知られているすべての変種を含むタンパク質の群を、ＤＢＰと呼ぶ。

ＤＢＰ濃度は、通常血中でのビタミンＤの濃度の２０倍であり、したがって、ＤＢＰがビタミンＤへの極めて高い結合親和性を有するため、ほとんどの血中ビタミンＤは、ＤＢＰに結合していることが見出される。ビタミンＤ−ＤＢＰ複合体を、以下ではｈｏｌｏ−ＤＢＰと呼ぶ。

結合活性に関して、ＤＢＰは、ビタミンＤの形態／代謝物に、以下の相対的親和性で結合する：２５−ヒドロキシビタミンＤ（２５（ＯＨ）Ｄ）＝２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（２４，２５（ＯＨ）_２Ｄ）＞１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（１，２５（ＯＨ）_２Ｄ）＞コレカルシフェロール。

循環する２５（ＯＨ）Ｄの中で、９０％超が、通常ＤＢＰに結合していることが見出され、他のタンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が２５（ＯＨ）Ｄに結合していることが示されているが、それは、より低い親和性を顕著に有している。

健康に対して、その広範囲にわたり、かつ顕著な影響がある場合には、インビボでビタミンＤ濃度を容易にかつ正確に測定することができるための明らかな医学的必要条件がある。

体液中で測定することができるビタミンＤの２種の主要な形態、即ち２５（ＯＨ）Ｄおよび１，２５（ＯＨ）_２Ｄがある。上記のように、２５（ＯＨ）Ｄは通常、血中で１，２５（ＯＨ）_２Ｄより高い濃度にて見出され、それがまた比較的長い半減期を有するため、２５（ＯＨ）Ｄを一般的に測定して、個体におけるビタミンＤ状況を評価し、モニタリングする。さらに、ビタミンＤの活性型であって、１，２５（ＯＨ）_２Ｄの血漿／血清濃度は、一定のレベルにて維持される傾向があり、したがって２５（ＯＨ）Ｄ濃度は、個体の全体的な循環するビタミンＤ状況のより良好な指標である。しかし、１，２５（ＯＨ）_２Ｄの濃度を測定することは、腎臓（１または２以上）において当該化合物の活性形態の十分な生産があるか否かの指標としての役割を果たす。

標的の濃度の決定を求める場合には、それを直接測定することが常識である。したがって、ビタミンＤ濃度を決定するための現在のアッセイには、ビタミンＤが、水性媒体への可溶性が乏しいビタミンＤの濃度を測定する前にそのＤＢＰから最初に解離することが必要である。この分離は、ＤＢＰを変性させ、除去するか、または置換試薬を用いて、ビタミンＤを放出させ、次に得られた遊離のビタミンＤを測定することによって達成され得る。ＤＢＰの解離のための必要条件には、そのような段階をすべてのビタミンＤアッセイにおいて包含させることが明らかに必要であり、したがってアッセイを行う時間および複雑さが追加される。

ビタミンＤの疎水性の性質のために、現在のアッセイ手法は、例えば溶媒を用いて、ビタミンＤを放出し、ＤＢＰを変性させることである。そのようなアプローチには、変性したＤＢＰおよび溶媒抽出物を、ビタミンＤ含量を評価することができる前にその後分離することが必要である。

さらに、ビタミンＤ濃度を評価する現在の方法は、個別の手法および種々のアッセイを比較した場合に関しても、顕著な変動性の問題を有することが報告されている。プロセスの複雑さが増大するに伴って、したがって信頼性などの問題は、より困難になる。非精密性のレベルは、高感度アッセイについて極めて重要になり、既存のプロセス（ビタミンＤ置換、液体の添加および除去、ならびに複数の洗浄段階を含む）の多段階の性質のために、誤差が蓄積し得、精度は相応して劣る。したがって、より小さい非精密性を提供する傾向がある単純化されたビタミンＤアッセイについての必要性がある。

これらの問題に対処するために、本発明は、従来技術と関連した問題を解決することを求める。
本発明の第１の観点において、ｈｏｌｏ−ＤＢＰを認識するが、ａｐｏ−ＤＢＰ（また結合していないＤＢＰまたはＤＢＰとして知られている）を認識しないかまたはそれに対する比較的低い親和性を有する分子を提供する。比較的低い親和性を、例えば＜１０％または好ましくは＜１％のａｐｏ−ＤＢＰに対する交差反応性を示す分子によって提示して、それがａｐｏ−ＤＢＰよりもｈｏｌｏ−ＤＢＰに優先的に結合するようにしてもよい。

この認識分子は、ｈｏｌｏ−ＤＢＰとａｐｏ−ＤＢＰとを区別することが正確かつ効果的に可能である。これによって、この分子を、試料、例えば組織試料または体液中のビタミンＤの検出のための試験において用いることが可能になる。このようにして、ＤＢＰのｈｏｌｏ形態およびａｐｏ形態の選択的な決定を可能にすることによって、本発明は、既存の手順によって付与されるよりも正確であり、迅速であり、有益に標的されたビタミンＤ濃度の測定を可能にする。

認識分子は、主にビタミンＤを認識するがｈｏｌｏＤＢＰと交差反応し、ｈｏｌｏＤＢＰを認識するようにすることができる。この点において、「認識」の語（またはそのすべての派生語（例えば認識する））を本明細書中で用いることは、一次的な認識、交差反応性または認識のすべての二次的な、もしくは以降の認識の形態を包含するものと考慮される。「認識分子」の語は、すべての形態において標的と相互作用するかまたはそれに結合する分子を包含するものと理解される。

好ましくは、前記認識分子を用いて、ｈｏｌｏ−ＤＢＰを捕捉、濃縮、分離または検出してもよい。
好ましくは、認識分子は、結合していないビタミンＤを認識しない。あるいはまた、認識分子は、結合していないビタミンＤを試料中のｈｏｌｏ−ＤＢＰと共に認識することができる。

好ましくは、認識分子は、ビタミンＤ、例えば２５（ＯＨ）Ｄの特定の変種の形態（１または２以上）の方向への選択性を示す。
好ましくは、認識分子を産生し、試験するために用いられるＤＢＰは、混合タイプのＤＢＰ、即ちタンパク質の遺伝的変異体の混合物を含むＤＢＰである。あるいはまた、ＤＢＰは、ＤＢＰの特定の遺伝的変異体であり得る。

好都合には、前記認識分子は、抗体（例えばモノクローナル抗体）、抗体断片（例えばＦ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ｖ）、ｓｃＦｖ）、タンパク質、分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド（例えばアプタマー）またはｈｏｌｏ−ＤＢＰへの親和性を有する小有機化学物質から選択される。

任意に、前記認識分子は、シグナル構成要素を含み、ここで前記構成要素は、放射性同位体、フルオロフォア、発色団、結合リガンドまたは酵素基質であり、したがって前記シグナル構成要素によって、前記構成要素の検出が可能になる。認識分子に接合することができるシグナル分子の例は、酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ、化学発光化合物、例えばアクリジニウムエステル、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド(phthaldehyde)およびフルオレサミン(fluorescamine)を含む好適な蛍光標識化合物であるが、これらには限定されない。

本発明の他の観点において、本明細書中に記載した認識分子と競合する分子を、提供する。
本発明の他の観点において、試料中のビタミンＤの検出のための方法を提供し、当該方法は、試料を本発明の分子と接触させ、試料中に存在するビタミンＤの量を決定することを含む。

この方法は、ビタミンＤレベルを決定する際のビタミンＤのＤＢＰからの解離の必要条件を否定し、したがってビタミンＤをより迅速かつ単純にアッセイすることを可能にする。ｈｏｌｏ−ＤＢＰの試料中の量は、ビタミンＤの量との直接的な関係を有する。

当該方法を用いて、用いる認識分子に依存して種々の形態のビタミンＤを検出することもできる。例えば、ビタミンＤを処理するにあたっての腎臓の機能を評価するべきである場合には、１，２５（ＯＨ）_２Ｄについての認識分子を用いることができ、またはビタミンＤの血中の量を評価するべきである場合には、ＤＢＰに結合するすべてのビタミンＤを認識する一般的な認識分子を用いることができるか、またはＤＢＰに結合した血中のビタミンＤの主要な形態、即ち２５（ＯＨ）Ｄを認識するものを用いることができた。

好都合には、試料は、すべての組織試料または体液、好ましくは血液、血清または血漿であり得る。

そのような方法を豊富な種類の種々の方法で、かつ種々の原理に依存して行うことができることは、当業者によって理解されるだろう。例えば、使用において、認識分子を固定して、ｈｏｌｏ−ＤＢＰの試料の残余からの分離を可能にしてもよく、または可能にすることができ得る。前記認識分子を固定する場合には、それを、固体表面、例えばフィルターもしくは管の壁に、または他の例として、液体クロマトグラフィーにおいて用いるための担体もしくはマトリックス（それをカラム中に投入してもよい）に直接または間接的に結合させてもよい。認識分子を固定することができる場合には、これを、分子を特定の結合パートナーシップのメンバー（例えばビオチン／ストレプトアビジン）に結合させ、その後他のパートナーシップのメンバーを用いて、分子を試料の残余から固定するかまたは凝集させることによって達成してもよい。

当業者はさらに、当該方法を、場合によっては競合的または置換アッセイとして行ってもよく、それによって、例えば、任意に標識されていてもよく、認識分子への結合についてｈｏｌｏ−ＤＢＰと競合する分子（即ちｈｏｌｏ−ＤＢＰ競合分子）を用いてもよいことを理解する。さらに、ｈｏｌｏ−ＤＢＰ認識分子および／またはｈｏｌｏ−ＤＢＰ−認識分子複合体と相互作用する追加の分子をまた、本発明の特定の態様において用いてもよいことが理解される。

本発明の種々の態様において、いずれかまたは両方が溶液中で固定されるかまたは沈殿してもよい認識分子および／またはｈｏｌｏ−ＤＢＰ競合分子を測定することが所望され得る。他の態様において、適切に標識したｈｏｌｏ−ＤＢＰ競合分子と適切に標識した認識分子との間の空間的相互作用を測定することは好都合である。

本発明の種々の態様において利用することができる広範囲の検出手法がある。直接的評価、例えば質量分析法またはＨＰＬＣを用いることができるか、または好都合には、用いる構成要素を、シグナル分子または標識、例えば発光性、化学発光性、放射活性、蛍光性であるもの、比色検出に適するもの、結合タンパク質、エピトープまたは酵素または基質に結合させてもよい。さらに、放射性標識または電気化学的標識を、任意に構成要素中に包含させてもよい。実際には、当該分野において知られているすべてのシグナル分子または標識を、場合によっては本発明の態様中に包含させてもよい。

当業者は、本発明の方法を種々のシステム、例えば放射免疫測定アッセイ(radioimmunometric assay)（ＩＲＭＡ）および酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）、免疫沈降および液体クロマトグラフィー、ならびに直接的分析様式、例えば表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance）、表面音響波（Surface Acoustic Wave）および水晶振動子マイクロバランス（Quartz Crystal Microbalance）方法を用いて行うことができることを理解する。

好都合には、認識分子を、マイクロタイタープレート上に、または微粒子、例えばビーズ上に固定し、ここでビーズは、ラテックス、ポリスチレン、シリカ、キレート化セファロースを含み、かつ／または磁性である。
本発明の他の観点において、ｈｏｌｏ−ＤＢＰをａｐｏ−ＤＢＰから、本明細書中に記載した認識分子を用いて分離する方法を提供する。

本発明の他の観点において、上記のようにビタミンＤを検出する方法またはｈｏｌｏ−ＤＢＰをａｐｏ−ＤＢＰから分離する方法のための、本明細書中に記載した分子を含むキットを提供する。

本発明をここで、以下の非限定的な例によって例示する。以下の例において、ｈｏｌｏ−ＤＢＰは、２５−ＯＨ−Ｄ_３の複合体（Merck Chemicals Ltd.から得られる、カタログ番号679102）および混合タイプＤＢＰ（またMerck Chemicals Ltd.から得られる、カタログ番号345802）であるが、同様にすべての形態のビタミンＤおよびすべての形態のＤＢＰの複合体、特定の形態のビタミンＤおよび不特定の形態のＤＢＰの複合体または不特定の形態のビタミンＤおよび特定の形態のＤＢＰの複合体に関連し得る。
本発明を、添付した図面に関して記載する。

図１は、抗体生産脾臓細胞の骨髄腫細胞との初期融合の後の、ｈｏｌｏ−ＤＢＰ抗体のｈｏｌｏ−ＤＢＰ（１μｇ／ｍＬ）およびａｐｏ−ＤＢＰ（１μｇ／ｍＬ）への示差的な結合（differential binding）を示す。図２は、第１ラウンドの限界希釈の後の、ｈｏｌｏ−ＤＢＰ抗体のｈｏｌｏ−ＤＢＰ（１μｇ／ｍＬ）およびａｐｏ−ＤＢＰ（１μｇ／ｍＬ）への示差的な結合を示す。

図３は、第２のラウンドの限界希釈の後の、ｈｏｌｏ−ＤＢＰ抗体のｈｏｌｏ−ＤＢＰ（１μｇ／ｍＬ）およびａｐｏ−ＤＢＰ（１μｇ／ｍＬ）への示差的な結合を示す。図４は、ＳＥＬＥＸプロセスを示す。

例１
モノクローナル抗体の調製
ｈｏｌｏ−ＤＢＰ（ＤＢＰに複合したビタミンＤ）に対するマウスモノクローナル抗体を、KohlerおよびMilsteinの方法(G. Kohler and C. Milstein Nature, 1975 256, 495)の改変によって調製する。雌のＢａＬｂ／Ｃマウスを、非共役ｈｏｌｏ−ＤＢＰ（マウスあたり５０μｇ）の皮下注射によって免疫する。免疫原を、フロイント完全アジュバント中に提示する。フロイント不完全アジュバント中に提示した抗原追加免疫を施与して、抗体応答を増強する（追加免疫あたりマウスあたり２０μｇ）。免疫応答を、ｈｏｌｏ−ＤＢＰに対する固相イムノアッセイによってモニタリングする。マウスに、脾臓細胞の回収およびマウス骨髄腫細胞との融合の前に４回または５回の追加免疫を施与する。

脾臓リンパ球および骨髄腫細胞の融合
免疫マウス脾臓細胞を、ＮＳＯマウス骨髄腫細胞と、ＰＥＧの存在下で融合する。細胞を、培養皿のウェル中に播種し、選択的ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）培地の存在下で増殖させ、それによって、融合した脾臓細胞および骨髄腫細胞の選択が可能になる。融合細胞からの上清を、ｈｏｌｏ−ＤＢＰおよび／またはａｐｏ−ＤＢＰに対する反応性について、標準的な固相イムノアッセイ手法によって試験する（以降の例（１または２以上）を参照）。

免疫グロブリン画分の腹水からの単離
免疫グロブリン画分を腹水から単離するために、免疫グロブリン画分を、先ず４℃にて腹水から、等しい容量の飽和硫酸アンモニウム溶液を加えることによって沈殿させる。沈殿物を遠心分離し、次に最初の腹水の容積に等しい容積の標準的なTris緩衝液に溶解し、次に同一のTris緩衝液に対して透析する。免疫グロブリン溶液を、モノＱカラムおよび塩勾配を用いてさらに精製して、免疫グロブリンを溶離させる。免疫グロブリン画分を、次に抗原に対する免疫応答について試験する。

例２
ポリクローナル抗血清の調製
ｈｏｌｏ−ＤＢＰに対するポリクローナル抗血清を、ヒツジまたはウサギにおいて、ｈｏｌｏ−ＤＢＰを用いて、Methods in Enzymology, H. Van VunatisおよびJ.J. Langone（編）、1981, (729b)および1983, 92(E)に記載されている方法によって生産させることができる。当該分野において知られている他の種をまた、ポリクローナル抗体の生産に用いてもよい。

ｈｏｌｏ−ＤＢＰについて選択性であるポリクローナル抗体を、当業者によく知られている手法、例えばアフィニティー精製を用いて単離することができる。例えば、ポリクローナル抗血清を、ｈｏｌｏ−ＤＢＰでコートした固相と共にインキュベートすることができ、その後、固相に結合していない物質を、ｈｏｌｏ−ＤＢＰに結合することができる分子のみを残留させて洗浄して除去することができ、それら自体を固相から、カオトロピックイオンを用いることを含む多数の手法によって放出させることができる。放出された抗体を次に、ａｐｏ−ＤＢＰでコートした固相と共にインキュベートし、したがってａｐｏ−ＤＢＰを上回るｈｏｌｏ−ＤＢＰについての特異性を示す当該抗体のみを溶液中に残留させることができる。

例３
ファージディスプレイライブラリーのパニング
ＤＢＰと複合したビタミンＤを結合するが、ビタミンＤまたはＤＢＰを単独で認識しない前述の特性を有する抗体についての選別を、ファージの表面上でのコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーを用いて行い、それは、Barbas C.F. and Lerner, R.A. (1991) Combinatorial immunoglobulin libraries on the surface of phage (phabs). Rapid selection of antigen-specific Fabs. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2: 119-124に記載されている通りである。

所望される抗体を示すファージを、「ファージパニング」によって選択し、それは、固相イムノアッセイとの類似点を有する手法である。ｈｏｌｏ−ＤＢＰを、固体表面、例えばマイクロタイタープレート、例えば限定しないで磁気ビーズなどのビーズ、またはカラム上に固定する。次にファージを加え、放置してｈｏｌｏ−ＤＢＰと相互作用させる。洗浄してすべての相互作用していない物質を除去した後に、結合したファージを溶離させ、新たな細菌性宿主細胞中で複製によって増幅する。ｈｏｌｏ−ＤＢＰについての抗体の選択を増強するために、増大する濃度のａｐｏ−ＤＢＰを、ｈｏｌｏ−ＤＢＰと相互作用させる際に溶液相に加える。この選択プロセスを数回繰り返して、ｈｏｌｏ−ＤＢＰを結合する抗体のみを発現するファージの集団について選択する。

抗体遺伝子をファージコートタンパク質を伴わずに発現させなければならないため、抗体遺伝子を次に単離し、発現ベクター中に挿入して、可溶性の抗体断片を生産する。これを、標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅または制限酵素を用いることによって達成することができ、ここで軽鎖および重鎖についてのＦａｂ遺伝子を単離し、新たなベクター中にクローン化する。ｆａｂ断片を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中５μｇ／ｍＬにてプレート上にコートしたａｐｏまたはｈｏｌｏ−ＤＢＰのいずれかへの示差的な結合について、試験する。Ｆａｂを、ＰＢＳ中の０．１μｇ／ｍＬまたは２μｇ／ｍＬのいずれかの濃度にてアッセイする。

モノクローナル抗体を生産するために、ベクター−Ｆａｂ遺伝子を、新たな宿主中に形質転換し、単一のコロニーとして単離する。いくつかのコロニーを単離し、抗体発現を誘発し、モノクローナル抗体の細胞溶解による放出に続いて、溶解物を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によってｈｏｌｏ−ＤＢＰに対する抗体の存在について試験する。

例４
抗体結合アッセイおよびクローン選択
NUNC maxisorbプレートを、ウェルあたり１００μＬのｈｏｌｏまたはａｐｏ−ＤＢＰのいずれかで、炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中１μｇ／ｍＬの濃度にて一晩コートする。翌日、コーティング混合物を捨て、プレートを、ＢＳＡ（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．５中２ｍｇ／ｍＬ）で６０分間室温にてブロッキングする。プレートを、ＰＢＳ＋０．１％ tween 20（ＰＢＳＴ）で１回洗浄する。試料、即ちＰＢＳで希釈した出血／細胞上清材料を、ｈｏｌｏまたはａｐｏ−ＤＢＰのいずれかと共に６０分間室温にてインキュベートする。ｈｏｌｏ−ＤＢＰに特異性であって、ａｐｏ−ＤＢＰに特異性でない抗体の選択を推進するため、増加する過剰濃度（即ちタンパク質の関連するコーティング濃度と比較して１０〜１００倍過剰、即ち試料あたり１μｇ〜１０μｇ）におけるａｐｏ−ＤＢＰ（即ち結合したビタミンＤが欠如したＤＢＰ）もまた、ｈｏｌｏ−ＤＢＰでコートしたウェル中でのインキュベーションの前に１時間のプレインキュベーションのための抗体溶液に加えてもよい。

次に上清を捨て、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。ＰＢＳでの１：５０００の希釈にて用いる二次抗体（セイヨウワサビペルオキシダーゼに接合したヤギ抗マウス抗体、Bio-Radカタログ番号170-6516）を、プレートと共に６０分間室温にてインキュベートする。プレートを、次にＰＢＳＴで３回洗浄し、その後テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Biopanda Diagnosticsから得られる、カタログ番号TMB Solution II）を加える。反応を、２ＭのＨ_２ＳＯ_４を加えることによって停止する。次に４５０ｎＭにおける試料吸光度／光学密度の読み取りを、分光光度計において測定する。図１は、抗体生産脾臓細胞の骨髄腫細胞との初期融合の後に生産された一連の実験からの抗体の、ｈｏｌｏ−ＤＢＰおよびａｐｏ−ＤＢＰへの典型的な示差的な結合を示す。表１は、ｈｏｌｏ−ＤＢＰ抗体上清のａｐｏ−ＤＢＰとの交差反応性を示す。

ｈｏｌｏ−ＤＢＰについてのａｐｏ−ＤＢＰより特異性を示すすべてのウェル（試料）を、さらに選別する。抗体生産細胞が得られるすべてのウェルからの試料を除去し、少なくとも２ラウンドの標準的な限界希釈クローニング手順によってクローン化する。各々のラウンドの限界希釈の後、クローン上清を、ｈｏｌｏ−ＤＢＰについてのａｐｏ−ＤＢＰより特異性を示す抗体の発現について、上記で示したように試験する。

それぞれ第１および第２ラウンドの限界希釈の後の、ｈｏｌｏ−ＤＢＰ抗体クローンのｈｏｌｏ−およびａｐｏ−ＤＢＰへの示差的な結合についての一連の実験からの結果について、図２および３を参照。またｈｏｌｏ−ＤＢＰ抗体上清のａｐｏ−ＤＢＰとの交差反応性について、表２および３を参照（表２は図２の試料に関し、表３は図３の試料に関する）。

抗体ｍＲＮＡをまた、クローン細胞ペレットから単離してもよい。ｍＲＮＡを、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに変換する。可変ドメインプライマーを用いてモノクローナル抗体ＤＮＡの可変重鎖および可変軽鎖領域を共に増幅するＰＣＲ反応を行い、抗体の可変重鎖および軽鎖（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ断片（しかしこれらの抗体断片に限定されない）を、他の発現系、例えば大腸菌、酵母、哺乳動物細胞系または当該分野において知られている他の発現系において、標準的な分子生物学的手法を用いて発現させてもよい。Le Gall F. et al FEBS Letters, 453 (1999)164-168およびKortt A.A. et al Biomolecular Engineering,18 (2001) 95-108に記載されている可変重鎖と可変軽鎖との間のリンカー長さの操作を用いて、多量体（例えば二量体、三量体、しかしこれらに限定されない）ｓｃＦｖ抗体断片の発現について選択することができる。

例５
アプタマーの調製
ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーの単離を、インビトロ選択プロセスである試験管内進化法（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment；ＳＥＬＥＸ）を用いて行う。ＳＥＬＥＸプロセスについて、図４を参照。

各々特有の配列を有する約１０^１４個のオリゴヌクレオチド配列のプールを、標準的な自動化オリゴヌクレオチド合成方法を用いて産生させる。開始プールは、典型的には約６０〜８０個のヌクレオチドの範囲内の配列長を有するが、これに限定されない。

次にオリゴヌクレオチドを、例６に記載するように固定されたｈｏｌｏ−ＤＢＰに対して選別する。ｈｏｌｏ−ＤＢＰを、固体表面、例えばマイクロタイタープレート、例えば限定しないで磁気ビーズなどのビーズ、またはカラム上に固定する。オリゴヌクレオチドを、ｈｏｌｏ−ＤＢＰと共に、増大する量のａｐｏ−ＤＢＰの存在下で放置してインキュベートする。低い親和性を有する分子は、溶液中に残留し、洗浄によって除去することができる。すべてのｈｏｌｏ−ＤＢＰ結合オリゴヌクレオチド、即ちアプタマーを、ｈｏｌｏ−ＤＢＰから精製して除去し、増幅し、ＳＥＬＥＸプロセスの以降のラウンドにおいて用いる。当該サイクルを、ｈｏｌｏ−ＤＢＰに対するアプタマーが残余のオリゴヌクレオチド集団の大部分であるまで繰り返す。

最終的なアプタマーは、通常２０〜４０個のヌクレオチドの範囲内の長さを有し、これらのアプタマーをクローン化し、配列決定する。
図４に述べたアプタマー産生のためのＳＥＬＥＸプロセスを用いた。

例６
ｈｏｌｏ−ＤＢＰについての認識分子を用いた間接的なアッセイ様式
ｈｏｌｏ−ＤＢＰ、およびしたがって血漿／血清試料中のビタミンＤ濃度の間接的な測定のための好適な分析様式の例は、放射免疫測定アッセイ（ＩＲＭＡ）および酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）および微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）を含む。競合的アッセイにおいて、ｈｏｌｏ−ＤＢＰを、検出可能な標識で標識することができる。ｈｏｌｏ−ＤＢＰを含む試料を、ｈｏｌｏ−ＤＢＰに特異的な認識分子および標識したｈｏｌｏ−ＤＢＰと共にインキュベートすることができ、免疫複合体の生成、分離および検出の後に、ｈｏｌｏ−ＤＢＰの試料中の濃度を測定することができる。ｈｏｌｏ−ＤＢＰの量は、試料中のビタミンＤの濃度に関連する。

認識分子が、例えばＤＢＰに結合した２５（ＯＨ）Ｄに特異的である場合には、２５（ＯＨ）Ｄの試料中の濃度を測定する。

認識分子に接合することができるシグナル分子の例は、酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ、化学発光化合物、例えばアクリジニウムエステル、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレサミンを含む好適な蛍光標識化合物であるが、これらには限定されない。

認識分子を、他の方法で放射標識するかまたは電気化学的に標識してもよい。
つまり、血漿または血清試料中のｈｏｌｏ−ＤＢＰ、したがってビタミンＤ濃度を、固体表面、例えば抗ＤＢＰ抗体で前コーティングした(pre-coated)９６ウェルプレートまたは磁気もしくはラテックス微粒子の表面であるが、これらには限定されないものの上にｈｏｌｏ−ＤＢＰを捕獲することによって測定する。次に、ｈｏｌｏ−ＤＢＰを、前に記載したようにシグナル分子に接合した抗ｈｏｌｏ−ＤＢＰ抗体を用いて測定する。ビタミンＤの濃度を、検量線から決定する。

逆に、マイクロタイタープレートまたは微粒子（それはラテックスまたは磁性であり得る）を、抗ｈｏｌｏ−ＤＢＰ抗体または他の認識分子でコートしてもよい。この抗体または他の認識分子は、血漿または血清試料中のｈｏｌｏ−ＤＢＰを捕獲する。マイクロタイターウェル／微粒子を、次に洗浄して、結合していない試料材料を除去し、標識した抗ＤＢＰ抗体、抗ビタミンＤ抗体、抗ｈｏｌｏ−ＤＢＰ抗体または他の認識分子を、捕獲されたｈｏｌｏ−ＤＢＰと共にインキュベートする。必要であれば、次に基質を加え、標識の存在を測定する。産生したシグナルの量は、試料中のｈｏｌｏ−ＤＢＰの量に直接関連する。試料中のｈｏｌｏ−ＤＢＰの量は、試料中のビタミンＤの濃度に直接関連し、検量線から測定することができる。

例７
ｈｏｌｏ−ＤＢＰについての認識分子を用いた直接的なアッセイ様式
つまり、ｈｏｌｏ−ＤＢＰ認識分子をまた、ｈｏｌｏ−ＤＢＰおよびしたがって２５（ＯＨ）ビタミンＤの直接的な検出において用いてもよい。例えば、Surface Plasmon Resonance、Surface Acoustic WaveおよびQuartz Crystal Microbalance方法（Suzuki M, Ozawa F, Sugimoto W, Aso S. Anal Bioanal Chem 372:301-304 2002；Pearson J E, Kane J W, Petraki-Kallioti I, Gill A, Vadgama P. J Immunol Methods; 221 :81-94 1998；Weisch W, Klein C, von Schickfus M, Hunklinger S. Anal Chem; 68 2000-20004, 1996；Chou S F, Hsu W L, Huang J M, Chen C Y. Clin Chem 48:913-918, 2002）などの手法を用いる。

例８
近接ライゲーションアッセイ
また近接ライゲーションと呼ばれる近接探索は、近接プローブを検出することができる手法であり、巨大分子、例えばタンパク質の特異的、感受性かつ迅速な検出のために用いられる。近接ライゲーションは、標的分子、例えばビタミンＤを結合することによって空間的近接とするべき個別の非重複合成オリゴヌクレオチドに結合する抗体、ペプチド、タンパク質またはアプタマーであり得る２種の付着性の分子に依存する。２種の非重複オリゴヌクレオチドを一緒にする架橋として作用する第３のオリゴヌクレオチドを導入し、ＤＮＡリガーゼが近接するＤＮＡ要素を完成するのを可能にする。リアルタイム蛍光定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって、一緒にうまくライゲーションされたＤＮＡ断片のみの増幅が可能になる。

Claims

ｈｏｌｏ−ＤＢＰを認識するが、ａｐｏ−ＤＢＰを認識しない、分子。
ｈｏｌｏ−ＤＢＰを認識し、ａｐｏ−ＤＢＰに対する比較的低い親和性を有する、分子。
ａｐｏ−ＤＢＰに対する交差反応性が１０％より低い、請求項２に記載の分子。
ａｐｏ−ＤＢＰに対する交差反応性が１％より低い、請求項３に記載の分子。
さらにシグナル構成要素を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分子。
分子がビタミンＤを認識しない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分子。
分子がビタミンＤを認識する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分子。
ｈｏｌｏ−ＤＢＰが、ＤＢＰと関連する２５（ＯＨ）Ｄを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分子。
ＤＢＰが混合タイプのＤＢＰである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分子。
分子が抗体またはその断片である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の分子。
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の分子と競合する、分子。
試料中のビタミンＤの検出のための方法であって、試料を請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分子と接触させ、試料中に存在するビタミンＤの量を検出することを含む、前記方法。
結合したｈｏｌｏ−ＤＢＰの量が、試料中のビタミンＤの量を示す、請求項１２に記載の方法。
試料が体液である、請求項１２または１３に記載の方法。
体液が血漿または血清である、請求項１４に記載の方法。
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分子を用いて、ｈｏｌｏ−ＤＢＰをａｐｏ−ＤＢＰから分離する方法。
請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のビタミンＤを検出する方法または請求項１６に記載のｈｏｌｏ−ＤＢＰをａｐｏ−ＤＢＰから分離する方法のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分子を含むキット。