JPS6318268A - 生化学分析用担体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、生化学分析に用いる担体およびその製造方
法に関する。

〔従来の技術〕

例えば、抗原抗体反応を利用して分析を行うアフィニテ
ィクロマトグラフィ用のカラム充填剤として、従来、シ
リカ系キャリアとポリマ系キャリアとがある。シリカ系
キャリアは親水性で、高い線流速にも耐え得るが、耐ア
ルカリ性に弱い欠点がある。これに対し、ポリマ系キャ
リア、なかでもデキストラン系のセファデックス（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ　　；商品名、ファーマシア（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）社製）やアガロース系のスペローズ（Ｓｕｐ
ｅｒｏｓｅ　　；商品名＼ファーマシア社製）等は、耐
アルカリ性に強いと共に比較的強度もある。

このポリマ系キャリア本体は疎水性で、そのベース面に
親水性水酸基（−ＯＨ基）を有する。従来、ポリマ系キ
ャリア本体へのタンパク質の固定化は、第７図に示すよ
うにして行っている。先ず、キャリア本体表面の一〇Ｈ
基をエピクロルヒドリン法によりエポキシ化する。その
後、２級アミン、例えば１．６ジアミノヘキサンを添加
して、キャリア本にアミノ基（−ＮＨ，基）を導入する
。次に、このようにしてアミノ化したキャリア本体表面
をグルタルアルデヒドにより活性化させてアルデヒド化
した後、そのアルデヒド基（−ＣＨＯ基）に所望のタン
パク質を固定化する。その後、−余ったーＣ１１Ｏ基の
アルブミンによるブロックおよ。びＮａＢＨ４による還
元処理を行って表面に所望のタンパク質を固定化した担
体を得る。このようにして得た担体の表面の様子を第８
図に示す。

〔発明が解決しようとする問題点〕

第８図において、ポリマ系キャリア本体１のベース面は
疎水性であり、またタンパク質２は一般的に疎水性の強
いものが多い。このような疎水性タンパク質２をポリマ
系キャリア本体１０表面に固定化するにあたって、上述
した従来法にあっては、１，６ジアミノヘキサンのよう
な２級アミノでアミノ化しているが、このようにアミノ
化合物でアミノ化した場合にはスペンサが短いために、
タンパク質２がアミノ基だけでなく、直接キャリア本体
１のベース面に疎水性相互作用により吸着してしまう。

この疎水結合で吸着したタンパク質２は、確実な共有結
合で結合したものでないために外れ易く、このため十分
な固定化量を得ることができないという問題点があるう
ちなみに、上述した従来法によりポリマ系キャリア本体
１へのタンパク質２の固定化量はヤギＩｇＧの場合で約
６■／ｒｎ　Ｉ！　−ｇｅ　ｊ！である。

また、タンパク質２が疎水結合でキャリア本体１の表面
に吸着されるため、キャリア本体１の表面には−ＮＨ２
基が残り、この−Ｎｌ２基への非特異的吸着が多く起こ
って分析精度が低下するという問題もある。

この発明は、このような従来の問題点に着目してなされ
たポリマ系キャリア本体に所望のりガントを、疎水性相
互作用による吸着がなく、確実な共有結合により多量に
結合した生化学分析用担体およびその製造方法を提供す
ることを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

上記目的を達成するこの発明の生化学分析用担体は、ア
ミノポリマまたはイミノポリマによりアミン化したポリ
マ系キャリア本体のアミノ基に架橋剤を介してリガンド
を共有結合により固定化して成る。

また、この発明は上記の生化学分析用担体を製造するに
あたり、ポリマ系キャリア本体表面を活性化した後、ア
ミノポリマまたはイミノポリマによりアミノ基を導入し
、このアミン化した表面にリガンドを架橋剤を介して共
有結合により固定化する。

〔作　用〕

すなわち、この発明では疎水性の表面をもつポリマ系キ
ャリア本体にリガンドを確実に固定化するために、長い
側鎖をもつイミノポリマまたはアミノポリマによりキャ
リア本体をアミノ化する。

このように、イミノポリマまたはアミノポリマを用いる
と、スペンサが長くなり、それ自身がキャリア本体の疎
水性表面を覆うことになる。したがって、リガンドはキ
ャリア本体表面との疎水結合が減り、イミノポリマまた
はアミノポリマから出ているアミノ基と確実に共有結合
することになる。

なお、この発明において、リガンドは抗原、抗体、酵素
等の生理活性物質やアミノ酸または化学合成されたペプ
チドおよび細菌、ウィルス等の微生物を含むものである
。また、イミノポリマおよびアミノポリマは分子内に（
ＲＮＨ）　、ｌおよび（ＲＮＨ２）、。

をそれぞれ含むものである。ここで、Ｒは低級アルキル
、低級アルキルフェニル、フェニルで、ｎは自然数であ
る。

〔実施例〕

この発明の一実施例においては、ポリマ系キャリア本体
として、ＴＳＫ−ＧＥＬ　ＴＯＹＯｐＨ１ＡＲＬ　Ｈ讐
７５Ｆ（商品名；東洋曹達社製）を用い、このキャリア
本体の表面にポリエチレンイミン（（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ
）　ＬｌｌＭＷ　＝６００００〜８００００　）により
アミノ基を導入して、このアミノ基にリガンドとして所
定の抗体を共有結合により吸着させる。

第１図および第２図は、キャリア本体の表面をアミノ化
するまでの順次の処理の工程図および反応模式図を示す
ものである。

先ず、キャリア本体１０をｌ″Ｎ　Ｎａ（ＩＨとエピク
ロルヒドリンとの溶液中にてよく攪拌し、室温で１夜反
応させてキャリア本体１０の一〇Ｈ基にエビクロルヒド
リンを結合させるエポキシ化を行ってキャリア本体表面
を活性化する。その後、第１の緩衝液（０，１Ｍ　Ｎａ
ｚＣＯ＝−ＮａＨＣＯ＝、　ＰＨ＝　１１）でよく洗浄
してから、５％ポリエチレンイミン水溶液をゲルの１６
倍量加え、室温で８時間反応させてアミノ化を行う。

次に、上澄を吸引してからポリエチレンイミンよりも分
子量の小さい１．６ジアミノヘキサンを含む水溶液を添
加し、２５℃、２４時間反応させてポリエチレンイミン
でアミノ化しきれなかったエポキシ基のアミノ化を行う
。その後、高純水でゲルをよ（洗浄してキャリア本体１
０の表面の７ミノ化処理を終了する。

次に、以上のようにしてアミノ化したキャリア本体１０
に抗体を固定化する処理を、第３図および第４図に示す
工程図および反応模式図を参照して説明する。

先ず、アミノ化した２５０μｌのキャリア本体１０に５
％グリタルアルデヒド溶液１２５０μｌを添加し、２５
℃、１時間反応させてキャリア本体表面をアルデヒド化
する。その後、高純水で３回、第２の緩衝液（０，０１
Ｍ　ＰＢＳ　ＰＨ＝７．０　、０．５Ｍ　ＮａＣ１，０
，０５％Ｔｗｅｅｎ８０）で２回：先浄してから、抗ヒ
トＩｇＧ　（ＹＡＭＡＳＡ。

ＭＣＡＩｇＧ　ｉ商品名）　２５０　ｐ　１　（ｌ　ｒ
ｒｇ／ｍ７りを第２の緩衝液で７５０μｌに希釈したも
のを添加し、４℃、２２時間反応させて、抗ヒ）ＩｇＧ
（抗体１１）をアルデヒド基（−ＣｕＯ基）に固定化す
る。このようにして、抗体１１を架橋剤であるグルタル
アルデヒドを介してアミノ化したキャリア本体１０の表
面に固定化する。

次に上澄を吸引してから、１０％ＢＳＡと第２の緩衝液
とで作成した溶液１ｍｌを添加し、４°Ｃ１２４時間放
置してアルブミン１２によるブロックを行う。

その後、第３の緩衝液（０，０１門ＰＢＳ　　ＰＨ＝７
．５　、０．５ＭＮａＣｌ　、　０．０５％Ｔｉｎｅｅ
ｎ８０）でゲルの洗浄を行ってから、１？１１．６ジア
ミノヘキサン（第４図において符号１３）と第３の緩衝
液とで作成した溶液１ｍｌを添加し、４℃、６時間放置
して、アルブミン１２や抗体１１でブロックしきれずに
残った一ＣＦＩＯ基１４のブロックを行う。

次に、第４の緩衝液（０，２Ｍ　ＰＢＳ　ＰＨ＝７．５
）でよく洗浄してから、この第４の緩衝液１ｍｌとＮａ
ＢＨ４１，２５■とを添加し、４℃、５時間反応させて
さらに余った一ＣＩ（Ｏ基１４を完全に還元する。その
後、第５の緩衝液（０，０１１１ＰＢＳ　ＰＨ＝７．０
　、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０）によって洗浄して、抗
体の固定化処理を終了する。

第５図は以上のようにして得た生化学分析用担体の表面
の様子を示すものである。第５図から明らかなように、
キャリア本体１０の表面はポリエチレンイミンによって
覆われているので、リガンドここではＩｇＧ抗体１１は
キャリア本体１０の表面に疎水結合せず、ポリエチレン
イミン上の−ＮＨ，基と安定に共有結合する。したがっ
て、ＩｇＧ抗体１１を−ＮＨ２基を残すことなく確実に
固定化することができる。

また、この実施例によるＩｇＧ抗体１１の固定化量は、
１１■７ｍａｌ−ｇｅｌであり、従来法のほぼ２倍もあ
る。

第６図は上記の実施例によって得た生化学分析用担体を
、内径１顛、長さ１０ｃｍ０カラムに充填してＨＰＬＣ
（高性能液体クロマトグラフィ）にかけ、アフィニティ
クロマトグラフィを行ったときのクロマトグラムを示す
ものである。なお、このクロマトグラフィにおいては、
洗浄液として０．０Ｅ　ＰＢＳＰＨ＝７．２　、０．１
５Ｍ　ＮａＣ１溶液を、解離液としてＯ，１Ｍグリシン
−１ｆＣＩＰＨ＝２．５　ｉ液を用い、サンプルとして
ヒト血清より４０％硫安で分画されたグロブリン溶液を
用いた。また、溶出液の測定波長λはλ”２８０　ｎｒ
ａとした。

第６図のクロマトグラムから明らかなように、この実施
例による生化学分析用担体を用いれば、抗体の固定化量
が多く、しかも不所望な非特異的反応が起こらないので
、振幅の大きいヒ）ＩｇＧの溶出ピーク１５が得られる
。したがって、精度の高い分析を行うことができる。

以上のように、この実施例においては、ポリマ系キャリ
ア本体表面にスペンサの長いイミノポリマを共用結合に
より導入し、このイミノポリマで覆いきれなかった細部
の活性基をイミノポリマよりも分子量の少ないアミン化
合物でアミノ化している。したがって、イミノポリマに
よる立体障害に加え、細部わたり活性基がアミノ化され
ているので、リガンドのポリマ系キャリア本体のベース
面への疎水結合を二重に固止することができる。

なお、この発明は上述した実施例にのみ限定されるもの
ではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば
、上述した実施例ではイミノポリマ（ポリエチレンイミ
ノ）でアミン化されずに残ったエポキシ基のアミノ化を
アミノ化合物（１，６ジアミノヘキサン）で行うように
したが、このアミノ化はイミノ化合物によって行うよう
にしてもよい。また、イミノポリマによるアミノ化はス
ペンサの長いアミノ基を導入できればよいので、イミノ
ポリマに代え長い側鎖をもつアミノポリマでアミン化し
てもよい。更に、イミノポリマまたはアミノポリマによ
ってアミノ化すれば、長いスペンサによってキャリア本
体の疎水性表面が有効に覆われるので、その後の分子量
の少ないアミノ化合物またはイミノ化合物によるアミノ
化は省略してもよい。また、上述した実施例では、リガ
ンドをアミン基に共有結合させる架橋剤としてグルタル
アルデヒドを用いたが、ビスエポキシや活性化カルボジ
イミド等を用いることもできる。更に、この発明による
生化学分析用担体は、アフィニティクロマトグラフィ用
のカラム充填剤のみならず、免疫分析における固相体等
の他の生化学分析用担体としても有効に適用できること
勿論である。

〔発明の効果〕

以上述べたように、この発明によればポリマ系キャリア
本体にイミノポリマまたはアミノポリマを結合させたの
で、その長いスペンサによって疎水性のキャリア本体表
面を有効に覆うことができる。したがって、リガンドを
疎水結合による吸着を起こすことなく、キャリア本体に
共有結合により確実に固定化することができると共にそ
の固定化量も増加させることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の一実施例におけるポリマ系キャリア
本体表面のアミノ化処理の工程図、第２図はその反応模
式図、 第３図はアミノ化処理したポリマ系キャリア本体へのリ
ガンドの固定化処理の工程図、第４図はその反応模式図
、 第５図はこの発明に係る生化学分析用担体の表面の様子
を示す模式図、 第６図はこの発明に係る生化学分析用担体を用いるアフ
ィニティクロマトグラフィによるクロマトグラムの一例
を示す図、 第７図は従来の生化学分析用担体の製造方法を示す工程
図、 第８図は同じ〈従来の生化学分析用担体の表面の様子を
示す模式図である。 １０・・・ポリマ系キャリア本体 １１・・・抗体 １２・・・アルブミン １３・・・１，６ジアミノヘキサン １４・・・アルデヒド基 １５・・・ヒトＩｇＧの溶出ピーク 第１図 第２図 第３図 第４図 第５図 Ｉ？４間 手　　続　　補　　正　　書 昭和６１先１２月２４日 特許庁長官　　黒　　１）　明　　雄　　殿１、事件の
表示 昭和６１年特許願第１６０８６３号 ２、発明の名称 生化学分析用担体およびその製造方法 （０３７）　　オリンパス光学工業株式会社４、代理人 ５、補正の対象　　　明細書の「発明の詳細な説明」の
欄６、補正の内容（別紙の通り） １、明細書第２頁第５〜１４行の「これに対し、−−一
示すようにして行っている。」を次の通りに訂正する。 「これに対し、ポリマ系キャリアには親水性と疎水性の
２種類のゲルがある。親水性ゲルにはデキストラン系、
例えばセフアゾ・ノクス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　；商品名
、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製）やアガロ
ース系、例えばスペロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ；商品名
、ファルマシア社製）等があり、また疎水性ゲルではポ
リビニル系、例えばＴＳＫ−ＧＥＬ　ＴＯＹＯＰＥＡＲ
Ｌ商品名；東洋曹達社製）やポリスチレン系、例えばＢ
ｉｏ　Ｂｅａｄｓ（商品名；Ｂｉｏ　Ｒａｄ社製）等が
ある。 なかでもベース面が疎水性であり、親水性水酸基（−Ｏ
Ｈ基）を有するＴＳＫ−ＧＥＬは比較的強度があり、耐
アルカリ性が高い。従来、−ＯＨ基を有するポリマ系キ
ャリア本体へのタンパク質の固定化の一例として第７図
に示す方法がある。」２、同第３頁第９〜１１行の「第
８図において、−ｍ−このような疎水性」を［第８図に
おいて、ポリマ系キャリア本体１のベース面が疎水性で
ある場合、タンパク質２は疎水基と親水基の両方を持っ
ているから、このような」に訂正し、同頁第１６〜１７
行の「スペンサが短いために、タンパク質２がアミノ基
だけでなく、」を「スペーサが短いために、タンパク質
２がアミノ基だけでなく、タンパク質の疎水基の部分が
」に訂正する。 ３、同第４真第２〜６行の「上述した従来法により一−
−キャリア本体どを次のように訂正する。 ［上述した従来法によりＴＳＸ−ＧＥＬへのタンパク質
２の固定化量はヤギＩｇＧの場合で、疎水結合による吸
着も含み約３ｍｇ／−であり、実際に共有結合で固定化
されている量はごく僅かである。 また、タンパク質２が疎水結合で疎水性キャリア本体」 ４、同第５頁第１４行、第１０頁第１５行、第１１頁第
１０〜１１行、同頁第１４〜１５行および第１２頁第９
行の「スペンサ」を「スペーサ」にそれぞれ訂正する。 ５、同第６頁第１４行の「吸着させる。」を「固定化さ
せる。」に訂正する。 ６、同第７頁第１８行の「グリクルアルデヒド溶液」を
「グルタルアルデヒド溶液」に訂正する。 ７、同第８頁第１行のｒ（０，ＯＩＭ　ＰＢＳ　Ｐ）ｌ
　＝７．０．Ｊをｒ　（０，０１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ）ＰＩ（＝７．０．Ｊに訂正する。 ８、同第９頁第１６行のｒｌ１ｗ／　ｍｌ−ｇ、ｅｌｌ
であり、従来法のほぼ２倍もある。」をｒ　１２＋＋＋
＋ｒ／　ｍｌ−ｇｅ　１であり、従来法のほぼ４倍もあ
る。」に訂正し、同頁第１９行の「（高性能液体クロマ
トグラフィ）」を「（高速液体クロマトグラフィ）」に
訂正する。 ９、同第１０頁第３行のｒＰＨ＝７．２．０．１５Ｍ　
Ｎ５ＣＩ溶液」をｒＰＨ＝７．２溶液」に訂正する。 １０、同第１１頁第６行の「（ポリエチレンイミノ）」
を「（ポリエチレンイミン）」に訂正する。 外１名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アミノポリマまたはイミノポリマによりアミノ化し
   たポリマ系キャリア本体のアミノ基に架橋剤を介してリ
   ガンドを共有結合により固定化して成る生化学分析用担
   体。 ２、ポリマ系キャリア本体表面を活性化した後、アミノ
   ポリマまたはイミノポリマによりアミノ基を導入し、こ
   のアミノ化した表面にリガンドを架橋剤を介して共有結
   合により固定化することを特徴とする生化学分析用担体
   の製造方法。