JP2886983B2 - 固相試薬およびそれを用いた抗体の測定法 - Google Patents

固相試薬およびそれを用いた抗体の測定法

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、β２−グリコプロテインＩを特定の担体に
結合させて得た固相試薬、該固相試薬を用いた抗リン脂
質抗体症候群に特異的な抗体の測定法、抗リン脂質抗体
症候群に特異的な抗体と感染症に特異的な抗体を分別検
出する方法及び該方法に使用するキットに関するもので
ある。
背景技術 抗リン脂質抗体の一種である抗カルジオリピン抗体の
測定法としては、HarrisらによるRIA法（Lancet.iii:12
11,1983）、小池らのELISA法（Clin,Exp.Immunol.,56:1
93,1984）などの種々の方法が報告されている。
しかし、上述の方法は、抗カルジオリピン抗体を定量
的に測定できなかったり、感染症由来の抗体と抗リン脂
質抗体症候群由来の抗体とを区別して測定できないとい
った問題を有し、必ずしも満足できるものではなかっ
た。
最近、松浦らは、抗リン脂質抗体症候群由来の抗カル
ジオリピン抗体は固相化したカルジオリピンを認識する
のではなく、カルジオリピンとβ２−グリコプロテイン
Ｉ（別名：アポリポプロテインＨまたは抗カルジオリピ
ン抗体・コファクター）との複合体を認識することを見
い出すとともに、この原理を利用して、上述の従来法の
問題点を克服しうる抗リン脂質抗体の測定を開発した
（Lancet,336:177,1990、臨床免疫,22（Suppl.15）:17
0,1990、WO91/06006号、J.Immunol.,148:3855,1992）。
松浦らの研究により、抗リン脂質抗体症候群由来の抗
カルジオリピン抗体はカルジオリピンとβ２−グリコプ
ロテインＩとの複合体を認識するものであることが明ら
かにされたものの、その臨床的意義については未だに不
明な点が多い。したがって、抗カルジオリピン抗体の結
合性に関する臨床的意義を明らかにすることは、抗リン
脂質抗体症候群の発症メカニズムの解明にもつながりう
ることであり、今後の重要課題と考えられている。
この課題の解決のためには、特異性及び定量性に優れ
たより簡便な測定法の開発が重要である。しかし、従来
のRIA法およびELISA法では、上述したように梅毒などの
感染症患者に認められるカルジオリピンに直接反応する
抗体と抗リン脂質抗体症候群の患者に認められるカルジ
オリピン・β２−グリコプロテインＩ複合体に反応する
抗体との分別測定が不可能であった。また、松浦らの改
良型測定法ではこの種の分別測定が可能であるものの、
固相試薬の調製が面倒であるなど、より簡便な測定法の
確立が要望されていた。
したがって、本発明は、カルジオリピン・β２−グリ
コプロテインＩ複合体に対して特異的な抗体のより簡便
な測定法の提供を目的とするものである。
発明の開示 本発明者らは上記目的を達成すべく研究を重ねた結
果、陰性荷電もしくは孤立電子対を有する官能基および
／または遊離基を表面に導入した担体にβ２−グリコプ
ロテインＩを結合させたものを固相試薬として用いるこ
とにより、抗リン脂質抗体症候群に特異的な抗体を特異
的に測定できることを見いだし、本発明を完成された。
したがって、本発明は、陰性荷電もしくは孤立電子対
を有する官能基および／または遊離基を表面に導入した
担体にβ２−グリコプロテインＩを結合させた得た固相
試薬（以下、第１の固相試薬と略称することもある）に
関するものである。また、本発明は、第１の固相試薬を
使用する抗リン脂質抗体症候群に特異的な抗体の測定法
およびキットに関するものである。
さらに、本発明は、抗リン脂質抗体症候群に特異的な
抗体と感染症に特異的な抗体を分別検出する方法及びキ
ットに関するものである。
さらにまた、上記分別検定法に使用する、陰性荷電も
しくは孤立電子対を有する官能基および／または遊離基
を表面に導入した担体にβ２−グリコプロテインＩを結
合させた部位とそれを結合させない部位の２種類の部位
を有する固相試薬（以下、第２の固相試薬と略称するこ
ともある）に関するものである。
図面の簡単な説明 第１図は、従来のELISA法を用いたときの結果を示し
たものである。
第２図は、松浦らによる変法を用いたときの結果を示
したものである。
第３図は、本発明方法を用いたときの結果を示したも
のである。
第４図は、本発明方法と松浦らによる変法により得ら
れた結果の相関を示したものである。
第５図は、抗カルジオリピン抗体のβ２−GPI結合放
射線または電子線照射プレートへの反応性を示したもの
である。
第６図は、WB−CAL−１の特異性を示したものであ
る。
第７図は、As血清の特異性を示したものである。
第８図は、抗β２−GPI抗体（Cof−18）の特異性を示
したものである。
第９図は、カルボキシル化プレートを用いた抗カルジ
オリピン抗体の測定結果を示したものである。
第10図は、放射線照射プレートおよびCL吸着プレート
により得られる抗カルジオリピン抗体価の相関を示した
ものである。
第11図は、カルボキシル化プレートおよびCL吸着プレ
ートにより得られる抗カルジオリピン抗体価の相関を示
したものである。
第12図は、放射線照射プレートおよびカルボキシル化
プレートにより得られる抗カルジオリピン抗体価の相関
を示したものである。
第13図は、市販のポリスチレンプレートにβ２−GPI
を固相化したものを用いた抗カルジオリピン抗体の測定
結果を示したものである。
第14図は、自己免疫性および感染性の各抗カルジオリ
ピン抗体の分別検定の結果を示したものである。
第15図は、Ｘ線光電子分光分析による本発明の放射線
または電子線照射ポリスチレンプレートの表面の解析結
果を示したものである。
発明を実施するための最良の形態 以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明の固相試薬 本発明の第１の固相試薬は、陰性荷電もしくは孤立電
子対を有する官能基および／または遊離基を表面に導入
した担体にβ２−グリコプロテインＩを結合させたもの
であり、抗リン脂質抗体症候群に特異的な抗体の測定法
およびキットに使用される。
本明細書において抗リン脂質抗体症候群とは、全身性
エリテマトーデス（SLE）に代表される自己免疫疾患、
あるいは血栓症、神経症状、習慣性流産、血小板減少等
の症状を呈する一群の疾患（J.Rheumatol.,13,486（198
6））を意味する。
β２−グリコプロテインＩを結合させるために使用す
る担体としては、陰性荷電もしくは孤立電子対を有する
官能基および／または遊離基を表面に導入したものであ
れば特に限定されない。
ここで、陰性荷電もしくは孤立電子対を有する官能基
および／または遊離基とは、その分子中に陰性荷電もし
くは孤立電子対を有するものを指称する。具体的には例
えば水酸基、カルボキシル基、カルボニル基、ホルミル
基、イミノ基、ニトロ基、チオール基、スルホニル基な
どの官能基、酸素ラジカルなどの遊離基を例示すること
ができる。好ましいものとしては、陰性荷電もしくは孤
立電子対が酸素原子に由来する官能基あるいは遊離基、
例えば、水酸基、カルボキシル基、カルボニル基、酸素
ラジカルなどが挙げられる。このような官能基および／
または遊離基を有する担体は、例えば、タンパク質の吸
着性の高い疎水性表面を有する合成樹脂、より具体的に
はポリ塩化ビニル、ポリスチレン、スチレン−ジビニル
ベンゼン共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合
体、ナイロン、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニト
リル、ポリプロピレン、ポリメチレンメタクリレートな
どの合成樹脂に、直極的にまたは必要に応じて陰性荷電
もしくは孤立電子対を有する官能基を化学的に導入する
ことにより調製することができる。
また、上記の疏水表面を有する合成樹脂に紫外線、放
射線（ｘ線、β線、γ線など）、電子線などを照射して
疎水性表面に陰性荷電もしくは孤立電子対を有する官能
基および／または遊離基を導入する方法、あるいは上記
の疏水表面を有する合成樹脂をオゾン、プラズマなどで
処理して疎水性表面に陰性荷電もしくは孤立電子対を有
する官能基および／または遊離基を導入する方法も本発
明の好適な担体を調製する方法として使用することがで
きる。
このような各種処理は常法により行うことができ、た
とえば、放射線または電子線を用いる場合には１〜200K
グレイ程度の放射線を上記合成樹脂の表面に照射するこ
とにより、担体の表面に陰性荷電もしくは孤立電子対を
有する官能基および／または遊離基を導入することがで
きる。
このような担体の具体例としては、EBプレート（ラボ
システムズ社製）、Ｈタイププレート、Ｃタイププレー
ト（住友ベークライト社製）、マキシソーププレート
（ヌンク社製）などを例示することができる。
担体物質の形状は、平板状（マイクロタイタープレー
ト、ディスクなど）、粒子状（ビーズなど）、管状（試
験管など）、繊維状、膜状、微粒子状（ラテックス粒子
など）などが例示され、測定法に応じた適宜な形状の担
体を選択すればよい。
担体に結合させるβ２−グリコプロテインＩは、哺乳
動物由来のものであれば特に限定されないが、特にヒト
由来のものが好ましい。また、β２−グリコプロテイン
Ｉの一部のあるいは全部の糖鎖を取り除いたものであっ
ても本発明に使用することができる。
β２−グリコプロテインＩの調製は、公知の方法、た
とえばマックニールらの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,87:4120,1990）により行うことができる。また、β２
−グリコプロテインＩのアミノ酸配列および塩基配列は
既に明らかにされており、通常のペプチド合成手段また
はDNA組換え手法により調製したものであっても本発明
に使用することができる。
β２−グリコプロテインＩの精製度は高い方が望まし
いが、これも特に限定されるものではない。
β２−グリコプロテインＩと上記担体との結合は、酵
素などのタンパク質の固定化法として通常使用されてい
る方法・条件（千畑一郎編；固定化酵素、昭和50年
（株）講談社発行、生化学実験講座11;エンザイムイム
ノアッセイ、1989年（株）東京化学同人発行など参照）
を適宜選択して行うことができる。たとえば、物理的吸
着法、イオン結合法、共有結合法などいずれの方法も使
用することができる。
本発明の第２の固相試薬は、陰性荷電もしくは孤立電
子対を有する官能基および／または遊離基を表面に導入
した担体にβ２−グリコプロテインＩを結合させた部位
とそれを結合させない部位の２種類の部位を有するもの
であり、抗リン脂質抗体症候群に特異的な抗体と感染症
に特異的な抗体を分別検出するために使用する。
第２の固相試薬に使用する担体、β２−グリコプロテ
インＩ及びそれらを用いた固相試薬の調製は、基本的に
は上述した第１の固相試薬の場合と同じであり、分別検
定に適するように適宜変更あるいは応用することにより
実施することができる。
（２）本発明方法及びキット 本発明の抗リン脂質抗体症候群に特異的な抗体を測定
法は、上述の本発明の第１の固相試薬を使用することを
特徴としており、この第１の固相試薬を使用する方法で
あれば、その測定原理・条件等は制限されない。
たとえば、反応様式による分類としては競合反応法と
非競合反応法が知られているが、本発明においてはいず
れの方法も採用できる。また、検出方法による分類とし
ては抗原抗体反応の結果を直接検出する非標識法（ネフ
ェロメトリーなど）となんらかのマーカーを使用して検
出する標識法が知られているが、本発明はどちらの方法
であってもよい。さらに、BF分離を行う必要のあるヘテ
ロジニアス法とその必要のないホモジニアス法が知られ
ており、本発明にはいずれの方法を適用してもよい。す
なわち、これら公知の一般法の中から本発明の測定法の
目的に適合する方法を適宜選択すればよい。
なお、一般的方法の詳細については、たとえば以下の
文献に詳細に記載されている。
入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（株）講談
社、昭和54年５月１日発行 石川栄治ら編「酵素免疫測定法（第２版）」（株）医
学書院、1982年12月15日発行 臨床病理 臨時増刊 特集第53号「臨床検査のための
イムノアッセイ−技術と応用−」臨床病理刊行会、1983
年発行 「バイオテクノロジー事典」（株）シーエムシー、19
86年10月９日発行 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.70」 （Immunochemical techniques（Part A）） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.73」 （Immunochemical techniques（Part B）） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.74」 （Immunochemical techniques（Part C）） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.84」 （Immunochemical techniques（Part D:Selected Immun
oassay）） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.92」 （Immunochemical techniques（Part E:Monoclonal Ant
ibodies and General Immunoassay Methods）） （〜はアカデミックプレス社発行） たとえば、陰性荷電もしくは孤立電子対を有する官能
基および／または遊離基を表面に導入したマイクロタイ
タープレートにβ２−グリコプロテインＩを結合させた
ものを固相試薬を用いたELISA法を例に挙げ、本発明の
測定法をさらに具体的に説明する。
最初に、β２−グリコプロテインＩを結合させたプレ
ートの各ウエルに被験試料（たとえば、血液、血清な
ど）を添加し、β２−グリコプロテインＩと被験液中の
抗体を反応させる。次に、ウエルを洗浄後、酵素標識抗
免疫グロブリン抗体（たとえば、ペルオキシダーゼ標識
抗IgG抗体など）を反応させ、固相と液相を分離する。
固相または液相に基質（ペルオキシダーゼの場合、たと
えば過酸化水素及びテトラメチルベンチジンなど）を添
加し、いずれかの相に含まれる酵素活性を測定する。最
後に、予め作成しておいた検量線に基づき、得られた測
定値に対応する抗体の量を算出すればよい。
本発明の抗リン脂質抗体症候群に特異的な抗体の測定
法に使用するキットも上述の本発明の第１の固相試薬を
構成試薬として包含することを特徴としており、その他
の構成試薬は採用した測定法に合致するように適宜組み
合わせればよい。
たとえば、上記ELISA法を実施するためのキットは下
記の試薬から構成される。
β２−グリコプロテインＩを結合させた固相試薬 酵素標識抗免疫グロブリン抗体 基質溶液 既知濃度の標準抗体液 次に、抗リン脂質抗体症候群に特異的な抗体と感染症
に特異的な抗体との分別検定は、β２−グリコプロテイ
ンＩを結合させた部位（試薬）または結合させない部位
（試薬）に対する各々の抗体の反応性の違いを利用した
ものである。すなわち、抗リン脂質抗体症候群に特異的
な抗体はβ２−グリコプロテインＩを結合させた部位
（試薬）に特異的に結合するが、感染症に特異的な抗体
はそのような傾向を示さない。この反応性の相違を測定
することにより、試料中の抗体の由来を同定し、各々の
抗体を分別することができる。
したがって、前記の第２の固相試薬を使用するか、ま
たは陰性荷電もしくは孤立電子対を有する官能基および
／または遊離基を表面に導入した担体にβ２−グリコプ
ロテインＩを結合させた第１の固相試薬とβ２−グリコ
プロテインＩを結合させない試薬の２種類の固相試薬を
用いること以外は、上述の抗リン脂質抗体症候群に特異
的な抗体の測定法と同様の方法で実施することができ
る。
また、抗リン脂質抗体症候群に特異的な抗体と感染症
に特異的な抗体との分別検定に使用するキットも、前記
の第２の固相試薬を使用するか、または陰性荷電もしく
は孤立電子対を有する官能基および／または遊離基を表
面に導入した担体にβ２−グリコプロテインＩを結合さ
せた第１の固相試薬とβ２−グリコプロテインＩを結合
させない試薬の２種類の固相試薬を用いることを特徴と
しており、その他の試薬は採用した測定法に合致するよ
うに適宜組み合わせればよい。
β２−グリコプロテインＩだけを使用して抗リン脂質
抗体症候群に特異的な抗体を特異的に測定できることは
本発明者らによって初めて見いだされた知見である。し
たがって、本発明においては、抗リン脂質抗体症候群に
特異的な抗体を測定するためにβ２−グリコプロテイン
Ｉとリン脂質の二つの成分を必要とせず、測定試薬の調
製が極めて簡便なものとなった。また、本発明の方法
は、松浦らの改良測定法により測定した結果と強い相関
を示すため、松浦らの方法の代わりに使用できる簡便な
測定法である。
また、陰性荷電もしくは孤立電子対を有する官能基お
よび／または遊離基を表面に導入した担体にβ２−グリ
コプロテインＩを結合させた部位とそれを結合させない
部位の２種類の部位を有する固相試薬、または陰性荷電
もしくは孤立電子対を有する官能基および／または遊離
基を表面に導入した担体にβ２−グリコプロテインＩを
結合させたものとそれを結合させないものの２種類の固
相試薬を用いることにより、抗リン脂質抗体症候群に特
異的な抗体と感染症に特異的な抗体との分別検定を実施
することもできる。
以下、比較例および実施例を示し、本発明を具体的に
説明する。
比較例1:従来のELISA法 ウシ心臓由来のカルジオリピン（シグマ社製）50μg/
mlのエタノール溶液を50μl/ウエルずつ96ウエルマイク
ロタイタープレート（ポリスチレン；ラボシステムズ社
製）の各ウエルに添加し、ウエル中のエタノールを減圧
下で乾燥した。乾燥後、10％ウシ胎児血清含有リン酸緩
衝生理食塩水（PBS）（PBS−FBS）（pH7.4）を250μl/
ウエル加え、室温で１時間放置した後、全ウエルを200
μｌの0.05％（V/V）Tween20（商品名，キシダ化学社
製）含有PBS（PBS−Tween）で３回洗浄した。
次に、被験血清のPBS−FBSによる適宜稀釈液を100μ
ｌずつウエルに添加し、室温で１時間反応させ、PBS−T
ween 200μｌで３回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ標記抗ヒトIgC抗体を100μｌずつ各ウエルに添加
し、室温で１時間反応させ、PBS−Tween 200μｌで３回
洗浄した。基質溶液〔0.003％過酸化水素水を含有0.3mM
3,3′5,5′−テトラメチルベンジジン（TMBZ）溶液〕10
0μｌを加え、室温で10分反応させた後、反応停止後（2
N硫酸）100μｌを反応液に加え、吸光度（450nm）を測
定した。なお、使用した酵素標識抗体は過ヨウ素酸架橋
法で西洋ワサビペルオキシダーゼとマウスモノクローナ
ル抗ヒトIgG抗体（Ｇ−O2,IgGクラス、ヤマサ醤油
（株）製）を結合させたものである。
その結果を第１図に示す。図中、丸印は典型的な抗リ
ン脂質抗体症候群（SLEでかつ習慣性流産）患者から得
られた血清、三角印は梅毒患者から得られた血清、四角
印は健常人から得た血清をそれぞれ用いたときの結果を
示したものである。第１図から明らかなように、従来法
では抗リン脂質抗体症候群に特異的な抗体と感染症に特
異的な抗体との分別的定量はできない。
比較例2:松浦らによる改良測定法（WO91/06006号） ウシ心臓由来のカルジオリピン（シグマ社製）50μg/
mlのエタノール溶液を50μl/ウエルずつ96ウエルマイク
ロタイタープレート（ポリスチレン；ラボシステムズ社
製）の各ウエルに加え、ウエル中のエタノールを減圧下
で乾燥した。乾燥後、１％ウシ精製アルブミン（ウシβ
２−グリコプロテインＩ不含のもの）含有リン酸緩衝生
理食塩水（PBS）（PBS−pBSA）（pH7.4）を200μl/ウエ
ル加え、室温で１時間放置した後、全ウエルを250μｌ
の0.05％（V/V）Tween）20（商品名、キシダ化学社製）
含有PBS（PBS−Tween）で３回洗浄した。
次に、各ウエルに精製ヒトβ２−グリコプロテインＩ
（PBS−pBSAで30μ/mlに調製したもの）50μl/ウエルず
つ添加し（対照群にはPBS−pBSAを50μl/ウエル添加す
る）、10分間放置した後、更に被験血清のPBS−pBSAに
よる適宜希釈液を50μｌずつウエルに加え、室温で30分
間反応させた。PBS−Tween200μｌによる３回の洗浄の
後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体を1
00μｌずつ各ウエルに加え、室温で１時間反応させ、PB
S−Tween200μｌで３回洗浄した。基質溶液〔0.003％過
酸化水素水を含む0.3mM3,3′,5,5′−テトラメチルベン
ジジン（TMBZ）溶液〕100μｌを加え、室温で10分反応
させた後、反応停止液（2N硫酸）100μｌを反応液に加
え、吸光度（450nm）を測定した。
その結果を第２図に示す。第２図中、パネル（Ａ）は
β２−グリコプロテインＩ添加群、パネル（Ｂ）は非添
加群（対照群）示す。また、丸印、三角印、四角印の意
味するところは第１図の時と同じである。
このように対照群を同時に測定することで被験液中の
抗体のβ２−グリコプロテインＩに対する依存性を確認
することができ、抗リン脂質抗体症候群由来の抗体と感
染症由来の抗体との分別定量が可能である。
実施例1:β線または電子線照射ポリスチレン製マイクロ
タイタープレートにβ２−グリコプロテインＩを結合さ
せた固相試薬を用いる抗リン脂質抗体の測定 β線または電子線を照射したポリスチレンプレート
（コンビプレートEB（商品名）ラボシステムズ社、フィ
ンランド）に、精製ヒトβ２−グリコプロテインＩ（10
μg/ml:150mM NaCl含有10mM Hepes（pH7.4）（Hepes）
で調製）50μl/ウエルずつ加え、４℃で１晩インキュベ
ートした。200μｌのPBS−Tweenで３回洗浄した後Hepes
−pBSAで適宜希釈した被験血清を100μｌずつウエルに
加え、室温で30分間静置した。200μｌのPBS−Tweenで
３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒ
トIgG抗体を100μｌずつ各ウエルに加え、室温で１時間
反応させた。PBS−Tween200μｌで３回洗浄後、基質溶
液〔0.003％過酸化水素水を含む0.3mM 3,3′,5,5′−テ
トラメチルベンジジン（TMBZ）溶液〕100μｌを加え、
室温で10分反応させ、反応停止後（2N硫酸）100μｌを
反応液に加え、吸光度（450nm）を測定した。
その結果を第３図に示す。第３図中、パネル（Ａ）は
β線または電子線を照射したポリスチレンプレート、パ
ネル（Ｂ）は同じ会社の照射をしていないポリスチレン
プレートをそれぞれ用いた時の結果を示したものであ
る。また、丸印、三角印、四角印の意味するところは第
１図の場合と同じである。
第３図から明らかなように、本発明方法により抗リン
脂質抗体症候群由来の抗体を特異的に測定できることが
明かとなった。
また、下記表１および第４図は、抗リン脂質抗体症候
群患者（19例）および健常人（20例）の血清中の抗リン
脂質抗体価を参考例２に記載の方法と本発明方法の二種
類の方法で同時に測定し、その結果の相関を調べたもの
である。その結果、参考例２のβ２−グリコプロテイン
Ｉを添加して測定した時の結果と本発明方法で得られた
結果はきわめて強い相関（相関係数:0.97,N＝39）を示
し、本発明方法が参考例２の方法と同様に血清中の抗カ
ルジオリピン・β２−グリコプロテインＩ複合体に対す
る抗体を測定できるものであることが確認された。
実施例２ 実施例２で使用する抗体の説明 WB−CAL−１および同−3: NZWマウスとMXSBマウスのF1マウスの脾細胞とミエロ
ーマ細胞との細胞融合によって確立したハイブリドーマ
より分泌されるモノクローナル抗カルジオリピン抗体
（いずれもIgGクラス）。カルジオリピン（CL）とβ２
−グリコプロテインＩ（β２−GPI）の複合体に対して
特異的を有している。
As: 抗カルジオリピン抗体陽性の抗リン脂質抗体症候群患
者血清。CLとβ２−GPIの複合体に反応する。
Cof−18: 精製ヒトβ２−GPIをBALB/cマウスに免疫して得られ
たモノクローナル抗体。β２−GPIに反応性を示す（PCT
/JP92/00528）。
（Ａ）：抗カルジオリピン抗体のβ２−GPI結合放射線
照射プレートへの反応性 異なる線量の放射線〔γ線（100、50、25、12.5、6.
3、3.1、1.6kGray）、およびβ線（または電子線）（5
0、25kGray）〕を照射した96−ウエルマイクロテストプ
レート〔MS−3496F（Ｓタイプ、住友ベークライト社
製）〕の各ウエルに50μｌの精製ヒトβ２−GPI（10μg
/ml、150mM NaCl含有10mM Hepes（pH7.4）（Hepes）で
調製）を添加し、４℃で一晩放置した。200μｌの0.05
％Tween20含有リン燐酸緩衝生理食塩水（PBS−Tween）
で各ウエルを３回洗浄後、３％ゼラチン−PBSを200μｌ
添加し、室温で１時間放置することでブロッキング処理
を施した。ゼラチン−PBSを除去後、各種抗カルジオリ
ピン抗体〔WB−CAL−１（500ng/ml）、WB−CAL−３（50
0ng/ml）、As血清（200倍希釈）〕およびモノクローナ
ル抗β２−GPI抗体（Cof−18、500ng/ml）を100μｌず
つ添加し、30分間室温で放置した。PBS−Tweenで３回洗
浄した後、適宜希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標
識抗マウスIgG抗体（HRP−amlg）、もしくは西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体（HRP−ahlg）を10
0μｌずつ各ウエルに添加し、30分間放置した。洗浄の
後、0.003％過酸化水素含有0.3mMテトラメチルベンジジ
ン（TMBZ）溶液100μｌを添加し、正確に10分経過後、2
N硫酸を100μｌ加えることで反応を停止させ、450nmの
吸光度を測定した。
結果は第５図のごとく、３種類全ての抗カルジオリピ
ン抗体は放射線（γ線、β線）または電子線の照射量に
依存して反応性を示した。Cof−18についても依存性は
認められるが非照射群でも有意な結合が認められ、抗カ
ルジオリピン抗体の反応特異性とは区別された。
（Ｂ）：抗カルジオリピン抗体の特異性 （Ａ）と同様の方法でβ２−GPI結合プレートを調製し
た。今回の阻害試験にはCLミセル、β２−GPI溶液、CL
吸着ラテックスおよびβ２−GPI結合CL吸着ラテックス
の４種類の試薬を用いた。調製法の概要は以下の通りで
ある。
CLミセル:CLエタノール溶液（シグマ社製）からエタノ
ールを乾燥除去してフィルム状にした後、ボルテクスお
よびバスソニケーターで分散懸濁させることにより調製
した。
β２−GPI溶液：精製ヒトβ２−GPIをHepesにて希釈調
製した。
CL吸着ラテックス：ラテックスビーズ（6.4μｍ、セラ
ダイン社）からコロイド状シリカを除去した後、CLを吸
着させた。
β２−GPI結合CL吸着ラテックス:CLラテックスをβ２−
GPI溶液中でインキュベートし、遊離のβ２−GPIを遠心
除去して調製した。
WB−CAL−１（500ng/ml）またはAs血清（200倍希釈）
を第６図もしくは第７図中に表示の各濃度に調製し、こ
れをβ２−GPI結合プレートに添加して室温で30分反応
させた。以後の抗体結合量の測定操作は（Ａ）と同様に
行った。第６図および第７図に示す通り、抗カルジオリ
ピン抗体の固相化β２−GPIに対する結合はβ２−GPI結
合CL吸着ラテックスのみで濃度依存的に抑制された。ま
た、参考までに第８図に抗β２−GPI抗体の特異試験の
結果を示した。その結果、β２−GPI抗体（Cof18）の固
相化β２−GPIに対する結合はβ２−GPIによって濃度依
存的に抑制された。
（Ｃ）：化学的にカルボキシル基を導入したポリスチレ
ンプレートを用いた抗カルジオリピン抗体の測定 化学的にカルボキシル基を導入したポリスチレンプレ
ート（カルボキシル化プレート）に（Ａ）と同様の方法
でβ２−GPIを結合させ、以下上記（Ａ）と同様の方法
で抗カルジオリピン抗体の結合量を定量した。
その結果、第９図に示すようにAs、WB−CAL−１およ
びWB−CAL−３はβ２−GPIを結合させたプレートに特異
的に結合性を示した。対照である健常人血清（Nor＃11
0）は如何なる条件でも結合性は示さなかった。
（Ｄ）：放射線照射プレート、カルボキシル化プレート
およびCL吸着プレートにより得られる抗カルジオリピン
抗体価の相関 100kGrayのγ線を照射したプレートまたはカルボキシ
ル化プレートにβ２−GPIを吸着させたものを用いて、
（Ａ）と同様にAPS由来の抗カルジオリピン抗体陽性患
者血清中の抗体価を測定した。また、松浦らによる改良
測定法（WO91/06006号）により抗カルジオリピン抗体を
測定し、３種類の測定法間の測定値（吸光度）の相関を
調べた。第10図〜第12図に示すごとく、３種類の測定間
には強い相関が認められた。
（Ｅ）：市販のポリスチレンプレートによるβ２−GPI
固相を用いる抗カルジオリピン抗体の測定 基本的な測定手順は（Ａ）と同じである。用いたプレ
ートはラボシステムズ社のユニバーサルプレート（非処
理プレート）、EBプレート（β線または電子線照射プレ
ート）、住友ベークライト社のＳタイプ（非処理プレー
ト）、Ｈタイプ（γ線照射プレート）、Ｃタイプ（カル
ボキシル化プレート）である。第13図のごとく、β線照
射、γ線照射、もしくは化学修飾によりカルボキシル基
を導入することで抗カルジオリピン抗体の測定が可能に
なった。
実施例3:自己免疫性および感染性の各抗カルジオリピン
抗体の分別検定 カルボキシル化プレート（Ｃタイプ、住友ベークライ
ト社製）の各ウエルに精製β２−GPI（10μg/ml、Hepes
で調製）を50μｌずつ添加し、４℃で一晩インキュベー
ションした。対照群には上記のHepes緩衝液を入れた。P
BS−Tweenで３回洗浄の後、ゼラチン−PBS（200μｌ）
を加え、室温で１時間ブロッキングした。ゼラチン−PB
Sを除去後、Hepes−BSAで200倍希釈した血清サンプルを
各ウエルに100μｌずつ添加し、室温で30分静置した。
以下、実施例２の（Ａ）に示した方法で行った。第14図
に示すごとく、APS由来の抗カルジオリピン抗体はβ２
−GPIをコートしたプレートでのみ結合性を示すが、梅
毒由来の抗体はβ２−GPIに依存しないでカルボキシル
化プレートに特異的に結合した。
実施例4:X線光電子分光分析（ｘ−ray photoelectron s
pectroscopy;XPS）による放射線または電子線照射ポリ
スチレンプレートの表面の解析 ESCAスペクトロメーター（JPS−9000MC,JEOL Ltd.,To
kyo Japan）によるXPS解析を行った。MgKa 1,2（1253.6
ev）で０−1000evのサーベイスキャンスペクトル、及び
Clsスペクトルを求めた。この際の通過エネルギーは10E
Vで解像度（resolution）はAg 3d 5/2ピークで0.9evで
ある。ClsピークのＣ−Ｃ結合エネルギーを285.0evとし
て補正した。更にスペクトルの解析にはGaussian/Loren
tzian（80:20）のcurve fittingを用いた。第15図に示
す通り未処理プレート表面上には（Ａ）の如くＣ−０
（1.3％）がわずかに検出されたのみであるが電子線（5
0KGy）照射（Ｂ）、及びγ線（100KGy）照射プレートで
は各々Ｃ−０（8.2％）及びＣ−０（5.3％）、Ｃ＝０
（3.9％）と有意に酸素原子の導入が認められた。
産業上の利用分野 本発明によればβ２−グリコプロテインＩだけを使用
して抗リン脂質抗体症候群に特異的な抗体を特異的に測
定できる。したがって、本発明においては、抗リン脂質
抗体症候群に特異的な抗体を測定するためにβ２−グリ
コプロテインＩとリン脂質の二つの成分を必要とせず、
測定試薬の調製が極めて簡便なものとなる。
また、陰性荷電もしくは孤立電子対を有する官能基お
よび／または遊離基を表面に導入した担体にβ２−グリ
コプロテインＩを結合させた部位とそれを結合させない
部位の２種類の部位を有する固相試薬、または陰性荷電
もしくは孤立電子対を有する官能基および／または遊離
基を表面に導入した担体にβ２−グリコプロテインＩを
結合させたものとそれを結合させないものの２種類の固
相試薬を用いることにより、抗リン脂質抗体症候群に特
異的な抗体と感染症に特異的な抗体との分別検定を実施
することもできる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小池 隆夫 北海道札幌市中央区南五条西22丁目１− １ 南五条円山シテイーハウス401 (56)参考文献 国際公開91／15772（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/564

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】陰性荷電もしくは孤立電子対を有する官能
    基および／または遊離基を表面に導入した担体にβ２−
    グリコプロテインＩを結合させて得た固相試薬であって
    リン脂質を含まない、抗リン脂質抗体症候群に特異的な
    抗体を測定するための固相試薬。
  2. 【請求項２】合成樹脂に放射線または電子線を照射して
    合成樹脂の表面に陰性荷電もしくは孤立電子対を有する
    官能基および／または遊離基を導入したものを担体とし
    て使用する、請求の範囲第１項記載の固相試薬。
  3. 【請求項３】合成樹脂をオゾンまたはプラズマで処理し
    て合成樹脂の表面に陰性荷電もしくは孤立電子対を有す
    る官能基および／または遊離基を導入したものを担体と
    して使用する、請求の範囲第１項記載の固相試薬。
  4. 【請求項４】陰性荷電もしくは孤立電子対が酸素原子に
    由来するものである、請求の範囲第１項記載の固相試
    薬。
  5. 【請求項５】陰性荷電もしくは孤立電子対を有する官能
    基が、水酸基、カルボキシル基、カルボニル基、ホルミ
    ル基、イミノ基、ニトロ基、チオール基またはスルホニ
    ル基である、請求の範囲第１項記載の固相試薬。
  6. 【請求項６】陰性荷電もしくは孤立電子対を有する遊離
    基が、酸素ラジカルである、請求の範囲第１項記載の固
    相試薬。
  7. 【請求項７】陰性荷電もしくは孤立電子対を有する官能
    基および／または遊離基を表面に導入した担体にβ２−
    グリコプロテインＩを結合させて得た固相試薬を使用
    し、リン脂質を使用しないことを特徴とする、抗リン脂
    質抗体症候群に特異的な抗体の測定法。
  8. 【請求項８】陰性荷電もしくは孤立電子対を有する官能
    基および／または遊離基を表面に導入した担体にβ２−
    グリコプロテインＩを結合させて得た固相試薬を構成試
    薬として包含し、リン脂質を包含しない、抗リン脂質抗
    体症候群に特異的な抗体を測定するためのキット。
  9. 【請求項９】陰性荷電もしくは孤立電子対を有する官能
    基および／または遊離基を表面に導入した担体にβ２−
    グリコプロテインＩを結合させた部位とそれを結合させ
    ない部位の２種類の部位を有する固相試薬であってリン
    脂質を含まない、抗リン脂質抗体症候群に特異的な抗体
    と感染症に特異的な抗体を分別検出するための固相試
    薬。
  10. 【請求項１０】請求の範囲第９項記載の固相試薬を使用
    し、リン脂質を使用することなくこの固相試薬の各々の
    部位に対する試料中の抗体の反応性を測定することから
    なる、抗リン脂質抗体症候群に特異的な抗体と感染症に
    特異的な抗体を分別検出する方法。
  11. 【請求項１１】請求の範囲第９項記載の固相試薬を構成
    試薬として包含し、リン脂質を包含しない、抗リン脂質
    抗体症候群に特異的な抗体と感染症に特異的な抗体を分
    別検出するためのキット。
  12. 【請求項１２】陰性荷電もしくは孤立電子対を有する官
    能基および／または遊離基を表面に導入した担体にβ２
    −グリコプロテインＩを結合させたものとそれを結合さ
    せないものの２種類の固相試薬を用い、リン脂質を用い
    ることなくこの２種類の固相試薬に対する試料中の抗体
    の反応性を測定することからなる、抗リン脂質抗体症候
    群に特異的な抗体と感染症に特異的な抗体を分別検出す
    る方法。
  13. 【請求項１３】陰性荷電もしくは孤立電子対を有する官
    能基および／または遊離基を表面に導入した担体にβ２
    −グリコプロテインＩを結合させたものとそれを結合さ
    せないものの２種類の固相試薬を構成試薬として包含
    し、リン脂質を包含しない、抗リン脂質抗体症候群に特
    異的な抗体と感染症に特異的な抗体を分別検出するため
    のキット。
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