CN113533746B - 一种P-Tau蛋白化学发光检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种P‑Tau蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球、ABEI标记的第一株抗体、FITC标记的第二珠抗体、P‑Tau蛋白标准品、质控品和浓缩洗液，所述第一株抗体和第二株抗体为抗P‑Tau蛋白的单克隆抗体，且第一株抗体所识别的P‑Tau蛋白的氨基酸位点与第二株抗体所识别的P‑Tau蛋白的氨基酸位点不同。本发明对常规的磁性微球进行改良，制备得到悬浮稳定性和分散性好的高分散磁性微球，使磁性微球在分离标记抗体时分离速度更快，最终使试剂盒灵敏度更高。
Description
技术领域
本发明属于生化检测技术领域，具体涉及一种用于P-Tau蛋白定性定量化学发光检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
Tau蛋白又称微管结合蛋白（Microtubulue Association Protein，MAP），存在于正常脑组织神经元轴突中，具有合成和稳定神经元细胞骨骼的作用。正常脑中Tau蛋白的细胞功能是与微管蛋白结合促进其聚合形成微管；与形成的微管结合，维持微管稳定性，降低微管蛋白分子的解离，并诱导微管成束。正常脑中Tau蛋白分子含2-3个磷酸基，而阿尔茨海默症（AD）患者脑中的Tau蛋白则异常过度磷酸化，每分子Tau蛋白可含5-9个磷酸基，并丧失正常生物功能。
有研究表明AD致病的主要原因是由于大脑中Tau蛋白过度磷酸化导致神经纤维缠结和大脑中β淀粉样蛋白大量沉积构成老年斑，进而导致神经元功能异常，Tau蛋白过度磷酸化是AD脑神经元降解的重要初始步骤。有研究表明，AD患者大脑中Tau蛋白过度磷酸化产生的P-Tau-181蛋白可启动血脑屏障外的P-Tau-181蛋白的生成，最终导致血液中P-Tau-181含量的增加。因此，检测血清中P-Tau-181蛋白的含量对诊断AD有着较高的临床价值。
目前已知的P-Tau蛋白检测方法主要有放射免疫测定法（RIA）、均相酶免疫检测法、酶联免疫法（ELISA）、高效液相色谱法、气相色谱法和气相色谱和质谱联用法（GC-MS）。
放射免疫测定法，试剂的半衰期段，污染大，费用较高，需要用专门的设备，有时会出现交叉反应、假阳性反应，组织样品处理不够迅速，不能灭活降解酶和盐及pH有时会影响结果。
酶联免疫法，目前市面上已有通过CFDA认证的市售检测试剂盒，深圳市安群生物工程有限公司的“磷酸化Tau-181蛋白测定试剂盒(化学发光法)”，该试剂盒采用双抗体夹心法，血清标本加到包被有P-Tau-181抗体的微孔板上，存在于标本中的P-Tau-181与板上的抗体结合，通过洗板，将未结合的游离成分洗去；加入P-Tau-181的多抗（结合抗体），温育后洗涤，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗（酶结合物），最终形成一个抗体／抗原／抗体/酶标二抗的复合物，加入显色剂显色，一段时间后终止反应，在450nm处测OD值，OD值随标本中P-Tau-181浓度的增加而升高，根据校准品绘制的标准曲线即可算出标本中P-Tau-181的含量。该试剂盒操作步骤烦琐，易出错，实验耗时4个小时以上，特异性较差，经常会出现假阳性、假阴性的结果判读。
色谱法检测蛋白目前商品化非常少，因需要专业的设备，且灵敏度低，只在实验室分析应用较多。
目前，已有的P-Tau蛋白检测方法或多或少都存在如试剂检测成本高、操作复杂、易产生污染、产生一定的假阴性和假阳性等缺陷。因此，开发一种污染小、灵敏度高、操作简单、成本低的P-Tau蛋白快速定量检测方法亟不可待，这对阿尔兹海默症患者早期诊断具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种定量检测P-Tau蛋白的磁微粒化学发光试剂盒，所述试剂盒采用化学发光免疫双抗体夹心法对血清中P-Tau蛋白进行定量检测。
本发明通过以下技术方案实现实现定量检测P-Tau蛋白的目的。
第一方面，本发明提供一种P-Tau蛋白检测试剂盒，所述试剂盒包括包被兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球、ABEI标记的第一株抗体、FITC标记的第二珠抗体、P-Tau蛋白标准品、质控品和浓缩洗液，所述第一株抗体和第二株抗体为抗P-Tau蛋白的单克隆抗体，且所述第一株抗体所识别的P-Tau蛋白的氨基酸位点序列如SEQ ID:1所示，所述第二株抗体所识别的P-Tau蛋白的氨基酸位点序列如SEQ ID:2所示。
SEQ ID:1 MAEPRQEFEV MEDHAGTYGL GDRKDQGGYT
SEQ ID:2 MHQDQEGDTDAGLKESPLQT PTEDGSEEPG SETSDAKSTP TAEDVTAPLVDEGAPGKQAA
ABEI标记的第一株抗体和FITC标记的第二珠抗体均保存于含有5-8%（w/v）牛血清蛋白，0.2%（w/v）NaN3的PBS缓冲液中，ABEI标记的第一株抗体浓度为0.3-1.5μg/mL，FITC标记的第二珠抗体浓度为1.0-3.0μg/mL。
P-Tau蛋白标准品是P-Tau蛋白浓度为0.00 ng/mL、2.00 ng/mL、6.00 ng/mL、30.00 ng/mL、150.00 ng/mL、300.00 ng/mL，含有5-8%（w/v）牛血清蛋白，0.2%（w/v）NaN3的PBS缓冲液。
质控品为含有5-8%（w/v）牛血清蛋白，0.2%（w/v）NaN3的PBS缓冲液。
浓缩洗液是0.6%（W/V）TRIS缓冲液，使用时将浓缩洗液稀释15倍使用。
所述包被兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球保存于含有0.2%（w/v）NaN3的TRIS缓冲液中，包被兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球浓度为0.05-0.20%（v/v）。
本发明所述的高分散磁性微球通过如下方法制备得到：首先采用多臂聚乙二醇-氨基对磁性微球本体进行化学修饰，再将含羧基的线性高分子聚合物共价偶联到前述经化学修饰的磁性微球表面。
所述含羧基的线性高分子聚合物分子量为3000-8000，选自透明质酸、聚丙烯酸、马来酸丙烯酸共聚物中的一种或两种以上的组合。
优选的，所述含羧基的线性高分子聚合物为透明质酸。
所述多臂聚乙二醇-氨基为通式Ⅰ所示的化合物：
其中，R选自季戊四醇或聚季戊四醇、丙三醇或聚丙三醇，n为臂数，n为≥3的整数，1≤k≤n。
在本发明的优选实施方式中，所述多臂聚乙二醇-氨基为如式Ⅱ所示的三臂聚乙二醇-氨基，或者如式Ⅲ所示的四臂聚乙二醇-氨基，PEG分子量为400-2000。
优选的，所述高分散磁性微球的制备方法包括如下步骤：
（1）将磁性微球本体分散于质量浓度为10-30%多臂聚乙二醇-氨基水溶液中，40-45℃反应1-4小时，用蒸馏水清洗磁性微球后分散于pH7.4的PBS中；
（2）室温下将含有羧基的线性高分子聚合物活化，加入步骤（1）得到的磁性微球，反应过夜，用蒸馏水清洗磁性微球，制备得到高分散磁性微球。
为了使修饰在磁性微球表面的-COOH过量，优选的，多臂聚乙二醇-氨基与含羧基的线性高分子聚合物质量比为1:(3-6)。
本发明所述的磁性微球本体可通过商业途径购买或者自行制备。优选的，本发明实施例中使用的磁性微球通过以下方法制备得到：取质量浓度为0.05-0.1g/mL的 FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O溶于超纯水中，搅拌并匀速升温至60-65℃，向反应体系中加入氨水，继续升温至80-85℃熟化1-2小时，制备得到磁性微球本体，所述磁性微球本体粒径在100nm-1μm之间。
第二方面，本发明提供一种利用所述试剂盒检测P-Tau蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
（1）分别吸取各浓度的P-Tau蛋白标准品50-100μL，再分别加入50-100μL ABEI标记的第一株抗体和FITC标记的第二珠抗体，充分混匀后37℃孵育15-20min；
（2）加入包被有兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球80-150μL，混匀后再37℃下孵育5-6min；
（3）将反应物在磁分离器上静置1-2min，弃上清后加入洗液，清洗沉淀物2-4次,将沉淀物直接放入测量暗箱，加入激发底物，延迟3-5s后检测发出的相对光强度（RLU），根据P-Tau蛋白标准品浓度与RLU绘制标准曲线；
（4）取待测样品，按照上述相同的操作方法检测样品的RLU，根据标准曲线得出样品中的P-Tau蛋白浓度。
本发明使用晶型完整均匀的磁性微球作为基质，该磁性微球通过化学共沉淀法合成。首先利用多臂聚乙二醇-氨基将磁性微球表面进行修饰，引入氨基，再通过共价结合的方式向磁性微球表面引入含羧基的线性高分子聚合物以进一步增加磁性微球的悬浮稳定性和分散性。悬浮稳定性好的磁性微球在分离标记的抗体时分离速度更快，同时使试剂盒灵敏度更高。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所有实施例使用的磁性微球本体均采用如下方法制备得到：取10gFeCl2·4H2O和10g FeCl3·6H2O于150mL超纯水中，缓慢搅拌30分钟混合均匀，匀速升温至60℃，加入10mL氨水，反应30分钟，再次升温至80℃熟化1小时，用无水乙醇清洗，分散于超纯水中得到固含量在20-25%之间的磁性微球本体。
本发明所述的ABEI标记的第一株抗体、FITC标记的第二珠抗体由本领域技术人员知晓的常规技术手段标记制备得到，在本次技术方案中不再赘述。
高分散磁性微球的制备
制备例1
S1：取5mL磁性微球本体分散于10mL质量浓度为10%三臂聚乙二醇-氨基（分子量1400）水溶液中，40-45℃反应1-4小时，用蒸馏水清洗磁性微球，将磁性微球悬浮于pH7.4的PBS中；
S2：称取透明质酸（M=5000）6 mg溶解于蒸馏水中，加入EDC 12mg和NHS 18 mg，调pH 值至7.4，于37℃水浴活化4小时，加入步骤S1得到的磁性微球，反应过夜，用蒸馏水清洗，制备得到高分散磁性微球。
制备例2
制备方法及使用原料配比同制备例1，区别仅在于将三臂聚乙二醇-氨基替换为四臂聚乙二醇-氨基（分子量1800）。
制备例3
S1：取5mL磁性微球本体分散于10mL质量浓度为10%三臂聚乙二醇-氨基（分子量1400）水溶液中，40-45℃反应1-4小时，用蒸馏水清洗磁性微球，将磁性微球悬浮于pH7.4的PBS中；
S2：称取马来酸丙烯酸共聚物（M=3000）6 mg溶解于蒸馏水中，加入EDC 12mg和NHS18 mg，调pH 值至7.4，于37℃水浴活化4小时，加入步骤S1得到的磁性微球，反应过夜，用蒸馏水清洗，制备得到高分散磁性微球。
制备例4
制备方法及使用原料配比同制备例1，区别仅在于将三臂聚乙二醇-氨基替换为四臂聚乙二醇-氨基（分子量1800）。
制备例5
S1：取5mL磁性微球本体分散于10mL质量浓度为10%三臂聚乙二醇-氨基（分子量1400）水溶液中，40-45℃反应1-4小时，用蒸馏水清洗磁性微球，将磁性微球悬浮于pH7.4的PBS中；
S2：称取聚丙烯酸（M=3000）6 mg溶解于蒸馏水中，加入EDC 12mg和NHS 18 mg，调pH 值至7.4，于37℃水浴活化4小时，加入步骤S1得到的磁性微球，反应过夜，用蒸馏水清洗，制备得到高分散磁性微球。
制备例6
制备方法及使用原料配比同制备例1，区别仅在于将三臂聚乙二醇-氨基替换为四臂聚乙二醇-氨基（分子量1800）。
制备例7
制备方法及使用原料配比同制备例1，区别仅在于将三臂聚乙二醇-氨基替换为直链聚乙二醇-氨基（分子量450）。
制备包被兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球
制备例1a
将100μg纯化的兔抗FITC多克隆抗体溶解到100μL，pH7.4的PBS中，分别加入1mL制备例1得到的高分散磁性微球，轻微搅动状态下反应1小时，分离磁性微球，用TRIS缓冲液清洗微球，再将磁性微球溶于含有0.2%（w/v）NaN3的TRIS缓冲液中，制备得到包被兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球，体积浓度为0.20%。
制备例2a
制备方法及原料同制备例1a，区别仅在于利用制备例2得到的高分散磁性微球为载体，制备得到包被兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球。
制备例3a
制备方法及原料同制备例1a，区别仅在于利用制备例3得到的高分散磁性微球为载体，制备得到包被兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球。
制备例4a
制备方法及原料同制备例1a，区别仅在于利用制备例4得到的高分散磁性微球为载体，制备得到包被兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球。
制备例5a
制备方法及原料同制备例1a，区别仅在于利用制备例5得到的高分散磁性微球为载体，制备得到包被兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球。
制备例6a
制备方法及原料同制备例1a，区别仅在于利用制备例6得到的高分散磁性微球为载体，制备得到包被兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球。
制备例7a
制备方法及原料同制备例1a，区别仅在于利用制备例7得到的高分散磁性微球为载体，制备得到包被兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球。
实施例1 P-Tau蛋白化学发光检测试剂盒
本发明提供的用于检测P-Tau蛋白化学发光检测试剂盒含有如下表所示的成分：
表1
| 名称 | 装量 | 组成成分 | |
| 1 | 包被兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球 | 4.5mL | 0.2%包被兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球、0.2%NaN<sub>3</sub>、0.6% TRIS缓冲液 |
| 2 | ABEI标记的第一株抗体 | 4.5mL | 1.0 μg/mL ABEI标记的第一株抗体、5%牛血清蛋白、0.2%NaN<sub>3</sub>、PBS缓冲液 |
| 3 | FITC标记的第二珠抗体 | 4.5mL | 2.0 μg/mL FITC标记的第二珠抗体、5%牛血清蛋白、0.2%NaN<sub>3</sub>、PBS缓冲液 |
| 4 | P-Tau蛋白标准品A | 2.0mL | 0.00 ng/mL P-Tau蛋白、5%牛血清蛋白、0.2%NaN<sub>3</sub>、PBS缓冲液 |
| 5 | P-Tau蛋白标准品B | 1.0mL | 2.00 ng/mL P-Tau蛋白、5%牛血清蛋白、0.2%NaN<sub>3</sub>、PBS缓冲液 |
| 6 | P-Tau蛋白标准品C | 1.0mL | 6.00 ng/mL P-Tau蛋白、5%牛血清蛋白、0.2%NaN<sub>3</sub>、PBS缓冲液 |
| 7 | P-Tau蛋白标准品D | 1.0mL | 30.00 ng/mL P-Tau蛋白、5%牛血清蛋白、0.2%NaN<sub>3</sub>、PBS缓冲液 |
| 8 | P-Tau蛋白标准品E | 1.0mL | 150.00 ng/mL P-Tau蛋白、5%牛血清蛋白、0.2%NaN<sub>3</sub>、PBS缓冲液 |
| 9 | P-Tau蛋白标准品F | 2.0mL | 300.00 ng/mL P-Tau蛋白、5%牛血清蛋白、0.2%NaN<sub>3</sub>、PBS缓冲液 |
| 10 | 质控品 | 2.0mL | 5%牛血清蛋白、0.2%NaN<sub>3</sub>、PBS缓冲液 |
| 11 | 浓缩洗液 | 6mL | 0.6%TRIS缓冲液 |
分别利用制备例1a-7a所述的7种包被兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球可以制备得到7种P-Tau蛋白化学发光检测试剂盒1-7。
实施例2 P-Tau蛋白化学发光检测试剂盒使用方法
S1：分别吸取100μL试剂盒中的P-Tau蛋白标准品（0.00 ng/mL、2.00 ng/mL、6.00ng/mL、30.00 ng/mL、150.00 ng/mL、300.00 ng/mL），各加入100μL ABEI标记的第一株抗体和100μL FITC标记的第二珠抗体，充分混匀后37℃孵育15分钟；加入包被有兔抗FITC多克隆抗体的磁性微球80μL，混匀后在37℃下孵育5分钟；将反应物在磁分离器上静置1-2min，弃上清后加入洗液，清洗沉淀物2-4次；将沉淀物直接放入测量暗箱，加入激发底物NaOH和H2O2，延迟3-5s后检测发出的相对光强度（RLU）分别为502256、319834、168910、87362、40284、21678，根据P-Tau蛋白标准品与RLU绘制标准曲线，相关系数R2=0.9999；
S2：取待测样品，按照上述相同的操作方法检测样品的RLU，根据标准曲线得出样品中的P-Tau蛋白浓度。
效果实施例
1，高分散磁性微球悬浮稳定性检测
检测制备例1-6和对比制备例1制备得到的磁性微球在30min及7d悬浮稳定性以及分离速度，结果如下表所示。
表2
| 30min悬浮稳定性 | 7d悬浮稳定性 | 分离速度 | |
| 制备例1 | 下降＜1% | 下降4% | 5s |
| 制备例2 | 下降＜1% | 下降3.1% | 5s |
| 制备例3 | 下降＜1% | 下降5.2% | 8s |
| 制备例4 | 下降＜1% | 下降4.5% | 7s |
| 制备例5 | 下降1.3% | 下降7% | 12s |
| 制备例6 | 下降＜1% | 下降8.3% | 10s |
| 制备例7 | 下降4% | 下降13% | 15s |
对比实施例1与2，3与4，5与6的检测结果可以看出，当含羧基的线性高分子聚合物相同时，四臂聚乙二醇-氨基对磁性微球的稳定性较三臂聚乙二醇-氨基的稳定性更好。实际上，30min内磁性微球的悬浮稳定性差异不明显，但放置7天以后，明显地，用四臂聚乙二醇-氨基修饰的磁性微球悬浮稳定性更好。这是因为四臂聚乙二醇-氨基由于支链较多，对磁性微球的包覆作用更好，与制备例7中直链聚乙二醇-氨基对比效果更明显。对比实施例1、3、5的检测结果可以看出，不同的含羧基线性聚合物对磁性微球的稳定性具有明显差异，其中透明质酸的稳定作用力最强，其次是马来酸丙烯酸共聚物，最后是聚丙烯酸。分析原因我们认为，透明质酸线性糖链结构，比起聚丙烯酸这类线性碳链结构对磁性微球的包覆效果更好，另外，可能是因为透明质酸分子结构中同时含有-COOH和-OH，电负性强，使得其修饰的磁性微球分散性更好。
，试剂盒灵敏度检测
以试剂盒1为例，测定20次零浓度标准品，计算20次RLU的平均值（M）以及标准差（SD），测定3次浓度为2.00 ng/mL标准品的RLU值，以浓度为X轴，PLU为Y轴，根据零浓度标准品和其他标准品（2.00 ng/mL）之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得到一次方程，将M+3SD带入方程，得出相应浓度即为试剂盒的灵敏度。本发明制备的7种试剂盒的灵敏度如下表所示：
表3
| 试剂盒1 | 1.24ng/mL |
| 试剂盒2 | 1.02 ng/mL |
| 试剂盒3 | 1.66ng/mL |
| 试剂盒4 | 1.34ng/mL |
| 试剂盒5 | 1.78ng/mL |
| 试剂盒6 | 1.57ng/mL |
| 试剂盒7 | 2.08ng/mL |
根据上表所示数据可以看出，试剂盒2对P-tau蛋白检测灵敏度最高，试剂盒7的灵敏度最低。试剂盒7与试剂盒1和2相比，灵敏度显著降低，说明用聚乙二醇-氨基对磁性微球进行修饰时，聚乙二醇的臂数越多，试剂盒的灵敏度相对更好。因为多臂聚乙二醇-氨基对磁性微球的包覆作用更好，磁性微球稳定性好，起到的分离作用更好。其次，就试剂盒1、试剂盒3与试剂盒5相比较，试剂盒1的灵敏度更好，说明透明质酸作为磁性微球的修饰试剂效果更好，原因在于，与线性碳链聚合物相比，线性糖链聚合物对磁性微球的稳定性改善效果更强。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 深圳市天大生物医疗器械有限公司
<120> 一种P-Tau蛋白化学发光检测试剂盒及其制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr
20 25 30
<210> 2
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met His Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser
1 5 10 15
Pro Leu Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu
20 25 30
Thr Ser Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro
35 40 45
Leu Val Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala
50 55 60
Claims (6)
1.一种P-Tau蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球、ABEI标记的第一株抗体、FITC标记的第二珠抗体、P-Tau蛋白标准品、质控品和浓缩洗液，所述第一株抗体和第二株抗体为抗P-Tau蛋白的单克隆抗体，且所述第一株抗体所识别的P-Tau蛋白的氨基酸位点序列如SEQ ID:1所示，所述第二株抗体所识别的P-Tau蛋白的氨基酸位点序列如SEQ ID:2所示；
所述的高分散磁性微球通过如下方法制备得到：首先采用多臂聚乙二醇-氨基对磁性微球本体进行化学修饰，再将含羧基的线性高分子聚合物共价偶联到前述经化学修饰的磁性微球表面；所述含羧基的线性高分子聚合物分子量为3000-8000，选自透明质酸；
所述多臂聚乙二醇-氨基为如式Ⅲ所示的四臂聚乙二醇-氨基，PEG分子量为400-2000，
2.根据权利要求1所述的P-Tau蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述包被兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球保存于含有0.2％(w/v)NaN3的TRIS缓冲液中，浓度为0.05-0.20％(v/v)。
3.根据权利要求1所述的P-Tau蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述高分散磁性微球的制备方法包括如下步骤：
(1)将磁性微球本体分散于质量浓度为10-30％多臂聚乙二醇-氨基水溶液中，40-45℃反应1-4小时，用蒸馏水清洗磁性微球后分散于pH7.4的PBS中；
(2)室温下将含有羧基的线性高分子聚合物活化，加入步骤(1)得到的磁性微球，反应过夜，用蒸馏水清洗磁性微球，制备得到高分散磁性微球。
4.根据权利要求1所述的P-Tau蛋白检测试剂盒，其特征在于，多臂聚乙二醇-氨基与含羧基的线性高分子聚合物质量比为1:(3-6)。
5.根据权利要求1所述的P-Tau蛋白检测试剂盒，其特征在于，ABEI标记的第一株抗体和FITC标记的第二珠抗体均保存于含有5-8％(w/v)牛血清蛋白，0.2％(w/v)NaN3的PBS缓冲液中，ABEI标记的第一株抗体浓度为0.3-1.5μg/mL，FITC标记的第二珠抗体浓度为1.0-3.0μg/mL；
P-Tau蛋白标准品是P-Tau蛋白浓度为0.00ng/mL、2.00ng/mL、6.00ng/mL、30.00ng/mL、150.00ng/mL、300.00ng/mL，含有5-8％(w/v)牛血清蛋白，0.2％(w/v)NaN3的PBS缓冲液；
质控品为含有5-8％(w/v)牛血清蛋白，0.2％(w/v)NaN3的PBS缓冲液；
浓缩洗液是0.6％(W/V)TRIS缓冲液，使用时将浓缩洗液稀释15倍使用。
6.一种利用权利要求1所述的试剂盒检测P-Tau蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)分别吸取各浓度的P-Tau蛋白标准品50-100μL，再分别加入50-100μL ABEI标记的第一株抗体和FITC标记的第二珠抗体，充分混匀后37℃孵育15-20min；
(2)加入包被有兔抗FITC多克隆抗体的高分散磁性微球80-150μL，混匀后再37℃下孵育5-6min；
(3)将反应物在磁分离器上静置1-2min，弃上清后加入洗液，清洗沉淀物2-4次,将沉淀物直接放入测量暗箱，加入激发底物，延迟3-5s后检测发出的相对光强度(RLU)，根据P-Tau蛋白标准品浓度与RLU绘制标准曲线；
(4)取待测样品，按照上述相同的操作方法检测样品的RLU，根据标准曲线得出样品中的P-Tau蛋白浓度。
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