CN105247372A - 用于测定维生素d代谢物的方法和试剂 - Google Patents

用于测定维生素d代谢物的方法和试剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于释放结合性维生素D的方法，这是通过使得一种含维生素D的试样与一种释放剂接触的方式实现的，所述释放剂包含至少一种助水溶性物质和至少一种过渡金属盐。所述被释放的维生素D可接着被定量地测定。另外，本发明还涉及一种用于释放和任选的测定维生素D的试剂，其包含至少一种助水溶性物质和至少一种过渡金属盐，以及涉及这种用于释放和任选的测定维生素D的释放剂的应用。

Description

用于测定维生素D代谢物的方法和试剂
技术领域
本发明涉及用于释放结合性维生素D的方法，这是通过使得含维生素D的试样与释放剂接触的方式实现的，这种释放剂包含至少一种助水溶性物质和至少一种过渡金属盐。所述被释放的维生素D可接着被定量地测定。另外，本发明还涉及用于释放和任选的测定维生素D的试剂，包含至少一种助水溶性物质和至少一种过渡金属盐，以及涉及这种用于释放和任选的测定维生素D的释放剂的应用。
背景技术
对于人而言，提供充足的维生素D非常重要。维生素D的最常见生理形态是维生素D3或维生素D2。维生素D3(Cholecalciferol)最重要的、具有生理效应的衍生物是25OHD3(25-羟基维生素D3或骨化二醇)和1，25(OH)2D3(1-alpha，25-二羟基维生素D3或骨化三醇)。通常，绝大多数的维生素D3并不像其他维生素那样是通过食物被吸收的，而是在UV光线的作用下在皮肤内生成的。其中，7-二羟基胆固醇通过UV照射被转换为预维生素D3，其中不稳定的中间产物会重组构成维生素D3。在食物中，维生素D3尤其是包含在脂肪丰富的鱼类中。维生素D的能够出现在人体中的另一种形态是维生素D2(钙化醇或麦角钙化醇)，其可出现在菌类中并且连同食物一起被吸收。维生素D3和维生素D2制剂则构成用于提供充足维生素D量的另一种来源。
维生素D及其天然的衍生物是非常疏水的分子。在血液中，维生素D输送是在与维生素D-结合-蛋白质(DBP)的复合物中实现的。DBP属于清蛋白族并且结合维生素D、维生素D代谢产物和脂肪酸。
在肝脏中，维生素D通过细胞色素P450在C-25位被氧化。所得25OHD(25-羟基维生素D3或25-羟基维生素D2)是主要存在于循环中的维生素D代谢物。血清中的25OHD浓度充当评价人体的维生素D状态的指标。
在肾脏和其他器官内，25OHD就转化为1，25(OH)2D即维生素D的生理活性形态，其在与维生素D受体(VDR)结合后调节依赖维生素D所调控(VDRE)的基因活性。
提供充足的维生素D，对于正常的骨结构以及对于要调控钙和磷酸盐再吸收而言，非常重要。借助1，25(OH)2D来活化受体，就将肠的钙吸收率提高了约30％以及将磷酸盐吸收率提高了约80％。当血清中25OHD的浓度下降到30ng/ml以下时，则其与肠内钙再吸收的明显减少以及甲状旁腺素浓度的上升有关。维生素D缺乏作为高骨折风险的骨质疏松的重要因素，关联于其他健康风险。由于血清中的维生素D浓度水平取决于食物吸收和日照而剧烈波动，25OHD血清浓度则充当用于确定维生素D供给状态的良好指标。因此，在医疗诊断中常规地进行血清25OHD浓度的测定。
25OHD和其他维生素D物质在DBP上的结合构成维生素D代谢物测定的重大障碍。所有测定方案都要以从DBP复合物中释放出维生素D代谢物作为前提。
为了能够测定血清中的维生素D及其代谢物，其必须将其从与DBP的结合中释放出来。这可通过不同的方法来进行，例如借助有机溶剂(例如乙醇、甲醇)析出DBP或者借助成相(phasenbildenden)溶剂例如氯仿或己烷由水相提取维生素D及其代谢物。
US7,482,162B2(ImmunodiagnosticSystemsLtd.)说明了使用8-苯胺基-1-萘磺酸铵盐(8-ANS)作为非竞争性抑制剂，用于释放与DBP结合的1，25(OH)2D。
WO2011/144661(RocheDiagnosticGmbH)说明了一种试剂混合物，其包含释放出碳酸盐或碳酸氢盐的物质和与之结合的还原剂和碱化物质，其中维生素D代谢物从DBP复合物的释放是在11至14的pH范围内进行的。
EP2126586(ImmundiagnostikAG)涉及借助蛋白酶K的蛋白水解法来使得DBP失活、由此引起维生素D代谢物释放并且随后在ELISA试验系统中测定维生素D代谢物的应用。
US7,087,395(Quest)涉及从DBP释放维生素D代谢物的方法：在pH13用碱性试剂混合物预处理血清，所述碱性试剂混合物由NaOH、洗涤剂、环糊精衍生物和水杨酸盐所组成。
WO2008/138783(NordicBiosciencesA/S)说明一种血清或血浆样品的预处理，其借助了双羟萘酸来从DBP复合物释放维生素D。
然而，目前所已知的用于从与DBP的复合物释放维生素D的方法要么投入巨大并且难以自动化，要么容易出现误差。
用来测定维生素D的可自动化的测试方法要求从与DBP的复合物中释放是在这样的条件下进行的，即其理想化地容许直接对反应混合物进行进一步分析。但DBP是非常稳定的蛋白质并且以相对高的血清浓度存在，其对应1900ng/ml的维生素D结合能力。这在平均25OHD-血清浓度为30ng/ml的情况下意味着25OHD结合能力超出了60倍。
因此，释放剂要将维生素D从与DBP的稳定结合中释放出来，其使得由于高DBP血清浓度而存在的维生素D结合能力显著过量失去活性，并且另外使得所释放的维生素D能够与测定试剂、通常是抗体相结合。
发明内容
因此，本发明的目的在于，提供用于释放结合性维生素D的试剂，该试剂解决了目前从蛋白质复合物释放结合性维生素D的问题并且也适用于在用于维生素D的直接定量测定的自动化方法中的应用。
现有技术的试剂成分的限制和不足至少有部分通过本发明得以克服。本发明提供了用于释放结合性维生素D的试剂，该试剂能够实现维生素D的有效释放。另外，这种试剂可包含维生素D的测定试剂。上述释放剂的使用提供的优点是：待测定的维生素D并非必须要从试样中分离出来。含有所加释放剂的试样可不经额外处理而直接进行免疫测定流程。相较于现有技术而言，这就使得测定维生素D的成本更低且更节省时间。
因此，通过本发明，提供了可靠且可自动化的用于测定维生素D、尤其是25-羟基维生素D3或25-羟基维生素D2的浓度的方法。
因此，本发明的第一方面涉及用于释放维生素D的体外方法，包括以下步骤：
a)使得含有结合性维生素D、尤其是含有与蛋白质的复合物形式的结合性维生素D的试样与释放剂接触，所述释放剂包含：
i.至少一种助水溶性物质；以及
ii.至少一种过渡金属盐；
以及
b)释放结合性维生素D。
如未另作说明，“维生素D”的表述即包括所有天然出现的化合物，其具有根据结构式I或II的维生素D2基础骨架或维生素D3基础骨架。
结构式I
结构式II
在上述结构式I和II中碳原子编号是根据类固醇命名法给出的。25-羟基维生素D表示维生素D代谢物，其在所述结构式I或II的25位上被羟基化，，也即25-羟基维生素D2以及25-羟基维生素D3。更多的羟基维生素D化合物是例如1，25-二羟基维生素D或24，25-二羟基维生素D。
1，25-二羟基维生素D涉及维生素D的活性形式(所谓的D激素)，其在所述结构式I和II的1位上以及25位上被羟基化。
其他的普遍所知的维生素D化合物包括24，25-二羟基维生素D2、24，25-二羟基维生素D3和C3-表-25-二羟基维生素D。
“释放结合性维生素D”的表述意味着维生素D完全地或至少部分地从含有与其相结合的蛋白质、尤其是DBP的复合物中分离出来。优选基本上存在于试样内的维生素D被全部释放出来。在这里，“基本上”意味着至少有90％、95％、98％并且优选至少99％的维生素D被释放出来。
“助水溶性物质”或“助水溶性化合物”的表述表示这样的化合物，其提高了不可溶或难溶的有机化合物在水性介质中的溶解度。在此，所述助水溶性化合物降低了水的表面张力，由此使得待溶解物质更容易分散(助水溶物)。
“过渡金属盐”的表述表示元素周期表中III-XII系或者说Ib-VIIb和VIII系的金属的无机盐或有机盐。
待检验的试样优选是例如由血液、血清、血浆或奶中所选出的生物学液体。所述试样通常来自生物，优选来自哺乳类动物，例如来自人体。
所述助水溶性物质优选是芳香酸和/或其酯、酰胺或者盐。其优选选自由N，N-二甲基苯甲酰胺、二甲基苯甲酸、1，2-萘醌磺酸、对甲苯磺酸、磺胺酸、蒽醌-2-磺酸、苯胺-2-磺酸和/或其的盐所构成的组。尤其优选所述助水溶性物质是甲苯磺酸和/或其的酯、酰胺或者盐。
另外，所述助水溶性物质优选具有12至18的HLB值。“HLB”(亲水亲油平衡值(hydrophiliclipophilicbalance))的表述是由W.C.Griffin所引入的表示非离子表面活化剂和乳化剂的亲水亲油性的单位。化合物的相应HLB值可通过本领域所已知的方法得出。
根据本发明方法的过渡金属盐优选包括5、6、7、8、10和/或12族金属的盐，例如钒、铬、锰、铁、钴、镍和/或锌的盐。尤其优选所述过渡金属盐是铁(III)盐，并且最优选氯化铁(III)或者柠檬酸铁(III)。其中，所述盐由过渡金属阳离子和无机或有机阴离子构成。
无机阴离子包括卤化物，例如氟化物、氯化物、溴化物或碘化物、硫化物、碳酸盐、碳酸氢盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐和硫氰酸盐。
有机阴离子包括羧酸阴离子，例如甲酸盐、乙酸盐、棕榈酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、延胡索酸盐、苯甲酸盐、马来酸盐或水杨酸盐，以及有机硫酸盐、例如十二烷基硫酸盐。
另外，所述释放剂可包含一种络合剂，优选柠檬酸盐、EDTA和/或其盐，最优选柠檬酸和/或其盐。“络合剂”的表述表示能够构成复合物的化合物，例如螯合剂。
释放剂优选以一定量加入试样，以便调节出200至1000mM、尤其是300至700mM的助水溶性物质最终浓度和5至100mM、尤其是10至40mM的过渡金属盐的最终浓度。释放剂优选以水性介质中的储备溶液形式出现，其包括相对于释放剂总重量而言5至30重量百分比、优选10至25重量百分比的助水溶性物质以及0.1至5重量百分比、优选0.2至2重量百分比的过渡金属盐。
本发明的另一个方面涉及用于测定维生素D化合物的体外方法，包括以下步骤：
a)使得含有结合性维生素D、尤其是含有与蛋白质的复合物形式的结合性维生素D的试样与释放剂接触，所述释放剂包含：
i.至少一种助水溶性物质；以及
ii.至少一种过渡金属盐；
b)释放结合性维生素D；
以及
c)测定所释放的维生素D。
根据步骤c)的对所释放维生素D的测定可在时间上在步骤a)和b)之后进行或者与步骤a)和b)一起进行。优选，步骤c)与步骤a)和b)同时实施而无需将释放剂从待测定的维生素D中分离，由此提供用于测定试样中的维生素D的一步方法。
在步骤c)中的维生素D浓度的测定优选为免疫学方法，在其中，待测定的维生素D与免疫性结合伴侣相结合，以便构成免疫复合物。“免疫性结合伴侣”的表述包括抗体。
适合的免疫学方法例如包括异相测定法、匀相测定法、夹心测定法、竞争测定法、酶免疫测定法、放射免疫测定法、荧光偏振免疫测定法、微粒酶免疫测定法和化学发光磁性免疫测定法。许多上述测试类型能够要么在一步方法中，要么在两步方法中实施。优选使用能够在一步方法中实施的测试类型。
“异相测定法”的表述涉及这样的方法，其中的所述免疫复合物需要与其他成分分离开来，例如通过洗涤。
“匀相测定法”的表述涉及这样的方法，其中的所述免疫复合物并非必须与其他成分分离开来。
“竞争测定法”的表述涉及这样的方法，其中存在于所述试样内的维生素D与可测定的(例如被标记的)示踪物竞争免疫性结合伴侣。
“夹心测定法”涉及这样的方法，其中的维生素D结合于两个免疫性结合伴侣之间，这两个结合伴侣其中的至少一个为可测定的(例如通过标记)。
“酶免疫测定法”涉及利用酶作为标记的方法。这些标记的实例是碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和β-半乳糖苷酶。ELISA(酶联免疫吸附测定)例如是优选的异相夹心酶联免疫测定。
“放射免疫测定法”涉及利用放射性同位素作为标记的方法。这种标记的实例是碘125。
适合的方法包括测定步骤。测定步骤可包括标记测定。在此可使用所有在本领域已知用于这样目的的标记。适合标记的实例包括酶标记(如上所述)；放射性同位素标记(如上所述)；荧光素标记、例如荧光素标记或若丹明标记；化学发光标记、例如鲁米诺或吖啶酯；以及多组氨酸标记。
尤其优选在步骤c)中使用竞争性免疫学方法来测定维生素D的浓度。适合的竞争性测试类型对于本领域人员而言是相当熟悉的。在典型的竞争性结合测试中，使得包含示踪物、即维生素D的标记形式的受体或抗体与待检验的试样接触。那么，以与受体或抗体相结合的形式存在的示踪物的量就反映了未标记的维生素D在试样内所占的份额。替代方案是，竞争性结合测试还可包括使得与示踪物相结合的受体或抗体与待检验的试样接触并且测量被挤出()的示踪物的量，该数量反映了试样中维生素D所占的分量。最优选使用以生物素标记的示踪物以及通过过氧化物酶标记的链霉亲和素进行的测定。
优选为了测定维生素D，不分离任何试样成分。方法步骤a)、b)和c)可在单一反应容器内进行，而不在各个方法步骤之间进行萃取或提纯。
通过根据本发明的方法所释放的并且待测定的维生素D包括了所有已知的维生素D化合物，例如25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2、1，25-二羟基维生素D3、1，25-二羟基维生素D2、维生素D3、维生素D2以及其混合物。尤其优选所述维生素D化合物为25-羟基维生素D3和/或25-羟基维生素D2。
本发明的另一方面涉及用于释放维生素D的试剂，包含：
a)至少一种助水溶性物质；以及
b)至少一种过渡金属盐。
所述试剂优选另外包含络合剂。优选使用柠檬酸盐、EDTA和/或其盐，尤其优选使用柠檬酸和/或其盐作为络合剂。
在另一种实施方式中，所述试剂另外包含至少一种用于测定维生素D的试剂。
本发明的另一个方面是上述试剂用于释放结合性维生素D和任选的用于测定所释放的维生素D的用途。
下面更详细地通过以下附图和实施例来说明本发明。
附图说明
图1：由与血清-DBP的结合中释放既定的25OHD3浓度以及与生物素-25OHD3示踪剂竞争的表征。为了对特异性25OHD竞争进行ELISA测定，在7.5ng/ml的生物素-25OHD示踪剂存在下，向不含维生素D的血清基质(SerCon，SeracareInc.)中浓度0、5、10、20、20、50、100、200、300ng/ml的25OHD3稀释序列(Verduennungsserie)加入80μl维生素D释放剂，并且放置到涂覆有抗25OHD抗体的微量滴定板空腔上。借助过氧化物酶标记的链霉亲和素和四甲基联苯胺(TMB)-显色反应，通过测量OD450nm来测定取决于竞争性25OHD浓度的示踪剂结合。
图2：包含既定的25OHD3和25OHD2浓度(6PLUS1MultilevelSerumCalibratorSet25-OH-VitaminD3/D2，ChromsystemsGmbH)的血清以及其在不含维生素D的血清基质(SerCon，SeracareInc.)内的稀释的对比分析表明了HPLC和LC-MS/MS定义的25-OHD3/D2浓度与在自动化的AleriaTM系统(ORG270，ORGENTEC)内的25-OH维生素D3/D2直接测定法之间的高度一致性。
具体实施方式
实施例1：制备维生素D释放剂
将甲苯磺酸钠溶于水中，并且与1M柠檬酸钠和1M氯化铁(III)的储备溶液调节至1M甲苯磺酸钠、100mM柠檬酸钠和50mM氯化铁(III)的最终浓度。
实施例2：25-OHD抗体在固相上的结合
将25-OH-维生素D3或25-OH-维生素D2的抗体在pH8.0的Tris盐缓冲液中稀释至1μg/ml的浓度。给微量滴定板(Maxisorb，Nunc)的空腔涂覆100μl的抗体稀释液，在37℃干燥并在4℃放置直到进行测试。
实施例3：竞争性结合分析
将不含维生素D的血清基质(Seracon，SeracareInc.)已与既定的25-OHD3浓度相混合。将浓度系列的各80μl充入预涂有25-OHD-生物素示踪剂的微量滴定板空腔内，并且在RT(20-27℃)温育5分钟，以便示踪剂再溶解。接着，将80μl实施例1维生素D释放剂加入试样中并且混合。将100μl以维生素D释放剂稀释的试样转移到涂覆了25OHD-抗体的空腔内并且在室温温育30分钟。接着，移除样本混合物，用各200μl的洗涤缓冲液来清洗空腔3次。借助过氧化物酶标记的链霉亲和素和四甲基联苯胺(TMB)-显色反应来对与抗体结合的生物素-25OHD示踪物进行检测。在通过添加100μl的50mM磷酸使底物反应停止之后，在450nm测量光密度。在此，如图1所示，在25OHD3浓度为5ng/ml的情况下，就已证实生物素-25OHD示踪物的特异性竞争。
实施例4：在自动化的AlegriaTM25-OH维生素D3/D2试验系统中测定血清或血浆中的25-羟基维生素D
为了检验基于HPLC+LC-MS/MS的25OHD3/D2测定法与自动化的AlegriaTM25-OH维生素D3/D2试验系统之间的相关性，其25OHD3/D2浓度是通过基于HPLC+LC-MS/MS的方法来表征(6PLUS1MultilevelSerumCalibratorSet25-OH-VitaminD3/D2，ChromsystemsGmbH)的血清或血浆试样以及由此形成的稀释梯度被等分地贮藏在-20℃直到进行测定。
为了在自动化AlegriaTM25-OHVitaminD3/D2试验系统中进行测定，将各80μl试样放进AlegriaTM试验片的空腔A内。在此，试验片的8个空腔包含了维生素D释放剂、酶联亲和素-HRP缀合物、TMB底物，为每一次试样检验都涂覆有25OHD校准溶液和25-OHD抗体的空腔。试验工作自动地在AlegriaTM自动化设备内进行。在此，在试验片内，各自将试样和试验片内的校准液与25-OHD生物素示踪物和维生素D释放剂混合，转移到涂覆有25OHD抗体的空腔内并且在温育30分钟后洗涤。与抗体结合的生物素-25OHD示踪物的测定是借助过氧化物酶标记的链霉亲和素和四甲基联苯胺(TMB)-显色反应通过测量在650nm的光密度来进行的。
如图2中所示，会观察到在HPLC和LC-MS/MS所定义的血清试样中的25-OHD3/D2浓度与在自动化AlegriaTM系统(ORG270，ORGENTEC)内的25-OH维生素D3/D2直接测定法之间的高度一致性。

Claims (16)

1.用于释放维生素D的体外方法，包括以下步骤：
a)使得包含结合性维生素D的试样与释放剂接触，所述释放剂包含：
i.至少一种助水溶性物质；以及
ii.至少一种过渡金属盐；
以及
b)释放结合性维生素D。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待检验试样是生物学液体，其优选选自血液、血清、血浆或奶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述助水溶性物质是芳香酸和/或其酯、酰胺或者盐，优选N，N-二甲基苯甲酰胺、二甲基苯甲酸、1，2-萘醌磺酸、甲苯磺酸、磺胺酸、蒽醌-2-磺酸、苯胺-2-磺酸和/或其盐，并且尤其优选对甲苯磺酸和/或其酯、酰胺或者盐。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述过渡金属盐是5、6、7、8、10和/或12族金属的盐，优选是钒、铬、锰、铁、钴、镍和/或锌的盐，尤其优选为铁(III)盐，最优选氯化铁(III)或柠檬酸铁(III)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述释放剂另外包括络合剂，优选为柠檬酸盐、EDTA和/或其盐。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述释放剂以一定量被加入所述试样中，以便调节出所述助水溶性物质的最终浓度为200至1000mM和/或所述过渡金属盐的最终浓度为5至100mM。
7.用于测定维生素D的体外方法，包括以下步骤：
a)和b)按照根据权利要求1至6中任一项所述的用于释放结合性维生素D的方法；以及
c)测定所释放的维生素D。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述维生素D选自包括25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2、1，25-二羟基维生素D3、1，25-二羟基维生素D2、维生素D3、维生素D2及其混合物的组，其中所述维生素D优选为25-羟基维生素D3和/或25-羟基维生素D2。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，进行维生素D的测定而不用分离释放剂。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤c)中测定维生素D的浓度是通过免疫学方法、优选通过竞争性免疫学方法进行的。
11.用于释放维生素D的试剂，包括：
a)至少一种助水溶性物质；
b)至少一种过渡金属盐；以及
c)任选的至少一种络合剂。
12.根据权利要求11所述的试剂，其特征在于，所述助水溶性物质是芳香酸和/或其酯、酰胺或者盐，优选N，N-二甲基苯甲酰胺、二甲基苯甲酸、1，2-萘醌磺酸、对甲苯磺酸、磺胺酸、蒽醌-2-磺酸、苯胺-2-磺酸和/或其盐，并且尤其优选为甲苯磺酸和/或其酯、酰胺或者盐。
13.根据权利要求11所述的试剂，其特征在于，所述过渡金属盐是5、6、7、8、10和/或12族金属的盐，优选是钒、铬、锰、铁、钴、镍和/或锌的盐，尤其优选为铁(III)盐，最优选氯化铁(III)或柠檬酸铁(III)。
14.根据权利要求11所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括相对于该试剂在水性流体中的总重量而言5至30重量百分比、优选10至25重量百分比的所述至少一种助水溶性物质以及0.1至5重量百分比、优选0.2至2重量百分比的所述至少一种过渡金属盐。
15.用于测定维生素D的试剂，包含根据权利要求12至14中任一项所述的释放剂和用于维生素D的测定试剂。
16.根据权利要求11至15中任一项所述的试剂用于释放结合性维生素D的用途，尤其是在根据权利要求7至10中任一项所述的方法中的用途。
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