CN112557675A - 一种25-羟基维生素d及其代谢物的解离剂及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种25‑羟基维生素D及其代谢物的解离剂及其制备方法、应用。本发明解离剂以重量百分含量计，由表面活性剂、缓冲剂、溶剂、pH调节剂和水组成；所述表面活性剂由8‑苯胺基‑1‑萘磺酸和氟代烷基类表面活性剂组成，所述氟代烷基类表面活性剂为全氟辛酸或其盐、全氟庚酸或其盐中的一种或几种；所述缓冲剂由BIS‑TRIS、氯化钠组成。实验表明，本发明解离剂解离效率高、稳定性强，能够使25‑羟基维生素D及其代谢物从结合蛋白上充分释放，从而得到更准确、有效的检测。

Description

一种25-羟基维生素D及其代谢物的解离剂及其制备方法、 应用

技术领域

本发明涉生物技术领域，具体涉及一种25-羟基维生素D及其代谢物的解离剂及其制备方法、应用。

背景技术

维生素D作为一种类固醇物质，其主要包含两类，一类为麦角钙化醇(维生素D2)，另一类为胆钙化醇(维生素D3)。人类获取维生素D主要通过日照，通过紫外线的作用使皮肤中的7-脱氢胆固醇转化为维生素D3，或者通过食物获取人体所需的维生素D2和维生素D3。维生素D会在维生素D结合蛋白的作用下转移到肝脏和肾脏，在肝脏内维生素D会被代谢为25-羟基维生素D，进一步在肾脏作用下转化为1，25二羟基维生素D。在人体内循环中的25-羟基维生素D是维生素D的主要存在形式，其半衰期长达3周，相比含量低、半衰期短暂的1，25二羟基维生素D，25-羟基维生素D更适合作为待测物去反映人体真实的维生素D含量。维生素D结合蛋白是一种古老的微量蛋白质，其与待测物牢固结合，故若需准确测量样本中的25-羟基维生素D，亟需获取高效稳定的解离方法使25-羟基维生素D从维生素D结合蛋白上快速解离。

现有技术报道的用于解离维生素D的解离剂大多采用单一种类的表面活性剂，如：发明专利CN108872614A涉及至少一种氟代烷基类表面活性剂和至少一种具有1至4个碳原子的醇用于从维生素D结合蛋白解离维生素D和/或维生素D代谢物的用途。发明专利106199015A提供了一种用于血清样品检测的维生素D释放剂，其释放剂包括全氟辛酸0.2％-0.5％，二甲亚砜0.1％-0.5％，乙二醇0.1％-0.5％，乙醇0.01％-0.1％，缓冲液0.05M的TRIS-HCL溶液。发明专利CN 101273272 B公开一种用于从维生素D结合蛋白释放维生素D的试剂组合物值，pH为3.8-4.8，包括：5-30vol％的一种或多种选自二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)和N-甲基吡咯烷酮(N-MP)的两性试剂以及任选地0.7-8vol％的短链C1-C3醇。经研究发现，使用单一的表面活性剂无法将25-羟基维生素D及其代谢物从维生素D结合蛋白上充分释放出来，解离效果不理想。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种25-羟基维生素D及其代谢物的解离剂及其制备方法、应用，本发明解离剂对25-羟基维生素D的解离效率高、稳定性强，能够使25-羟基维生素D及其代谢物从结合蛋白上充分释放，从而得到更准确、有效的检测。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种25-羟基维生素D及其代谢物的解离剂由表面活性剂、缓冲剂、溶剂、pH调节剂和水组成；

所述表面活性剂由8-苯胺基-1-萘磺酸和氟代烷基类表面活性剂组成；

所述氟代烷基类表面活性剂为全氟辛酸或其盐、全氟庚酸或其盐中的一种或几种；

所述缓冲剂由BIS-TRIS和氯化钠组成。

氟代烷基类表面活性剂与维生素D结合蛋白之间可能存在疏水作用力、氢键和静电引力，引起维生素D结合蛋白上的不同氨基酸残基附近出现亲水性环境增强或疏水性环境强的现象，导致蛋白质发生松散现象和折叠构象，起到解离25-羟基维生素D及其类似物的功效。然而，25-羟基维生素D与维生素D结合蛋白结合的非常牢固，埋藏在维生素D结合蛋白结构深位点的25-羟基维生素D不能得到完全的解离，因此，现有技术报道的采用单一的氟代烷基类表面活性剂无法将25-羟基维生素D完全解离出来。

本发明提供的解离剂将氟代烷基类表面活性剂与苯胺类表面活性剂联用，能够有效的将与维生素D结合蛋白牢固结合的那部分维生素D彻底地置换出来，解离效率更高，且稳定性较强。而且，利用本发明构建的缓冲体系能够有效保护氟代烷基类表面活性剂和苯胺类表面活性剂的形成复合物，使其整体发挥高效率解离的功能，能够使本发明解离剂在不同环境的影响下充分发挥解离功效。

一些实施方案中，本发明解离剂中，各组分用量为：

以重量体积百分比g/ml计，所述表面活性剂占所述解离剂的重量体积百分含量为0.5％-10％；所述缓冲剂占所述解离剂的重量体积百分含量为1％-10％；所述溶剂占所述解离剂的重量体积百分含量为2％-20％；

所述pH调节剂的用量为使得所述溶剂、缓冲剂的混合体系的pH为6～10；

余量为水。

以上各组分的质量百分含量之和为100％。

一些实施方案中，8-苯胺基-1-萘磺酸与氟代烷基类表面活性剂的质量比为1:(2～10)。

一些实施方案中，所述苯胺类表面活性剂为8-苯胺基-1-萘磺酸；所述氟代烷基类表面活性剂为全氟辛酸或全氟庚酸。

一些具体实施例中，所述苯胺类表面活性剂为8-苯胺基-1-萘磺酸；所述氟代烷基类表面活性剂为全氟辛酸，8-苯胺基-1-萘磺酸和全氟庚酸的质量比为1:2。另一些具体实施例中，所述苯胺类表面活性剂为8-苯胺基-1-萘磺酸；所述氟代烷基类表面活性剂为全氟庚酸；8-苯胺基-1-萘磺酸和全氟辛酸的质量比为1:10。

一些实施方案中，所述溶剂由二甲亚砜和二甲基甲酰胺组成。其中，二甲基甲酰胺与二甲亚砜的质量比为(1～5):1。一些具体实施例中，二甲基甲酰胺与二甲亚砜的质量比为1:1或5:1。

本发明对pH调节剂的种类没有特殊要求，能够调节溶液pH至6～10即可。本发明中所述pH调节剂为盐酸。一些具体实施例中，pH调节剂优选为6mol/L盐酸。

一些实施方案中，所述苯胺类表面活性剂为8-苯胺基-1-萘磺酸；所述氟代烷基类表面活性剂为全氟辛酸。

一些具体实施例中，以重量体积百分比g/ml计，所述解离剂中各组分的含量为：2％BIS-TRIS、1％氯化钠、7.5％二甲基甲酰胺、7.5％二甲基亚砜、0.33％ANS、0.66％全氟庚酸和余量的水。

另一些具体实施例中，以重量体积百分比g/ml计，所述解离剂中各组分的含量为：2.5％BIS-TRIS、0.8％氯化钠、8.33％的二甲基甲酰胺、1.66％二甲基亚砜，0.18％ANS、1.81％全氟辛酸和余量的水。

本发明解离剂的制备中，pH调节剂的用量为使得所述溶剂、缓冲剂体系的混合体系的pH为6～10，所用含量较少，占解离剂的重量体积百分比较低低，因此在计算各组分占所述解离剂的重量体积百分比含量时可忽略不计。一些具体实施方案中，pH调节剂的用量为使得所述解离剂的pH为6.5或7.5。

本发明还提供了所述解离剂的制备方法，将缓冲剂、溶剂、pH调节剂和表面活性剂混合，获得所述解离剂。

一些实施方案中，所述混合具体为：

将缓冲剂和溶剂混合，获得混合液；

用pH调节剂调节所述混合液的pH至6～10，加入所述表面活性剂充分混匀。

本发明提供的制备方法中，首先将缓冲剂和溶剂混合形成稳定的缓冲体系，然后加入pH调节剂，调节溶液pH至6～10，再加入由苯胺类表面活性剂和氟代烷基类表面活性剂组成的复合物。

本发明还提供了所述解离剂在制备检测25-羟基维生素D及其代谢物含量的检测试剂盒中的应用。

其中，所述25-羟基维生素D包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3。

本发明还提供一种检测25-羟基维生素D及其代谢物含量的检测试剂盒，包含本发明所述解离剂。

本发明将氟代烷基类表面活性剂与苯胺类表面活性剂联合用于25-羟基维生素D的解离，配合适宜的缓冲剂，所得解离剂的解离效率高、稳定性强，能够使25-羟基维生素D及其代谢物从结合蛋白上充分释放，从而得到更准确、有效的检测。经大量的实验研究表明，任意的单一组分的解离效果均明显下降，均无法获得高效解离能力。

附图说明

图1本发明实施例1的解离剂检测的校准曲线图；

图2实施例1解离剂检测与液相串联质谱法检测结果的相关性分析图；

图3本发明实施例2的解离剂检测的校准曲线图；

图4采用实施例2解离剂检测与液相串联质谱法检测结果的相关性分析图；

图5对比解离溶液1检测与液相串联质谱法检测结果的相关性分析图；

图6对比解离溶液2检测与液相串联质谱法检测结果的相关性分析图；

图7对比解离溶液3检测与液相串联质谱法检测结果的相关性分析图。

具体实施方式

本发明公开了一种25-羟基维生素D及其代谢物的解离剂及其制备方法、应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

本发明提供的一种25-羟基维生素D及其代谢物的解离剂及其制备方法、应用中所用材料或试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1本发明解离剂的制备

以各组分占所述解离剂的质量体积百分比g/ml计，本发明解离剂包含：2％BIS-TRIS、1％氯化钠、7.5％二甲基甲酰胺、7.5％二甲基亚砜、0.33％ANS、0.66％全氟庚酸复合物和余量的水。其中pH调节剂的用量为使溶剂、缓冲剂的混合体系的pH 6.5。

制备方法：按上述比例称取BIS-TRIS、氯化钠、二甲基甲酰胺和二甲基亚砜与水混合，得到稳定的溶剂-缓冲剂体系，之后加6M盐酸调节溶剂-缓冲剂体系的pH值至pH 6.5，再加入ANS、全氟庚酸充分混匀，过滤，获得解离剂。

实施例2检测人血清或血浆样品中25-羟基维生素D含量的方法

(一)试剂的配制：

1、制备包被25-羟基维生素D的磁微粒混悬液：根据实际用量量取合适的含羧基的磁微粒，采用过量的EDC和NHS溶液进行磁珠活化，活化缓冲液采用MES(2-(吗琳代)乙磺酸)缓冲液，进行30分钟活化，活化后用PBS溶液洗涤并弃去上清液；之后加入适量的25-羟基维生素D抗体进行包被，包被完成后弃去上清并添加一定量的含牛血清白蛋白的封闭液进行封闭，分装至于2-8℃备用。

2、25-羟基维生素D系列校准品的配置：选取适量缓冲液配置得到0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、60ng/mL、80ng/mL、150ng/mL的系列校准品，依次安排瓶盖颜色为白、黄、绿、蓝、紫、黑。

3、制备辣根过氧化物酶标记的25-羟基维生素D：将25-羟基维生素D(衍生物)上的羧基基团与辣根过氧化物酶分子的氨基经EDC缩合为酰胺化合物，透析后得到酶标25-羟基维生素D，将标记好的酶标25-羟基维生素D加入用pH 7.5的TRIS-HCL缓冲溶液稀释后的小牛血清中进行稀释得到本实验所需的酶结合物。

(二)检测方法：

1.根据实验要求添加一定量的校准品、待测样本(血清或血浆)于反应杯中；

2.添加一定量的实施例1的解离剂；

3.添加一定量混匀的磁微粒缓冲液；

4.加入适量酶结合物；

5.混匀后于37℃温育；

6.利用磁分离设备分离磁珠并洗涤；

7.震荡磁珠使其均匀；

8.添加发光底物A液及B液，混匀后进行避光反应；

9.使用化学发光免疫分析仪检测发光强度；

10.利用四参数拟合方式，以校准品发光值为Y轴，对应浓度为X轴建立定标曲线，根据待测样本的发光值回算其相应浓度值。

采用上述方法检测测量结果校准曲线相关性R²大于0.9999，结果见附图1所示。

(三)临床不同方法对比

取20份临床血清，按照上述测量方法与液相串联质谱同时进行实验对比。检测结果相关性见图2。

实验结果表明，本发明测量结果与液相串联质谱测量结果的相关性R大于0.98，按照本发明解离剂进行的样本测试结果与金标准液相串联质谱的测量结果具有较好的一致性，表明本发明解离剂能够较好的应用于临床检测当中，具有广阔的应用前景。

实施例3本发明解离剂的制备及相关性检测试验

以各组分占所述解离剂的质量体积g/ml百分比计，本发明解离剂包含：2.5％BIS-TRIS、0.8％氯化钠、8.33％的二甲基甲酰胺、1.66％二甲基亚砜，0.18％ANS1.81％全氟辛酸和余量的水。其中pH调节剂的用量为使溶剂、缓冲剂的混合体系的pH 7.5。

制备方法：先将上述比例的BIS-TRIS-氯化钠与二甲基甲酰胺及二甲基亚砜与水混合，得到稳定的溶剂-缓冲剂体系，之后加6M盐酸调节缓冲体系pH值为pH 7.5，再加入上述比例的ANS及全氟辛酸复合物充分溶解后过滤得到本发明解离剂。

利用上述制得的解离剂检测人血清或血浆样品中25-羟基维生素D含量，方法同实施例1。检测测量结果校准曲线相关性R²大于0.9999，结果见附图3所示。

临床不同方法对比

取20份临床血清，利用上述制得的解离剂按照实施例1的检测方法与液相串联质谱同时进行实验对比。检测结果相关性见图4。

实验结果表明，本发明检测结果与液相串联质谱测量结果的相关性R大于0.98，按照本发明解离剂进行的样本测试结果与金标准液相串联质谱的测量结果具有较好的一致性，表明本发明解离剂能够较好的应用于临床检测当中，具有广阔的应用前景。

对比例

对比解离溶液1:仅含0.3％的SDS的TRIS缓冲液溶液；

对比解离溶液2:仅含PBS缓冲溶液和2％ANS及全氟辛酸复合物(两组份比例为1:10)的溶液；

对比解离溶液3:仅含体积比为2.5％BIS-TRIS、0.8％氯化钠、10％的二甲基甲酰胺及二甲基亚砜(两组份比例5:1)和0.2％的SDS溶液。

按照上述配方配制的对比解离溶液1～3，用于检测人血清或血浆样品中25-羟基维生素D含量，方法实施例1。

临床不同方法对比

取20份临床血清，分别利用对比解离溶液1～3、液相串联质谱同时进行实验对比，检测结果相关性见图5～7。

结果显示，对比解离溶液1的测量结果与液相串联质谱的相关性R仅为0.47；对比解离溶液2的测量结果与液相串联质谱的相关性R仅为0.51；对比解离溶液3的测量结果与液相串联质谱的相关性R仅为0.59。以上结果表明，上述三种解离溶液与金标准液相串联质谱的测量结果一致性较差。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种25-羟基维生素D及其代谢物的解离剂，其特征在于，由表面活性剂、缓冲剂、溶剂、pH调节剂和水组成；

所述表面活性剂由8-苯胺基-1-萘磺酸和氟代烷基类表面活性剂组成；

所述氟代烷基类表面活性剂为全氟辛酸或其盐、全氟庚酸或其盐中的一种或几种；

所述缓冲剂由BIS-TRIS和氯化钠组成。

2.根据权利要求1所述的解离剂，其特征在于，各组分用量为：

以重量体积百分比g/ml计，所述表面活性剂占所述解离剂的重量体积百分含量为0.5％-10％；所述缓冲剂占所述解离剂的重量体积百分含量为1％-10％；所述溶剂占所述解离剂的重量体积百分含量为2％-20％；余量为水；

所述pH调节剂的用量为使得所述溶剂和缓冲剂的混合体系的pH为6～10。

3.根据权利要求1所述的解离剂，其特征在于，所述表面活性剂中，苯胺类表面活性剂与氟代烷基类表面活性剂的质量比为1:(2～10)。

4.根据权利要求1所述的解离剂，其特征在于，所述溶剂由二甲基甲酰和二甲亚砜胺组成。

5.根据权利要求4所述的解离剂，其特征在于，所述溶剂中，二甲基甲酰胺与二甲亚砜的质量比为(1～5):1。

6.权利要求1～5所述的解离剂的制备方法，其特征在于，将缓冲剂、溶剂、pH调节剂和表面活性剂混合，获得所述解离剂。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述混合具体为：

将缓冲剂和溶剂混合，获得混合液；

用pH调节剂调节所述混合液的pH至6～10，加入所述表面活性剂充分混匀。

8.权利要求1～5任一项所述的解离剂，或权利要求6或7所述的制备方法制得的解离剂在制备检测25-羟基维生素D及其代谢物含量的检测试剂盒中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述25-羟基维生素D包括25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3。

10.一种检测25-羟基维生素D及其代谢物含量的检测试剂盒，包括权利要求1～5任一项所述的解离剂，或权利要求6或7一项所述的制备方法制得的解离剂。

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