JP7300452B2 - エンドサイトーシスビタミンdの状態の測定方法 - Google Patents
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Description
複雑な生物学的機能は、複雑なタンパク質間相互作用ネットワークを通じて現れる。タンパク質間相互作用の重要なクラスは、ペプチドを介した相互作用に対応し、1つのパートナーからの短いペプチドストレッチが他のパートナーからの大きなタンパク質表面と相互作用する。タンパク質-ペプチド相互作用は、一般的に親和性が低く、タンパク質相互作用ネットワークを動的に再形成する調節メカニズムに関与する。比較的小さい相互作用表面のため、タンパク質-ペプチド相互作用の調節は、例えば治療目的のために、実行可能であり及び非常に魅力的であると考えられてきた。残念ながら、利用可能なタンパク質-ペプチド界面の三次元構造の数は非常に限られている。しかしながら、ビタミンDの輸送及び代謝の文脈におけるDBPと他のタンパク質、特にメガリン/LRP2(UniProtKB/Swiss-Prot、タンパク質アクセッション番号P98164、ヒト)との相互作用に関する情報は、限定的であるか又は全くなかった。DBPとメガリンのペプチドレベルでの潜在的な相互作用を調べるために、PepSite2プログラム(http://pepsite2.russelllab.org)を用いてペプチド結合スポットを予測した。PepSite法は、既知のタンパク質-ペプチド三次元構造のセットから計算された好ましいペプチド結合環境と、既知のペプチドから得られる距離制約とを組み合わせたものに依存する。Pepsiteの予測によれば、メガリンは、ドメイン2及び3に位置するリガンド結合性リピート9、13-15、16、19、22-25;27及び29を介してヒトビタミンD結合タンパク質と相互作用する可能性が高い(図1Aを参照のこと)。
精製された可溶性メガリンM1又はM2断片とDBP単独又はビタミンD代謝物で占有されたDBPとの形成された複合体のさらなる特性決定のために、得られた複合体をマイクロスケール熱泳動によってさらに分析し、その結果を図5Aに示す。マイクロスケール熱泳動(MST)は、ミクロな温度勾配(熱泳動)の中での粒子の方向性のある動きを調べる。生体分子の構造変化による水和シェルの変化は、温度勾配に沿った動きの相対的な変化をもたらす。この原理を利用して、2つの分子の結合親和性を決定し得る。この技術により、特に表面に固定化することなく、溶液中の相互作用を調べることができる。空間的な温度差は、高温領域での分子濃度の低下をもたらし、そしてこれが決定され得る。熱泳動は通常、蛍光標識された分子を用いて行われる。
種々のメガリン可溶性断片の結合特性を、ヒト対象の血清及び血漿試料を用いた共免疫沈降により、さらに分析した。その結果を図6Aに示す。精製された可溶性メガリンM1タンパク質を、試料中に存在する可溶性メガリンM1断片及び内因性DBPとの相互作用を可能にするために、2つのヒト血清又は血漿試料と混合した。試料を、樹脂へのメガリンM1/DBPの相互作用を可能にするために、Ni-NTA樹脂でインキュベートした。樹脂を洗浄した後、結合した複合体を樹脂から溶出させ、ウエスタンブロット法でアッセイした。図6A(右)は、DBPが両方の試料に存在し、特異的な抗体を用いて検出することができたことを示す。図6A(左、上側ブロット)は、プルダウンされたDBPの存在によって示されるように、精製された可溶性メガリンM1断片が、全ての試料においてDBPと溶液中で相互作用したことを示す。注目すべきことに、血清のみを含むがメガリンタンパク質を含まない対照試料を使用しても、DBPは検出されなかった。精製メガリンM1タンパク質の存在は、抗6xHisタグ抗体を用いて、全ての試料において検出された(図6A、左、下側ブロット)。
DBP、ビタミンD3、メガリンの三元複合体(M1及びM2断片)の割合を詳細に測定するために、メガリンコートプレートを用いたELISAを開発した。血清試料中のDBPの総量は、市販のDBP用ELISAを用いて測定した。その結果を図6Bに示す。アッセイは、血清中のDBPの総量のわずかな割合(0.0028%)のみが、水酸化ビタミンD3と結合しており、メガリンと結合し得ることを示す。メガリンM1断片を用いたアッセイでは、9.45ng複合体/mLの血清濃度値が得られた。メガリンM2断片の場合、約12.89ng複合体/mLの血清の値が得られた。これは、メガリン断片がプロホルモンとの複合体のときにDBPのみを行ったことを示す証拠である。このようにメガリンは、臨床試料中の生理的に活性化されたプロホルモン(DBPに結合している)を検出し及び定量するための手段と考えられ得る。
組換えメガリン断片の製造。メガリン(LRP2)cDNA断片は、Caco-2細胞(ヒト大腸癌上皮細胞)由来のmRNAを用いて、RT-PCRにより増幅させた。cDNA転写合成には、Maxima H Minus First strand cDNA合成キット(Thermo Scientific)を用いた。本キットは20kbまでのcDNAを合成し得る。オリゴdt18プライマー及び65Cを用いた。PCR反応には、Platinum PCR SupermixハイフィデリティPCRキット(Invitrogen)を使用した。メガリンM1 cDNA:1158bp;メガリンM2 cDNA:1215bp;メガリンM3 cDNA:1482bp。
メガリン複合ELISA結合アッセイ。マイクロタイタープレートに可溶性精製メガリンM1又はM2断片(PBS1Xで希釈した1μg/100μl)をコーティングし、2時間、室温でインキュベートした。25-ヒドロキシビタミンD3(VD3)0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20ngを100μlのPBSで連続希釈し、それぞれ1μgのDBP(DBP)を混合した。この混合物を37℃で1時間インキュベートした。非特異的な結合部位をブロッキングバッファー(PBS1X中の1%BSA)で1時間室温でブロッキングした。DBP-VD3混合物又は血清試料をメガリンコートウェルに添加し、4℃で一晩インキュベートした。PBST-バッファー(PBS中の0.05% Tween 20)で洗浄後、100μlのウサギ抗DBP抗体(1:3500で希釈したブロッキングバッファー)を添加し、室温で2時間インキュベートした。PBSTで洗浄した後、HRP共役ロバ抗ウサギ第2抗体(ブロッキングバッファーで1:500希釈)100μlを添加し、37℃で1時間インキュベートした。100μlの基質試薬A+B(1:1)(R&D)を添加し、室温で30分間インキュベートした。その後、100μlの停止液をウェルに添加した。吸光度は450nmで読み取った。その値を、既知の25-ヒドロキシビタミンD3濃度の標準値と比較した。
組換え精製可溶性メガリン及びヒト血清からのDBPの共免疫沈降。Ni-NTA精製可溶性メガリンM1又はM2タンパク質断片(3μg)を、最初にヒト血清又は血漿試料(30μl)と混合した。これらの試料を50μlの前平衡化Ni-NTA樹脂で4℃で一晩インキュベートした。樹脂をH-バッファー+20mMイミダゾールで3回洗浄した。結合した複合体を200mMイミダゾールを含有するH-バッファーで溶出し、DBPに対するポリクローナルウサギ抗体(Abcam)を用いたウエスタンブロットで分析した。
可溶性メガリンを用いたビタミンDの状態を決定するための免疫比濁法アッセイ。Ni-NTA精製可溶性メガリンM1又はM2タンパク質断片(3μg)を、最初にヒト血清又は血漿試料(30μl)と混合する。試料を50μlの前平衡化Ni-NTA樹脂で4℃で一晩インキュベートする。樹脂をH-バッファー+20mMイミダゾールで3回洗浄する。結合した複合体を200mMイミダゾール含有H-バッファーで溶出する。溶出した複合体をビタミンD結合タンパク質に対する抗体を水溶液に接触させる。濁度の増加は、標準の濁度計で測定され、既知の25-ヒドロキシビタミンD3濃度の標準値と比較される。
直線性の範囲を決定するためのELISA結合アッセイ。マイクロタイタープレートに、精製メガリンM1又はM2タンパク質断片(PBS1Xで希釈した1μg/100μl)を2時間、室温でインキュベートすることによりコーティングした。DBPと25-ヒドロキシビタミンD3(VD3)、25-ヒドロキシビタミンD2(VD2)又は24,25-ヒドロキシビタミンD(24,25VD)の混合物を、20μgのDBP及び100μlのPBS中の連続希釈VD(0、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50ng)と混合することによって調製した。混合物を37℃で1時間インキュベートした。プレートブロッキング後、上記調製したDBP-VD混合物をメガリンコートウェルに添加し、4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを100μl希釈したウサギ抗DBP抗体(ブロッキングバッファーで希釈した1:1000)で2時間、室温でインキュベートし、次いで、100μlのHRP共役ロバ抗ウサギ抗体(ブロッキングバッファーで希釈した1:500)で37℃で1時間インキュベートした。基質反応後、450nmで吸光度を読み取った。アッセイは50ng/mlまで直線的であった。感度限界は2.0ng/mlとした。
マイクロスケール熱泳動アッセイ。精製DBP(Merck,345802)をMonolith Protein Labeling Kit Red(NanoTemper Technologies,Munich,DE)を用いて赤色蛍光色素NT-647で標識した。Ni-NTA精製メガリン断片(M1、M2)を0.488~1000nmol/Lの範囲で滴定した。精製DBP(Merck,345802)を、Monolith Protein Labeling Kit Redを用いて赤色蛍光色素NT-647で標識した。25-ヒドロキシビタミンD3(VD3)を0.0488~100nmol/Lの範囲の濃度で滴定した。25-ヒドロキシビタミンD2(VD2)、24,25-ヒドロキシビタミンD(24,25VD)及び3epi25(OH)VD3を0.0163~37nmol/Lの範囲の濃度で滴定した。50nMのNT-647標識DBPにVD3、VD2、24,25VDをそれぞれ37.8nM添加した。測定には、Monolith NT.115デバイス(NanoTemper Technologies)を使用した。解析には、NT解析ソフトウェアバージョン1.427(NanoTemper Technologies)を使用した。変数:レーザーパワー、100%;LED、80;レーザーのオンタイム、30秒;レーザーのオフタイム、5秒;温度、25℃。FNorm:正規化蛍光;Kd:解離定数。
Claims (13)
- 対象からの体液試料中のビタミンD及びその代謝物を測定する方法であって、前記体液試料は、内因性ビタミンD結合タンパク質(DBP)を含有し得、前記方法は、
a)結合条件下で前記体液試料をメガリン及び/又はその断片と接触させてDBP、ビタミンD代謝物及びメガリン又はその断片を含む三元複合体を形成する工程と、
b)メガリン又はその断片によって結合したDBPの量を測定する工程と、
c)メガリン結合DBPの量を前記対象の前記ビタミンDの状態と関連付ける工程と、
を含む、方法。 - メガリンの前記断片が、配列番号01~配列番号10のアミノ酸配列のうちのいずれか1つを含む、請求項1に記載の方法。
- メガリンの前記断片が、アミノ酸配列番号1若しくは配列番号2又はそれらの組み合わせを含む、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- メガリンの前記断片が、ビタミンD結合タンパク質(DBP)のみと結合し、メガリンの他のリガンドのいずれとも結合しない、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 結合した前記ビタミンD代謝物を決定することを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 25-ヒドロキシビタミンD2、24,25-ジヒドロキシビタミンD2又は24,25-ジヒドロキシビタミンD3の存在下で、25-ヒドロキシビタミンD3を示差測定することを含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 既知の量のビタミンD結合タンパク質を前記体液試料に添加することを含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記体液試料をキュービリン及び/又はその可溶性断片と接触させることをさらに含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- DBPとの前記三元複合体が、粒子増強免疫比濁法又はネフェロメトリーによって決定される、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- DBPとの前記三元複合体が、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、RIA(ラジオイムノアッセイ)、FIA(蛍光イムノアッセイ)、L1A(発光イムノアッセイ)又はILMAの群から選択されるイムノアッセイによって決定される、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- (a)固相に結合した規定量のメガリン及び/又はその可溶性断片を提供する工程と、
(b)前記体液試料を、メガリン及び/又はその可溶性断片を結合した前記固相と接触させる工程と、
(c)ビタミンD結合タンパク質(DBP)及びビタミンD代謝物によって形成される複合体にメガリン及び/又はその可溶性断が結合することを可能にする条件を作成する工程であって、ビタミンD結合タンパク質(DBP)単独ではメガリン及び/又はその可溶性断片に結合しない工程と、前記固相を洗浄する工程と、
(e)DBP、ビタミンD又はその代謝物及びメガリン又はその可溶性断片を含む前記三元複合体を認識する抗体を提供する工程と、
(f)ビタミンD結合タンパク質(DBP)及びビタミンD代謝物に結合した前記メガリン及び/又はその可溶性断片を、前記抗体と接触させて免疫複合体を形成し、前記免疫複合体を前記固相上に固定化する工程と、
(g)前記固相に結合した前記抗体の量を測定し、標準試料との相関により血漿又は血清である前記体液試料中の前記ビタミンD代謝物を定量する工程と、
を含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。 - 体液試料中のビタミンD状態を決定する方法において使用するための試験キットであって、ビタミンD結合タンパク質(DBP)に対する抗体及び任意選択で担体に結合された、メガリンの断片を含む、キット。
- 体液試料中のビタミンD代謝物を測定するための組成物であって、ビタミンD結合タンパク質(DBP)のエピトープに対する抗体及びメガリンの断片を含む、組成物。
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