JP6429857B2 - ビタミンｄ代謝物を測定するための方法および試薬 - Google Patents

Description

本発明は、ビタミンＤを含む試料を、少なくとも１つのヒドロトロープ物質（ｈｙｄｒｏｔｒｏｐｅ Ｓｕｂｓｔａｎｚ）および少なくとも１つの遷移金属塩を含む遊離試薬と接触させて、結合されたビタミンＤを遊離させるための方法に関する。前記遊離させたビタミンＤは、続いて定量的に測定することができる。本発明は、さらに、ビタミンＤを遊離および場合により測定するための、少なくとも１つのヒドロトロープ物質および少なくとも１つの遷移金属塩を含む試薬、ならびにビタミンＤを遊離および場合により測定するための前記遊離試薬の使用に関する。

ビタミンＤの充分な補給は、人間にとって不可欠である。ビタミンＤの最も豊富に存在する生理学的形態は、ビタミンＤ₃またはビタミンＤ₂である。生理的に作用する最も重要なビタミンＤ₃の誘導体（コレカルシフェロール）は、２５ＯＨＤ₃（２５−ヒドロキシビタミンＤ₃またはカルシジオール）および１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃（１−アルファ，２５−ジヒドロキシタミンＤ₃またはカルシトリオール）である。一般に、圧倒的な量のビタミンＤ₃は、別のビタミンのように食物と一緒に摂取されるのではなく、ＵＶ光の影響下に皮膚で生成される。ここで、７−ジヒドロキシコレステロールが、ＵＶ照射によって反応してプレビタミンＤ₃になり、ここで、不安定な中間生成物が再構成してビタミンＤ₃になる。食物において、ビタミンＤ₃は、特に、脂肪の豊富な魚に含まれている。体内で見られるビタミンＤのさらなる形態は、ビタミンＤ₂（カルシフェロールまたはエルゴカルシフェロール）であり、これは、菌類に見られるものであり、食物と一緒に摂取することができる。ビタミンＤ₃およびビタミンＤ₂のプレパラート（Ｐｒａｅｐａｒａｔｅ）は、充分な量のビタミンＤを補給するためのさらなる源である。

ビタミンＤおよびその天然誘導体は、極めて疎水性の分子である。血中では、ビタミンＤは、ビタミンＤ結合タンパク（ＤＢＰ）との複合体として輸送される。ＤＢＰは、アルブミン群に含まれるものであり、ビタミンＤ、ビタミンＤ代謝物および脂肪酸を結合する。

肝臓では、ビタミンＤは、シトクロームＰ４５０により、Ｃ−２５位で酸化される。結果として生じる２５ＯＨＤ（２５−ヒドロキシビタミンＤ₃または２５−ヒドロキシビタミンＤ₂）は、主に血液循環中に存在しているビタミンＤ代謝物である。血清２５ＯＨＤ濃度は、人間のビタミンＤの状態を評価するための指標として用いられる。

腎臓およびさらなる組織において、２５ＯＨＤの１，２５（ＯＨ）₂Ｄ（ビタミンＤの生理的活性形態）への転換が行われ、この転換によって、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）での結合後に、ビタミンＤに応じて調節される（ＶＤＲＥ）遺伝子活性が制御される。

ビタミンＤの充分な補給は、通常の骨構造ならびにカルシウムおよびリンの吸収の調節に不可欠である。ＶＤＲの１，２５（ＯＨ）₂Ｄによる活性化は、腸のカルシウム吸収の効率を約３０％、およびリン吸収を約８０％上昇させる。２５ＯＨＤ血清濃度が、３０ｎｇ／ｍｌよりも低下する場合、腸におけるカルシウム吸収の明らかな減少および副甲状腺ホルモン濃度の上昇を伴う。ビタミンＤの欠乏は、骨折の危険が高い骨粗しょう症の主な要因と見なされており、さらなる健康リスクを伴う。血清ビタミンＤ濃度が、栄養摂取および太陽光への曝露によって大きく変動する一方、血清２５ＯＨＤ濃度は、ビタミンＤの供給状態を求めるための優れた指標とされる。したがって、血清２５ＯＨＤ濃度の測定は、医学的診断において日常的に行われるものである。

２５ＯＨＤおよび別のビタミンＤ物質のＤＢＰへの結合は、ビタミンＤ代謝物の測定において大きな障害である。いずれの測定方法もビタミンＤ代謝物をＤＢＰ複合体から遊離させることを前提としている。

血清中のビタミンＤおよびその代謝物を測定できるようにするためには、それらをＤＢＰとの結合から遊離させる必要がある。これは、種々の方法、例えば、ＤＢＰの有機溶媒（例えば、エタノール、メタノール）による沈殿、またはビタミンＤおよびその代謝物を水相から相形成溶媒、例えば、クロロホルムまたはヘキサンによる抽出により行うことができる。

ＵＳ７，４８２，１６２Ｂ２（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ．）は、ＤＢＰに結合された１，２５（ＯＨ）₂Ｄを遊離させるための非競合型の置換試薬として、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸アンモニウム塩（８−ＡＮＳ）を使用することを記載している。

ＷＯ２０１１／１４４６６１（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）は、炭酸塩または炭酸水素塩を遊離させる物質を、還元剤およびアルカリ化物質と組み合わせて含む試薬混合物を記載しており、ここで、ビタミンＤ代謝物は、ｐＨ範囲１１〜１４でＤＢＰ複合体から遊離される。

ＥＰ２１２６５８６（Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ ＡＧ）は、ビタミンＤ代謝物の遊離の結果生じたＤＢＰを不活性化し、それに続いてＥＬＩＳＡ試験システムにおいてビタミンＤ代謝物を測定するために、プロテイナーゼＫの使用下でのタンパク質分解法の適用に関する。

ＵＳ７，０８７，３９５（Ｑｕｅｓｔ）は、ＮａＯＨ、洗剤、シクロデキシトリン誘導体およびサリチル酸塩からなるアルカリ性の試薬混合物を使用して、ｐＨ１３で、血清を前処理して、ビタミンＤ代謝物をＤＢＰから遊離させる方法に関する。

ＷＯ２００８／１３８７８３（Ｎｏｒｄｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａ／Ｓ）は、ビタミンＤをＤＢＰ複合体から遊離させるために、血清試料または血漿試料をパモ酸で前処理することを記載している。

しかし、ビタミンＤをＤＢＰとの複合体から遊離させるための従来公知の方法は、労働集約的であり、自動化しにくいか、またはミスが起きやすい。

ビタミンＤを測定するための自動化試験法は、理想的には反応バッチを直接さらに分析することができる条件下で、ＤＢＰとの複合体からの遊離を必要とする。しかし、ＤＢＰは、極めて安定したタンパクであり、ビタミンＤの結合能１９００ｎｇ／ｍｌに相当する比較的高い血清濃度で存在している。これは、平均血清２５ＯＨＤ濃度が３０ｎｇ／ｍｌの場合、２５ＯＨＤの結合能の６０倍を上回ることを示す。

遊離試薬は、ビタミンＤをＤＢＰとの安定した結合から切り離し、ＤＢＰ血清濃度が高いことによって存在している、著しく過剰なビタミンＤの結合能を不活性化して、さらに、遊離させたビタミンＤの、検出試薬、一般に抗体への結合を可能にすることも望ましい。

したがって、本発明の課題は、結合されたビタミンＤを遊離させるための試薬であって、結合されたビタミンＤをタンパク質複合体から遊離させる場合の従来の問題を解決し、およびビタミンＤを直接定量的に測定するための自動化方法における使用に好適な試薬を提供することである。

先行技術の試薬組成物の制約および欠点は、本発明により少なくとも部分的に取り除かれる。本発明は、結合されたビタミンＤを遊離させるための試薬であって、ビタミンＤの効率的な遊離を可能にする前記試薬を提供する。この試薬は、さらに、ビタミンＤの測定試薬を含んでいてよい。前記遊離試薬の使用は、測定されるビタミンＤを試料から単離させる必要がないという利点を提供する。添加された遊離試薬を有する試料は、さらに処理することなしに、直接、免疫学的測定方法に供することができる。これによって、先行技術よりも経済的かつ時間を節約してビタミンＤを測定することができる。

したがって、本発明によって、ビタミンＤ、特に、２５−ヒドロキシビタミンＤ₃または２５−ヒドロキシビタミンＤ₂の濃度を測定するための確実かつ自動化可能な方法が提供される。

したがって、本発明の第一の実施態様は、以下の工程：
ａ）結合されたビタミンＤを、特に、タンパク質との複合体の形態として含む試料を、以下：
ｉ．少なくとも１つのヒドロトロープ物質、および
ｉｉ．少なくとも１つの遷移金属塩
を含む遊離試薬と接触させる工程、
および
ｂ）前記結合されたビタミンＤを遊離させる工程
を含む、ビタミンＤを遊離させるためのインビトロの方法に関する。

特に記載がない場合、「ビタミンＤ」という言葉は、構造式Ｉ

または構造式ＩＩ

に記載のビタミンＤ₂基本骨格またはビタミンＤ₃基本骨格を有するあらゆる天然由来の化合物を含む。

構造式ＩおよびＩＩ中の炭素原子の番号は、ステロイド命名法にしたがって表示されている。２５−ヒドロキシビタミンＤは、構造式ＩまたはＩＩの２５位でヒドロキシル化されているビタミンＤ代謝物、つまり、２５−ヒドロキシビタミンＤ₂ならびに２５−ヒドロキシビタミンＤ₃を表す。さらなるヒドロキシビタミンＤ化合物は、例えば、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤまたは２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤである。

１，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、構造式ＩおよびＩＩの１位ならびに２５位でヒドロキシル化されているビタミンＤの活性形態（いわゆるＤホルモン）を指す。

別のよく知られているビタミンＤ化合物は、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₂、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃、およびＣ３−ｅｐｉ−２５−ヒドロキシビタミンＤである。

「結合されたビタミンＤの遊離」という言葉は、ビタミンＤが結合しているタンパク質、特にＤＢＰとの複合体からビタミンＤを完全または部分的に分離させることを意味する。実質的に、試料中に存在しているすべてのビタミンＤが遊離されるのが好ましい。この関連において、「実質的に」、ビタミンＤの少なくとも９０％、９５％、９８％、好ましくはビタミンＤの少なくとも９９％が遊離されることを意味する。

「ヒドロトロープ物質」または「ヒドロトロープ化合物」という言葉は、不溶性であるか、または溶解しにくい有機化合物の水性溶媒中での溶解性を高める化合物を表す。ここで、前記ヒドロトロープ化合物は、水の表面張力を低下させ、それによって切り離される物質の分散性を容易にする（ヒドロトロープ）。

「遷移金属塩」という言葉は、元素周期表の第ＩＩＩ族〜第ＸＩＩ族もしくは第Ｉｂ族〜第ＶＩＩｂ族および第ＶＩＩＩ族の金属の無機塩または有機塩を表す。

試験される試料は、例えば、血液、血清、血漿または乳汁から選択される生物学的液体であるのが好ましい。前記試料は、通常、生物、好ましくは、哺乳類、例えば、人に由来するものである。

前記ヒドロトロープ物質は、好ましくは、芳香族酸および／またはそのエステル、アミドまたは塩である。これらは、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、ジメチル安息香酸、１，２−ナフトキノンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、スルファニル酸、アントラキノン−２−スルホン酸、アニリン−２−スルホン酸および／またはそれらの塩からなる群から選択されるのが好ましい。前記ヒドロトロープ物質は、トルエンスルホン酸および／またはそのエステル、アミドまたは塩であるのが特に好ましい。

前記ヒドロトロープ物質は、ＨＬＢ値１２〜１８を有しているのがさらに好ましい。「ＨＬＢ値（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｂａｌａｎｃｅ）」という言葉は、Ｗ．Ｃ．グリフィンによって導入された、非イオノゲンの界面活性剤および乳化剤の親水性および親油性の基準である。化合物の相応のＨＬＢ値は、当該分野で公知の方法によって求めることができる。

本発明による方法の遷移金属塩は、第５族、第６族、第７族、第８族、第１０族および／または第１２族の金属の塩、例えば、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケルおよび／または亜鉛の塩を含むのが好ましい。前記遷移金属塩は、鉄（ＩＩＩ）塩が特に好ましく、塩化鉄（ＩＩＩ）またはクエン酸鉄（ＩＩＩ）が最も好ましい。ここで、前記塩は、遷移金属カチオンおよび無機または有機のアニオンからなる。

前記無機アニオンには、ハロゲン化物、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物またはヨウ化物、硫化物、炭酸塩、炭酸水素塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩およびチオシアン酸塩が含まれる。

前記有機アニオンには、カルボン酸アニオン、例えば、ギ酸塩、酢酸塩、パルミチン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、安息香酸、マレイン酸塩またはサリチル酸塩、および有機硫酸塩、例えば、ラウリル硫酸塩が含まれる。

前記遊離試薬は、さらに、錯化剤、好ましくは、クエン酸、ＥＤＴＡおよび／またはそれらの塩、最も好ましくは、クエン酸および／またはその塩を含んでいてよい。「錯化剤」という言葉は、錯体の形成を可能にする化合物、例えば、キレート形成剤を表す。

前記遊離試薬は、前記ヒドロトロープ物質の最終濃度を２００〜１０００ｍＭ、特に３００〜７００ｍＭに、および前記遷移金属塩の最終濃度を５〜１００ｍＭ、特に１０〜４０ｍＭに調節する量で前記試料に添加されるのが好ましい。前記遊離試薬は、水性溶媒中に主要液として装入されるのが好ましく、この遊離試薬の総質量に対して５〜３０質量％、好ましくは１０〜２５質量％の前記ヒドロトロープ物質、および０．１〜５質量％、好ましくは、０．２〜２質量％の前記遷移金属塩を有するものである。

本発明のさらなる実施態様は、以下の工程：
ａ）結合されたビタミンＤを、特に、タンパク質との複合体の形態として含む試料を、以下：
ｉ．少なくとも１つのヒドロトロープ物質、および
ｉｉ．少なくとも１つの遷移金属塩、
を含む遊離試薬と接触させる工程、
ｂ）前記結合されたビタミンＤを遊離させる工程、
および
ｃ）前記遊離させたビタミンＤを測定する工程
を含む、ビタミンＤ化合物を測定するためのインビトロの方法を含む。

工程ｃ）の前記遊離させたビタミンＤを測定する工程は、時間に関して、工程ａ）およびｂ）の後か、または工程ａ）およびｂ）と同時に実施することができる。工程ｃ）は、測定されるビタミンＤから前記遊離試薬を分離することなく、工程ａ）およびｂ）と同時に実施されるのが好ましく、これによって、試料中のビタミンＤを測定するための一段階法が提供される。

工程ｃ）のビタミンＤの濃度を測定する工程は、測定されるビタミンＤを、免疫学的結合パートナーに結合させて、免疫複合体を形成させる免疫学的方法であるのが好ましい。「免疫学的結合パートナー」という言葉は、抗体を含む。

好適な免疫学的方法の例は、不均一測定法、均一測定法、サンドイッチ測定法、競合測定法、酵素免疫測定法、放射免疫測定法、蛍光偏光免疫測定法、微粒子酵素免疫測定法、および化学発光磁気免疫測定法を含む。上述の試験形態の多くは、一段階法か、または二段階法で実施することができる。一段階法で実施することができる試験形態が使用されるのが好ましい。

「不均一測定法」という言葉は、前記免疫複合体と別の構成成分とを、例えば、洗浄によって分離することが必要な方法を指す。

「均一測定法」という言葉は、前記免疫複合体を、別の構成成分と分離させる必要がない方法を指す。

「競合測定法」という言葉は、試料中に存在しているビタミンＤと、検出可能な（例えば、標識された）トレーサーとを、免疫学的結合パートナーに関して競合させる方法を指す。

「サンドイッチ測定法」という言葉は、ビタミンＤを、２つの免疫学的結合パートナーとの間に結合させ、この２つの免疫学的結合パートナーのうちの少なくとも１つが検出可能（例えば、標識による）である方法を指す。

「酵素免疫測定法」という言葉は、酵素を標識として利用する方法を指す。そのような標識の例は、アルカリ性ホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼである。ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ ａｓｓａｙ）は、例えば、好ましい不均一のサンドイッチ酵素免疫測定法である。

「放射免疫測定法」という言葉は、放射性同位元素を標識として利用する方法を指す。そのような標識の例は、ヨウ素１２５である。

前記好適な方法は、検出工程を含む。この工程は、標識の検出を含んでいてよい。ここで、前記目的のために当該分野で公知のあらゆる標識を使用することができる。好適な標識の例は、酵素標識（上述の通り）放射性同位元素標識（上述の通り）、蛍光偏光標識、例えば、フルオレスセインまたはローダミン、化学発光性標識、例えば、ルミノールまたはアクリジニウムエステル、およびポリヒスチジン標識を含む。

工程ｃ）においてビタミンＤの濃度を測定する場合、競合免疫学的方法が使用されるのが特に好ましい。好適な競合試験形態は、当業者に充分に公知である。一般的な競合結合測定法において、トレーサー、つまり、ビタミンＤの標識形態を有する受容体または抗体を、試験する試料と接触させる。その場合、前記受容体または抗体に結合して存在しているトレーサーの量は、前記試料中の標識されていないビタミンＤの割合を示す。代替的に、競合結合測定法は、トレーサーに結合した受容体または抗体を、試験する試料と接触させる工程、および試料中のビタミンＤの量を示す、排除されたトレーサーの量を測定する工程を含んでいてよい。ビオチンで標識したトレーサーおよびペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジンによる検出が使用されるのが最も好ましい。

ビタミンＤを測定するために、試料構成成分が分離されないことが好ましい。方法工程ａ）、ｂ）およびｃ）は、抽出または精製をそれぞれの方法工程の間で行うことなく、単一の反応容器内で実施することができる。

本発明による方法により遊離されて、測定されるビタミンＤには、あらゆる公知のビタミンＤ化合物、例えば、２５−ヒドロキシビタミンＤ₃、２５−ヒドロキシビタミンＤ₂、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₂、ビタミンＤ₃、ビタミンＤ₂およびそれらの混合物が含まれる。前記ビタミンＤ化合物は、２５−ヒドロキシビタミンＤ₃および／または２５−ヒドロキシビタミンＤ₂であるのが特に好ましい。

本発明のさらなる実施態様は、以下：
ａ）少なくとも１つのヒドロトロープ物質、および
ｂ）少なくとも１つの遷移金属塩
を含む、ビタミンＤを遊離させるための試薬に関する。

前記試薬が、さらに錯化剤を含んでいるのが好ましい。錯化剤として、クエン酸、ＥＤＴＡおよび／またはそれらの塩が使用されるのが好ましく、クエン酸および／またはその塩がより好ましい。

さらなる実施態様において、前記試薬は、さらに、ビタミンＤを測定するための、少なくとも１つの試薬を含む。

本発明のさらなる実施態様は、上記試薬の、結合されたビタミンＤを遊離させるため、および場合によりこの遊離させたビタミンＤを測定するための使用である。

さらに、本発明を以下の図および例によってより詳しく説明する。

図１は、定義された濃度の２５ＯＨＤ₃の、血清ＤＢＰとの結合からの遊離、およびビオチン２５ＯＨＤ₃トレーサー試薬との競合を特性化した図である。２５ＯＨＤの特異的競合法のＥＬＩＳＡ検出のために、ビタミンＤを含まない血清マトリックス（ＳｅｒＣｏｎ、Ｓｅｒａｃａｒｅ Ｉｎｃ．）中で、０、５、１０、２０、２０、５０、１００、２００、３００ｎｇ／ｍｌ濃度の２５ＯＨＤ₃の希釈系に、ビオチン−２５ＯＨＤトレーサー試薬７．５ｎｇ／ｍｌの存在下で、ビタミンＤ遊離試薬８０μｌを加えて、抗２５ＯＨＤの抗体で被覆されたマイクロプレートのウェルに塗布した。競合する２５ＯＨＤ濃度によって決まるトレーサーの結合を、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンおよびテトラメチルベンジジン（ＴＢ）呈色反応を用いて、４５０ｎｍでＯＤを測定して決定した。

図２は、定義された濃度の２５ＯＨＤ₃および２５ＯＨＤ₂を有する血清（６ＰＬＵＳ１ Ｍｕｌｔｉｌｅｖｅｌ Ｓｅｒｕｍ Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ Ｓｅｔ ２５−ＯＨ−Ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ₃／Ｄ₂、Ｃｈｒｏｍｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ）、ならびにビタミンＤを含まない血清マトリックス（ＳｅｒＣｏｎ、Ｓｅｒａｃａｒｅ Ｉｎｃ．）中でのその希釈の比較分析は、ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳが定義する２５−ＯＨＤ₃／Ｄ₂濃度と、Ａｌｅｇｒｉａ（登録商標）自動システム（ＯＲＧ２７０、ＯＲＧＥＮＴＥＣ）における２５ＯＨビタミンＤ₃／Ｄ₂の直接測定法との高い一致を示した。

定義された濃度の２５ＯＨＤ₃の、血清ＤＢＰとの結合からの遊離、およびビオチン２５ＯＨＤ₃トレーサー試薬との競合を特性化した図 定義された濃度の２５ＯＨＤ₃および２５ＯＨＤ₂を有する血清、ならびにビタミンＤを含まない血清マトリックス中でのその希釈の比較分析を示す図

例１：ビタミンＤ遊離試薬の製造
トルエンスルホン酸ナトリウムを水に溶かして、クエン酸ナトリウム１Ｍおよび塩化鉄（ＩＩＩ） １Ｍの主要液を用いて、トルエンスルホン酸ナトリウム １Ｍ、クエン酸ナトリウム１００ｍＭおよび塩化鉄（ＩＩＩ）５０ｍＭの最終濃度に調節した。

例２：２５−ＯＨＤ抗体の固相への結合
２５−ＯＨ−ビタミン−Ｄ₃もしくは２５−ＯＨ−ビタミン−Ｄ₂に対する抗体を、ｐＨ８．０のトリス塩緩衝液中で、濃度１μｇ／ｍｌに希釈した。マイクロプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、Ｎｕｎｃ）のウェルを、前記抗体希釈液１００μｌで被覆して、３７℃で乾燥して、試験実施まで４℃で貯蔵した。

例３：競合結合分析
ビタミンＤを含まない血清マトリックス（Ｓｅｒａｃｏｎ、Ｓｅｒａｃａｒｅ Ｉｎｃ．）に、定義された濃度の２５−ＯＨＤ₃を加えた。前記濃度系それぞれ８０μｌを、２５−ＯＨＤ−ビオチントレーサーであらかじめ被覆したマイクロプレートのウェルに充填して、トレーサー試薬を再可溶化させるために、５分、ＲＴ（室温）（２０〜２７℃）で保温した。次に、例１のビタミンＤ遊離試薬８０μｌを、前記試料に加えて混合した。ビタミンＤ遊離試薬で希釈した前記試料１００μｌを、２５ＯＨＤ抗体で被覆したウェルに移して、室温で３０分保温した。続いて、前記試料バッチを取り除いて、前記ウェルを３回、それぞれ洗浄緩衝液２００μｌで洗浄した。抗体結合したビオチン−２５ＯＨＤトレーサーを、ペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジンおよびテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）呈色反応によって検出した。５０ｍＭのリン酸１００μｌを添加して基質反応を停止した後、４５０ｎｍで光学密度を測定した。ここで、図１に示される通り、２５ＯＨＤ₃濃度が５ｎｇ／ｍｌの場合にすでに、ビオチン−２５ＯＨＤトレーサーの特異的競合が示された。

例４：Ａｌｅｇｒｉａ（登録商標）２５−ＯＨ ビタミンＤ₃／Ｄ₂自動試験システムにおける、血清または血漿中の２５−ヒドロキシビタミンＤの測定
ＨＰＬＣ＋ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに基づく２５ＯＨＤ₃／Ｄ₂測定方法と、Ａｌｅｇｒｉａ（登録商標）２５−ＯＨビタミンＤ₃／Ｄ₂自動試験システムとの相関関係を試験するため、血清または血漿試料、ならびにその希釈段階を、測定まで一定分量で−２０℃にて貯蔵した。前記血清または血漿試料の２５ＯＨＤ₃／Ｄ₂濃度は、ＨＰＬＣ＋ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに基づく方法によって特徴付けられたものであった（６ＰＬＵＳ１ Ｍｕｌｔｉｌｅｖｅｌ Ｓｅｒｕｍ Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ Ｓｅｔ ２５−ＯＨ−Ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ₃／Ｄ₂、Ｃｈｒｏｍｓｙｓｙｔｅｍｓ ＧｍｂＨ）。

Ａｌｅｇｒｉａ（登録商標）２５−ＯＨビタミンＤ₃／Ｄ₂自動試験システムで測定するために、前記試料それぞれ８０μｌを、Ａｌｅｇｒｉａ（登録商標）試験片のキャビティ（Ｋａｖｉｔａｔｅｔ）Ａに装入した。ここで、１つの試験片の８つのキャビティは、ビタミンＤ遊離試薬、ストレプトアビジン−ＨＲＰ共役体、ＴＭＢ基質、２５ＯＨＤキャリブレーション溶液、および２５−ＯＨＤ抗体が被覆されたキャビティをそれぞれ試料測定に対して含んでいた。試験の処理は、Ａｌｅｇｒｉａ（登録商標）自動装置で自動的に行った。ここで、試験片内で、前記試料それぞれ、および試験辺内の検量用試料（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ）に、２５ＯＨＤ−ビオチントレーサーおよびビタミンＤ遊離試薬を混合し、前記２５ＯＨＤ抗体が被覆されたキャビティに移して、３０分保温した後に洗浄した。抗体結合したビオチン−２５ＯＨＤトレーサーの検出を、ペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジンおよびテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）呈色反応によって、６５０ｎｍで光学密度を測定して行った。

図２に示される通り、ＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって定義された血清試料の２５−ＯＨＤ₃／Ｄ₂の濃度と、Ａｌｅｇｒｉａ（登録商標）自動システム（ＯＲＧ２７０、ＯＲＧＥＮＴＥＣ）における２５−ＯＨビタミンＤ₃／Ｄ₂直接測定法との高い一致が観察された。

Claims (27)

1. ビタミンＤを遊離させるためのインビトロの方法であって、以下の工程：
   ａ）結合されたビタミンＤを含む試料を、以下：
   ｉ．少なくとも１つのヒドロトロープ物質、および
   ｉｉ．少なくとも１つの遷移金属塩
   を含む遊離試薬と接触させる工程、
   ならびに
   ｂ）前記結合されたビタミンＤを遊離させる工程
   を含む前記方法。
2. 前記試験される試料が、血液、血清、血漿または乳汁から選択される生物学的液体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記ヒドロトロープ物質が、芳香族酸および／またはそのエステル、アミドまたは塩、であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記ヒドロトロープ物質が、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、ジメチル安息香酸、１，２−ナフトキノンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルファニル酸、アントラキノン−２−スルホン酸、アニリン−２−スルホン酸、および／またはそれらの塩であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
5. 前記ヒドロトロープ物質が、パラトルエンスルホン酸および／またはそのエステル、アミド、または塩であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. 前記遷移金属塩が、第５族、第６族、第７族、第８族、第１０族および／または第１２族の金属の塩であることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
7. 前記遷移金属塩が、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケルおよび／または亜鉛の塩であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
8. 前記遷移金属塩が、鉄（ＩＩＩ）塩、塩化鉄（ＩＩＩ）またはクエン酸鉄（ＩＩＩ）であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
9. 前記遊離試薬が、さらに、クエン酸、ＥＤＴＡおよび／またはそれらの塩から選択される錯化剤を含むことを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
10. 前記遊離試薬を、前記ヒドロトロープ物質の最終濃度を２００〜１０００ｍＭに、および／または前記遷移金属塩の最終濃度を５〜１００ｍＭに調節する量で前記試料に添加することを特徴とする、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
11. ビタミンＤを測定するためのインビトロの方法であって、以下の工程：
    結合されたビタミンＤを遊離させるための、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法におけるａ）およびｂ）の工程、および
    ｃ）前記遊離させたビタミンＤを測定する工程
    を含む前記方法。
12. 前記ビタミンＤが、２５−ヒドロキシビタミンＤ₃、２５−ヒドロキシビタミンＤ₂、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₂、ビタミンＤ₃、ビタミンＤ₂およびそれらの混合物を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
13. 前記ビタミンＤが、２５−ヒドロキシビタミンＤ ₃ および／または２５−ヒドロキシビタミンＤ ₂ であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
14. 前記ビタミンＤを測定する工程を、前記遊離試薬を分離することなく行うことを特徴とする、請求項１１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
15. 工程ｃ）のビタミンＤの濃度を測定する工程を、免疫学的方法により行うことを特徴とする、請求項１１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
16. 前記免疫学的方法を、競合的免疫学的方法により行うことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
17. ビタミンＤを遊離させるための試薬であって、
    ａ）少なくとも１つのヒドロトロープ物質、
    ｂ）少なくとも１つの遷移金属塩
    を含み、水性液体中の該試薬の総質量に対して５〜３０質量％の前記少なくとも１つのヒドロトロープ物質、および０．１〜５質量％の前記少なくとも１つの遷移金属塩を有する前記試薬。
18. 試薬が、更に少なくとも１つの錯化剤を含む、請求項１７に記載の試薬。
19. 試薬が、水性液体中の該試薬の総質量に対して１０〜２５質量％の前記少なくとも１つのヒドロトロープ物質、および０．２〜２質量％の前記少なくとも１つの遷移金属塩を有する、請求項１７または１８に記載の試薬。
20. 前記ヒドロトロープ物質が、芳香族酸および／またはそのエステル、アミドまたは塩、であることを特徴とする、請求項１７から１９までのいずれか１項に記載の試薬。
21. 前記ヒドロトロープ物質が、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、ジメチル安息香酸、１，２−ナフトキノンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、スルファニル酸、アントラキノン−２−スルホン酸、アニリン−２−スルホン酸および／またはそれらの塩であることを特徴とする、請求項２０に記載の試薬。
22. 前記ヒドロトロープ物質が、トルエンスルホン酸および／またはそのエステル、アミドまたは塩であることを特徴とする、請求項２１に記載の試薬。
23. 前記遷移金属塩が、第５族、第６族、第７族、第８族、第１０族および／または第１２族の金属の塩であることを特徴とする、請求項１７から１９までのいずれか１項に記載の試薬。
24. 前記遷移金属塩が、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケルおよび／または亜鉛の塩であることを特徴とする、請求項２３に記載の試薬。
25. 前記遷移金属塩が、鉄（ＩＩＩ）塩、塩化鉄（ＩＩＩ）またはクエン酸鉄（ＩＩＩ）であることを特徴とする、請求項２４に記載の試薬。
26. 請求項１７から２５までのいずれか１項に記載の遊離試薬およびビタミンＤの測定試薬を含む、ビタミンＤを測定するための試薬。
27. 請求項１７から２６までのいずれか１項に記載の試薬の、結合されたビタミンＤを、請求項１１から１６までのいずれか１項に記載の方法で遊離させるための使用。

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